JP6087148B2 - タンパク質の生産方法 - Google Patents
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Description
1.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞を得て、且つ該哺乳動物細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法。
2.以下の工程(A)〜(C)を含むことを特徴とする、目的タンパク質を生産する方法。
(A)以下の発現ベクター(a)および(b)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター
(b)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
(B)工程(A)で浮遊性の哺乳動物細胞に導入した発現ベクター(b)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
(C)工程(B)で得られた目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
3.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞を得る方法。
4.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターの少なくとも1つが、目的タンパク質をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターである、前項1〜3のいずれか1に記載の方法。
5.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターに加えて、さらに選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターを哺乳動物細胞に導入する前項1〜4のいずれか1に記載の方法。
6.目的タンパク質をコードするDNAが抗体をコードするDNAである前項1〜5のいずれか1に記載の方法。
7.抗体をコードするDNAが、抗体のH鎖をコードするDNAおよび抗体のL鎖をコードするDNAの少なくとも一方である前項6に記載の方法。
8.下記(a)〜(d)から選ばれる発現ベクターを浮遊性の哺乳動物細胞に導入する、前項4〜7のいずれか1に記載の方法。
(a)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(b)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(c)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(d)抗体のH鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
9.浮遊性の哺乳動物細胞が、無血清培養で生存および増殖可能な細胞である、前項1〜8のいずれか1に記載の方法。
10.浮遊性の哺乳動物細胞が、CHO細胞を浮遊培養に馴化した浮遊性のCHO細胞、PER.C6細胞、ラットミエローマ細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(またはYB2/0ともいう)および浮遊培養に馴化した浮遊性のマウスミエローマ細胞NS0から選ばれるいずれか1つの細胞である前項1〜9のいずれか1に記載の方法。
11.CHO細胞がCHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である前項10に記載の方法。
12.選択マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性遺伝子である前項4〜11のいずれか1に記載の方法。
13.シクロヘキシミド耐性遺伝子がリボソームタンパク質である前項12に記載の方法。
14.一対のトランスポゾン配列が哺乳動物細胞で機能する一対のDNA型トランスポゾン由来の塩基配列である前項1〜13のいずれか1に記載の方法。
15.一対のDNA型トランスポゾン由来の塩基配列が、一対のTol1トランスポゾン由来の塩基配列またはTol2トランスポゾン由来の塩基配列である前項14に記載の方法。
16.一対のTol2トランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号2で表される塩基配列および配列番号3で表される塩基配列である前項15に記載の方法。
17.一対のTol1トランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号14で表される塩基配列および配列番号15で表される塩基配列である前項15に記載の方法。
18.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター(a)、および該トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース(転移酵素)をコードするDNAを含む発現ベクター(b)を同時に導入されることで、該一対のトランスポゾン配列の間に挿入された該遺伝子断片が染色体に組込まれ、且つ該目的タンパク質を生産する浮遊性の哺乳動物細胞。
19.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター(a)が、目的タンパク質をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターである、前項18に記載の哺乳動物細胞。
20.発現ベクター(a)および(b)に加えて、さらに選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター(c)を哺乳動物細胞に導入された細胞である、前項18または19に記載の哺乳動物細胞。
21.目的タンパク質をコードするDNAが抗体をコードするDNAである前項18〜20のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
22.抗体をコードするDNAが、抗体のH鎖をコードするDNAおよび抗体のL鎖をコードするDNAの少なくとも一方である前項21に記載の哺乳動物細胞。
23.下記(a)〜(d)から選ばれる発現ベクターを導入された、前項18〜22のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
(a)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(b)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(c)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(d)抗体のH鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
24.無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性の哺乳動物細胞である、前項18〜23のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
25.CHO細胞を浮遊培養に馴化した浮遊性のCHO細胞、PER.C6細胞、ラットミエローマ細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(またはYB2/0ともいう)および浮遊培養に馴化した浮遊性のマウスミエローマ細胞NS0から選ばれるいずれか1つの浮遊性の哺乳動物細胞である前項18〜24のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
26.CHO細胞がCHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である前項25に記載の哺乳動物細胞。
27.選択マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性遺伝子である前項19〜26のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
28.シクロヘキシミド耐性遺伝子がヒトリボソームタンパク質の変異体をコードする遺伝子である前項27に記載の哺乳動物細胞。
29.一対のトランスポゾン配列が哺乳動物細胞で機能する一対のDNA型トランスポゾン由来の塩基配列である前項19〜28のいずれか1に記載の哺乳動物細胞。
30.一対のDNA型トランスポゾン由来の塩基配列が、一対のTol1トランスポゾン由来の塩基配列またはTol2トランスポゾン由来の塩基配列である前項29に記載の哺乳動物細胞。
31.一対のTol2トランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号2で表される塩基配列および配列番号3で表される塩基配列である前項30に記載の哺乳動物細胞。
32.一対のTol1トランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号14で表される塩基配列および配列番号15で表される塩基配列である前項30に記載の哺乳動物細胞。
33.目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
34.一対のトランスポゾン配列が一対のTol1トランスポゾン由来の塩基配列またはTol2トランスポゾン由来の塩基配列である前項33に記載の発現ベクター。
35.一対のTol2トランスポゾン由来の塩基配列が、配列番号2で表される塩基配列および配列番号3で表される塩基配列である前項34に記載の発現ベクター。
36.一対のTol1トランスポゾン由来の配列が、配列番号14で表される塩基配列および配列番号15で表される塩基配列である前項34に記載の発現ベクター。
[図2]図2は、抗ヒトインフルエンザM2抗体発現ベクターの模式図を示す。CMVはCMVプロモーターを、poly Aはポリアデニレーションサイトを、Hcはヒト抗体H鎖cDNAを、Lcはヒト抗体L鎖cDNAを、CHX−rはシクロヘキシミド耐性遺伝子を示す。
[図3]図3は、Tol2トランスポゼース発現ベクターの模式図を示す。CAGGSはCAGGSプロモーターを、poly Aはポリアデニレーションサイトを、TPase cDNAはTol2トランスポゼースcDNAを示す。
[図4]図4は、抗ヒトインフルエンザM2抗体発現Tol2トランスポゾンベクターを用いた場合の、浮遊性のCHO−K1細胞および接着性のCHO−K1細胞における抗ヒトインフルエンザM2抗体の発現量を検討した結果を示す。図4Aは浮遊性のCHO−K1細胞、図4Bは接着性のCHO−K1細胞の結果を示す。いずれの図も縦軸は抗体産生量(μg/mL)、横軸は各細胞の遺伝子導入クローン番号を示す。
[図5]図5は、抗ヒトインフルエンザM2抗体発現Tol1トランスポゾンベクターの模式図を示す。Tol1−Lはleft end Tol1トランスポゾン(配列番号14)を、Tol1−Rはright end Tol1トランスポゾン(配列番号15)を、CMVはCMVプロモーターを、poly Aはポリアデニレーションサイトを、Hcはヒト抗体H鎖cDNAを、Lcはヒト抗体L鎖cDNAを、CHX−rはシクロヘキシミド耐性遺伝子を示す。
[図6]図6は、Tol1トランスポゼース発現ベクターの模式図を示す。CAGGSはCAGGSプロモーターを、poly Aはポリアデニレーションサイトを、TPase cDNAはTol1トランスポゼースcDNAを示す。
[図7]図7は、抗ヒトインフルエンザM2抗体発現Tol1トランスポゾンベクターを用いた場合の、浮遊性のCHO−K1細胞における抗ヒトインフルエンザM2抗体の発現量を検討した結果を示す。縦軸は抗体産生量(μg/mL)、横軸は各細胞の遺伝子導入クローン番号を示す。
[図8]図8は、抗ヒトCD98抗体重鎖発現トランスポゾンベクターの模式図を示す。Tol2−Lはleft end Tol2トランスポゾン(配列番号2)、Tol2−Rはright end Tol2トランスポゾン(配列番号3)、PmoはMoloney Murine Leukemia Virus プロモーター、poly Aはポリアデニレーションサイト、Hcは抗ヒトCD98抗体重鎖cDNA(配列番号18)
[図9]図9は、抗ヒトCD98抗体軽鎖発現トランスポゾンベクターの模式図を示す。Tol2−Lはleft end Tol2トランスポゾン(配列番号2)、Tol2−Rはright end Tol2トランスポゾン(配列番号3)、CMVはCMVプロモーター、poly Aはポリアデニレーションサイト、Lcは抗ヒトCD98抗体軽鎖cDNA(配列番号21)を示す。
[図10]図10は、シクロヘキシミド耐性遺伝子発現トランスポゾンベクターの模式図を示す。Tol2−Lはleft end Tol2トランスポゾン(配列番号2)、Tol2−Rはright end Tol2トランスポゾン(配列番号3)、CMVはCMVプロモーター、poly Aはポリアデニレーションサイト、CHX−rはシクロヘキシミド耐性遺伝子(配列番号7)を示す。
[図11]図11は、TNFα−CHXタンデムベクターまたは、TNFαH−CHXベクターならびにTNFαLベクターを、CHO−K1細胞へ遺伝子導入した時の、抗ヒトTNFα抗体産生量を示す。縦軸は、培地中に産生された抗体濃度(μg/mL)、対照区はコントロール、実験区はExp.で示す。
[図12]図12は、CD20−CHXタンデムベクターまたは、CD20H−CHXベクターならびにCD20Lベクターを、CHO−K1細胞へ遺伝子導入した時の、抗ヒトCD20抗体産生量を示す。縦軸は、培地中に産生された抗体濃度(μg/mL)、対照区はコントロール、実験区はExp.で示す。
[図13]図13は、抗体発現ベクターAの構造を示す。図13中、Tol2−LはTol2−L配列(配列番号2)からなるDNA断片を、Tol2−RはTol2−R配列(配列番号3)からなるDNA断片を、CMVはCMVプロモーターを、poly Aはポリアデニレーションサイトを、Hcは抗ヒトCD98抗体の重鎖遺伝子を、Lcは抗ヒトCD98抗体軽鎖遺伝子を、SOはSV40プロモーターを、SVはSV40ポリアデニレーションサイトを、Neo−rはネオマイシン耐性遺伝子を示す。
工程(A)以下の発現ベクター(a)および(b)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター
(b)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B)工程(A)で浮遊性の動物細胞に導入した発現ベクター(b)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を前記哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
工程(C)工程(B)で得られた目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
工程(A)以下の発現ベクター(a)および(b)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)目的タンパク質をコードするDNAと選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含むタンパク質発現ベクター
(b)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B)工程(A)で浮遊性の動物細胞に導入した発現ベクター(b)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された前記遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
工程(C)工程(B)で得られた目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
工程(A)以下の発現ベクター(a)、(b)および(c)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター
(b)選択マーカー遺伝子の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(c)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B)工程(A)で浮遊性の動物細胞に導入した発現ベクター(c)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された前記遺伝子断片を該哺乳動物細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
工程(C)工程(B)で得られた目的タンパク質を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程
工程(A) 以下の(a)〜(c)から選ばれる1の発現ベクターの組み合わせまたは発現ベクター(d)、および発現ベクター(e)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(c)抗体のL鎖をコードするDNAおよび薬剤耐性遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(d)抗体のH鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(e)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B) 工程(A)で浮遊性の哺乳動物細胞に導入した発現ベクター(e)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された前記H鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子が前記哺乳動物細胞の染色体に組み込まれた、抗体を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を選択する工程
工程(A) 以下の(a)〜(c)から選ばれる1の発現ベクターの組み合わせまたは発現ベクター(d)、および発現ベクター(e)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)抗体のH鎖をコードするDNAおよび薬剤耐性遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(c)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(d)抗体のH鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(e)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B) 工程(A)で浮遊性の哺乳動物細胞に導入した発現ベクター(e)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された前記H鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子を前記哺乳動物細胞の染色体に組込み、抗体を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程工程(C) 工程(B)で得られた抗体を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、抗体を生産させる工程
工程(A) 以下の(a)〜(c)から選ばれる1の発現ベクターの組み合わせまたは発現ベクター(d)、および発現ベクター(e)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(c)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(d)抗体のH鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(e)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B) 工程(A)で浮遊性の哺乳動物細胞に導入した発現ベクター(e)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された前記H鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子が前記哺乳動物細胞の染色体に組込まれ、抗体を高発現する浮遊性の哺乳動物細胞を選択する工程
工程(A) 以下の(a)〜(c)から選ばれる1の発現ベクターの組み合わせまたは発現ベクター(d)、および発現ベクター(e)を浮遊性の哺乳動物細胞に同時に導入する工程
(a)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(b)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(c)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、ならびに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(d)抗体のH鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター
(e)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター
工程(B) 工程(A)で浮遊性の哺乳動物細胞に導入した発現ベクター(e)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された前記H鎖、L鎖および選択マーカー遺伝子を前記哺乳動物細胞の染色体に組込み、抗体を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を得る工程
工程(C) 工程(B)で得られた抗体を発現する浮遊性の哺乳動物細胞を浮遊培養して、抗体を生産させる工程
タンパク質発現用プラスミドベクターには、一対のTol2トランスポゾン配列の間に挿入された任意のヒト抗体遺伝子および薬剤選択マーカー遺伝子を含む、哺乳動物細胞用遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いた。
トランスポゼースは、目的とする抗体の発現ベクターとは独立した発現ベクターを用いて発現させた。すなわち、pCAGGSベクター(Gene 108,193−200,1991)のCAGGSプロモーターの下流にメダカ由来のTol2トランスポゼースをコードする遺伝子(配列番号4)を挿入し、Tol2トランスポゼース発現ベクター(以下、Tol2ベクターと略記する)を作製した(図3)。
10%血清(FCS)を添加したα−MEM培地(Invitrogen社)で培養した接着性CHO細胞を、トリプシン処理により剥離、回収し、新しい10% FCS添加α−MEM培地を用いて、5% CO2インキュベータ内で、37℃にて振とう培養した。数日後、これらの細胞が増殖していることを確認したのち、5%FCS添加α−MEM培地に2×105個/mLの濃度で播種し、振とう培養を行った。
発現ベクターとして、実施例1および実施例2の抗ヒトインフルエンザM2抗体発現トランスポゾンベクター(以下、トランスポゾンベクターと略記する)およびTol2ベクターpCAGGS−T2TP[図3、Kawakami K&Noda T.Genetics.166,895−899(2004)]を用いた。また、コントロールとしてトランスポゾン配列を有していない抗ヒトインフルエンザM2抗体発現ベクターを用いた。
その結果を表1および表2に示す。
浮遊性CHO細胞または接着性CHO細胞における抗体生産効率を検討するために、各細胞株における抗体の産生量を検討した。浮遊性CHO細胞としては、浮遊培養に馴化した浮遊性CHO−K1細胞を用いた。また、接着性CHO細胞としては浮遊培養馴化前の接着性CHO−K1細胞を用いた。
実施例1と同様に、タンパク質発現用プラスミドベクターには、一対のTol1トランスポゾン配列の間に挿入された任意のヒト抗体遺伝子および薬剤選択マーカー遺伝子を含む、哺乳動物細胞用遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いた。
トランスポゼースは目的抗体の発現ベクターとは独立した発現ベクターを用いて発現させた。すなわち、CMVエンハンサー/プロモーター制御下に、配列番号16で表される塩基配列からなるメダカ由来のTol1トランスポゼース(配列番号17)をコードするDNA断片が接続されたTol1トランスポゼース遺伝子発現カセットを、pBluescriptII SK(+)(Stratagene社製)に挿入し、Tol1トランスポゼース発現ベクターpTol1aseとして利用した(図6)。
上述(1)〜(3)で作製した発現ベクターを用いて、実施例3と同様の方法によりTol1トランスポゾンによる発現ベクターの導入効果を検討した。その結果を表3に示す。
Tol1トランスポゾンを用いて、浮遊性CHO細胞における抗体生産効率を、実施例3の(3)と同様にして検討を行った。
(1)抗ヒトCD98抗体重鎖発現トランスポゾンベクターおよび抗ヒトCD98抗体軽鎖発現トランスポゾンベクターの作製
配列番号20および23のアミノ酸配列で表された可変領域H鎖およびL鎖を有する抗ヒトCD98抗体を作製するために、各抗体可変領域にヒトIgG1抗体定常領域のアミノ酸配列を連結させH鎖およびL鎖のアミノ酸配列を作製した。
実施例1に記載のCMVエンハンサー/プロモーター制御下に、シクロヘキシミド耐性遺伝子をコードする配列(配列番号7)を接続し、該シクロヘキシミド耐性遺伝子発現カセットの両端に一対のトランスポゾン配列(Tol−2L、Tol2−R)を挿入し、シクロヘキシミド耐性遺伝子発現トランスポゾンベクター(以下、CHXベクターと略記する)を構築した(図10)。
上述(1)および(2)で作製したCD98Hベクター(図8)、CD98Lベクター(図9)、CHXベクター(図10)および実施例2で作製したTol2ベクター(図3)を浮遊培養に馴化したCHO−K1細胞に導入し、抗体を高発現する細胞の出現数を比較した。
実施例5(1)で作製した抗ヒトCD98抗体重鎖発現トランスポゾンベクターに、同実施例5(1)で作製した抗ヒトCD98抗体軽鎖発現遺伝子カセットおよび実施例5(2)で作製したシクロヘキシミド耐性遺伝子カセットをそれぞれ連結し、上述と同様合成DNA、PCR法を用いて抗ヒトCD98抗体重鎖遺伝子断片、抗ヒトCD98抗体軽鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(以下、CD98−CHXタンデムベクターと略記する)を構築した。
実施例5(1)で作製した抗ヒトCD98抗体重鎖発現トランスポゾンベクターに、実施例5(2)に示したシクロヘキシミド耐性遺伝子カセットをそれぞれ連結し、上述と同様合成DNA、PCR法を用いて抗ヒトCD98抗体重鎖およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(CD98H−CHX発現トランスポゾンベクターと略記する)を構築した。
前記実施例5(1)および(2)ならびに前記実施例6(1)および(2)で作製した発現トランスポゾンベクターを用いて、抗ヒトCD98抗体のH鎖およびL鎖を同一の発現ベクターで遺伝子導入した場合(対照区)、抗ヒトCD98抗体のH鎖、L鎖またはシクロヘキシミド耐性遺伝子をそれぞれ別々の発現ベクターで遺伝子導入した場合(実験区1)、およびH鎖またはL鎖を別々の発現ベクターで遺伝子導入した場合(実験区2)の、抗CD98抗体を高発現する細胞の出現数を比較した。
上述実施例6(3)で得られたCD98−CHXタンデムベクターが導入された細胞ならびにCD98H−CHXベクターおよびCD98Lベクターが導入された細胞のぞれぞれから、抗体発現量の高い上位3株について抗体発現量を比較した。実験の詳細を以下に示す。
配列番号26および29のアミノ酸配列を有する抗ヒトTNFα抗体を作製するために、実施例6(1)で作製した抗ヒトCD98抗体重鎖遺伝子断片、軽鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(CD98−CHXタンデムベクター)のVHおよびVL遺伝子断片を抗ヒトTNFα抗体由来VHおよびVLにそれぞれ置換し、抗ヒトTNFα抗体重鎖遺伝子断片、抗ヒトTNFα抗体軽鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子発現トランスポゾンベクター(以下、TNFα−CHXタンデムベクターと略記する。)を構築した。
実施例6(2)で作製した抗ヒトCD98抗体重鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(CD98H−CHXベクター)のVH遺伝子断片部位を、抗ヒトTNFα抗体VH遺伝子断片に改変し、抗ヒトTNFα抗体重鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(以下、TNFαH−CHXベクターと略記する)を構築した。抗ヒトTNFα抗体重鎖遺伝子は本項(1)に示した配列と同じ配列を用いた。
実施例6(1)で作製した抗ヒトCD98抗体軽鎖遺伝子発現トランスポゾンベクター(CD98Lベクター)の軽鎖遺伝子部位を、抗ヒトTNFα抗体軽鎖に改変し、抗ヒトTNFα抗体軽鎖遺伝子発現トランスポゾンベクター(以下、TNFαLベクターと略記する)を構築した。抗ヒトTNFα抗体VL遺伝子は本項(1)に示した配列と同じ配列を用いた。
抗ヒトTNFα抗体を生産するCHO−K1細胞を作製するために、上述(1)で作製したTNFα−CHXタンデムベクター(20μg)と実施例2で作製したTol2トランスポゼース発現ベクター(Tol2ベクター)(10μg)を、実施例3(1)で作製した浮遊培養に馴化したCHO−K1細胞へ導入した(対照区)。
上述(4)で得られたTNFα−CHXタンデムベクターが導入された細胞ならびにTNFαH−CHXベクターおよびTNFαLベクターが共導入された細胞から、シクロヘキシミド耐性で選抜され、且つ抗ヒトTNFα抗体を発現している細胞を選択し、96穴プレート、24穴プレート、次いで6穴プレートへ順次拡大培養した。拡大培養に成功したTNFα−CHXタンデムベクターが導入された細胞4株ならびにTNFαH−CHXベクターおよびTNFαLベクターが共導入された細胞52株を、培養期間が7日間である以外は実施例6(4)と同様にして細胞を培養し、抗体発現量を計測した。結果を図11に示す。
配列番号32および35のアミノ酸配列で表されるVHおよびVLを含む抗ヒトCD20抗体を作製するために、実施例6(1)で作製したCD98−CHXタンデムベクターの抗体VHまたはVL遺伝子部位を、ぞれぞれ抗ヒトCD20抗体由来VHまたはVLに置換し、抗ヒトCD20抗体重鎖遺伝子断片、抗ヒトCD20抗体軽鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(以下、CD20−CHXタンデムベクターと略記する)を構築した。
実施例6(2)で作製したCD98H−CHXベクター抗体VH遺伝子部位を、抗ヒトCD20抗体由来VHに改変し、抗ヒトCD20抗体重鎖遺伝子断片およびシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む発現トランスポゾンベクター(以下、CD20H−CHXベクターと略記する)を構築した。抗ヒトCD20抗体重鎖遺伝子は上述(1)に示した配列と同じ配列を用いた。
実施例6(1)で作製したCD98Lベクター抗体VL遺伝子部位を抗ヒトCD20抗体由来VLに改変し、抗ヒトCD20抗体軽鎖遺伝子発現トランスポゾンベクター(以下、CD20Lベクター)を構築した。抗ヒトCD20抗体重軽遺伝子は上述(1)に示した配列と同じ配列を用いた。
抗ヒトCD20抗体を生産するCHO−K1細胞を作製するために、上述(1)で作製したCD20−CHXタンデムベクターと実施例2で作製したTol2トランスポゼース発現ベクター(Tol2ベクター)を、実施例3(1)で作製した浮遊培養に馴化したCHO−K1細胞へ導入した(対照区)。
上述(3)で得られたCD20−CHXタンデムベクターが導入された細胞ならびにCD20H−CHXベクターおよびCD20Lベクターが共導入された細胞から、シクロヘキシミド耐性で選抜され且つ抗ヒトCD20抗体を発現している細胞を選択し、96穴プレート、24穴プレート、次いで6穴プレートへ順次拡大培養した。拡大培養に成功した対照区細胞4株および実験区細胞50株を、培養期間が7日間である以外は実施例6(4)と同様にして細胞を培養し、抗体発現量を計測した。結果を図12に示す。
タンパク質発現用プラスミドベクターには、一対のTol2由来の塩基配列の間に挿入された任意のヒト抗体遺伝子および薬剤耐性マーカー遺伝子を含む、哺乳動物細胞用遺伝子発現カセットを含むプラスミドを用いた。
(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号37で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子1に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターBを作製した。
(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号38で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子2に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターCを作製した。
(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を、配列番号39で表される塩基配列からなる改変型ネオマイシン耐性遺伝子3に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターDを作製した。
実施例9(1)〜(4)で作製した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターA〜Dを、配列番号40で表されるアミノ酸配列からなるTol2トランスポゼースを発現するベクターpCAGGS−T2TP[Kawakami K&Noda T.Genetics.166,895−899(2004)]とともに浮遊化CHO−K1細胞にそれぞれ導入し、抗体生産細胞A〜Dを作製した。
実施例9(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を配列番号41で表される塩基配列からなる改変型ピューロマイシン耐性遺伝子1に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターEを作製した。
実施例9(1)で得られた野生型ネオマイシン耐性遺伝子を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターAのネオマイシン耐性遺伝子を配列番号43で表される塩基配列からなる改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2に置換した抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターFを作製した。改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2は、野生型ピューロマイシン耐性遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードし、且つ全体の14%にあたる79塩基を改変している。具体的には、改変型ピューロマイシン耐性遺伝子1のアラニン残基に対応するコドンの改変に加え、ロイシン残基に対応するコドンをTTA、バリン残基に対応するコドンをGTA、セリンのコドンをTCGとした。
実施例11(1)の改変型ピューロマイシン耐性遺伝子1を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターE、実施例11(2)の改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2を有する抗ヒトCD98抗体発現トランスポゾンベクターF、Tol2トランスポゼース発現ベクターpCAGGS−T2TPを浮遊化したCHO−K1細胞に導入し、抗体生産細胞EおよびFを作製した。
実施例12で得られた改変型ピューロマイシン耐性遺伝子2を発現する抗体生産細胞Fを三角フラスコで培養し、抗ヒトCD98抗体を生産した。
本出願は、2010年12月15日出願の日本特許出願2010−279849に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
配列番号2−人工配列の説明;Tol2−L配列
配列番号3−人工配列の説明;Tol2−R配列
配列番号7−人工配列の説明;シクロヘキシミド耐性遺伝子の塩基配列
配列番号8−人工配列の説明;シクロヘキシミド耐性遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9−人工配列の説明;M2Z3抗体H鎖をコードする塩基配列
配列番号10−人工配列の説明;M2Z3抗体H鎖のアミノ酸配列
配列番号11−人工配列の説明;M2Z3抗体L鎖をコードする塩基配列
配列番号12−人工配列の説明;M2Z3抗体L鎖のアミノ酸配列
配列番号13−人工配列の説明;非自律性Tol1の塩基配列
配列番号14−人工配列の説明;Tol1−L配列
配列番号15−人工配列の説明;Tol1−R配列
配列番号18−人工配列の説明;CD98抗体重鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号19−人工配列の説明;CD98抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号20−人工配列の説明;CD98抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号21−人工配列の説明;CD98抗体軽鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号22−人工配列の説明;CD98抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号23−人工配列の説明;CD98抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号24−人工配列の説明;抗ヒトTNFα抗体重鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号25−人工配列の説明;抗ヒトTNFα抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号26−人工配列の説明;抗ヒトTNFα抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号27−人工配列の説明;抗ヒトTNFα抗体軽鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号28−人工配列の説明;抗ヒトTNFα抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号29−人工配列の説明;抗ヒトTNFα抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号30−人工配列の説明;抗ヒトCD20抗体重鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号31−人工配列の説明;抗ヒトCD20抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号32−人工配列の説明;抗ヒトCD20抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号33−人工配列の説明;抗ヒトCD20抗体軽鎖可変領域をコードする塩基配列
配列番号34−人工配列の説明;抗ヒトCD20抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号35−人工配列の説明;抗ヒトCD20抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号36−人工配列の説明;野生型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号37−人工配列の説明;改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号38−人工配列の説明;改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号39−人工配列の説明;改変型ネオマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号41−人工配列の説明;改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号42−人工配列の説明;野生型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号43−人工配列の説明;改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号44−人工配列の説明;改変型ピューロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号45−人工配列の説明;改変型ゼオシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号46−人工配列の説明;改変型ゼオシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号47−人工配列の説明;改変型ハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
配列番号48−人工配列の説明;改変型ハイグロマイシン耐性遺伝子の塩基配列
Claims (10)
- 目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を該CHO細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞を得て、且つ該CHO細胞を浮遊培養して該目的タンパク質を生産する方法であって、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列であり、
下記(i)〜(iii)から選ばれる発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入する方法。
(i)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(ii)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(iii)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。 - 以下の工程(A)〜(C)を含むことを特徴とする、目的タンパク質を生産する方法であって、
(A)以下の発現ベクター(a)および(b)を無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に同時に導入する工程、
(a)目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター、
(b)トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼースをコードするDNAを含むベクター、
(B)工程(A)で無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入した発現ベクター(b)によりトランスポゼースを一過性発現させて、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を該CHO細胞の染色体に組込み、目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞を得る工程、
(C)工程(B)で得られた目的タンパク質を発現する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞を浮遊培養して、目的タンパク質を生産させる工程、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列であり、
下記(i)〜(iii)から選ばれる発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入する方法。
(i)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(ii)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(iii)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。 - 目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入し、一対のトランスポゾン配列の間に挿入された目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を該CHO細胞の染色体に組込み、該目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞を得る方法であって、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列であり、
下記(i)〜(iii)から選ばれる発現ベクターを無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞に導入する方法。
(i)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(ii)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(iii)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。 - CHO細胞がCHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性遺伝子である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- シクロヘキシミド耐性遺伝子がリボソームタンパク質である請求項5に記載の方法。
- 目的タンパク質をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む少なくとも1種類の発現ベクター(a)、および該トランスポゾン配列を認識し、且つ一対のトランスポゾン配列の間に挿入された遺伝子断片を染色体に転移させる活性を有するトランスポゼース(転移酵素)をコードするDNAを含む発現ベクター(b)を同時に導入されることで、該一対のトランスポゾン配列の間に挿入された該遺伝子断片が染色体に組込まれ、且つ該目的タンパク質を生産する無血清培養で生存および増殖可能な浮遊性のCHO細胞であって、
該一対のトランスポゾン配列が、配列番号2で表わされる塩基配列および配列番号3で表わされる塩基配列である一対のTol2由来の塩基配列であり、
下記(i)〜(iii)から選ばれる発現ベクターを導入されたCHO細胞。
(i)抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクターおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(ii)抗体のH鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のL鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。
(iii)抗体のL鎖をコードするDNAおよび選択マーカー遺伝子を含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター、並びに抗体のH鎖をコードするDNAを含む遺伝子断片を含み、且つ該遺伝子断片の両端に一対のトランスポゾン配列を含む発現ベクター。 - CHO細胞がCHO−K1、CHO−K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro−3およびCHO−Sから選ばれるいずれか1つの細胞である請求項7に記載のCHO細胞。
- 選択マーカー遺伝子がシクロヘキシミド耐性遺伝子である請求項7または8に記載のCHO細胞。
- シクロヘキシミド耐性遺伝子がヒトリボソームタンパク質の変異体をコードする遺伝子である請求項9に記載のCHO細胞。
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