CN103261414A - 蛋白质的生产方法 - Google Patents

蛋白质的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103261414A
CN103261414A CN2011800608327A CN201180060832A CN103261414A CN 103261414 A CN103261414 A CN 103261414A CN 2011800608327 A CN2011800608327 A CN 2011800608327A CN 201180060832 A CN201180060832 A CN 201180060832A CN 103261414 A CN103261414 A CN 103261414A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
transposon
gene fragment
gene
pair
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800608327A
Other languages
English (en)
Inventor
川上浩一
黑川惠
山口惠奈
小川梨沙
塚原正义
林洋子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems
Kyowa Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kirin Co Ltd, Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems filed Critical Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Priority to CN201710220003.XA priority Critical patent/CN107312796A/zh
Publication of CN103261414A publication Critical patent/CN103261414A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Abstract

本发明涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质的方法以及表达该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

Description

蛋白质的生产方法
技术领域
本发明涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该蛋白质的方法、表达该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞以及包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
背景技术
利用基因重组技术的外源蛋白质的生产在药品和食品行业等各种产业中得到利用。多数情况下，重组蛋白质的生产通过如下方法进行：将含有编码目标蛋白质的碱基序列的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞等宿主中，选择出该表达载体重组到染色体中而得到的转化株，再将该转化株在适当的培养条件下培养而使其表达目标蛋白质。
但是，为了开发出能够高效地生产外源蛋白质的宿主，需要根据每种目标蛋白质选择出生产率良好的宿主细胞，因而期望对各个宿主中的外源蛋白质生产技术进行进一步的技术革新。
大肠杆菌等细菌和酵母的系统与动物细胞不同，大多难以进行糖链修饰等翻译后修饰，在生产具有活性的蛋白质的方面成为问题。
昆虫细胞的系统具有如下优点：所生产的蛋白质接受磷酸化、糖链附加等翻译后修饰，能够在保持原有的生理活性的状态下进行表达。但是，分泌蛋白质的糖链结构与来源于哺乳类的细胞的糖链结构不同，因此，用于药品用途时抗原性等成为问题。
另外，昆虫细胞的系统在外源基因的导入中使用重组病毒，因此，从安全性的观点出发，存在需要使其灭活或将其包埋的问题。
对于动物细胞的系统而言，能够以更等同于生物体中制造的蛋白质的方式对以人类为代表的高等动物来源的蛋白质进行磷酸化、糖链附加、折叠等翻译后修饰。这种准确的翻译后修饰是在重组蛋白质中重现蛋白质本来具有的生理活性所必需的，对于需要这种生理活性的药品等，经常使用以哺乳动物细胞为宿主的蛋白质生产系统。
但是，以动物细胞为宿主的蛋白质表达系统的生产率一般较低，导入基因的稳定性也大多存在问题。提高以哺乳动物培养细胞为宿主的蛋白质的生产率不仅在治疗用药品或诊断药品等的制造中非常重要，对于它们的开发研究也有很大贡献。因此，当务之急是开发以哺乳动物培养细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主且能够容易地获得高生产株的基因表达系统。
转座子是能够从染色体的一个基因座移动到另一个基因座的转座性遗传因子。转座子是分子生物学或遗传学的研究中强有力的工具，基于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作等目的用于昆虫或线虫(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))和植物中，但这种技术的开发在包括哺乳动物细胞在内的脊椎动物中很缓慢。
但是，近年来，在脊椎动物中也报道了具有活性的转座子，并且确认了其中若干转座子在小鼠或人类等的哺乳动物细胞中也具有活性。作为代表性的转座子，可以列举：由青鳉克隆得到的转座子Tol1(专利文献1)、Tol2(非专利文献1)、由存在于鲑科鱼类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty)(非专利文献2)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog prince)(非专利文献3)、昆虫来源的转座子piggyBac(非专利文献4)。
这些DNA转座子作为用于给哺乳动物细胞的基因组带来新的表现型的基因导入工具已经用于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作、表达抗药性蛋白质等(非专利文献5～12)。
对于昆虫而言，研究了使用鳞翅目昆虫来源的转座子piggyBac将外源基因导入家蚕染色体并使其表达该外源基因所编码的蛋白质的方法，并公开了使用该技术的蛋白质生产方法(专利文献2)。
但是，由于所表达的目标蛋白质的表达量不充分且在家蚕全身都有生产，因此，为了从存在大量杂质蛋白质的体液中以高纯度的形式回收表达的外源蛋白质，需要高度的纯化技术，因此在经济方面存在问题。
另外，已知使用来源于青鳉的Tol2转座子在哺乳动物细胞中表达与G418抗性相关的蛋白质的例子(非专利文献12、非专利文献13)。
在利用来源于哺乳动物的培养细胞生产医疗用蛋白质药品的情况下，为了防止未知病毒或者病原性多肽的不可预期的混入，重要的是在其生产步骤中不含来源于动物的成分。CHO细胞作为生产蛋白质药品的动物细胞最频繁地使用，通过近年的研究，也确立了能够在不使用血清或来源于动物的成分的安全的培养基中培养的悬浮性CHO细胞株。但是，在无血清/无蛋白质条件下进行基因导入而得到的细胞株止于在使用血清的条件下进行基因导入而得到的细胞株的一半的生产率(非专利文献14)，表明在无血清/无蛋白质条件下的基因导入在技术上困难。
通常而言，用于筛选表达目标蛋白质的细胞的选择标记配置在同一基因表达载体上。这基于如下假说：在基因组中存在的基因具有容易表达的位点和不易表达的位点(被称为位置效果，非专利文献15)，如果表达选择标记，则也表达目标蛋白质。
作为克服其的方法，报道了如下例子：将本来由一条多肽链构成的dhfr基因分割成两条多肽链，在重链表达载体上配置一条多肽链，在轻链表达载体上配置另一条多肽链(非专利文献17)。
但是，在非专利文献17中记载的细胞是添加在培养基中的蛋白质成分依赖性的CHO细胞，如上所述，与无血清/无蛋白质条件下的基因导入的情况不同，存在基因导入效率高的可能性。仍然预测在不存在病毒感染等危险性的安全性高的无血清/无蛋白质条件下进行基因导入时，难以筛选出生产率高的细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/072540号
专利文献2：日本特表2001-532188号公报
非专利文献
非专利文献1：Nature383,30(1996)
非专利文献2：Cell91,501-510(1997)
非专利文献3：Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)
非专利文献4：Insect Mol.Biol.5,141-151(1996)
非专利文献5：Genetics.166,895-899(2004)
非专利文献6：PLoS Genet,2,e169(2006)
非专利文献7：Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,10769-10773(1998)
非专利文献8：Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6759-6764(2001)
非专利文献9：Nature436,221-226(2005)
非专利文献10：Nucleic Acids Res,31,6873-6881(2003)
非专利文献11：Nucleic Acids Res.35,e87(2007)
非专利文献12：Proc Natl Acad Sci USA,103,15008-15013(2006)
非专利文献13：Plos Genetics,2,1715-1724(2006)
非专利文献14：Biotech.Bioeng.96,1118-1126(2007)
非专利文献15：Nature Biotech.22,1393-1398(2004)
非专利文献16：Biotech.Bioeng.96,337-348(2007)
非专利文献17：Biotech.Bioeng.84,439-444(2003)
发明内容
发明所要解决的问题
为了生产、分析目标蛋白质，必须使用来源于哺乳动物的培养细胞来选择稳定地高表达目标蛋白质的细胞株，但生产目标蛋白质的细胞的制作和培养需要大量的劳动和时间。
另外，迄今为止已知使用转座子序列在哺乳动物细胞中进行蛋白质表达的技术，但关于通过使用转座子序列制作能够作为蛋白质的生产系统利用的高表达目标蛋白质的细胞的技术以及使用转座子序列的高生产目标蛋白质的哺乳动物细胞的制作方法和使用该细胞的蛋白质的生产方法还没有任何了解。
一直以来期望高效且在短时间内制作如上所述使用哺乳动物培养细胞对目标蛋白质进行高表达的蛋白质生产系统从而高生产目标蛋白质的技术。此外，还期望在贯穿从基因导入到生产株建立的过程中完全不使用动物来源的成分的生产细胞的建立。
因此，本发明的目的在于提供能够高效制作的、高表达目标蛋白质的细胞以及使用该细胞生产目标蛋白质的方法。
用于解决问题的方法
本发明人为了解决上述问题而反复进行了深入的研究，结果发现，通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端具有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、使插入在一对(两个)转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，能够高效地制作该目标蛋白质。而且还发现，通过使用该细胞，能够高效地生产目标蛋白质，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
1.一种生产目标蛋白质的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并且对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质。
2.一种生产目标蛋白质的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)～(C)：
(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，
(b)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及
(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
3.一种得到生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
4.如上述项1～3中任一项所述的方法，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体的至少一种为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
5.如上述项1～4中任一项所述的方法，其中，除了将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中之外，还将在包含选择标记基因的基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中。
6.如上述项1～5中任一项所述的方法，其中，编码目标蛋白质的DNA为编码抗体的DNA。
7.如上述项6所述的方法，其中，编码抗体的DNA为编码抗体的H链的DNA和编码抗体的L链的DNA中的至少一种。
8.如上述项4～7中任一项所述的方法，其中，将选自下述(a)～(d)的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
9.如上述项1～8中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为能够在无血清培养条件下存活和增殖的细胞。
10.如上述项1～9中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任意一种细胞。
11.如上述项10所述的方法，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。
12.如上述项4～11中任一项所述的方法，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。
13.如上述项12所述的方法，其中，抗放线菌酮基因为核糖体蛋白质。
14.如上述项1～13中任一项所述的方法，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥作用的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。
15.如上述项14所述的方法，其中，一对来源于DNA型转座子的碱基序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。
16.如上述项15所述的方法，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
17.如上述项15所述的方法，其中，一对来源于Tol1转座子的碱基序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。
18.一种悬浮性哺乳动物细胞，其通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的表达载体(b)同时导入而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质。
19.如上述项18所述的哺乳动物细胞，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
20.如上述项18或19所述的哺乳动物细胞，其为将表达载体(a)和(b)、以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体(c)导入哺乳动物细胞而得到的细胞。
21.如上述项18～20中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，编码目标蛋白质的DNA为编码抗体的DNA。
22.如上述项21所述的哺乳动物细胞，其中，编码抗体的DNA为编码抗体的H链的DNA和编码抗体的L链的DNA中的至少一种。
23.如上述项18～22中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，导入有选自下述(a)～(d)的表达载体，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
24.如上述项18～23中任一项所述的哺乳动物细胞，其为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
25.如上述项18～24中任一项所述的哺乳动物细胞，其为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任意一种悬浮性哺乳动物细胞。
26.如上述项25所述的哺乳动物细胞，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。
27.如上述项19～26中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。
28.如上述项27所述的哺乳动物细胞，其中，抗放线菌酮基因为编码人核糖体蛋白质的突变体的基因。
29.如上述项19～28中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥作用的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。
30.如上述项29所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于DNA型转座子的碱基序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。
31.如上述项30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
32.如上述项30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol1转座子的碱基序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。
33.一种表达载体，其包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段，并且在该基因片段的两端含有一对转座子序列。
34.如上述项33所述的表达载体，其中，一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。
35.如上述项34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
36.如上述项34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol1转座子的序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。
发明效果
根据本发明的蛋白质的生产方法，能够使用悬浮性哺乳动物细胞高效地生产目标蛋白质。另外，本发明的细胞能够作为用于高效地生产基因重组蛋白质或基因重组多肽的生产细胞使用。
附图说明
图1表示抗人流感M2抗体表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示人抗体H链cDNA，Lc表示人抗体L链cDNA，CHX-r表示抗放线菌酮基因。
图2表示抗人流感M2抗体表达载体的示意图。CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示人抗体H链cDNA，Lc表示人抗体L链cDNA，CHX-r表示抗放线菌酮基因。
图3表示Tol2转座酶表达载体的示意图。CAGGS表示CAGGS启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，TPase cDNA表示Tol2转座酶cDNA。
图4表示对使用抗人流感M2抗体表达Tol2转座子载体时的、悬浮性CHO-K1细胞和粘附性CHO-K1细胞中的抗人流感M2抗体的表达量进行研究而得到的结果。图4A表示悬浮性CHO-K1细胞的结果，图4B表示粘附性CHO-K1细胞的结果。在任意一个图中，纵轴均表示抗体产生量(μg/mL)，横轴均表示各细胞的基因导入克隆编号。
图5表示抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体的示意图。Tol1-L表示左端Tol1转座子(序列号14)，Tol1-R表示右端Tol1转座子(序列号15)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示人抗体H链cDNA，Lc表示人抗体L链cDNA，CHX-r表示抗放线菌酮基因。
图6表示Tol1转座酶表达载体的示意图。CAGGS表示CAGGS启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，TPase cDNA表示Tol1转座酶cDNA。
图7表示对使用抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体时的、悬浮性CHO-K1细胞中的抗人流感M2抗体的表达量进行研究而得到的结果。纵轴表示抗体产生量(μg/mL)，横轴表示各细胞的基因导入克隆编号。
图8表示抗人CD98抗体重链表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，Pmo表示莫洛尼小鼠白血病病毒启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示抗人CD98抗体重链cDNA(序列号18)。
图9表示抗人CD98抗体轻链表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Lc表示抗人CD98抗体轻链cDNA(序列号21)。
图10表示抗放线菌酮基因表达转座子载体的示意图。Tol2-L表示左端Tol2转座子(序列号2)，Tol2-R表示右端Tol2转座子(序列号3)，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，CHX-r表示抗放线菌酮基因(序列号7)。
图11表示将TNFα-CHX串联载体、或者TNFαH-CHX载体以及TNFαL载体向CHO-K1细胞进行基因导入时的、抗人TNFα抗体产生量。纵轴表示培养基中产生的抗体浓度(mg/mL)，对照区用对照表示，实验区用Exp.表示。
图12表示将CD20-CHX串联载体、或者CD20H-CHX载体以及CD20L载体向CHO-K1细胞进行基因导入时的、抗人CD20抗体产生量。纵轴表示培养基中产生的抗体浓度(mg/mL)，对照区用对照表示，实验区用Exp.表示。
图13表示抗体表达载体A的结构。图13中，Tol2-L表示由Tol2-L序列(序列号2)构成的DNA片段，Tol2-R表示由Tol2-R序列(序列号3)构成的DNA片段，CMV表示CMV启动子，poly A表示多聚腺苷酸化位点，Hc表示抗人CD98抗体的重链基因，Lc表示抗人CD98抗体轻链基因，SO表示SV40启动子，SV表示SV40多聚腺苷酸化位点，Neo-r表示抗新霉素基因。
具体实施方式
本发明涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入哺乳动物细胞中、将插入在一对(两个)转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到悬浮性哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该蛋白质的方法以及表达该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
作为本发明的生产目标蛋白质的方法(以下也称为本发明的方法)，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的生产目标蛋白质的方法。
步骤(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，
(b)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到上述哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及
步骤(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
另外，本发明涉及一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，将插入在一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中，并且生产该目标蛋白质。
本发明中，目标蛋白质是指由一个以上多肽构成的蛋白质，根据本发明的方法，能够进行表达至少一种目标蛋白质和/或表达至少一个多肽中的任意一种。
包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体是指一种或两种以上的该表达载体。具体而言，为了表达由多个多肽构成的目标蛋白质，使用包含含有编码各多肽的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的多个表达载体。
更具体而言，例如，在上述由多个多肽构成的目标蛋白质为抗体的情况下，可以通过一种表达载体表达抗体的H链和L链，也可以使用表达H链的载体和表达L链的载体这两种表达载体进行表达。
根据本发明的方法，能够使用导入包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体、将插入在一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞来制造目标蛋白质。
作为基因插入的指标的选择标记基因可以重组到与含有编码目标蛋白质的DNA的表达载体相同的载体上，也可以重组到其他载体上。
即，可以将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体中的至少一种设定为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
另外，除了可以将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中之外，还可以将包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中。
具体而言，作为本发明的生产目标蛋白质的方法，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的生产目标蛋白质的方法。
步骤(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体，
(b)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及
步骤(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
另外，作为本发明的生产目标蛋白质的方法，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的生产目标蛋白质的方法。
步骤(A)将以下的表达载体(a)、(b)和(c)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，
(b)在选择标记基因的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(c)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性动物细胞中的表达载体(c)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；
步骤(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
本发明涉及一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体和在选择标记基因的两端含有一对转座子序列的表达载体，将插入在一对转座子序列之间的该基因片段和选择标记基因重组到染色体中，并且生产该目标蛋白质。
另外，本发明涉及一种悬浮性哺乳动物细胞，其中，导入有包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体，将插入在一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中，并且生产该目标蛋白质。
另外，作为本发明的生产目标蛋白质的哺乳动物细胞，可以列举通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的蛋白质表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的载体(b)同时导入而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
本发明中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的、导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体只要能够利用该哺乳动物细胞表达和制造目标蛋白质，则数目没有限制，可以优选列举1～20种表达载体，可以更优选列举2～10种表达载体，优选例如3～8种表达载体、4～7种表达载体、1～6种表达载体、1～5种表达载体、1～4种表达载体、1～3种表达载体。
另外，作为本发明的方式，可以列举：通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种蛋白质表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段向该哺乳动物细胞的染色体中的重组增加的方法；将编码目标蛋白质的DNA以高频率重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法；以及通过该方法得到的生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
本说明书中，“转座子”为转座性遗传因子，是指在保持一定结构的状态下在染色体上转座(transposition)或者从染色体转座到其他染色体上的基因单元。
转座子包含在基因单元的两端具有反向或同向的重复的转座子序列[也称为反向重复序列(IR序列)或末端反向重复序列(TIR序列)]和编码识别该转座子序列并使存在于转座子序列之间的基因发生转移的转座酶的碱基序列。
由转座子翻译而成的转座酶识别转座子两端的转座子序列，将插入在一对转座子序列之间的DNA片段切出并插入到转移目的地，由此能够进行DNA的转移。
本说明书中，“转座子序列”是指被转座酶识别的转座子的碱基序列，与IR序列或TIR序列具有相同的含义。包含该碱基序列的DNA只要能够在转座酶的作用下发生转移(插入到基因组中的其他位置)则也可以含有不完全的重复部分，存在对转座酶具有特异性的转座子序列。
本发明中使用的转座子序列优选为来源于DNA型转座子的碱基序列，更优选为被转座酶识别的、能够在哺乳动物细胞内转座的天然或人工的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。
作为来源于DNA型转座子的碱基序列，可以列举例如：来源于青鳉来源的Tol1和Tol2转座子、由存在于鲑科魚类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frogprince)和昆虫来源的转座子piggyBac的碱基序列。
这些中，优选来源于由序列表的序列号6表示的碱基序列构成的青鳉来源的Tol2转座子和由序列表的序列号13表示的碱基序列构成的青鳉来源的Tol1转座子的碱基序列。
作为一对来源于Tol2转座子的碱基序列，可以列举：由序列表的序列号6表示的Tol2转座子的碱基序列的第1位至第2229位的碱基序列和第4148位至第4682位的碱基序列。
作为一对来源于Tol2转座子的碱基序列，可以更优选列举：由序列表的序列号1表示的Tol2转座子的碱基序列中第1位至第200位的碱基序列(序列号2)(以下，记作Tol2-L序列)和第2285位至第2788位的碱基序列(序列号3)(以下，记作Tol2-R序列)。
作为一对来源于Tol1转座子的碱基序列，可以列举：由序列表的序列号13表示的Tol1转座子的碱基序列中第1位至第157位的碱基序列和第1748位至第1855位的碱基序列。
作为一对来源于Tol1转座子的碱基序列，可以更优选列举：由序列表的序列号13表示的Tol1转座子的碱基序列中第1位至第200位的碱基序列(序列号14)(以下，记作“Tol1-L序列”)和第1351位至第1855位的碱基序列(序列号15)(以下，记作Tol1-R序列)。
本发明中使用的转座子序列也包括通过使用上述的转座子来源的转座子序列的部分序列、调节碱基序列的长度以及利用碱基序列的添加、缺失或取代进行改变而对转移反应进行调控后的转座子序列。
作为本发明的生产目标蛋白质的方法，也包括使用至少两种转座子序列和至少两种转座酶来制造至少一种目标蛋白质。
具体而言，可以列举例如包括如下步骤的蛋白质的制造方法：将插入在两个Tol1转座子序列中的第一个含有编码目标蛋白质的DNA的载体、插入在两个Tol2转座子序列中的第二个含有编码目标蛋白质的DNA的载体、Tol1转座酶表达载体和Tol2转座子表达载体同时或者依次导入悬浮性哺乳动物细胞中，使各个编码目标蛋白质的DNA重组到该哺乳动物细胞的染色体中，获得生产两种目标蛋白质的哺乳动物细胞。
另外，第一个目标蛋白质与第二个目标蛋白质可以相同，也可以通过使导入细胞中的基因的拷贝数增加来提高目标蛋白质的生产率。
转座子的转移反应的调控可以通过促进或抑制利用转座酶的转座子序列的识别来促进或抑制转移反应。另外，转座子的转移反应可以通过缩短一对(两个)转座子序列之间含有的碱基序列的长度而使该转移反应增强，可以通过延长一对(两个)转座子序列之间含有的碱基序列的长度而使转移反应减弱。因此，在表达、制造由多个蛋白质构成的目标蛋白质的情况下，可以制作将编码各蛋白质的DNA重组到各自的表达载体中、使该DNA重组到宿主细胞的染色体内并且生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并使用该细胞来制造目标蛋白质。
本说明书中，“转座酶”是指识别具有转座子序列的碱基序列并使存在于该碱基序列之间的基因片段在染色体上转座或者从染色体转座到其他染色体上的酶。
作为转座酶，可以列举例如来源于青鳉来源的Tol1和Tol2、由存在于鲑科魚类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty，SB)、睡美人11(Sleeping Beauty11，SB11)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog Prince，FP)或昆虫来源的转座子piggyBac(PB)的酶。
转座酶可以使用天然型酶，只要保持与转座酶同样的转座活性，也可以对其一部分氨基酸进行取代、缺失、插入和/或添加。通过调控转座酶的酶活性，能够调控存在于转座子序列之间的基因片段的转移反应。
分析是否保持与转座酶同样的转移活性时，可以利用日本特开2003-235575号公报所公开的双组分分析系统进行测定。
具体而言，可以分别使用含有Tol2转座酶发生缺陷的Tol2转座子(Tol2来源的非自主性转座子)的质粒和含有Tol2转座酶的质粒，对非自主性Tol2元件是否能够在转座酶的作用下转移、插入到哺乳动物细胞的染色体内进行分析。
本说明书中，“非自主性转座子”是指存在于转座子内的转座酶发生缺陷、不能自主性地转移的转座子。对于非自主性转座子而言，可以通过使细胞内同时存在转座酶的蛋白质、编码转座酶的蛋白质的mRNA或编码转座酶的蛋白质的DNA而将插入在非自主性转座子的转座子序列之间的DNA转移到宿主细胞的染色体内。
转座酶基因是指编码转座酶的基因。为了提高哺乳动物细胞中的表达效率，可以在该基因的翻译起始密码子ATG的上游连接有kozak的共有序列(Kozak,M.Nucleic Acids Res.,12,857-872,1984)或者将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节至适当距离(例如6～18个碱基)而得到的序列。
本发明的方法中，为了将至少一种表达载体中的编码目标蛋白质的DNA重组到宿主细胞的染色体中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入宿主细胞中，使转座酶对导入到该细胞内的表达载体中含有的转座子序列发挥作用。
为了使转座酶对导入到宿主细胞内的表达载体中含有的转座子序列发挥作用，可以将转座酶注入该细胞内，也可以将包含编码转座酶的DNA的表达载体与包含至少一种编码目标蛋白质的DNA或者包含编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的表达载体一起导入宿主细胞中。另外，也可以将编码转座酶基因的RNA导入宿主细胞内，使转座酶在该细胞内进行表达。
作为表达载体，没有特别限定，可以根据重组有转座酶基因的载体所要导入的宿主细胞、用途等从本领域技术人员已知的表达载体中适当选择来使用。
本发明中，在生产由两种以上的多肽构成的目标蛋白质、或者两种以上的目标蛋白质的情况下，将编码各蛋白质的DNA重组到同一表达载体中，或者重组到各自不同的表达载体中，并将该表达载体导入宿主细胞中，由此，能够制作该DNA重组到该细胞的染色体中的蛋白质生产细胞。
转座酶可以重组到表达载体中与目标蛋白质一起表达，也可以重组到表达载体之外的载体中进行表达。转座酶可以暂时性地起作用，也可以持续性地起作用，为了制作稳定的产生细胞，优选使转座酶暂时性地起作用。
作为使转座酶暂时性地起作用的方法，可以列举例如将编码转座酶的DNA重组到含有编码目标蛋白质的DNA的表达载体之外的表达载体中并将两表达质粒同时导入宿主细胞中的方法。
本说明书中，“表达载体”是指为了转化哺乳动物细胞并表达目标蛋白质而使用的表达载体。本发明中使用的表达载体具有在表达盒的两侧至少存在一对转座子序列的结构。
本说明书中，“表达盒”是指具有用于表达目标蛋白质所需要的基因表达调控区域和编码目标蛋白质的序列的核酸序列。作为该基因表达调控区域，可以列举例如增强子、启动子和终止子等。表达盒中可以含有选择标记基因。
作为启动子，只要能够在哺乳动物细胞中发挥功能则可以使用任意一种启动子。可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的IE(immediate early，即刻早期)基因的启动子、SV40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloneymurine leukemia virus)的启动子和增强子等。另外，可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
“选择标记基因”是指能够用于区别导入有质粒载体的细胞和缺少该载体的细胞的任意的标记基因。
作为选择标记基因，可以列举例如：抗药性基因[抗新霉素基因、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、抗嘌呤霉素基因、抗杀稻瘟菌素基因、抗博莱霉素基因、抗潮霉素基因、抗放线菌酮基因(日本特开2002-262879号公报)]以及荧光或生物发光标记基因(绿色荧光蛋白GFP等)等。
本发明中，优选的选择标记为抗药性基因，特别优选的选择标记为抗放线菌酮基因。另外，通过对选择标记基因进行基因改变而制作氨基酸改变体或者调节选择标记基因的转录或翻译(例如，启动子的改变以及氨基酸密码子的改变等)，也可以改变选择标记蛋白质的抗药性能和发光能力。另外，通过调节药剂浓度，也可以选择抗药性强度不同的选择标记基因导入细胞。
为了调节选择标记蛋白质的抗药性能和发光能力，优选使用弱化的选择标记基因。弱化的选择标记基因是指以使选择标记基因所编码的蛋白质在细胞内的活性降低的方式进行改变后的选择标记基因。
作为以使细胞内的活性降低的方式进行改变后的选择标记基因，可以列举例如：(A)通过改变选择标记基因所编码的蛋白质的氨基酸序列而使该蛋白质在细胞内的活性降低的选择标记基因，以及(B)通过改变对选择标记基因的表达进行调控的碱基序列或改变选择标记基因的ORF(Open ReadingFrame，开放读码框)内的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的选择标记基因。
作为通过改变选择标记基因所编码的蛋白质的氨基酸序列而使该蛋白质在细胞内的活性降低的选择标记基因，可以列举例如：Sauter etal.[Biotech.Bioeng.89,530-538(2005)]或Chen et al.[Journal ofImmunological Methods295,49-56(2004)]中记载的抗新霉素基因。
作为通过改变对选择标记基因的表达进行调控的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的方法，可以列举例如：对调控选择标记基因的表达的启动子序列、终止子序列、增强子序列、kozak的共有序列或夏因-达尔加诺序列的序列进行改变的方法。更具体而言，可以列举例如：将调控选择标记基因的表达的启动子序列取代成更弱的启动子序列的方法。
作为通过改变选择标记基因的ORF内的碱基序列而使该蛋白质在细胞内的表达量降低的方法，可以列举例如将该ORF内的密码子取代成在该细胞内的使用频率更低的同义密码子的方法。
作为本发明的弱化的选择标记基因，可以列举例如：将上述的该基因的ORF内的密码子取代成在该细胞内的使用频率更低的同义密码子的选择标记基因。
在各种生物种类的细胞内，各同义密码子中使用频率更低的同义密码子可以基于公知的文献或数据库等进行选择。
这种取代成使用频率低的同义密码子的取代，具体而言，例如，在CHO细胞的情况下，是指将亮氨酸的密码子取代成TTA、将精氨酸的密码子取代成CGA或CGT、将丙氨酸的密码子取代成GCG、将缬氨酸的密码子取代成GTA、将丝氨酸的密码子取代成TCG、将异亮氨酸的密码子取代成ATA、将苏氨酸的密码子取代成ACG、将脯氨酸的密码子取代成CCG、将谷氨酸的密码子取代成GAA、将酪氨酸的密码子取代成TAT、将赖氨酸的密码子取代成AAA、将苯丙氨酸的密码子取代成TTT、将组氨酸的密码子取代成CAT、将谷氨酰胺的密码子取代成CAA、将天冬酰胺的密码子取代成AAT、将天冬氨酸的密码子取代成GAT、将半胱氨酸的密码子取代成TGT或者将甘氨酸的密码子取代成GGT。
弱化的选择标记基因中，只要能够高效地获得生产蛋白质的细胞则与改变前的选择标记基因相比被取代的密码子数没有特别限制，优选对20个以上的氨基酸残基所对应的密码子进行取代。
弱化的选择标记基因中，与改变前的选择标记基因相比被改变的碱基数没有特别限制，优选对编码选择标记基因的碱基序列的10%以上进行改变。
另外，弱化的选择标记基因中取代的密码子所编码的氨基酸残基没有特别限制，可以优选列举亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
弱化的选择标记基因中，在对亮氨酸残基所对应的密码子进行取代的情况下，没有特别限制，优选对选择标记基因中含有的全部亮氨酸残基所对应的密码子中70%以上的亮氨酸残基所对应的密码子进行取代。
另外，弱化的选择标记基因中，在对丙氨酸残基所对应的密码子进行取代的情况下，没有特别限制，优选对选择标记基因中含有的全部丙氨酸残基所对应的密码子中70%以上的丙氨酸残基所对应的密码子进行取代。
作为这种通过取代成使用频率低的同义密码子而改变得到的、弱化的选择标记基因的例子，具体而言，可以列举：由序列号37、38或39表示的碱基序列构成的抗新霉素基因、由序列号41、43或44表示的碱基序列构成的抗嘌呤霉素基因、由序列号45或46表示的碱基序列构成的抗博莱霉素基因、由序列号47或48表示的碱基序列构成的抗潮霉素基因。
另外，也可以通过在抗体生产细胞的制作中使选择抗药性细胞时的药剂的浓度与通常使用的浓度相比显著提高或在药剂代谢、分解之前追加施用抗药性基因等来使选择标记基因弱化。
放线菌酮(以下，也有时简记为CHX)为蛋白质合成抑制剂，作为将抗CHX基因用作选择标记的例子，已知酵母[Kondo K.J.Bacteriol.,177,24,7171-7177(1995)]、动物细胞(日本特开2002-262879号公报)的例子。
对于动物细胞而言，明确了使由序列表的序列号5表示的碱基序列编码的人核糖体蛋白质亚单位的L36a的54位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺的、表达由序列表的序列号7表示的碱基序列编码的蛋白质而得到的转化株赋予对放线菌酮的抗性。另外，作为抗放线菌酮标记，可以列举例如：人核糖体蛋白质亚单位L44的54位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺的突变人核糖体蛋白质亚单位L44。
作为将包含上述转座子序列的蛋白质表达载体、表达转座酶的质粒载体或RNA导入宿主细胞中的方法，没有特别限定，可以列举例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、基因枪法和脂质体转染法等。
在将转座酶以蛋白质的形式直接导入的情况下，可以列举例如通过显微注射法或胞吞作用供给到细胞内的方法。基因导入可以通过新基因工程手册、村松正实、山本雅编著、羊土社、ISBN 9784897063737中记载的方法进行。
作为宿主细胞，可以列举能够传代培养且能够稳定地表达目标蛋白质的哺乳动物细胞。作为宿主细胞，可以列举例如：PER.C6细胞、人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猴细胞COS细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK、HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of ExperimentalMedicine,108,945(1958);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,601275(1968);Genetics,55,513(1968);Chromosoma,41,129(1973);Methods in CellScience,18,115(1996);Radiation Research,148,260(1997);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980);Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968);Cell,6,121(1975);Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)]、CHO/DG44、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCCCCL-1781)、CHO-S(Life Technologies,Cat#11619)、Pro-3和CHO细胞的亚系。
另外，上述宿主细胞也可以通过改变染色体DNA和导入外源性基因等以适合蛋白质生产的方式进行改变后用于本发明的蛋白质的生产方法。
另外，作为宿主细胞，为了调控生产的目标蛋白质上结合的糖链结构，也可以使用获得了植物凝集素抗性的Lec13[Somatic Cell and Moleculargenetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因发生缺陷的CHO细胞(国际公开第05/35586号、国际公开第02/31140号)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)发生缺陷的细胞和Fx蛋白质发生缺陷的细胞。
本发明中，目标蛋白质也包括由至少一种多肽构成的蛋白质、由多种多肽或蛋白质构成的复合蛋白质中的任意一种。另外，本发明中，蛋白质与多肽的含义相同，但有时也将较低分子量的蛋白分子或者构成复合蛋白质的蛋白质定义为多肽。
本发明中，目标蛋白质只要能够通过本发明的方法表达，则可以为任意的蛋白质、多肽。具体而言，可以列举例如：人血清蛋白、白蛋白结合蛋白质、肽类激素、生长因子、细胞因子、血液凝固因子、纤溶类蛋白质、抗体、选择标记蛋白质、膜蛋白质和各种蛋白质的部分片段等。具体而言，可以列举例如：人静脉免疫球蛋白(IVIG)、红细胞生成素(EPO)、白蛋白、生长激素(GH)、卵泡刺激激素(FSH)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、干扰素(INF)、Fas配体、血液凝固因子(II、VII、VIII、IX、X)、凝血酶原、纤维蛋白原、蛋白C、蛋白S、抗凝血酶III(ATIII)、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、单克隆抗体、多克隆抗体以及药剂选择(抗性)基因等。
抗体是由抗体重链(H链)多肽和两条抗体轻链(L链)多肽构成的分子，已知IgA、IgD、IgE、IgG和IgM亚类。另外，IgG分类成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4类。
IgG抗体是指由两条H链多肽和两条L链多肽构成的异四聚体分子。H链和L链分别由与抗原结合相关的可变区(V)和恒定区(C)构成，被称为VH、CH、VL或CL。CH区进一步分类成CH1区、CH2区、CH3区，将CH2区和CH3区合并称为Fc区或者简称为Fc。
抗体包括与单一表位反应的单克隆抗体、与多个表位反应的多克隆抗体、基因重组抗体。
单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞分泌的抗体，仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)是均匀的。
多克隆抗体是指单克隆抗体的混合物，能够与多个表位反应。
作为基因重组抗体，可以列举例如：嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、Fc融合蛋白、Fc氨基酸改变抗体、多价抗体及该部分片段等。氨基酸改变抗体可以对可变区或恒定区中的任意一个部分实施氨基酸残基改变，使抗体的活性得到调控。
多价抗体有与一个抗原上的两个以上不同的表位反应的多价抗体、与两个以上不同的抗原反应的多价抗体等，可以为其中的任意一种。另外，只要是维持与抗原的结合活性的多价抗体，则可以为任意结构的多价抗体(国际公开第2001/77342号、美国专利第7612181号说明书、国际公开第2009/131239号)。
根据本发明的制造方法，能够表达、制造上述任意的目标蛋白质和/或目标肽。
作为本发明的导入有至少一种编码目标蛋白质的DNA的细胞，可以列举通过以下的(A)和(B)的步骤制造的抗体产生细胞，
步骤(A)将选自以下的(a)～(c)中的一种表达载体的组合或表达载体(d)、以及表达载体(e)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和编码抗药性基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(e)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，选择出表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞。
作为本发明的制造抗体的方法，可以列举包括以下的步骤(A)～(C)的、生产目标蛋白质的方法，
步骤(A)将选自以下的(a)～(c)中的一种表达载体的组合或表达载体(d)、以及表达载体(e)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码抗药性基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(e)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，得到表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞；
步骤(C)对步骤(B)中得到的表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产抗体。
另外，本发明包括包含以下的(A)和(B)的步骤的抗体高生产株的制造方法以及筛选方法，
步骤(A)将选自以下的(a)～(c)中的一种表达载体的组合或表达载体(d)、以及表达载体(e)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(e)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，选择出高表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞。
另外，本发明包括包含以下的(A)、(B)和(C)的步骤的抗体制造方法，
步骤(A)将选自以下的(a)～(c)中的一种表达载体的组合或表达载体(d)、以及表达载体(e)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和编码选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体，
(e)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
步骤(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(e)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的上述H链、L链和选择标记基因重组到上述哺乳动物细胞的染色体中，得到表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞；
步骤(C)对步骤(B)中得到的表达抗体的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产抗体。
作为本发明的导入有至少一种编码目标蛋白质的DNA的哺乳动物细胞，可以列举例如：导入有多个不同的抗体基因的多克隆抗体产生细胞以及复合物分子产生细胞等。
作为多克隆抗体产生细胞，可以列举例如：导入有抗一种抗原的至少两种以上不同的单克隆抗体基因的细胞、导入有抗多种抗原的多种单克隆抗体基因的细胞、导入有抗原被免疫的来源于非人动物的抗体基因文库的细胞、以及导入有来源于患者的抗体基因文库的细胞等。
复合物分子生产细胞只要是导入有编码在细胞内共表达的各个分子形成复合物分子的蛋白质的DNA的细胞，则可以为任意一种细胞。具体而言，可以列举例如：共导入有FcγRIII(CD16)和共有γ链的细胞、共导入有新生儿Fc受体(FcRn)和β2巨球蛋白的细胞、以及共导入有CD98和LAT1的细胞(国际公开第2007/114496号)等。
通过本发明的抗体制造方法制造的抗体可以为任意的抗体，可以列举例如：识别肿瘤相关抗原的抗体、识别与过敏或炎症相关的抗原的抗体、识别与循环器官疾病相关的抗原的抗体、识别与自身免疫疾病相关的抗原的抗体、以及识别与病毒或细菌感染相关的抗原的抗体等。
作为肿瘤相关抗原，可以列举例如：CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40配体(CD40L)、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、肾上腺髓质素、血管生成素相关蛋白4(ARP4)、极光激酶、B7-H1、B7-DC、整合素、骨髓基质抗原2(BST2)、CA125、CA19.9、碳酸酐酶9(CA9)、钙粘蛋白、cc-趋化因子受体(CCR)4、CCR7、癌胚抗原(CEA)、富含半胱氨酸的成纤维细胞生长因子受体-1(CFR-1)、c-Met、c-Myc、胶原蛋白、CTA、结缔组织生长因子(CTGF)、CTLA-4、细胞角蛋白-18、DF3、E-钙粘蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、EGFR2(HER2)、EGFR3(HER3)、EGFR4(HER4)、细胞膜糖蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、血管内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、肝配蛋白、肝配蛋白受体(Eph)、EphA2、endotheliase-2(ET2)、FAM3D、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fc受体同系物1(FcRH1)、铁蛋白、成纤维细胞生长因子-8(FGF-8)、FGF8受体、碱性FGF(bFGF)、bFGF受体、FGF受体(FGFR)3、FGFR4、FLT1、FLT3、叶酸受体、卷曲同源物10(FZD10)、卷曲受体4(FZD-4)、G250、G-CSF受体、神经节苷脂(例如，GD2、GD3、GM2和GM3等)、globo H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙酰肝素酶I、肝细胞生长因子(HGF)、HGF受体、HLA抗原(例如，HLA-DR等)、HM1.24、人乳脂肪球蛋白(HMFG)、hRS7、热休克蛋白90(hsp90)、独特型表位、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF受体(IGFR)、白细胞介素(例如，IL-6和IL-15等)、白细胞介素受体(例如，IL-6R和IL-15R等)、整合素、免疫受体转运相关-4(IRTA-4)、激肽释放酶1、KDR、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1、lamp-2、层粘连蛋白-5、路易斯寡糖y、唾液酸化的路易斯寡糖x、淋巴毒素β-受体(LTBR)、LUNX、黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、间皮素、MICA、苗勒管抑制物质II型受体(MISIIR)、粘蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、Necl-5、Notch1、骨桥蛋白、血小板衍生生长因子(PDGF)、PDGF受体、血小板因子-4(PF-4)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、甲状旁腺激素相关蛋白/肽(PTHrP)、NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)、透明质酸受体介导的细胞游走受体(RHAMM)、ROBO1、SART3、脑信号蛋白4B(SEMA4B)、白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)、SM5-1、1-磷酸鞘氨醇、肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)、转铁蛋白受体(TfR)、TGF-β、Thy-1、Tie-1、Tie2受体、T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域1(TIM-1)、人组织因子(hTF)、Tn抗原、肿瘤坏死因子(TNF)、Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原)、TNF受体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TRAIL受体(例如，DR4和DR5等)、系统ASC氨基酸转运蛋白2(ASCT2)、trkC、TROP-2、TWEAK受体Fn14、IV型胶原酶、尿激酶受体、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3等)、波形蛋白和VLA-4等，可以列举抗这些抗原的抗体等。
另外，作为识别肿瘤相关抗原的抗体，可以列举例如：抗GD2抗体[Anticancer Res.,13,331(1993)]、抗GD3抗体[Cancer Immunol.Immunother.,36,260(1993)]、抗GM2抗体[Cancer Res.,54,1511(1994)]、抗CD52抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285(1992)]、抗MAGE抗体[British J.Cancer,83,493(2000)]、抗HM1.24抗体[Molecular Immunol.,36,387(1999)]、抗甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)抗体[Cancer,88,2909(2000)]、抗bFGF抗体、抗FGF-8抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,9911(1989)]、抗bFGFR抗体、抗FGFR1抗体(国际公开第2005/037235号)、抗FGF-8R抗体[J.Biol.Chem.,265,16455(1990)]、抗IGF抗体[J.Neurosci.Res.,40,647(1995)]、抗IGF-IR抗体[J.Neurosci.Res),40,647(1995)]、抗PSMA抗体[J.Urology,160,2396(1998)]、抗VEGF抗体[Cancer Res),57,4593(1997)、Avastin(R)]、抗VEGFR抗体[Oncogene,19,2138(2000)、国际公开第96/30046号]、抗CD20抗体[Curr.Opin.Oncol.,10,548(1998)、US5,736,137、Rituxan(R)、Ocrelizumab、Ofatumumab]、抗EGFR抗体(Erbitux(R)、Vectivix(R))、抗HER2抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285(1992)、US5,725,856、Herceptin(R)、Pertuzumab)、抗HER3抗体(US2008/0124345)、c-Met抗体(US6,468,529)、抗CD10抗体、抗EGFR抗体(国际公开第96/402010号)、抗Apo-2R抗体(国际公开第98/51793号)、抗ASCT2抗体(国际公开第2010/008075号)、抗CEA抗体[キャンサー·リサーチ(Cancer Res.),55(23 suppl)：5935s-5945s,(1995)]、抗CD38抗体、抗CD33抗体、抗CD22抗体、抗CD20氨基酸改变抗体(Immunology,115,4393,2010.)、抗EpCAM抗体、抗A33抗体和抗叶酸受体抗体(MRAb-003)等。
作为识别与过敏或炎症相关的抗原的抗体，可以列举例如：抗白介素6抗体[Immunol.Rev.,127,5(1992)]、抗白介素6受体抗体[MolecularImmunol.,31,371(1994)、Actemura(R)]、抗白介素5抗体[Immunol.Rev.,127,5(1992)]、抗白介素5受体抗体、抗白介素4抗体[Cytokine,3,562(1991)]、抗白介素4受体抗体[J.Immunol.Methods,217,41(1998)]、抗肿瘤坏死因子抗体[Hybridoma,13,183(1994)、Humira(R)]、抗肿瘤坏死因子受体抗体[Molecular Pharmacol.,58,237(2000)]、抗CCR4抗体[Nature,400,776,(1999)]、抗趋化因子抗体(Peri et al.,J.Immunol.Meth.,174,249-257,1994)以及抗趋化因子受体抗体[J.Exp.Med.,186,1373(1997)]等。作为识别与循环器官疾病相关的抗原的抗体，可以列举例如：抗GPIIb/IIIa抗体[J.Immunol.,152,2968(1994)]、抗血小板来源的生长因子抗体[サイエンス(Science),253,1129(1991)]、抗血小板来源的生长因子受体抗体[J.Biol.Chem.,272,17400(1997)]、抗血液凝固因子抗体[CirculatioN,101,1158(2000)]、抗IgE抗体、抗αVβ3抗体以及α4β7抗体等。
作为识别与病毒或细菌感染相关的抗原的抗体，可以列举例如：抗gp120抗体[Structure,8,385(2000)]、抗CD4抗体[J.Rheumatology,25,2065(1998)]、抗CCR5抗体、抗志贺毒素抗体[J.Clin.Microbiol.,37,396(1999)]以及抗M2抗体(日本特开2003-235575号公报)等。
通过本发明的方法生产的单克隆抗体的效应活性可以通过各种方法进行调控。已知例如：对抗体的Fc区的第297位的天冬酰胺(Asn)上结合的N连接复合型糖链的还原末端上存在的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上α-1,6连接的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行调控的方法(国际公开第05/035586号、国际公开第02/31140号、国际公开第00/61739号)；以及通过改变抗体的Fc区的氨基酸残基来进行调控的方法；等。通过本发明的方法生产的单克隆抗体可以使用任意一种方法调控效应活性。
“效应活性”是指经由抗体的Fc区而引起的抗体依赖性活性，已知抗体依赖性细胞毒活性(ADCC活性)、补体依赖性细胞毒活性(CDC活性)或者巨噬细胞或树突细胞等吞噬细胞的抗体依赖性吞噬作用(Antibody-dependent phagocytosis，ADP活性)等。
另外，通过对利用本发明的方法生产的单克隆抗体的Fc区的N连接复合型糖链的核心岩藻糖的含量进行调控，能够增加或降低抗体的效应活性。
作为使抗体的Fc区上结合的N连接复合型糖链上结合的岩藻糖的含量降低的方法，可以通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因发生缺陷的CHO细胞表达抗体而获得未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高ADCC活性。
另一方面，作为使抗体的Fc上结合的N连接复合型糖链上结合的岩藻糖的含量增加的方法，可以通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞表达抗体而获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体更低的ADCC活性。
另外，可以通过改变抗体的Fc区的氨基酸残基来增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，可以通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书中记载的抗体的Fc区的氨基酸序列来增加抗体的CDC活性。
另外，也可以通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书中记载的氨基酸改变来增加或降低ADCC活性或CDC活性。
本发明中使用的“悬浮性哺乳动物细胞”是指不粘附于微珠或组织培养用培养器(也称为组织培养容器或粘附培养容器等)等培养细胞容易粘附且施加有涂层的细胞培养支持体上而能够悬浮于培养液中存活和增殖的细胞。
只要细胞不粘附于细胞培养支持体上，则可以是在培养液中以一个细胞的状态存活、增殖或者以多个细胞相互聚集而成的细胞团的状态存活、增殖中的任意一种状态。
另外，作为本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞，优选能够在不含胎牛血清(fetal calf serum，以下记作FCS)等的无血清培养基中不粘附于细胞培养支持体上而悬浮于培养液中存活和增殖的细胞，更优选能够在不含蛋白质的无蛋白培养基中以悬浮状态存活和增殖的哺乳动物细胞。
作为组织培养用培养器，只要是粘附培养用的施加有涂层的烧瓶、培养皿等则可以是任何一种培养器。具体而言，通过使用市售的组织培养烧瓶(グライナー公司制造)和粘附培养烧瓶(住友ベークライト公司制造)等，可以确认为悬浮性哺乳动物细胞。
作为本发明中使用的悬浮性哺乳动物细胞，可以是原来就具有悬浮性的性质的在悬浮培养中驯化而得到的细胞，也可以是使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞。
作为原来就具有悬浮性的性质的哺乳动物细胞，可以列举例如：PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和CHO-S细胞(Invitrogen公司制造)等。
上述“将粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化而得到的悬浮性哺乳动物细胞”可以通过Mol.Biotechnol.2000,15(3),249-57中记载的方法或以下所示的方法等进行制作，可以通过建立与悬浮培养驯化前同样或者比悬浮培养驯化前更优良的增殖和存活的细胞来制作(J.Biotechnol.2007,130(3),282-90)。
“与悬浮培养驯化前同等”是指悬浮培养中驯化得到的细胞的存活率和增殖速度(倍增时间)等与悬浮培养驯化前的细胞相比实质上相同。
本发明中，作为使粘附性的哺乳动物细胞在悬浮性培养条件下驯化的方法，可以列举如下方法。将含有血清的培养基的血清含量减至1/10，以比较高的细胞浓度重复进行传代培养，在哺乳动物细胞能够存活和增殖的时刻进一步减少血清含量并重复进行传代培养。根据该方法，可以制作能够在无血清条件下存活、增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
另外，也可以通过向培养液中添加适当的非离子性表面活性剂Pluronic-F68等并进行培养的方法来制作悬浮性哺乳动物细胞。
作为通过在悬浮性培养条件下驯化而成为悬浮性的粘附性的哺乳动物细胞，可以列举例如：小鼠骨髓瘤细胞NS0和CHO细胞等。
本发明中，作为悬浮性CHO细胞所具有的性质，在将该细胞以2×105个细胞/mL进行悬浮培养的情况下，3～4天后培养结束时的细胞密度优选为5×105个细胞/mL以上，更优选为8×105个细胞/mL以上，特别优选为1×106个细胞/mL以上，最优选为1.5×106个细胞/mL以上。
另外，作为本发明的悬浮性哺乳动物细胞的倍增时间，优选为48小时以下，更优选为24小时以下，特别优选为18小时以下，最优选为11小时以下。
悬浮培养基可以使用例如CD-CHO培养基(Invitrogen公司)、EX-CELL325-PF培养基(SAFC Biosciences公司)以及SFM4CHO培养基(HyClone公司)等市售的培养基。另外，也可以通过配合哺乳动物细胞的培养所需的糖类、氨基酸类等并进行制备而得到。
悬浮性哺乳动物细胞的培养可以使用能够进行悬浮培养的培养容器，通过能够进行悬浮培养的培养条件来进行。作为培养容器，可以使用例如：细胞培养用的96孔板(康宁公司)、T-烧瓶(BD公司)和三角烧瓶(康宁公司)等。
作为培养条件，例如可以在5%CO2气氛中、37℃的培养温度下通过静置培养等来进行。也可以使用作为悬浮培养专用培养设备的Wave生物反应器(GE医疗集团生命科学部)等振荡培养装置等。
关于使用Wave生物反应装置的哺乳动物细胞的悬浮培养条件，可以通过GE医疗集团生命科学部主页http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf中记载的方法进行。
除了振荡培养以外，也可以利用生物反应器等旋转搅拌装置进行培养。利用生物反应器的培养可以通过Cytotechnology(2006)52:199-207中记载的方法等进行。
本发明中，在使用悬浮性哺乳动物细胞以外的细胞株的情况下，也可以应用通过如上所述的方法在悬浮培养中驯化得到的且能够使用本发明的蛋白质生产方法的细胞株中的任意一种细胞株。
由悬浮性哺乳动物细胞生产的目标蛋白质的纯化可以通过从含有蛋白质的培养液或细胞破碎液中将目标蛋白质与目标蛋白质以外的杂质分离来进行。作为分离的方法，可以列举例如：离心、透析、硫酸铵沉淀、柱层析或过滤器等，可以利用目标蛋白质与杂质的物理化学性质的差异或在单一柱上的结合力的差异来进行。
纯化目标蛋白质的方法可以通过例如蛋白质实验记录(上)提取、分离和重组蛋白的表达(羊土社，冈田雅人、宫崎香编著，ISBN9784897069180)中记载的方法来进行。
本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献的全部内容按照与各自具体记载的内容相同的程度作为参考援引到本说明书中。
以上，为便于理解，示出了优选实施方式对本发明进行了说明。以下，基于实施例对本发明更具体地进行说明，但上述说明和下述实施例只是为了例示的目的而提供，并不是为了限定本发明的目的而提供。因此，本发明的范围不受本说明书中具体记载的实施方式和实施例的限定而仅由权利要求书进行限定。
关于以下记载的克隆等与基因重组相关的各种实验技术，依据J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis著、分子克隆第二版(Molecular Cloning2nd edition)和Frederick M.Ausubel等编著、Current Protocols发行、CurrentProtocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验操作指南)等中记载的基因工程方法进行。
实施例
[实施例1]抗人流感M2抗体表达转座子载体的制作
蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对Tol2转座子序列之间的任意的人抗体基因和药剂选择标记基因的哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。
所使用的基因的DNA通过基于已知的碱基序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。
转座子序列使用由日本特开2003-235575号公报公开的非自主性Tol2转座子的碱基序列(序列号1)中第1位至第200位的碱基序列(Tol2-L序列)(序列号2)和第2285位至第2788位的碱基序列(Tol2-R序列)(序列号3)的碱基序列。
通过如下方法分别制作包含一对转座子序列的合成DNA片段(宝生物株式会社制造)。制作包含在Tol2-R序列的5’末端和3’末端这两个末端都连接有限制性内切酶NruI的识别序列的碱基序列的DNA片段。另外，制作包含在Tol2-L序列的5’末端连接有限制性内切酶FseI的识别序列且在3’末端连接有限制性内切酶AscI的识别序列的碱基序列的DNA片段。
接着，将制作的包含Tol2-R序列和Tol2-L序列的DNA片段插入包含编码抗人流感M2抗体Z3G1的氨基酸序列的碱基序列的表达载体N5LG1_M2_Z3载体(国际公开第06/061723号)中。
抗体基因表达盒使用在CMV增强子/启动子调控下插入编码抗人流感M2抗体Z3G1(ATCC Deposit No.PTA-5968;deposited March13,2004,American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)的H链(序列号10)的碱基序列(序列号9)以及编码L链(序列号12)的碱基序列(序列号11)而得到的N5LG1_M2_Z3载体(国际公开第06/061723号)。
在M5LG1_M2_Z3载体的、包含抗体基因表达盒和选择标记基因表达盒的基因片段的5’末端侧存在的限制性内切酶NruI位点上插入包含Tol2-R序列的DNA片段。另外，在3’末端侧存在的限制性内切酶FseI和AscI位点上插入包含Tol2-L序列的DNA片段。
另外，在CMV增强子/启动子调控下将连接有编码抗放线菌酮基因(人核糖体蛋白质L36a的54位的脯氨酸突变为谷氨酰胺的基因)的碱基序列(序列号5)的抗放线菌酮基因表达盒插入到连接有Tol2转座子序列的N5LG1_M2_Z3载体的FseI识别位点，构建抗人流感M2抗体转座子表达载体(图1)。
另一方面，将不含转座子序列的载体命名为抗人流感M2抗体表达载体，作为对照载体使用(图2)。
[实施例2]转座酶表达载体的制作
转座酶使用与目标抗体的表达载体独立的表达载体来表达。即，将编码来源于青鳉的Tol2转座酶的基因(序列号4)插入到pCAGGS载体(Gene108,193-200,1991)的CAGGS启动子的下游，制作Tol2转座酶表达载体(以下，简记为Tol2载体)(图3)。
[实施例3]使用哺乳动物细胞的转化体的制作
(1)悬浮化CHO细胞的制作
将在添加有10%血清(FCS)的α-MEM培养基(Invitrogen公司)中培养的粘附性CHO细胞通过胰蛋白酶处理进行剥离、回收，使用新的添加有10%FCS的α-MEM培养基，在37℃、5%CO2孵育箱内进行振荡培养。几天后，确认这些细胞进行增殖后，以2×105个/mL的浓度接种到添加有5%FCS的α-MEM培养基中并进行振荡培养。
再过几天后，使用添加有5%FCS的α-MEM培养基进行同样的接种操作。最后使用不含血清的α-MEM培养基重复进行传代、振荡培养，确认与血清存在下的培养具有同样的增殖能力，制作悬浮培养驯化株。
(2)生产抗体的CHO细胞的制作
作为表达载体，使用实施例1和实施例2的抗人流感M2抗体表达转座子载体(以下，简记为转座子载体)和Tol2载体pCAGGS-T2TP[图3、Kawakami K&Noda T.Genetics.166,895-899(2004)]。另外，作为对照，使用不具有转座子序列的抗人流感M2抗体表达载体。
将上述表达载体导入到在悬浮培养中驯化而得到的CHO-K1细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，目录号CCL-61)或HEK293细胞(Invitrogen公司，FreeStyle293F细胞)中，并对得到抗放线菌酮克隆的频率进行比较。
使各4×106个的细胞悬浊于400μL的PBS中，将抗人流感M2抗体表达转座子载体(10μg)与Tol2载体(25μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。需要说明的是，Tol2载体使Tol2转座酶暂时性地表达，因此，为了防止重组到宿主染色体中而以环状DNA的状态导入。
另外，作为对照，根据利用标准的电穿孔的基因导入法，将抗人流感M2抗体表达载体(10μg)利用限制性内切酶形成为直链状后，导入各细胞中。
电穿孔使用电穿孔仪(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造))，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。
通过电穿孔导入基因后，将各细胞接种到3块96孔板上，并将CHO细胞使用SAFC Biosciences公司的EX-CELL325-PF培养基在CO2孵育箱内培养3天，将HEK293细胞使用freeStyle-293培养基(Invitrogen公司)在CO2孵育箱内培养3天。
接着，从基因导入4天后的培养基更换开始，加入3μg/mL的放线菌酮，在放线菌酮存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养3周。
培养3周后，计数观察到抗放线菌酮菌落的孔数。
将该结果示于表1和表2。
表1抗放线菌酮细胞数的比较(CHO细胞)
表2抗放线菌酮细胞数的比较(NEK293细胞)
Figure BDA00003356910500442
如表1所示，在悬浮性CHO-K1细胞中导入有抗人流感M2抗体表达转座子载体或抗人流感M2抗体表达载体后，与其他细胞株同样地不会由导入有抗人流感M2抗体表达载体的细胞获得放线菌酮抗性的转化株，但由抗人流感M2抗体表达转座子载体导入细胞以高频率得到放线菌酮抗性的转化株。
另一方面，如表2所示，即使在HEK293细胞中导入抗人流感M2抗体表达转座子载体或抗人流感M2抗体表达载体中的任意一种表达载体，也不会获得放线菌酮抗性的转化株。
由这些结果可知，悬浮性哺乳动物细胞中，插入在一对转座子序列之间的编码目标蛋白质的基因和抗放线菌酮基因高效地导入到宿主细胞的染色体内。
(3)悬浮性CHO细胞和粘附性CHO细胞中的抗体生产的研究
为了研究悬浮性CHO细胞或者粘附性CHO细胞中的抗体生产效率，对各细胞株中的抗体的产生量进行研究。作为悬浮性CHO细胞，使用在悬浮培养中驯化后的悬浮性CHO-K1细胞。另外，作为粘附性CHO细胞，使用悬浮培养驯化前的粘附性CHO-K1细胞。
分别以抗人流感M2抗体表达转座子载体(10μg)和Tol2载体(25μg)对悬浮性CHO-K1细胞和粘附性CHO-K1细胞进行电穿孔。然后，将悬浮性CHO-K1细胞和粘附性CHO-K1细胞分别接种到3块96孔板上。
对于悬浮性CHO-K1细胞，使用悬浮细胞用培养基(SAFC Biosciences公司的EX-CELL325-PF)，对于粘附性CHO-K1细胞，使用添加有10%血清的α-MEM培养基(Invitrogen公司)。将各细胞在CO2孵育箱内培养3天，从电穿孔4天后的培养基更换开始，在3μg/mL的放线菌酮存在下培养3周。此时，每周进行培养基更换。
对于悬浮性CHO-K1细胞，将1×106个的细胞接种到6孔板上，在CO2孵育箱内振荡培养3天，使用培养上清，通过HPLC测定抗人流感M2抗体的蛋白质量。
对于粘附性CHO-K1细胞，在6孔板中达到汇合成片后(2×106个)进行培养基更换，静置培养3天后，使用培养上清，通过HPLC测定抗体蛋白质量。
培养上清中的抗体浓度的测定通过FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316中记载的方法进行。将结果示于图4。
如图4A所示，对于在悬浮培养中驯化后的CHO-K1细胞而言，多数得到显示出极高的抗体表达量的细胞。另一方面，如图4B所示，对于粘附性的CHO-K1细胞而言，仅得到显示出HPLC的检测限(5μg/mL)以下的表达量的细胞。
由这些结果发现，由于使用转座子载体来表达目标蛋白质，因此，能够在使用悬浮性哺乳动物细胞的情况下高表达目标蛋白质。
另外，由实施例1～3的结果可知，本发明的方法可以作为使用在悬浮培养中驯化后的悬浮性哺乳动物细胞来高效地制作高表达外源基因的生产细胞、生产目标蛋白质的新方法利用。
[实施例4]利用Tol1转座子的抗体表达细胞的制作以及抗体制造
(1)抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体的制作
与实施例1同样，蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对Tol1转座子序列之间的任意的人抗体基因和药剂选择标记基因的、哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。
所使用的基因的DNA通过基于已知的序列信息进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。
转座子序列使用由序列表的序列号13表示的非自主性Tol1转座子的碱基序列(国际公开第2008/072540号)中第1位至第200位的碱基序列(Tol1-L序列)(序列号14)和第1351位至第1855位的碱基序列(Tol1-R序列)(序列号15)。
通过如下方法分别制作包含一对转座子序列的合成DNA片段。制作包含在Tol1-R序列的5’末端和3’末端这两个末端都连接有限制性内切酶NruI的识别序列的碱基序列的DNA片段。另外，制作包含在Tol1-L序列的5’末端连接有限制性内切酶FseI的识别序列且在3’末端连接有限制性内切酶AscI的识别序列的碱基序列的DNA片段。
接着，将制作的包含Tol1-R序列和Tol1-L序列的DNA片段插入到N5LG1_M2_Z3载体中。在N5LG1_M2_Z3载体的、包含抗体基因表达盒和选择标记基因表达盒的基因片段的5’末端侧存在的限制性内切酶NruI位点上插入包含Tol1-R序列的DNA片段，在3’末端侧存在的限制性内切酶FseI和AscI位点上插入包含Tol1-L序列的DNA片段。
另外，在CMV增强子/启动子调控下，将连接有抗放线菌酮基因(人核糖体蛋白质L36a的54位的脯氨酸突变为谷氨酰胺的基因)(序列号7)的抗放线菌酮基因表达盒插入到连接有Tol1转座子序列的N5LG1_M2_Z3载体的FseI识别位点，构建抗人流感M2抗体Tol1转座子表达载体(图5)。
(2)Tol1转座酶表达载体的制作
转座酶使用与目标抗体的表达载体独立的表达载体来表达。即，在CMV增强子/启动子调控下，将连接有由序列号16表示的碱基序列构成的编码来源于青鳉的Tol1转座酶(序列号17)的DNA片段的Tol1转座酶基因表达盒插入到pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司制造)中，作为Tol1转座酶表达载体pTol1ase利用(图6)。
(3)生产抗体的CHO细胞的制作
使用上述(1)～(3)中制作的表达载体，通过与实施例3同样的方法对利用Tol1转座子的表达载体的导入效果进行研究。将该结果示于表3。
表3
Figure BDA00003356910500481
如表3所示，在悬浮性CHO-K1细胞中导入抗人流感M2抗体表达Tol1转座子载体时，与导入有抗人流感M2抗体表达Tol2转座子载体的实施例3同样地，以高频率得到放线菌酮抗性的转化株。
由该结果可知，在悬浮性哺乳动物细胞中，即使使用来源于Tol1转座子的碱基序列即转座子序列，也会将插入在两个转座子序列之间的抗体基因和抗放线菌酮基因高效地导入宿主细胞的染色体内。
(4)悬浮性CHO细胞中的抗体生产的研究
使用Tol1转座子，与实施例3的(3)同样地对悬浮性CHO细胞中的抗体生产效率进行研究。
培养上清中的抗体浓度的测定通过FEMS Yeast Res.,7,(2007),1307-1316中记载的方法进行。将结果示于图7。
如图7所示，在使用来源于Tol1转座子的碱基序列即转座子序列的情况下，与Tol2同样地，多数也得到显示出极高的抗体表达量的细胞。由该结果可知，在使用来源于Tol1转座子的碱基序列作为转座子序列的情况下，与使用来源于Tol2转座子的碱基序列时同样地得到高表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
[实施例5]抗人CD98抗体的制作
(1)抗人CD98抗体重链表达转座子载体和抗人CD98抗体轻链表达转座子载体的制作
为了制作具有由序列号20和23的氨基酸序列表示的可变区H链和L链的抗人CD98抗体，在各抗体可变区连接人IgG1抗体恒定区的氨基酸序列，制作H链和L链的氨基酸序列。
连接有信号序列的抗人CD98抗体重链可变区和轻链可变区的基因序列(序列号18、21)使用日本专利第4324637号公报中公开的重组到(N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L载体)中的序列，转座子序列、启动子等使用与实施例1同样的转座子序列、启动子，分别构建抗人CD98抗体重链表达转座子载体(简记为CD98H载体)和抗人CD98抗体轻链表达转座子载体(简记为CD98L载体)(图8、9)。
所使用的DNA片段通过基于已知的序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的重组操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。
(2)抗放线菌酮基因表达转座子载体的制作
在实施例1中记载的CMV增强子/启动子调控下连接编码抗放线菌酮基因的序列(序列号7)，在该抗放线菌酮基因表达盒的两端插入一对转座子序列(Tol-2L、Tol2-R)，构建抗放线菌酮基因表达转座子载体(以下，简记为CHX载体)(图10)。
所使用的DNA片段通过基于已知的序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。
(3)生产抗人CD98抗体的CHO细胞的制作
将上述(1)和(2)中制作的CD98H载体(图8)、CD98L载体(图9)、CHX载体(图10)以及实施例2中制作的Tol2载体(图3)导入在悬浮培养中驯化后的CHO-K1细胞中，并对高表达抗体的细胞的出现数进行比较。
在实验区，使4×106个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98H载体(10μg)、CD98L载体(10μg)、CHX载体(10μg)和Tol2载体(10μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。Tol2载体使Tol2转座酶暂时性地表达，因此，为了防止重组到宿主染色体中而以环状DNA的状态导入。电穿孔使用电穿孔仪(Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造))，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。
另外，在对照区，将CD98H载体(10μg)、CD98L载体(10μg)和CHX载体(10μg)分别利用限制性内切酶PciI(宝生物公司)形成为直链状后，与上述同样地进行电穿孔。
通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞悬浊于添加有0.5%大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)(以下记作0.5CD培养基)中，接种到1块96孔板上，在CO2孵育箱内培养4天。接着，从基因导入后5天后的培养基更换开始，使用添加有3μg/mL的放线菌酮(Sigma-Aldrich公司，C4859)的0.5CD培养基，在放线菌酮存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养4周。
培养4周后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法(LENCETM、パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。关于抗体高表达细胞，将培养上清中的抗体浓度为5.0μg/mL以上的表达的克隆作为抗体表达的细胞进行测量，将其结果示于表4。
表4
Figure BDA00003356910500501
如表4所示，将Tol2载体与抗人CD98抗体重链表达转座子载体、抗人CD98抗体轻链表达载体和抗放线菌酮基因载体一起共导入到悬浮性CHO-K1细胞的实验区中，观察到大量抗人CD98抗体表达细胞，但在没有共导入Tol2载体的对照区中，尽管使载体形成线状，也没有观察到抗人CD98抗体表达细胞。
[实施例6]抗人CD98抗体的制造
(1)包含抗人CD98抗体重链基因片段、抗人CD98抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作
在实施例5(1)中制作的抗人CD98抗体重链表达转座子载体中分别连接该实施例5(1)中制作的抗人CD98抗体轻链表达基因盒和实施例5(2)中制作的抗放线菌酮基因盒，与上述同样地使用合成DNA、PCR法，构建包含抗人CD98抗体重链基因片段、抗人CD98抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为CD98-CHX串联载体)。
(2)包含抗人CD98抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作
在实施例5(1)中制作的抗人CD98抗体重链表达转座子载体中分别连接实施例5(2)中所示的抗放线菌酮基因盒，与上述同样地使用合成DNA、PCR法，构建包含抗人CD98抗体重链和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(简记为CD98H-CHX表达转座子载体)。
(3)生产抗人CD98抗体的CHO细胞的制作
使用上述实施例5(1)和(2)以及上述实施例6(1)和(2)中制作的表达转座子载体，对将抗人CD98抗体的H链和L链利用同一表达载体进行基因导入的情况(对照区)、将抗人CD98抗体的H链、L链或抗放线菌酮基因分别利用不同的表达载体进行基因导入的情况(实验区1)、以及将H链或L链利用不同的表达载体进行基因导入的情况(实验区2)下的、高表达抗CD98抗体的细胞的出现数进行比较。
在实验区1，使4×106个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98H载体(10μg)、CD98L载体(10μg)、CHX载体(10μg)和Tol2载体(10μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。
在实验区2，使4×106个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98H-CHX载体(10μg)、CD98L载体(10μg)和Tol2载体(10μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。
在对照区，使4×106个CHO-K1细胞悬浊于400μL的PBS中，将CD98-CHX串联载体(10μg)、Tol2载体(20μg)通过电穿孔法以环状DNA的状态进行共导入。另外，在全部实验中，为了暂时性地表达Tol2转座酶，并且为了防止重组到宿主染色体中，将Tol2载体以环状DNA的状态导入。
以下的方法中，通过与实施例5(3)同样的方法，进行抗体生产细胞的出现率的确认。对于抗体表达细胞，将培养上清中的抗体浓度为3.0μg/mL以上的克隆作为抗体表达的细胞进行测量。将其结果示于表5。
表5
在导入有CD98H载体、CD98L载体和CHX载体的实验区1、以及导入有CD98H载体和CD98L载体的实验区2，高表达抗人CD98抗体的细胞的出现率大幅增加。
以上的结果表明，与将抗体重链基因与抗体轻链基因重组到同一表达载体中而得到的表达载体导入悬浮性CHO细胞中时相比，在将抗体重链基因和抗体轻链基因分别插入在不同的转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中的情况下，能够更容易地获得以及制造抗体高生产株。另外，由实验区1和实验区2的结果可知，即使在导入的载体为多个的情况下，抗药性基因(选择标记基因)为至少一个即足够。另外可知，抗药性基因可以位于重组有抗体重链基因的表达载体上，也可以位于分别独立的载体上。
以上的结果表明，作为以往困难的向悬浮性哺乳动物细胞中将配置在两个以上载体上的基因同时高效地导入细胞中的方法，转座子载体是有效的。另外表明，为了高生产由多个多肽构成的蛋白质和多个蛋白质，有效的是将各多肽或蛋白质利用不同的转座子载体导入细胞中。
(4)生产抗人CD98抗体的CHO细胞的培养
分别由上述实施例6(3)中得到的导入有CD98-CHX串联载体的细胞以及导入有CD98H-CHX载体和CD98L载体的细胞，对抗体表达量高的前3株比较抗体表达量。实验的细节如下所示。
将实施例6(3)中得到的利用放线菌酮抗性选择且表达抗人CD98抗体的CHO-K1细胞依次在96孔板、24孔板、6孔板(康宁公司)中放大培养。在放大培养后，测定培养上清中的抗体浓度，选择出高表达抗人CD98抗体的CHO细胞的前3株。接着，将选择出的3株以分别达到2×105个/mL的方式悬浊于0.5%CD培养基(Invitrogen公司)0.5CD培养基3mL中，使用6孔板，在37℃、5%CO2的气氛中旋转培养5天。通过HPLC(Waters公司)对培养5天后的培养基中的抗体量进行定量。将其结果示于表6。
表6
抗体表达量(mg/L)
如表6所示可知，共导入有CD98H载体和CD98L载体的CHO-K1细胞与导入有CD98-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，抗体生产量更高。
以上的结果表明，通过将抗体重链基因与抗体轻链基因分别插入在不同的一对转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，不仅能够容易地获得以及制造抗体高生产株，而且所得到的细胞具有高抗体生产率。
[实施例7]抗人肿瘤坏死因子-α(TNFα)抗体的制造
(1)包含抗人TNFα抗体重链基因片段、抗人TNFα抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作
为了制作具有序列号26和29的氨基酸序列的抗人TNFα抗体，将实施例6(1)中制作的包含抗人CD98抗体重链基因片段、轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(CD98-CHX串联载体)的VH和VL基因片段分别取代成来源于抗人TNFα抗体的VH和VL，构建抗人TNFα抗体重链基因片段、抗人TNFα抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因表达转座子载体(以下，简记为TNFα-CHX串联载体)。
关于抗人TNFα抗体重链基因和轻链基因的序列，制作在ヒュミラ(R)皮下注40mg审查报告书(独立行政法人药品医疗器械综合机构，2008年2月14日)图2和图1中记载的阿达木单抗(基因重组)的重链可变区亚单位或轻链可变区亚单位的氨基酸序列(序列号25、28)上连接有信号序列的氨基酸序列(序列号26、29)，以氨基酸序列不发生改变的方式确定碱基序列，使用合成DNA制作抗人TNFα抗体重链基因和轻链基因的序列(序列号24、27)。为了之后的基因操作，在人工序列的端部附加限制性内切酶切割位点。
(2)包含抗人TNFα抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作
将实施例6(2)中制作的包含抗人CD98抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(CD98H-CHX载体)的VH基因片段位点改变成抗人TNFα抗体VH基因片段，构建包含抗人TNFα抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为TNFαH-CHX载体)。抗人TNFα抗体重链基因使用与本项(1)所示的序列相同的序列。
(3)抗人TNFα抗体轻链基因表达转座子载体的制作
将实施例6(1)中制作的抗人CD98抗体轻链基因表达转座子载体(CD98L载体)的轻链基因位点改变成抗人TNFα抗体轻链，构建抗人TNFα抗体轻链基因表达转座子载体(以下，简记为TNFαL载体)。抗人TNFα抗体VL基因使用与本项(1)所示的序列相同的序列。
(4)生产抗人TNFα抗体的CHO细胞的制作
为了制作生产抗人TNFα抗体的CHO-K1细胞，将上述(1)中制作的TNFα-CHX串联载体(20μg)与实施例2中制作的Tol2转座酶表达载体(Tol2载体)(10μg)导入实施例3(1)中制作的在悬浮培养中驯化而得到的CHO-K1细胞中(对照区)。
同样地，将上述(2)和(3)中制作的TNFαH-CHX载体(10μg)、TNFαL载体(10μg)、Tol2载体(10μg)分别以环状DNA的状态进行共导入(实验区)。用5块96孔板进行基因导入细胞的培养，除此以外，与实施例6同样地进行基因导入、细胞培养等，对高表达抗体的细胞的出现数进行比较。关于抗体高表达细胞，将培养上清中的抗体浓度为3.0μg/mL以上的克隆作为抗体表达的细胞进行测量。将该结果示于表7。
表7
如表7所示，与实施例6中进行的抗人CD98抗体的生产细胞同样地共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的CHO-K1细胞与导入有TNFα-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，高表达抗人TNFα抗体的细胞的出现率高约4倍。
该结果表明，不论是何种抗体，通过将分别重组在不同的表达载体中的插入在一对转座子序列之间的抗体重链基因和抗体轻链基因共导入到悬浮性CHO细胞中，都能够容易地获得以及制造抗体高生产株。
(5)生产抗人TNFα抗体的CHO细胞的培养
从上述(4)中得到的导入有TNFα-CHX串联载体的细胞以及共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的细胞中选择出利用放线菌酮抗性进行筛选且表达抗人TNFα抗体的细胞，依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板上进行放大培养。对于成功进行放大培养后的导入有TNFα-CHX串联载体的4株细胞以及共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的52株细胞，除了使培养期间为7天以外，与实施例6(4)同样地对细胞进行培养，测量抗体表达量。将结果示于图11。
结果，共导入有TNFαH-CHX载体和TNFαL载体的CHO-K1细胞与导入有TNFα-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，显示出高约2.4倍的抗体生产量。
结果，与实施例6(4)同样地，通过将抗体重链基因和抗体轻链基因分别重组在不同的一对转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，不仅能够容易地获得以及制造抗体高生产株，而且所得到的细胞具有高抗体生产率。
[实施例8]抗人CD20抗体的制造
(1)包含抗人CD20抗体重链基因片段、抗人CD20抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作
为了制作包含由序列号32和35的氨基酸序列表示的VH和VL的抗人CD20抗体，将实施例6(1)中制作的CD98-CHX串联载体的抗体VH或VL基因位点分别取代成来源于抗人CD20抗体的VH或VL，构建包含抗人CD20抗体重链基因片段、抗人CD20抗体轻链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为CD20-CHX串联载体)。
关于抗人CD20抗体VH区和VL区的基因序列，制作GenBank登录号AR000013中记载的碱基序列以及リツキサン(R)注10mg/mL审查报告书(卫研发第3395号，2003年8月28日)附件中记载的利妥昔单抗的VH和VL的氨基酸序列(序列号32、35)上连接有信号序列的氨基酸序列(序列号31、34)，以氨基酸序列不发生改变的方式确定碱基序列，使用合成DNA制作抗人CD20抗体VH区和VL区的基因序列(序列号30、33)。为了之后的基因操作，在人工序列的端部附加限制性内切酶切割位点。
(2)包含抗人CD20抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体的制作
将实施例6(2)中制作的CD98H-CHX载体抗体VH基因位点改变为来源于抗人CD20抗体的VH，构建包含抗人CD20抗体重链基因片段和抗放线菌酮基因的表达转座子载体(以下，简记为CD20H-CHX载体)。抗人CD20抗体重链基因使用与上述(1)所示的序列相同的序列。
(3)抗人CD20抗体轻链基因表达转座子载体的制作
将实施例6(1)中制作的CD98L载体抗体VL基因位点改变为来源于抗人CD20抗体的VL，构建抗人CD20抗体轻链基因表达转座子载体(以下，称为CD20L载体)。抗人CD20抗体重轻基因使用与上述(1)所示的序列相同的序列。
(4)生产抗人CD20抗体的CHO细胞的制作
为了制作生产抗人CD20抗体的CHO-K1细胞，将上述(1)中制作的CD20-CHX串联载体和实施例2中制作的Tol2转座酶表达载体(Tol2载体)导入实施例3(1)中制作的在悬浮培养中驯化而得到的CHO-K1细胞中(对照区)。
同样地，将上述(2)和(3)中制作的CD20H-CHX载体(10μg)、CD20L载体(10μg)与Tol2载体(10μg)一起共导入到CHO-K1细胞中(实验区)。用5块96孔板进行基因导入细胞的培养，除此以外，与实施例6同样地进行基因导入、细胞培养等，对高表达抗体的细胞的出现数进行比较。另外，将抗体浓度为3.0μg/mL以上的孔作为表达抗体的孔进行测量。将其结果示于表8。
表8
结果，共导入有CD20H-CHX载体和CD20L载体的CHO-K1细胞与导入有CD20-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，高表达抗人CD20抗体的细胞的出现率高约3倍。
结果表明，得到与实施例6(3)或实施例7(3)中实施的抗人CD98抗体、抗人TNFα抗体同样的结果，不论是何种抗体，通过将抗体重链基因和抗体轻链基因分别重组在不同的转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，都能够容易地获得以及制造抗体高生产株。
(5)生产抗人CD20抗体的CHO细胞的培养
从上述(3)中得到的导入有CD20-CHX串联载体的细胞以及共导入有CD20H-CHX载体和CD20L载体的细胞中选择出利用放线菌酮抗性进行筛选且表达抗人CD20抗体的细胞，依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板上进行放大培养。对于成功进行放大培养后的4株对照区细胞以及50株实验区细胞，除了使培养期间为7天以外，与实施例6(4)同样地对细胞进行培养，测量抗体表达量。将结果示于图12。
如图12所示可知，共导入有CD20H-CHX载体和CD20L载体的CHO-K1细胞与导入有CD20-CHX串联载体的CHO-K1细胞相比，具有高约1.6倍的抗体生产率。
结果，得到与实施例6(4)、实施例7(5)中实施的抗人CD98抗体、抗人TNFα抗体的生产率同样的结果，通过将抗体重链基因和抗体轻链基因分别重组在不同的转座子序列之间的表达载体共导入到悬浮性CHO细胞中，不仅能够容易地获得以及制造抗体高生产株，而且所得到的细胞具有高抗体生产率。
[实施例9]表达抗新霉素基因和抗人CD98表达抗体的转座子载体的制作
(1)野生型抗新霉素基因和抗人CD98表达抗体的转座子载体的制作
蛋白质表达用质粒载体使用包含含有插入在一对来源于Tol2的碱基序列之间的任意的人抗体基因和抗药性标记基因的哺乳动物细胞用基因表达盒的质粒。
所使用的基因的DNA通过基于已知的碱基序列进行人工化学合成或者制作其两端序列的引物并以适当的DNA源为模板进行PCR来获得。为了之后的基因操作，在引物的端部附加限制性内切酶切割位点。
转座子序列使用由日本特开2003-235575号公报公开的非自主性Tol2转座子的碱基序列(序列号1)中第1位至第200位的碱基序列(Tol2-L序列)(序列号2)和第2285位至第2788位的碱基序列(Tol2-R序列)(序列号3)的碱基序列。
分别合成包含Tol2-R序列或Tol2-L序列的DNA片段来使用。
作为抗体重链基因表达盒，制备基于抗人CD98抗体N5KG1-ValC2IgG1NS/I117L载体(日本专利第4324637号公报)扩增得到的、含有在CMV启动子调控下编码抗体H链的碱基序列(序列号18)的DNA片段，作为抗体轻链基因表达盒，制备基于抗人CD98抗体N5KG1-ValC2IgG1NS/I117L载体扩增得到的、含有在SV40启动子调控下编码抗体轻链的碱基序列(序列号21)的DNA片段。
作为抗新霉素基因表达盒，制备具有由在SV40启动子调控下编码抗新霉素基因的碱基序列构成的DNA(由序列号36和Genbank登录号U47120.2表示的碱基序列构成的编码新霉素磷酸转移酶的DNA)的DNA片段。
将上述的抗体重链基因表达盒、抗体轻链基因表达盒和抗新霉素基因表达盒连接，再在其两端连接含有Tol2-R序列的DNA片段和含有Tol2-L序列的DNA片段，制作抗人CD98抗体表达载体A(图13)。
(2)具有改变型抗新霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号37表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因1，制作抗人CD98抗体表达转座子载体B。
改变型抗新霉素基因1与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的22%的167个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的25个亮氨酸残基所对应的密码子变为TAA的方式进行了改变。
(3)具有改变型抗新霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号38表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因2，制作抗人CD98抗体表达转座子载体C。
改变型抗新霉素基因2与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的23%的180个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的28个亮氨酸残基所对应的密码子变为TAA的方式进行了改变。
(4)具有改变型抗新霉素基因3的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号39表示的碱基序列构成的改变型抗新霉素基因3，制作抗人CD98抗体表达转座子载体D。
改变型抗新霉素基因3与野生型抗新霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的26%的203个碱基进行了改变。具体而言，以使全部32个亮氨酸残基中的30个亮氨酸残基所对应的密码子变为TAA的方式进行了改变。
[实施例10]利用表达改变型抗新霉素基因的抗体生产CHO细胞的抗体生产
将实施例9(1)～(4)中制作的抗人CD98抗体表达转座子载体A～D与表达由序列号40表示的氨基酸序列构成的Tol2转座酶的载体pCAGGS-T2TP[Kawakami K&Noda T.Genetics.166,895-899(2004)]一起分别导入悬浮化CHO-K1细胞中，制作抗体生产细胞A～D。
载体向悬浮CHO细胞中的导入通过如下方法进行：将CHO细胞(4×106个)悬浊于400μL的PBS缓冲液中，通过电穿孔法将保持环状DNA状态的抗人CD98抗体表达转座子载体(10μg)和Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP(20μg)进行共导入。
在此，为了暂时性地表达Tol2转座酶，将Tol2转座酶表达载体也以环状DNA的状态导入。
另外，作为不使用Tol2转座酶的对照，利用限制性内切酶PciI(宝生物公司)使实施例19(4)的抗人CD98抗体表达转座子载体D(10μg)形成直链状后，通过电穿孔法导入悬浮化CHO-K1细胞中。
电穿孔使用电穿孔仪[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造)]，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。
通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞接种到1块96孔板中，使用添加有5%大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)在CO2孵育箱内培养3天。
接着，从基因导入4天后的培养基更换开始，添加G418(Geneticin(R)，Invitrogen公司)使终浓度为500μg/mL，在G418存在下进行培养，每周进行培养基更换，并培养3周。
培养后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法使用LANCE(R)分析试剂(パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。将其结果示于表9。
表9
Figure BDA00003356910500631
如表9所示，表达改变型抗新霉素基因的细胞B～D中，与表达野生型抗新霉素基因的细胞A相比，抗人CD98抗体的表达量更高。
特别是，对于表达改变型抗新霉素基因3的抗人CD98抗体生产细胞D而言，得到了显示出表达野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体生产细胞A的10倍的表达的细胞株。
另外，对于即使使用改变型抗新霉素基因3但未共导入Tol2转座酶表达载体的对照细胞而言，尽管已使载体形成线状，但仍未能得到抗人CD98抗体表达细胞。
[实施例11]表达抗嘌呤霉素基因和抗人CD98抗体的转座子载体的制作
(1)具有改变型抗嘌呤霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将实施例9(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号41表示的碱基序列构成的改变型抗嘌呤霉素基因1，制作抗人CD98抗体表达转座子载体E。
改变型抗嘌呤霉素基因1与由序列号42表示的碱基序列构成的野生型抗嘌呤霉素基因(嘌呤霉素-N-乙酰转移酶基因，由Genbank登录号U07648.1中公开的碱基序列构成)编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的3%的17个碱基进行了改变。具体而言，通过改变使抗嘌呤霉素基因中含有的全部28个丙氨酸残基中的17个丙氨酸残基所对应的密码子成为GCG，与野生型中已为GCG的密码子合并，使全部丙氨酸残基所对应的密码子均为GCG。
(2)具有改变型抗嘌呤霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体的制作
将实施例9(1)中得到的具有野生型抗新霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体A的抗新霉素基因取代成由序列号43表示的碱基序列构成的改变型抗嘌呤霉素基因2，制作抗人CD98抗体表达转座子载体F。改变型抗嘌呤霉素基因2与野生型抗嘌呤霉素基因编码相同的氨基酸序列且对相当于整体的14%的79个碱基进行了改变。具体而言，在改变型抗嘌呤霉素基因1的丙氨酸残基所对应的密码子改变的基础上，使亮氨酸残基所对应的密码子为TAA、使缬氨酸残基所对应的密码子为GTA、使丝氨酸的密码子为TCG。
[实施例12]利用表达改变型抗嘌呤霉素基因的抗体生产CHO细胞生产抗体之1
将实施例11(1)的具有改变型抗嘌呤霉素基因1的抗人CD98抗体表达转座子载体E、实施例11(2)的具有改变型抗嘌呤霉素基因2的抗人CD98抗体表达转座子载体F、Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP导入悬浮化的CHO-K1细胞中，制作抗体生产细胞E和F。
载体向悬浮性CHO细胞中的导入通过如下方法进行：将悬浮化CHO细胞(4×106个)悬浊于400μL的PBS缓冲液中，通过电穿孔法将保持环状DNA状态的具有改变型抗嘌呤霉素基因的抗人CD98抗体表达转座子载体(10μg)和pCAGGS-T2TP(20μg)进行共导入。
在此，为了暂时性地表达Tol2转座酶，将Tol2转座酶表达载体pCAGGS-T2TP也以环状DNA的状态导入。
电穿孔使用电穿孔仪[Gene Pulser XceII system(Bio-Rad公司制造)]，在电压300V、静电容量500μF、室温的条件下使用间隙宽度为4mm的小池(Bio-Rad公司制造)进行。
通过电穿孔导入基因后，将各小池的细胞接种到1块96孔板中，使用添加有5%大豆水解物的CD OptiCHO培养基(Invitrogen公司)在CO2孵育箱内培养3天。
接着，从基因导入2天后的培养基更换开始，添加嘌呤霉素(P9620，Sigma-Aldrich公司)使终浓度为5μg/mL，每周用含有嘌呤霉素的培养基进行培养基更换，并培养4周。
培养后，通过利用FRET(荧光共振能量转移)的夹心法使用LANCE(R)分析试剂(パーキンエルマー公司)对抗体的表达进行定量。将其结果示于表2。
表10
Figure BDA00003356910500651
由表10所示，表达改变型抗
嘌呤霉素基因2的抗体生产细胞F显示出表达改变型抗嘌呤霉素基因1的抗体生产细胞E的2倍以上的抗体生产量。
[实施例13]利用表达改变型抗嘌呤霉素基因的抗体生产CHO细胞的生产抗体之2
将实施例12中得到的表达改变型抗嘌呤霉素基因2的抗体生产细胞F在三角烧瓶中进行培养，生产抗人CD98抗体。
具体而言，将抗体生产细胞F依次在96孔板、24孔板、之后在6孔板中进行放大培养。选出细胞数充分增加后的抗体生产细胞F2株(细胞株1和细胞株2)，分别以2×105个/ml悬浊于35ml添加有5%大豆水解物的CDOptiCHO培养基(Invitrogen公司)中，使用容量为125ml的三角烧瓶(带通气孔盖，康宁公司)，在37℃、5%CO2的气氛中旋转培养1周，生产抗人CD98抗体。
使用HPLC(Waters公司)对培养后的培养基中的抗体量进行定量。将其结果示于表11。
表11
细胞株1 细胞株2
抗体表达量(mg/L) 15.6 14.8
以上的结果显示，悬浮性CHO细胞中，插入在一对转座子序列之间的抗体基因和改变型抗药性基因被高效地导入宿主的染色体内，而且对高表达细胞的筛选有效。另外可知，所得到的细胞能够进行放大培养，在悬浮培养条件下能够进行目标蛋白质的生产。
参考特定的方式对本发明进行了详细说明，但对本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的意图和范围的情况下可以进行各种变更和变形。
本申请基于2010年12月15日提出的日本专利申请2010-279849，其内容作为参考并入本说明书中。
产业上的可利用性
根据本发明的蛋白质的生产方法，能够使用悬浮性哺乳动物细胞高效地生产目标蛋白质。本发明的细胞能够作为用于生产基因重组蛋白质的蛋白质生产细胞使用。
序列表自由文本
序列号1-人工序列的说明；非自主性Tol2转座子的碱基序列
序列号2-人工序列的说明；Tol2-L序列
序列号3-人工序列的说明；Tol2-R序列
序列号7-人工序列的说明；抗放线菌酮基因的碱基序列
序列号8-人工序列的说明；抗放线菌酮基因所编码的蛋白质的氨基酸序列
序列号9-人工序列的说明；编码M2Z3抗体H链的碱基序列
序列号10-人工序列的说明；M2Z3抗体H链的氨基酸序列
序列号11-人工序列的说明；编码M2Z3抗体L链的碱基序列
序列号12-人工序列的说明；M2Z3抗体L链的氨基酸序列
序列号13-人工序列的说明；非自主性Tol1的碱基序列
序列号14-人工序列的说明；Tol1-L序列
序列号15-人工序列的说明；Tol1-R序列
序列号18-人工序列的说明；编码CD98抗体重链可变区的碱基序列
序列号19-人工序列的说明；CD98抗体重链可变区的氨基酸序列
序列号20-人工序列的说明；CD98抗体重链可变区的氨基酸序列
序列号21-人工序列的说明；编码CD98抗体轻链可变区的碱基序列
序列号22-人工序列的说明；CD98抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号23-人工序列的说明；CD98抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号24-人工序列的说明；编码抗人TNFα抗体重链可变区的碱基序列
序列号25-人工序列的说明；抗人TNFα抗体重链可变区的氨基酸序列
序列号26-人工序列的说明；抗人TNFα抗体重链可变区的氨基酸序列
序列号27-人工序列的说明；编码抗人TNFα抗体轻链可变区的碱基序列
序列号28-人工序列的说明；抗人TNFα抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号29-人工序列的说明；抗人TNFα抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号30-人工序列的说明；编码抗人CD20抗体重链可变区的碱基序列
序列号31-人工序列的说明；抗人CD20抗体重链可变区的氨基酸序列
序列号32-人工序列的说明；抗人CD20抗体重链可变区的氨基酸序列
序列号33-人工序列的说明；编码抗人CD20抗体轻链可变区的碱基序列
序列号34-人工序列的说明；抗人CD20抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号35-人工序列的说明；抗人CD20抗体轻链可变区的氨基酸序列
序列号36-人工序列的说明；野生型抗新霉素基因的碱基序列
序列号37-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列
序列号38-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列
序列号39-人工序列的说明；改变型抗新霉素基因的碱基序列
序列号41-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号42-人工序列的说明；野生型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号43-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号44-人工序列的说明；改变型抗嘌呤霉素基因的碱基序列
序列号45-人工序列的说明；改变型抗博莱霉素基因的碱基序列
序列号46-人工序列的说明；改变型抗博莱霉素基因的碱基序列
序列号47-人工序列的说明；改变型抗潮霉素基因的碱基序列
序列号48-人工序列的说明；改变型抗潮霉素基因的碱基序列
Figure IDA00003356911100011
Figure IDA00003356911100021
Figure IDA00003356911100031
Figure IDA00003356911100041
Figure IDA00003356911100051
Figure IDA00003356911100061
Figure IDA00003356911100071
Figure IDA00003356911100081
Figure IDA00003356911100091
Figure IDA00003356911100111
Figure IDA00003356911100121
Figure IDA00003356911100131
Figure IDA00003356911100141
Figure IDA00003356911100161
Figure IDA00003356911100171
Figure IDA00003356911100181
Figure IDA00003356911100201
Figure IDA00003356911100211
Figure IDA00003356911100221
Figure IDA00003356911100241
Figure IDA00003356911100251
Figure IDA00003356911100261
Figure IDA00003356911100271
Figure IDA00003356911100281
Figure IDA00003356911100291
Figure IDA00003356911100301
Figure IDA00003356911100311
Figure IDA00003356911100321
Figure IDA00003356911100341
Figure IDA00003356911100351
Figure IDA00003356911100361
Figure IDA00003356911100381
Figure IDA00003356911100391
Figure IDA00003356911100401
Figure IDA00003356911100411
Figure IDA00003356911100421
Figure IDA00003356911100431
Figure IDA00003356911100441
Figure IDA00003356911100451
Figure IDA00003356911100461
Figure IDA00003356911100481
Figure IDA00003356911100511
Figure IDA00003356911100531
Figure IDA00003356911100541
Figure IDA00003356911100561
Figure IDA00003356911100571
Figure IDA00003356911100581
Figure IDA00003356911100591
Figure IDA00003356911100601
Figure IDA00003356911100611
Figure IDA00003356911100621
Figure IDA00003356911100631
Figure IDA00003356911100641
Figure IDA00003356911100651
Figure IDA00003356911100661
Figure IDA00003356911100671
Figure IDA00003356911100681
Figure IDA00003356911100691
Figure IDA00003356911100701
Figure IDA00003356911100741
Figure IDA00003356911100751
Figure IDA00003356911100761
Figure IDA00003356911100771
Figure IDA00003356911100781
Figure IDA00003356911100801
Figure IDA00003356911100811
Figure IDA00003356911100821
Figure IDA00003356911100831

Claims (36)

1.一种生产目标蛋白质的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞，并且对该哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该目标蛋白质。
2.一种生产目标蛋白质的方法，其特征在于，包括以下的步骤(A)～(C)：
(A)将以下的表达载体(a)和(b)同时导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体，
(b)含有编码识别转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶的DNA的载体；
(B)利用步骤(A)中导入到悬浮性哺乳动物细胞中的表达载体(b)使转座酶暂时性表达，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中而得到表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞；以及
(C)对步骤(B)中得到的表达目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产目标蛋白质。
3.一种得到生产目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞的方法，其中，将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，将插入在一对转座子序列之间的含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中，得到生产该目标蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体的至少一种为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，除了将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中之外，还将在包含选择标记基因的基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入哺乳动物细胞中。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，编码目标蛋白质的DNA为编码抗体的DNA。
7.如权利要求6所述的方法，其中，编码抗体的DNA为编码抗体的H链的DNA和编码抗体的L链的DNA中的至少一种。
8.如权利要求4～7中任一项所述的方法，其中，将选自下述(a)～(d)的表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞中，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为能够在无血清培养条件下存活和增殖的细胞。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，悬浮性哺乳动物细胞为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任意一种细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。
12.如权利要求4～11中任一项所述的方法，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。
13.如权利要求12所述的方法，其中，抗放线菌酮基因为核糖体蛋白质。
14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥作用的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中，一对来源于DNA型转座子的碱基序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
17.如权利要求15所述的方法，其中，一对来源于Tol1转座子的碱基序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。
18.一种悬浮性哺乳动物细胞，其通过将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)和含有编码识别该转座子序列且具有使插入在一对转座子序列之间的基因片段转移到染色体上的活性的转座酶(转移酶)的DNA的表达载体(b)同时导入而将插入在该一对转座子序列之间的该基因片段重组到染色体中并且生产该目标蛋白质。
19.如权利要求18所述的哺乳动物细胞，其中，包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的至少一种表达载体(a)为包含含有编码目标蛋白质的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
20.如权利要求18或19所述的哺乳动物细胞，其为将表达载体(a)和(b)、以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体(c)导入哺乳动物细胞而得到的细胞。
21.如权利要求18～20中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，编码目标蛋白质的DNA为编码抗体的DNA。
22.如权利要求21所述的哺乳动物细胞，其中，编码抗体的DNA为编码抗体的H链的DNA和编码抗体的L链的DNA中的至少一种。
23.如权利要求18～22中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，导入有选自下述(a)～(d)的表达载体，
(a)包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体、包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(b)包含含有编码抗体的H链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的L链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(c)包含含有编码抗体的L链的DNA和选择标记基因的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体以及包含含有编码抗体的H链的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体；
(d)包含含有编码抗体的H链、L链和选择标记基因的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。
24.如权利要求18～23中任一项所述的哺乳动物细胞，其为能够在无血清培养条件下存活和增殖的悬浮性哺乳动物细胞。
25.如权利要求18～24中任一项所述的哺乳动物细胞，其为选自将CHO细胞在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性CHO细胞、PER.C6细胞、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)和在悬浮培养中驯化而得到的悬浮性小鼠骨髓瘤细胞NS0中的任意一种悬浮性哺乳动物细胞。
26.如权利要求25所述的哺乳动物细胞，其中，CHO细胞为选自CHO-K1、CHO-K1SV、DUKXB11、CHO/DG44、Pro-3和CHO-S中的任意一种细胞。
27.如权利要求19～26中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，选择标记基因为抗放线菌酮基因。
28.如权利要求27所述的哺乳动物细胞，其中，抗放线菌酮基因为编码人核糖体蛋白质的突变体的基因。
29.如权利要求19～28中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，一对转座子序列为在哺乳动物细胞中发挥作用的一对来源于DNA型转座子的碱基序列。
30.如权利要求29所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于DNA型转座子的碱基序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。
31.如权利要求30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
32.如权利要求30所述的哺乳动物细胞，其中，一对来源于Tol1转座子的碱基序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。
33.一种表达载体，其包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列。
34.如权利要求33所述的表达载体，其中，一对转座子序列为一对来源于Tol1转座子的碱基序列或者来源于Tol2转座子的碱基序列。
35.如权利要求34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol2转座子的碱基序列为由序列号2表示的碱基序列和由序列号3表示的碱基序列。
36.如权利要求34所述的表达载体，其中，一对来源于Tol1转座子的序列为由序列号14表示的碱基序列和由序列号15表示的碱基序列。
CN2011800608327A 2010-12-15 2011-12-14 蛋白质的生产方法 Pending CN103261414A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710220003.XA CN107312796A (zh) 2010-12-15 2011-12-14 蛋白质的生产方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-279849 2010-12-15
JP2010279849 2010-12-15
PCT/JP2011/078935 WO2012081628A1 (ja) 2010-12-15 2011-12-14 タンパク質の生産方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710220003.XA Division CN107312796A (zh) 2010-12-15 2011-12-14 蛋白质的生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103261414A true CN103261414A (zh) 2013-08-21

Family

ID=46244724

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710220003.XA Pending CN107312796A (zh) 2010-12-15 2011-12-14 蛋白质的生产方法
CN2011800608327A Pending CN103261414A (zh) 2010-12-15 2011-12-14 蛋白质的生产方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710220003.XA Pending CN107312796A (zh) 2010-12-15 2011-12-14 蛋白质的生产方法

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9102971B2 (zh)
EP (1) EP2653540B9 (zh)
JP (1) JP6087148B2 (zh)
KR (1) KR102058658B1 (zh)
CN (2) CN107312796A (zh)
AU (1) AU2011342161C1 (zh)
CA (1) CA2820151C (zh)
DK (1) DK2653540T3 (zh)
ES (1) ES2661981T3 (zh)
PT (1) PT2653540T (zh)
RU (1) RU2598255C2 (zh)
SG (2) SG10201602874VA (zh)
TR (1) TR201802431T4 (zh)
TW (1) TWI617664B (zh)
WO (1) WO2012081628A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011342162B2 (en) 2010-12-15 2017-04-20 Kyowa Kirin Co., Ltd. Method for producing proteins
EP2794878B1 (en) 2011-12-22 2020-03-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Expression vector organization, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
PT2692865E (pt) * 2012-07-30 2015-02-06 Nbe Therapeutics Llc Identificação mediada por transposição de proteínas funcionais ou de ligação específicas
JP6871679B2 (ja) * 2016-03-23 2021-05-12 国立大学法人 岡山大学 遺伝子発現用カセット及びその産生物
US10960721B2 (en) * 2018-06-26 2021-03-30 Ford Global Technologies, Llc System for detection and response to retreating trailer
JPWO2021049606A1 (zh) 2019-09-13 2021-03-18
KR102586165B1 (ko) * 2019-10-02 2023-10-10 아주대학교산학협력단 생체 조직 접착성 및 결합력이 증가된 조직 유합제 조성물 및 이의 제조방법
CN112480236B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽lecvepncrskr及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002262879A (ja) * 2001-03-09 2002-09-17 Kirin Brewery Co Ltd 新規動物細胞用ベクターおよびその使用
WO2008072540A1 (ja) * 2006-12-13 2008-06-19 National University Corporation Nagoya University Ｔｏｌ１因子のトランスポザーゼ及びそれを用いたＤＮＡ導入システム
US20100311116A1 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 Excellgene Sa Fast generation of high expression stable cell lines expressing recombinant proteins under minimal and short-term selective pressure

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5667786A (en) 1995-06-07 1997-09-16 Novavax, Inc. Method for treating tumors with a toxin
JPH10299A (ja) 1996-06-18 1998-01-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 誘導加熱式アイロン装置
CA2287911C (en) 1997-05-15 2014-05-06 Genentech, Inc. Apo-2 receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
DK2270150T4 (da) 1999-04-09 2019-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Fremgangsmåde til at kontrollere aktiviteten af immunologisk funktionelt molekyle.
AU4806100A (en) * 1999-04-28 2000-11-10 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University P element derived vector and methods for its use
GB9924721D0 (en) 1999-10-19 1999-12-22 Craig Roger Protein production system
BR0014926A (pt) * 1999-10-19 2002-06-18 Minos Biosystems Ltd Sistema de produção de proteìna
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
PL218428B1 (pl) 2000-10-06 2014-12-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
JP4364474B2 (ja) * 2002-02-15 2009-11-18 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 哺乳動物において機能的なトランスポゾン
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
GB0212666D0 (en) * 2002-05-31 2002-07-10 Secr Defence Immunogenic sequences
ES2358994T3 (es) * 2002-07-24 2011-05-17 Manoa Biosciences Inc. Vectores basados en transposones y métodos para la integración de ácidos nucleicos.
EP1688439A4 (en) 2003-10-08 2007-12-19 Kyowa Hakko Kogyo Kk HYBRID PROTEIN COMPOSITION
ATE506077T1 (de) 2003-10-16 2011-05-15 Imclone Llc Fibroblasten-wachstumsfaktor-1-hemmer und behandlungsverfahren dafür
US20060141627A1 (en) * 2004-11-18 2006-06-29 Stratatech Corporation Vectors for stable gene expression
AU2005313026B2 (en) 2004-12-06 2011-09-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to influenza M2 protein and methods of making and using same
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
WO2007082164A2 (en) 2006-01-05 2007-07-19 The Johns Hopkins University Methods for identifying functional noncoding sequences
TWI390034B (zh) 2006-04-06 2013-03-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Novel anti-CD98 antibody
JP5522405B2 (ja) 2008-04-25 2014-06-18 協和発酵キリン株式会社 安定な多価抗体
CN102099468B (zh) 2008-07-17 2014-01-15 协和发酵麒麟株式会社 抗-系统asc氨基酸转运蛋白2(asct2)抗体
US9150880B2 (en) * 2008-09-25 2015-10-06 Proteovec Holding, L.L.C. Vectors for production of antibodies
AU2010259533B2 (en) * 2009-06-11 2015-03-12 Kyowa Kirin Co., Ltd. Process for production of protein

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002262879A (ja) * 2001-03-09 2002-09-17 Kirin Brewery Co Ltd 新規動物細胞用ベクターおよびその使用
WO2008072540A1 (ja) * 2006-12-13 2008-06-19 National University Corporation Nagoya University Ｔｏｌ１因子のトランスポザーゼ及びそれを用いたＤＮＡ導入システム
US20100311116A1 (en) * 2009-06-04 2010-12-09 Excellgene Sa Fast generation of high expression stable cell lines expressing recombinant proteins under minimal and short-term selective pressure

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIHIKO等: "Germline transgenesis of zebrafish using the medaka tol1 transposon system", 《DEVELOPMENTAL DYNAMICS》, vol. 237, no. 9, 30 September 2008 (2008-09-30), pages 2466 - 2474 *
AKIHIKO等: "The tol1 element of medaka fish is transposed with only terminal regions and can deliver large DNA fragments into the chromosomes", 《J HUM GENET》, vol. 52, no. 12, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 1026 - 1030 *
AKIHIKO等: "The tol1 transposoable element of the medaka fish moves in human and mouse cells", 《J HUM GENET》, vol. 52, 7 June 2007 (2007-06-07), pages 628 - 635 *
KRISTEN等: "The Tol2 kit:a multisite gateway-based construction kit for Tol2 Transposon Transgenesis constructs", 《DEVELOPMENTAL DYNAMICS》, vol. 236, no. 11, 30 November 2007 (2007-11-30), pages 3088 - 3099 *
XUE YU-LIN等: "Generation and Characterization of Blood Vessel Specific EGFP Transgenic Zebrafish via Tol2 Transposon Mediated Enhancer Trap Screen", 《生物化学与生物物理进展》, vol. 37, no. 7, 31 July 2010 (2010-07-31), pages 720 - 727 *
孟立等: "转座子Tol2的特性及其在转基因动物中的应用", 《江西农业学报》, vol. 21, no. 11, 30 November 2009 (2009-11-30), pages 123 - 126 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107312796A (zh) 2017-11-03
RU2013132448A (ru) 2015-01-20
JPWO2012081628A1 (ja) 2014-05-22
ES2661981T3 (es) 2018-04-04
SG10201602874VA (en) 2016-05-30
EP2653540A4 (en) 2014-05-21
KR102058658B1 (ko) 2019-12-24
EP2653540A1 (en) 2013-10-23
CA2820151C (en) 2019-03-26
PT2653540T (pt) 2018-02-27
RU2598255C2 (ru) 2016-09-20
EP2653540B9 (en) 2018-05-16
TR201802431T4 (tr) 2018-03-21
AU2011342161A1 (en) 2013-05-02
EP2653540B1 (en) 2018-01-24
SG191124A1 (en) 2013-07-31
US9102971B2 (en) 2015-08-11
AU2011342161C1 (en) 2016-03-17
AU2011342161B2 (en) 2015-09-10
WO2012081628A1 (ja) 2012-06-21
TW201231650A (en) 2012-08-01
BR112013014949A2 (pt) 2017-05-30
US20120196327A1 (en) 2012-08-02
JP6087148B2 (ja) 2017-03-01
KR20140012035A (ko) 2014-01-29
DK2653540T3 (en) 2018-02-05
CA2820151A1 (en) 2012-06-21
TWI617664B (zh) 2018-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103261414A (zh) 蛋白质的生产方法
JP6152402B2 (ja) タンパク質の生産方法
JP2022177131A (ja) 真核細胞においてポリペプチドを発現させるための発現構築物及び方法
CN103339255A (zh) 蛋白质的生产方法
BR112013014949B1 (pt) Métodos para a produção de uma proteína de interesse e para a obtenção de uma suspensão de células cho capaz de sobreviver e proliferar em um meio sem soro que produz uma proteína de interesse

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20130821