JP2002542781A - Ｐ因子由来ベクター及びその使用法 - Google Patents

Ｐ因子由来ベクター及びその使用法

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Abstract

(57)【要約】 新規P因子由来ベクター、及び外因性核酸を標的細胞ゲノムへ挿入するためのその使用法が提供される。本ベクターは、少なくとも2個の転写活性遺伝子に隣接した1対のP因子トランスポザーゼ認識挿入配列、例えば31塩基対逆方向反復配列を有する。本方法の実施においては、転移が起こるために十分な条件下で、本発明のベクターが標的細胞へ導入される。本方法は、例えば研究用途、合成用途、及び治療用途を含む、外因性核酸が標的細胞ゲノムへ挿入されることが望ましい様々な用途において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】序論 発明の分野 本発明の分野は、核酸ベクターである。
【０００２】発明の背景 「形質転換」として知られている過程である、外因性核酸配列（例えば、DNA
）の細胞への導入は、研究用途、合成用途、及び治療用途を含む、多様なバイオ
テクノロジー及び関連用途において大きな役割を果たしている。形質転換が重要
な役割を果たしている研究用途には、トランスジェニック細胞及びトランスジェ
ニック動物の作製が含まれる。形質転換が重要な役割を果たしている合成用途に
は、ペプチド及びタンパク質の作製が含まれる。形質転換が中心的な（key）役
割を果たしている治療用途には、遺伝子治療用途が含まれる。形質転換が上記及
びその他の用途において果たしている役割は広範囲に及ぶため、多様な異なる形
質転換プロトコルが開発されている。
【０００３】 多くの形質転換用途においては、それが標的細胞ゲノムに組み入れられるよう
な様式で、外因性DNAを導入することが望ましい。ゲノム組み込みを提供する1つ
の手段は、相同的組み換え能を有するベクターを使用することである。相同的組
み換えを当てにした技術は、必要な相同性が必ずしも存在しないこと、組み換え
事象に時間がかかりうることなどの点から、不利益でありうる。そのため、相同
的組み換えに基づくプロトコルは、完全には満足のゆくものでない。
【０００４】 従って、外因性DNAを細胞へ導入し、次いで導入されたDNAを標的細胞ゲノムへ
組み込むためにウイルスベクターが使用される、ウイルスに基づく代替的な形質
転換プロトコルが開発されている。使用される（find use）ウイルスに基づくベ
クターには、レトロウイルスベクター、例えばマロネイ（Maloney）マウス白血
病ウイルスに基づくベクターが含まれる。使用されるその他のウイルスに基づく
ベクターには、アデノウイルス由来ベクター、HSV由来ベクター、シンドビス由
来ベクター等が含まれる。ウイルスベクターは多数の利点を提供するが、多くの
場合にはそれらの使用は最適ではない。ウイルスに基づくベクターと関連した欠
点には、免疫原性、ウイルスに基づく合併症等が含まれる。
【０００５】 従って、形質転換プロトコルにおいて用いるためのさらなるベクターの開発に
対する関心が続いている。相同的組み換え以外のメカニズムによる、外因性DNA
の細胞ゲノムへの安定的な組み込みを提供する、非ウイルスベクターの開発に特
に関心がもたれる。
【０００６】関連文献 対象となる米国特許には、第5,719,055号及び第4,670,388号が含まれる。対象
となるその他の参照には、リオ（Rio）ら,「生物学的に活性なショウジョウバエ
P因子トランスポザーゼの同定及び免疫化学的分析（Identification and Immuno
chemical Analysis of Biologically Active Drosophila P Element Transposas
e）」,Cell(1986年1月17日)44:21-32、及びリオ（Rio）ら,「哺乳動物細胞及び
酵母におけるショウジョウバエP因子トランスポザーゼ活性の証拠（Evidence fo
r Drosophila P Element Transposase Activity in Mammalian Cells and Yeast
）」,J.Mol.Biol.(1988)200:411-415が含まれる。
【０００７】 さらなる対象となる文献には、ショーテン（Schouten）ら,Nuc.Acids Res.(19
98)26:3013-3017、イビックス（Ivics）ら,Cell(1997)91:501-510、ルオ（Luo）
ら,Proc.Nat'l Acad.Sci USA(1998)95:10769-10773、及びイビックス（Ivics）
ら, Proc.Nat'l Acad.Sci.USA(1996)93:5008-5013が含まれる。
【０００８】発明の概要 P因子由来ベクター、及び外因性核酸を標的細胞ゲノムへ挿入する際のその使
用法が提供される。本発明のベクターは、少なくとも2個の転写活性遺伝子に隣
接した1対のP因子トランスポザーゼ認識挿入配列、例えばP因子由来31塩基対逆
方向反復配列を含む。本発明の実施においては、ベクターから標的細胞ゲノムへ
の外因性核酸の転移に十分な条件下で、外因性核酸を有する上記ベクターが、標
的細胞へ導入される。本方法は、研究用途、ポリペプチド合成用途、及び治療用
途を含む多様な形質転換用途において使用が見出される。
【０００９】特定の態様の説明 P因子由来ベクター、及び外因性核酸の細胞ゲノムへの挿入におけるその使用
法が提供される。本ベクターは、少なくとも2個の転写活性遺伝子に隣接した2個
のP因子トランスポザーゼ認識挿入配列、例えばP因子由来31塩基対逆方向反復配
列を含む。本方法においては、外因性核酸の標的細胞ゲノムへの挿入が起こるた
めに十分な条件下で、外因性核酸を含む本発明によるベクターが、標的細胞へ導
入される。本方法は、遺伝子治療用途を含む多様な異なる用途において使用され
る。本発明のさらなる説明において、まず本ベクターを説明し、続いて標的細胞
の形質転換のため本ベクターを用いる方法について考察する。
【００１０】 本発明をさらに説明する前に、特定の態様の変法が作成されうり、更に添付の
特許請求の範囲の範囲内に含まれるため、本発明が以下に記載される本発明の特
定の態様に限定されないことを理解されたい。使用された技術用語は特定の態様
を説明するためのものであり、制限を意図したものではないこともまた理解され
たい。その代わり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により確立されると
考えられる。
【００１１】 本明細書及び添付の特許請求の範囲において、別途明示しない限り、単数形「
1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「その（the）」には、複数形も含まれる
。別途定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術的用語及び科学
的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通して理解されるものと同じ意味を
有する。
【００１２】ベクター 本発明のベクターは、P因子由来ベクター、即ちP因子由来トランスポゾンベク
ターであり、これは、ベクターが、ショウジョウバエP因子のP因子トランスポザ
ーゼ認識挿入配列を少なくとも含むことを意味する。そのため、本ベクターは、
1対のP因子の31塩基対逆方向反復配列ドメイン又はその機能的等価物、即ちP因
子によりコードされたトランスポザーゼにより認識されるドメインを含む。31塩
基対逆方向反復配列（即ち、Pフット（foot））は、ビオール（Beall）ら,「シ
ョウジョウバエP因子トランスポザーゼは新規な部位特異的エンドヌクレアーゼ
である（Drosophila P-element transposase is a novel site-specific endonu
clease）」,Genes Dev(1997年8月15日)11(16):2137-51に開示されている。
【００１３】 本ベクターにおいて、1対のP因子によりコードされたトランスポザーゼ認識挿
入配列（即ち、Pフット）は、少なくとも2個の転写活性遺伝子に隣接している。
ベクター内の転写活性遺伝子の数がしばしば2個又は3個であるとき、少なくとも
2個とは、2個以上、通常は5個以下、さらに通常は4個以下を意味する。ある態様
において、以下にさらに詳細に記載される本方法において標的細胞ゲノムへ挿入
される外因性核酸は、ベクターの転写活性遺伝子の1つである。転写活性遺伝子
とは、細胞内条件下で発現されることができるコード配列、例えば本ベクターと
共に用いられる標的細胞の細胞内環境における発現に必要な任意の必須発現調節
因子と組み合わされたコード配列を意味する。そのため、本ベクターの転写活性
遺伝子は典型的に、必須の（1つ又は複数の）転写媒介因子又は制御因子との機
能的な組み合わせにおいて、即ち機能的に連結されたヌクレオチドのコード配列
を含む、一続きのヌクレオチド又はドメイン、即ち発現モジュールを含む。発現
モジュール内に存在しうる必須の転写媒介因子には、プロモーター、エンハンサ
ー、終結及びポリアデニル化のシグナル因子、スプライシングシグナル因子等が
含まれる。
【００１４】 好ましくは、発現モジュールは、広範囲の宿主域における遺伝子の発現を提供
する転写調節因子を含む。多様なそのような組み合わせが既知であり、特定の転
写調節因子として以下が含まれる：ジジケマ（Dijkema）ら,EMBO J.(1985)4:761
に記載されたようなSV40因子；ゴルマン（Gorman）ら,Proc.Nat'l Acad.Sci USA
(1982)79:6777に記載されたようなラウス肉腫ウイルスのLTR由来の転写調節因子
；ボシャート（Boshart）ら,Cell(1985)41:521に記載されたようなヒトサイトメ
ガロウイルス（CMV）のLTR由来の転写調節因子；hsp70プロモーター（Levy-Holt
zman,R.及びI.Schechter(Biochim.Biophys.Acta(1995)1263:96-98)、Presnail,J
.K.及び M.A.Hoy,(Exp.Appl.Acarol.(1994)18:301-308))等。
【００１５】 多くの態様において、本ベクター内に存在する転写活性遺伝子又は発現モジュ
ールのうちの少なくとも1つは選択可能マーカーである。多様な異なる遺伝子が
選択可能マーカーとして使用されており、選択可能マーカーとして本ベクターに
おいて使用される特定の遺伝子は、主に便宜上の理由で選択される。既知の選択
可能マーカー遺伝子には、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
遺伝子、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、CAD、
アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、例えばtetr 、ampr、Cmr又はcat、kanr又はneor（アミノグリコシドホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子）などの抗生物質耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子等が含まれる。
【００１６】 さらに、本ベクターは典型的に、外因性核酸の挿入のための部位としてはたら
く、Pフット間に位置する制限エンドヌクレアーゼ認識部位、例えば制限酵素部
位を、少なくとも1個含む。多様な制限酵素部位が当技術分野において既知であ
り、ベクターに含まれうる。そのような部位には、以下の制限酵素により認識さ
れるものが含まれる：HindIII、PstI、SalI、AccI、HincII、XbaI、BamHI、SmaI
、XmaI、KpnI、SacI、EcoRI等。多くの態様において、ベクターは、ポリリンカ
ー、即ち上記で列挙されたような多数の異なる制限酵素により認識される、密に
配置された一連の部位又は部位のアレイを含む。
【００１７】 もし存在する場合、少なくとも2個の転写活性遺伝子及び外因性核酸を含む、
ベクターのPフット間ドメイン、即ちPフット間に位置するか又は配置されたベク
ターのドメイン又は領域は、非常に様々なサイズに変化する。典型的には、この
Pフット間ドメイン（即ち、Pフットに隣接したドメイン）のサイズは、少なくと
も約50bp長、通常は少なくとも約1000bp長、より通常は少なくとも約2000bp長で
あり、このドメインの長さは150,000bp程度又はそれ以上でありうるが、一般的
には約20,000bp長を超えず、より通常は約10,000bp長を超えない。
【００１８】 ある態様において、本ベクターは、トランスポザーゼコードドメイン、即ちト
ランスポザーゼ活性、特にP因子のPフットを認識するトランスポザーゼ活性を有
するタンパク質、とりわけP因子トランスポザーゼ活性を有するタンパク質即ちP
因子トランスポザーゼ又はその機能的等価物もしくはその類似物をコードする配
列を有するヌクレオチド領域をさらに含む。P因子トランスポザーゼのアミノ酸
配列は、リオ（Rio）ら,Cell(1986年1月17日)44:21-32に開示されている。本ベ
クター上に存在しうる特定のトランスポザーゼをコードする核酸は、pTURBO上に
見出され、このプラスミドの配列は、W.R.エンゲルス（Engels）,Bioess.14:681
-686(1992)；http://firefly.bio.indiana.eduに開示されている。本ベクター上
に存在する場合、このP因子トランスポザーゼコード領域又はドメインは、Pフッ
トに隣接した領域の外側に位置する。換言すると、トランスポザーゼコード領域
は、Pフットに隣接した領域の外部、即ち前述のPフット間ドメインの外側に位置
する。さらに換言すると、トランスポザーゼコード領域は、左末端Pフットの左
側、又は右末端Pフットの右側に位置する。
【００１９】 本ベクターは、極めて多様な内因性及び/又は外因性核酸を標的細胞ゲノムへ
安定的に挿入するために用いられ得る（外因性とは、標的細胞に存在しない配列
を有する核酸を意味し、内因性とは挿入前に標的細胞に既に存在する核酸を意味
する）。核酸の性質は、実施される特定のプロトコルに依って異なると考えられ
る。例えば、研究用途において、外因性又は内因性の核酸は、そのタンパク質産
物がよく特徴付けされていない新規な遺伝子であり得る。そのような用途におい
ては、遺伝子を特徴付けするため、遺伝子を標的細胞へ安定的に導入し、細胞の
表現型の変化を観察するためにベクターが使用される。又は、タンパク質合成用
途において、外因性又は内因性の核酸は、細胞により産生されない対象となるタ
ンパク質をコードするものである。ベクターが遺伝子治療ベクターとして使用さ
れる、さらに他の態様において、外因性又は内因性の核酸は、治療的活性を有す
る遺伝子、即ち治療的に有益な産物をコードする遺伝子である。核酸は非常に様
々なサイズでありうる。一般に、ベクターにより保持される核酸のサイズは、少
なくとも50bp、通常は少なくとも約1000bp、より通常は少なくとも約2000bpであ
り、長さは150,000bp以上でありうるが、一般には約20,000bp長を超えず、より
通常は約10,000bp長を超えない。多くの態様において、外因性核酸は長い、即ち
約30〜50kbの範囲の長さを有する。
【００２０】 本ベクターは、例えば大腸菌などの原核宿主におけるベクターの増幅にとって
必要な1個又は複数個の因子をさらに含みうる。原核宿主におけるベクターの増
幅において用いるためのベクター上に含まれうる因子には、複製開始点、選択可
能マーカー等が含まれる。
【００２１】 本発明の代表的なベクターを、図1に図示する。
【００２２】 少なくとも2個の転写活性遺伝子を含む上記のベクターに加え、1個の転写活性
遺伝子を含むベクターもまた提供される。本発明のこの態様のベクターにおいて
、転写活性遺伝子の一部であるプロモーターは、CMVプロモーターでないことを
条件として、前記のもののうちのいずれか、例えばSV40でありうる。1個の転写
活性遺伝子を含むこの態様のベクターは、下記のようにして調製され用いられう
るが、以下の記載は、少なくとも2個の転写活性遺伝子を含むベクターに関して
提供される。
【００２３】 本ベクターの調製法 本発明のベクターは、制限酵素切断、ライゲーション、及び分子クローニング
の常法により作製されうる。本ベクターを構築するための1つのプロトコルには
、以下の段階が含まれる。まず、初期起源、例えばショウジョウバエP因子から
、制限エンドヌクレアーゼにより、所望の成分ヌクレオチド配列を含有する精製
された核酸断片及び無関係の配列を含有する精製された核酸断片を分解する。次
いで、従来の分離法を用いて、例えばアガロースゲル電気泳動により、サイズの
異なる不要な断片から所望のヌクレオチド配列を含有する断片を分離する。所望
の断片をゲルから切り出し、所望の配列、例えば前記の本ベクターの様々な因子
に対応する配列を含有する環状核酸、又はプラスミドが作製されるように、適当
な配置で共にライゲーションする。次に、望ましい場合、そのように構築された
環状分子を原核宿主、例えば大腸菌中で増幅させる。これらの段階に含まれる分
解、プラスミド構築、細胞形質転換、及びプラスミド作製の方法は、当業者に周
知であり、制限及びライゲーションに必要な酵素は市販されている（例えば、R.
Wu編、「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」,第68巻,Academic Press,N.
Y.(1979);T.Maniatis,E.F.FritschおよびJ.Sambrook、「分子クローニング：実
験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」,Cold Spring Harb
or Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982);カタログ1982-83,New En
gland Biolabs,Inc.;カタログ1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc.を
参照のこと）。本発明のベクターの構築法の実施例は、後述の実施例の項におい
て示され、図2に図示されている。
【００２４】 本ベクターの使用法 本ベクターは、外因性又は内因性の核酸を標的細胞ゲノムへ導入し安定的に組
み込むことが望ましい、多様な用途において使用される。前述のように、外因性
核酸とは、標的細胞に元々は存在しないヌクレオチドの延長を意味し、一方、内
因性核酸とは、標的細胞に既に存在する核酸を意味する。多くの態様において、
外因性核酸内に存在するヌクレオチドの配列は、標的細胞ゲノムには見出されな
いものであると考えられる。本方法は、多様な標的細胞と共に用いられ得る。本
ベクターと共に使用されうる標的細胞は一般に、動物細胞又は植物細胞であり、
多くの態様において、標的細胞は動物細胞である。多くの態様において、脊椎動
物細胞、特に、例えばニワトリ細胞などのトリ細胞；マウス、ブタ、ヒツジ、ウ
マ、ラット、イヌ、ネコ、サル、及びヒトの細胞を含む哺乳動物細胞等を標的と
するための本ベクターの使用に特に関心がもたれる。
【００２５】 本発明の方法において、前記のようなP因子由来ベクターは、Pフットに隣接し
た核酸のベクターからの切り出し、及びそれに続く標的細胞ゲノムへの切り出さ
れた核酸の組み込みのために十分な条件下で、標的細胞へ導入される。P因子由
来ベクターは、「切り出し及び組み込みが起こるために十分な条件下で」細胞へ
導入されるため、本方法は、導入されたベクターと共に、必須のトランスポザー
ゼ活性が標的細胞に存在することを保証する段階をさらに含む。ベクター自体の
構造によって、即ちベクターがP因子トランスポザーゼ活性を有する産物をコー
ドする領域を含むか否かによって、方法は、必須のトランスポザーゼ活性をコー
ドする第2のベクターを標的細胞へ導入する段階をさらに含みうる。
【００２６】 プロトコルは、インビトロ又はインビボにおけるベクター導入を提供するもの
でありうる場合に、ベクター（及び、必要な場合には第2のベクター）は、任意
の便利なプロトコルを用いて標的細胞へ導入されうる。核酸を細胞へ導入するた
めの多数の異なるインビトロプロトコルが存在しており、本方法において使用さ
れうる。適当なプロトコルには、以下が含まれる：リン酸カルシウム媒介トラン
スフェクション；DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション；ポリブレン媒
介トランスフェクション；ベクター量が増量されたプロトプラストを標的細胞と
融合させる、プロトプラスト融合；標的細胞の細胞膜をベクターにとって透過性
とするため、標的細胞に短時間の高電圧電気パルスを印加する、エレクトロポレ
ーション；ベクターを保有するリポソームを標的細胞と融合させるリポソーム媒
介輸送；カペッシ（Capechhi）ら、Cell(1980)22:479に記載のような、ベクター
を細胞へ直接注入する、マイクロインジェクション等が含まれる。上記のインビ
トロプロトコルは、当技術分野において周知であり、サムブルック（Sambrook）
, Fritsch & Maniatis、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual）」(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)の
16.30〜16.55頁に、さらに詳細に概説されている。本ベクターの輸送において有
用なインビボプロトコルには、ベクターの細胞又は組織特異的輸送のために、特
異的な細胞型へ、脂質に基づく媒体を指向化させることができる、例えばリポソ
ーム媒体などに基づく脂質を介した輸送が含まれる。そのような方法を開示して
いる特許には、米国特許第5,877,302号、同第5,840,710号、同第5,830,430号、
及び同第5,827,703号が含まれ、これらの開示は参照として本明細書に組み入れ
られる。ターゲティング成分で修飾されていても修飾されていなくてもよいポリ
リジンに基づくペプチドの担体としての使用、マイクロインジェクション、エレ
クトロポレーション等を含む、その他のインビボ輸送もまた使用されうる（Broo
ks,A.I.ら、1998,J.neurosci.Methods V.80 p:137-47;Muramatsu,T.,Nakamura,A
.およびH.M.Park 1998,Int.J.Mol.Med.V.1 p:55-62）。
【００２７】 細胞へ導入されるベクター核酸の量は、所望の、外因性核酸の切り出し及び標
的細胞ゲノムへの挿入を提供するために十分なものである。そのため、導入され
るベクター核酸の量は、十分な量のトランスポザーゼ活性及び十分なコピー数の
外因性核酸を提供するものであるべきである。標的細胞へ導入されるベクター核
酸の量は、使用される特定の導入又は感染プロトコルの効率に依って異なる。
【００２８】 必須のトランスポザーゼと組み合わされたベクターDNAの標的細胞への導入の
後、ベクターのPフットに隣接したベクターの核酸領域、即ちP因子トランスポザ
ーゼ認識31塩基対末端反復配列の間に位置するベクター核酸が、提供されたトラ
ンスポザーゼによりベクターから切り出され、標的細胞ゲノムへと挿入される。
そのため、ベクターDNAの標的細胞への導入の後、ベクターが保持する外因性核
酸の、トランスポザーゼにより媒介される切り出し及び標的細胞ゲノムへの挿入
が起こる。
【００２９】 本トランスポゾンに基づくベクターの特定の特性のため、本ベクターは大きな
DNA片を標的細胞ゲノムへ組み込むために用いられ得る。一般に、ベクターが標
的細胞ゲノムへ挿入するDNAのサイズは、少なくとも約50bp、通常は少なくとも
約1000bp、より通常は少なくとも約2000bpであり、サイズは、150,000bpまたは
それ以上でありうるが、一般には約20,000bp長を超えず、より通常は約10,000bp
長を超えない。ベクターが大きなDNA片を標的細胞ゲノムへ挿入する場合、挿入
されるDNAのサイズは約30〜150kbの範囲である。
【００３０】 標的細胞ゲノムへの外因性核酸の安定的な組み込みにおける本方法は、標的細
胞ゲノムへの外因性核酸の安定的な組み込みが望まれる、多様な用途において有
用である。本ベクター及び方法が有用である用途には、研究用途、ポリペプチド
合成用途、及び治療用途が含まれる。これらの代表的な用途カテゴリを、それぞ
れ個別に以下に詳述する。
【００３１】 研究用途 本ベクターが有用である研究用途の例には、特定の遺伝子を特徴付けするため
に設計された用途が含まれる。そのような用途においては、対象となる遺伝子を
標的細胞へ挿入するためにベクターが使用され、その結果生じる、挿入された遺
伝子の細胞表現型に対する効果が観察される。このようにして、遺伝子の活性及
びそれによりコードされた産物の性質に関する情報が推量されうる。ベクターは
、例えば時間的（例えば、ある種の発達段階）又は空間的（例えば、特定の細胞
又は組織型）に遺伝子発現を制御するDNA配列を同定し定義するためにも使用さ
れうる。そのようなアッセイにおいて、本ベクターは、標的細胞ゲノムへ、選択
可能マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性LacZ等を安定的に組み込むために使用
される。ここで、ベクターは、マーカーが、内因性プロモーター因子の支配下に
ない限り、たとえ発現されるとしても有意には発現されないよう、マーカー遺伝
子のための十分なプロモーターを欠いている。マーカー遺伝子は、内因性プロモ
ーター配列との十分な関係をもって標的細胞ゲノムへ挿入された場合に、発現さ
れると考えられる。次いで、得られたマーカー遺伝子の発現プロファイルから、
その発現を媒介している内因性プロモーターが特徴付けされうる。本ベクターが
有用である、さらにもう一つの研究用途は、遺伝子発現研究の結果の同定及び特
徴付けである。例えば、内因性プロモーター媒介に依存して発現される、即ちプ
ロモーターを欠いているか、又は極弱いプロモーターとカップリングしている対
象となる遺伝子が、様々な標的細胞ゲノムの異なる位置に挿入されている、多数
の異なるベクター標的細胞（又はそれらから作製された動物）が調製される。多
数とは、少なくとも2個を意味し、その数は通常約2〜5000個であり、通常は約2
〜200個である。この多数のベクター標的細胞は、多数の細胞へベクターを導入
するか、又は遺伝子の挿入部位に関して同種のプレ標的（pretargeted）細胞、
即ち単一の標的細胞の子孫の集団を用意し、次いでその集団の構成メンバーのう
ちの全てではないにしても1個又は複数個へトランスポザーゼを導入することに
より、作製されうる。本ベクターは、組み込み変異体を研究するためにも用いら
れ得る。その場合には、対象となる遺伝子がランダムにゲノムに挿入され、この
ランダムな挿入の標的細胞表現型に対する影響が観察される。細胞において対象
となる遺伝子の過剰発現及び/又は誤発現が生じるモデルを作製するため本ベク
ターを使用し、この変異型発現パターンの効果を観察することもできる。対象と
なる表現型及び/又は発現パターンを生じる挿入突然変異誘発により、クローン
遺伝子を宿主細胞へと容易に導入するため、本ベクターを用いることもできる。
そのような用途において、本ベクターは、DNAのランダム組み込みによる挿入変
異体を生成させるため使用されうる。次いで、得られた変異体の表現型及び/又
は発現パターンを、任意の便利なプロトコルを用いてアッセイする。これらの対
象となる変異体において、対象となる表現型及び/又は発現パターンと関連したD
NAのクローニングが、本ベクターのPフットを用いることにより容易に達成され
る。
【００３２】 ポリペプチド合成用途 上記の研究用途に加え、本発明は、対象となるポリペプチド、例えばタンパク
質の合成においても有用である。そのような用途において、必須配列及び/又は
所望の発現調節配列、例えばプロモーター等（即ち、発現モジュール）と組み合
わされた対象となるポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターが、ポリペ
プチド発現のための発現宿主として作用する標的細胞へと導入される。次いで、
導入及びその後の標的細胞ゲノムへの安定的な組み込みの後、標的宿主細胞を、
組み込まれた遺伝子の発現にとって十分な条件下で維持する。次いで、タンパク
質を発現する形質転換された宿主を調製した後、所望のタンパク質を含む組成物
を作製するため、タンパク質を精製する。任意の便利なタンパク質精製法が使用
されうる。適当なタンパク質精製法は、「タンパク質精製の手引き（Guide to P
rotein Purification）」,(Deuthser編)(Academic Press,1990)に記載されてい
るものである。例えば、タンパク質を発現する発現宿主から溶解物を調製し、HP
LC、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ等を
用いて精製することができる。
【００３３】 治療用途 本ベクターは、ベクターが治療用核酸、例えば遺伝子を標的細胞ゲノムへ安定
的に組み込むために使用される、治療用途、即ち遺伝子治療用途においても有用
である。本ベクターは、極めて多様な治療用核酸を輸送するために用いられ得る
。対象となる治療用核酸には、遺伝子欠陥に基づく疾患状態の原因となる遺伝子
のような、標的宿主細胞における欠陥遺伝子を交換する遺伝子；癌の治療におい
て治療的に有益な遺伝子等が含まれる。遺伝子欠陥に基づく疾患状態の治療にお
いて用いるための特定の治療用遺伝子には、以下の産物：第VIII因子、第IX因子
、β-グロビン、低密度タンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセレブロシダーゼ
、嚢胞性繊維症膜貫通調節物質、α-アンチトリプシン、CD-18、オルニチントラ
ンスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、フェニルアラニンヒドロ
キシラーゼ、分岐α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラー
ゼ、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、
α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ等を
コードする遺伝子が含まれる。本ベクターにより輸送されうる癌治療用遺伝子に
は、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、腫瘍細胞の免疫原性を増強する発
現産物の遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、
アンチセンス配列等が含まれる。本ベクターにより保持されうる核酸の長さのた
め、本発明は、対象となる治療用遺伝子のみならず、治療用遺伝子の所望の時間
的及び空間的発現を得るために望ましい可能性のあるプロモーターのような任意
の発現調節因子等をも導入するために用いられ得る。
【００３４】 以下の実施例は、制限のためではなく、例示のために提示される。
【００３５】実施例 I. P因子由来ベクターの調製 図1に図示された遺伝子移入ベクターは、図2に示されたpcdna3.1hislaczベク
ターを、制限エンドヌクレアーゼBglII及びBstBIで消化することにより調製され
た。これにより、6kb及び2.5kbの DNA断片が生じた。neo遺伝子及びlacz遺伝子
を含有する6.5kb断片を、遺伝子移入ベクターを構築するために用いた。pCasper
4（図2に図示）を、制限エンドヌクレアーゼClaI及びBamHIで処理した。これに
より、2.8kb及び5kbのDNA断片が生じた。P因子の移動及び組み込みにとって必要
なP因子逆方向反復配列を含有する5kb断片を、遺伝子移入ベクターを構築するた
めに用いた。pCasper4由来の5kbのClaI、BamHI DNA断片を、pcdna3.1hislacz由
来の6kbのBglII、BstBI DNA断片とライゲーションした。これにより、下記のよ
うな新たなベクターが形成された。持続的に機能するこのベクターの異型が作成
されている。作成された異型は、lacz遺伝子からgfp遺伝子への置換え、及びマ
ルチプルクローニングポリリンカーの付加を含む。
【００３６】 II. P因子由来ベクターによる細胞のトランスフェクション 多数の異なる細胞型へとトランスフェクトする能力について、上記Iで作製し
たベクターを試験した。
【００３７】 A. QT6繊維芽細胞 上記Iにおいて作製したP因子由来ベクターを、培養QT6繊維芽細胞へと一過的
にトランスフェクトした。P因子トランスポザーゼ遺伝子を含有している別のベ
クターpTURBO（W.R.Engels,Bioess.14:681-686(1992)；http://firefly.bio.ind iana.edu. ）も、これらの細胞へトランスフェクトした。ベクターのP因子トラン
スポゾンドメイン（即ち、Pフットに隣接したベクターのドメイン）の組み込み
を、ネオマイシン様抗生物質G418を200μg/ml含有する培地上での長期培養（13
日）により決定した。G418耐性細胞は、全てベータガラクトシダーゼ陽性であっ
た（示していない）。G418耐性は、QT6細胞へと共トランスフェクトされたP因子
に基づくベクターと、Pトランスポザーゼベクターとの両方に依存していた。い
ずれかのベクター単独では、G418耐性細胞は生じなかった。さらに、G418耐性細
胞の数は、細胞へ導入されたDNA量に濃度依存的であった。結果を、下記の表1に
提供する。P因子のw/lacZ遺伝子及びG418r遺伝子を単独で1μgを、QT6細胞にト
ランスフェクトした場合、10日後、G418処理されていない細胞において、LacZ遺
伝子発現はもはや検出されなかった（示していない）。トランスフェクションは
、標準的な塩化カルシウムプロトコルを用いて実施された。
【００３８】
【表１】 G418r遺伝子を含有するP因子に基づくベクターは、トランスポザーゼ
産生ベクターと共にQT6細胞へ導入された場合にのみ、安定的な耐性を与える。 ＊ 割合は、倍化時間を考慮して、生存細胞数/最初の総細胞数により決定され
る。
【００３９】 トランスポザーゼ及びP因子をトランスフェクトしたQT6細胞は、LacZ及びG418
r両方の遺伝子発現を少なくとも30日間維持する。
【００４０】 上記の結果は、P因子に基づくトランスポゾンベクターが、トランスポザーゼ
依存的にゲノムへの組み込みを行うことを示している。
【００４１】 前記のようなQT6細胞の形質転換のために必要なベクター属性を決定するため
、前記の方法に従い、様々な対照ベクターを組み立て、これらの対照ベクターが
QT6細胞へとトランスフェクトする能力を決定した。結果を、表2に提供する。
【００４２】
【表２】 ＊ 割合は、倍化時間を考慮して、生存細胞数/最初の総細胞数により決定され
る。
【００４３】 上記の結果は、組み込み及び遺伝子発現の成功が、2つの転写活性遺伝子を有
することに依存していることを示している。1つの遺伝子単独（G418r）では、組
み込みが可能にならない。さらに、インサートDNAは、lacZ遺伝子と置換され、
構築物の全体的なサイズを一定に維持しているため、ベクターのサイズは転写性
に重要な要件ではない。
【００４４】 B. マウス胚性幹細胞（CCE） 前記IIAに記載された方法と類似の方法で、カナマイシン遺伝子及びベータガ
ラクトシダーゼ遺伝子をマウス胚性幹細胞へ組み込むため、前記Iで調製された
ベクターを用いた。結果を表3に提供する。
【００４５】
【表３】
【００４６】 D. ヒト腎細胞（293） 前記IIAに記載された方法と類似の方法で、カナマイシン遺伝子及びベータガ
ラクトシダーゼ遺伝子をヒト腎細胞へ組み込むため、前記Iで調製されたベクタ
ーを用いた。結果を表4に提供する。
【００４７】
【表４】 分析された細胞全てを殺傷するであろう抗生物質処理を見出すことは困難であっ
た。
【００４８】 上記の結果は、本P因子に基づくベクターが、外因性核酸を脊椎動物細胞、特
に哺乳動物細胞ゲノムへと安定的に組み込む能力を有することを証明している。
そのため、上記の結果は、外因性核酸の哺乳動物細胞への導入において用いるベ
クターとして、本ベクターが適していることを証明している。
【００４９】 E. 大きなDNA断片の標的細胞への組み込み P因子ベクターは、最大150kbのDNAを移動させる能力を有する。このことは、
同程度の長さの治療的に用いられるDNA配列を保持するP因子を、標的細胞へと導
入できることを示している。4メガ塩基ものDNA断片の操作及び取り扱いは、困難
であるが、再現可能に達成されている。例えば、このベクターは、ヒトハンチン
トン遺伝子のサイズ（〜150〜200kb）の遺伝子を分析することを可能にしうる。
【００５０】 III. 遺伝子治療 前記の方法に従い、所望の遺伝子及びその制御配列を有する遺伝子移入ベクタ
ーを作出した後、遺伝子組み込みを達成するためには、構築物をレシピエント細
胞の核に到達させなければならない。このベクターのレシピエント細胞への移入
を達成するための多くの方法が存在する。例えば、マウス卵母細胞/胚の核への
マイクロインジェクションは、遺伝物質を移入した生殖系列を作製するのに最適
であると思われる。このことは、マウス胚性幹細胞にトランスフェクトする段階
、ゲノムへ移入された所望の遺伝物質を有する細胞を選択する段階、およびこれ
らの細胞を偽妊娠の雌へ移植する段階により達成されうる。
【００５１】 遺伝物質をヒト細胞へ移入する幾つかの方法が示されている。裸のDNAの直接
注入する方法では、DNAは筋細胞において取り込まれ、かつ一過的に発現される
ことが示されている。一方、DNAの取り込みを促進するため、脂質又はタンパク
質の複合体を用いる方法も存在する。最終的には、電流を用いた方法でも、生物
におけるDNAの移入を達成することが示されている。
【００５２】 VI. マウスにおける遺伝子治療 6週齢の雄マウス（体重30グラム）に、組み込みベクター5マイクログラム及び
トランスポザーゼ含有ベクター2マイクログラムを注入した。マイラストランジ
ット（mirus transit）インビボ遺伝子輸送系からの標準的な手法を、注入のた
め用いた。簡単に説明すると、この手法は、血中での分解からのDNAを保護する
のを助け、かつ動物においては、細胞にDNAが取り込まれるのを補助するために
、DNAを脂質担体と組み合わせるものである。注入は、動物の尾静脈へ行った。1
5週齢で、肝臓、精巣、及び尾から組織試料を採取した。標準的なタンパク質分
解酵素k/スプーリング技術を用いて、これらの試料からゲノムDNAを単離した。
これらのゲノムDNAの調製物を、PCR分析に供した。
【００５３】 組み込みベクターの存在は、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子に対するプライ
マーを用いて調査し、トランスポザーゼ含有ベクターの存在は、トランスポザー
ゼ遺伝子に対するプライマーを用いて調査した。未処理対照マウスの尾由来のゲ
ノムDNAは、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子及びトランスポザーゼ遺伝子の両方
が存在しないことを示した。トランスポザーゼ遺伝子及びベータ-ガラクトシダ
ーゼ遺伝子はいずれもマウスゲノムに内因性でないため、この対照は驚くべきも
のではなかった。しかし、組み込みベクター及びトランスポザーゼベクターを試
験マウスへ注射した9週間後、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子は容易に検出可能
であった。このことから、組み込みベクターが、調査された全ての組織において
ゲノムDNAへ挿入されたことが示された。ゲノムDNAにトランスポザーゼベクター
が存在しないことは、DNAがランダムにマウスゲノムに組み込まれたのではない
こと、および組み込みベクターがその標準的なメカニズムを介して組み込みを行
ったことを示している。両PCRプライマーセットが低濃度の標的DNAを増幅するこ
とができることを保証するため、組み込みベクターDNAおよびトランスポザーゼ
ベクターのDNAを0.01ナノグラムずつ、未処理マウスのゲノムDNAと混合し、そこ
からトランスポザーゼ遺伝子及びベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子の両方を検出
可能とした。
【００５４】
【表５】 マウスにおける遺伝子組み込み
【００５５】 このデータは、このベクターが体細胞遺伝子治療のために用いられ得ることを
示している。さらに、精巣細胞への組み込みは、本ベクターが、生殖系列への適
用における用途を見出すことも示している。
【００５６】 上記の結果及び考察より、本発明は、広範囲の用途を有する新規核酸ベクター
を提供することが明らかである。他の既知の核酸ベクターよりも優れた本ベクタ
ーの利点には、長い核酸鎖を標的細胞ゲノムへ組み込む能力が含まれる。この特
徴は、天然の発現調節因子と共に外因性遺伝子を組み込むという能力を含む、多
くの理由から有利である。本発明のもう1つの特徴は、ベクターが、多くの用途
において望ましい、外来核酸のランダムな挿入を提供することである。本発明の
さらなる利点は、本ベクターが、多くのウイルスに基づくベクターとは対照的に
、宿主免疫反応を誘発しない点である。さらに、本ベクターは、ウイルス感染又
は組み換えの危険性を保持しない。そのため、本ベクターは、当技術分野におい
て現在既知であり、かつ使用されている他のベクターよりも優れた多数の利点を
提供し、従って当技術分野に対する有意な貢献を提示する。
【００５７】 本明細書において引用された全ての出版物及び特許出願は、それぞれが参照と
して組み入れられると特別かつ個別に示されているように、参照として本明細書
に組み入れられる。すべての出版物の引用は、出願日よりも前の開示のために、
先行発明という理由で、本発明がそのような出版物に先行している権利を有しな
いことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【００５８】 以上、理解を明確にするために例示及び具体例により幾分詳細に発明を記載し
たが、本発明の開示を考慮すれば、添付の特許請求の範囲の本旨又は範囲から逸
脱することなく、いくつかの改変及び修飾がそれらになされうることは、当業者
には容易に明らかであると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明によるベクターの図である。
【図２】 図1に図示されたベクターの合成を示す図を提供する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フォガーティ パトリック アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン タ クルズ デラウェア アベニュー 2125 スート ビー (72)発明者 リップシック ジョセフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 スタ ンフォード エル−216 デパートメント オブ パソロジー スタンフォード ユ ニバーシティー スクール オブ メディ シン Ｆターム(参考） 4B024 AA20 DA01 DA02 FA13 HA01 HA17 4B065 AA87 AB03 AB04 BA02 CA24 CA44

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 外因性核酸を標的細胞ゲノムへ導入するためのP因子ベクタ
    ーであり、少なくとも2個の転写活性（transcriptionally active）遺伝子に隣
    接した1対のP因子トランスポザーゼ認識挿入配列を含むベクター。
  2. 【請求項２】 転写活性遺伝子がそれぞれ、細胞内条件下で発現されるコー
    ド配列を含む、請求項1記載のベクター。
  3. 【請求項３】 少なくとも1個のエンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含む
    、請求項1記載のベクター。
  4. 【請求項４】 エンドヌクレアーゼ切断部位がポリリンカー内に存在する、
    請求項1記載のベクター。
  5. 【請求項５】 トランスポザーゼドメインが上記の1対のトランスポザーゼ
    認識挿入配列に隣接しないような、P因子トランスポザーゼ活性を有する産物を
    コードするトランスポザーゼドメインをさらに含む、請求項1記載のベクター。
  6. 【請求項６】 上記の1対のトランスポザーゼ認識挿入配列間の部位に位置
    する外因性配列をさらに含む、請求項1記載のベクター。
  7. 【請求項７】 トランスポザーゼ認識挿入配列が、31塩基対逆方向反復配列
    である、請求項1記載のベクター。
  8. 【請求項８】 転写活性遺伝子がそれぞれ、細胞内条件下で発現されるコー
    ド配列を含む、少なくとも2個の転写活性遺伝子に隣接した1対のP因子由来31塩
    基対逆方向反復配列を含む、外因性核酸を標的細胞ゲノムへ導入するためのP因
    子由来ベクター。
  9. 【請求項９】 1対のP因子由来31塩基対逆方向反復配列に隣接したベクター
    ドメインの外側に位置する、P因子トランスポザーゼ活性を有する産物をコード
    する核酸配列をさらに含む、請求項8記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 P因子由来31塩基対逆方向反復配列間に位置する外因性核
    酸をさらに含む、請求項8記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 標的細胞が昆虫細胞ではないという条件で、外因性核酸が
    ゲノムへ挿入されるように、外因性核酸を標的細胞ゲノムへ挿入する方法であっ
    て、転移が起こるために十分な条件下で、該外因性核酸を含むP因子由来ベクタ
    ーを該細胞へ導入する段階を含む方法。
  12. 【請求項１２】 標的細胞が動物細胞又は植物細胞である、請求項11記載の
    方法。
  13. 【請求項１３】 外因性核酸がゲノムへ挿入されるように、外因性核酸を標
    的細胞ゲノムへ挿入する方法であって、転移が起こるために十分な条件下で、請
    求項1記載のベクターを該細胞へ導入する段階を含む方法。
  14. 【請求項１４】 ベクターがトランスポザーゼドメインを含む、請求項13記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 トランスポザーゼドメインを含む第2のベクターを細胞へ
    導入する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
  16. 【請求項１６】 外因性核酸が、約50bp〜150,000bpの範囲の長さである、
    請求項13記載の方法。
  17. 【請求項１７】 標的細胞が脊椎動物細胞である、請求項13記載の方法。
  18. 【請求項１８】 脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項17記載の方法
    。
  19. 【請求項１９】 外因性核酸を標的細胞へ挿入するために使用されるキット
    であって、少なくとも2個の転写活性遺伝子に隣接した1対のP因子トランスポザ
    ーゼ認識挿入配列を含むP因子由来ベクターを含むキット。
  20. 【請求項２０】 転写活性遺伝子がそれぞれ、細胞内条件下で発現されるコ
    ード配列を含む、請求項19記載のキット。
  21. 【請求項２１】 ベクターが、トランスポザーゼ認識挿入配列間に位置する
    少なくとも1個のエンドヌクレアーゼ切断部位をさらに含む、請求項19記載のキ
    ット。
  22. 【請求項２２】 エンドヌクレアーゼ切断部位がポリリンカー内に存在する
    、請求項21記載のキット。
  23. 【請求項２３】 P因子トランスポザーゼ活性を有する産物をコードする核
    酸配列をさらに含む、請求項19記載のキット。
  24. 【請求項２４】 ベクターが、トランスポザーゼ活性を有する産物をコード
    する核酸配列を含む、請求項23記載のキット。
  25. 【請求項２５】 トランスポザーゼ活性を有する産物をコードする核酸配列
    が、第2のベクター上に存在する、請求項23記載のキット。
  26. 【請求項２６】 トランスポザーゼ認識挿入配列が、31塩基対逆方向反復配
    列である、請求項19記載のキット。
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