WO2023238949A1 - 細胞の作出方法、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法、バイスペシフィック抗体の製造方法、ベクターセット、哺乳動物細胞、ｃｈｏ細胞、及び細胞プールの作出方法 - Google Patents

細胞の作出方法、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法、バイスペシフィック抗体の製造方法、ベクターセット、哺乳動物細胞、ｃｈｏ細胞、及び細胞プールの作出方法 Download PDF

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expression vector
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達也 松浦
明里 黒田
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富士フイルム株式会社
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present disclosure relates to methods for producing cells, methods for producing heteromultimeric proteins, methods for producing bispecific antibodies, vector sets, mammalian cells, CHO cells, and methods for producing cell pools.
  • Patent Document 1 discloses a method for selecting bispecific antibody-expressing cells, which involves transducing eukaryotic cells using a lentivirus.
  • Patent Document 2 discloses producing a bispecific anti-HER2 antibody by culturing host cells containing an expression vector for the bispecific anti-HER2 antibody.
  • Patent Document 3 describes (1) a domain containing an antibody variable region having glypican 3-binding activity, (2) a domain containing an antibody variable region having T cell receptor complex binding activity, and (3) a domain for Fc ⁇ receptor Disclosed is a multispecific antigen-binding molecule comprising a domain including an Fc region with reduced binding activity, and in which the variable region (1) and the L chain variable region contained in the variable region (2) have a common amino acid sequence. has been done.
  • Patent Document 4 discloses a first antigen-binding site that recognizes blood coagulation factor IX and a second antigen-binding site that recognizes blood coagulation factor X, and has a function to replace the function of blood coagulation factor VIII.
  • a multispecific antigen binding molecule is disclosed that has the following properties.
  • Patent Document 5 discloses a bispecific antibody that includes an antigen-binding domain that binds to CD40 and an antigen-binding domain that binds to EpCAM.
  • Patent Document 6 discloses a bispecific anti-HER2 antibody having a common light chain and two different heavy chains.
  • Patent Document 7 discloses a bispecific antibody that binds to the extracellular portion of PD-1 and the extracellular portion of TIM-3.
  • Patent Document 8 discloses a bispecific antibody that binds to hPD-L1 and TIGIT or LAG-3.
  • Patent Document 9 discloses a bispecific antibody that binds to CD38 and PD-L1.
  • Patent Document 10 discloses a fibronectin secretion leader that promotes secretion of a target polypeptide produced in host cells.
  • expression vectors for subunits constituting heteromultimeric proteins have been introduced into host cells for the purpose of producing cells that produce heteromultimeric proteins.
  • a heteromultimeric protein consists of one subunit A, one subunit B, and one subunit C
  • the expression cassette of subunit A, the expression cassette of subunit B, and the expression of subunit C Expression vectors containing each cassette are introduced into host cells.
  • a simple prediction would be that the three types of subunits described above would be expressed in an expression ratio of 1:1:1, and a heteromultimeric protein would be produced.
  • the expression level or purity of the heteromultimeric protein may be low, and the production amount of the heteromultimeric protein may not reach the expected value. Possible reasons for this include the fact that each subunit has a different transcription rate or translation rate; some subunits are easily degraded; and all subunits aggregate when a certain type of subunit is in excess. It will be done.
  • the optimal ratio of the expression levels of subunits As a means of increasing the expression level or purity of a heteromultimeric protein, it is possible to know in advance the optimal ratio of the expression levels of subunits and to load expression cassettes of subunits into one expression vector in a number ratio according to this ratio. Conceivable. However, it is not always easy to know the optimal ratio of subunit expression levels. Furthermore, when the optimal ratio of the expression levels of subunits is a relatively large integer (for example, 1:2:3), the total number of expression cassettes to be carried on one expression vector increases. As a result, the size of the expression vector increases and the rate of introduction into host cells decreases.
  • Another possible means of increasing the expression level or purity of a heteromultimeric protein is to place each subunit expression cassette on a separate expression vector and introduce multiple types of expression vectors into host cells.
  • expression vector A for subunit A, expression vector B for subunit B, and expression vector C for subunit C are Introduce into cells. Since the numbers of expression vectors A, B, and C introduced into host cells vary from host cell to host cell, diversity occurs in the number of expression cassettes possessed by host cells. Cells with a high expression level or purity of the heteromultimeric protein are selected from a variety of host cells. However, it is necessary to construct the same number of expression vectors as the number of subunits constituting the heteromultimeric protein, and it is necessary to prepare the same number of selection markers as the number of subunits.
  • the present disclosure provides a means different from the above two means as a means for increasing the expression level or purity of a heteromultimeric protein.
  • One embodiment of the present disclosure aims to provide a method for producing cells with excellent productivity of heteromultimeric proteins or bispecific antibodies.
  • An object of an embodiment of the present disclosure is to provide a method for producing a heteromultimeric protein or a bispecific antibody with excellent productivity.
  • One embodiment of the present disclosure aims to provide a vector set for use in producing cells that produce heteromultimeric proteins or bispecific antibodies.
  • One embodiment of the present disclosure aims to provide mammalian cells and CHO cells that produce heteromultimeric proteins or bispecific antibodies.
  • One embodiment of the present disclosure aims to provide a method for creating a cell pool for use in selecting cells that produce heteromultimeric proteins or bispecific antibodies.
  • a first expression vector and a second expression vector that is, two types of expression vectors, are introduced into a host cell to express a heteromultimeric protein.
  • the expression cassette of the subunit of interest (usually the subunit whose expression is desired to be enhanced) is placed on both the first expression vector and the second expression vector.
  • the number of subunits of interest may be one type or two or more types.
  • Expression cassettes for the remaining subunits other than the subunit of interest are placed on either the first expression vector or the second expression vector for each type. Expression of all subunits is ensured by introducing both the first expression vector and the second expression vector into the host cell.
  • the expression cassette of the subunit of interest is present in both the first expression vector and the second expression vector, the amount introduced is relatively large, and the expression of the subunit of interest can be enhanced. Since the number of the first expression vector and the second expression vector introduced into the host cell varies from host cell to host cell, diversity occurs in the number of each expression cassette possessed by the host cell. Cells that meet evaluation criteria (eg, expression level or purity of heteromultimeric protein) are selected from a variety of host cells.
  • a method for producing cells that produce a heteromultimeric protein consisting of n types of subunits (n is an integer of 2 or more), introducing the vector set into a host cell; selecting cells that produce a heteromultimeric protein from host cells into which the vector set has been introduced; How to create cells: Vector set: a set of a first expression vector and a second expression vector, an expression cassette for at least one type of subunit X that is part of the n types of subunits is included in both the first expression vector and the second expression vector, An expression cassette of subunit Y remaining after subunit X is removed from n types of subunits is contained in one of the first expression vector and the second expression vector for each type.
  • Vector set a set of a first expression vector and a second expression vector, an expression cassette for at least one type of subunit X that is part of the n types of subunits is included in both the first expression vector and the second expression vector, An expression cassette of subunit Y remaining after subunit X is removed from n types of subunits
  • the vector set is the following vector set, Method for producing cells described in ⁇ 1>:
  • Vector set a set of a first expression vector and a second expression vector, an expression cassette for at least one type of subunit X that is part of the n types of subunits is included in both the first expression vector and the second expression vector, All expression cassettes for subunit Y remaining after subunit X is removed from the n types of subunits are contained in one of the first expression vector and the second expression vector.
  • Vector set a set of a first expression vector and a second expression vector, an expression cassette for at least one type of subunit X that is part of the n types of subunits is included in both the first expression vector and the second expression vector, All expression cassettes for subunit Y remaining after subunit X is removed from the n types of subunits are contained in one of the first expression vector and the second expression vector.
  • the heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is a heteromultimeric protein consisting of 2 to 6 types of subunits, at least one type of subunit X is one type, two types, or three types of subunits X; The method for producing cells according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • the heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is a heteromultimeric protein consisting of 3 types or 4 types of subunits, at least one type of subunit X is one type, two types, or three types of subunits X; The method for producing cells according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • a heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is a heteromultimeric protein consisting of three types of subunits, at least one type of subunit X is one or two types of subunits
  • the heteromultimeric protein is an antibody, The method for producing cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody, The method for producing cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • All of the expression cassettes of the subunits constituting the heteromultimeric protein contain the same type of promoter. The method for producing cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>.
  • the promoter is hEF-1 ⁇ promoter, The method for producing cells according to ⁇ 8>.
  • At least one of the expression cassettes of the subunits constituting the heteromultimeric protein contains a coding sequence for a fibronectin secretion leader, In the expression cassette containing the coding sequence of the fibronectin secretory leader, the coding sequences of the subunits constituting the heteromultimeric protein are located downstream of the coding sequence of the fibronectin secretory leader in the same reading frame.
  • the expression cassettes of the subunits that make up the heteromultimeric protein contain the coding sequence for the fibronectin secretory leader;
  • the coding sequences of the subunits constituting the heteromultimeric protein are located downstream and in the same reading frame of the coding sequence of the fibronectin secretory leader.
  • the first expression vector further comprises an expression cassette for a first selection marker;
  • the second expression vector further comprises an expression cassette for a second selection marker;
  • the first selection marker and the second selection marker are different types of selection markers, the first selection marker is at least one selected from the group consisting of a dihydrofolate reductase gene, a glutamine synthetase gene, and an antibiotic resistance gene;
  • the second selection marker is at least one selected from the group consisting of a dihydrofolate reductase gene, a glutamine synthetase gene, and an antibiotic resistance gene.
  • ⁇ 15> The method for producing a cell according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the host cell is a CHO cell (Chinese hamster ovary cell).
  • the host cell is a CHO-DG44 cell, a CHO-K1 cell, a CHO-DXB11 cell, a CHOpro3 ⁇ cell, or an established cell line derived from these cells.
  • a method for producing cells is any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the host cell is a CHO-DG44 cell, a CHO-K1 cell, a CHO-DXB11 cell, a CHOpro3 ⁇ cell, or an established cell line derived from these cells.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of a first H chain, a second H chain, and an L chain common to the first H chain and the second H chain, Subunit X is a L chain, subunit Y is a first H chain and a second H chain,
  • the vector set is the following vector set, Method for producing cells described in ⁇ 1>: Vector set: a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector include a light chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a first heavy chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a second heavy chain expression cassette; Vector set.
  • a method for producing a cell that produces a bispecific antibody consisting of a first H chain, a second H chain, and an L chain common to the first H chain and the second H chain introducing the vector set into a host cell; selecting cells that produce bispecific antibodies from host cells into which the vector set has been introduced; How to create cells: Vector set: a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector include a light chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a first heavy chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a second heavy chain expression cassette; Vector set.
  • one of the first expression vector and the second expression vector comprises a first H chain expression cassette and a second H chain expression cassette;
  • the first expression vector includes an L chain expression cassette, a first H chain expression cassette, and a second H chain expression cassette, the second expression vector comprises a light chain expression cassette;
  • the bispecific antibody is a tetramer consisting of one first H chain, one second H chain, and two L chains, The method for producing cells according to any one of ⁇ 17-1> to ⁇ 17-4>.
  • the first expression vector and the second expression vector each contain one L chain expression cassette, one of the first expression vector and the second expression vector contains one first H chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector contains one second H chain expression cassette; The method for producing cells according to any one of ⁇ 17-1> to ⁇ 17-5>.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of an H chain, a L chain, and a scFv-Fc, Subunit X is a L chain and scFv-Fc, subunit Y is a H chain,
  • the vector set is the following vector set A, Method for producing cells described in ⁇ 1>: Vector set A: a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector include an expression cassette for the light chain and an expression cassette for the scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; Vector set.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of an H chain, a L chain, and a scFv-Fc, Subunit X is scFv-Fc, subunit Y is H chain and L chain,
  • the vector set is the following vector set B, Method for producing cells described in ⁇ 1>: Vector set B: a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector contain an expression cassette for scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector contains an expression cassette for the L chain; Vector set.
  • ⁇ 18-4> A method for producing cells that produce bispecific antibodies consisting of H chain, L chain, and scFv-Fc, introducing vector set A or B into a host cell; selecting cells that produce bispecific antibodies from host cells into which vector set A or B has been introduced; How to create cells: Vector set A: a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector include an expression cassette for the light chain and an expression cassette for the scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; Vector set.
  • Vector set B a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector contain an expression cassette for scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector contains an expression cassette for the L chain; Vector set.
  • the promoter is hEF-1 ⁇ promoter, The method for producing cells according to ⁇ 19>.
  • At least one of the expression cassettes of the subunits constituting the bispecific antibody contains a coding sequence for a fibronectin secretion leader, In the expression cassette containing the coding sequence of the fibronectin secretory leader, the coding sequences of the subunits constituting the bispecific antibody are arranged downstream of the coding sequence of the fibronectin secretory leader in the same reading frame.
  • All of the subunit expression cassettes that make up the bispecific antibody contain the coding sequence for the fibronectin secretory leader, The coding sequences of the subunits constituting the bispecific antibody are located downstream of and in the same reading frame as the coding sequence of the fibronectin secretory leader.
  • the first expression vector further comprises an expression cassette for a first selection marker; the second expression vector further comprises an expression cassette for a second selection marker; The method for producing a cell according to any one of ⁇ 17-1> to ⁇ 17-5>, ⁇ 18-1> to ⁇ 18-5>, and ⁇ 19> to ⁇ 22>.
  • the first expression vector includes an L chain expression cassette, a first H chain expression cassette, a second H chain expression cassette, and a first selection marker expression cassette
  • the second expression vector comprises an expression cassette for the light chain and an expression cassette for the second selection marker; The method for producing cells according to ⁇ 23>.
  • the first selection marker and the second selection marker are different types of selection markers,
  • the first selection marker is a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene, The method for producing cells according to ⁇ 24>.
  • the first selection marker is a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene, the second selection marker is an antibiotic resistance gene; The method for producing cells according to ⁇ 24>.
  • ⁇ 27> The cell according to any one of ⁇ 17-1> to ⁇ 17-5>, ⁇ 18-1> to ⁇ 18-5> and ⁇ 19> to ⁇ 26>, wherein the host cell is a mammalian cell. Creation method.
  • ⁇ 28> Any one of ⁇ 17-1> to ⁇ 17-5>, ⁇ 18-1> to ⁇ 18-5>, and ⁇ 19> to ⁇ 26>, wherein the host cell is a CHO cell (Chinese hamster ovary cell).
  • the method for producing cells described in . ⁇ 29> The host cell is a CHO-DG44 cell, a CHO-K1 cell, a CHO-DXB11 cell, a CHOpro3 ⁇ cell, or an established cell line derived from these cells, ⁇ 17-1> to ⁇ 17-5>, ⁇ 18
  • a method for producing a heteromultimeric protein comprising culturing cells produced by the method for producing cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 16>.
  • ⁇ 31> Cultivating cells produced by the method for producing cells according to any one of ⁇ 17-1> to ⁇ 17-5>, ⁇ 18-1> to ⁇ 18-5>, and ⁇ 19> to ⁇ 29>.
  • a method for producing a bispecific antibody comprising:
  • Vector set that expresses a heteromultimeric protein consisting of n types of subunits (n is an integer of 2 or more)
  • a set of a first expression vector and a second expression vector, an expression cassette for at least one type of subunit X that is part of the n types of subunits is included in both the first expression vector and the second expression vector, All expression cassettes for subunit Y remaining after subunit X is removed from the n types of subunits are contained in one of the first expression vector and the second expression vector.
  • the heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is a heteromultimeric protein consisting of 2 to 6 types of subunits, at least one type of subunit X is one type, two types, or three types of subunits X;
  • the heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is a heteromultimeric protein consisting of 3 types or 4 types of subunits, at least one type of subunit X is one type, two types, or three types of subunits X;
  • a heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is a heteromultimeric protein consisting of three types of subunits, at least one type of subunit X is one or two types of subunits
  • the heteromultimeric protein is an antibody, The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 36>.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody, The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 36>. ⁇ 39> All of the expression cassettes of the subunits constituting the heteromultimeric protein contain the same type of promoter. The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 38>. ⁇ 40> The promoter is hEF-1 ⁇ promoter, The vector set described in ⁇ 39>.
  • At least one of the expression cassettes of the subunits constituting the heteromultimeric protein contains a coding sequence for a fibronectin secretion leader, In the expression cassette containing the coding sequence of the fibronectin secretory leader, the coding sequences of the subunits constituting the heteromultimeric protein are located downstream of the coding sequence of the fibronectin secretory leader in the same reading frame.
  • ⁇ 42> All of the expression cassettes of the subunits that make up the heteromultimeric protein contain the coding sequence for the fibronectin secretory leader; The coding sequences of the subunits constituting the heteromultimeric protein are located downstream and in the same reading frame of the coding sequence of the fibronectin secretory leader.
  • the first expression vector further comprises an expression cassette for a first selection marker; the second expression vector further comprises an expression cassette for a second selection marker; The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 42>.
  • the first selection marker and the second selection marker are different types of selection markers, the first selection marker is at least one selected from the group consisting of a dihydrofolate reductase gene, a glutamine synthetase gene, and an antibiotic resistance gene;
  • the second selection marker is at least one selected from the group consisting of a dihydrofolate reductase gene, a glutamine synthetase gene, and an antibiotic resistance gene.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of a first H chain, a second H chain, and an L chain common to the first H chain and the second H chain, Subunit X is a L chain, subunit Y is a first H chain and a second H chain, both the first expression vector and the second expression vector include a light chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a first heavy chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a second heavy chain expression cassette; The vector set described in ⁇ 32>.
  • a set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector include a light chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a first heavy chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector comprises a second heavy chain expression cassette;
  • the first expression vector includes an L chain expression cassette, a first H chain expression cassette, and a second H chain expression cassette, the second expression vector comprises a light chain expression cassette;
  • the bispecific antibody is a tetramer consisting of one first H chain, one second H chain, and two L chains, The vector set according to any one of ⁇ 45-1> to ⁇ 45-4>.
  • the first expression vector and the second expression vector each contain one L chain expression cassette, one of the first expression vector and the second expression vector contains one first H chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector contains one second H chain expression cassette;
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of an H chain, a L chain, and a scFv-Fc
  • Subunit X is a L chain and scFv-Fc
  • subunit Y is a H chain
  • both the first expression vector and the second expression vector include an expression cassette for the light chain and an expression cassette for the scFv-Fc
  • one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of an H chain, a L chain, and a scFv-Fc, Subunit X is scFv-Fc, subunit Y is H chain and L chain, both the first expression vector and the second expression vector contain an expression cassette for scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector contains an expression cassette for the L chain; The vector set described in ⁇ 32>.
  • a vector set that expresses a bispecific antibody consisting of an H chain, an L chain, and a scFv-Fc A set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector include an expression cassette for the light chain and an expression cassette for the scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; Vector set.
  • a vector set that expresses a bispecific antibody consisting of an H chain, an L chain, and a scFv-Fc A set of a first expression vector and a second expression vector, both the first expression vector and the second expression vector contain an expression cassette for scFv-Fc; one of the first expression vector and the second expression vector contains an H chain expression cassette; one of the first expression vector and the second expression vector contains an expression cassette for the L chain; Vector set.
  • the bispecific antibody is a trimer consisting of H chain, L chain, and scFv-Fc, The vector set according to any one of ⁇ 46-2> to ⁇ 46-5>.
  • All of the subunit expression cassettes that make up a bispecific antibody contain the same type of promoter.
  • the promoter is hEF-1 ⁇ promoter, The vector set described in ⁇ 47>.
  • At least one of the expression cassettes of the subunits constituting the bispecific antibody contains a coding sequence for a fibronectin secretion leader, In the expression cassette containing the coding sequence of the fibronectin secretory leader, the coding sequences of the subunits constituting the bispecific antibody are arranged downstream of the coding sequence of the fibronectin secretory leader in the same reading frame.
  • All of the subunit expression cassettes that make up the bispecific antibody contain the coding sequence for the fibronectin secretory leader, The coding sequences of the subunits constituting the bispecific antibody are located downstream of and in the same reading frame as the coding sequence of the fibronectin secretory leader.
  • the first expression vector further comprises an expression cassette for a first selection marker; the second expression vector further comprises an expression cassette for a second selection marker; The vector set according to any one of ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 50>.
  • the first expression vector includes an L chain expression cassette, a first H chain expression cassette, a second H chain expression cassette, and a first selection marker expression cassette, the second expression vector comprises an expression cassette for the light chain and an expression cassette for the second selection marker; The vector set described in ⁇ 51>.
  • the first selection marker and the second selection marker are different types of selection markers,
  • the first selection marker is a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene, The vector set described in ⁇ 52>.
  • the first selection marker is a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene, the second selection marker is an antibiotic resistance gene; The vector set described in ⁇ 52>.
  • ⁇ 55> The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 44>, ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • Transfected mammalian cells ⁇ 56> The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 44>, ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • Transfected CHO cells Choinese hamster ovary cells).
  • ⁇ 57> In mammalian cells transfected with the vector set according to any one of ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • ⁇ 58> In mammalian cells transfected with the vector set according to any one of ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • a mammalian cell wherein when the first H chain mRNA amount is 1, the second H chain mRNA amount is 0.625 to 1.6, and the L chain mRNA amount is 3 to 8.
  • CHO cells transfected with the vector set described in any one of ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • ⁇ 60> CHO cells transfected with the vector set described in any one of ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • ⁇ 61> The vector set according to any one of ⁇ 32> to ⁇ 44>, ⁇ 45-1> to ⁇ 45-5>, ⁇ 46-1> to ⁇ 46-6>, and ⁇ 47> to ⁇ 54>.
  • a method of producing a cell pool comprising introducing it into a host cell.
  • ⁇ 62> The method for producing a cell pool according to ⁇ 61>, wherein the host cells are mammalian cells.
  • ⁇ 63> The method for producing a cell pool according to ⁇ 61>, wherein the host cells are CHO cells (Chinese hamster ovary cells).
  • ⁇ 64> The method for producing a cell pool according to ⁇ 61>, wherein the host cells are CHO-DG44 cells, CHO-K1 cells, CHO-DXB11 cells, CHOpro3 ⁇ cells, or established cell lines derived from these cells.
  • a method for producing cells with excellent productivity of heteromultimeric proteins or bispecific antibodies is provided.
  • a method for producing a heteromultimeric protein or a bispecific antibody with excellent productivity is provided.
  • a vector set is provided for use in producing cells that produce heteromultimeric proteins or bispecific antibodies.
  • mammalian cells and CHO cells that produce heteromultimeric proteins or bispecific antibodies are provided.
  • a method for creating a cell pool for use in selecting cells that produce a heteromultimeric protein or a bispecific antibody is provided.
  • FIG. 1 is a vector map of expression vector 1 constructed in Examples. This is a vector map of expression vector 2 constructed in Examples. This is a vector map of expression vector 3 constructed in Examples. This is a vector map of expression vector 4 constructed in Examples.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing the structure of bispecific antibodies (BiAb1 and BiAb2) produced in Examples.
  • Embodiments of the present disclosure will be described below. These descriptions and examples are illustrative of the embodiments and do not limit the scope of the embodiments.
  • the mechanism of action described in this disclosure includes speculation, and its validity does not limit the scope of the embodiments.
  • a numerical range indicated using " ⁇ " indicates a range that includes the numerical values written before and after " ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively.
  • the upper limit or lower limit described in one numerical range may be replaced with the upper limit or lower limit of another numerical range described step by step.
  • the upper limit or lower limit of the numerical range may be replaced with the values shown in the Examples.
  • each component may contain multiple types of corresponding substances.
  • the amount of each component in the composition in this disclosure if there are multiple types of substances corresponding to each component in the composition, unless otherwise specified, multiple types of substances present in the composition means the total amount of
  • nucleic acids include all nucleic acids (e.g., DNA, RNA, analogs thereof, natural products, artificial products), and all nucleic acids, including low-molecular compounds, groups (for example, methyl groups), molecules and structures other than nucleic acids. This term includes nucleic acids to which substances are linked. Nucleic acids may be single-stranded or double-stranded.
  • a vector is a substance that has the effect of transporting a foreign nucleic acid into cells, and is itself a nucleic acid.
  • Expression vector refers to a vector that expresses a polypeptide based on its nucleic acid sequence. There are no restrictions on the size and base sequence of vectors and expression vectors. Vectors and expression vectors are preferably double-stranded DNA.
  • polypeptide refers to a molecule in which amino acids are linked by peptide bonds. There is no limit to the number of amino acid residues in a polypeptide, and the term polypeptide includes proteins. It is desirable that the polypeptide according to the present disclosure has six or more amino acid residues.
  • Polypeptides include polypeptides in which amino acids have been post-translationally modified. Post-translational modifications of amino acids include phosphorylation, methylation, acetylation, and the like.
  • a heteromultimeric protein refers to a protein formed by an assembly of at least two types of subunits.
  • One subunit refers to a single polypeptide that constitutes a multimeric protein.
  • a heteromultimeric protein is a protein made up of at least two coding sequences that are expressed independently of each other.
  • a heteromultimeric protein composed of n types of subunits is expressed by n types of coding sequences that are expressed independently of each other (n is an integer of 2 or more).
  • heteromultimeric proteins include antibodies, Fc fusion proteins, enzymes, interleukins, cytokines, chemokines, peptide hormones, growth factors, transcription factors, receptors, receptor fragments, therapeutic proteins, viruses, virus-like particles, and vaccines. can be mentioned.
  • antibodies are not limited to immunoglobulins, and may be any molecules that bind to antigens.
  • antibody is a term that includes antibody fragments and antigen-binding molecules.
  • Antibodies include both monovalent antibodies and multivalent antibodies.
  • Antibodies include intact immunoglobulin molecules, Fab antibodies, Fab' antibodies, F(ab') 2 antibodies, single chain antibodies (scFv), diabodies, and variants thereof.
  • Antibodies have antigen recognition sites called paratopes, and paratopes bind to antigens.
  • Typical IgG contains two heavy chains (HC) with the same amino acid sequence and two light chains (LC) with the same amino acid sequence. It has a structure connected by bonds.
  • HC contains a variable region (VH) and constant region (CH1, CH2, and CH3)
  • LC contains a variable region (VL) and a constant region (CL).
  • antibodies examples include human antibodies that have human variable regions and human constant regions; mouse antibodies that have mouse variable regions and mouse constant regions; chimeric antibodies that combine regions derived from multiple types of animals; mouse variable regions and human constant regions.
  • bispecific antibodies refers to an antibody that can bind to two types of epitopes simultaneously.
  • Multispecific antibody refers to an antibody that can bind to three or more types of epitopes simultaneously.
  • the structure of a bispecific antibody and the number of epitope binding sites are not limited.
  • the structure of a multispecific antibody and the number of epitope binding sites are not limited.
  • bispecific antibodies include bispecific antibodies consisting of a first H chain, a second H chain, and an L chain common to the first H chain and the second H chain.
  • an L chain common to two types of H chains means one type of L chain that pairs with two types of H chains.
  • An example of this bispecific antibody is a tetramer in which one first H chain, one second H chain, and two L chains are connected by disulfide bonds.
  • the first H chain, the second H chain, and the L chain each need only contain at least a region for recognizing an antigen and a region for forming an antibody.
  • bispecific antibodies include bispecific antibodies consisting of an H chain, an L chain, and an scFv-Fc.
  • scFv is a fusion protein of immunoglobulin heavy chain variable region and light chain variable region
  • scFv-Fc is a fusion protein of scFv and Fc region.
  • An example of this bispecific antibody is a trimer in which one H chain, one L chain, and one scFv-Fc are connected by a disulfide bond.
  • the antigen and structure of the bispecific antibody are not limited as long as it has an arm that recognizes the first antigen and an arm that recognizes the second antigen.
  • Examples of bispecific antibodies include Emicizumab, Blinatumomab, Vanucizumab, Istiratumab, Pasotuxizumab, Duligotuzumab, Duvortuxizumab, Faricimab. can be mentioned.
  • One embodiment of the present disclosure is a method for producing cells that produce heteromultimeric proteins.
  • the method for producing cells includes introducing a vector set of a first expression vector and a second expression vector into a host cell, and selecting cells that produce a heteromultimeric protein from the host cells into which the vector set has been introduced. including.
  • a "vector set” means a set of a first expression vector and a second expression vector.
  • expression vector when describing matters common to the first expression vector and the second expression vector, the first expression vector and the second expression vector are collectively referred to as "expression vector.”
  • the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • prokaryotic cells include bacterial cells.
  • eukaryotic cells include yeast, insect cells and mammalian cells. As the host cell, eukaryotic cells are preferred, and mammalian cells are more preferred.
  • bacterial cells examples include Gram-negative bacterial cells such as Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa; gram-positive bacterial cells such as P. subtilis).
  • Preferred bacterial cells are Enterobacteriaceae, more preferably E. coli, especially strain B or K12.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Hansenula polymorpha.
  • insect cells examples include BmN cells from Bombyx mori, Sf9 and Sf21 cells from Spodoptera frugiperda, S2 cells from Drosophila melanogaster, and Pv11 cells from Polypedilum vanderplanki. Can be mentioned.
  • mammalian cells examples include Chinese hamster ovary cells (CHO cells), baby hamster kidney cells (BHK cells), human embryonic kidney cell lines (e.g. HEK293 cells), and human retinoblast-derived cell lines (e.g. PER.C6 cells). and mouse myeloma cell lines (eg, NS0 cells and SP2/0 cells).
  • CHO cells Chinese hamster ovary cells
  • BHK cells baby hamster kidney cells
  • human embryonic kidney cell lines e.g. HEK293 cells
  • human retinoblast-derived cell lines e.g. PER.C6 cells
  • mouse myeloma cell lines eg, NS0 cells and SP2/0 cells.
  • the host cells are preferably Chinese hamster ovary cells (CHO cells).
  • CHO cells include CHO-DG44 cells, CHO-K1 cells, CHO-DXB11 cells, CHOpro3 ⁇ cells, and established cell lines derived from these cells.
  • Examples of means for introducing expression vectors into host cells include electroporation, lipofection, microinjection, and cell infection with viral vectors. Electroporation is preferred from the viewpoints of high safety, high introduction efficiency, and low cytotoxicity. Further, when introducing multiple types of expression vectors into cells, electroporation is preferred from the viewpoint of highly uniform introduction into cells and chromosomes without bias depending on the type of expression vector.
  • first expression vector and the second expression vector are introduced into the host cell.
  • the first expression vector and the second expression vector may be introduced into a host cell together or separately. From the viewpoint of shortening the steps and period required for producing the target cells, it is preferable to introduce the first expression vector and the second expression vector into the host cell together.
  • a vector solution containing both expression vectors is prepared.
  • the molar concentration ratio of the first expression vector and the second expression vector is, for example, 1:5 to 5:1, 1:2 to 2:1, or 1:1.
  • a vector solution containing the first expression vector and a vector solution containing the second expression vector are prepared.
  • the molar concentration ratio of the expression vectors in both vector solutions is, for example, 1:5 to 5:1, 1:2 to 2:1, or 1:1.
  • the molar ratio of the first expression vector and the second expression vector to be brought into contact with the host cell is, for example, 1:5 to 5:1, 1. :2 to 2:1 or 1:1.
  • the sizes of the first expression vector and the second expression vector are not limited.
  • the size of the first expression vector is, for example, 400 bp to 50,000 bp (base pair), 600 bp to 20,000 bp, or 800 bp to 10,000 bp.
  • the size of the second expression vector is, for example, 400 bp to 50,000 bp (base pair), 600 bp to 20,000 bp, or 800 bp to 10,000 bp.
  • the expression vector introduced into a host cell may be integrated into the genome of the host cell, may be integrated into an extrachromosomal element such as a plasmid, or may be contained in the cell as an independent extrachromosomal element. From the viewpoint of enabling long-term expression of the heteromultimeric protein of interest, the expression vector is preferably integrated into the genome of the host cell.
  • Selecting cells that produce a heteromultimeric protein from host cells into which a vector set has been introduced involves, for example, setting standards for the expression level and/or purity of the heteromultimeric protein, and selecting cells that meet the standards; This is carried out by selecting cells with relatively high expression levels and/or purity of multimeric proteins. Specifically, for example, the following (a) to (d) are performed.
  • the expression level of a heteromultimeric protein is the amount of the heteromultimeric protein itself.
  • the purity of a heteromultimeric protein refers to the ratio of the heteromultimeric protein of interest to the total amount of multiple types of proteins.
  • the expression level and/or purity of a protein can be measured by a known method. For example, the amount of protein separated by electrophoresis or the like is detected by a known method such as a fluorescence method or absorbance measurement. Measuring equipment such as the icIEF analyzer Maurice (Protein Simple) may be used.
  • a multimeric protein that is not in its original form e.g., a multimeric protein lacking some subunits, or a multimeric protein in which one subunit is replaced by another subunit
  • the proportion of multimeric proteins that are not in their original form is low.
  • the cells that produce the heteromultimeric protein may be transiently expressing cells or stably expressing cells, and are preferably stably expressing cells.
  • One embodiment of the present disclosure is a vector set used to create cells that produce heteromultimeric proteins.
  • the vector set is a set of a first expression vector and a second expression vector, and these two types of expression vectors contain all the expression cassettes of the subunits constituting the heteromultimeric protein.
  • a heteromultimeric protein consisting of n types of subunits is expressed from n types of expression cassettes in which the coding sequences of the subunits are different from each other.
  • the vector set includes n types of expression cassettes whose subunit coding sequences differ from each other.
  • the expression cassette for a subunit contains all the nucleic acids necessary for expression of that subunit.
  • the size and base sequence of the subunit expression cassette are not limited.
  • the size of one subunit expression cassette is, for example, 400bp to 4000bp (base pair ), 600bp to 3000bp, or 800bp to 2000bp.
  • subunits constituting the heteromultimeric protein are divided into two groups, subunit X and subunit Y.
  • Subunit X is a part of the subunits that constitute the heteromultimeric protein, and is, for example, a subunit whose expression is desired to be enhanced.
  • Subunit X is a part, but not all, of the subunits that constitute the heteromultimeric protein. There may be one type of subunit X, or there may be two or more types of subunits.
  • the number of types of subunits X is an integer of 1 or more (n-1) or less.
  • Subunit Y is the remaining subunit after removing subunit X from the subunits constituting the heteromultimeric protein. There may be one type of subunit Y or two or more types.
  • the subunit X expression cassette is included in both the first expression vector and the second expression vector.
  • both the first expression vector and the second expression vector contain an expression cassette for subunit X.
  • Subunit X is expressed from both the first expression vector and the second expression vector.
  • the first expression vector contains the expression cassette for X1, the expression cassette for X2, and the expression cassette for The expression cassette includes an X2 expression cassette and an X3 expression cassette.
  • the first expression vector may contain one or more expression cassettes for at least one type of subunit X for each type of subunit.
  • the number of expression cassettes for subunits X contained in the first expression vector may be the same or different between the types of subunits. For example, when there are three types of subunits X1, X2, and X3, the number of expression cassettes for X1, the number of expression cassettes for X2, and the number of expression cassettes for X3 contained in the first expression vector are independent of each other, They may all have the same number, or may have different numbers.
  • the second expression vector may contain one or more expression cassettes for at least one type of subunit X for each type of subunit.
  • the number of expression cassettes for subunits X contained in the second expression vector may be the same or different between the types of subunits. For example, when there are three types of subunits X1, X2, and X3, the number of expression cassettes for X1, the number of expression cassettes for X2, and the number of expression cassettes for X3 contained in the second expression vector are independent of each other, They may all have the same number, or may have different numbers.
  • the first expression vector includes at least one expression cassette for each type of subunit X
  • the second expression vector includes at least one expression cassette for each type of subunit X.
  • An example is a form containing one each.
  • At least one type of expression cassette for subunit Y is included in one of the first expression vector and the second expression vector for each type. At least one type of subunit Y is expressed from one of the first expression vector and the second expression vector for each type.
  • one of the first expression vector and the second expression vector may contain the entire expression cassette of subunit Y, or the first expression vector and the second expression vector may contain the entire expression cassette of subunit Y.
  • the vector may contain expression cassettes for subunit Y divided for each type of subunit.
  • the first expression vector when there are three types of subunits Y, Y1, Y2, and Y3, A configuration in which only the first expression vector contains an expression cassette for Y1, an expression cassette for Y2, and an expression cassette for Y3; A configuration in which the first expression vector contains an expression cassette of Y1, and the second expression vector contains an expression cassette of Y2 and an expression cassette of Y3; A configuration in which the first expression vector contains an expression cassette of Y2, and the second expression vector contains an expression cassette of Y1 and an expression cassette of Y3; The first expression vector may contain the Y3 expression cassette, and the second expression vector may contain the Y1 expression cassette and the Y2 expression cassette.
  • the first expression vector may contain one or more expression cassettes for each type of subunit.
  • the number of expression cassettes for subunit Y contained in the first expression vector may be the same or different between the types of subunits.
  • the first expression vector contains three types of subunits Y, Y1, Y2, and Y3, the number of expression cassettes for Y1, the number of expression cassettes for Y2, and the number of expression cassettes for Y3 are included in the first expression vector.
  • the numbers are independent from each other, and may be the same number or different numbers.
  • the second expression vector may contain one or more expression cassettes for each type of subunit.
  • the second expression vector may contain two or more types of expression cassettes for subunit Y
  • the number of expression cassettes for subunit Y contained in the second expression vector may be the same or different between the types of subunits.
  • the second expression vector contains three types of subunits Y, Y1, Y2, and Y3, the number of expression cassettes for Y1, the number of expression cassettes for Y2, and the number of expression cassettes for Y3 are included in the second expression vector.
  • the numbers are independent from each other, and may be the same number or different numbers.
  • An example of an embodiment is a configuration in which one of the first expression vector and the second expression vector contains one expression cassette for each type of subunit Y.
  • Another example of an embodiment is a configuration in which the first expression vector and the second expression vector contain expression cassettes for subunit Y, one for each type.
  • At least one expression cassette for subunit X is included in both the first expression vector and the second expression vector, and all expression cassettes for at least one subunit Y are included in , a vector set included in one of the first expression vector and the second expression vector.
  • both the first expression vector and the second expression vector contain the expression cassette for subunit X
  • one of the first expression vector and the second expression vector contains the expression cassette for subunit Y.
  • the first expression vector includes one expression cassette for each type of subunit X
  • the second expression vector includes one expression cassette for each type of subunit
  • Examples include a vector set in which one of the first expression vector and the second expression vector includes one expression cassette for each type of subunit Y.
  • a preferred form of using a vector set is one in which the heteromultimeric protein is an antibody.
  • a more preferred form of using a vector set is one in which the heteromultimeric protein is a bispecific antibody.
  • a preferred form of using a vector set includes a form in which the heteromultimeric protein consists of two or more types and six or less types of subunits, and the number of subunits X is one, two, or three types.
  • This form includes, for example: A form in which the heteromultimeric protein consists of two types of subunits, with one type of subunit X; A form in which the heteromultimeric protein consists of three types of subunits and one type of subunit X: A form in which the heteromultimeric protein consists of three types of subunits, and there are two types of subunits X; A form in which the heteromultimeric protein consists of four types of subunits, with one type of subunit X; A form in which the heteromultimeric protein consists of four types of subunits, and there are two types of subunits X; A form in which the heteromultimeric protein consists of five types of subunits, with one type of subunit X; A form in which the heteromultimeric protein consists of six types of subunit
  • a particularly preferable form of using a vector set includes a form in which the heteromultimeric protein consists of three types of subunits, and the number of subunits X is one or two types.
  • Both the first expression vector and the second expression vector contain a light chain expression cassette, one of the first expression vector and the second expression vector contains a first heavy chain expression cassette, and one of the first expression vector and the second expression vector contains a first heavy chain expression cassette;
  • the vector set related to the above bispecific antibody is such that the first expression vector and the second expression vector each contain one L chain expression cassette, and the first expression vector and the second expression vector each contain one L chain expression cassette.
  • one of the second expression vectors contains one expression cassette for the first H chain
  • one of the first expression vector and the second expression vector contains one expression cassette for the second H chain.
  • a further example of a form that utilizes a vector set is a form in which the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of an H chain, a L chain, and an scFv-Fc.
  • the expression level of scFv-Fc is preferably 0.3 times or more, more preferably 0.5 times or more, the expression level of H chain.
  • the amount of scFv-Fc mRNA is preferably 0.3 times or more, more preferably 0.5 times or more, the amount of H chain mRNA.
  • the amount of mRNA is determined by quantitative PCR as described below. Examples of embodiments of vector sets related to this bispecific antibody include vector sets A and B below.
  • Vector set A Both the first expression vector and the second expression vector contain an expression cassette for the L chain and an expression cassette for the scFv-Fc, and one of the first expression vector and the second expression vector contains the expression cassette for the H chain.
  • Vector set B both the first expression vector and the second expression vector contain the expression cassette of scFv-Fc, one of the first expression vector and the second expression vector contains the expression cassette of H chain, and the first expression vector and the second expression vector contain the expression cassette of H chain.
  • An example of a bispecific antibody consisting of a H chain, a L chain, and a scFv-Fc is a trimer in which one H chain, one L chain, and one scFv-Fc are assembled. .
  • Expression vectors and expression cassettes contain the necessary elements for expression of the polypeptide, depending on the type of host cell.
  • the expression vector contains plasmid stability loci such as, for example, origins of replication, restriction enzyme sites, transcription terminators, and cer stability sequences. Good too.
  • the expression vector may contain, for example, a promoter, a transcription terminator, a selection marker, and an origin of replication.
  • the expression vector may include, for example, a promoter, a transcription terminator, and a selection marker.
  • the expression vector includes, for example, a promoter, a polyadenylation sequence (e.g., human beta globin polyA sequence, bovine growth hormone polyA sequence, SV40 early polyA sequence, SV40 late PolyA sequence (SV40 late polyA )) and a selection marker.
  • a polyadenylation sequence e.g., human beta globin polyA sequence, bovine growth hormone polyA sequence, SV40 early polyA sequence, SV40 late PolyA sequence (SV40 late polyA )
  • a selection marker e.g., human beta globin polyA sequence, bovine growth hormone polyA sequence, SV40 early polyA sequence, SV40 late PolyA sequence (SV40 late polyA )
  • Promoters that can be used in prokaryotic cells include the promoters disclosed in J. Mol. Biol. 1986; 189(1): 113-30, phage polymerase promoters, and E. coli polymerase promoters. Specific examples include T7A1, T7A2, T7A3, ⁇ pL, ⁇ pR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA and rrnB.
  • promoters examples include gal promoter, AOX1 promoter, AOX2 promoter, GAP promoter, GAL1 promoter, and GAL10 promoter.
  • promoters examples include polyhedrin promoter, P10 promoter, viral infection early expression protein (IE-1) promoter, MT promoter, COPIA promoter, CMV promoter, RSV promoter, SV40 promoter, heat shock protein promoter, Examples include the OPIE2 promoter and the actin5C promoter.
  • promoters that can be used in mammalian cells include virus-derived promoters and housekeeping gene-derived promoters.
  • virus-derived promoters include human CMV promoter, rat CMV promoter, SV40 promoter, RSR-LTR promoter and HSK-TK promoter.
  • promoters derived from housekeeping genes include the hEF-1 ⁇ promoter, the Chinese hamster EF-1 ⁇ promoter, the ⁇ -actin promoter, and the mouse phosphoglycerate kinase (mPGK) promoter.
  • mPGK mouse phosphoglycerate kinase
  • a preferred example of a promoter that can be used in mammalian cells is the EF-1 ⁇ promoter, more preferably the hEF-1 ⁇ promoter.
  • the subunit expression cassette preferably contains a secretion leader coding sequence for the purpose of promoting transport or secretion of the expressed polypeptide to the outside of the cell.
  • a secretory leader is a type of signal peptide that induces the transport or secretion of a polypeptide to the outside of the cell.
  • Functional equivalents of the fibronectin secretory leader have an amino acid sequence with 70% or more identity, preferably 75% or more identity, more preferably 80% or more identity, even more preferably 90% or more identity, most preferably It preferably has an identity of 95% or more and has the function of secreting the recombinant polypeptide to the outside of the cell. Sequence identity of amino acid sequences is calculated using, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  • the origin organism of the fibronectin secretion leader depends on the type of host cell.
  • the host cell is a human cell, it is preferred to utilize a human fibronectin secretory leader in the expression cassette.
  • the host cell is a rat cell, it is preferred to utilize a rat fibronectin secretory leader in the expression cassette.
  • the host cell is a CHO cell, it is preferable to utilize the Chinese hamster fibronectin secretory leader as the expression cassette.
  • fibronectin secretion leader examples include a human fibronectin secretion leader having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a Chinese hamster fibronectin secretion leader having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • An example of the code sequence of SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 3.
  • An example of the code sequence of SEQ ID NO: 2 is SEQ ID NO: 4.
  • Sequence number 3 ATGCTGAGAGGCCCTGGACCTGGACTGCTGCTGCTGGCTGCCGTCTGGGAACCGCCGTGCCTTCTACCGGCGCC
  • Sequence number 4 ATGCTCAGGGGTCCGGGACCCGGGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGACAGCGGTGCGCTGTACCGAAGCC
  • the expression cassette for a subunit of a heteromultimeric protein comprises an hEF-1 ⁇ promoter, a fibronectin secretion leader coding sequence, a subunit coding sequence, and a polyA sequence, operably linked to each other. .
  • the expression vector preferably contains an expression cassette for a selection marker for the purpose of confirming the introduction of the expression vector into host cells or for the purpose of creating stable expression cells.
  • the selection marker is a marker that functions to select cells into which an expression vector has been introduced, and refers to a gene integrated into the expression vector and a protein encoded by the gene.
  • the selected drug is an enzyme inhibitor
  • the selection drug is methotrexate (MTX)
  • the selection marker is dihydrofolate reductase (DHFR) and its gene.
  • MTX methotrexate
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the DHFR-MTX system is an effective system in host cells lacking the DHFR gene (eg, CHO-DG44 cells).
  • the selected drug is an enzyme inhibitor
  • the selection agent is methionine sulfoximine (MSX)
  • the selection marker is glutamine synthetase (GS) and its gene.
  • MSX methionine sulfoximine
  • GS glutamine synthetase
  • the GS-MSX system is an effective system in host cells lacking the GS gene (eg, GS knockout CHO cells).
  • the selection marker is an antibiotic degrading enzyme and its gene, the antibiotic resistance gene.
  • the antibiotic resistance gene For example, hygromycin resistance gene, neomycin resistance gene, puromycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, G418 resistance gene, blasticidin resistance gene , zeocin resistance gene, phleomycin resistance gene, and ampicillin resistance gene.
  • An example of an embodiment of a vector set is such that the first expression vector includes an expression cassette for the first selection marker, the second expression vector includes the expression cassette for the second selection marker, and the first expression vector includes the expression cassette for the first selection marker.
  • the two selection markers are different types of selection markers.
  • the first selection marker is, for example, at least one selected from the group consisting of a dihydrofolate reductase gene, a glutamine synthetase gene, and an antibiotic resistance gene.
  • the second selection marker is, for example, at least one selected from the group consisting of a dihydrofolate reductase gene, a glutamine synthetase gene, and an antibiotic resistance gene.
  • An example of an embodiment of the vector set is that one of the first expression vector and the second expression vector contains an expression cassette for a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene, and the other contains an expression cassette for an antibiotic resistance gene.
  • a preferred example of an expression cassette for the dihydrofolate reductase gene includes the mPGK promoter.
  • a preferred example of an expression cassette for the glutamine synthetase gene includes the mPGK promoter.
  • a preferred example of an antibiotic resistance gene expression cassette includes a viral promoter.
  • the following vector set is an example of an embodiment of a vector set related to a bispecific antibody consisting of a first H chain, a second H chain, and an L chain common to the first H chain and the second H chain.
  • the first expression vector includes an L chain expression cassette, a first H chain expression cassette, a second H chain expression cassette, and a first selection marker expression cassette;
  • a vector set comprising an expression cassette and an expression cassette of a second selection marker.
  • the vector set of the above form has a first selection marker and a second selection marker, from the viewpoint of making the amount of subunits expressed from the first expression vector larger than the amount of subunits expressed from the second expression vector.
  • the first selection marker is preferably a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene.
  • the first selection marker is a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene
  • the second selection marker is an antibiotic resistance gene.
  • Expression vectors containing a dihydrofolate reductase gene or a glutamine synthetase gene tend to increase in copy number within host cells more easily than expression vectors containing an antibiotic resistance gene.
  • An example of an embodiment of a vector set related to a bispecific antibody consisting of an H chain, a L chain, and an scFv-Fc includes the following vector set.
  • the first expression vector includes an expression cassette for an H chain, an expression cassette for an L chain, an expression cassette for an scFv-Fc, and an expression cassette for a first selection marker
  • the second expression vector includes an expression cassette for an L chain, an expression cassette for an scFv-Fc, and an expression cassette for a first selection marker.
  • a vector set comprising an expression cassette for Fc and an expression cassette for a second selection marker.
  • the first expression vector includes an expression cassette for H chain, an expression cassette for L chain, an expression cassette for scFv-Fc, and an expression cassette for the first selection marker
  • the second expression vector includes an expression cassette for scFv-Fc and an expression cassette for scFv-Fc.
  • a vector set containing expression cassettes for two selection markers The first expression vector includes an expression cassette for the H chain, an expression cassette for scFv-Fc, and an expression cassette for the first expression marker
  • a second expression vector includes an expression cassette for the L chain, an expression cassette for scFv-Fc, and an expression cassette for the first expression marker.
  • a preferred embodiment of the first selection marker and the second selection marker in the vector set of the above form is common to the first H chain, the second H chain, and the first H chain and the second H chain. This is similar to the vector set related to bispecific antibodies consisting of L chain.
  • Embodiments of the present disclosure do not preclude the use of a third expression vector other than the vector set (i.e., the first expression vector and the second expression vector).
  • a third expression vector may be utilized, for example, to express polypeptides necessary for host cell growth or metabolism.
  • One embodiment of the present disclosure is a mammalian cell transfected with a set of vectors.
  • the mammalian cell transfected with the vector set may be a cell that transiently expresses the heteromultimeric protein or a cell that stably expresses the heteromultimeric protein, and is preferably a cell that stably expresses the heteromultimeric protein.
  • One embodiment of the present disclosure is CHO cells transfected with a set of vectors.
  • Specific examples include CHO-DG44 cells, CHO-K1 cells, CHO-DXB11 cells, CHOpro3 ⁇ cells transfected with the vector set, and cell lines derived from these cells.
  • the CHO cells transfected with the vector set may be transiently or stably expressing the heteromultimeric protein, and are preferably stably expressing cells.
  • the heteromultimeric protein is a bispecific antibody consisting of a first H chain, a second H chain, and a L chain common to the first H chain and the second H chain
  • transfection with a vector set is required.
  • the number of copies of the L chain expression cassette in the infected mammalian cells and CHO cells is greater than the sum of the number of copies of the first H chain expression cassette and the number of copies of the second H chain expression cassette.
  • it is a cell. This increases the expression level and/or purity of the bispecific antibody.
  • the amount of mRNA measured by quantitative polymerase chain reaction (PCR) is useful for predicting the number of copies of an expression cassette present in a cell.
  • the amount of mRNA measured by quantitative PCR is the amount of mRNA of the second H chain, when the amount of mRNA of the first H chain is set to 1. It is preferable that the mRNA amount of the chain is 0.5 to 2, and the amount of L chain mRNA is 2 to 10.
  • the amount of mRNA measured by quantitative PCR is the amount of mRNA of the second H chain, when the amount of mRNA of the first H chain is set to 1. It is more preferable that the mRNA amount of the chain is 0.625 to 1.6, and the amount of L chain mRNA is 3 to 8.
  • Mammalian cells and CHO cells transfected with the vector set are cells that express heteromultimeric proteins and can be used for the production of heteromultimeric proteins. Mammalian cells and CHO cells transfected with the vector set can also be used for administration, infusion, or transplantation into mammals.
  • a method for producing a heteromultimeric protein includes culturing cells that produce the heteromultimeric protein. By culturing cells, heteromultimeric proteins are produced within the cells, and the heteromultimeric proteins accumulate in the culture medium and/or cells.
  • the cells used in the method for producing a heteromultimeric protein are cells produced by a cell production method that is one of the embodiments of the present disclosure. These cells are selected according to evaluation criteria and/or relative production performance regarding heteromultimeric proteins, and therefore have excellent productivity of heteromultimeric proteins.
  • the cell culture method and medium composition for producing a heteromultimeric protein may be selected depending on the type of host cell.
  • Culture conditions eg, culture scale, cell density, temperature, and CO 2 concentration
  • An example of an embodiment of the method for producing a heteromultimeric protein includes recovering the heteromultimeric protein from a culture solution.
  • Methods for recovering heteromultimeric proteins from culture solutions include, for example, centrifugation, filtration, diafiltration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, gel filtration chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC). ).
  • the recovered heteromultimeric protein is used, for example, in the production of pharmaceutical compositions.
  • An example of an embodiment of a method for producing a heteromultimeric protein includes recovering cells in which heteromultimeric proteins have accumulated from a culture medium. Methods for recovering cells from the culture medium include, for example, centrifugation and filtration. Depending on their nature, heteromultimeric proteins accumulate inside or on the surface of cells. The collected cells are, for example, administered, infused, or transplanted into a mammal.
  • One embodiment of the present disclosure is a method for creating a cell pool.
  • the method for creating a cell pool includes introducing a set of vectors into a host cell.
  • the created cell pool is subjected to selection of cells that produce heteromultimeric proteins.
  • a cell pool refers to a population of cells that has diversity in the copy number of the expression cassette of each subunit.
  • the scale of the cell pool is not limited, but includes, for example, 10 to 10,000 types of clones.
  • the host cells used in the cell pool production method are preferably eukaryotic cells, more preferably mammalian cells, and even more preferably CHO cells.
  • Examples of CHO cells include CHO-DG44 cells, CHO-K1 cells, CHO-DXB11 cells, CHOpro3 ⁇ cells, and established cell lines derived from these cells.
  • the cells contained in the cell pool may be cells that transiently express the heteromultimeric protein or cells that stably express the heteromultimeric protein, and preferably cells that stably express the heteromultimeric protein.
  • the cell pool may be maintained by culturing the cells, or may be stored by freezing the cells.
  • Expression vectors 1 and 2 were constructed to express a tetrameric bispecific antibody consisting of two types of H chains having mutually different amino acid sequences and one type of L chain common to the two types of H chains.
  • BiAb1 the above bispecific antibody
  • the two types of H chains will be referred to as “HC1” and “HC2”
  • one type of L chain will be referred to as “common LC”.
  • HC1, HC2 and common LC are collectively referred to as "antibody subunits.”
  • Figure 1 is a vector map of expression vector 1.
  • Expression vector 1 is a vector containing one expression cassette for HC1, one expression cassette for HC2, one expression cassette for common LC, and one expression cassette for DHFR gene.
  • Each antibody subunit expression cassette contains the hEF-1 ⁇ promoter, the fibronectin secretory leader coding sequence, the antibody subunit coding sequence, and the polyA sequence, consecutively downstream and in the same reading frame of the fibronectin secretory leader coding sequence.
  • the coding sequences for antibody subunits are located.
  • Figure 2 is a vector map of expression vector 2.
  • Expression vector 2 is a vector containing one common LC expression cassette and one hygromycin resistance gene expression cassette.
  • the common LC expression cassette contains the hEF-1 ⁇ promoter, the fibronectin secretory leader coding sequence, the common LC coding sequence and the polyA sequence, and the common LC expression cassette is continuous and in the same reading frame downstream of the fibronectin secretory leader coding sequence.
  • the code arrangement is arranged.
  • Expression vector 1 alone or expression vector 1 and expression vector 2 were introduced into CHO-DG44 cells by electroporation.
  • CHO-DG44 cells introduced with the expression vector were seeded in 10 mL of OptiCHO medium (Lifetechnologies, 12681011) and cultured statically at a temperature of 37° C. in an atmosphere of 5% CO 2 (v/v).
  • methotrexate was added as a selective drug to CHO-DG44 cells into which only expression vector 1 had been introduced, and methotrexate and hygro as selective drugs were added to CHO-DG44 cells into which expression vector 1 and expression vector 2 had been introduced.
  • Mycin B was added at the same time.
  • the culture volume was expanded to 20 mL, transferred to a 125 mL flask for shaking culture, and cultured with shaking.
  • ⁇ Selection of BiAb1 producing cells The shake-cultured cells were dispensed one cell per well into a 96-well plate using a droplet cell sorter, and cultured stationary at a temperature of 37° C. in an atmosphere of 10% CO 2 (v/v). After culturing for 14 days, the culture supernatant was collected, and the antibody concentration was measured using an intermolecular interaction analyzer Octet Qke (Sartorius). Clones with high antibody concentrations were selected and cultured in 24-well plates, and then in bioreactor tubes for scale-up. In this way, cells producing BiAb1 were created.
  • BiAb1-producing cells created by introducing only expression vector 1 are referred to as BiAb1-TGV cells.
  • BiAb1-producing cells created by introducing expression vector 1 and expression vector 2 are referred to as BiAb1-TGV/SGV cells.
  • BiAb1-TGV cells and BiAb1-TGV/SGV cells were each suspended in 40 mL of basal medium, transferred to a 125 mL flask for shaking culture, and shaken at a speed of 140 rpm at a temperature of 37°C and an atmosphere of 5% CO 2 (v/v). Cultivation and feeding were performed. A constant amount of feed medium was added every day from the 3rd day to the 13th day of culture. Samples were taken every 1 to 3 days, and cell density, culture medium components, and antibody concentration were measured. On the 14th day after the start of culture, the culture solution was collected, and cells and cell debris were removed using a depth filter (pore size: 0.22 ⁇ m) to obtain a culture supernatant.
  • a depth filter pore size: 0.22 ⁇ m
  • the antibody concentration in the culture supernatant was measured by liquid chromatography using a Protein A column.
  • the antibody was purified from the culture supernatant using a Protein A column, and the icIEF analyzer Maurice (Protein Simple) was used to quantify BiAb1 and detect mispaired antibodies (antibodies with only HC1 in the H chain and antibodies with only HC2 in the H chain). Quantification was performed to determine the purity of BiAb1. Purity here is BiAb1/(BiAb1+mispaired antibody) ⁇ 100 (%). Table 1 shows the measurement results for the clones with the highest antibody concentrations.
  • the amount of mRNA of the antibody subunit in each clone was measured by quantitative PCR.
  • Table 2 shows the measurement results for the clones with the highest antibody concentrations.
  • the numerical values shown in Table 2 are relative values when the amount of HC1 mRNA in BiAb1-TGV cells is set to 1.
  • BiAb1-TGV cells and BiAb1-TGV/SGV cells contain HC1 expression cassettes and HC2 expression cassettes at a ratio of 1:1. It is thought that it is held at 1.
  • the expression levels of HC1 and HC2 are comparable, and it is presumed that mispaired antibodies are unlikely to occur.
  • the amount of BiAb1 was 2.6 g/L in BiAb1-TGV cells, 4.7 g/L in BiAb1-TGV/SGV cells, and 1.8 times that in BiAb1-TGV/SGV cells. Ta.
  • Expression vector 1 contains one HC1 expression cassette, one HC2 expression cassette, and one common LC expression cassette, so BiAb1-TGV cells contain one HC1 expression cassette, one HC2 expression cassette, and one common LC expression cassette. It is thought that they are held in a number ratio of 1:1:1. It is presumed that the difference in mRNA amount between the subunits is due to the difference in transcription efficiency of each expression cassette.
  • BiAb1-TGV/SGV cells the common LC mRNA amount was 5.6 times that of HC1 and 8.9 times that of HC2.
  • BiAb1-TGV/SGV cells are thought to possess more common LC expression cassettes than HC1 and HC2 expression cassettes. This is considered to be the result of introducing both expression vector 1 and expression vector 2 into the host cell.
  • the common LC mRNA amount was 3.4 times the total mRNA amount of HC1 and HC2. If we simply predict, the total expression level of HC1 and HC2 is sufficient for the expression level of common LC, so it can be said that the expression level of common LC is excessive in BiAb1-TGV/SGV cells (three times the theoretically required amount). That's all.) It is presumed that the excessive expression level of common LC contributed to the increase in the amount of BiAb1 in BiAb1-TGV/SGV cells (1.8 times that in BiAb1-TGV cells).
  • CHO cells with high expression level and purity of BiAb1 were selected from CHO cells transfected with the vector set of expression vector 1 and expression vector 2, and CHO cells with excellent BiAb1 productivity could be generated.
  • Expression vectors 3 and 4 for expressing a trimeric bispecific antibody consisting of one type of H chain, one type of L chain that pairs with the H chain, and one type of single chain antibody scFv-Fc was built.
  • BiAb2 the above bispecific antibody
  • one type of H chain will be referred to as "HC”
  • one type of L chain will be referred to as "LC”
  • scFv-Fc the above bispecific antibody
  • HC, LC, and scFv-Fc are collectively referred to as "antibody subunits.”
  • Figure 3 is a vector map of expression vector 3.
  • Expression vector 3 is a vector containing one HC expression cassette, one LC expression cassette, one scFv-Fc expression cassette, and one DHFR gene expression cassette.
  • Each antibody subunit expression cassette contains the hEF-1 ⁇ promoter, the fibronectin secretory leader coding sequence, the antibody subunit coding sequence, and the polyA sequence, consecutively downstream and in the same reading frame of the fibronectin secretory leader coding sequence.
  • the coding sequences for antibody subunits are located.
  • Figure 4 is a vector map of expression vector 4.
  • Expression vector 4 is a vector containing one expression cassette for LC, one expression cassette for scFv-Fc, and one expression cassette for hygromycin resistance gene.
  • the LC expression cassette contains the hEF-1 ⁇ promoter, the fibronectin secretory leader coding sequence, the LC coding sequence, and the polyA sequence, and the LC coding sequence is continuously downstream of the fibronectin secretory leader coding sequence and in the same reading frame. It is located.
  • the scFv-Fc expression cassette contains the hEF-1 ⁇ promoter, the fibronectin secretion leader coding sequence, the scFv-Fc coding sequence and the polyA sequence, and the scFv-Fc expression cassette contains the hEF-1 ⁇ promoter, the fibronectin secretory leader coding sequence, the scFv-Fc coding sequence, and the polyA sequence, and the scFv-Fc is continuously downstream of the fibronectin secretory leader coding sequence and in the same reading frame.
  • -Fc code sequence is located.
  • Expression vector 3 alone or expression vector 3 and expression vector 4 were introduced into CHO-DG44 cells by electroporation.
  • CHO-DG44 cells introduced with the expression vector were seeded in 10 mL of OptiCHO medium (Lifetechnologies, 12681011) and cultured statically at a temperature of 37° C. in an atmosphere of 5% CO 2 (v/v).
  • OptiCHO medium Lifetechnologies, 12681011
  • methotrexate and hygromycin B were simultaneously added as selective drugs to the CHO-DG44 cells into which expression vectors 3 and 4 had been introduced.
  • the culture volume was expanded to 20 mL, transferred to a 125 mL flask for shaking culture, and cultured with shaking.
  • BiAb2-producing cells created by introducing only expression vector 3 are referred to as BiAb2-TGV cells.
  • BiAb2-producing cells created by introducing expression vector 3 and expression vector 4 are referred to as BiAb2-TGV/DGV cells.
  • BiAb2-TGV cells and BiAb2-TGV/DGV cells were each suspended in 40 mL of basal medium, transferred to a 125 mL flask for shaking culture, and shaken at a speed of 140 rpm at a temperature of 37°C and an atmosphere of 5% CO 2 (v/v). Cultivation and feeding were performed. A fixed amount of feed medium was added every day from the 3rd day to the 13th day of culture. Samples were taken every 1 to 3 days, and cell density, culture medium components, and antibody concentration were measured. On the 14th day after the start of culture, the culture solution was collected, and cells and cell debris were removed using a depth filter (pore size: 0.22 ⁇ m) to obtain a culture supernatant.
  • a depth filter pore size: 0.22 ⁇ m
  • the antibody concentration in the culture supernatant was measured by liquid chromatography using a Protein A column.
  • Antibodies were purified from the culture supernatant using a Protein A column, and quantification of BiAb2 and mispaired antibodies (antibodies in which HC and scFv-Fc are not paired) were performed using a capillary electrophoresis analyzer PA800plus (AB SCIEX). The purity of BiAb2 was determined. Purity here is BiAb2/(BiAb2+mispaired antibody) ⁇ 100 (%). Table 3 shows the productivity of each cell.
  • the amount of mRNA of the antibody subunit in each BiAb2-producing cell was measured by quantitative PCR.
  • Table 4 shows the measurement results for each cell.
  • the numerical values shown in Table 4 are relative values when the amount of HC gene mRNA in BiAb2-TGV cells is set to 1.
  • BiAb2-TGV cells As shown in Table 3, the purity of BiAb2 in BiAb2-TGV cells was 51%, whereas in BiAb2-TGV/DGV cells, the purity was 95%, significantly improving the purity. Since expression vector 3 contains one HC expression cassette and one scFv-Fc expression cassette, BiAb2-TGV cells and BiAb2-TGV/DGV cells carry the HC expression cassette and the scFv-Fc expression cassette. It is thought that they are held at a number ratio of 1:1.
  • Expression vector 1 contains one each of the HC expression cassette, LC expression cassette, and scFv-Fc expression cassette. It is thought that the expression cassettes are contained in a number ratio of 1:1:1. It is presumed that the difference in mRNA amount between subunits is due to the difference in transcription efficiency of each expression cassette, and in particular, it was found that scFv-Fc has significantly lower transcription efficiency than HC and LC.
  • BiAb2-TGV/DGV cells the amount of LC mRNA was 4 times that of HC, and the amount of scFv-Fc mRNA was about 0.5 times that of HC.
  • BiAb2-TGV/DGV cells are thought to possess more LC and scFv-Fc expression cassettes than HC expression cassettes. This is considered to be the result of introducing both expression vector 3 and expression vector 4 into the host cell.
  • CHO cells with high BiAb2 expression level and purity were selected from CHO cells transfected with the vector set of expression vector 3 and expression vector 4, and CHO cells with excellent BiAb2 productivity could be generated.

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Abstract

ベクターセットを宿主細胞に導入し、ベクターセットを導入した宿主細胞からヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を選ぶ。ベクターセットは、第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれ、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットからサブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットが種類ごとに、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれる。

Description

細胞の作出方法、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法、バイスペシフィック抗体の製造方法、ベクターセット、哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、及び細胞プールの作出方法
　本開示は、細胞の作出方法、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法、バイスペシフィック抗体の製造方法、ベクターセット、哺乳動物細胞、ＣＨＯ細胞、及び細胞プールの作出方法に関する。
　特許文献１には、レンチウイルスを用いて真核細胞に形質導入することを含む、バイスペシフィック抗体の発現細胞を選択する方法が開示されている。
　特許文献２には、バイスペシフィック抗ＨＥＲ２抗体の発現ベクターを含む宿主細胞を培養してバイスペシフィック抗ＨＥＲ２抗体を製造することが開示されている。
　特許文献３には、（１）グリピカン３結合活性を有する抗体可変領域を含むドメイン、（２）Ｔ細胞受容体複合体結合活性を有する抗体可変領域を含むドメイン、及び（３）Ｆｃγ受容体に対する結合活性が低下しているＦｃ領域を含むドメインを含み、（１）の可変領域と（２）の可変領域に含まれるＬ鎖可変領域が共通のアミノ酸配列である多重特異性抗原結合分子が開示されている。
　特許文献４には、血液凝固第ＩＸ因子を認識する第一の抗原結合部位及び血液凝固第Ｘ因子を認識する第二の抗原結合部位を含み、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の機能を代替する機能を有する、多重特異性抗原結合分子が開示されている。
　特許文献５には、ＣＤ４０に結合する抗原結合ドメイン及びＥｐＣＡＭに結合する抗原結合ドメインを含むバイスペシフィック抗体が開示されている。
　特許文献６には、共通軽鎖及び互いに異なる２つの重鎖を有するバイスペシフィック抗ＨＥＲ２抗体が開示されている。
　特許文献７には、ＰＤ－１の細胞外部分及びＴＩＭ－３の細胞外部分に結合するバイスペシフィック抗体が開示されている。
　特許文献８には、ｈＰＤ－Ｌ１とＴＩＧＩＴ又はＬＡＧ－３とに結合するバイスペシフィック抗体が開示されている。
　特許文献９には、ＣＤ３８及びＰＤ－Ｌ１に結合するバイスペシフィック抗体が開示されている。
　特許文献１０には、宿主細胞において生産される標的ポリペプチドの分泌を促進するフィブロネクチン分泌リーダーが開示されている。
特表２０１５－５０３９０７号公報 特表２０１７－５０１７０６号公報 国際公開第２０１６／０４７７２２号 国際公開第２０１２／０６７１７６号 国際公開第２０１９／０９３３４２号 特表２０１８－５０４１１３号公報 特表２０２０－５３２２８１号公報 特表２０１９－５２８０８３号公報 特表２０１９－５１６３９６号公報 国際公開第２０１４／１７７８２６号
　従来、ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を作出する目的で、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現ベクターを宿主細胞に導入することが行われている。例えば、ヘテロ多量体タンパク質が１個のサブユニットＡ、１個のサブユニットＢ及び１個のサブユニットＣからなる場合、サブユニットＡの発現カセット、サブユニットＢの発現カセット及びサブユニットＣの発現カセットを１個ずつ含む発現ベクターを宿主細胞に導入する。単純に予測すれば、上記３種類のサブユニットが発現量比１：１：１で発現し、ヘテロ多量体タンパク質が生成する。しかし現実には、ヘテロ多量体タンパク質の発現量又は純度が低く、ヘテロ多量体タンパク質の生産量が期待値に届かないことがある。その理由として、サブユニットごとに転写率又は翻訳率が異なる；一部のサブユニットが分解されやすい；特定の種類のサブユニットの個数が過剰であるときに全サブユニットが集合する；などが考えられる。
　ヘテロ多量体タンパク質の発現量又は純度を上げる手段として、サブユニットの発現量の最適比を予め知り、この比にしたがった個数比でサブユニットの発現カセットを１個の発現ベクターにのせることが考えられる。しかし、サブユニットの発現量の最適比を知ることは必ずしも容易ではない。また、サブユニットの発現量の最適比が比較的大きい整数である場合（例えば１：２：３）、１個の発現ベクターにのせる発現カセットの総個数が多くなる。その結果、発現ベクターのサイズが大きくなり、宿主細胞への導入率が低下する。
　ヘテロ多量体タンパク質の発現量又は純度を上げる別の手段として、サブユニットの発現カセットそれぞれを別個の発現ベクターにのせ、宿主細胞に複数種類の発現ベクターを導入することが考えられる。例えば、ヘテロ多量体タンパク質がサブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣからなる場合、サブユニットＡの発現ベクターＡと、サブユニットＢの発現ベクターＢと、サブユニットＣの発現ベクターＣとを宿主細胞に導入する。宿主細胞に導入される発現ベクターＡ、発現ベクターＢ及び発現ベクターＣの個数には宿主細胞ごとにばらつきがあるので、宿主細胞には保有する各発現カセットの個数において多様性が生じる。多様な宿主細胞のなかから、ヘテロ多量体タンパク質の発現量又は純度が高い細胞を選択する。ただし、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの種類数と同じ種類数の発現ベクターを構築する必要があるし、サブユニットの種類数と同じ種類数の選択マーカーをとりそろえる必要がある。
　本開示は、ヘテロ多量体タンパク質の発現量又は純度を上げる手段として、上記の２つの手段とは異なる手段を提供する。
　本開示の一実施形態は、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体の生産性に優れる細胞の作出方法を提供することを課題とする。
　本開示の一実施形態は、生産性に優れるヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体の製造方法を提供することを課題とする。
　本開示の一実施形態は、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体を生産する細胞の作出に用いるベクターセットを提供することを課題とする。
　本開示の一実施形態は、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体を生産する哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞を提供することを課題とする。
　本開示の一実施形態は、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体を生産する細胞の選抜に用いる細胞プールの作出方法を提供することを課題とする。
　本開示の細胞の作出方法は、ヘテロ多量体タンパク質を発現させるために第１の発現ベクター及び第２の発現ベクター、つまり２種類の発現ベクターを宿主細胞に導入する。
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に、着目したサブユニット（通常は発現を増強したいサブユニット）の発現カセットをのせる。着目したサブユニットは、１種類でもよく２種類以上でもよい。着目したサブユニット以外の残りのサブユニットの発現カセットは種類ごとに、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターのいずれか一方にのせる。
　宿主細胞に第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方が導入されることで全サブユニットの発現が担保される。着目したサブユニットの発現カセットが第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に存在しているゆえ、導入量が比較的多くなり、着目したサブユニットの発現を増強することができる。
　宿主細胞に導入される第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの個数には宿主細胞ごとにばらつきがあるので、宿主細胞には保有する各発現カセットの個数において多様性が生じる。多様な宿主細胞のなかから、評価基準（例えば、ヘテロ多量体タンパク質の発現量又は純度）を満たす細胞を選ぶ。
　課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を作出する方法であり（ｎは２以上の整数である。）、
　ベクターセットを宿主細胞に導入することと、
　ベクターセットを導入した宿主細胞からヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を選ぶことと、を含む、
　細胞の作出方法：
　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれ、
　ｎ種類のサブユニットからサブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットが種類ごとに、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれる、
　ベクターセット。
＜２＞
　ベクターセットが下記のベクターセットである、
　＜１＞に記載の細胞の作出方法：
　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれ、
　ｎ種類のサブユニットからサブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットがすべて、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれる、
　ベクターセット。
＜３＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、２種類以上６種類以下のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
　少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
　＜１＞又は＜２＞に記載の細胞の作出方法。
＜４＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類又は４種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
　少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
　＜１＞又は＜２＞に記載の細胞の作出方法。
＜５＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
　少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類又は２種類のサブユニットＸである、
　＜１＞又は＜２＞に記載の細胞の作出方法。
＜６＞
　ヘテロ多量体タンパク質が抗体である、
　＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜７＞
　ヘテロ多量体タンパク質がバイスペシフィック抗体である、
　＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜８＞
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
　＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜９＞
　プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
　＜８＞に記載の細胞の作出方法。
＜１０＞
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、において、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１１＞
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１２＞
　第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
　第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
　＜１＞～＜１１＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１３＞
　第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
　第１の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
　第２の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、
　＜１２＞に記載の細胞の作出方法。
＜１４＞
　宿主細胞が哺乳動物細胞である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１５＞
　宿主細胞がＣＨＯ細胞（Chinese hamster ovary cell）である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１６＞
　宿主細胞が、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、又はこれらの細胞に由来する株化細胞である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１７－１＞
　ヘテロ多量体タンパク質が、第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体であり、
　サブユニットＸがＬ鎖であり、サブユニットＹが第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖であり、
　ベクターセットが下記のベクターセットである、
　＜１＞に記載の細胞の作出方法：
　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜１７－２＞
　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体を生産する細胞を作出する方法であり、
　ベクターセットを宿主細胞に導入することと、
　ベクターセットを導入した宿主細胞からバイスペシフィック抗体を生産する細胞を選ぶことと、を含む、
　細胞の作出方法：
　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜１７－３＞
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
　＜１７－１＞又は＜１７－２＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１７－４＞
　第１の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを含み、
　第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセットを含む、
　＜１７－１＞～＜１７－３＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１７－５＞
　バイスペシフィック抗体が、１個の第１のＨ鎖と、１個の第２のＨ鎖と、２個のＬ鎖と
からなる４量体である、
　＜１７－１＞～＜１７－４＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１８－１＞
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターがそれぞれＬ鎖の発現カセットを１個含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを１個含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを１個含む、
　＜１７－１＞～＜１７－５＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１８－２＞
　ヘテロ多量体タンパク質が、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体であり、
　サブユニットＸがＬ鎖及びｓｃＦｖ－Ｆｃであり、サブユニットＹがＨ鎖であり、
　ベクターセットが下記のベクターセットＡである、
　＜１＞に記載の細胞の作出方法：
　ベクターセットＡ：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜１８－３＞
　ヘテロ多量体タンパク質が、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体であり、
　サブユニットＸがｓｃＦｖ－Ｆｃであり、サブユニットＹがＨ鎖及びＬ鎖であり、
　ベクターセットが下記のベクターセットＢである、
　＜１＞に記載の細胞の作出方法：
　ベクターセットＢ：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＬ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜１８－４＞
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体を生産する細胞を作出する方法であり、
　ベクターセットＡ又はＢを宿主細胞に導入することと、
　ベクターセットＡ又はＢを導入した宿主細胞からバイスペシフィック抗体を生産する細胞を選ぶことと、を含む、
　細胞の作出方法：
　ベクターセットＡ：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
　ベクターセットＢ：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＬ鎖の発現カセットを含む、
ベクターセット。
＜１８－５＞
　バイスペシフィック抗体が、１個のＨ鎖と、１個のＬ鎖と、１個のｓｃＦｖ－Ｆｃとからなる３量体である、＜１８－２＞～＜１８－４＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜１９＞
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
　＜１７－１＞～＜１７－５＞及び＜１８－１＞～＜１８－５＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜２０＞
　プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
　＜１９＞に記載の細胞の作出方法。
＜２１＞
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞、＜１９＞及び＜２０＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜２２＞
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞、＜１９＞及び＜２０＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜２３＞
　第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
　第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
　＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞及び＜１９＞～＜２２＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜２４＞
　第１の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、第１のＨ鎖の発現カセット、第２のＨ鎖の発現カセット及び第１の選択マーカーの発現カセットを含み、
　第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット及び第２の選択マーカーの発現カセットを含む、
　＜２３＞に記載の細胞の作出方法。
＜２５＞
　第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
　第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子である、
　＜２４＞に記載の細胞の作出方法。
＜２６＞
　第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子
であり、
　第２の選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、
　＜２４＞に記載の細胞の作出方法。
＜２７＞
　宿主細胞が哺乳動物細胞である、＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞及び＜１９＞～＜２６＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜２８＞
　宿主細胞がＣＨＯ細胞（Chinese hamster ovary cell）である、＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞及び＜１９＞～＜２６＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜２９＞
　宿主細胞が、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、又はこれらの細胞に由来する株化細胞である、＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞及び＜１９＞～＜２６＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法。
＜３０＞
　＜１＞～＜１６＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法によって作出された細胞を培養することを含む、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法。
＜３１＞
　＜１７－１＞～＜１７－５＞、＜１８－１＞～＜１８－５＞及び＜１９＞～＜２９＞のいずれか１項に記載の細胞の作出方法によって作出された細胞を培養することを含む、バイスペシフィック抗体の製造方法。
＜３２＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質を発現するベクターセットであり（ｎは２以上の整数である。）、
　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれ、
　ｎ種類のサブユニットからサブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットが種類ごとに、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれる、
　ベクターセット。
＜３３＞
　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれ、
　ｎ種類のサブユニットからサブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットがすべて、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれる、
　＜３２＞に記載のベクターセット。
＜３４＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、２種類以上６種類以下のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
　少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
　＜３２＞又は＜３３＞に記載のベクターセット。
＜３５＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類又は４種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
　少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
　＜３２＞又は＜３３＞に記載のベクターセット。
＜３６＞
　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
　少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類又は２種類のサブユニットＸである、
　＜３２＞又は＜３３＞に記載のベクターセット。
＜３７＞
　ヘテロ多量体タンパク質が抗体である、
　＜３２＞～＜３６＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜３８＞
　ヘテロ多量体タンパク質がバイスペシフィック抗体である、
　＜３２＞～＜３６＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜３９＞
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
　＜３２＞～＜３８＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４０＞
　プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
　＜３９＞に記載のベクターセット。
＜４１＞
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜３２＞～＜４０＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４２＞
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜３２＞～＜４０＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４３＞
　第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
　第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
　＜３２＞～＜４２＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４４＞
　第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
　第１の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
　第２の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、
　＜４３＞に記載のベクターセット。
＜４５－１＞
　ヘテロ多量体タンパク質が、第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体であり、
　サブユニットＸがＬ鎖であり、サブユニットＹが第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖であり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
　＜３２＞に記載のベクターセット。
＜４５－２＞
　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体を発現するベクターセットであり、
　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜４５－３＞
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
　＜４５－１＞及び＜４５－２＞に記載のベクターセット。
＜４５－４＞
　第１の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを含み、
　第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセットを含む、
　＜４５－１＞～＜４５－３＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４５－５＞
　バイスペシフィック抗体が、１個の第１のＨ鎖と、１個の第２のＨ鎖と、２個のＬ鎖とからなる４量体である、
　＜４５－１＞～＜４５－４＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４６－１＞
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターがそれぞれＬ鎖の発現カセットを１個含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを１個含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを１個含む、
　＜４５－１＞～＜４５－５＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４６－２＞
　ヘテロ多量体タンパク質が、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体であり、
　サブユニットＸがＬ鎖及びｓｃＦｖ－Ｆｃであり、サブユニットＹがＨ鎖であり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含む、
　＜３２＞に記載のベクターセット。
＜４６－３＞
　ヘテロ多量体タンパク質が、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体であり、
　サブユニットＸがｓｃＦｖ－Ｆｃであり、サブユニットＹがＨ鎖及びＬ鎖であり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＬ鎖の発現カセットを含む、
　＜３２＞に記載のベクターセット。
＜４６－４＞
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体を発現するベクターセットであり、
　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜４６－５＞
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体を発現するベクターセットであり、
　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含み、
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＬ鎖の発現カセットを含む、
　ベクターセット。
＜４６－６＞
　バイスペシフィック抗体が、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなる３量体である、
　＜４６－２＞～＜４６－５＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４７＞
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
　＜４５－１＞～＜４５－５＞及び＜４６－１＞～＜４６－６＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜４８＞
　プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
　＜４７＞に記載のベクターセット。
＜４９＞
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞、＜４７＞及び＜４８＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜５０＞
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネ
クチン分泌リーダーのコード配列を含み、
　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞、＜４７＞及び＜４８＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜５１＞
　第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
　第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５０＞のいずれか１項に記載のベクターセット。
＜５２＞
　第１の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、第１のＨ鎖の発現カセット、第２のＨ鎖の発現カセット及び第１の選択マーカーの発現カセットを含み、
　第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット及び第２の選択マーカーの発現カセットを含む、
　＜５１＞に記載のベクターセット。
＜５３＞
　第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
　第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子である、
　＜５２＞に記載のベクターセット。
＜５４＞
　第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子であり、
　第２の選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、
　＜５２＞に記載のベクターセット。
＜５５＞
　＜３２＞～＜４４＞、＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
＜５６＞
　＜３２＞～＜４４＞、＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（Chinese hamster ovary cell）。
＜５７＞
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞であり、
　第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．５～２であり、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が２～１０である、哺乳動物細胞。
＜５８＞
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞であり、
　第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．６２５～１．６であり、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が３～８である、哺乳動物細胞。
＜５９＞
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり、
　第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．５～２であり、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が２～１０である、ＣＨＯ細胞。
＜６０＞
　＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり、
　第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．６２５～１．６であり、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が３～８である、ＣＨＯ細胞。
＜６１＞
　＜３２＞～＜４４＞、＜４５－１＞～＜４５－５＞、＜４６－１＞～＜４６－６＞及び＜４７＞～＜５４＞のいずれか１項に記載のベクターセットを宿主細胞に導入することを含む、細胞プールの作出方法。
＜６２＞
　宿主細胞が哺乳動物細胞である、＜６１＞に記載の細胞プールの作出方法。
＜６３＞
　宿主細胞がＣＨＯ細胞（Chinese hamster ovary cell）である、＜６１＞に記載の細胞プールの作出方法。
＜６４＞
　宿主細胞が、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、又はこれらの細胞に由来する株化細胞である、＜６１＞に記載の細胞プールの作出方法。
　本開示の一実施形態によれば、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体の生産性に優れる細胞の作出方法が提供される。
　本開示の一実施形態によれば、生産性に優れるヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体の製造方法が提供される。
　本開示の一実施形態によれば、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体を生産する細胞の作出に用いるベクターセットが提供される。
　本開示の一実施形態によれば、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体を生産する哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞が提供される。
　本開示の一実施形態によれば、ヘテロ多量体タンパク質又はバイスペシフィック抗体を生産する細胞の選抜に用いる細胞プールの作出方法が提供される。
実施例において構築した発現ベクター１のベクターマップである。 実施例において構築した発現ベクター２のベクターマップである。 実施例において構築した発現ベクター３のベクターマップである。 実施例において構築した発現ベクター４のベクターマップである。 実施例において作出したバイスペシフィック抗体（ＢｉＡｂ１及びＢｉＡｂ２）の構成を示す概念図である。
　以下に、本開示の実施形態を説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、実施形態の範囲を制限するものではない。本開示において述べる作用機序は推定を含んでおり、その正否は実施形態の範囲を制限するものではない。
　本開示において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本開示において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する複数種の物質の合計量を意味する。
　本開示において核酸は、あらゆる核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの類似体、天然物、人工物）と、あらゆる核酸に低分子化合物、基（group。例えばメチル基）、核酸以外の分子、構造物などが連結している核酸とを含む用語である。核酸は、一本鎖でもよく二本鎖でもよい。
　本開示においてベクターは、細胞に外来性の核酸を運び入れる作用を有する物質であり、それ自体が核酸である。発現ベクターは、その核酸の配列を基にしてポリペプチドを発現するベクターを意味する。ベクター及び発現ベクターのサイズ及び塩基配列に制限はない。ベクター及び発現ベクターは、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
　本開示においてポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合により繋がった分子を指す。ポリペプチドのアミノ酸残基数に制限はなく、ポリペプチドはタンパク質を含む用語である。本開示におけるポリペプチドはアミノ酸残基数が６残基以上であることが望ましい。ポリペプチドには、アミノ酸が翻訳後修飾されたポリペプチドが含まれる。アミノ酸の翻訳後修飾としては、リン酸化、メチル化、アセチル化などが挙げられる。
　本開示において、アミノ酸の表記に、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＭＢ　ＪＣＢＮ（IUPAC-IUBMB Joint Commission on Biochemical Nomenclature）が定める３文字表記及び１文字表記を使用する。本開示において言及されるアミノ酸は、特に断らない限り、Ｌ－アミノ酸である。
　本開示においてヘテロ多量体タンパク質は、少なくとも２種類のサブユニットが集合してなるタンパク質を意味する。１サブユニットは、多量体タンパク質を構成する単一のポリペプチドを意味する。多量体タンパク質を構成するポリペプチドであって、複数個のポリペプチドが１個又は複数個のペプチドリンカーで繋がれた１ポリペプチドは１サブユニットに相当する。言い換えると、ヘテロ多量体タンパク質とは、互いに独立して発現する少なくとも２種類のコード配列によって作られるタンパク質である。ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質は、互いに独立して発現するｎ種類のコード配列によって発現する（ｎは２以上の整数である。）。
　ヘテロ多量体タンパク質の例として、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、増殖因子、転写因子、受容体、受容体断片、治療用タンパク質、ウイルス、ウイルス様粒子及びワクチンが挙げられる。
　本開示において抗体は、免疫グロブリンに限定されず、抗原に結合する分子であればよい。本開示において抗体は、抗体断片及び抗原結合分子を含む用語である。抗体は、一価抗体及び多価抗体のいずれも含む。抗体は、免疫グロブリン分子そのもの（intact immunoglobulin）、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、Ｆ(ａｂ’)２抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、及びこれらの改変体のいずれも含む。抗体はパラトープと呼ばれる抗原認識部位を有し、パラトープが抗原と結合する。
　一般的なＩｇＧは、アミノ酸配列が同一の重鎖（ＨＣ）を２個及びアミノ酸配列が同一の軽鎖（ＬＣ）を２個含み、ＨＣ同士がジスルフィド結合によって接続し且つＨＣとＬＣとがジスルフィド結合によって接続した構造を有する。ＨＣは可変領域（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、ＬＣは可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）を含む。
　抗体の例として、ヒト可変領域及びヒト定常領域を有するヒト抗体；マウス可変領域及びマウス定常領域を有するマウス抗体；複数種類の動物に由来する領域を組み合わせたキメラ抗体；マウス可変領域及びヒト定常領域を有するヒト化抗体；ラクダ科動物の重鎖可変領域及びヒトＦｃ領域を有するヒト化抗体；などが挙げられる。
　抗体の例として、バイスペシフィック抗体及びマルチスペシフィック抗体が挙げられる。バイスペシフィック抗体は、２種類のエピトープに同時に結合可能な抗体を意味する。マルチスペシフィック抗体は、３種類以上のエピトープに同時に結合可能な抗体を意味する。バイスペシフィック抗体の構造及びエピトープ結合部位の個数は制限されない。マルチスペシフィック抗体の構造及びエピトープ結合部位の個数は制限されない。
　バイスペシフィック抗体の例として、第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体が挙げられる。なお、本開示において、２種類のＨ鎖に共通するＬ鎖とは、２種類のＨ鎖に対合する１種類のＬ鎖を意味する。このバイスペシフィック抗体の一例は、１個の第１のＨ鎖と、１個の第２のＨ鎖と、２個のＬ鎖とがジスルフィド結合によって接続した４量体である。第１のＨ鎖、第２のＨ鎖及びＬ鎖はそれぞれ、少なくとも、抗原を認識するための領域と抗体を形成するための領域とを含んでいればよい。
　バイスペシフィック抗体のさらなる例として、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体が挙げられる。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の融合タンパク質であり、ｓｃＦｖ－Ｆｃは、ｓｃＦｖとＦｃ領域の融合タンパク質である。このバイスペシフィック抗体の一例は、１個のＨ鎖と、１個のＬ鎖と、１個のｓｃＦｖ－Ｆｃとがジスルフィド結合によって接続した３量体である。
　バイスペシフィック抗体は、第１抗原を認識するアームと第２抗原を認識するアームとを有していれば、抗原及び構造は限定されるものではない。バイスペシフィック抗体の例として、エミシズマブ（Emicizumab）、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、バヌシズマブ（Vanucizumab）、イスティラツマブ（Istiratumab）、パソツキシズマブ（Pasotuxizumab）、デュリゴツズマブ（Duligotuzumab）、デュボルツキシズマブ（Duvortuxizumab）、ファリシマブ（Faricimab）が挙げられる。
　本開示の実施形態の一つは、ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞の作出方法である。細胞の作出方法は、第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのベクターセットを宿主細胞に導入することと、ベクターセットを導入した宿主細胞からヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を選ぶこととを含む。
　本開示において「ベクターセット」とは、第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットを意味する。
　本開示において第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターに共通する事項を説明する場合、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを「発現ベクター」と総称する。
　宿主細胞は、原核細胞でもよく真核細胞でもよい。原核細胞の例として、細菌細胞が挙げられる。真核細胞の例として、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が挙げられる。宿主細胞としては、真核細胞が好ましく、哺乳動物細胞がより好ましい。
　細菌細胞の例として、大腸菌、サルモネラチフィムリウム（Salmonella typhimurium）、セラチアマルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナスプチダ（Pseudomonas putida）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）等のグラム陰性細菌細胞；枯草菌（Bacillus subtilis）等のグラム陽性細菌細胞；が挙げられる。好ましい細菌細胞は、腸内細菌科細菌（Enterobacteriaceae）であり、より好ましくは大腸菌、特にＢ株又はＫ１２株である。
　酵母の例として、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキアパストリス（Pichia pastoris）及びハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）が挙げられる。
　昆虫細胞の例として、カイコ（Bombyx mori）由来のＢｍＮ細胞、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）由来のＳｆ９細胞及びＳｆ２１細胞、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来のＳ２細胞、並びにネムリユスリカ（Polypedilum vanderplanki）由来のＰｖ１１細胞が挙げられる。
　哺乳動物細胞の例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、ヒト胚性腎細胞株（例えばＨＥＫ２９３細胞）、ヒト網膜芽由来細胞株（例えばＰＥＲ．Ｃ６細胞）及びマウスミエローマ細胞株（例えばＮＳ０細胞及びＳＰ２／０細胞）が挙げられる。
　宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が好ましい。ＣＨＯ細胞の例として、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、及びこれらの細胞に由来する株化細胞が挙げられる。
　発現ベクターを宿主細胞に導入する手段の例として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、及びウイルスベクターの細胞感染が挙げられる。安全性の高さ、導入効率の高さ及び細胞毒性の低さの観点から、エレクトロポレーションが好ましい。また、複数種類の発現ベクターを細胞に導入する際に、発現ベクターの種類による偏りなく均一性高く細胞内及び染色体内に導入される観点から、エレクトロポレーションが好ましい。
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを宿主細胞に導入する順番に制限はない。第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを宿主細胞に一緒に導入してもよく別々に導入してもよい。目的の細胞の作出に要する工程及び期間を短縮する観点から、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを宿主細胞に一緒に導入することが好ましい。
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを宿主細胞に一緒に導入する場合、両発現ベクターを含むベクター溶液を用意する。このベクター溶液において第１の発現ベクターと第２の発現ベクターのモル濃度比は、例えば、１：５～５：１、１：２～２：１、又は１：１である。
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターを宿主細胞に別々に導入する場合、第１の発現ベクターを含むベクター溶液と、第２の発現ベクターを含むベクター溶液とを用意する。両ベクター溶液の発現ベクターのモル濃度比は、例えば、１：５～５：１、１：２～２：１、又は１：１である。両ベクター溶液をそれぞれ宿主細胞に接触させて両ベクターを導入する場合、宿主細胞に接触させる第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターのモル比が、例えば、１：５～５：１、１：２～２：１、又は１：１であることが好ましい。
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターのサイズは、限定されるものではない。
　第１の発現ベクターのサイズは、例えば、４００ｂｐ～５万ｂｐ（base pair）、６００ｂｐ～２万ｂｐ、又は、８００ｂｐ～１万ｂｐである。
　第２の発現ベクターのサイズは、例えば、４００ｂｐ～５万ｂｐ（base pair）、６００ｂｐ～２万ｂｐ、又は、８００ｂｐ～１万ｂｐである。
　宿主細胞に導入された発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、プラスミド等の染色体外因子に組み込まれてもよく、又は、独立した染色体外因子として細胞に含まれてもよい。目的のヘテロ多量体タンパク質の長期に亘る発現を可能にする観点から、発現ベクターは宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。
　ベクターセットを導入した宿主細胞からヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を選ぶことは、例えば、ヘテロ多量体タンパク質の発現量及び／又は純度の基準を設定し、基準に達した細胞を選ぶこと；ヘテロ多量体タンパク質の発現量及び／又は純度が相対的に高い細胞を選ぶこと；によって実施する。具体的には例えば、下記の（ａ）～（ｄ）を行う。
（ａ）宿主細胞の培地に選択薬剤を添加すること。
（ｂ）宿主細胞をシングルセル化すること。
（ｃ）シングルセル化された細胞の培養液の一部を採取し、ヘテロ多量体タンパク質の発現量及び／又は純度を測定すること。
（ｄ）ヘテロ多量体タンパク質の発現量及び／又は純度が基準値以上である細胞を選ぶこと、及び／又は、ヘテロ多量体タンパク質の発現量及び／又は純度が相対的に高い細胞を選ぶこと。
　ヘテロ多量体タンパク質の発現量は、そのヘテロ多量体タンパク質自体の量である。
　ヘテロ多量体タンパク質の純度は、複数種類のタンパク質の総量に占める目的のヘテロ多量体タンパク質の割合を意味する。タンパク質の発現量及び／又は純度は、公知の方法により測定することができる。例えば、電気泳動等により分離したタンパク質の量を、蛍光法、吸光度測定等の公知の方法により検出する。ｉｃＩＥＦ分析装置Ｍａｕｒｉｃｅ（Protein Simple）等の測定機器を用いてもよい。ヘテロ多量体タンパク質の発現においては、本来の形状ではない多量体タンパク質（例えば、一部のサブユニットが欠けた多量体タンパク質、あるサブユニットが別のサブユニットに置き換わった多量体タンパク質）が生ずることがあり、本来の形状ではない多量体タンパク質の割合が低いことが望ましい。
　ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞は、一過性発現細胞でもよく安定発現細胞でもよく、安定発現細胞であることが好ましい。
　本開示の実施形態の一つは、ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞の作出に使用するベクターセットである。ベクターセットは、第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、この２種類の発現ベクターにヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのすべての発現カセットを含む。ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質は、サブユニットのコード配列が互いに異なるｎ種類の発現カセットから発現する。ベクターセットは、サブユニットのコード配列が互いに異なるｎ種類の発現カセットを含む。
　サブユニットの発現カセットは、そのサブユニットの発現に必要なすべての核酸を含む。サブユニットの発現カセットのサイズ及び塩基配列は限定されるものではない。サブユニットの発現カセット１個のサイズは、例えば、４００ｂｐ～４０００ｂｐ（base pair
）、６００ｂｐ～３０００ｂｐ、又は、８００ｂｐ～２０００ｂｐである。
　ベクターセットの構築において、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットは、サブユニットＸとサブユニットＹとの２群に分けられる。
　サブユニットＸは、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの一部であり、例えば発現を増強したいサブユニットである。サブユニットＸは、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの一部であり全部ではない。サブユニットＸは、１種類でもよく２種類以上でもよい。ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質において、サブユニットＸの種類数は、１以上（ｎ－１）以下の整数である。
　サブユニットＹは、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットからサブユニットＸを除いた残りのサブユニットである。サブユニットＹは、１種類でもよく２種類以上でもよい。
　サブユニットＸの発現カセットは、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれる。換言すると、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がサブユニットＸの発現カセットを含む。サブユニットＸは、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方から発現する。
　例えばサブユニットＸがＸ１、Ｘ２及びＸ３の３種類であるとき、第１の発現ベクターがＸ１の発現カセット、Ｘ２の発現カセット及びＸ３の発現カセットを含み、且つ、第２の発現ベクターがＸ１の発現カセット、Ｘ２の発現カセット及びＸ３の発現カセットを含む。
　第１の発現ベクターが含む少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットは、サブユニットの種類ごとに１個でもよく２個以上でもよい。サブユニットＸが２種類以上の場合、第１の発現ベクターが含むサブユニットＸの発現カセットの個数は、サブユニットの種類間で同じでもよく異なっていてもよい。
　例えばサブユニットＸがＸ１、Ｘ２及びＸ３の３種類であるとき、第１の発現ベクターが含むＸ１の発現カセットの個数、Ｘ２の発現カセットの個数及びＸ３の発現カセットの個数は互いに独立であり、全部同じ個数でもよく、互いに異なる個数でもよい。
　第２の発現ベクターが含む少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットは、サブユニットの種類ごとに１個でもよく２個以上でもよい。サブユニットＸが２種類以上の場合、第２の発現ベクターが含むサブユニットＸの発現カセットの個数は、サブユニットの種類間で同じでもよく異なっていてもよい。
　例えばサブユニットＸがＸ１、Ｘ２及びＸ３の３種類であるとき、第２の発現ベクターが含むＸ１の発現カセットの個数、Ｘ２の発現カセットの個数及びＸ３の発現カセットの個数は互いに独立であり、全部同じ個数でもよく、互いに異なる個数でもよい。
　実施形態の一例として、第１の発現ベクターが少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットを種類ごとに１個ずつ含み、第２の発現ベクターが少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットを種類ごとに１個ずつ含む形態が挙げられる。
　少なくとも１種類のサブユニットＹの発現カセットは種類ごとに、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれる。少なくとも１種類のサブユニットＹは種類ごとに、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方から発現する。
　サブユニットＹが２種類以上の場合、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が、サブユニットＹの発現カセットの全部を含んでもよく、又は、第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとが、サブユニットＹの発現カセットをサブユニットの種類ごとに分けて含んでもよい。
　例えばサブユニットＹがＹ１、Ｙ２及びＹ３の３種類であるとき、
　第１の発現ベクターのみがＹ１の発現カセット、Ｙ２の発現カセット及びＹ３の発現カセットを含む形態；
　第１の発現ベクターがＹ１の発現カセットを含み、第２の発現ベクターがＹ２の発現カセット及びＹ３の発現カセットを含む形態；
　第１の発現ベクターがＹ２の発現カセットを含み、第２の発現ベクターがＹ１の発現カセット及びＹ３の発現カセットを含む形態；
　第１の発現ベクターがＹ３の発現カセットを含み、第２の発現ベクターがＹ１の発現カセット及びＹ２の発現カセットを含む形態；のいずれでもよい。
　第１の発現ベクターがサブユニットＹの発現カセットを含む場合、第１の発現ベクターが含む少なくとも１種類のサブユニットＹの発現カセットは、サブユニットの種類ごとに１個でもよく２個以上でもよい。第１の発現ベクターがサブユニットＹの発現カセットを２種類以上含む場合、第１の発現ベクターが含むサブユニットＹの発現カセットの個数は、サブユニットの種類間で同じでもよく異なっていてもよい。
　例えば第１の発現ベクターが含むサブユニットＹがＹ１、Ｙ２及びＹ３の３種類であるとき、第１の発現ベクターが含むＹ１の発現カセットの個数、Ｙ２の発現カセットの個数及びＹ３の発現カセットの個数は互いに独立であり、全部同じ個数でもよく、互いに異なる個数でもよい。
　第２の発現ベクターがサブユニットＹの発現カセットを含む場合、第２の発現ベクターが含む少なくとも１種類のサブユニットＹの発現カセットは、サブユニットの種類ごとに１個でもよく２個以上でもよい。第２の発現ベクターがサブユニットＹの発現カセットを２種類以上含む場合、第２の発現ベクターが含むサブユニットＹの発現カセットの個数は、サブユニットの種類間で同じでもよく異なっていてもよい。
　例えば第２の発現ベクターが含むサブユニットＹがＹ１、Ｙ２及びＹ３の３種類であるとき、第２の発現ベクターが含むＹ１の発現カセットの個数、Ｙ２の発現カセットの個数及びＹ３の発現カセットの個数は互いに独立であり、全部同じ個数でもよく、互いに異なる個数でもよい。
　実施形態の一例として、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がサブユニットＹの発現カセットを全種類１個ずつ含む形態が挙げられる。
　実施形態の別の一例として、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターがサブユニットＹの発現カセットを種類ごとに分けて各種類１個ずつ含む形態が挙げられる。
　ベクターセットの実施形態の一例として、少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方に含まれ、少なくとも１種類のサブユニットＹの発現カセットがすべて、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方に含まれるベクターセットが挙げられる。
　換言すると、上記ベクターセットは、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がサブユニットＸの発現カセットを含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がサブユニットＹの発現カセットを含む。
　ベクターセットの実施形態の一例として、第１の発現ベクターがサブユニットＸの発現カセットを全種類１個ずつ含み、第２の発現ベクターがサブユニットＸの発現カセットを全種類１個ずつ含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がサブユニットＹの発現カセットを全種類１個ずつ含むベクターセットが挙げられる。
　ベクターセットを利用する好ましい形態として、ヘテロ多量体タンパク質が抗体である形態が挙げられる。ベクターセットを利用するより好ましい形態として、ヘテロ多量体タンパク質がバイスペシフィック抗体である形態が挙げられる。
　ベクターセットを利用する好ましい形態として、ヘテロ多量体タンパク質が２種類以上６種類以下のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類、２種類又は３種類である形態が挙げられる。この形態には、例えば、
　ヘテロ多量体タンパク質が２種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態：
　ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が５種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が６種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が６種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが３種類である形態；などが含まれる。
　ベクターセットを利用するより好ましい形態として、ヘテロ多量体タンパク質が３種類、４種類又は５種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類又は２種類である形態が挙げられる。この形態には、例えば、
　ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が５種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；などが含まれる。
　ベクターセットを利用する更に好ましい形態として、ヘテロ多量体タンパク質が３種類又は４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類、２種類又は３種類である形態が挙げられる。この形態には、例えば、
　ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態：
　ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類である形態；
　ヘテロ多量体タンパク質が４種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが２種類である形態；などが含まれる。
　ベクターセットを利用する特に好ましい形態として、ヘテロ多量体タンパク質が３種類のサブユニットからなり、サブユニットＸが１種類又は２種類である形態が挙げられる。
　ベクターセットを利用する形態の一例として、ヘテロ多量体タンパク質が、第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体である形態が挙げられる。本形態においては、Ｌ鎖の発現量が第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖の合計発現量と同等以上であることが好ましい。また、本形態においては、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖の合計ｍＲＮＡ量と同等以上であることが好ましい。ｍＲＮＡ量は、後述のように、定量ＰＣＲで求められる。このバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの実施形態の一例として下記のベクターセットが挙げられる。
　第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセットを含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを含む、ベクターセット。
　上記のベクターセットの一例は、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを含む。
　上記のベクターセットの別の一例は、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを含み、他方が第２のＨ鎖の発現カセットを含む。
　第１のＨ鎖の発現量と第２のＨ鎖の発現量とを同等にするために、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを個数比１：１で含むことが好ましい。
　上記のバイスペシフィック抗体に係るベクターセットは、発現ベクターのサイズを小さくする観点から、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターがそれぞれＬ鎖の発現カセットを１個含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第１のＨ鎖の発現カセットを１個含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方が第２のＨ鎖の発現カセットを１個含むことが好ましい。
　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの好ましい形態として、第１の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、第１のＨ鎖の発現カセット及び第２のＨ鎖の発現カセットを１個ずつ含み、第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセットを１個含む形態が挙げられる。
　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体の一例は、１個の第１のＨ鎖と、１個の第２のＨ鎖と、２個のＬ鎖とが集合した４量体である。
　ベクターセットを利用する形態のさらなる一例として、ヘテロ多量体タンパク質が、Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体である形態が挙げられる。本形態においては、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現量が、Ｈ鎖の発現量に対して０．３倍以上であることが好ましく、０．５倍以上であることがより好ましい。また、本形態においては、ｓｃＦｖ－ＦｃのｍＲＮＡ量がＨ鎖のｍＲＮＡ量の０．３倍以上であることが好ましく、０．５倍以上であることがより好ましい。ｍＲＮＡ量は、後述のように、定量ＰＣＲで求められる。このバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの実施形態の一例として下記のベクターセットＡ及びＢが挙げられる。
　ベクターセットＡ：第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がＬ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含む、ベクターセット。
　ベクターセットＢ：第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの両方がｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含み、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＬ鎖の発現カセットを含む、ベクターセット。
　上記のベクターセットＢの一例は、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセット及びＬ鎖の発現カセットを含む。
　上記のベクターセットＢの別の一例は、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がＨ鎖の発現カセットを含み、他方がＬ鎖の発現カセットを含む。
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの好ましい形態として、第１の発現ベクターが、Ｈ鎖の発現カセット、Ｌ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを１個ずつ含み、第２の発現ベクターが、Ｌ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを１個ずつ含む形態が挙げられる。
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの別の好ましい形態として、第１の発現ベクターが、Ｈ鎖の発現カセット、Ｌ鎖の発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを１個ずつ含み、第２の発現ベクターが、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを１個含む形態が挙げられる。
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体の一例は、１個のＨ鎖と、１個のＬ鎖と、１個のｓｃＦｖ－Ｆｃとが集合した３量体である。
　発現ベクターを構築する基盤の核酸及び塩基配列は、限定されるものではない。発現ベクターを構築する基盤の核酸として、例えば、ウイルスベクター由来の核酸、非ウイルスベクター由来の核酸、及び人工の核酸が挙げられる。基盤の核酸は、環状の核酸でもよく、直鎖状の核酸でもよい。
　ウイルスベクター由来の核酸の例として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス又はバクテリオファージに由来する核酸が挙げられる。
　非ウイルスベクター由来の核酸の例として、プラスミドが挙げられる。
　発現ベクター及び発現カセットは、宿主細胞の種類に応じて、ポリペプチドの発現に必要な要素を含む。
　宿主細胞が原核細胞である場合、発現ベクターは、例えば、複製起点、制限酵素部位、転写ターミネータ、及びｃｅｒ安定化配列（cer stability sequence）等のプラスミド安定化座（plasmid stability locus）を含んでいてもよい。
　宿主細胞が酵母である場合、発現ベクターは、例えば、プロモーター、転写ターミネータ、選択マーカー及び複製起点を含んでいてもよい。
　宿主細胞が昆虫細胞である場合、発現ベクターは、例えば、プロモーター、転写ターミネータ及び選択マーカーを含んでいてもよい。
　宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、発現ベクターは、例えば、プロモーター、ポリアデニル化配列（例えば、ヒトβグロビンポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列、ＳＶ４０初期ポリＡ配列（SV40 early polyA）、ＳＶ４０後期ポリＡ配列（SV40 late polyA
））及び選択マーカーを含んでいてもよい。
　原核細胞に利用できるプロモーターには、J. Mol. Biol. 1986; 189(1): 113-30に開示されるプロモーター、ファージポリメラーゼプロモーター及び大腸菌ポリメラーゼプロモーターがある。具体的な例として、Ｔ７Ａ１、Ｔ７Ａ２、Ｔ７Ａ３、λｐＬ、λｐＲ、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｐｈｏＡ及びｒｒｎＢが挙げられる。
　酵母細胞に利用できるプロモーターの例として、ｇａｌプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター及びＧＡＬ１０プロモーターが挙げられる。
　昆虫細胞に利用できるプロモーターの例として、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、ウイルス感染初期発現タンパク質（ＩＥ－１）プロモーター、ＭＴプロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、熱ショックタンパク質プロモーター、ＯＰＩＥ２プロモーター及びアクチン５Ｃプロモーターが挙げられる。
　哺乳動物細胞に利用できるプロモーターの例として、ウイルス由来プロモーター及びハウスキーピング遺伝子由来プロモーターが挙げられる。ウイルス由来プロモーターの例として、ヒトＣＭＶプロモーター、ラットＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＲ－ＬＴＲプロモーター及びＨＳＫ－ＴＫプロモーターが挙げられる。ハウスキーピング遺伝子由来プロモーターの例として、ｈＥＦ－１αプロモーター、チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ｍＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞に利用できるプロモーターの好ましい例は、ＥＦ－１αプロモーターであり、より好ましくはｈＥＦ－１αプロモーターである。
　各サブユニットの発現カセットに含まれるプロモーターは、その種類において同じでもよく異なってもよい。実施形態の一例は、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む。実施形態の好ましい一例は、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがｈＥＦ－１αプロモーターを含む。
　サブユニットの発現カセットは、発現したポリペプチドの細胞外への輸送又は分泌を促進する目的で、分泌リーダーのコード配列を含むことが好ましい。分泌リーダーは、シグナルペプチドの１種であり、ポリペプチドの細胞外への輸送又は分泌を誘導するシグナルペプチドである。
　サブユニットの発現カセットが分泌リーダーのコード配列を含む場合、分泌リーダーのコード配列とサブユニットのコード配列とは同じ読み枠で配置されている。ここで「同じ読み枠で配置」とは、分泌リーダーとサブユニットとが一つのポリペプチドとして発現可能に両コード配列が配置されていることを意味する。サブユニットの発現カセットにおいて、分泌リーダーのコード配列とサブユニットのコード配列との間には、リンカー又はスペーサーのコード配列があってもよく、なくてもよい。
　好ましい形態は、サブユニットのコード配列が、分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている形態である。本形態の発現カセットから、サブユニットのＮ末端側に分泌リーダーが配置した組換えポリペプチドが発現する。より好ましい形態は、サブユニットのコード配列が、分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で連続して配置されている形態である。本形態の発現カセットから、サブユニットのＮ末端に分泌リーダーが結合した組換えポリペプチドが発現する。ここで「下流」とは２つのコード配列の配置順を意味し、コード配列Ａの転写の後にコード配列Ｂが転写されるように両コード配列が配置されているとき、コード配列Ｂがコード配列Ａの下流に配置されているという。
　組換えポリペプチドの分泌リーダーは、一般的には、組換えポリペプチドの輸送又は分泌の過程において、組換えポリペプチドから切断される。
　分泌リーダーの例として、フィブロネクチン分泌リーダー、コラーゲン分泌リーダー及びアルブミン分泌リーダーが挙げられる。組換えポリペプチドの細胞外への分泌率が高い観点から、フィブロネクチン分泌リーダーが好ましい。
　フィブロネクチン分泌リーダーの例として、両性類のフィブロネクチン分泌リーダー及び哺乳動物のフィブロネクチン分泌リーダーが挙げられる。両性類のフィブロネクチン分泌リーダーの例として、アフリカツメガエルのフィブロネクチン分泌リーダーが挙げられる。哺乳動物のフィブロネクチン分泌リーダーの例として、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ及びチャイニーズハムスターの各フィブロネクチン分泌リーダー並びにその機能的同等物が挙げられる。フィブロネクチン分泌リーダーの機能的同等物は、アミノ酸配列において７０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、更に好ましくは９０％以上の同一性、最も好ましくは９５％以上の同一性を有し、組換えポリペプチドを細胞外に分泌する機能を有する。アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ (Basic Local Alignment Search Tool)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を使用して算出する。
　宿主細胞の種類に応じてフィブロネクチン分泌リーダーの由来生物を選択することが好ましい。宿主細胞がヒト細胞の場合、ヒトフィブロネクチン分泌リーダーを発現カセットに利用することが好ましい。宿主細胞がラット細胞の場合、ラットフィブロネクチン分泌リーダーを発現カセットに利用することが好ましい。宿主細胞がＣＨＯ細胞の場合、チャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーを発現カセットに利用することが好ましい。
　フィブロネクチン分泌リーダーの実施形態例として、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトフィブロネクチン分泌リーダー及び配列番号２のアミノ酸配列を有するチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーが挙げられる。配列番号１のコード配列の一例が、配列番号３である。配列番号２のコード配列の一例が、配列番号４である。
配列番号１：ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＬＡＶＱＣＬＧＴＡＶＰＳＴＧＡ
配列番号２：ＭＬＲＧＰＧＰＧＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＡＶＲＣＴＥＡ
配列番号３：ＡＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＣＧＣＣ
配列番号４：ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣ
　実施形態の一例として、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む形態が挙げられる。
　宿主細胞がヒト細胞の場合、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがヒトフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含むことが好ましい。
　宿主細胞がＣＨＯ細胞の場合、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含むことが好ましい。
　実施形態の一例として、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む形態が挙げられる。
　宿主細胞がヒト細胞の場合、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがヒトフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含むことが好ましい。
　宿主細胞がＣＨＯ細胞の場合、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがチャイニーズハムスターフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含むことが好ましい。
　実施形態の好ましい一例において、ヘテロ多量体タンパク質のサブユニットの発現カセットは、互いに作動可能に連結された、ｈＥＦ－１αプロモーター、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列、サブユニットのコード配列及びポリＡ配列を含む。
　発現ベクターは、宿主細胞への発現ベクターの導入を確認する目的又は安定発現細胞を作出する目的で、選択マーカーの発現カセットを含むことが好ましい。
　本開示において選択マーカーは、発現ベクターが導入された細胞を選択するために機能するマーカーであり、発現ベクターに組み込まれた遺伝子及びその遺伝子によりコードされたタンパク質を意味する。
　選択マーカーの発現カセットは、その選択マーカーの発現に必要なすべての核酸を含む。選択マーカーの発現カセットのサイズ及び塩基配列は限定されるものではない。
　選択マーカーの例として、選択薬剤に対し耐性を示すタンパク質及びその遺伝子が挙げられる。選択薬剤の例として、酵素阻害剤及び抗生物質が挙げられる。
　選択薬剤が酵素阻害剤である例として、ＤＨＦＲ－ＭＴＸシステムがある。ＤＨＦＲ－ＭＴＸシステムは、選択薬剤がメトトレキサート（ＭＴＸ）であり、選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びその遺伝子である。ＤＨＦＲ－ＭＴＸシステムは、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損している宿主細胞（例えばＣＨＯ－ＤＧ４４細胞）において有効なシステムである。
　選択薬剤が酵素阻害剤である例として、ＧＳ－ＭＳＸシステムがある。ＧＳ－ＭＳＸシステムは、選択薬剤がメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）であり、選択マーカーがグルタミン合成酵素（ＧＳ）及びその遺伝子である。ＧＳ－ＭＳＸシステムは、ＧＳ遺伝子を欠損している宿主細胞（例えばＧＳノックアウトＣＨＯ細胞）において有効なシステムである。
　選択薬剤が抗生物質の場合、抗生物質の分解酵素及びその遺伝子である抗生物質耐性遺伝子が選択マーカーである。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
　ベクターセットの実施形態の一例は、第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットを含み、第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットを含み、第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーである。第１の選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである。第２の選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである。
　ベクターセットの実施形態の一例は、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクターの一方がジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子の発現カセットを含み、他方が抗生物質耐性遺伝子の発現カセットを含む。ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現カセットの好ましい一例は、ｍＰＧＫプロモーターを含む。グルタミン合成酵素遺伝子の発現カセットの好ましい一例は、ｍＰＧＫプロモーターを含む。抗生物質耐性遺伝子の発現カセットの好ましい一例は、ウイルス由来プロモーターを含む。
　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの実施形態の一例として下記のベクターセットが挙げられる。
　第１の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、第１のＨ鎖の発現カセット、第２のＨ鎖の発現カセット及び第１の選択マーカーの発現カセットを含み、第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット及び第２の選択マーカーの発現カセットを含む、ベクターセット。
　上記形態のベクターセットは、第１の発現ベクターから発現するサブユニット量を、第２の発現ベクターから発現するサブユニット量よりも多くする観点から、第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子であることが好ましい。より好ましい形態は、第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子であり、第２の選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である。ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子を含む発現ベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含む発現ベクターよりも、宿主細胞内でコピー数が増えやすい傾向がある。
　Ｈ鎖と、Ｌ鎖と、ｓｃＦｖ－Ｆｃとからなるバイスペシフィック抗体に係るベクターセットの実施形態の一例として下記のベクターセットが挙げられる。
　第１の発現ベクターがＨ鎖の発現カセット、Ｌ鎖の発現カセット、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット及び第１の選択マーカーの発現カセットを含み、第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット及び第２の選択マーカーの発現カセットを含む、ベクターセット。
　第１の発現ベクターがＨ鎖の発現カセット、Ｌ鎖の発現カセット、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット及び第１の選択マーカーの発現カセットを含み、第２の発現ベクターがｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット及び第２の選択マーカーの発現カセットを含む、ベクターセット。
　第１の発現ベクターがＨ鎖の発現カセット、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット及び第１の発現マーカーの発現カセットを含み、第２の発現ベクターがＬ鎖の発現カセット、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット及び第２の選択マーカーの発現カセットを含む、ベクターセット。
　上記形態のベクターセットにおける第１の選択マーカー及び第２の選択マーカーの好ましい態様は、第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体に係るベクターセットと同様である。
　本開示の実施形態は、ベクターセット（つまり、第１の発現ベクター及び第２の発現ベクター）以外の第３の発現ベクターを利用することを排除しない。第３の発現ベクターは、例えば、宿主細胞の生育又は代謝に必要なポリペプチドを発現するために利用されてもよい。
　本開示の実施形態の一つは、ベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞である。ベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞は、ヘテロ多量体タンパク質の一過性発現細胞でもよく安定発現細胞でもよく、安定発現細胞であることが好ましい。
　本開示の実施形態の一つは、ベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞である。具体的な例として、ベクターセットでトランスフェクトされた、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、及びこれらの細胞に由来する株化細胞が挙げられる。ベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、ヘテロ多量体タンパク質の一過性発現細胞でもよく安定発現細胞でもよく、安定発現細胞であることが好ましい。
　ヘテロ多量体タンパク質が、第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、第１のＨ鎖及び第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体であるとき、ベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞は、Ｌ鎖の発現カセットのコピー数が、第１のＨ鎖の発現カセットのコピー数と第２のＨ鎖の発現カセットのコピー数との合計よりも多い細胞であることが好ましい。このことによって、バイスペシフィック抗体の発現量及び／又は純度が上がる。
　定量ＰＣＲ（quantitative polymerase chain reaction）によって測定されるｍＲＮＡ量は、細胞内に存在する発現カセットのコピー数の多寡の予測に役立つ。上記のバイスペシフィック抗体に係るベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞において、定量ＰＣＲによって測定されるｍＲＮＡ量は、第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．５～２であり、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が２～１０であることが好ましい。上記のバイスペシフィック抗体に係るベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞において、定量ＰＣＲによって測定されるｍＲＮＡ量は、第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．６２５～１．６であり、Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が３～８であることがより好ましい。
　ベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞は、ヘテロ多量体タンパク質を発現する細胞であり、ヘテロ多量体タンパク質の製造に用いることができる。ベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞及びＣＨＯ細胞は、哺乳動物に投与、輸注又は移植する利用も可能である。
　本開示の実施形態の一つは、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法である。ヘテロ多量体タンパク質の製造方法は、ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を培養することを含む。細胞を培養することによって、ヘテロ多量体タンパク質が細胞内で生産され、培養液及び／又は細胞にヘテロ多量体タンパク質が蓄積する。
　ヘテロ多量体タンパク質の製造方法に使用する細胞は、本開示の実施形態の一つである細胞の作出方法によって作出された細胞である。この細胞は、ヘテロ多量体タンパク質に係る評価基準及び／又は相対的な生産性能に従い選ばれた細胞であるので、ヘテロ多量体タンパク質の生産性に優れる。
　ヘテロ多量体タンパク質を生産するための細胞の培養方法及び培地組成は、宿主細胞の種類に応じて選択すればよい。培養条件（例えば、培養スケール、細胞密度、温度及びＣＯ２濃度）も、宿主細胞の種類に応じて選択すればよい。
　ヘテロ多量体タンパク質の製造方法の実施形態の一例は、培養液からヘテロ多量体タンパク質を回収することを含む。培養液からヘテロ多量体タンパク質を回収する方法として、例えば、遠心分離、濾過、透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。回収されたヘテロ多量体タンパク質は、例えば、医薬組成物の製造に使用される。
　ヘテロ多量体タンパク質の製造方法の実施形態の一例は、ヘテロ多量体タンパク質が蓄積した細胞を培地から回収することを含む。培地から細胞を回収する方法として、例えば、遠心分離及び濾過が挙げられる。ヘテロ多量体タンパク質は、その性質にしたがって細胞の内部又は表面に蓄積する。回収された細胞は、例えば、哺乳動物に投与、輸注又は移植される。
　本開示の実施形態の一つは、細胞プールの作出方法である。細胞プールの作出方法は、ベクターセットを宿主細胞に導入することを含む。作出された細胞プールは、ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞の選抜に供される。本開示において細胞プールは、各サブユニットの発現カセットのコピー数において多様性を有する細胞の集団を意味する。
　細胞プールの規模は、制限されるものではないが、例えば１０種類～１万種類のクローンを含む。
　細胞プールの作出方法に用いる宿主細胞としては、真核細胞が好ましく、哺乳動物細胞がより好ましく、ＣＨＯ細胞が更に好ましい。ＣＨＯ細胞の例として、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、及びこれらの細胞に由来する株化細胞が挙げられる。
　細胞プールに含まれる細胞は、ヘテロ多量体タンパク質の一過性発現細胞でもよく安定発現細胞でもよく、安定発現細胞であることが好ましい。
　細胞プールは、細胞を培養して維持してもよく、細胞を凍結して保存してもよい。
　以下に具体例を挙げて、ヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞の作出方法及びベクターセットをより具体的に説明する。以下の具体例に示す材料、処理手順等は、本開示の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。本開示のベクターセット等の範囲は、以下に示す具体例によって限定的に解釈されるべきではない。
　なお、実施例１及び実施例２において作出したバイスペシフィック抗体（ＢｉＡｂ１及びＢｉＡｂ２）の構成を図５に示す。
≪実施例１≫
＜発現ベクターの構築＞
　互いに異なるアミノ酸配列を有する２種類のＨ鎖と、２種類のＨ鎖に共通する１種類のＬ鎖とからなる４量体バイスペシフィック抗体を発現するための発現ベクター１及び発現ベクター２を構築した。
　以下、上記のバイスペシフィック抗体を「ＢｉＡｂ１」といい、２種類のＨ鎖をそれぞれ「ＨＣ１」及び「ＨＣ２」といい、１種類のＬ鎖を「共通ＬＣ」という。ＨＣ１、ＨＣ２及び共通ＬＣをまとめて「抗体サブユニット」という。
　図１が発現ベクター１のベクターマップである。発現ベクター１は、ＨＣ１の発現カセット１個、ＨＣ２の発現カセット１個、共通ＬＣの発現カセット１個、及び、ＤＨＦＲ遺伝子の発現カセット１個を含むベクターである。抗体サブユニットの発現カセットはそれぞれ、ｈＥＦ－１αプロモーター、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列、抗体サブユニットのコード配列及びポリＡ配列を含み、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に連続して同じ読み枠で抗体サブユニットのコード配列が配置されている。
　図２が発現ベクター２のベクターマップである。発現ベクター２は、共通ＬＣの発現カセット１個、及び、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセット１個を含むベクターである。共通ＬＣの発現カセットは、ｈＥＦ－１αプロモーター、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列、共通ＬＣのコード配列及びポリＡ配列を含み、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に連続して同じ読み枠で共通ＬＣのコード配列が配置されている。
＜発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入＞
　ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に、エレクトロポレーション法によって、発現ベクター１のみ、又は、発現ベクター１及び発現ベクター２を導入した。
　発現ベクターを導入したＣＨＯ－ＤＧ４４細胞を、ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Lifetechnologies、12681011）１０ｍＬに播種し、温度３７℃且つＣＯ２５％（ｖ／ｖ）雰囲気下で静置培養した。
　発現ベクターを導入して１日後、発現ベクター１のみを導入したＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に選択薬剤としてメトトレキサートを添加し、発現ベクター１及び発現ベクター２を導入したＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に選択薬剤としてメトトレキサートとハイグロマイシンＢを同時に添加した。
　発現ベクターを導入して１４日後、培養体積を２０ｍＬに拡大し、振とう培養用１２５ｍＬフラスコに移し、振とう培養した。
＜ＢｉＡｂ１生産細胞の選択＞
　振とう培養した細胞を、ドロップレットセルソーターを用いて９６ウェルプレートに１ウェルあたり１細胞分注し、温度３７℃且つＣＯ２１０％（ｖ／ｖ）雰囲気下で静置培養した。１４日間培養後、培養上清を回収し、分子間相互作用解析装置Ｏｃｔｅｔ　Ｑｋｅ（Sartorius）を用いて抗体濃度を測定した。抗体濃度が上位のクローンを選択し、２４ウェルプレートで培養し、次いでバイオリアクターチューブで培養し、スケールアップを行った。こうして、ＢｉＡｂ１を生産する細胞を作出した。
　発現ベクター１のみの導入によって作出したＢｉＡｂ１生産細胞を、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞という。発現ベクター１及び発現ベクター２の導入によって作出したＢｉＡｂ１生産細胞を、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞という。
＜ＢｉＡｂ１の生産＞
　ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞及びＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞をそれぞれ、基礎培地４０ｍＬに懸濁し、振とう培養用１２５ｍＬフラスコに移し、温度３７℃且つＣＯ２５％（ｖ／ｖ）雰囲気下、速度１４０ｒｐｍで振とう培養及びフィードを行った。培養開始３日目から１３日目まで毎日、フィード培地を一定量加えた。１～３日おきにサンプリングし、細胞密度、培養液成分及び抗体濃度を測定した。培養開始１４日目に培養液を回収し、デプスフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて細胞と細胞デブリを除き、培養上清を得た。
　培養上清中の抗体濃度を、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いた液体クロマトグラフィーによって測定した。ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いて培養上清から抗体を精製し、ｉｃＩＥＦ分析装置Ｍａｕｒｉｃｅ（Protein Simple）を用いて、ＢｉＡｂ１の定量及びミスペア抗体（Ｈ鎖がＨＣ１のみの抗体及びＨ鎖がＨＣ２のみの抗体）の定量を行い、ＢｉＡｂ１の純度を求めた。ここで純度とは、ＢｉＡｂ１／（ＢｉＡｂ１＋ミスペア抗体）×１００（％）である。表１に、抗体濃度が最上位のクローンについての測定結果を示す。
　各クローンにおける抗体サブユニットのｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲによって測定した。表２に、抗体濃度が最上位のクローンについての測定結果を示す。表２に示す数値は、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞におけるＨＣ１のｍＲＮＡ量を１としたときの相対値である。
　表１に示すとおり、両細胞においてＢｉＡｂ１の純度は７５％（４分の３）を超えていた。ＨＣ１の発現カセットとＨＣ２の発現カセットは発現ベクター１に１個ずつ含まれているので、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞及びＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞は、ＨＣ１の発現カセットとＨＣ２の発現カセットを個数比１：１で保有していると考えられる。ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞及びＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞において、ＨＣ１の発現量とＨＣ２の発現量が同程度であり、ミスペア抗体が生じにくいと推測される。
　ＢｉＡｂ１量は、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞が２．６ｇ／Ｌであり、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞が４．７ｇ／Ｌであり、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞がＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞の１．８倍であった。
　表２に示すとおり、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞において、共通ＬＣのｍＲＮＡ量は、ＨＣ１のｍＲＮＡ量の２．１倍であり、ＨＣ２のｍＲＮＡ量の２．６倍であった。
　ＨＣ１の発現カセット、ＨＣ２の発現カセット及び共通ＬＣの発現カセットは発現ベクター１に１個ずつ含まれているので、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞は、ＨＣ１の発現カセットとＨＣ２の発現カセットと共通ＬＣの発現カセットを個数比１：１：１で保有していると考えられる。サブユニット間のｍＲＮＡ量の差は、それぞれの発現カセットの転写効率の差によるものと推測される。
　ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞においては、共通ＬＣのｍＲＮＡ量が、ＨＣ１のｍＲＮＡ量の５．６倍であり、ＨＣ２のｍＲＮＡ量の８．９倍であった。ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞は、共通ＬＣの発現カセットをＨＣ１の発現カセット及びＨＣ２の発現カセットよりも多く保有していると考えられる。これは、宿主細胞に発現ベクター１と発現ベクター２とを両方導入した結果と考えられる。
　ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞においては、共通ＬＣのｍＲＮＡ量が、ＨＣ１及びＨＣ２の合計ｍＲＮＡ量の３．４倍であった。単純に予測すれば、共通ＬＣの発現量はＨＣ１及びＨＣ２の合計発現量で足りるのだから、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞においては共通ＬＣの発現量が過剰と言える（理論的な必要量の３倍以上である。）。共通ＬＣの発現量が過剰であることが、ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ／ＳＧＶ細胞におけるＢｉＡｂ１量の増加（ＢｉＡｂ１－ＴＧＶ細胞の１．８倍）に寄与したものと推測される。
　発現ベクター１及び発現ベクター２のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から、ＢｉＡｂ１の発現量及び純度の高いＣＨＯ細胞を選択して、ＢｉＡｂ１の生産性に優れるＣＨＯ細胞を作出することができた。
≪実施例２≫
＜発現ベクターの構築＞
　１種類のＨ鎖と、Ｈ鎖に対合する１種類のＬ鎖と、１種類の一本鎖抗体ｓｃＦｖ－Ｆｃからなる３量体バイスペシフィック抗体を発現するための発現ベクター３及び発現ベクター４を構築した。
　以下、上記のバイスペシフィック抗体を「ＢｉＡｂ２」といい、１種類のＨ鎖を「ＨＣ」、１種類のＬ鎖を「ＬＣ」、１種類の一本鎖抗体を「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」という。ＨＣ、ＬＣ及びｓｃＦｖ－Ｆｃをまとめて「抗体サブユニット」という。
　図３が発現ベクター３のベクターマップである。発現ベクター３は、ＨＣの発現カセット１個、ＬＣの発現カセット１個、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット１個、及び、ＤＨＦＲ遺伝子の発現カセット１個を含むベクターである。抗体サブユニットの発現カセットはそれぞれ、ｈＥＦ－１αプロモーター、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列、抗体サブユニットのコード配列及びポリＡ配列を含み、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に連続して同じ読み枠で抗体サブユニットのコード配列が配置されている。
　図４が発現ベクター４のベクターマップである。発現ベクター４は、ＬＣの発現カセット１個、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセット１個、及びハイグロマイシン耐性遺伝子の発現カセット１個を含むベクターである。ＬＣの発現カセットは、ｈＥＦ－１αプロモーター、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列、ＬＣのコード配列及びポリＡ配列を含み、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に連続して同じ読み枠でＬＣのコード配列が配置されている。ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットは、ｈＥＦ－１αプロモーター、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列、ｓｃＦｖ－Ｆｃのコード配列及びポリＡ配列を含み、フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に連続して同じ読み枠でｓｃＦｖ－Ｆｃのコード配列が配置されている。
＜発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入＞
　ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に、エレクトロポレーション法によって、発現ベクター３のみ、又は、発現ベクター３及び発現ベクター４を導入した。
　発現ベクターを導入したＣＨＯ－ＤＧ４４細胞を、ＯｐｔｉＣＨＯ培地（Lifetechnologies、12681011）１０ｍＬに播種し、温度３７℃且つＣＯ２５％（ｖ／ｖ）雰囲気下で静置培養した。
　発現ベクターを導入して１日後、発現ベクター３及び発現ベクター４を導入したＣＨＯ－ＤＧ４４細胞に選択薬剤としてメトトレキサートとハイグロマイシンＢを同時に添加した。
　発現ベクターを導入して１４日後、培養体積を２０ｍＬに拡大し、振とう培養用１２５ｍＬフラスコに移し、振とう培養した。
　発現ベクター３のみの導入によって作出したＢｉＡｂ２生産細胞を、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞という。発現ベクター３及び発現ベクター４の導入によって作出したＢｉＡｂ２生産細胞を、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞という。
＜ＢｉＡｂ２の生産＞
　ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞及びＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞をそれぞれ、基礎培地４０ｍＬに懸濁し、振とう培養用１２５ｍＬフラスコに移し、温度３７℃且つＣＯ２５％（ｖ／ｖ）雰囲気下、速度１４０ｒｐｍで振とう培養及びフィードを行った。培養開始３日目から１３日目まで毎日、フィード培地を一定量加えた。１～３日おきにサンプリングし、細胞密度、培養液成分及び抗体濃度を測定した。培養開始１４日目に培養液を回収し、デプスフィルター（ポアサイズ０．２２μｍ）を用いて細胞と細胞デブリを除き、培養上清を得た。
　培養上清中の抗体濃度を、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いた液体クロマトグラフィーによって測定した。ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いて培養上清から抗体を精製し、キャピラリー電気泳動分析装置ＰＡ８００ｐｌｕｓ（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ）を用いて、ＢｉＡｂ２の定量及びミスペア抗体（ＨＣとｓｃＦｖ－Ｆｃが対になっていない抗体）の定量を行い、ＢｉＡｂ２の純度を求めた。ここで純度とは、ＢｉＡｂ２／（ＢｉＡｂ２＋ミスペア抗体）×１００（％）である。表３に、それぞれの細胞の生産性を示す。
　各ＢｉＡｂ２生産細胞における抗体サブユニットのｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲによって測定した。表４に、それぞれの細胞についての測定結果を示す。表４に示す数値は、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞におけるＨＣ遺伝子のｍＲＮＡ量を１としたときの相対値である。
　表３に示すとおり、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞においてＢｉＡｂ２の純度は５１％だったのに対し、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞においては純度が９５％となり、純度が大幅に改善された。ＨＣの発現カセットとｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットは発現ベクター３に１個ずつ含まれているので、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞及びＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞は、ＨＣの発現カセットとｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを個数比１：１で保有していると考えられる。しかしながら、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞に比べＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞の純度が大幅に改善していることから、ＨＣとｓｃＦｖ－Ｆｃのコピー数あたりの発現量が異なっており、それにより、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞では、生成されるＢｉＡｂ２の純度が低下していることが推測される。
　ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞においては、目的ＢｉＡｂの濃度が１．０ｇ／Ｌであるのに対し、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞においては目的ＢｉＡｂの濃度が１．７ｇ／Ｌであった。
　表４に示すとおり、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶにおいて、ＬＣのｍＲＮＡ量は、ＨＣのｍＲＮＡ量の２．１倍であり、ｓｃＦｖ－ＦｃのｍＲＮＡ量はＨＣのｍＲＮＡ量の０．２倍であった。
　ＨＣの発現カセット、ＬＣの発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットは発現ベクター１に１個ずつ含まれているので、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞は、ＨＣの発現カセット、ＬＣの発現カセット及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットを個数比１：１：１で保有していると考えられる。サブユニット間のｍＲＮＡ量の差は、それぞれの発現カセットの転写効率の差によるものと推測され、特にｓｃＦｖ－ＦｃはＨＣやＬＣに比べ転写効率が著しく低いものであることが見出された。
　ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞においては、ＬＣのｍＲＮＡ量が、ＨＣのｍＲＮＡ量の４倍であり、ｓｃＦｖ－ＦｃのｍＲＮＡ量はＨＣのｍＲＮＡ量の約０．５倍であった。ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞は、ＬＣ及びｓｃＦｖ－Ｆｃの発現カセットをＨＣの発現カセットよりも多く保有していると考えられる。これは、宿主細胞に発現ベクター３と発現ベクター４とを両方導入した結果と考えられる。
　ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ／ＤＧＶ細胞においては、ＢｉＡｂ２－ＴＧＶ細胞に対しＨＣの発現量が０．７倍であるにもかかわらず、目的ＢｉＡｂ２の生産量が高くなっている。これは、ｓｃＦｖ－Ｆｃの発現量が改善したことにより、ＨＣ－ＬＣホモダイマー量が減り、正しいペアでのＢｉＡｂ２が形成されたことによると考えられる。
　これらの結果から、転写効率が相対的に低く、発現量が不足している遺伝子を含むベクターを追加で導入することにより、発現バランスを改善し、ＢｉＡｂの生産性及び純度を向上することができた。
　発現ベクター３及び発現ベクター４のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から、ＢｉＡｂ２の発現量及び純度の高いＣＨＯ細胞を選択して、ＢｉＡｂ２の生産性に優れるＣＨＯ細胞を作出することができた。
　２０２２年６月１０日に出願された日本国特許出願第２０２２－０９４５７７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (64)

  1. 　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を作出する方法であり（ｎは２以上の整数である。）、
    　下記のベクターセットを宿主細胞に導入することと、
    　前記ベクターセットを導入した宿主細胞からヘテロ多量体タンパク質を生産する細胞を選ぶことと、を含む、
    　細胞の作出方法：
    　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
    　前記ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの両方に含まれ、
    　前記ｎ種類のサブユニットから前記サブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットが種類ごとに、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方に含まれる、
    　ベクターセット。
  2. 　前記ベクターセットが下記のベクターセットである、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法：
    　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
    　前記ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの両方に含まれ、
    　前記ｎ種類のサブユニットから前記サブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットがすべて、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方に含まれる、
    　ベクターセット。
  3. 　前記ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、２種類以上６種類以下のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
    　前記少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  4. 　前記ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類又は４種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
    　前記少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  5. 　前記ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
    　前記少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類又は２種類のサブユニットＸである、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  6. 　前記ヘテロ多量体タンパク質が抗体である、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  7. 　前記ヘテロ多量体タンパク質がバイスペシフィック抗体である、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  8. 　前記ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  9. 　前記プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
    　請求項８に記載の細胞の作出方法。
  10. 　前記ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  11. 　前記ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  12. 　前記第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
    　前記第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  13. 　前記第１の選択マーカーと前記第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
    　前記第１の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
    　前記第２の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、
    　請求項１２に記載の細胞の作出方法。
  14. 　前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  15. 　前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  16. 　前記宿主細胞が、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、又はこれらの細胞に由来する株化細胞である、
    　請求項１に記載の細胞の作出方法。
  17. 　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、前記第１のＨ鎖及び前記第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体を生産する細胞を作出する方法であり、
    　下記のベクターセットを宿主細胞に導入することと、
    　前記ベクターセットを導入した宿主細胞からバイスペシフィック抗体を生産する細胞を選ぶことと、を含む、
    　細胞の作出方法：
    　ベクターセット：第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの両方が前記Ｌ鎖の発現カセットを含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第１のＨ鎖の発現カセットを含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
    　ベクターセット。
  18. 　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターがそれぞれ前記Ｌ鎖の発現カセットを１個含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第１のＨ鎖の発現カセットを１個含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第２のＨ鎖の発現カセットを１個含む、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  19. 　前記バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  20. 　前記プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
    　請求項１９に記載の細胞の作出方法。
  21. 　前記バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  22. 　前記バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  23. 　前記第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
    　前記第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  24. 　前記第１の発現ベクターが前記Ｌ鎖の発現カセット、前記第１のＨ鎖の発現カセット、前記第２のＨ鎖の発現カセット及び前記第１の選択マーカーの発現カセットを含み、
    　前記第２の発現ベクターが前記Ｌ鎖の発現カセット及び前記第２の選択マーカーの発現カセットを含む、
    　請求項２３に記載の細胞の作出方法。
  25. 　前記第１の選択マーカーと前記第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
    　前記第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺
    伝子である、
    　請求項２４に記載の細胞の作出方法。
  26. 　前記第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子であり、
    　前記第２の選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、
    　請求項２４に記載の細胞の作出方法。
  27. 　前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  28. 　前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  29. 　前記宿主細胞が、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、又はこれらの細胞に由来する株化細胞である、
    　請求項１７に記載の細胞の作出方法。
  30. 　請求項１～請求項１６のいずれか１項に記載の細胞の作出方法によって作出された細胞を培養することを含む、
    　ヘテロ多量体タンパク質の製造方法。
  31. 　請求項１７～請求項２９のいずれか１項に記載の細胞の作出方法によって作出された細胞を培養することを含む、
    　バイスペシフィック抗体の製造方法。
  32. 　ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質を発現するベクターセットであり（ｎは２以上の整数である。）、
    　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
    　前記ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの両方に含まれ、
    　前記ｎ種類のサブユニットから前記サブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットが種類ごとに、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方に含まれる、
    　ベクターセット。
  33. 　前記第１の発現ベクターと前記第２の発現ベクターとのセットであり、
    　前記ｎ種類のサブユニットの一部である少なくとも１種類のサブユニットＸの発現カセットが、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの両方に含まれ、
    　前記ｎ種類のサブユニットから前記サブユニットＸを除いた残りのサブユニットＹの発現カセットがすべて、前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方に含まれる、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  34. 　前記ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、２種類以上６種類以下のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
    　前記少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  35. 　前記ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類又は４種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
    　前記少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類、２種類又は３種類のサブユニットＸである、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  36. 　前記ｎ種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質が、３種類のサブユニットからなるヘテロ多量体タンパク質であり、
    　前記少なくとも１種類のサブユニットＸが、１種類又は２種類のサブユニットＸである、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  37. 　前記ヘテロ多量体タンパク質が抗体である、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  38. 　前記ヘテロ多量体タンパク質がバイスペシフィック抗体である、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  39. 　前記ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  40. 　前記プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
    　請求項３９に記載のベクターセット。
  41. 　前記ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  42. 　前記ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　ヘテロ多量体タンパク質を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  43. 　前記第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
    　前記第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
    　請求項３２に記載のベクターセット。
  44. 　前記第１の選択マーカーと前記第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
    　前記第１の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つであり、
    　前記第２の選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つである、
    　請求項４３に記載のベクターセット。
  45. 　第１のＨ鎖と、第２のＨ鎖と、前記第１のＨ鎖及び前記第２のＨ鎖に共通するＬ鎖とからなるバイスペシフィック抗体を発現するベクターセットであり、
    　第１の発現ベクターと第２の発現ベクターとのセットであり、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの両方が前記Ｌ鎖の発現カセットを含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第１のＨ鎖の発現カセットを含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第２のＨ鎖の発現カセットを含む、
    　ベクターセット。
  46. 　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターがそれぞれ前記Ｌ鎖の発現カセットを１個含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第１のＨ鎖の発現カセットを１個含み、
    　前記第１の発現ベクター及び前記第２の発現ベクターの一方が前記第２のＨ鎖の発現カセットを１個含む、
    　請求項４５に記載のベクターセット。
  47. 　前記バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてが同種類のプロモーターを含む、
    　請求項４５に記載のベクターセット。
  48. 　前記プロモーターがｈＥＦ－１αプロモーターである、
    　請求項４７に記載のベクターセット。
  49. 　前記バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットの少なくとも１つがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含む発現カセットにおいて、バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項４５に記載のベクターセット。
  50. 　前記バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットの発現カセットのすべてがフィブロネクチン分泌リーダーのコード配列を含み、
    　バイスペシフィック抗体を構成するサブユニットのコード配列が、前記フィブロネクチン分泌リーダーのコード配列の下流に同じ読み枠で配置されている、
    　請求項４５に記載のベクターセット。
  51. 　前記第１の発現ベクターが第１の選択マーカーの発現カセットをさらに含み、
    　前記第２の発現ベクターが第２の選択マーカーの発現カセットをさらに含む、
    　請求項４５に記載のベクターセット。
  52. 　前記第１の発現ベクターが前記Ｌ鎖の発現カセット、前記第１のＨ鎖の発現カセット、前記第２のＨ鎖の発現カセット及び前記第１の選択マーカーの発現カセットを含み、
    　前記第２の発現ベクターが前記Ｌ鎖の発現カセット及び前記第２の選択マーカーの発現カセットを含む、
    　請求項５１に記載のベクターセット。
  53. 　前記第１の選択マーカーと前記第２の選択マーカーとが互いに異なる種類の選択マーカーであり、
    　前記第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子である、
    　請求項５２に記載のベクターセット。
  54. 　前記第１の選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又はグルタミン合成酵素遺伝子であり、
    　前記第２の選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、
    　請求項５２に記載のベクターセット。
  55. 　請求項３２～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
  56. 　請求項３２～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞。
  57. 　請求項４５～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞であり、
    　前記第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、前記第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．５～２であり、前記Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が２～１０である、
    　哺乳動物細胞。
  58. 　請求項４５～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされた哺乳動物細胞であり、
    　前記第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、前記第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．６２５～１．６であり、前記Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が３～８である、
    　哺乳動物細胞。
  59. 　請求項４５～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり、
    　前記第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、前記第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．５～２であり、前記Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が２～１０である、
    　ＣＨＯ細胞。
  60. 　請求項４５～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞であり、
    　前記第１のＨ鎖のｍＲＮＡ量を１としたとき、前記第２のＨ鎖のｍＲＮＡ量が０．６２５～１．６であり、前記Ｌ鎖のｍＲＮＡ量が３～８である、
    　ＣＨＯ細胞。
  61. 　請求項３２～請求項５４のいずれか１項に記載のベクターセットを宿主細胞に導入することを含む、
    　細胞プールの作出方法。
  62. 　前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、
    　請求項６１に記載の細胞プールの作出方法。
  63. 　前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、
    　請求項６１に記載の細胞プールの作出方法。
  64. 　前記宿主細胞が、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯｐｒｏ３－細胞、又はこれらの細胞に由来する株化細胞である、
    　請求項６１に記載の細胞プールの作出方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20100027352A (ko) * 2008-09-02 2010-03-11 한국생명공학연구원 외래단백질을 고효율로 생산하는 리더서열
JP2016517691A (ja) * 2013-05-03 2016-06-20 フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ ・ユーケイ・リミテッド 発現方法
JP2019515666A (ja) * 2016-04-20 2019-06-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 発現強化座位の使用に基づいた抗体を作製するための組成物および方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100027352A (ko) * 2008-09-02 2010-03-11 한국생명공학연구원 외래단백질을 고효율로 생산하는 리더서열
JP2016517691A (ja) * 2013-05-03 2016-06-20 フジフィルム・ダイオシンス・バイオテクノロジーズ ・ユーケイ・リミテッド 発現方法
JP2019515666A (ja) * 2016-04-20 2019-06-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 発現強化座位の使用に基づいた抗体を作製するための組成物および方法

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