TWI617664B - 抗體之生產方法、獲得生產抗體之懸浮性之cho細胞之方法、生產抗體之懸浮性之cho細胞、及抗體表現載體 - Google Patents

抗體之生產方法、獲得生產抗體之懸浮性之cho細胞之方法、生產抗體之懸浮性之cho細胞、及抗體表現載體 Download PDF

Info

Publication number
TWI617664B
TWI617664B TW100146605A TW100146605A TWI617664B TW I617664 B TWI617664 B TW I617664B TW 100146605 A TW100146605 A TW 100146605A TW 100146605 A TW100146605 A TW 100146605A TW I617664 B TWI617664 B TW I617664B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
gene
transposon
pair
gene fragment
Prior art date
Application number
TW100146605A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201231650A (en
Inventor
Megumi Kurokawa
Keina Yamaguchi
Risa Ogawa
Masayoshi Tsukahara
Koichi Kawakami
Yoko Hayashi
Original Assignee
Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems, Kyowa Hakko Kirin Co Ltd filed Critical Inter Univ Research Institute Corporation Research Organization Of Information And Systems
Publication of TW201231650A publication Critical patent/TW201231650A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI617664B publication Critical patent/TWI617664B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明係關於一種將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端具有一對轉座子序列的表現載體導入至至少一種懸浮性之哺乳動物細胞中，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中的方法；懸浮培養生產該目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞而生產該目標蛋白質之方法；及表現該目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞。

Description

抗體之生產方法、獲得生產抗體之懸浮性之CHO細胞之方法、生產抗體之懸浮性之CHO細胞、及抗體表現載體
本發明係關於一種將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體導入至至少一種懸浮性之哺乳動物細胞中，將插入至一對轉座子序列間之基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中之方法；懸浮培養生產該蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞而生產該蛋白質之方法；表現該蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞；以及含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段，且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
藉由基因重組技術之外來蛋白質之生產現用於醫藥品及食品業界等各種產業。多數情形下，重組蛋白質之生產係藉由將包含編碼目標蛋白質之鹼基序列之表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞及動物細胞等宿主中，選擇染色體中組入有該表現載體之轉形株，進而於適當之培養條件下培養該轉形株，使目標蛋白質表現而進行。
然而，為了開發出可效率良好地生產外來蛋白質之宿主，必須對每個目標蛋白質選擇生產性良好之宿主細胞，業界期待對各宿主中之外來蛋白質生產技術的進一步技術革新。
於大腸桿菌等細菌及酵母之系統中，與動物細胞不同，多情況下糖鏈修飾等轉譯後修飾較為困難，於生產具有活性之蛋白質方面存在問題。
於昆蟲細胞之系統中，所生產之蛋白質具有受到磷酸化、糖鏈之附加等轉譯後修飾，而可在保持原本之生理活性之狀態下直接表現之優點。然而，由於分泌蛋白質之糖鏈結構與源自哺乳類細胞者不同，故而用於醫藥品用途時，抗原性等成為問題。
又，由於昆蟲細胞之系統係使用重組病毒導入外來基因，故而就安全性方面而言，存在必須將其滅活或封存之課題。
於動物細胞之系統中，對於源自以人為首之高等動物之蛋白質，更可以與生物體中所製造者相同之方式施加磷酸化、糖鏈附加及摺疊等轉譯後修飾。該正確之轉譯後修飾係於重組蛋白質中再現蛋白質原本所具有之生理活性所必需者，此種必需生理活性之醫藥品等中經常使用將哺乳動物細胞作為宿主之蛋白質生產系。
然而，將動物細胞作為宿主之蛋白質表現系之生產性一般較低，多數情況下導入基因之穩定性亦存在問題。提高將哺乳動物培養細胞作為宿主之蛋白質之生產性不僅於治療用醫藥品或診斷藥等之製造中非常重要，亦對該等之開發研究大有助益。因此，當務之急為開發出可將哺乳動物培養細胞、尤其是中國倉鼠卵巢細胞(CHO(Chinese Hamster's Oophoritis)細胞)作為宿主而容易地獲取高生產株的基因表現系。
轉座子係可自染色體中之一個基因座移動至其他基因座之轉座性遺傳因子。轉座子於分子生物學或遺傳學之研究中為強力工具，於昆蟲或線蟲(例如黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)或扁形蟲(Caenorhabditis elegans))及植物中用於突變導入、基因捕獲及基因轉殖個體之製作等目的。然而，此種技術於包含哺乳動物細胞之脊椎動物方面之開發較遲。
然而，近年來對於脊椎動物，亦報告有具有活性之轉座子，可確認其中之數種於小鼠或人等之哺乳動物細胞中亦具有活性。作為代表性者，可列舉自青鱂魚選殖之轉座子Tol1(專利文獻1)、Tol2(非專利文獻1)、由存在於鮭科魚類基因組之非自主性之轉座子再構建之睡美人(Sleeping Beauty)(非專利文獻2)、源自蛙之人工轉座子青蛙王子(Frog prince)(非專利文獻3)及源自昆蟲之轉座子piggyBac(非專利文獻4)。
該等DNA轉座子作為用以將新穎之表現系帶入哺乳動物細胞之基因組的基因導入工具而用於突變導入、基因捕獲、基因轉殖個體之製作及耐藥性蛋白質之表現等(非專利文獻5~12)。
對於昆蟲，研究有使用源自鱗翅目昆蟲之轉座子piggyBac將外來基因導入至蠶染色體，使該外來基因所編碼之蛋白質表現之方法，並揭示有使用該技術之蛋白質生產方法(專利文獻2)。
然而，所表現之目標蛋白質之表現量不充分，並且由於在蠶全身生產，故而為了以高純度之形式自存在大量之夾雜蛋白質之體液中回收所表現之外來蛋白質，需要高度之純化技術，因此於經濟上存在問題。
又，已知使用源自青鱂魚之Tol2轉座子，使於哺乳動物細胞中關於G418耐性之蛋白質表現之例(非專利文獻12、非專利文獻13)。
於在源自哺乳動物之培養細胞中生產醫療用之蛋白質醫藥品之情形時，為了防止未知病毒或病原性多肽之未預期之混入，較為重要的是於其生產步驟中不含源自動物之成分。CHO細胞作為生產蛋白質醫藥品之動物細胞使用最為頻繁，根據近年之研究，亦創造有可於不使用血清或源自動物之成分之安全之培養基中培養的懸浮性之CHO細胞株。然而，於無血清、無蛋白質條件下進行基因導入之株之生產性為在使用血清之條件下進行基因導入之株之一半(非專利文獻14)，顯示無血清、無蛋白質條件下之基因導入於技術上較為困難。
用以篩選表現目標蛋白質之細胞的選拔標記一般配置於同一基因表現載體上。其係基於如下假說：存在於基因組中之基因有容易表現之部位與不易表現之部位(稱為位置效應(Position Effect)，非專利文獻15)，若選拔標記進行表現，則目標蛋白質亦表現。
另一方面，亦已知於如抗體等般，目標蛋白質由複數個多肽所構成之情形時，使各自利用不同之載體表現。於抗體之情形時，抗體之重鏈之表現越高於輕鏈之表現，則生產性越高(非專利文獻16)。於同一載體上，預測重鏈與輕鏈之表現為固定，為了獲得較高之生產性，而藉由有意地使重鏈與輕鏈利用不同之載體表現，結果可獲得以最佳比例表現之細胞株。然而，於利用複數個不同之載體使蛋白質表現之情形時，亦需要複數個選拔標記基因。
作為克服該問題之手段，報告有將原本包含一個多肽鏈之dhfr基因分割成兩個多肽鏈，將其中一者配置於重鏈表現載體上，並將另一者配置於輕鏈表現載體上之例(非專利文獻17)。
然而，非專利文獻17所記載之細胞係對添加於培養基中之蛋白質成分具有依賴性之CHO細胞，如上所述，與無血清、無蛋白質條件下之基因導入之情形不同，有基因導入效率較高之可能性。可預想於無病毒感染等危險性之安全性較高之無血清、無蛋白質條件下導入基因時，生產性較高之細胞之選拔依然困難。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2008/072540號
專利文獻2：日本專利特表2001-532188號公報
非專利文獻
非專利文獻1：Nature 383,30(1996)
非專利文獻2：Cell 91,501-510(1997)
非專利文獻3：Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)
非專利文獻4：Insect Mol. Biol. 5,141-151(1996)
非專利文獻5：Genetics. 166,895-899(2004)
非專利文獻6：PLoS Genet,2,e169(2006)
非專利文獻7：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,10769-10773(1998)
非專利文獻8：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6759-6764(2001)
非專利文獻9：Nature 436,221-226(2005)
非專利文獻10：Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)
非專利文獻11：Nucleic Acids Res. 35,e87(2007)
非專利文獻12：Proc Natl Acad Sci USA,103,15008-15013(2006)
非專利文獻13：Plos Genetics,2,1715-1724(2006)
非專利文獻14：Biotech. Bioeng. 96,1118-1126(2007)
非專利文獻15：Nature Biotech. 22,1393-1398(2004)
非專利文獻16：Biotech. Bioeng. 96,337-348(2007)
非專利文獻17：Biotech. Bioeng. 84,439-444(2003)
為了生產、分析目標蛋白質，必須選擇使用源自哺乳動物之培養細胞而穩定地高度表現目標蛋白質的細胞株，但生產目標蛋白質之細胞之製作及培養需要極大之勞力與時間。
又，已知迄今為止使用轉座子序列而利用哺乳動物細胞進行目標蛋白質之表現，但關於藉由使用轉座子序列而製作可用作蛋白質之生產系之高度表現目標蛋白質之細胞的情況、使用轉座子序列之高效生產目標蛋白質之哺乳動物細胞之製作方法及使用該細胞之蛋白質之生產方法尚屬未知。
先前，業界要求如上所述使用哺乳動物培養細胞有效率地且於短期內製作高度表現目標蛋白質之蛋白質生產系，從而高效生產目標蛋白質。並且要求自基因導入至生產株之產生為止連貫地進行，產生完全不使用源自動物之成分的生產細胞。
因此，本發明之目的在於提供一種可有效率地製作之高度表現目標蛋白質的細胞及使用該細胞生產目標蛋白質之方法。
本發明者等人為了解決上述課題反覆努力研究，結果發現：藉由將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端具有一對轉座子序列的至少一種表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，將插入至一對(兩個)轉座子序列間之基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中，可有效地製作該目標蛋白質。進而發現：藉由使用該細胞，可高效地生產目標蛋白質，從而完成本發明。
即，本發明如下所述。
1.一種生產目標蛋白質之方法，其係將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼目標蛋白質之DNA的基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中，而獲得生產該目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞，並且懸浮培養該哺乳動物細胞而生產該目標蛋白質。
2.一種生產目標蛋白質之方法，其特徵在於包括以下步驟(A)~(C)：
(A)將以下表現載體(a)及(b)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，
(b)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之表現載體(b)使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼目標蛋白質之DNA的基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中，而獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞；
(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞而生產目標蛋白質。
3.一種獲得生產目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞之方法，其係將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼目標蛋白質之DNA的基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中，而獲得生產該目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞。
4.如上述1至3中任一項之方法，其中含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體之至少一者為含有包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
5.如上述1至4中任一項之方法，其中除了含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體以外，進而將於包含選擇標記基因之基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體導入至哺乳動物細胞中。
6.如上述1至5中任一項之方法，其中編碼目標蛋白質之DNA為編碼抗體之DNA。
7.如上述6之方法，其中編碼抗體之DNA為編碼抗體之H鏈之DNA及編碼抗體之L鏈之DNA中之至少一者。
8.如上述4至7中任一項之方法，其中將選自下述(a)~(d)中之表現載體導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；
(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；
(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；
(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
9.如上述1至8中任一項之方法，其中懸浮性之哺乳動物細胞為可於無血清培養下生存及增殖之細胞。
10.如上述1至9中任一項之方法，其中懸浮性之哺乳動物細胞為選自將CHO細胞藉由懸浮培養馴化之懸浮性之CHO細胞、PER.C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)及藉由懸浮培養馴化之懸浮性之小鼠骨髓瘤細胞NS0中之任一細胞。
11.如上述10之方法，其中CHO細胞為選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中之任一細胞。
12.如上述4至11中任一項之方法，其中選擇標記基因為環己醯亞胺耐性基因。
13.如上述12之方法，其中環己醯亞胺耐性基因為核糖體蛋白質。
14.如上述1至13中任一項之方法，其中一對轉座子序列為於哺乳動物細胞中發揮功能之一對源自DNA型轉座子之鹼基序列。
15.如上述14之方法，其中一對源自DNA型轉座子之鹼基序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
16.如上述15之方法，其中一對源自Tol2轉座子之鹼基序列為序列編號2所示之鹼基序列及序列編號3所示之鹼基序列。
17.如上述15之方法，其中一對源自Tol1轉座子之鹼基序列為序列編號14所示之鹼基序列及序列編號15所示之鹼基序列。
18.一種懸浮性之哺乳動物細胞，其藉由同時導入含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體(a)、及包含編碼識別該轉座子序列、且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性之轉座酶(轉移酶)之DNA的表現載體(b)，而將插入至該一對轉座子序列間之該基因片段組入染色體中，並且生產該目標蛋白質。
19.如上述18之哺乳動物細胞，其中含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體(a)為含有包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
20.如上述18或19之哺乳動物細胞，其係除了表現載體(a)及(b)以外，進而將含有包含選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體(c)導入至哺乳動物細胞中而成之細胞。
21.如上述18至20中任一項之哺乳動物細胞，其中編碼目標蛋白質之DNA為編碼抗體之DNA。
22.如上述21之哺乳動物細胞，其中編碼抗體之DNA為編碼抗體之H鏈之DNA及編碼抗體之L鏈之DNA中之至少一者。
23.如上述18至22中任一項之哺乳動物細胞，其中導入有選自下述(a)~(d)中之表現載體，
(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；
(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；
(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；
(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
24.如上述18至23中任一項之哺乳動物細胞，其係可於無血清培養下生存及增殖之懸浮性之哺乳動物細胞。
25.如上述18至24中任一項之哺乳動物細胞，其係選自將CHO細胞藉由懸浮培養馴化之懸浮性之CHO細胞、PER.C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)及藉由懸浮培養馴化之懸浮性之小鼠骨髓瘤細胞NS0中之任一懸浮性之哺乳動物細胞。
26.如上述25之哺乳動物細胞，其中CHO細胞為選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中之任一細胞。
27.如上述19至26中任一項之哺乳動物細胞，其中選擇標記基因為環己醯亞胺耐性基因。
28.如上述27之哺乳動物細胞，其中環己醯亞胺耐性基因為編碼人核糖體蛋白質之變異體之基因。
29.如上述19至28中任一項之哺乳動物細胞，其中一對轉座子序列為於哺乳動物細胞中發揮功能之一對源自DNA型轉座子之鹼基序列。
30.如上述29之哺乳動物細胞，其中一對源自DNA型轉座子之鹼基序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
31.如上述30之哺乳動物細胞，其中一對源自Tol2轉座子之鹼基序列為序列編號2所示之鹼基序列及序列編號3所示之鹼基序列。
32.如上述30之哺乳動物細胞，其中一對源自Tol1轉座子之鹼基序列為序列編號14所示之鹼基序列及序列編號15所示之鹼基序列。
33.一種表現載體，其含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段，且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列。
34.如上述33之表現載體，其中一對轉座子序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
35.如上述34之表現載體，其中一對源自Tol2轉座子之鹼基序列為序列編號2所示之鹼基序列及序列編號3所示之鹼基序列。
36.如上述34之表現載體，其中一對源自Tol1轉座子之序列為序列編號14所示之鹼基序列及序列編號15所示之鹼基序列。
根據本發明之蛋白質之生產方法，可使用懸浮性之哺乳動物細胞而效率良好地生產目標蛋白質。又，本發明之細胞可用作用以高效率地生產基因重組蛋白質或基因重組多肽的生產細胞。
本發明係關於一種將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體導入至哺乳動物細胞中，將插入至一對(兩個)轉座子序列間之包含編碼目標蛋白質之DNA的基因片段組入懸浮性之哺乳動物細胞之染色體中的方法，懸浮培養生產該蛋白質之哺乳動物細胞而生產該蛋白質的方法，及表現該蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞。
作為本發明之生產目標蛋白質之方法(以下亦稱為本發明之方法)，可列舉包含以下步驟(A)~(C)之生產目標蛋白質之方法。
步驟(A)將以下表現載體(a)及(b)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，
(b)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之動物細胞中之表現載體(b)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼目標蛋白質之DNA的基因片段組入上述哺乳動物細胞之染色體中，而獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞；
步驟(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞而生產目標蛋白質。
又，本發明係關於一種懸浮性之哺乳動物細胞，其導入有含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，於染色體中組入有插入至一對轉座子序列間之該基因片段，並且生產該目標蛋白質。
於本發明中，所謂目標蛋白質，係指包含一個以上之多肽之蛋白質，根據本發明之方法，可表現至少一種目標蛋白質、及/或表現至少一個多肽。
所謂含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，係指一種或兩種以上之該表現載體。具體而言，為了表現包含複數個多肽之目標蛋白質，需要使用含有包含編碼各多肽之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的複數個表現載體。
更具體而言，例如於上述包含複數個多肽之目標蛋白質為抗體之情形時，可使抗體之H鏈及L鏈利用一種表現載體表現，亦可使用表現H鏈之載體及表現L鏈之載體之兩種表現載體而使其表現。
根據本發明之方法，可使用如下懸浮性之哺乳動物細胞製造目標蛋白質，該懸浮性之哺乳動物細胞中導入有含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，於染色體中組入有插入至一對轉座子序列間之該基因片段，並且生產該目標蛋白質。
視為基因插入之指標之選擇標記基因可組入與包含編碼目標蛋白質之DNA之表現載體同一載體上，亦可組入其他載體上。
即，可將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體中之至少一者設為含有包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
又，亦可除含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體以外，進而將含有包含選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體導入至哺乳動物細胞中。
具體的而言，作為本發明之生產目標蛋白質之方法，可列舉包含以下步驟(A)~(C)之生產目標蛋白質之方法。
步驟(A)將以下表現載體(a)及(b)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼目標蛋白質之DNA與選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的蛋白質表現載體，
(b)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之動物細胞中之表現載體(b)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之上述基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中，而獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞；
步驟(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞而生產目標蛋白質。
又，作為本發明之生產目標蛋白質之方法，可列舉具有以下步驟(A)~(C)之生產目標蛋白質之方法。
步驟(A)將以下表現載體(a)、(b)及(c)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，
(b)於選擇標記基因之兩端包含一對轉座子序列之表現載體，
(c)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之動物細胞中之表現載體(c)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之上述基因片段組入該哺乳動物細胞之染色體中，獲得表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞；
步驟(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞而生產目標蛋白質。
本發明係關於如下懸浮性之哺乳動物細胞，其導入有含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體及於選擇標記基因之兩端包含一對轉座子序列之表現載體，於染色體中組入有插入至一對轉座子序列間之該基因片段及選擇標記基因，並且生產該目標蛋白質。
又，本發明係關於如下懸浮性之哺乳動物細胞，其導入有含有包含編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因之兩端包含一對轉座子序列的蛋白質表現載體，於染色體中組入有插入至一對轉座子序列間之該基因片段，並且生產該目標蛋白質。
又，作為本發明之生產目標蛋白質之哺乳動物細胞，可列舉如下懸浮性之哺乳動物細胞，其藉由同時導入含有包含編碼目標蛋白質之DNA與選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列蛋白質表現載體(a)、及包含編碼識別該轉座子序列、且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性之轉座酶(轉移酶)之DNA的載體(b)，而將插入至該一對轉座子序列間之該基因片段組入染色體中，並且生產該目標蛋白質。
於本發明中，含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段、於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之表現載體只要可藉由該哺乳動物細胞而表現及製造目標蛋白質，則數量並無限制，可列舉較佳為1~20種表現載體，進而較佳為2~10種表現載體，例如較佳為3~8種表現載體、4~7種表現載體、1~6種表現載體、1~5種表現載體、1~4種表現載體、1~3種表現載體。
又，作為本發明之態樣，可列舉藉由將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種蛋白質表現載體(a)、及包含編碼識別該轉座子序列、且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性之轉座酶之DNA的載體(b)同時導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，從而增加插入至該一對轉座子序列間之該基因片段對該哺乳動物細胞之染色體中之組入的方法，將編碼目標蛋白質之DNA高頻度地組入該哺乳動物細胞之染色體中之方法，及藉由該方法而獲得之生產目標蛋白質的懸浮性之哺乳動物細胞。
於本說明書中，所謂「轉座子」，係轉座性遺傳因子，意指保持一定之結構而於染色體上轉座(transposition)、或自染色體轉座至其他染色體的基因單位。
轉座子包含沿基因單位之兩端逆向或同向之重複之轉座子序列[亦稱為反向重複序列(Inverted Repeat Sequence，IR序列)或末端反向重複序列(Terminal Inverted Repeat Sequence，TIR序列)]及編碼識別該轉座子序列、並使存在於該轉座子序列間之基因轉移之轉座酶的鹼基序列。
由轉座子所轉譯之轉座酶藉由識別轉座子兩端之轉座子序列，切割出插入至一對轉座子序列間之DNA片段，並插入至轉移目標而進行DNA之轉移。
於本說明書中，所謂「轉座子序列」，意指藉由轉座酶而識別之轉座子之鹼基序列，與IR序列或TIR序列同義。若包含該鹼基序列之DNA可藉由轉座酶之作用而轉移(插入至基因組中之其他位置)，則亦可包含不完全之重複部分，於轉座酶中存在特異性之轉座子序列。
本發明所使用之轉座子序列較佳為源自DNA型轉座子之鹼基序列，更佳為藉由轉座酶而識別之可於哺乳動物細胞內轉座之天然或人工之一對源自DNA型轉座子的鹼基序列。
作為源自DNA型轉座子之鹼基序列，例如可列舉源自以下轉座子之鹼基序列：源自青鱂魚之Tol1轉座子及Tol2轉座子、由存在於鮭科魚類基因組中之非自主性之轉座子所再構建之睡美人、源自蛙之人工轉座子青蛙王子以及源自昆蟲之轉座子PiggyBac。
於該等中，較佳為源自以下轉座子之鹼基序列：包含以序列表之序列編號6所示之鹼基序列之源自青鱂魚之Tol2轉座子及包含以序列表之序列編號13所示之鹼基序列之源自青鱂魚之Tol1轉座子。
作為一對源自Tol2轉座子之鹼基序列，可列舉以序列表之序列編號6所示之Tol2轉座子之鹼基序列之第1位起至第2229位的鹼基序列及第4148位起至第4682位的鹼基序列。
作為一對源自Tol2轉座子之鹼基序列，更佳為列舉以序列表之序列編號1所示之Tol2轉座子之鹼基序列中之第1位至第200位的鹼基序列(序列編號2)(以下記載為「Tol2-L序列」)與第2285位起至第2788位的鹼基序列(序列編號3)(以下記載為Tol2-R序列)。
作為一對源自Tol1轉座子之轉座子序列，可列舉以序列表之序列編號13所示之Tol1轉座子之鹼基序列之第1位起至第157位的鹼基序列及第1748位起至第1855位的鹼基序列。
作為一對源自Tol1轉座子之轉座子序列，更佳為列舉以序列表之序列編號13所示之Tol1轉座子之鹼基序列中之第1位起至第200位的鹼基序列(序列編號14)(以下記載為「Tol1-L序列」)與第1351位起至第1855位的鹼基序列(序列編號15)(以下記載為Tol1-R序列)。
於本發明所使用之轉座子序列中，亦包含藉由使用上述源自轉座子之轉座子序列之部分序列、調節鹼基序列之長度、及進行由鹼基序列之附加、缺失或置換而產生之改變而控制轉移反應的轉座子序列。
作為本發明之生產目標蛋白質之方法，亦包含使用至少兩種轉座子序列與至少兩種轉座酶而製造至少一種目標蛋白質。
具體而言，例如可列舉包含如下步驟之蛋白質之製造方法：將插入至兩個Tol1轉座子序列中之包含編碼第一個目標蛋白質之DNA的載體、插入至兩個Tol2轉座子序列中之包含編碼第二個目標蛋白質之DNA的載體、Tol1轉座酶表現載體及Tol2轉座子表現載體同時地或依序地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，將編碼各目標蛋白質之DNA組入該哺乳動物細胞之染色體中，取得生產兩種目標蛋白質之哺乳動物細胞。
又，第一個目標蛋白質與第二個目標蛋白質可相同，藉由增加導入至細胞中之基因之複製數，亦可提高目標蛋白質之生產性。
轉座子之轉移反應之控制可藉由促進或抑制利用轉座酶之轉座子序列之識別而促進或抑制轉移反應。又，轉座子之轉移反應可藉由縮短一對(兩個)轉座子序列間所包含之鹼基序列之長度而增加其轉移反應，並可藉由延長而減少轉移反應。因此，於表現‧製造包含複數個蛋白質之目標蛋白質之情形時，可製作將編碼各蛋白質之DNA組入各表現載體中，將該DNA組入宿主細胞之染色體內，並且生產該目標蛋白質的懸浮性之哺乳動物細胞，使用該細胞而製造目標蛋白質。
於本說明書中，所謂「轉座酶」，意指識別具有轉座子序列之鹼基序列，使存在於該鹼基序列間之基因片段轉移至染色體上，或自染色體轉移至其他染色體的酵素。
作為轉座酶，例如可列舉源自以下轉座子之酵素：源自青鱂魚之Tol1及Tol2、由存在於鮭科魚類基因組之非自主性之轉座子所再構建之睡美人(SB)、睡美人11(SB11)、源自蛙之人工轉座子青蛙王子(FP)、或源自昆蟲之轉座子PiggyBac(PB)。
轉座酶可使用天然型之酵素，若與轉座酶保持同樣之轉座活性，則其一部分之胺基酸亦可經置換、缺失、插入、及/或附加。可藉由控制轉座酶之酵素活性而控制存在於轉座子序列間之基因片段之轉移反應。
為了分析是否保持與轉座酶相同之轉移活性，可藉由日本專利特開2003-235575號公報所揭示之雙成分分析系統而測定。
具體而言，可分別使用包含缺失Tol2轉座酶之Tol2轉座子(源自Tol2之非自主性轉座子)之質體與包含Tol2轉座酶之質體，分析非自主性Tol2元素是否可藉由轉座酶之作用而轉移、插入至哺乳動物細胞之染色體內。
於本說明書中，所謂「非自主性轉座子」，係指缺失存在於轉座子內之轉座酶，無法自主性地轉移的轉座子。非自主性轉座子可藉由使轉座酶之蛋白質、編碼轉座酶之蛋白質之mRNA(messenger ribonucleic acid，訊息核糖核酸)或編碼轉座酶之蛋白質之DNA同時存在於細胞內而使插入至非自主性轉座子之轉座子序列間之DNA轉移至宿主細胞之染色體內。
所謂轉座酶基因，意指編碼轉座酶之基因。為了提高於哺乳動物細胞中之表現效率，亦可於該基因之轉譯起始密碼子ATG之上游連結有將柯薩克之一致序列[Kozak,M. Nucleic Acids Res.,12,857-872(1984)]、或作為核糖體結合序列的夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子之間調節成適當之距離(例如6~18個鹼基)的序列。
於本發明之方法中，為了將至少一種表現載體中之編碼目標蛋白質之DNA組入宿主細胞之染色體中，將含有包含編碼目標蛋白質之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體導入至宿主細胞中，使轉座酶對導入至該細胞內之表現載體所包含之轉座子序列產生作用。
為了使轉座酶對導入至宿主細胞內之表現載體所包含之轉座子序列產生作用，可將轉座酶注入於該細胞內，亦可將包含編碼轉座酶之DNA之表現載體與包含編碼至少一種目標蛋白質之DNA、或編碼目標蛋白質之DNA及選擇標記基因之表現載體一併導入至宿主細胞中。又，亦可將編碼轉座酶基因之RNA導入至宿主細胞內，使轉座酶於該細胞內表現。
作為表現載體，並無特別限定，可根據導入組入有轉座酶基因之表現載體之宿主細胞、用途等而自業者所知曉之表現載體中適當選擇並使用。
於本發明中，於生產由兩種以上之多肽所構成之目標蛋白質、或兩種以上之目標蛋白質之情形時，可藉由將編碼各蛋白質之DNA組入同一表現載體中，或分別組入不同之表現載體中，將該表現載體導入至宿主細胞中，從而製作該DNA組入該細胞之染色體中之蛋白質生產細胞。
轉座酶可組入表現載體中而與目標蛋白質一併表現，亦可組入與表現載體不同之載體中而表現。可使轉座酶暫時性地發揮作用，亦可連續地發揮作用，為了製作穩定之產生細胞，較佳為使轉座酶暫時性地發揮作用。
作為使轉座酶暫時性地發揮作用之方法，例如可列舉將編碼轉座酶之DNA組入與包含編碼目標蛋白質之DNA之表現載體不同之表現載體中，將兩個表現質體同時地導入至宿主細胞中之方法。
於本說明書中，所謂「表現載體」，意指用以將哺乳動物細胞轉形而表現目標蛋白質的表現載體。本發明所使用之表現載體具有於表現卡匣之兩側存在至少一對轉座子序列之結構。
於本說明書中，所謂「表現卡匣」，意指具有表現目標蛋白質所必需之基因表現控制區域及編碼目標蛋白質之序列的核酸序列。作為該基因表現控制區域，例如可列舉促進子、啟動子及終止子等。於表現卡匣中亦可包含選擇標記基因。
作為啟動子，只要為可於哺乳動物細胞中發揮功能者，則可使用任一者。例如可列舉巨細胞病毒(CMV，Cytomegalovirus)之IE(immediate early，即刻早期)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)之啟動子及促進子等。又，亦可將人CMV之IE基因之促進子與啟動子一併使用。
所謂「選擇標記基因」，意指可用以區別導入有質體載體之細胞與缺少該載體之細胞的任意之其他標記基因。
作為選擇標記基因，例如可列舉耐藥性基因[新黴素耐性基因、二氫葉酸還原酶(DHFR，dihydrofolate reductase)基因、嘌呤黴素耐性基因、殺稻瘟菌素耐性基因、吉歐黴素耐性基因、潮黴素耐性基因、環己醯亞胺耐性基因(日本專利特開2002-262879號公報)]及螢光或生物發光標記基因(綠色螢光蛋白質GFP(Green Fluorescent Protein)等)等。
於本發明中，較佳之選擇標記為耐藥性基因，尤佳之選擇標記為環己醯亞胺耐性基因。進而，藉由將選擇標記基因進行基因改變而製作胺基酸改變體、或調整選擇標記基因之轉錄或轉譯(例如啟動子之改變及胺基酸密碼子之改變等)，亦可改變選擇標記蛋白質之耐藥性能及發光能力。進而，亦可藉由調整藥劑濃度而選擇耐藥性強度不同之選擇標記基因導入細胞。
為了調整選擇標記蛋白質之耐藥性能及發光能力，較佳為使用減弱化之選擇標記基因。所謂減弱化之選擇標記基因，係指以由選擇標記基因所編碼之蛋白質之細胞內之活性降低之方式而改變之選擇標記基因。
作為以細胞內之活性降低之方式而改變之選擇標記基因，例如可列舉(A)藉由改變由選擇標記基因所編碼之蛋白質之胺基酸序列而降低於該蛋白質之細胞內之活性的選擇標記基因，及(B)藉由改變控制選擇標記基因之表現之鹼基序列或改變選擇標記基因之ORF(Open Reading Frame，開放閱讀框架)內之鹼基序列而降低於該蛋白質之細胞內之表現量的選擇標記基因。
作為藉由改變由選擇標記基因所編碼之蛋白質之胺基酸序列而降低於該蛋白質之細胞內之活性的選擇標記基因，例如可列舉Sauter et al.[Biotech. Bioeng. 89,530-538(2005)]或Chen et al.[Journal of Immunological Methods 295,49-56(2004)]所記載之新黴素耐性基因。
作為藉由改變控制選擇標記基因之表現之鹼基序列而降低於該蛋白質之細胞內之表現量之方法，例如可列舉改變控制選擇標記基因之表現之啟動子序列、終止子序列、促進子序列、柯薩克一致序列或夏因-達爾加諾序列之序列的方法。更具體而言，例如可列舉將控制選擇標記基因之表現之啟動子序列置換為更弱之啟動子序列的方法。
作為藉由改變選擇標記基因之ORF內之鹼基序列而降低於當該蛋白質之細胞內之表現量之方法，例如可列舉將該ORF內之密碼子置換為於該細胞內之使用頻度更低之同義密碼子的方法。
作為本發明之減弱化之選擇標記基因，例如可列舉將上述該基因之ORF內之密碼子置換為於該細胞內之使用頻度更低之同義密碼子而成之選擇標記基因。
於各種生物種之細胞內，各同義密碼子中之使用頻度更低之同義密碼子可基於公知之文獻或資料庫等而選擇。
作為此種向使用頻度較低之同義密碼子之置換，具體而言，例如於CHO細胞之情形時，係指將白胺酸之密碼子置換為TTA，將精胺酸之密碼子置換為CGA或CGT，將丙胺酸之密碼子置換為GCG，將纈胺酸之密碼子置換為GTA，將絲胺酸之密碼子置換為TCG，將異白胺酸之密碼子置換為ATA，將蘇胺酸之密碼子置換為ACG，將脯胺酸置換為CCG，將麩胺酸之密碼子置換為GAA，將酪胺酸之密碼子置換為TAT，將離胺酸之密碼子置換為AAA，將苯丙胺酸之密碼子置換為TTT，將組胺酸之密碼子置換為CAT，將麩醯胺之密碼子置換為CAA，將天冬醯胺之密碼子置換為AAT，將天冬醯胺酸之密碼子置換為GAT，將半胱胺酸之密碼子置換為TGT，或將甘胺酸之密碼子置換為GGT。
於減弱化之選擇標記基因中，經置換之密碼子之數與改變前之選擇標記基因相比，只要可有效地取得蛋白質之生產細胞，則並無特別限制，較佳為置換20個以上之對應於胺基酸殘基之密碼子。
於減弱化之選擇標記基因中，與改變前之選擇標記基因相比，改變之鹼基之數並無特別限制，較佳為改變編碼選擇標記基因之鹼基序列之10%以上。
又，於減弱化之選擇標記基因中，置換之密碼子所編碼之胺基酸殘基並無特別限制，較佳可列舉白胺酸、丙胺酸、絲胺酸及纈胺酸。
於減弱化之選擇標記基因中，於置換對應於白胺酸殘基之密碼子之情形時，並無特別限制，較佳為置換選擇標記基因所包含之所有白胺酸殘基所對應之密碼子中70%以上之白胺酸殘基所對應之密碼子。
又，於減弱化之選擇標記基因中，於置換對應於丙胺酸殘基之密碼子之情形時，並無特別限制，較佳為置換選擇標記基因所包含之所有丙胺酸殘基所對應之密碼子中70%以上之丙胺酸殘基所對應之密碼子。
作為此種藉由置換為使用頻度較低之同義密碼子而改變並獲得之減弱化之選擇標記基因之例，具體而言，可列舉包含序列編號37、38或39所示之鹼基序列之新黴素耐性基因、包含序列編號41、43或44所示之鹼基序列之嘌呤黴素耐性基因、包含序列編號45或46所示之鹼基序列之吉歐黴素耐性基因、包含序列編號47或48所示之鹼基序列之潮黴素耐性基因。
進而，亦可藉由於抗體生產細胞之製作中，使選擇耐藥性細胞時之藥劑之濃度明顯高於通常所使用之濃度，或於耐藥性基因代謝‧分解藥劑前追加投予等，從而將選擇標記基因減弱化。
環己醯亞胺(以下亦有時簡稱為CHX(cycloheximide))為蛋白質合成抑制劑，作為將CHX耐性基因作為選擇標記之利用例，已知有酵母[Kondo K. J. Bacteriol.,177,24,7171-7177(1995)]、動物細胞(日本專利特開2002-262879號公報)之例。
已知於動物細胞中，表現以序列表之序列編號5所示之鹼基序列所編碼之人核糖體蛋白質次單元之L36a之54位之脯胺酸置換成麩醯胺而成的以序列表之序列編號7所示之鹼基序列所編碼之蛋白質的轉形株賦予對環己醯亞胺之耐性。又，作為環己醯亞胺耐性標記，例如可列舉人核糖體蛋白質次單元L44之54位之脯胺酸置換為麩醯胺而成之突變人核糖體蛋白質次單元L44。
作為於宿主細胞中導入包含上述轉座子序列之蛋白質表現載體、表現轉座酶之質體載體或RNA的方法，並無特別限定，例如可列舉磷酸鈣法、電穿孔法、脂質體法、基因槍法及脂質體轉染法等。
作為將轉座酶直接作為蛋白質而導入之方法，例如可列舉微注射法及藉由內噬作用而供給至細。基因導入例如可利用新基因工學手冊、村松正實‧山本雅/編、羊土公司、ISBN 9784897063737所記載之方法而實施。
作為宿主細胞，可列舉可繼代培並可穩定地表現目標蛋白質之哺乳動物細胞。作為宿主細胞，例如可列舉PER.C6細胞、人白血病細胞Namalwa細胞、猴細胞COS細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)、小鼠骨髓瘤細胞NS0、小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14、敍利亞倉鼠細胞BHK、HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,601275(1968)；Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in Cell Science,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77,4216(1980)；Proc. Natl. Acad. Sci.,60,1275(1968)；Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp. 883-900)]、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat #11619)、Pro-3及CHO細胞之亞株。
又，上述宿主細胞可藉由改變染色體DNA及導入外來性基因等而以適於蛋白質之生產之方式改變，並用於本發明之蛋白質之生產方法。
進而，作為宿主細胞，為了控制結合於生產之目標蛋白質的糖鏈結構，亦可使用獲得凝集素耐性之Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、缺失α1,6-岩藻糖轉移酶基因之CHO細胞(國際公開第05/35586號、國際公開第02/31140號)、缺失GDP(guanosine diphosphate，鳥苷二磷酸鹽)-甘露糖4,6-脫水酶(GMD，GDP-mannose 4,6-dehydratase)之細胞及缺失Fx蛋白質之細胞。
於本發明中，所謂目標蛋白質，包括包含至少一種多肽之蛋白質、包含複數個多肽或蛋白質之複合蛋白質之任一者。又，於本發明中，蛋白質與多肽同義，但亦有時將比較低分子量之蛋白質分子或構成複合蛋白質之蛋白質定義為多肽。
於本發明中，目標蛋白質只要可藉由本發明之方法而表現，則可為任何蛋白質、多肽。具體而言，例如可列舉人血清蛋白質、白蛋白結合蛋白質、肽激素、生長因子、細胞激素、凝血因子、線溶系蛋白質、抗體、選擇標記蛋白質、膜蛋白質及各種蛋白質之部分片段等。具體的而言，例如可列舉人靜脈免疫球蛋白(IVIG，Intravenous immunoglobulin)、紅血球生成素(EPO，erythropoietin)、白蛋白、生長激素(GH，Growth Hormone)、激濾泡素(FSH，Follicle Stimulating Hormone)、肝細胞生長因子(HGF，Hepatocyte Growth Factor)、胰島素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I，Insulin-like Growth Factor-I)、干擾素(INF，interferon)、Fas配位子、凝血因子(II、VII、VIII、IX、X)、凝血酶原、血纖維蛋白原、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III(ATIII)、組織纖維蛋白溶酶原活化物(tPA，tissue plasminogen activator)、單株抗體、多株抗體及藥劑選擇(耐性)基因等。
所謂抗體，係指包含抗體重鏈(H鏈)多肽與兩條抗體輕鏈(L鏈)多肽之分子，已知有IgA(immunoglobulinA，免疫球蛋白A)、IgD、IgE、IgG及IgM亞型。進而IgG可分類為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4類。
IgG抗體為包含兩條H鏈多肽與兩條L鏈多肽之異四聚體分子。H鏈及L鏈分別包含參與抗原結合之可變區(V)及恆定區(C)，稱為VH(variable region of heavy chain，重鏈可變區)、CH(constant region of heavy chain，重鏈恆定區)、vL(variable region of light chain，輕鏈可變區)或CL(constant region of heavy chain，輕鏈恆定區)。CH區域進而分類為CH1、CH2、CH3區域，將與CH2及CH3區域一併稱為Fc(fragment crytallizable，可結晶片段)區域或僅稱為Fc。
於抗體中包含於單獨之抗原決定區反應之單株抗體、於複數個抗原決定區反應之多株抗體、基因重組抗體。
所謂單株抗體，係指單一純系之抗體產生細胞所分泌之抗體，僅識別一個抗原決定區(亦稱為抗原決定基)，且構成單株抗體的胺基酸序列(1次結構)較為均勻。
所謂多株抗體，係指單株抗體之混合物，可於複數個抗原決定區反應。
作為基因重組抗體，例如可列舉嵌合抗體、人源化抗體、人源抗體、Fc融合蛋白質、Fc胺基酸改變抗體、多價抗體及該部分片段等。胺基酸改變抗體可於可變區或恆定區任一部分上實施胺基酸殘基改變，抗體之活性受到控制。
於多價抗體中具有於一個抗原上之兩個以上之不同之抗原決定區上反應之多價抗體、於兩個以上之不同之抗原上反應之多價抗體等，可為任一者。又，只要為維持對抗原之結合活性之多價抗體，可為任一結構之多價抗體(國際公開第2001/77342號、美國專利第7,612,181號說明書、國際公開第2009/131239號)。
根據本發明之製造方法，可表現、製造上述任一目標蛋白質及/或目標肽。
作為本發明之導入有編碼至少一種目標蛋白質之DNA的細胞，可列舉藉由以下(A)及(B)之步驟而製造之抗體產生細胞。
步驟(A)將選自以下(a)~(c)中之一個表現載體之組合或表現載體(d)、及表現載體(e)同時導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及編碼耐藥性基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(e)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)選擇藉由步驟(A)中導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之表現載體(e)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之上述H鏈、L鏈及選擇標記基因組入上述哺乳動物細胞之染色體中的表現抗體之懸浮性之哺乳動物細胞。
作為本發明之製造抗體之方法，可列舉包含以下步驟(A)~(C)之生產目標蛋白質之方法。
步驟(A)將選自以下(a)~(c)中之一個表現載體之組合或表現載體(d)、及表現載體(e)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及編碼耐藥性基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(e)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之表現載體(e)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之上述H鏈、L鏈及選擇標記基因組入上述哺乳動物細胞之染色體中，而獲得表現抗體之懸浮性之哺乳動物細胞；
步驟(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現抗體之懸浮性之哺乳動物細胞而生產抗體。
又，本發明包括包含以下(A)及(B)之步驟之抗體高生產株之製造方法及篩選方法。
步驟(A)將選自以下(a)~(c)中之一個表現載體之組合或表現載體(d)、及表現載體(e)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(e)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)選擇藉由步驟(A)中導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之表現載體(e)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之上述H鏈、L鏈及選擇標記基因組入上述哺乳動物細胞之染色體中而高度表現抗體的懸浮性之哺乳動物細胞。
進而，本發明包括包含以下(A)、(B)及(C)之步驟之抗體製造方法。
步驟(A)將選自以下(a)~(c)中之一個表現載體之組合或表現載體(d)、及表現載體(e)同時地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中，
(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及編碼選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、以及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體，
(e)包含編碼如下轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；
步驟(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之表現載體(e)而使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之上述H鏈、L鏈及選擇標記基因組入上述哺乳動物細胞之染色體中，獲得表現抗體之懸浮性之哺乳動物細胞；
步驟(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現抗體之懸浮性之哺乳動物細胞而生產抗體。
作為本發明之導入有編碼至少一種目標蛋白質之DNA的哺乳動物細胞，例如可列舉導入有複數個不同之抗體基因之多株抗體產生細胞及複合體分子產生細胞等。
作為多株抗體產生細胞，例如可列舉導入有對於一個抗原之至少兩種以上之不同之單株抗體基因的細胞、導入有對於複數個抗原之複數個單株抗體基因的細胞、導入有抗原經免疫之源自非人動物之抗體基因庫的細胞及導入有源自患者之抗體基因庫的細胞等。
複合體分子生產細胞只要為導入有編碼於細胞內共同表現之各分子形成複合體分子之蛋白質之DNA的細胞，則可為任一者。具體而言，例如可列舉共同導入有FcγRIII(CD16)與共用γ鏈(commonγ)之細胞、共同導入有新生兒Fc受體(FcRn，neonatal Fc receptor)與β2巨球蛋白之細胞、及共同導入有CD98與LAT1之細胞(國際公開第2007/114496號)等。
藉由本發明之抗體製造方法而製造之抗體可為任一抗體，例如可列舉識別腫瘤相關抗原之抗體、識別與過敏或炎症相關之抗原之抗體、識別與循環器官疾病相關之抗原之抗體、識別與自體免疫疾病相關之抗原之抗體、及識別與病毒或細菌感染相關之抗原之抗體等。
作為腫瘤相關抗原，例如可列舉CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40配體(CD40L)、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、腎上腺髓素(adrenomedullin)、血管生成素相關蛋白4(ARP4，angiopoietin related protein 4)、極光激酶(aurora)、B7-H1、B7-DC、整合蛋白(integlin)、骨髓基質抗原2(BST2，bone marrow stromal antigen 2)、CA125、CA19.9、碳酸酐酶9(CA9，carbonic anhydrase 9)、鈣黏附蛋白(cadherin)、cc-趨化素受體(CCR，cc-chemokine receptor)4、CCR7、癌胚抗原(CEA，carcinoembryonic antigen)、富半胱胺酸纖維母細胞生長因子受體-1(CFR-1，cysteine-rich fibroblast growth factor receptor-1)、c-Met、c-Myc、膠原蛋白(collagen)、CTA(Cancer-testis antigen，腫瘤睪丸抗原)、結締組織生長因子(CTGF，connective tissue growth factor)、細胞毒性T淋巴抗原-4(CTLA-4，Cytotoxic T lymphocyte antigen-4)、細胞角蛋白-18(cytokeratin-18)、DF3、E-鈣黏附蛋白(E-catherin)、表皮生長因子受體(EGFR，epidermal growth facter receptor)、EGFRvIII、EGFR2(HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor2，人表皮生長因子受體2))、EGFR3(HER3)、EGFR4(HER4)、細胞膜糖蛋白(endoglin)、上皮細胞黏附分子(EpCAM，epithelial cell adhesion molecule)、內皮細胞蛋白質C受體(EPCR，endothelial protein C receptor)、肝配蛋白(ephrin)、肝配蛋白受體(Eph，ephrin receptor)、EphA2、內皮細胞酶-2(ET2，endotheliase-2)、FAM3D(Family with sequence Similarity 3,member D，序列相似家族3成員D)、纖維母細胞活化蛋白(FAP，fibroblast activating protein)、Fc受體同源物1(FcRH1，Fc receptor homologl)、鐵蛋白(ferritin)、纖維母細胞生長因子-8(FGF-8，fibroblast growth factor-8)、FGF8受體(FGF8 receptor)、鹼性FGF(bFGF，basic FGF)、bFGF受體(bFGF receptor)、FGF受體(FGFR，FGF receptor)3、FGFR4、FLT1、FLT3、葉酸受體(folate receptor)、捲曲同源物10(FZD10，Frizzled homologue 10)、捲曲受體(FZD-4，frizzled receptor 4)、G250、G-CSF受體(G-CSF receptor)、神經節苷脂(ganglioside)(例如GD2、GD3、GM2及GM3等)、globo H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙醯肝素酶I(heparanase I)、肝細胞生長因子(HGF，hepatocyte growth factor)、HGF受體(HGF receptor)、HLA抗原(HLA antigen)(例如HLA-DR等)、HM1.24、人乳脂球(HMFG，human milk fat globule)、hRS7、熱休克蛋白90(hsp90，heat shock protein 90)、個體遺傳性抗原決定區(idiotype epitope)、胰島素樣生長因子(IGF，insulin-like growth factor)、IGF受體(IGFR，IGF receptor)、介白素(interleukin)(例如IL-6及IL-15等)、介白素受體(interleukin receptor)(例如IL-6R及IL-15R等)、整合素(integrin)、免疫受體移位關聯-(IRTA-4，immune receptor translocation associated-4)、胰舒血管素1(kallikrein 1)、KDR(Kinase insert domain receptor，激酶插入嵌合受體)、KIR2DL1(Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL1，殺傷細胞免疫球蛋白受體2DL1)、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1(Lysosomal-associated membrane protein-1，溶酶體相關膜蛋白-1)、lamp-2、層黏連蛋白-5(laminin-5)、路易斯y(Lewis y)、唾液酸化路易斯x(sialyl Lewis x)、淋巴毒素β受體(LTBR，lymphotoxin-beta receptor)、LUNX(Lung specific X protein，肺特異性蛋白)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP，melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan)、間皮素(mesothelin)、MICA(major histocompatibility complex class I chain-related gene A，主要組織相容性複合體I類鏈相關基因A)、謬勒抑制物質II型受體(MISIIR，Mullerian inhibiting substance type II receptor)、黏蛋白(mucin)、神經細胞黏附分子(NCAM，neural cell adhesion molecule)、Necl-5、Notch1、骨橋蛋白(osteopontin)、血小板衍生生長因子(PDGF，platelet-derived growth factor)、PDGF受體(PDGF receptor)、血小板因子-4(PF-4，platelet factor-4)、磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine)、前列腺特異抗原(PSA，Prostate Specific Antigen)、前列腺肝細胞抗原(PSCA，prostate stem cell antigen)、前列腺特異膜抗原(PSMA，prostate specific membrane antigen)、甲狀旁腺激素相關蛋白/肽(PTHrP，Parathyroid hormone related protein/peptide)、核因子kB受體活化因子配體(RANKL，receptor activator of NF-kappaB ligand)、透明質酸結合蛋白受體(RHAMM，receptor for hyaluronic acid mediated motility)、ROBO1(Roundabout homolog 1，迂迴同源物)、SART3(Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3，T細胞識別鱗狀細胞癌抗原3)、導向蛋白4B(SEMA4B，semaphorin 4B)、分泌性白血球蛋白酶抑制物(SLPI，secretory leukocyte protease inhibitor)、SM5-1、鞘氨醇-1-磷酸酯(sphingosine-1-phosphate)、腫瘤相關糖蛋白-72(TAG-72，tumor-associated glycoprotein-72)、轉鐵蛋白受體(TfR，transferrin receptor)、TGF-β(Transforming growth factor beta，轉化生長因子-β)、Thy-1、Tie-1(Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1，上皮生長因子樣域酪氨酸激酶1)、Tie2受體(Tie2 receptor)、T細胞免疫球蛋白域與黏蛋白域蛋白(TIM-1，T cell immunoglobulin domain and mucin domain 1)、人組織因子(hTF，human tissue factor)、Tn抗原(Tn antigen)、腫瘤壞死因子(TNF，tumor necrosis factor)、托馬斯-弗列德裏希抗原(TF antigen，Thomsen-Friedenreich antigen)、TNF受體(TNF receptor)、腫瘤壞死因子相關配體(TRAIL，tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)、TRAIL受體(TRAIL receptor)(例如DR4及DR5等)、系統ASC胺基酸轉運蛋白2(ASCT2，system ASC amino acid transporter 2)、trkC(tyrosine kinase receptor C，酪氨酸激酶受體C)、TROP-2(trophoblastic cell surface protein-2，滋養層細胞表面蛋白2)、TWEAK(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑)受體Fn14(fibroblast growth factor-inducible 14，纖維母細胞生長因子誘導)(TWEAK receptor Fn14)、IV型膠原酶(type IV collagenase)、尿激酶受體(urokinase receptor)、血管內皮生長因子(VEGF，vascular endothelial growth factor)、VEGF受體(VEGF receptor)(例如VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3等)、波形蛋白(vimentin)及VLA-4(very late antigen，極遲反應抗原)等，可列舉對於該等抗原之抗體等。
進而，作為識別腫瘤相關抗原之抗體，例如可列舉抗GD2抗體[Anticancer Res.,13,331(1993)]、抗GD3抗體[Cancer Immunol. Immunother.,36,260(1993)]、抗GM2抗體[Cancer Res.,54,1511(1994)]、抗CD52抗體[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89,4285(1992)]、抗MAGE抗體[British J. Cancer,83,493(2000)]、抗HM1.24抗體[Molecular Immunol.,36,387(1999)]、抗甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)抗體[Cancer,88,2909(2000)]、抗bFGF抗體、抗FGF-8抗體[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86,9911(1989)]、抗bFGFR抗體、抗FGFR1抗體(國際公開第2005/037235號)、抗FGF-8R抗體[J. Biol. Chem.,265,16455(1990)]、抗IGF抗體[J. Neurosci. Res.,40,647(1995)]、抗IGF-IR抗體[J. Neurosci. Res.,40,647(1995)]、抗PSMA抗體[J. Urology,160,2396(1998)]、抗VEGF抗體[Cancer Res.,57,4593(1997)、Avastin(R)]、抗VEGFR抗體[Oncogene,19,2138(2000)、國際公開第96/30046號]、抗CD20抗體[Curr. Opin. Oncol.,10,548(1998)、US5,736,137、Rituxan(R)、Ocrelizumab、Ofatumumab]、抗EGFR抗體(Erbitux(R)、Vectivix(R))、抗HER2抗體(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89,4285(1992)、US5,725,856、Herceptin(R)、Pertuzumab)、抗HER3抗體(US2008/0124345)、c-Met抗體(US6,468,529)、抗CD10抗體、抗EGFR抗體(國際公開第96/402010號)、抗Apo-2R抗體(國際公開第98/51793號)、抗ASCT2抗體(國際公開第2010/008075號)、抗CEA抗體[癌症研究(Cancer Res.),55(23 suppl): 5935s-5945s,(1995)]、抗CD38抗體、抗CD33抗體、抗CD22抗體、抗CD20胺基酸改變抗體(Immunology,115,4393,2010.)、抗EpCAM抗體、抗A33抗體及抗葉酸受容體抗體(MRAb-003)等。
作為識別與過敏或炎症相關之抗原之抗體，例如可列舉抗介白素6抗體[Immunol. Rev.,127,5(1992)]、抗介白素6受容體抗體[Molecular Immunol.,31,371(1994)、Actemura(R)]、抗介白素5抗體[Immunol. Rev.,127,5(1992)]、抗介白素5受容體抗體、抗介白素4抗體[Cytokine,3,562(1991)]、抗介白素4受容體抗體[J. Immunol. Methods,217,41(1998)]、抗腫瘤壞死因子抗體[Hybridoma,13,183(1994)、Humira(R)]、抗腫瘤壞死因子受容體抗體[Molecular Pharmacol.,58,237(2000)]、抗CCR4抗體[Nature,400,776(1999)]、抗趨化素抗體(Peri et al.,J. Immunol. Meth.,174,249-257,1994)及抗趨化素受容體抗體[J. Exp. Med.,186,1373(1997)]等。作為識別與循環器官疾病相關之抗原之抗體，例如可列舉抗GPIIb/IIIa抗體[J. Immunol.,152,2968(1994)]、抗血小板衍生生長因子抗體[科學(Science),253,1129(1991)]、抗血小板衍生生長因子受容體抗體[J. Biol. Chem.,272,17400(1997)]、抗凝血因子抗體[Circulation,101,1158(2000)]、抗IgE((immunoglobulin E，免疫球蛋白E))抗體、抗αVβ3抗體及α4β7抗體等。
作為識別與病毒或細菌感染相關之抗原之抗體，例如可列舉抗gp120抗體[Structure,8,385(2000)]、抗CD4抗體[J. Rheumatology,25,2065(1998)]、抗CCR5抗體、抗維羅毒素抗體[J. Clin. Microbiol.,37,396(1999)]及抗M2抗體(日本專利特開2003-235575號公報)等。
藉由本發明之方法而生產之單株抗體之效應器活性可利用各種方法控制。例如已知控制對存在於鍵結於抗體之Fc區域之第297位之天冬醯胺(Asn)之N結合複合型糖鏈之還原末端的N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)進行α1,6鍵結的岩藻糖(亦稱為核心岩藻糖)之量之方法(國際公開第05/035586號、國際公開第02/31140號、國際公開第00/61739號)及藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而進行控制之方法等。藉由本發明之方法而生產之單株抗體藉由任一方法均可控制效應器活性。
所謂「效應器活性」，係指經由抗體之Fc區域而引起之抗體依賴性之活性，已知有抗體依賴性細胞毒活性(ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity)活性)、補體依賴性毒活性(CDC(complement-dependent cytotoxicity)活性)、或由巨噬細胞或樹狀細胞等吞噬細胞所產生之抗體依賴性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。
又，藉由控制利用本發明之方法而生產之單株抗體之Fc區域之N結合複合型糖鏈之核心岩藻糖之含量，可使抗體之效應器活性增加或降低。
作為使與鍵結於抗體之Fc區域之N結合複合型糖鏈鍵結的岩藻糖之含量降低之方法，可藉由使用α1,6-岩藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞而表現抗體，從而取得未鍵結岩藻糖之抗體。未鍵結岩藻糖之抗體具有較高之ADCC活性。
另一方面，作為使與鍵結於抗體之Fc之N結合複合型糖鏈鍵結的岩藻糖之含量增加之方法，可藉由使用導入有α1,6-岩藻糖轉移酶基因之宿主細胞而表現抗體，從而取得鍵結有岩藻糖之抗體。鍵結有岩藻糖之抗體具有低於未鍵結有岩藻糖之抗體的ADCC活性。
又，可藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而使ADCC活性或CDC活性增加或降低。例如可藉由使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書所記載之抗體之Fc區域之胺基酸序列而增加抗體之CDC活性。
又，亦可藉由進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書、或美國專利第7,317,091號說明書所記載之胺基酸改變而使抗體之ADCC活性或CDC活性增加或降低。
所謂本發明所使用之「懸浮性之哺乳動物細胞」，係指可不接著於微球或組織培養用培養器(亦稱為組織培養或接著培養容器等)等經塗佈使得培養細胞容易接著之細胞培養支持體，而於培養液中懸浮並生存及增殖的細胞。
只要細胞接著於細胞培養支持體，則可於培養液中以一個細胞之狀態生存、增殖，或亦可以細胞彼此凝集複數個而成之細胞塊之狀態生存、增殖之任一狀態。
進而，作為本發明所使用之懸浮性之哺乳動物細胞，較佳為可於不含胎牛血清(fetal calf serum，以下稱為FCS)等之無血清培養基中，不接著於細胞培養支持體而懸浮於培養液中生存及增殖的細胞，更佳為可於不含蛋白質之無蛋白質培養基中懸浮並生存及增殖的哺乳動物細胞。
作為組織培養用培養器，只要為經接著培養用之塗佈之燒瓶、培養皿等則可為任何培養器。具體而言，例如藉由使用市售之組織培養燒瓶(greiner公司製造)及接著培養燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製造)等，可確認為懸浮性之哺乳動物細胞。
作為本發明所使用之懸浮性之哺乳動物細胞，可為原本具有懸浮性之性質之藉由懸浮培養馴化的細胞、將接著性之哺乳動物細胞於懸浮性之培養條件下馴化而成的懸浮性之哺乳動物細胞中之任一者。
作為原本具有懸浮性之性質之哺乳動物細胞，例如可列舉PER.C6細胞、大鼠骨髓瘤細胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或亦稱為YB2/0)及CHO-S細胞(Invitrogen公司製造)等。
上述「將接著性之哺乳動物細胞於懸浮性之培養條件下馴化而成之懸浮性之哺乳動物細胞」可利用Mol. Biotechnol. 2000,15(3),249-57所記載之方法、或以下所示之方法等而製作，藉由確定為顯示與懸浮培養馴化前同樣之、或優於懸浮培養馴化前之增殖及生存性的細胞而可進行製作[J. Biotechnol. 2007,130(3),282-90]。
所謂「與懸浮培養馴化前同等」，意指藉由懸浮培養馴化之細胞之生存率及增殖速度(倍增時間)等與懸浮培養馴化前之細胞相比實質上相同。
於本發明中，作為使接著性之哺乳動物細胞於懸浮性之培養條件下馴化之方法，可列舉以下方法。將含血清之培養基之血清含量減少成1/10，於比較高之細胞濃度下重複繼代培養，於哺乳動物細胞可生存及增殖之時間點上，進而減少血清含量，重複繼代培養。藉由該方法，可製作可於非血清下生存、增殖的懸浮性之哺乳動物細胞。
又，藉由於培養液中添加適當之非離子性界面活性劑Pluronic-F68等而進行培養之方法，亦可製作懸浮性之哺乳動物細胞。
作為藉由馴化成懸浮性之培養條件而成為懸浮性的接著性之哺乳動物細胞，例如可列舉小鼠骨髓瘤細胞NS0及CHO細胞等。
於本發明中，作為懸浮性之哺乳動物細胞所具有之性質，於以2×105細胞/mL懸浮培養該細胞之情形時，3~4天後之培養結束時之細胞密度較佳為5×105細胞/mL以上，更佳為8×105細胞/mL以上，尤佳為1×106細胞/mL以上，最佳為1.5×106細胞/mL以上。
又，作為本發明之懸浮性之哺乳動物細胞之倍增時間，較佳為48小時以下，更較佳為24小時以下，尤佳為18小時以下，最佳為11小時以下。
懸浮培養基例如可使用CD-CHO培養基(Invitrogen公司)、EX-CELL 325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)及SFM4CHO培養基(HyClone公司)等市售之培養基。又，亦可藉由調配哺乳動物細胞之培養所必需之糖類、胺基酸類等進行製備而獲得。
懸浮性之哺乳動物細胞之培養可使用可懸浮培養之培養容器，藉由可懸浮培養之培養條件而進行。作為培養容器，例如可利用細胞培養用之96孔培養盤(Corning公司)、T-燒瓶(Becton,Dickinson and Company公司)及三角燒瓶(Corning公司)等。
作為培養條件，例如可於5%之CO2環境中，於培養溫度為37℃下藉由靜置培養等而進行。亦可使用作為懸浮培養專用之培養設備之Wave生物反應器(GE Healthcare Biosciences公司)等振盪培養裝置等。
關於使用Wave生物反應器裝置之懸浮性之哺乳動物細胞之懸浮培養條件，可利用GE Healthcare Biosciences公司首頁http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf所記載之方法進行。
除振盪培養以外，亦可藉由生物反應器等旋轉攪拌裝置進行培養。生物反應器中之培養可利用Cytotechnology(2006) 52:199_207所記載之方法等進行。
於本發明中使用懸浮性之哺乳動物細胞以外之細胞株之情形時，只要為利用如上所述之方法藉由懸浮培養馴化之哺乳動物細胞株，且為可使用本發明之蛋白質生產方法的細胞株，則可使用任一細胞株。
利用懸浮性之哺乳動物細胞所生產之目標蛋白質之純化係藉由自包含目標蛋白質之培養液或細胞破碎液分離目標蛋白質與目標蛋白質以外之雜質而進行。作為分離之方法，例如可列舉離心分離、透析、硫酸銨沈澱、管柱層析及過濾器等，可藉由目標蛋白質與雜質之物理化學性質之不同或對管柱單體之結合力之不同而進行。
純化目標蛋白質之方法例如可藉由蛋白質實驗手冊(上)萃取‧分離與重組蛋白質之表現(羊土公司，岡田雅人‧宮崎香/編，ISBN 9784897069180)所記載之方法而實施。
於本說明書中所引用之科學文獻、專利、專利申請等參考文獻中，其整體係與各自具體所記載者相同程度地於本說明書中作為參考而援用。
以上，為了容易理解而表示較佳之實施形態對本發明進行說明。以下，基於實施例對本發明進而具體地進行說明，上述之說明及以下之實施例僅提供於例示之目的，並非提供於限定本發明之目的。因此，本發明之範圍並不限定於本說明書所具體記載之實施形態或實施例，而藉由申請專利之範圍所限定。
關於以下所記述之選殖等關於基因重組之各種實驗技術，係依照J. Sambrook,E. F. Frisch,T. Maniatis著，分子選殖第2版(Molecular Cloning 2nd edition)及Frederick M. Ausubel等人編，Current Protocols發行，Current Protocols in Molecular Biology等所記載之基因工程之方法而進行。
實 施例 [實施例1]　抗人流感M2抗體表現轉座子載體之製作
於蛋白質表現用質體載體中使用含有包含插入至一對Tol2轉座子序列間之任意之人源抗體基因及藥劑選擇標記基因之哺乳動物細胞用基因表現卡匣的質體。
所使用之基因之DNA根據已知之鹼基序列而人工地化學合成，或藉由製作其兩端序列之引子，將適當之DNA來源作為模板進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)而取得。為了其後之基因操作，對引子之末端附加限制酶切斷部位。
轉座子序列係使用日本專利特開2003-235575號公報所揭示之非自主性Tol2轉座子之鹼基序列(序列編號1)中，第1位至第200位之鹼基序列(Tol2-L序列)(序列編號2)、與第2285位至第2788位之鹼基序列(Tol2-R序列)(序列編號3)的鹼基序列。
藉由以下方法，製作分別包含一對轉座子序列之合成DNA片段(Takara Bio股份有限公司製造)。製作包含於Tol2-R序列之5'末端及3'末端兩者連結限制酶NruI之識別序列之鹼基序列的DNA片段。又，製作包含於Tol2-L序列之5'末端連結限制酶FseI之識別序列，於3'末端連結限制酶AscI之識別序列之鹼基序列的DNA片段。
繼而，將所製作之包含Tol2-R序列及Tol2-L序列之DNA片段插入至包含編碼抗人流感M2抗體Z3G1之胺基酸序列之鹼基序列的表現載體N5LG1_M2_Z3載體(國際公開第06/061723號)中。
於抗體基因表現卡匣中使用有於CMV促進子/啟動子控制下插入有編碼抗人流感M2抗體Z3G1(ATCC Deposit No. PTA-5968；deposited March 13,2004,American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)之H鏈(序列編號10)之鹼基序列(序列編號9)及編碼L鏈(序列編號12)之鹼基序列(序列編號11)的N5LG1_M2_Z3載體(國際公開第06/061723號)。
於M5LG1_M2_Z3載體之存在於包含抗體基因表現卡匣及選擇標記基因表現卡匣之基因片段之5'末端側的限制酶NruI區插入包含Tol2-R序列之DNA片段。又，於存在於3'末端側之限制酶FseI及AscI區插入包含Tol2-L序列之DNA片段。
進而，於CMV促進子/啟動子控制下，將連結有編碼對環己醯亞胺之耐性基因(人核糖體蛋白質L36a之54位之脯胺酸突變為麩醯胺之基因)之鹼基序列(序列編號5)的環己醯亞胺耐性基因表現卡匣插入至連結有Tol2轉座子序列之N5LG1_M2_Z3載體之FseI識別部位，構建抗人流感M2抗體轉座子表現載體(圖1)。
另一方面，將不含轉座子序列之載體命名為抗人流感M2抗體表現載體，用作對照載體(圖2)。
[實施例2]　轉座酶表現載體之製作
轉座酶係使用與作為目標之抗體之表現載體獨立之表現載體而使其表現。即，於pCAGGS載體(Gene 108,193-200，1991)之CAGGS啟動子之下游插入編碼源自青鱂魚之Tol2轉座酶之基因(序列編號4)，製作Tol2轉座酶表現載體(以下簡稱為Tol2載體)(圖3)。
[實施例3]　使用哺乳動物細胞之轉形體之製作(1)懸浮化CHO細胞之製作
將於添加有10%血清(FCS)之α-MEM培養基(Invitrogen公司)下培養之接著性CHO細胞藉由胰蛋白酶處理而剝離、回收，使用新的添加10% FCS之α-MEM培養基，於5% CO2培養箱內，於37℃下振盪培養。數天後，確認該等細胞增殖後，以2×105個/mL之濃度播種於添加5% FCS之α-MEM培養基中，並進行振盪培養。
進而，於數天後，使用添加5% FCS之α-MEM培養基進行相同之播種操作。最終使用不含血清之α-MEM培養基重複繼代、振盪培養，確認具有與血清存在下之培養相同之增殖能力，並製作懸浮培養馴化株。
(2)　生產抗體之CHO細胞之製作
使用實施例1及實施例2之抗人流感M2抗體表現轉座子載體(以下簡稱為轉座子載體)及Tol2載體pCAGGS-T2TP[圖3，Kawakami K & Noda T. Genetics. 166,895-899(2004)]作為表現載體。又，使用不具有轉座子序列之抗人流感M2抗體表現載體作為對照。
將上述表現載體導入至藉由懸浮培養馴化之CHO-K1細胞(American Type Culture Collection Cat. No. CCL-61)或HEK293細胞(Invitrogen公司FreeStyle 293F細胞)中，比較獲得對環己醯亞胺之耐性純系之頻度。
將各4×106個細胞懸浮於400 μL之PBS(Phosphate Buffer Solution，磷酸緩衝溶液)中，將抗人流感M2抗體表現轉座子載體(10 μg)與Tol2載體(25 μg)藉由電穿孔法而以環狀DNA之形式直接共同導入。再者，Tol2載體係為了使Tol2轉座酶暫時表現，以防止組入宿主染色體為目的而以環狀DNA之形式直接導入。
又，作為對照，將抗人流感M2抗體表現載體(10 μg)根據標準之利用電穿孔之基因導入法，藉由限制酶而製成直鏈狀後，導入至各細胞中。
電穿孔係使用電穿孔儀(electroporator)(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司製造))，於電壓為300 V、靜電電容為500 μF、室溫之條件下，使用間隙寬度為4 mm之比色管(Bio-Rad公司製造)而進行。
於利用電穿孔進行基因導入後，將各細胞播種至3片96孔培養盤中，CHO細胞係使用SAFC Biosciences公司之EX-CELL 325-PF培養基，HEK293細胞係使用freeStyle-293培養基(Invitrogen公司)，於CO2培養箱內培養3天。
繼而，於基因導入後4天後之培養基交換後，添加3 μg/mL之環己醯亞胺，於環己醯亞胺存在下進行培養，每1週進行培養基交換行，並進行3週培養。
培養3週後，數出可觀察到環己醯亞胺耐性群落之孔數。
將其結果示於表1及表2。
如表1所示，於在懸浮性之CHO-K1細胞中導入抗人流感M2抗體表現轉座子載體或抗人流感M2抗體表現載體時，自導入有抗人流感M2抗體表現載體之細胞與其他細胞株同樣地無法取得環己醯亞胺耐性之轉形株，自抗人流感M2抗體表現轉座子載體導入細胞可高頻度地獲得環己醯亞胺耐性之轉形株。
另一方面，如表2所示，於HEK293細胞中導入抗人流感M2抗體表現轉座子載體或抗人流感M2抗體表現載體中之任一表現載體均無法取得環己醯亞胺耐性之轉形株。
根據該等結果，可知於懸浮性之哺乳動物細胞中，插入至一對轉座子序列間之編碼目標蛋白質之DNA之基因及環己醯亞胺耐性基因效率良好地導入至宿主細胞之染色體內中。
(3)　懸浮性CHO細胞與接著性CHO細胞中之抗體生產之研究
為了研究懸浮性CHO細胞或接著性CHO細胞中之抗體生產效率，研究各細胞株中之抗體之產生量。使用藉由懸浮培養馴化之懸浮性CHO-K1細胞作為懸浮性CHO細胞。又，使用懸浮培養馴化前之接著性CHO-K1細胞作為接著性CHO細胞。
將抗人流感M2抗體表現轉座子載體(10 μg)與Tol2載體(25 μg)分別對懸浮性CHO-K1細胞及接著性CHO-K1細胞進行電穿孔。其後，將懸浮性CHO-K1細胞與接著性CHO-K1細胞分別播種於3片之96孔培養盤中。
懸浮性CHO-K1細胞係使用懸浮細胞用培養基(SAFC Biosciences公司之EX-CELL 325-PF)，接著性CHO-K1細胞係使用添加10%血清之α-MEM培養基(Invitrogen公司)。將各細胞於CO2培養箱內培養3天，於自電穿孔起4天後之培養基交換後，於3 μg/mL之環己醯亞胺存在下培養3週。此時，每1週進行培養基交換。
懸浮性CHO-K1細胞係將1×106個細胞播種於6孔培養盤中，於CO2培養箱內振盪培養3天，使用培養上清液藉由HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)測定抗人流感M2抗體之蛋白質量。
接著性CHO-K1細胞係於在6孔培養盤達到融合後(2×106個)進行培養基交換，並靜置培養3天，然後使用培養上清液，藉由HPLC測定抗體蛋白質量。
培養上清液中之抗體濃度之測定係依照FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316所記載之方法而進行。將結果示於圖4。
如圖4A所示，藉由懸浮培養馴化之CHO-K1細胞可大量獲得顯示極高之抗體表現量之細胞。另一方面，如圖4B所示，接著性之CHO-K1細胞僅可獲得顯示HPLC之檢測界限(5 μg/mL)以下之表現量之細胞。
根據該等結果，發現為了使用轉座子載體使目標蛋白質表現，於使用懸浮性之哺乳動物細胞之情形時可高度表現目標蛋白質。
又，根據實施例1~3之結果，可知本發明之方法可用作使用藉由懸浮培養馴化之懸浮性之哺乳動物細胞而有效地製作高度表現外來基因之生產細胞，並生產目標蛋白質的新穎之方法。
[實施例4]　利用Tol1轉座子之抗體表現細胞之製造及抗體
製造(1)抗人流感M2抗體表現Tol1轉座子載體之製作與實施例1同樣地，於蛋白質表現用質體載體中使用含有包含插入至一對Tol1轉座子序列間之任意之人源抗體基因及藥劑選擇標記基因之哺乳動物細胞用基因表現卡匣的質體。
所使用之基因之DNA係根據已知之序列資訊而人工地化學合成，或藉由製作其兩端序列之引子，將適當之DNA來源作為模板進行PCR而取得。為了進行其後之基因操作，對引子之末端附加限制酶切斷部位。
轉座子序列係使用以序列表之序列編號13所示之非自主性Tol1轉座子之鹼基序列(國際公開第2008/072540號)中，第1位至第200位之鹼基序列(Tol1-L序列)(序列編號14)、與第1351位至第1855位之鹼基序列(Tol1-R序列)(序列編號15)。
藉由以下方法，分別製作包含一對轉座子序列之合成DNA片段。製作包含於Tol1-R序列之5'末端及3'末端兩者連結限制酶NruI之識別序列之鹼基序列的DNA片段。又，製作包含於Tol1-L序列之5'末端連結限制酶FseI之識別序列，於3'末端連結限制酶AscI之識別序列之鹼基序列的DNA片段。
繼而，將所製作之包含Tol1-R序列及Tol1-L序列之DNA片段插入至N5LG1_M2_Z3載體中。於N5LG1_M2_Z3載體之存在於包含抗體基因表現卡匣及選擇標記基因表現卡匣之基因片段之5'末端側的限制酶NruI區插入包含Tol1-R序列之DNA片段，於存在於3'末端側之限制酶FseI及AscI區插入包含Tol1-L序列之DNA片段。
進而，於CMV促進子/啟動子控制下，將連結有對環己醯亞胺之耐性基因(人核糖體蛋白質L36a之54位之脯胺酸突變為麩醯胺之基因)(序列編號7)的環己醯亞胺耐性基因表現卡匣插入至連結有Tol1轉座子序列之N5LG1_M2_Z3載體之FSeI識別部位，構建抗人流感M2抗體Tol1轉座子表現載體(圖5)。
(2) Tol1轉座酶表現載體之製作
轉座酶係使用與目標抗體之表現載體獨立之表現載體而使其表現。即，於CMV促進子/啟動子控制下，將連結有編碼包含序列編號16所示之鹼基序列之源自青鱂魚之Tol1轉座酶(序列編號17)之DNA片段的Tol1轉座酶基因表現卡匣插入至pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司製造)，用作Tol1轉座酶表現載體pTollase(圖6)。
(3)　生產抗體之CHO細胞之製作
使用上述(1)~(3)所製作之表現載體，藉由與實施例3相同之方法研究利用Tol1轉座子之表現載體之導入效果。將其結果示於表3。
如表3所示，若於懸浮性之CHO-K1細胞中導入抗人流感M2抗體表現Tol1轉座子載體，則可與導入有抗人流感M2抗體表現Tol2轉座子載體之實施例3同樣地以高頻度獲得環己醯亞胺耐性之轉形株。
根據該結果，可知於懸浮性之哺乳動物細胞中，即便使用作為源自Tol1轉座子之鹼基序列的轉座子序列，亦可將插入至兩個轉座子序列間之抗體基因及環己醯亞胺耐性基因效率良好地導入至宿主細胞之染色體內。
(4)　懸浮性CHO細胞中之抗體生產之研究
使用Tol1轉座子，以與實施例3之(3)同樣之方式對懸浮性CHO細胞中之抗體生產效率進行研究。
培養上清液中之抗體濃度之測定係依照FEMS Yeast Res.,7,(2007)、1307-1316所記載之方法而進行。將結果示於圖7。
如圖7所示，於使用作為源自Tol1轉座子之鹼基序列的轉座子序列之情形時，亦可與Tol2同樣地大量獲得顯示極高之抗體表現量的細胞。根據該結果，可知於使用源自Tol1轉座子之鹼基序列作為轉座子序列之情形時，亦可與使用源自Tol2轉座子之鹼基序列之情形同樣地獲得高度表現目標蛋白質之懸浮性之哺乳動物細胞。
[實施例5]　抗人CD98抗體之製作
(1)　抗人CD98抗體重鏈表現轉座子載體及抗人CD98抗體輕鏈表現轉座子載體之製作
為了製作具有序列編號20及23之胺基酸序列所示之可變區H鏈及L鏈的抗人CD98抗體，使人IgG1抗體恆定區之胺基酸序列連結於各抗體可變區，製作H鏈及L鏈之胺基酸序列。
連結訊息序列之抗人CD98抗體重鏈可變區及輕鏈可變區之基因序列(序列編號18、21)係使用組入日本專利第4324637號公報所揭示之(N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L載體)序列，轉座子序列、啟動子等係使用與實施例1相同者而分別構建抗人CD98抗體重鏈表現轉座子載體(簡稱為CD98H載體)及抗人CD98抗體輕鏈表現轉座子載體(簡稱為CD98L載體)(圖8、9)。
所使用之DNA片段係根據已知之序列人工地化學合成，或藉由製作其兩端序列之引子，將適當之DNA來源作為模板進行PCR而取得。為了其後之重組操作，對引子之末端附加限制酶切斷部位。
(2)　環己醯亞胺耐性基因表現轉座子載體之製作
於實施例1所記載之CMV促進子/啟動子控制下，連結編碼環己醯亞胺耐性基因之序列(序列編號7)，將一對轉座子序列(Tol-2L、Tol2-R)插入至該環己醯亞胺耐性基因表現卡匣之兩端，構建環己醯亞胺耐性基因表現轉座子載體(以下簡稱為CHX載體)(圖10)。
所使用之DNA片段係根據已知之序列而人工地化學合成，或藉由製作其兩端序列之引子，將適當之DNA來源作為模板進行PCR而取得。為了其後之基因操作，對引子之末端附加限制酶切斷部位。
(3)　生產抗人CD98抗體之CHO細胞之製作
將上述(1)及(2)所製作之CD98H載體(圖8)、CD98L載體(圖9)、CHX載體(圖10)及實施例2所製作之Tol2載體(圖3)導入至藉由懸浮培養馴化之CHO-K1細胞中，比較高度表現抗體之細胞之出現數。
於實驗區中，將4×106個CHO-K1細胞懸浮於400 μL之PBS中，藉由電穿孔法將CD98H載體(10 μg)、CD98L載體(10 μg)、CHX載體(10 μg)及Tol2載體(10 μg)以環狀DNA之形式直接共同導入。Tol2載體為了使Tol2轉座酶暫時表現，以防止組入宿主染色體為目的，以環狀DNA之形式直接導入。電穿孔係使用電穿孔儀(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司製造))，於電壓為300 V、靜電電容為500 μF、室溫之條件下使用間隙寬度為4 mm之比色管(Bio-Rad公司製造)而進行。
又，於對照區中，於將CD98H載體(10 μg)、CD98L載體(10 μg)及CHX載體(10 μg)分別使用限制酶PciI(Takara Bio公司)製成直鏈狀後，以與上述相同之方式進行電穿孔。
於藉由電穿孔進行基因導入後，各比色管之細胞係懸浮於添加有0.5%大豆水解物之CD OptiCHO培養基(Invitrogen公司)(以下稱為0.5 CD培養基)，並播種於1片96孔培養盤中，於CO2培養箱內培養4天。繼而，於基因導入後5天後之培養基交換後，使用添加有3 μg/mL之環己醯亞胺(Sigma-Aldrich公司之C4859)的0.5 CD培養基，於環己醯亞胺存在下進行培養，每1週進行培養基交換，並培養4週。
於培養4週後，抗體之表現係藉由利用FRET(Fluorescence resonance energy transfer，螢光共振能量轉移)之三明治法(LENCETM，PerkinElmer公司)而定量。抗體高度表現細胞係測量培養上清液中之抗體濃度表現為5.0 μg/mL以上的純系作為表現抗體之細胞，將其結果示於表4。
如表4所示，於與抗人CD98抗體重鏈表現轉座子載體、抗人CD98抗體輕鏈表現載體及環己醯亞胺耐性基因載體一併將Tol2載體共同導入至懸浮性之CHO-K1細胞中的實驗區中，可確認大量抗人CD98抗體表現細胞，但於未共同導入有Tol2載體之對照區中，雖然將載體線狀化，但無法確認抗人CD98抗體表現細胞。
[實施例6]　抗人CD98抗體之製造(1)包含抗人CD98抗體重鏈基因片段、抗人CD98抗體輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因的表現轉座子載體之製作
於實施例5(1)所製作之抗人CD98抗體重鏈表現轉座子載體上分別連結該實施例5(1)所製作之抗人CD98抗體輕鏈表現基因卡匣及實施例5(2)所製作之環己醯亞胺耐性基因卡匣，與上述同樣地使用合成DNA、PCR法而構建包含抗人CD98抗體重鏈基因片段、抗人CD98抗體輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(以下簡稱為CD98-CHX串聯載體)。
(2)　包含抗人CD98抗體重鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體之製作
於實施例5(1)所製作之抗人CD98抗體重鏈表現轉座子載體上分別連結實施例5(2)所示之環己醯亞胺耐性基因卡匣，與上述同樣地使用合成DNA、PCR法而構建包含抗人CD98抗體重鏈及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(簡稱為CD98H-CHX表現轉座子載體)。
(3)　生產抗人CD98抗體之CHO細胞之製作
使用上述實施例5(1)及(2)以及上述實施例6(1)及(2)所製作之表現轉座子載體，比較於將抗人CD98抗體之H鏈及L鏈利用同一表現載體進行基因導入之情形(對照區)，將抗人CD98抗體之H鏈、L鏈或環己醯亞胺耐性基因分別利用不同之表現載體進行基因導入之情形(實驗區1)、及將H鏈或L鏈利用不同之表現載體進行基因導入之情形(實驗區2)的高度表現抗CD98抗體之細胞之出現數。
於實驗區1中，將4×106個CHO-K1細胞懸浮於400 μL之PBS中，將CD98H載體(10 μg)、CD98L載體(10 μg)、CHX載體(10 μg)、及Tol2載體(10μg)藉由電穿孔法以環狀DNA之形式直接共同導入。
於實驗區2中，將4×106個CHO-K1細胞懸浮於400 μL之PBS中，將CD98H-CHX載體(10 μg)、CD98L載體(10 μg)及Tol2載體(10 μg)藉由電穿孔法而以環狀DNA之形式直接共同導入。
於對照區中，將4×106個CHO-K1細胞懸浮於400 μL之PBS中，將CD98-CHX串聯載體(10 μg)、Tol2載體(20 μg)藉由電穿孔法以環狀DNA之形式直接共同導入。又，於所有實驗中，Tol2載體為了使Tol2轉座酶暫時表現，及以防止組入宿主染色體為目的，以環狀DNA之形式直接導入。
以下之方法係藉由與實施例5(3)相同之方法，進行抗體生產細胞之出現率之確認。抗體表現細胞係測量培養上清液中之抗體濃度為3.0 μg/mL以上之純系作為表現抗體之細胞。將其結果示於表5。
於導入有CD98H載體、CD98L載體及CHX載體之實驗區1、以及導入有CD98H載體及CD98L載體之實驗區2中，高度表現抗人CD98抗體之細胞之出現率大幅增加。
以上之結果顯示，與將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因組入同一表現載體上之表現載體導入至懸浮性CHO細胞中相比，將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因分別插入至不同之轉座子序列間的表現載體共同導入至懸浮性CHO細胞中可更為容易地取得及製造抗體高生產株。又，根據實驗區1與實驗區2之結果，可知即便於所導入之載體為複數個之情形時，耐藥性基因(選擇標記基因)至少為一個則充分。進而，可知耐藥性基因可於組入有抗體重鏈基因之表現載體上，亦可於其他獨立之載體上。
以上結果顯示，作為先前較為困難之將配置於兩個以上之載體上之基因同時效率良好地導入至懸浮性之哺乳動物細胞中之手段，轉座子載體較為有效。進而，顯示為了高效生產由複數個多肽所構成之蛋白質及複數個蛋白質，將各多肽或蛋白質利用不同之轉座子載體導入於細胞中較為有效。
(4)　生產抗人CD98抗體之CHO細胞之培養
對上述實施例6(3)所獲得之導入有CD98-CHX串聯載體之細胞以及導入有CD98H-CHX載體及CD98L載體之細胞各自中抗體表現量較高之前3株比較抗體表現量。將實驗之詳情示於以下。
將實施例6(3)所獲得之以環己醯亞胺耐性選拔且表現抗人CD98抗體之CHO-K1細胞於96孔培養盤、24孔培養盤、6孔培養盤(Corning公司)中依序擴大培養。擴大培養後，測定培養上清液中之抗體濃度，選拔高度表現抗人CD98抗體之CHO細胞之前3株。繼而，將選擇之3株分別以成為2×105個/mL之方式懸浮於0.5% CD培養基(Invitrogen公司)3 mL中，使用6孔培養盤於37℃、5% CO2之環境中旋轉培養5天。利用HPLC(Waters公司)定量培養5天後之培養基中之抗體量。將其結果示於表6。
如表6所示，可知共同導入有CD98H載體及CD98L載體之CHO-K1細胞與導入有CD98-CHX串聯載體之CHO-K1細胞相比，抗體生產量較高。
根據以上結果，顯示藉由將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因分別插入至不同之一對轉座子序列間之表現載體共同導入至懸浮性CHO細胞中，不僅可容易地取得及製造抗體高生產株，而且所獲得之細胞具有較高之抗體生產性。
[實施例7]　抗人腫瘤壞死因子α(TNFα，tumor necrosis factor-alpha)抗體之製造(1)包含抗人TNFα抗體重鏈基因片段、抗人TNFα抗體輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體之製作
為了製作具有序列編號26及29之胺基酸序列之抗人TNFα抗體，將實施例6(1)所製作之包含抗人CD98抗體重鏈基因片段、輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(CD98-CHX串聯載體)之VH及VL基因片段分別置換為源自抗人TNFα抗體之VH及VL，構建抗人TNFα抗體重鏈基因片段、抗人TNFα抗體輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因表現轉座子載體(以下簡稱為TNFα-CHX串聯載體)。
抗人TNFα抗體重鏈基因及輕鏈基因之序列係製作使訊息序列連結於humira(R)皮下注射40 mg審查報告書(獨立行政法人醫藥品醫療機器總合機構，2008年2月14日)圖2及圖1所記載之阿達木單抗(adalimumab)(基因重組)之重鏈可變區次單元或輕鏈可變區次單元之胺基酸序列(序列編號25、28)的胺基酸序列(序列編號26、29)，以胺基酸序列不變之方式決定鹼基序列，使用合成DNA而製作(序列編號24、27)。為了其後之基因操作，對人工序列之末端附加限制酶切斷部位。
(2)　包含抗人TNFα抗體重鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體之製作 將實施例6(2)所製作之包含抗人CD98抗體重鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(CD98H-CHX載體)之VH基因片段部位改變成抗人TNFα抗體VH基因片段，構建包含抗人TNFα抗體重鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(以下簡稱為TNFαH-CHX載體)。抗人TNFα抗體重鏈基因係使用與本項(1)所示之序列相同之序列。 (3)　抗人TNFα抗體輕鏈基因表現轉座子載體之製作
將實施例6(1)所製作之抗人CD98抗體輕鏈基因表現轉座子載體(CD98L載體)之輕鏈基因部位改變為抗人TNFα抗體輕鏈，構建抗人TNFα抗體輕鏈基因表現轉座子載體(以下簡稱為TNFαL載體)。抗人TNFα抗體VL基因係使用與本項(1)所示之序列相同之序列。
(4)　生產抗人TNFα抗體之CHO細胞之製作
為了製作生產抗人TNFα抗體之CHO-K1細胞，將上述(1)所製作之TNFα-CHX串聯載體(20 μg)與實施例2所製作之Tol2轉座酶表現載體(Tol2載體)(10 μg)導入至實施例3(1)所製作之藉由懸浮培養馴化之CHO-K1細胞中(對照區)。
同樣地，將上述(2)及(3)所製作之TNFαH-CHX載體(10 μg)、TNFαL載體(10 μg)、Tol2載體(10 μg)分別以環狀DNA之形式直接共同導入(實驗區)。除對5片96孔培養盤進行基因導入細胞之培養以外，基因導入、細胞培養等係以與實施例6相同之方式進行，並比較高度表現抗體之細胞之出現數。抗體高度表現細胞係測量培養上清液中之抗體濃度為3.0 μg/mL以上之純系作為表現抗體之細胞。將其結果示於表7。
如表7所示，與實施例6所進行之抗人CD98抗體之生產細胞相同，共同導入有TNFαH-CHX載體與TNFαL載體之CHO-K1細胞之高度表現抗人TNFα抗體之細胞之出現率高於導入有TNFα-CHX串聯載體之CHO-K1細胞約4倍。
根據該結果，顯示關於任何抗體，藉由將分別組入不同之表現載體之插入至一對轉座子序列間之抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因共同導入至懸浮性CHO細胞中，可容易地取得及製造抗體高生產株。
(5)　生產抗人TNFα抗體之CHO細胞之培養
自上述(4)所獲得之導入有TNFα-CHX串聯載體之細胞以及共同導入有TNFαH-CHX載體及TNFαL載體之細胞中選擇以環己醯亞胺耐性選拔，且表現抗人TNFα抗體的細胞，於96孔培養盤、24孔培養盤、繼而於6孔培養盤中依序擴大培養。除培養期間為7天以外，以與實施例6(4)相同之方式對成功地擴大培養之導入有TNFα-CHX串聯載體之細胞4株以及共同導入有TNFαH-CHX載體及TNFαL載體之細胞52株培養細胞，測量抗體表現量。將結果示於圖11。
其結果，顯示共同導入有TNFαH-CHX載體與TNFαL載體之CHO-K1細胞之抗體生產量高於導入有TNFα-CHX串聯載體之CHO-K1細胞約2.4倍。
該結果顯示，藉由與實施例6(4)同樣地將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因分別組入不同之一對轉座子序列間之表現載體共同導入至懸浮性CHO細胞，不僅可容易地取得及製造抗體高生產株，而且所獲得之細胞具有較高之抗體生產性。
[實施例8]　抗人CD20抗體之製造(1)包含抗人CD20抗體重鏈基因片段、抗人CD20抗體輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體之製作
為了製作包含序列編號32及35之胺基酸序列所示之VH及VL之抗人CD20抗體，將實施例6(1)所製作之CD98-CHX串聯載體之抗體VH或VL基因部位分別置換為源自抗人CD20抗體之VH或VL，構建包含抗人CD20抗體重鏈基因片段、抗人CD20抗體輕鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(以下簡稱為CD20-CHX串聯載體)。
抗人CD20抗體VH區域及VL區域之基因序列係製作於基因庫登陸號AR000013所記載之鹼基序列及利妥昔單抗(Rituxan)(R)注射10 mg/mL審查報告書(衛研發第3395號，2003年8月28日)別冊所記載之利妥昔單抗(Rituximab)之VH及VL之胺基酸序列(序列編號32、35)連結訊息序列而成之胺基酸序列(序列編號31、34)，以胺基酸序列未變化之方式決定鹼基序列，藉由合成DNA而製作(序列編號30、33)。為了其後之基因操作，對人工序列之末端附加限制酶切斷部位。
(2)　包含抗人CD20抗體重鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體之製作
將實施例6(2)所製作之CD98H-CHX載體抗體VH基因部位改變為源自抗人CD20抗體之VH，構建包含抗人CD20抗體重鏈基因片段及環己醯亞胺耐性基因之表現轉座子載體(以下簡稱為CD20H-CHX載體)。抗人CD20抗體重鏈基因係使用與上述(1)所示之序列相同之序列。
(3)　抗人CD20抗體輕鏈基因表現轉座子載體之製作
將實施例6(1)所製作之CD98L載體抗體VL基因部位改變為源自抗人CD20抗體之VL，構建抗人CD20抗體輕鏈基因表現轉座子載體(以下稱為CD20L載體)。抗人CD20抗體重鏈基因係使用與上述(1)所示之序列相同之序列。
(4)　生產抗人CD20抗體之CHO細胞之製作
為了製作生產抗人CD20抗體之CHO-K1細胞，將上述(1)所製作之CD20-CHX串聯載體與實施例2所製作之Tol2轉座酶表現載體(Tol2載體)導入至實施例3(1)所製作之藉由懸浮培養馴化之CHO-K1細胞中(對照區)。
同樣地，將上述(2)及(3)所製作之CD20H-CHX載體(10 μg)、CD20L載體(10 μg)與Tol2載體(10 μg)一併共同導入至CHO-K1細胞中(實驗區)。除對5片96孔培養盤進行基因導入細胞之培養以外，基因導入、細胞培養等以與實施例6相同之方式進行，並比較高度表現抗體之細胞之出現數。又，測量抗體濃度為3.0 μg/mL以上者作為表現抗體之孔。將其結果示於表8。
其結果，共同導入有CD20H-CHX載體與CD20L載體之CHO-K1細胞的高度表現抗人CD20抗體之細胞之出現率高於導入有CD20-CHX串聯載體之CHO-K1細胞約3倍。
該結果為與實施例6(3)或實施例7(3)所實施之抗人CD98抗體、抗人TNFα抗體為相同之結果，顯示關於任一抗體，藉由將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因分別組入不同之轉座子序列間的表現載體共同導入至懸浮性CHO細胞中，可容易地取得及製造抗體高生產株。
(5)　生產抗人CD20抗體之CHO細胞之培養
自上述(3)所獲得之導入有CD20-CHX串聯載體之細胞以及共同導入有CD20H-CHX載體及CD20L載體之細胞中，選擇以環己醯亞胺耐性選拔且表現抗人CD20抗體之細胞，於96孔培養盤、24孔培養盤、繼而於6孔培養盤依序擴大培養。對成功地擴大培養之對照區細胞4株及實驗區細胞50株，除培養時間為7天以外，以與實施例6(4)相同之方式培養細胞，測量抗體表現量。將結果示於圖12。
如圖12所示，可知共同導入有CD20H-CHX載體與CD20L載體之CHO-K1細胞具有高於導入有CD20-CHX串聯載體之CHO-K1細胞約1.6倍之抗體生產性。
該結果為與實施例6(4)、實施例7(5)所實施之抗人CD98抗體、抗人TNFα抗體之生產性相同之結果，顯示藉由將抗體重鏈基因與抗體輕鏈基因分別組入不同之轉座子序列間的表現載體共同導入至懸浮性CHO細胞中，不僅可容易地取得及製造抗體高生產株，而且所獲得之細胞具有較高之抗體生產性。
[實施例9]　表現新黴素耐性基因及抗人CD98抗體之轉座子載體之製作(1)表現野生型新黴素耐性基因及抗人CD98抗體之轉座子載體之製作
於蛋白質表現用質體載體中使用含有包含插入至一對源自Tol2之鹼基序列間之任意之人源抗體基因及耐藥性標記基因之哺乳動物細胞用基因表現卡匣的質體。
所使用之基因之DNA根據已知之鹼基序列而人工地化學合成，或藉由製作其兩端序列之引子，將適當之DNA來源作為模板進行PCR而取得。為了其後之基因操作，對引子之末端附加限制酶切斷部位。
轉座子序列係使用日本專利特開2003-235575號公報所揭示之非自主性Tol2轉座子之鹼基序列(序列編號1)中，第1位至第200位之鹼基序列(Tol2-L序列)(序列編號2)、與第2285位至第2788位之鹼基序列(Tol2-R序列)(序列編號3)的鹼基序列。
分別合成包含Tol2-R序列或Tol2-L序列之DNA片段並使用。
製備根據抗人CD98抗體N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L載體(日本專利第4324637號公報)而擴增之包含於CMV啟動子控制下編碼抗體H鏈之鹼基序列(序列編號18)的DNA片段作為抗體重鏈基因表現卡匣，製備根據抗人CD98抗體N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L載體而擴增之包含於SV40啟動子控制下編碼抗體輕鏈之鹼基序列(序列編號21)的DNA片段作為抗體輕鏈基因表現卡匣。
製備具有包含於SV40啟動子控制下編碼新黴素耐性基因之鹼基序列之DNA(包含序列編號36及基因庫登陸號U47120.2所示之鹼基序列之編碼新黴素磷酸轉移酶的DNA)的DNA片段作為新黴素耐性基因表現卡匣。
連結上述抗體重鏈基因表現卡匣、抗體輕鏈基因表現卡匣及新黴素耐性基因表現卡匣，進而於其兩端連結包含Tol2-R序列之DNA片段及包含Tol2-L序列之DNA片段，製作抗人CD98抗體表現載體A(圖13)。
(2)具有突變型新黴素耐性基因1之抗人CD98抗體表現轉座子載體之製作
製作將(1)所獲得之具有野生型新黴素耐性基因之抗人CD98抗體表現轉座子載體A之新黴素耐性基因置換成包含序列編號37所示之鹼基序列之突變型新黴素耐性基因1的抗人CD98抗體表現轉座子載體B。
突變型新黴素耐性基因1與野生型新黴素耐性基因編碼同一胺基酸序列，且改變相當於整體之22%之167個鹼基。具體而言，以對應於所有32個白胺酸殘基中之25個白胺酸殘基之密碼子成為TTA之方式進行改變。
(3)具有突變型新黴素耐性基因2之抗人CD98抗體表現轉座子載體之製作
製作將(1)所獲得之具有野生型新黴素耐性基因之抗人 CD98抗體表現轉座子載體A之新黴素耐性基因置換為包含序列編號38所示之鹼基序列之突變型新黴素耐性基因2的抗人CD98抗體表現轉座子載體C。
突變型新黴素耐性基因2與野生型新黴素耐性基因編碼同一胺基酸序列，且改變相當於整體之23%之180個鹼基。具體而言，以對應於所有32個白胺酸殘基中之28個白胺酸殘基之密碼子成為TTA之方式進行改變。
(4)具有突變型新黴素耐性基因3之抗人CD98抗體表現轉座子載體之製作
製作將(1)所獲得之具有野生型新黴素耐性基因之抗人CD98抗體表現轉座子載體A之新黴素耐性基因置換為包含序列編號39所示之鹼基序列之突變型新黴素耐性基因3的抗人CD98抗體表現轉座子載體D。
突變型新黴素耐性基因3與野生型新黴素耐性基因編碼同一胺基酸序列，且改變相當於整體之26%之203個鹼基。具體而言，以對應於所有32個白胺酸殘基中之30個白胺酸殘基之密碼子成為TTA之方式進行改變。
[實施例10]利用表現突變型新黴素耐性基因之抗體生產CHO細胞之抗體生產
將實施例9(1)~(4)所製作之抗人CD98抗體表現轉座子載體A~D分別與表現包含序列編號40所示之胺基酸序列之Tol2轉座酶之載體pCAGGS-T2TP[Kawakami K & Noda T.Genetics.166,895-899(2004)]一併導入至懸浮化CHO-K1細胞中，製作抗體生產細胞A~D。
載體對懸浮CHO細胞之導入係藉由將CHO細胞(4×106個)懸浮於400 μL之PBS緩衝液中，以環狀DNA之形式直接將抗人CD98抗體表現轉座子載體(10 μg)及Tol2轉座酶表現載體pCAGGS-T2TP(20 μg)利用電穿孔法共同導入而進行。
又，此處，為了使Tol2轉座酶暫時表現，亦將Tol2轉座酶表現載體以環狀DNA之形式直接導入。
又，作為未使用Tol2轉座酶之對照，將實施例19(4)之抗人CD98抗體表現轉座子載體D(10 μg)藉由限制酶PciI(Takara Bio公司)而製成直鏈狀後，藉由電穿孔法而導入至懸浮化CHO-K1細胞中。
電穿孔係使用電穿孔儀[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司製造)]，於電壓為300 V、靜電電容為500 μF、室溫之條件下，使用間隙寬度為4 mm之比色管(Bio-Rad公司製造)而進行。
於利用電穿孔之基因導入後，各比色管之細胞係播種於1片96孔培養盤中，使用添加有5%大豆水解物之CD OptiCHO培養基(Invitrogen公司)，於CO2培養箱內培養3天。
繼而，於基因導入4日後之培養基交換後，以最終濃度成為500 μg/mL之方式添加G418(Geneticin(R)，Invitrogen公司)，於G418存在下進行培養，每1週進行培養基交換，並培養3週。
於培養後，藉由利用FRET(螢光共振能量轉移)之三明治法，利用LANCE(R)分析(PerkinElmer公司)定量抗體之表現。將其結果示於表9。
如表9所示，表現突變型新黴素耐性基因之細胞B~D與表現野生型新黴素耐性基因之細胞A相比，抗人CD98抗體之表現量較高。
尤其是表現突變型新黴素耐性基因3之抗人CD98抗體生產細胞D可獲得顯示表現野生型新黴素耐性基因之抗人CD98抗體生產細胞A之10倍之表現的細胞株。
又，於即便使用突變型新黴素耐性基因3，但未共同導入有Tol2轉座酶表現載體之對照細胞中，雖將載體線狀化，但無法獲得抗人CD98抗體表現細胞。
[實施例11]　表現嘌呤黴素耐性基因及抗人CD98抗體之轉座子載體之製作(1)具有突變型嘌呤黴素耐性基因1之抗人CD98抗體表現轉座子載體之製作
製作將實施例9(1)所獲得之具有野生型新黴素耐性基因之抗人CD98抗體表現轉座子載體A之新黴素耐性基因置換為包含序列編號41所示之鹼基序列之突變型嘌呤黴素耐性基因1的抗人CD98抗體表現轉座子載體E。
突變型嘌呤黴素耐性基因1與包含序列編號42所示之鹼基序列之野生型嘌呤黴素耐性基因(嘌呤黴素-N-乙醯轉移酶基因，包含基因庫登陸號U07648.1所揭示之鹼基序列)編碼同一胺基酸序列，且改變相當於整體之3%之17個鹼基。具體而言，於嘌呤黴素耐性基因所包含之所有28個丙胺酸殘基中，藉由改變而使17個丙胺酸殘基所對應之密碼子成為GCG，與野生型中已為GCG之密碼子一併使所有對應於丙胺酸殘基之密碼子成為GCG。
(2)具有突變型嘌呤黴素耐性基因2之抗人CD98抗體表現轉座子載體之製作
製作將實施例9(1)所獲得之具有野生型新黴素耐性基因之抗人CD98抗體表現轉座子載體A之新黴素耐性基因置換成包含序列編號43所示之鹼基序列之突變型嘌呤黴素耐性基因2的抗人CD98抗體表現轉座子載體F。突變型嘌呤黴素耐性基因2與野生型嘌呤黴素耐性基因編碼同一胺基酸序列，且改變相當於整體之14%之79個鹼基。具體而言，除對應於突變型嘌呤黴素耐性基因1之丙胺酸殘基之密碼子之改變以外，使對應於白胺酸殘基之密碼子成為TTA，使對應於纈胺酸殘基之密碼子成為GTA，使絲胺酸之密碼子成為TCG。
[實施例12]利用表現突變型嘌呤黴素耐性基因之抗體生產CHO細胞之抗體生產1
將實施例11(1)之具有突變型嘌呤黴素耐性基因1之抗人CD98抗體表現轉座子載體E、實施例11(2)之具有突變型嘌呤黴素耐性基因2之抗人CD98抗體表現轉座子載體F、Tol2轉座酶表現載體pCAGGS-T2TP導入至懸浮化之CHO-K1細胞中，製作抗體生產細胞E及F。
載體對懸浮性CHO細胞之導入係藉由使懸浮化CHO細胞(4×106個)懸浮於400 μL之PBS緩衝液中，以環狀DNA之形式直接將具有突變型嘌呤黴素耐性基因之抗人CD98抗體表現轉座子載體(10 μg)與pCAGGS-T2TP(20 μg)利用電穿孔法共同導入而進行。
又，此處，為了使Tol2轉座酶暫時性表現，亦將Tol2轉座酶表現載體pCAGGS-T2TP以環狀DNA之形式直接導入。
電穿孔係使用電穿孔儀[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司製造)]，於電壓為300 V、靜電電容為500 μF、室溫之條件下，使用間隙寬度為4 mm之比色管(Bio-Rad公司製造)而進行。
於利用電穿孔之基因導入後，各比色管之細胞係播種於1片96孔培養盤中，使用添加有5%大豆水解物之CD OptiCHO培養基(Invitrogen公司)，於CO2培養箱內培養3天。
繼而，於基因導入2天後之培養基交換後，以最終濃度成為5 μg/mL之方式添加嘌呤黴素(P9620，Sigma-Aldrich公司)，每1週對包含嘌呤黴素之培養基進行培養基交換，並培養4週。
培養後，藉由利用FRET(螢光共振能量轉移)之三明治法，利用LANCE(R)分析(PerkinElmer公司)定量抗體之表現量。將其結果示於表10。
如表10所示，表現突變型嘌呤黴素耐性基因2之抗體生產細胞F顯示表現突變型嘌呤黴素耐性基因1之抗體生產細胞E之2倍以上之抗體生產量。
[實施例13]　利用表現突變型嘌呤黴素耐性基因之抗體生產CHO細胞之抗體生產2
利用三角燒瓶培養實施例12所獲得之表現突變型嘌呤黴素耐性基因2之抗體生產細胞F，生產抗人CD98抗體。
具體而言，將抗體生產細胞F自96孔培養盤至24孔培養盤、繼而於6孔培養盤中依序擴大培養。選拔細胞數充分增加之抗體生產細胞F2株(細胞株1及細胞株2)，分別以成為2×105個/ml之方式懸浮於添加有5%大豆水解物之CD OptiCHO培養基(Invitrogen公司)35 ml中，使用125 ml容量之三角燒瓶(附有旋蓋，Corning公司)，於37℃、5% CO2之環境中旋轉培養1週，生產抗人CD98抗體。
利用HPLC(Waters公司)定量培養後之培養基中之抗體量。將其結果示於表11。
以上結果顯示，於懸浮性之CHO細胞中，插入至一對轉座子序列間之抗體基因、及突變型耐藥性基因被效率良好地導入至宿主之染色體內，並且對高度表現細胞之選拔有效。又，可知所獲得之細胞可擴大培養，並可於懸浮培養條件下生產目標蛋白質。
對本發明詳細地，又，參照特定之實施態樣進行了說明，但業者應知曉可不脫離本發明之精神與範圍而施加各種變更或修正。
本申請案係基於2010年12月15日申請之日本專利申請2010-279849者，其內容係作為參照而併入於此。
產業上之可利用性
藉由本發明之蛋白質之生產方法，可使用懸浮性之哺乳動物細胞效率良好地生產目標蛋白質。本發明之細胞可用作用以生產基因重組蛋白質之蛋白質生產細胞。
序列表自由內容
序列編號1-人工序列之說明：非自主性Tol2轉座子之鹼基序列
序列編號2-人工序列之說明：Tol2-L序列
序列編號3-人工序列之說明：Tol2-R序列
序列編號7-人工序列之說明：環己醯亞胺耐性基因之鹼基序列
序列編號8-人工序列之說明：環己醯亞胺耐性基因所編碼之蛋白質之胺基酸序列
序列編號9-人工序列之說明：編碼M2Z3抗體H鏈之鹼基序列
序列編號10-人工序列之說明：M2Z3抗體H鏈之胺基酸序列
序列編號11-人工序列之說明：編碼M2Z3抗體L鏈之鹼基序列
序列編號12-人工序列之說明：M2Z3抗體L鏈之胺基酸序列
序列編號13-人工序列之說明：非自主性Tol1之鹼基序列
序列編號14-人工序列之說明：Tol1-L序列
序列編號15-人工序列之說明：Tol1-R序列
序列編號18-人工序列之說明：編碼CD98抗體重鏈可變區之鹼基序列
序列編號19-人工序列之說明：CD98抗體重鏈可變區之胺基酸序列
序列編號20-人工序列之說明：CD98抗體重鏈可變區之胺基酸序列
序列編號21-人工序列之說明：編碼CD98抗體輕鏈可變區之鹼基序列
序列編號22-人工序列之說明：CD98抗體輕鏈可變區之胺基酸序列
序列編號23-人工序列之說明：CD98抗體輕鏈可變區之胺基酸序列
序列編號24-人工序列之說明：編碼抗人TNFα抗體重鏈可變區之鹼基序列
序列編號25-人工序列之說明：抗人TNFα抗體重鏈可變區之胺基酸序列
序列編號26-人工序列之說明：抗人TNFα抗體重鏈可變區之胺基酸序列
序列編號27-人工序列之說明：編碼抗人TNFα抗體輕鏈可變區之鹼基序列
序列編號28-人工序列之說明：抗人TNFα抗體輕鏈可變區之胺基酸序列
序列編號29-人工序列之說明：抗人TNFα抗體輕鏈可變區之胺基酸序列
序列編號30-人工序列之說明：編碼抗人CD20抗體重鏈可變區之鹼基序列
序列編號31-人工序列之說明：抗人CD20抗體重鏈可變區之胺基酸序列
序列編號32-人工序列之說明：抗人CD20抗體重鏈可變區之胺基酸序列
序列編號33-人工序列之說明：編碼抗人CD20抗體輕鏈可變區之鹼基序列
序列編號34-人工序列之說明：抗人CD20抗體輕鏈可變區之胺基酸序列
序列編號35-人工序列之說明：抗人CD20抗體輕鏈可變區之胺基酸序列
序列編號36-人工序列之說明：野生型新黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號37-人工序列之說明：突變型新黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號38-人工序列之說明：突變型新黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號39-人工序列之說明：突變型新黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號41-人工序列之說明：突變型嘌呤黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號42-人工序列之說明：野生型嘌呤黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號43-人工序列之說明：突變型嘌呤黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號44-人工序列之說明：突變型嘌呤黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號45-人工序列之說明：突變型吉歐黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號46-人工序列之說明：突變型吉歐黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號47-人工序列之說明：突變型潮黴素耐性基因之鹼基序列
序列編號48-人工序列之說明：突變型潮黴素耐性基因之鹼基序列
圖1係表示抗人流感M2抗體表現轉座子載體之示意圖。Tol2-L表示左末端Tol2轉座子(序列編號2)，Tol2-R表示右末端Tol2轉座子(序列編號3)，CMV表示CMV啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，Hc表示人源抗體H鏈cDNA，Lc表示人源抗體L鏈cDNA，CHX-r表示環己醯亞胺耐性基因。
圖2係表示抗人流感M2抗體表現載體之示意圖。CMV表示CMV啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，Hc表示人源抗體H鏈cDNA，Lc表示人源抗體L鏈cDNA，CHX-r表示環己醯亞胺耐性基因。
圖3係表示Tol2轉座酶表現載體之示意圖。CAGGS表示CAGGS啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，TPase cDNA表示Tol2轉座酶cDNA。
圖4係表示對使用抗人流感M2抗體表現Tol2轉座子載體之情形之懸浮性之CHO-K1細胞及接著性之CHO-K1細胞中之抗人流感M2抗體之表現量進行研究之結果。圖4A表示懸浮性之CHO-K1細胞之結果，圖4B表示接著性之CHO-K1細胞之結果。任一圖均為縱軸表示抗體產生量(μg/mL)，橫軸表示各細胞之基因導入純系編號。
圖5係表示抗人流感M2抗體表現Tol1轉座子載體之示意圖。Tol1-L表示左末端Tol1轉座子(序列編號14)，Tol1-R表示右末端Tol1轉座子(序列編號15)，CMV表示CMV啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，Hc表示人源抗體H鏈cDNA，Lc表示人源抗體L鏈cDNA，CHX-r表示環己醯亞胺耐性基因。
圖6係表示Tol1轉座酶表現載體之示意圖。CAGGS表示CAGGS啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，TPase cDNA表示Tol1轉座酶cDNA。
圖7係表示對使用抗人流感M2抗體表現Tol1轉座子載體之情形之懸浮性之CHO-K1細胞中之抗人流感M2抗體之表現量進行研究之結果。縱軸表示抗體產生量(μg/mL)，橫軸表示各細胞之基因導入純系編號。
圖8係表示抗人CD98抗體重鏈表現轉座子載體之示意圖。Tol2-L表示左末端Tol2轉座子(序列編號2)，Tol2-R表示右末端Tol2轉座子(序列編號3)，Pmo表示莫洛尼小鼠白血病病毒啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，Hc表示抗人CD98抗體重鏈cDNA(序列編號18)。
圖9係表示抗人CD98抗體輕鏈表現轉座子載體之示意圖。Tol2-L表示左末端Tol2轉座子(序列編號2)，Tol2-R表示右末端Tol2轉座子(序列編號3)，CMV表示CMV啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，Lc表示抗人CD98抗體輕鏈cDNA(序列編號21)。
圖10係表示環己醯亞胺耐性基因表現轉座子載體之示意圖。Tol2-L表示左末端Tol2轉座子(序列編號2)，Tol2-R表示右末端Tol2轉座子(序列編號3)，CMV表示CMV啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，CHX-r表示環己醯亞胺耐性基因(序列編號7)。
圖11係表示將TNFα-CHX串聯載體或TNFαH-CHX載體以及TNFαL載體對CHO-K1細胞進行基因導入時之抗人TNFα抗體產生量。縱軸表示產生於培養基中之抗體濃度(μg/mL)，對照區表示為對照，實驗區表示為實驗。
圖12係表示將CD20-CHX串聯載體或CD20H-CHX載體以及CD20L載體對CHO-K1細胞進行基因導入時之抗人CD20抗體產生量。縱軸表示產生於培養基中之抗體濃度(μg/mL)，對照區表示為對照，實驗區表示為實驗。
圖13係表示抗體表現載體A之結構。於圖13中，Tol2-L表示包含Tol2-L序列(序列編號2)之DNA片段，Tol2-R表示包含Tol2-R序列(序列編號3)之DNA片段，CMV表示CMV啟動子，Poly A表示多腺苷酸化部位，Hc表示抗人CD98抗體之重鏈基因，Lc表示抗人CD98抗體輕鏈基因，SO表示SV40啟動子，SV表示SV40多腺苷酸化部位，Neo-r表示新黴素耐性基因。
<110> 協和醱酵麒麟股份有限公司 資訊‧系統研究機構
<120> 蛋白質之生產方法
<130> W503694
<150> JP2010-279849
<151> 2010-12-15
<160> 60
<170> PatentIn 3.3版
<210> 1
<211> 2788
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：非自主性Tol2轉座子
<400> 1
<210> 2
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：Tol2-L轉座子序列
<400> 2
<210> 3
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：Tol2-R轉座子序列
<400> 3
<210> 4
<211> 2156
<212> DNA
<213> 青鱂魚
<220>
<221> CDS
<222> (85)..(2034)
<400> 4
<210> 5
<211> 649
<212> PRT
<213> 青鱂魚
<400> 5
<210> 6
<211> 4682
<212> DNA
<213> 青鱂魚
<400> 6
<210> 7
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：環己醯亞胺耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 7
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 8
<210> 9
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> M2Z3重鏈
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1404)
<400> 9
<210> 10
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 10
<210> 11
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> M2Z3輕鏈
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(708)
<400> 11
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 12
<210> 13
<211> 1855
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 非自主性Tol1轉座子
<400> 13
<210> 14
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Tol1-L轉座子序列
<400> 14
<210> 15
<211> 505
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> Tol1-R轉座子序列
<400> 15
<210> 16
<211> 2745
<212> DNA
<213> 青鱂魚
<220>
<221> CDS
<222> (30)..(2585)
<400> 16
<210> 17
<211> 851
<212> PRT
<213> 青鱂魚
<400> 17
<210> 18
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD98抗體之VH區
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(417)
<400> 18
<210> 19
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 19
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD98抗體之VH區
<400> 20
<210> 21
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD98抗體之VL區
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(387)
<400> 21
<210> 22
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 22
<210> 23
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD98抗體之VL區
<400> 23
<210> 24
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗TNFα抗體之VH區
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(420)
<400> 24
<210> 25
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 25
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗TNFα抗體之VH區
<400> 26
<210> 27
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗TNFα抗體之VL區
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(387)
<400> 27
<210> 28
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 28
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗TNFα抗體之VL區
<400> 29
<210> 30
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD20抗體之VH區
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(420)
<400> 30
<210> 31
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 31
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD20抗體之VH區
<400> 32
<210> 33
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD20抗體之VL區
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(384)
<400> 33
<210> 34
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 34
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之描述：抗CD20抗體之VL區
<400> 35
<210> 36
<211> 795
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 野生型新黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(795)
<400> 36
<210> 37
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型新黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(795)
<400> 37
<210> 38
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型新黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(795)
<400> 38
<210> 39
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型新黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(795)
<400> 39
<210> 40
<211> 649
<212> PRT
<213> 青鱂魚
<400> 40
<210> 41
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型嘌呤黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(600)
<400> 41
<210> 42
<211> 600
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> 野生型嘌呤黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(600)
<400> 42
<210> 43
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型嘌呤黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(600)
<400> 43
<210> 44
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型嘌呤黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(600)
<400> 44
<210> 45
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型吉歐黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<400> 45
<210> 46
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型吉歐黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<400> 46
<210> 47
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型潮黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1026)
<400> 47
<210> 48
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 突變型潮黴素耐性基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1026)
<400> 48
<210> 49
<211> 264
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 合成結構
<400> 49
<210> 50
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 50
<210> 51
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 51
<210> 52
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 52
<210> 53
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 53
<210> 54
<211> 199
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 合成結構
<400> 54
<210> 55
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 55
<210> 56
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 56
<210> 57
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 57
<210> 58
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 58
<210> 59
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 59
<210> 60
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成結構
<400> 60
(無元件符號說明)

Claims (20)

  1. 一種生產抗體之方法，其係將含有包含編碼抗體之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體導入至懸浮性之CHO細胞中，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼抗體之DNA的基因片段組入該CHO細胞之染色體中，而獲得生產該抗體之懸浮性之CHO細胞，並且懸浮培養該CHO細胞而生產該抗體；該一對轉座子序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
  2. 一種生產抗體之方法，其特徵在於包括以下步驟(A)~(C)：(A)將以下表現載體(a)及(b)同時導入至懸浮性之CHO細胞中，(a)含有包含編碼抗體之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體，(b)包含編碼轉座酶之DNA的載體，該轉座酶識別轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性；(B)藉由步驟(A)中導入至懸浮性之CHO細胞中之表現載體(b)使轉座酶暫時表現，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼抗體之DNA的基因片段組入該CHO細胞之染色體中，而獲得表現抗體之懸浮性之CHO細胞；(C)懸浮培養步驟(B)所獲得之表現抗體之懸浮性之CHO細胞而生產抗體； 該一對轉座子序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
  3. 一種獲得生產抗體之懸浮性之CHO細胞之方法，其係將含有包含編碼抗體之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體導入至懸浮性之CHO細胞中，將插入至一對轉座子序列間之包含編碼抗體之DNA的基因片段組入該CHO細胞之染色體中，而獲得生產該抗體之懸浮性之CHO細胞；該一對轉座子序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中編碼抗體之DNA為編碼抗體之H鏈之DNA及編碼抗體之L鏈之DNA中之至少一者。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中將選自下述(a)~(d)中之表現載體導入至懸浮性之CHO細胞中，(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片 段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中懸浮性之CHO細胞為可於無血清培養下生存及增殖之細胞。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中CHO細胞為選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中之任一細胞。
  8. 如請求項5之方法，其中選擇標記基因為環己醯亞胺耐性基因。
  9. 如請求項8之方法，其中環己醯亞胺耐性基因為編碼核糖體蛋白質之變異體之基因。
  10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中一對源自Tol2轉座子之鹼基序列為序列編號2所示之鹼基序列及序列編號3所示之鹼基序列。
  11. 如請求項1至3中任一項之方法，其中一對源自Tol1轉座子之鹼基序列為序列編號14所示之鹼基序列及序列編號 15所示之鹼基序列。
  12. 一種懸浮性之CHO細胞，其藉由同時導入含有包含編碼抗體之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的至少一種表現載體(a)、及包含編碼識別該轉座子序列且具有使插入至一對轉座子序列間之基因片段轉移至染色體中之活性之轉座酶(轉移酶)之DNA的表現載體(b)，而將插入至該一對轉座子序列間之該基因片段組入染色體中，並且生產該抗體；該一對轉座子序列為一對源自Tol1轉座子之鹼基序列或源自Tol2轉座子之鹼基序列。
  13. 如請求項12之CHO細胞，其中編碼抗體之DNA為編碼抗體之H鏈之DNA及編碼抗體之L鏈之DNA中之至少一者。
  14. 如請求項12之CHO細胞，其中導入有選自下述(a)~(d)中之表現載體，(a)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；(b)含有包含編碼抗體之H鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之L鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載 體；(c)含有包含編碼抗體之L鏈之DNA及選擇標記基因之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體、及含有包含編碼抗體之H鏈之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體；(d)含有包含編碼抗體之H鏈、L鏈及選擇標記基因之DNA之基因片段且於該基因片段之兩端包含一對轉座子序列的表現載體。
  15. 如請求項12之CHO細胞，其係可於無血清培養下生存及增殖之懸浮性之CHO細胞。
  16. 如請求項12之CHO細胞，其中CHO細胞為選自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3及CHO-S中之任一細胞。
  17. 如請求項14之CHO細胞，其中選擇標記基因為環己醯亞胺耐性基因。
  18. 如請求項17之CHO細胞，其中環己醯亞胺耐性基因為編碼人核糖體蛋白質之變異體之基因。
  19. 如請求項12之CHO細胞，其中一對源自Tol2轉座子之鹼基序列為序列編號2所示之鹼基序列及序列編號3所示之鹼基序列。
  20. 如請求項12之CHO細胞，其中一對源自Tol1轉座子之鹼基序列為序列編號14所示之鹼基序列及序列編號15所示之鹼基序列。
TW100146605A 2010-12-15 2011-12-15 抗體之生產方法、獲得生產抗體之懸浮性之cho細胞之方法、生產抗體之懸浮性之cho細胞、及抗體表現載體 TWI617664B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010279849 2010-12-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201231650A TW201231650A (en) 2012-08-01
TWI617664B true TWI617664B (zh) 2018-03-11

Family

ID=46244724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100146605A TWI617664B (zh) 2010-12-15 2011-12-15 抗體之生產方法、獲得生產抗體之懸浮性之cho細胞之方法、生產抗體之懸浮性之cho細胞、及抗體表現載體

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9102971B2 (zh)
EP (1) EP2653540B9 (zh)
JP (1) JP6087148B2 (zh)
KR (1) KR102058658B1 (zh)
CN (2) CN103261414A (zh)
AU (1) AU2011342161C1 (zh)
BR (1) BR112013014949B1 (zh)
CA (1) CA2820151C (zh)
DK (1) DK2653540T3 (zh)
ES (1) ES2661981T3 (zh)
PT (1) PT2653540T (zh)
RU (1) RU2598255C2 (zh)
SG (2) SG191124A1 (zh)
TR (1) TR201802431T4 (zh)
TW (1) TWI617664B (zh)
WO (1) WO2012081628A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011342162B2 (en) * 2010-12-15 2017-04-20 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for producing proteins
JP2015502165A (ja) 2011-12-22 2015-01-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 発現ベクター構成、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用
PT2692865E (pt) * 2012-07-30 2015-02-06 Nbe Therapeutics Llc Identificação mediada por transposição de proteínas funcionais ou de ligação específicas
JP6871679B2 (ja) * 2016-03-23 2021-05-12 国立大学法人 岡山大学 遺伝子発現用カセット及びその産生物
US10960721B2 (en) * 2018-06-26 2021-03-30 Ford Global Technologies, Llc System for detection and response to retreating trailer
AU2020346580A1 (en) 2019-09-13 2022-03-31 Kyowa Kirin Co., Ltd. DcR3 variant
KR102586165B1 (ko) * 2019-10-02 2023-10-10 아주대학교산학협력단 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법
CN112480236B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽lecvepncrskr及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1484395B1 (en) * 2002-02-15 2009-07-29 Research Organization of Information and Systems Transposon being functional in mammals
US20100129914A1 (en) * 2006-12-13 2010-05-27 National University Corporation Nagoya University Tol1 FACTOR TRANSPOSASE AND DNA INTRODUCTION SYSTEM USING THE SAME
US20100311116A1 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 Excellgene Sa Fast generation of high expression stable cell lines expressing recombinant proteins under minimal and short-term selective pressure

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5667786A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Novavax, Inc. Method for treating tumors with a toxin
JPH10299A (ja) 1996-06-18 1998-01-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 誘導加熱式アイロン装置
PT1860187E (pt) 1997-05-15 2011-10-04 Genentech Inc Receptor apo-2
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2270150B2 (en) 1999-04-09 2019-08-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP2002542781A (ja) * 1999-04-28 2002-12-17 ザ、ボード、オブ、トラスティーズ、オブ、ザ、リーランド、スタンフォード、ジュニア、ユニバーシティ Ｐ因子由来ベクター及びその使用法
GB9924721D0 (en) 1999-10-19 1999-12-22 Craig Roger Protein production system
BR0014926A (pt) * 1999-10-19 2002-06-18 Minos Biosystems Ltd Sistema de produção de proteìna
CN100390288C (zh) 2000-04-11 2008-05-28 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
MXPA03002974A (es) 2000-10-06 2004-05-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk Celulas que producen composiciones de anticuerpo.
JP4817514B2 (ja) * 2001-03-09 2011-11-16 協和発酵キリン株式会社 新規動物細胞用ベクターおよびその使用
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
GB0212666D0 (en) * 2002-05-31 2002-07-10 Secr Defence Immunogenic sequences
ATE494370T1 (de) * 2002-07-24 2011-01-15 Manoa Biosciences Inc Vektoren auf transposonbasis und verfahren zur integration von nukleinsäuren
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2762955A1 (en) 2003-10-16 2005-04-28 Imclone Llc Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment thereof
US20060141627A1 (en) * 2004-11-18 2006-06-29 Stratatech Corporation Vectors for stable gene expression
AU2005313026B2 (en) 2004-12-06 2011-09-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to influenza M2 protein and methods of making and using same
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US20090298065A1 (en) 2006-01-05 2009-12-03 The John Hopkins University Methods for Identifying Functional Noncoding Sequences
TWI390034B (zh) 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
WO2009131239A1 (ja) 2008-04-25 2009-10-29 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 安定な多価抗体
CN103145835B (zh) 2008-07-17 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 抗-系统asc氨基酸转运蛋白2 (asct2)抗体
WO2010036976A2 (en) * 2008-09-25 2010-04-01 Transgenrx, Inc. Novel vectors for production of antibodies
RU2563514C2 (ru) * 2009-06-11 2015-09-20 Интер-Юниверсити Рисерч Инститьют Корпорейшн Рисерч Организейшн Оф Информейшн Энд Системз Способ получения белка

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1484395B1 (en) * 2002-02-15 2009-07-29 Research Organization of Information and Systems Transposon being functional in mammals
US20100129914A1 (en) * 2006-12-13 2010-05-27 National University Corporation Nagoya University Tol1 FACTOR TRANSPOSASE AND DNA INTRODUCTION SYSTEM USING THE SAME
US20100311116A1 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 Excellgene Sa Fast generation of high expression stable cell lines expressing recombinant proteins under minimal and short-term selective pressure

Also Published As

Publication number Publication date
EP2653540B1 (en) 2018-01-24
BR112013014949A2 (pt) 2017-05-30
SG191124A1 (en) 2013-07-31
CN103261414A (zh) 2013-08-21
CN107312796A (zh) 2017-11-03
EP2653540A4 (en) 2014-05-21
JPWO2012081628A1 (ja) 2014-05-22
AU2011342161C1 (en) 2016-03-17
AU2011342161B2 (en) 2015-09-10
CA2820151A1 (en) 2012-06-21
KR102058658B1 (ko) 2019-12-24
PT2653540T (pt) 2018-02-27
RU2598255C2 (ru) 2016-09-20
SG10201602874VA (en) 2016-05-30
JP6087148B2 (ja) 2017-03-01
WO2012081628A1 (ja) 2012-06-21
KR20140012035A (ko) 2014-01-29
RU2013132448A (ru) 2015-01-20
TR201802431T4 (tr) 2018-03-21
EP2653540A1 (en) 2013-10-23
EP2653540B9 (en) 2018-05-16
BR112013014949B1 (pt) 2021-12-28
ES2661981T3 (es) 2018-04-04
US9102971B2 (en) 2015-08-11
DK2653540T3 (en) 2018-02-05
AU2011342161A1 (en) 2013-05-02
TW201231650A (en) 2012-08-01
CA2820151C (en) 2019-03-26
US20120196327A1 (en) 2012-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI617664B (zh) 抗體之生產方法、獲得生產抗體之懸浮性之cho細胞之方法、生產抗體之懸浮性之cho細胞、及抗體表現載體
JP6152402B2 (ja) タンパク質の生産方法
JP2020202840A (ja) 真核細胞においてポリペプチドを発現させるための発現構築物及び方法
JP6087149B2 (ja) タンパク質の生産方法