ES2656079T3 - Procedimiento para producir proteínas - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende: (i) introducir un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de CHO en suspensión que puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender unos codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se reduce y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2; (ii) integrar el fragmento génico que comprende el ADN que codifica la proteína de interés insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO; (iii) obtener una célula de CHO que expresa la proteína de interés; y (iv) cultivar en suspensión la célula de CHO.

Description

Procedimiento para producir proteínas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión; integrar el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero; obtener una célula de mamífero en suspensión que produce la proteína de interés, y cultivar en suspensión la célula de mamífero, y una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés mediante el procedimiento.

Antecedentes de la técnica

La producción de proteínas exógenas mediante técnicas de ADN recombinante se utiliza en diversas industrias, tales como la industria farmacéutica y la industria alimentaria. En la mayoría de casos, la producción de proteínas recombinantes se lleva a cabo mediante la introducción de un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína de interés en un hospedador, tal como Escherichia coli, levadura, célula de insecto, célula vegetal y célula animal, seleccionar un transformante en el que se integra el vector de expresión en el cromosoma y cultivar además la línea de células transformadas bajo condiciones de cultivo apropiadas.

Sin embargo, con el fin de desarrollar un hospedador que puede producir una proteína exógena eficientemente, resulta necesario seleccionar una célula hospedadora con buena productividad de cada proteína de interés, de manera que se desea una innovación técnica adicional de las técnicas de producción de proteínas exógenas para cada hospedador.

En los sistemas bacterianos, tales como Escherichia coli, o en los sistemas de levadura, que son diferentes de las células animales, las modificaciones postraduccionales, tales como la modificación con cadenas sacáridas, resultan difíciles de llevar a cabo en muchos casos y, de esta manera, provocan un problema para la producción de proteína que presente su actividad.

Debido a que la proteína producida se somete a una modificación postraduccional, tal como la fosforilación y la adición de cadenas sacáridas en el sistema de insecto, este sistema presenta el mérito de que puede expresarse una proteína que presenta su actividad fisiológica original. Sin embargo, debido a que la estructura de la cadena sacárida de la proteína secretada es diferente de la de las células derivadas de mamífero, la antigenicidad y similares se convierten en un problema al aplicar la proteína al uso farmacéutico.

Además, debido a que se utiliza un virus recombinante en el sistema de células de insecto al introducir un gen exógeno, existe el problema de que, desde el punto de vista de la seguridad, resulta necesaria la inactivación y contención del virus.

En el sistema de células animales, pueden llevarse a cabo modificaciones postraduccionales, tales como la fosforilación, la adición de cadenas sacáridas y el plegamiento, en las proteínas derivadas de animales superiores, incluyendo el ser humano, de una manera más similar a la que se produce en el cuerpo in vivo. Resultan necesarias estas modificaciones postraduccionales exactas para recrear la actividad fisiológica que presenta una proteína en su forma de proteína recombinante, y habitualmente se aplica un sistema de producción de proteínas en el que se utiliza una célula de mamífero como hospedadora a los productos farmacéuticos y similares que requieren dicha actividad fisiológica.

Sin embargo, un sistema de expresión de proteínas en el que se utilice una célula de mamífero como hospedadora generalmente presenta una productividad baja y también conlleva en muchos casos un problema de estabilidad de los genes introducidos. la mejora de la productividad de una proteína utilizando una célula de mamífero en cultivo como hospedadora no sólo resulta muy importante para producir medicamentos para el tratamiento, agentes diagnósticos y similares, sino que también contribuye en gran medida a la investigación y desarrollo de los mismos. De esta manera, resulta urgente desarrollar un sistema de expresión génica que posibilite de manera sencilla la obtención de una línea celular de elevada productividad utilizando una célula de mamífero en cultivo, en particular una célula de ovario de hámster chino (célula CHO), como hospedadora.

Un transposón es un elemento genético transponible que puede desplazarse de un locus a otro en el cromosoma. Un transposón es una herramienta potente para el estudio de la biología y genética moleculares y se utiliza para un propósito, tal como la mutagénesis, la captura génica y la preparación de individuos transgénicos, en insectos o nemátodos (por ejemplo, Drosophila melanogaster o Caenorhabditis elegans) y

plantas. Sin embargo, el desarrollo de dicha técnica se ha retrasado para los animales vertebrados, incluyendo las células de mamífero.

Sin embargo, en los últimos años, se ha informado de transposones que presentan actividades también en animales vertebrados, y algunos de ellos han demostrado una actividad en células de mamífero, tales como las células derivadas de ratones y seres humanos. Entre los ejemplos típicos se incluyen los transposones Tol1 (referencia de patente nº 1) y Tol2 (referencia no de patente nº 1), que se clonan a partir del pez-arroz japonés ("medaka"); "Sleeping Beauty", reconstruido a partir de un transposón no autónomo existente en el genoma de los peces del género Onchorhynchus (referencia no de patente nº 2), el transposón artificial "Frog prince" (referencia de no de patente nº 3), que se deriva de una rana, y el transposón piggyBac (referencia no de patente nº 4), que se deriva de un insecto.

Estos transposones de ADN han sido utilizados para mutagénesis, captura génica, preparación de individuos transgénicos, expresión de proteínas resistentes a fármacos y similares, como herramienta de introducción de genes para producir un nuevo fenotipo en un genoma de una célula de mamífero (referencias no de patente nº 5 a nº 12).

En el caso de los insectos, se ha estudiado un procedimiento en el que se introduce un gen exógeno en el cromosoma del gusano de la seda utilizando el transposón piggyBac derivado de un insecto lepidóptero para expresar la proteína codificada por dicho gen exógeno y se ha dado a conocer un procedimiento de producción de proteínas utilizando las técnicas anteriormente indicadas (referencia de patente nº 2).

Sin embargo, debido a que la proteína de interés no se expresa a niveles suficientes y se produce en todo el cuerpo del gusano de la seda, provoca un problema económico debido a la necesidad de una técnica de purificación avanzada para recuperar la proteína exógena expresada en una forma altamente purificada a partir del líquido corporal que incluye una gran cantidad de proteínas contaminantes.

Además, se conoce un ejemplo en el que una proteína relacionad con la resistencia a G418 se expresa en una célula de mamífero utilizando el transposón Tol2 derivado de medaka (referencia no de patente nº 12).

Como procedimiento para cribar eficientemente células de nivel elevado de expresión, es conocida la atenuación de un gen marcador seleccionable. Como procedimiento para la atenuación, es conocida la modificación de aminoácidos en un gen de resistencia a la neomicina (referencias no de patente nº 13 y nº 14) y la unión de una secuencia de desestabilización al gen dhfr (referencia no de patente nº 15). Alternativamente, se ha demostrado que pueden obtenerse células de elevado nivel de expresión mediante la utilización de un gen marcador seleccionable atenuado.

Por otra parte, también se demuestra que el número de células resistentes a fármacos se reduce drásticamente mediante la atenuación y que, como resultado, existe la posibilidad de que no se obtenga ninguna célula resistente a fármaco. De esta manera, todavía se desea la creación de un procedimiento para cribar eficientemente las células de alto nivel de expresión.

Es conocido que en los genes codificantes de proteína, existe un sesgo en el uso de los codones según la especie y que la expresión de la eritropoyetina humana en una célula de CHO se mejora mediante la optimización de este sesgo de los codones (referencia no de patente nº 16).

Se ha descrito un procedimiento para la generación rápida de líneas celulares de alta expresión estables para la producción de proteínas recombinantes con una elevada eficacia de la integración estable utilizando simultáneamente una presión selectiva baja durante sólo un periodo de tiempo corto, que utiliza una transposasa de piggyBac expresada transitoriamente para mediar en la integración estable de un transgén flanqueado por extremos del transposón PB (literatura de patentes nº 3).

Se ha descrito un rendimiento mejorado de proteínas recombinante utilizando el marcador seleccionable DHFR de codones desoptimizados en un plásmido de expresión CHEF I (literatura no de patentes nº 17).

[Listado de referencias]

[Literatura de patentes]

[Literatura de patentes nº 1] Documento nº WO 2008/072540

[Literatura de patentes nº 2] solicitud no examinada publicada de patente japonesa nº 2001-532188

[Literatura de patentes nº 3] solicitud publicada de patente US nº US 2010/0311116.

[Literatura no de patentes]

[Literatura no de patentes nº 1] Nature 383:30, 1996.

[Literatura no de patentes nº 2] Cell 91:501-510, 1997.

[Literatura no de patentes nº 3] Nucleic Acids Res. 31:6873-6881, 2003.

[Literatura no de patentes nº 4] Insect Mol. Biol. 5:141-151, 1996.

[Literatura no de patentes nº 5] Genetics 166:895-899, 2004.

[Literatura no de patentes nº 6] PLoS Genet. 2:e169, 2006.

[Literatura no de patentes nº 7] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10769-10773, 1998.

[Literatura no de patentes nº 8] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6759-6764, 2001.

[Literatura no de patentes nº 9] Nature 436:221-226, 2005.

[Literatura no de patentes nº 10] Nucleic Acids Res. 31:6873-6881, 2003.

[Literatura no de patentes nº 11] Nucleic Acids Res. 35:e87, 2007.

[Literatura no de patentes nº 12] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15008-15013, 2006.

[Literatura no de patentes nº 13] Biotech. Bioeng. 89:530-538, 2005.

[Literatura no de patentes nº 14] Journal of Immunological Metdhos 295:49-56, 2004.

[Literatura no de patentes nº 15] Metabolic Engineering 9:304-316, 2007.

[Literatura no de patentes nº 16] Gene 199:293-301, 1997.

[Literatura no de patentes nº 17] Biotech. Prog. 26(6):1558-1566, 2010.

Exposición de la invención

Problemas que debe resolver la invención

Con el fin de producir y analizar una proteína de interés, resulta necesario seleccionar una línea celular que exprese establemente y a nivel elevado una proteína de interés, utilizando una célula de cultivo derivada de un mamífero. Sin embargo, la preparación y el cultivo de la célula que produce la proteína de interés requiere un esfuerzo y tiempo considerables.

Además, aunque es conocido que las proteínas se expresan en la célula de mamífero utilizando una secuencia de transposón, no se conoce la preparación de una célula con un nivel elevado de expresión de una proteína y que, de esta manera, pueda utilizarse como sistema de producción de la proteína mediante la utilización de una secuencia de transposón, ni una célula de producción elevada que comprenda una secuencia de transposón ni un procedimiento de producción de una proteína utilizando la célula. Además, no se conoce ningún ejemplo de obtención de una célula de nivel elevado de expresión mediante la modificación de un codón para suprimir la expresión (traducción) de un gen de resistencia a fármaco.

Tal como se ha indicado anteriormente, se ha necesitado la expresión de una proteína de interés en una gran cantidad mediante el establecimiento de un sistema de producción de proteínas que pueda producir a nivel elevado una proteína de interés utilizando una célula de mamífero en cultivo de manera eficiente y en un corto periodo de tiempo.

De esta manera, los objetivos de la presente invención son proporcionar una célula capaz de expresar a nivel elevado una proteína de interés que pueda establecerse eficientemente y un procedimiento para producir la proteína de interés utilizando la célula.

Medios para resolver los problemas

Con el fin de resolver los problemas anteriormente indicados, los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos y como consecuencia han encontrado que puede producirse eficientemente una célula de producción que exprese a nivel elevado una proteína de interés mediante la introducción de un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y que también comprende un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión, y la integración del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero en suspensión. Además, se ha encontrado que puede reducirse drásticamente el tiempo para preparar una línea celular de alta expresión de la proteína de interés y, de esta manera, se ha llevado a cabo la invención. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento de preparación de una célula de producción que puede preparar eficientemente la célula de producción que expresa a nivel elevado un gen exógeno y un procedimiento de producción de una proteína recombinante.

Específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente:

1. Un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende: introducir un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y además comprende un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de CHO en suspensión que es capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador

seleccionable antes de la modificación y para comprender codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO, de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se ha reducido, y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2; integrar el fragmento génico que comprende el ADN codificante de la proteína de interés

5 insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO; obtener una célula de CHO que expresa la proteína de interés y cultivar en suspensión la célula de mamífero.

2. Un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende las etapas (A) y (B) a continuación:

(A) una etapa de introducción simultánea de los vectores de expresión (a) y (b) siguientes en una célula de CHO en suspensión que es capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; integrar un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO mediante una transposasa de expresión transitoria; y obtener una célula de CHO en

15 suspensión que expresa la proteína de interés:

(a) un vector de expresión que comprende el fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y que comprende además el par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificante la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se reduce y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2,

(b) un vector de expresión que comprende un ADN codificante de la transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en el cromosoma,

(B) una etapa de cultivo en suspensión de la célula de CHO en suspensión que expresa la proteína de interés con el fin de producir la proteína de interés.

3. El procedimiento descrito en el ítem 1 o 2, anteriormente, en el que la célula de CHO en suspensión es

cualquiera de las células seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-2. 35

4.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 3, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable se modifica en 10% o más de la secuencia de nucleótidos codificante del gen marcador seleccionable antes de la modificación.

5.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 4, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable es modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA de entre los codones correspondientes a residuo de leucina incluidos en el gen.

6.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 5, anteriormente, en el que el gen marcador

45 seleccionable es modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de alanina son GCG de entre los codones correspondientes a residuo de alanina incluidos en el gen.

7.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 6, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable es modificado de manera que todos los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen son TTA o todos los codones correspondientes a residuo de alanina incluidos en el gen son GCG.

8.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 7, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable es un gen marcador seleccionable seleccionado de entre el grupo que consiste en gen de resistencia a neomicina, gen de resistencia a puromicina, gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia

55 a zeocina y un gen de resistencia a blasticidina.

9.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 8, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol2 son la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 3.

10.

El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 8, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 son las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID nº 35 y la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 36.

65 11. Una célula de CHO en suspensión que es capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, en la que se introduce un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de

una proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en la que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionado modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que se reduce el nivel de expresión en la célula de CHO y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2, y en el que el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón se integra en un cromosoma de la célula de CHO en suspensión y la célula de mamífero en suspensión produce la proteína de interés.

12. Una célula de CHO en suspensión que es capaz de sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, que presenta un cromosoma en el que se ha integrado un fragmento génico insertado entre un par de transposones y que produce una proteína de interés obtenible mediante la introducción simultánea de los vectores (a) y (b) a continuación:

(a)

un vector de expresión de proteínas que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y que comprende además el par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que se reduce el nivel de expresión en la célula de CHO y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposiciones Tol1 o Tol2,

(b)

un vector de expresión que comprende un ADN codificante de una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón al interior del cromosoma.

13.

La célula de CHO descrita en el ítem 11 o 12, anteriormente, que es cualquiera de las células seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.

14.

La célula de CHO descrita en cualquiera de los ítems 11 a 13, anteriormente, en la que el gen marcador seleccionable se modifica en 10% o más de la secuencia de nucleótidos codificante del gen marcador seleccionable antes de la modificación.

15.

La célula de CHO descrita en cualquiera de los ítems 11 a 14, anteriormente, en la que el gen marcador seleccionable se modifica de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA de entre los codones correspondientes al residuo leucina incluidos en el gen.

16.

La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 11 a 15, anteriormente, en la que el gen marcador seleccionable se modifica de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de alanina son GCG de entre los codones correspondientes al residuo alanina incluidos en el gen.

17.

La célula de mamífero indicada en cualquiera de los ítems 11 a 16, anteriormente, en la que el gen marcador seleccionable se modifica de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA o todos los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen son GCG.

18.

La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 11 a 17, anteriormente, en la que el gen marcador seleccionable es un gen marcador seleccionable seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la zeocina y un gen de resistencia a la blasticidina.

19.

La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 11 a 17, anteriormente, en la que las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol2 son la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 3.

20.

La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 11 a 17, anteriormente, en la que las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol2 son las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID nº 35 y la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 36.

21.

Un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un marcador seleccionable atenuado, y comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos como gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender codones utilizados a baja frecuencia en la célula de CHO de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se reduzca y en la que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2.

22.

El vector de expresión indicado en el ítem 21, anteriormente, en el que el par de secuencias de transposón derivadas de un par de transposones Tol2 son la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID nº 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID nº 3 o el par de secuencias de transposón derivadas de un par de transposones Tol1 son la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID nº 35 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SECID nº 36.

23.

El vector indicado en el ítem 21 o 22, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable se modifica en 10% o más de la secuencia de nucleótidos codificante del gen marcador seleccionable antes de la modificación.

24.

El vector indicado en cualquiera de los ítems 21 a 23, anteriormente, en el que el marcador seleccionable se modifica de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA de entre los codones correspondientes al residuo leucina incluidos en el gen.

25.

El vector indicado en cualquiera de los ítems 21 a 24, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable se modifica de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de alanina son GCG de entre los codones correspondientes al residuo alanina incluidos en el gen.

26.

El vector indicado en cualquiera de los ítems 21 a 25, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable modificado de manera que el nivel de expresión en la célula de mamífero ha sido reducido se modifica de manera que todos los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen son TTA o la totalidad de los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen son GCG.

27.

El vector indicado en cualquiera de los ítems 21 a 26, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable es un gen marcador seleccionable seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a zeocina y un gen de resistencia a blasticidina.

Efecto de la invención

Según el procedimiento de producción de proteínas de la presente invención, puede producirse eficientemente una proteína de interés mediante la utilización de una célula de mamífero. La célula de la presente invención puede utilizarse como célula de producción de proteínas para la producción de una proteína recombinante.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra la estructura del vector de expresión A de anticuerpos. En la figura 1, Tol2-L representa un fragmento de ADN que comprende la secuencia de Tol2-L (SEC ID nº 2) y Tol2-R representa un fragmento de ADN que comprende la secuencia de Tol2-R (SEC ID nº 3), CMV representa un promotor del CMV, poli A representa un sitio de poliadenilación, Hc representa un gen de cadena pesada del anticuerpo de CD98, Lc representa un gen de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano, SO representa un promotor de SV40, SV representa un sitio de poliadenilación de SV40 y Neo-r representa un gen de resistencia a neomicina.

Formas de realización para poner en práctica la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende introducir un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par (dos) secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión; integrar el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero; obtener una célula de mamífero en suspensión que produce la proteína de interés y cultivar en suspensión la célula de mamífero, y una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés mediante el procedimiento.

Entre los ejemplos de la célula productora de una proteína de interés de la presente invención se incluyen una célula de mamífero en suspensión, en la que se ha introducido un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN codificante de una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón se integra en un cromosoma y la célula de mamífero en suspensión produce la proteína de interés.

Además, entre los ejemplos de la célula productora de una proteína de interés de la presente invención se incluye una célula de mamífero en suspensión que presenta un cromosoma en el que se integra un fragmento génico insertado entre un par de transposones y que produce la proteína de interés obtenible mediante la introducción simultánea de los vectores (a) y (b), a continuación:

(a)

un vector de expresión que comprende el fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además el par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b)

un vector de expresión que comprende un ADN codificante de una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón al interior del cromosoma.

Entre los ejemplos del procedimiento para producir una proteína de interés de la presente invención se incluyen un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende las etapas (A) y (B) a continuación:

(A)

una etapa de introducción simultánea de los vectores (a) y (b) proporcionados a continuación, en una célula de mamífero en suspensión y obtención de una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés mediante la integración de un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero mediante una transposasa expresada transitoriamente:

(a)

un vector de expresión que comprende el fragmento génico que comprende un ADN codificante de la proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además el par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b)

un vector de expresión que comprende un ADN codificante de la transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón al interior del cromosoma, y

(B)

una etapa de cultivo en suspensión de la célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés para producir la proteína de interés.

Entre los términos utilizados en la presente memoria se incluyen las definiciones siguientes.

El transposón es un elemento genético transponible y el término transposón se refiere a una unidad génica que se desplaza en un cromosoma o de un cromosoma a otro cromosoma (transposición) manteniendo simultáneamente una determinada estructura.

El transposón presenta secuencias de transposón repetidas (también denominadas secuencia repetida invertida (secuencia RI) o secuencia repetida invertida terminal (secuencia RIT)) que se sitúa en la misma dirección o en la dirección contraria en ambos extremos de una unidad génica y una secuencia de nucleótidos codificante de una transposasa que reconoce la secuencia de transposón para introducir un gen existente entre las secuencias de transposón.

La transposasa traducida a partir del transposón puede introducir un ADN mediante el reconocimiento de las secuencias de transposón de ambos extremos del transposón, extrayendo el fragmento de ADN insertado entre el par de secuencias de transposón e insertando el fragmento en el sitio que debe introducirse.

La expresión secuencia de transposón se refiere a la secuencia de nucleótidos de un transposón reconocido por una transposasa y presenta el mismo significado que la secuencia RI o secuencia RIT. La secuencia puede comprender una fracción repetida imperfecta con la condición de que pueda introducirse (insertarse en otra posición del genoma) por la actividad de una transposasa y exista una secuencia de transposón específica de una transposasa.

La secuencia de transposón que debe ser utilizada en la presente invención puede ser cualquier secuencia con la condición de que sea una secuencia de nucleótidos derivada de los transposones Tol1 y Tol2 que pueda ser reconocida por una transposasa y ser transpuesta en células de mamífero. Entre los ejemplos de la misma se incluyen los transposones Tol1 y Tol2 derivados del pez medaka.

En particular, de entre ellas, resultan preferentes las secuencias de nucleótidos derivadas del transposón Tol2 derivado del pez medaka que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 6. Entre los ejemplos de secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol2 se incluye la secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 2.229 y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 4.148 a 4.682 en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 mostrada en SEC ID nº 6 del Listado de secuencias.

Como secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol2, resultan más preferentes la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (SEC ID nº 2) (en lo sucesivo denominada "secuencia de Tol2-L") y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 2.285 a 2.788 (SEC ID nº 3) (en lo sucesivo denominada "secuencia

de Tol2-R") en la secuencia de nucleótidos de transposón Tol2 mostrada en SEC ID nº 1 del Listado de secuencias.

Como secuencia de transposón de la presente invención, puede utilizarse la secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol1 derivado del pez medaka que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 37 del Listado de secuencias. Entre los ejemplos de secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol1 se incluye una secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 157 y una secuencia de nucleótidos en las posiciones 1.748 a 1.855 en la secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol1 derivado del pez medaka que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 37 del Listado de secuencias.

Como secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol1, resulta más preferente la región en las posiciones 1 a 200 (SEC ID nº 35) (en lo sucesivo denominada "secuencia de Tol1-L") y la región en las posiciones 1.351 a 1.855 (SEC ID nº 36) (en adelante denominada "secuencia de Tol1-R") en la secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol1 que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID nº 37 del Listado de secuencias.

Entre los ejemplos de la secuencia de transposón de la presente invención se incluyen secuencias de transposón las reacciones de transposón de las cuales se controlan mediante la utilización de una secuencia parcial de una secuencia de transposón específica para el transposón anteriormente indicado, mediante el ajuste de la longitud de la secuencia de nucleótidos y mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos por adición, deleción o sustitución. Con respecto al control de la reacción de transposición de un transposón, la reacción de transposición puede acelerarse o suprimirse mediante la elevación o reducción del reconocimiento de la secuencia del transposón por una transposasa, respectivamente.

El término transposasa se refiere a un enzima que reconoce secuencias de nucleótidos que presentan secuencias de transposón y transfieren un fragmento génico existente entre las secuencias de nucleótidos en un cromosoma o del cromosoma a otro cromosoma.

Entre los ejemplos de la transposasa se incluyen enzimas derivados de Tol1 y Tol2 que se derivan del pez medaka.

Como transposasa, puede utilizarse un enzima nativo y puede utilizarse cualquier transposasa en la que una parte de sus aminoácidos ha sido sustituida, delecionada, insertada y/o añadida, con la condición de que se mantenga la misma actividad de transposición que la de la transposasa. Mediante el control de la actividad enzimática de la transposasa, puede controlarse la reacción de transposición del ADN existente entre las secuencias de transposón.

Con el fin de analizar si presenta o no una actividad de transposición similar a la de la transposasa, puede medirse mediante el sistema de análisis de 2 componentes dado a conocer en la solicitud no examinada y publicada de patente japonesa nº 2003-235575. En particular, puede analizarse si un elemento Tol2 no autónomo puede transferirse e insertarse o no en un cromosoma de una célula de mamífero mediante la actividad de una transposasa mediante la utilización separada de un plásmido que comprende un transposón Tol2 de transposasa Tol2 delecionada (transposón no autónomo derivado de Tol2) y un plásmido que comprende transposasa Tol2.

La expresión transposón no autónoma en la presente invención se refiere a un transposón que ha perdido una transposasa existente dentro del transposón y que, por lo tanto, no puede llevarse a cabo su transposición autónomamente. El transposón no autónomo puede transferir el ADN insertado entre las secuencias de transposón del transposón no autónoma al interior del cromosoma de la célula hospedadora, al permitir que una proteína transposasa, un ARNm codificante de la proteína transposasa o un ADN codificante de la proteína transposasa se encuentren presentes simultáneamente en la célula.

El gen de transposasa se refiere a un gen codificante de una transposasa. Con el fin de mejorar su eficiencia de expresión en una célula de mamífero, puede conectarse una secuencia que ajusta el espacio entre la secuencia de consenso de Kozak (Kozak M., Nucleic Acids Res. 12:857-872, 1984) o una secuencia de unión ribosómica, secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio, a una distancia apropiada (por ejemplo de 6 a 18 bases), con un sitio situado cadena arriba del codón de inicio de traducción ATG del gen.

Según la presente invención, con el fin de integrar un vector de expresión en el cromosoma de una célula hospedadora, se permite que actúe una transposasa sobre el vector de expresión. Con el fin de permitir que una transposasa actúe sobre una célula, puede inyectarse el enzima transposasa en la misma, o puede introducirse un gen con el ADN codificante de la transposasa en un vector de expresión deseado y éste transfectarse en la célula. Además, mediante la transfección de la célula con un ARN codificante de un gen de transposasa, la transposasa puede expresarse dentro de la célula.

El vector de expresión que puede utilizarse en la presente memoria no se encuentra particularmente limitado. Puede utilizarse cualquier vector de expresión mediante la selección opcional de entre los vectores de expresión conocidos por el experto en la materia, dependiendo de la célula hospedadora en la que se introduce el vector de expresión que comprende un gen de transposasa, el uso y similares.

En el caso de que la proteína de interés que comprende dos o más polipéptidos se produzca mediante el procedimiento de la presente invención, el vector de expresión puede integrarse en el cromosoma de una célula hospedadora mediante la inserción del ADN codificante de cada uno de los dos o más polipéptidos en el mismo vector o en vectores de expresión diferentes. Específicamente, puede insertarse una cadena pesada y una cadena ligera de anticuerpo en diferentes vectores de expresión y el vector de expresión puede integrarse en un cromosoma de una célula hospedadora.

La transposasa puede insertarse en un vector de expresión para la expresión junto con la proteína de interés o puede insertarse en un vector diferente del vector de expresión. Puede permitirse que la transposasa actúe transitoriamente o puede permitirse que actúe continuamente, aunque resulta preferente permitir que la transposasa actúe transitoriamente con el fin de preparar una célula para la producción estable.

Con el fin de permitir que la transposasa actúe transitoriamente, puede insertarse, por ejemplo, un gen de transposasa en un plásmido de expresión que sea diferente del vector de expresión que presenta una proteína de interés y puede transfectarse una célula con ellos.

La expresión "vector de expresión" se refiere a un vector de expresión para la utilización en la introducción en una célula de mamífero. El vector de expresión utilizado en la presente invención presenta una estructura en la que se encuentra presente por lo menos un par de secuencias de transposón en ambos lados de un casete de expresión.

La expresión "casete de expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos que presenta una región de control de la expresión génica necesaria para expresar una proteína de interés y una secuencia codificante de la proteína de interés. Entre los ejemplos de la región de control de la expresión génica se incluyen un intensificador, un promotor y un terminador. El casete de expresión puede incluir un gen marcador seleccionable.

Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluye un promotor de gen IT (inmediato temprano) del citomegalovirus (CMV), un promotor temprano del SV40, un promotor de retrovirus, un promotor metalotioneína, un promotor de choque térmico, un promotor SRα, virus de la leucemia murina de Moloney, un intensificador y similares. Además, puede utilizarse el intensificador del gen IT del CMV humano junto con el promotor.

El gen marcador seleccionable se refiere a un gen marcador opcional que puede utilizarse para distinguir una célula en la que se introduce un vector plásmido de una célula que no presenta el vector. Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable se incluyen un gen de resistencia a fármaco (tal como un gen de resistencia a la neomicina, un gen DHFR, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a blasticidina, un gen de resistencia a zeocina y un gen de resistencia a higromicina), genes marcadores de fluorescencia y bioluminiscencia (tal como la proteína fluorescente verde, GFP por sus siglas en inglés, Green Fluorescent Protein) y similares.

Un gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable que se modifica de manera que se reduce la actividad de la proteína codificada por el gen marcador seleccionable en el interior de la célula.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable que se modifica de manera que la actividad en la célula sea baja se incluyen: (A) un gen marcador seleccionable en el que se modifica una secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por un gen marcador seleccionable de manera que se reduce la actividad de la proteína en la célula, o (B) un gen marcador seleccionable en el que una secuencia de nucleótidos que controla la expresión de un gen marcador seleccionable se modifica o una secuencia de nucleótidos dentro de un ORF (por sus siglas en inglés, Open Reading Frame, marco de lectura abierto) se modifica de manera que se reduce la expresión del gen marcador seleccionable.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable en el que se modifica la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen marcador seleccionable de manera que se reduce la actividad de la proteína en la célula se incluyen el gen de resistencia a neomicina descrito por Sauter et al. [Biotech. Bioeng. 89:530-538, 2005] o Chen et al. [Journal of Immunological Methods 295:49-56, 2004].

Entre los ejemplos del procedimiento para reducir el nivel de expresión de una proteína en la célula mediante la modificación de una secuencia de nucleótidos que controla la expresión del gen marcador seleccionable se incluye un procedimiento para modificar la secuencia del promotor, la secuencia del terminador, la secuencia intensificadora, la secuencia de consenso de Kozak o la secuencia de Shine-Dalgarno, que controla la expresión del gen marcador seleccionable.

Más específicamente, entre los ejemplos se incluye un procedimiento en el que una secuencia promotora que controla la expresión de un gen marcador seleccionable se sustituye por una secuencia promotora más débil.

Entre los ejemplos del procedimiento de reducción del nivel de expresión de la proteína en la célula mediante la modificación de una secuencia de nucleótidos en el ORF de un gen marcador seleccionable se incluye un procedimiento en el que se sustituye un codón en el ORF por un codón sinónimo que presenta una frecuencia todavía más baja de uso de codones en la célula.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable atenuado de la presente invención se incluye un marcador seleccionable en el que el codón anteriormente indicado en el ORF del gen se sustituye por un codón sinónimo que presenta una frecuencia todavía más baja de uso del codón en la célula.

En las células de diversas especies biológicas, el codón sinónimo que presenta una frecuencia todavía más baja de uso de entre cada codón sinónimo puede seleccionarse basándose en la literatura conocida, bases de datos y similares.

Entre los ejemplos de dicha sustitución por un codón sinónimo con una frecuencia más baja de uso, específicamente en el caso de la célula CO, se incluye la sustitución del codón de leucina por TTA, la sustitución del codón de arginina por CGA o CGT, la sustitución del codón de alanina por GCG, la sustitución del codón de valina por GTA, la sustitución del codón de serina por TCG, la sustitución del codón de isoleucina por ATA, la sustitución del codón de treonina por ACG, la sustitución del codón de prolina por CCG, la sustitución del codón de ácido glutámico por GAA, la sustitución del codón de tirosina por TAT, la sustitución del codón de lisina por AAA, la sustitución del codón de fenilalanina por TTT, la sustitución del codón de histidina por CAT, la sustitución del codón de glutamina por CAA, la sustitución del codón de asparagina por AAT, la sustitución del codón de ácido aspártico por GAT, la sustitución del codón de cisteína por TGT y la sustitución del codón de glicina por GGT.

En un gen marcador seleccionable atenuado, el número de codones que debe colocarse en comparación con el gen marcador seleccionable antes de la modificación no se encuentra particularmente limitado con la condición de que la célula productora de proteínas pueda obtenerse eficientemente, aunque resulta preferente sustituir codones correspondientes a 20 o más residuos aminoácidos.

En un gen marcador seleccionable atenuado, el número de bases que debe modificarse en comparación con el gen marcador seleccionable antes de la modificación no se encuentra particularmente limitado, aunque resulta preferente modificar 10% o más de la secuencia de nucleótidos codificante del gen marcador seleccionable.

Además, en un gen marcador seleccionable atenuado, los residuos aminoácidos codificados por los codones que deben sustituirse no se encuentran particularmente limitados, aunque entre los ejemplos preferentes se incluye leucina, alanina, serina y valina.

En el caso de un gen marcador seleccionable atenuado, en el que en que los codones correspondientes a la leucina son sustituidos, no se encuentra particularmente limitado pero resulta preferente sustituir los codones correspondientes a 70% o más de los residuos de leucina de entre los codones correspondientes al total de residuos de leucina contenidos en el gen marcador seleccionable. Además, en el caso de un gen marcador seleccionable atenuado, en el caso de que los codones correspondientes a alanina se sustituyan de manera no particularmente limitada, resulta preferente sustituir los codones correspondientes a 70% o más de los residuos de alanina de entre los codones correspondientes al total de residuos de alanina contenidos en el gen marcador seleccionable.

Entre los ejemplos específicos del gen marcador seleccionable atenuado obtenido mediante dicha modificación en la que los codones se sustituyen por codones sinónimos con una frecuencia de uso más baja se incluyen un gen de resistencia a neomicina que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 9, nº 11

o nº 13, un gen de resistencia a puromicina que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 21, nº 23 o nº 25, un gen de resistencia a zeocina que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 27 o nº 29 y un gen de resistencia a higromicina que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 31 o nº 33.

Además, resulta posible atenuar un gen marcador seleccionable también mediante el incremento considerable de la concentración de un fármaco en comparación con la concentración utilizada convencionalmente al seleccionar una célula resistente a fármaco en la preparación de una célula productora de anticuerpo o llevando a cabo una administración adicional antes de que el gen de resistencia a fármaco metabolice y degrade el fármaco.

El procedimiento para introducir el vector de expresión anteriormente indicado que comprende una secuencia de transposón, un vector plásmido para expresar una transposasa o ARN no se encuentra particularmente limitado. Entre los ejemplos se incluyen transfección con fosfato de calcio, electroporación, un procedimiento de

liposomas, un procedimiento de pistola génica, lipofección y similares. Entre los ejemplos del procedimiento para introducir directamente una transposasa en forma de una proteína se incluyen una técnica de microinyección o la introducción en la célula mediante endocitosis. La introducción génica puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito en Shin Idenshi Kogaku Handbook (New Genetic Engineering Handbook), editado por Masami Muramatsu y Tadashi Yamamoto, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897063737.

La célula hospedadora puede ser cualquier célula de CHO con la condición de que pueda subcultivarse y expresar establemente una proteína de interés.

Entre los ejemplos de la célula hospedadora particular se incluyen la célula de ovario de hámster chino, CHO (Journal of Experimental Medicine 108:945, 1958; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 601275, 1968; Genetics 55:513, 1968; Chromosom 41:129, 1973; Methods in Cell Science 18:115, 1996; Radiation Research 148:260, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216, 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. 60:1275, 1968; Cell 6:121, 1975; Molecular Cell Genetics, Apéndices I y II (páginas 883 a 900)), CHO/DG44 (ATCC nº CRL-9096), CHO-K1 (ATCC nº CCL-61), DUKXB11 (ATCC nº CCL-9096), Pro-5 (ATCC nº CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, nº de cat. 11619), Pro-3 y sublíneas de la línea celular de células de CHO.

Además, la célula hospedadora anteriormente indicado también puede utilizarse en el procedimiento de producción de proteínas de la presente invención mediante la modificación de la célula de manera que resulte adecuada para la producción de proteínas, debido a la modificación del ADN cromosómico, la introducción de un gen exógeno y similares.

Además, en la presente invención, con el fin de controlar la estructura de cadena sacárida unida a una proteína de interés que debe producirse, también puede utilizarse Lec13 que ha adquirido resistencia a lectina [Somatic Cell and Molecular Genetics 12:55, 1986] o una célula de CHO de la que se ha delecionado el gen de α1,6fucosiltransferasa (documentos nº WO2005/35586 y nº WO2002/31140) como célula hospedadora para producir una proteína de interés de la presente invención.

La proteína de interés producida en la presente invención puede ser cualquier proteína con la condición de que pueda expresarse mediante el procedimiento de producción de una proteína utilizando un transposón no autónomo de la presente invención. En particular, entre los ejemplos de la proteína de interés se incluyen una proteína sérica humana, una hormona peptídica, un factor de crecimiento, una citoquina, un factor de coagulación sanguínea, una proteína fibrinolítica, un anticuerpo, fragmentos parciales de diversas proteínas y similares.

Entre los ejemplos de la proteína de interés producida en la presente invención se incluyen preferentemente un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano, una proteína de fusión de Fc, una proteína de unión a albúmina y un fragmento parcial de los mismos.

La actividad efectora de un anticuerpo monoclonal producido en la presente invención puede controlarse mediante diversos procedimientos. Entre los ejemplos de los procedimientos conocidos se incluyen un procedimiento para controlar la cantidad de fucosa (en lo sucesivo también denominada "fucosa nuclear") que se encuentra unida a N-acetilglucosamina (GlcNAc) mediante enlace α-1,6 en un extremo reductor de una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo que se encuentra unida a la asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos nº WO 2005/035586, nº WO 2002/31140 y nº WO 00/61739), un procedimiento para controlar una actividad efectora mediante la modificación del residuo o residuos aminoácidos de una región Fc del anticuerpo o similar. La actividad efectora del anticuerpo monoclonal producido en la presente invención puede controlarse mediante la utilización de cualquiera de los procedimientos.

La actividad efectora se refiere a una actividad dependiente de anticuerpo que resulta inducida por una región Fc de un anticuerpo. Como actividad efectora se conoce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC), la fagocitosis dependiente de anticuerpos (actividad ADP) por células fagocíticas, tales como macrófagos o células dendríticas, y similares.

Además, mediante el control del contenido de fucosa nuclear de una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo de Fc de un anticuerpo monoclonal que se produce en la presente invención, puede incrementarse o reducirse la actividad efectora del anticuerpo. Como procedimiento para reducir el contenido de fucosa que se encuentra unida a una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo unida a Fc del anticuerpo, puede obtenerse un anticuerpo al que no se encuentra unido fucosa, mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula de CHO que es deficiente en un gen codificante de α1,6-fucosiltransferasa.

El anticuerpo al que la fucosa no se encuentra unida presenta una elevada actividad ADCC. Por otra parte, como procedimiento para incrementar el contenido de fucosa que se encuentra unida a una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo unida a Fc de un anticuerpo, puede obtenerse un anticuerpo al que se encuentra unida fucosa, mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula hospedadora en la que se introduce un gen codificante de α1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que se encuentra unido la fucosa presenta una

actividad ADCC más baja que el anticuerpo al que no se encuentra unida fucosa.

Además, mediante la modificación de uno o más residuos aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo, puede incrementarse o reducirse la actividad ADCC o la actividad CDC. Por ejemplo, la actividad CDC de un anticuerpo puede incrementarse mediante la utilización de la secuencia de aminoácidos de la región Fc indicada en el documento nº US 2007/0148165. Además, la actividad ADCC o la actividad CDC puede incrementarse o reducirse llevando a cabo la modificación de aminoácidos indicada en las patentes US nº 6.737.056, nº

7.297.775 o nº 7.317.091.

La expresión "célula de mamífero en suspensión" en la presente invención se refiere a una célula que no se adhiere a un anclaje de cultivo celular de recubrimiento para facilitar la adhesión de las células en cultivo, tal como microperlas, un recipiente de cultivo para el cultivo de tejidos (también denominado recipiente de cultivo de tejidos o de cultivo en adhesión y similares) y similares, y puede sobrevivir y crecer en suspensión en la solución de cultivo. Con la condición de que la célula no se adhiera al anclaje de cultivo celular, la célula puede sobrevivir y crecer en estado de células individuales en la solución de cultivo o sobrevivir y crecer en un estado de masa de células formada mediante la aglutinación de dos o más células.

Además, la célula de mamífero en suspensión que debe utilizarse en la presente invención es una célula que puede sobrevivir y crecer en un medio sin suero que no contiene suero de feto bovino (en lo sucesivo denominado FCS) y similares, en suspensión en la solución de cultivo sin adherirse al anclaje de cultivo celular. Resulta más preferente una célula de mamífero que puede sobrevivir y crecer en suspensión en un medio sin proteínas que no contiene proteínas.

El recipiente de cultivo para el cultivo de tejidos puede ser cualquiera, tal como un matraz, una placa Petri y similares, con la condición de que se haya aplicado al mismo un recubrimiento para el cultivo en adhesión. En particular, puede confirmarse que es una célula de mamífero en suspensión utilizando un matraz de cultivo de tejidos disponible comercialmente (fabricado por Greiner), un matraz de cultivo en adhesión (fabricado por Sumitomo Bakelite) y similares.

Como célula de mamífero en suspensión para la utilización en la presente invención, puede seleccionarse una célula preparada mediante la adaptación adicional de una célula que originalmente presentaba una propiedad en suspensión al cultivo en suspensión, o una célula de mamífero en suspensión preparada mediante la adaptación de una célula de mamífero adhesiva a condiciones de cultivo en suspensión. Entre los ejemplos de la célula que originalmente presentaba una propiedad en suspensión se incluyen la célula de CHO-S (fabricada por Invitrogen) y similares.

La célula de mamífero en suspensión preparada mediante la adaptación de una célula de mamífero adhesiva a condiciones de cultivo en suspensión en la presente invención puede prepararse mediante el procedimiento descrito en Mol. Biotechnol. 15(3):249-57, 2000, o mediante el procedimiento mostrado a continuación, y puede prepararse mediante el establecimiento de una célula que muestra una propiedad de proliferación y una propiedad de supervivencia similares a las presentes antes de adaptar el cultivo en suspensión o superiores a las presentes antes de la adaptación al cultivo en suspensión (J. Biotechnol. 130(3):282-90, 2007).

La expresión "similar a las condiciones antes de la adaptación al cultivo en suspensión" se refiere a que la proporción de supervivencia, la tasa de proliferación (tiempo de duplicación) y similares de la célula adaptada al cultivo en suspensión son sustancialmente iguales a las de la célula antes de la adaptación al cultivo en suspensión.

En la presente invención, entre los ejemplos del procedimiento de adaptación de una célula de mamífero adhesiva a las condiciones de cultivo en suspensión se incluye el procedimiento siguiente. El contenido en suero de un medio que contenía suero se redujo a 1/10 y se repitió el subcultivo a una densidad relativamente elevada de células. Cuando la célula de mamífero consigue sobrevivir y proliferar, el contenido en suero se reduce adicionalmente y se repite el subcultivo. Mediante este procedimiento puede prepararse una célula de mamífero en suspensión que puede sobrevivir y proliferar bajo condiciones sin suero.

Además, también puede prepararse una célula de mamífero en suspensión mediante el cultivo con la adición de un surfactante no iónico apropiado, tal como Pluronic-F68 o similar en la solución de cultivo. Un ejemplo de la célula de mamífero en suspensión en la que se adapta la célula de mamífero adhesiva a condiciones de cultivo en suspensión es una célula de CHO.

En la presente invención, la célula de CHO en suspensión preferentemente presenta una propiedad por la que, al llevar a cabo el cultivo en suspensión con 2x105 células/ml, la densidad celular después del cultivo durante 3 o 4 días preferentemente s de 5x105 células/ml o superior, más preferentemente de 8x105 células/ml o superior, particularmente preferentemente de 1x106 células/ml o superior, más preferentemente de 1,5x106 células/ml o superior. Además, el tiempo de duplicación de la célula de CHO en suspensión de la presente invención preferentemente es de 48 horas o inferior, más preferentemente de 24 horas o inferior, particularmente

preferentemente de 18 horas o inferior, más preferentemente de 11 horas o inferior.

Entre los ejemplos del medio para el cultivo en suspensión se incluye medio disponible comercialmente, tal como medio CD OptiCHO (Invitrogen), medio EX-CELL 325-PF (SAFC Biosciences), medio SFM4CHO (HyClone) y similares. Además, también puede obtenerse mediante la mezcla de sacáridos, aminoácidos, vitaminas, sales metálicas y similares, los cuales resultan necesarios para el cultivo de las células de CHO.

El cultivo en suspensión puede llevarse a cabo mediante la utilización de un recipiente de cultivo que puede utilizarse para el cultivo en suspensión bajo una condición de cultivo capaz de cultivo en suspensión. Entre los ejemplos de recipiente de cultivo se incluyen una placa de 96 pocillos para el cultivo celular en suspensión (fabricada por Corning), un matraz T (fabricado por Becton Dickinson), un matraz cónico (fabricado por Corning) y similares.

Con respecto a las condiciones de cultivo, por ejemplo, puede cultivarse estáticamente en una atmósfera con 5% de CO2 a una temperatura de cultivo de 37ºC. También puede utilizarse un equipo de cultivo bajo agitación, tal como un equipo de cultivo para el uso exclusivo en cultivo en suspensión, por ejemplo Wave Bioreactor (fabricado por GE Healthcare Bioscience).

Con respecto a las condiciones de cultivo en suspensión para una célula de CHO utilizando el equipo Wave Bioreactor, la célula puede cultivarse mediante el procedimiento descrito en la página de Internet principal de GE Healthcare Bioscience: http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf.

Además del cultivo bajo agitación, también puede utilizarse el cultivo utilizando un equipo de agitación mediante rotación, tal como un biorreactor. El cultivo utilizando un biorreactor puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito en Cytotechnology 52:199-207, 2006, y similares.

La purificación de la proteína producida por la célula en cultivo se lleva a cabo mediante la separación de la proteína de interés de impurezas diferentes de la proteína de interés en una solución de cultivo u homogeneizado celular que contiene la proteína. Entre los ejemplos del procedimiento de separación se incluyen la centrifugación, la diálisis, la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía de columna, la filtración o similares. La separación puede llevarse a cabo basándose en diferencias en las propiedades físicoquímicas de la proteína de interés y de las impurezas o en diferencias en su avidez para el portador de columna mismo.

Como procedimiento para purificar la proteína, la purificación se lleva a cabo mediante el procedimiento descrito en Protein Experimentation Note (el primer volumen) -Extraction, Separation and Expression of Recombinant Protein (traducción de un libro de texto escrito en japonés) (editado por Masato Okada y Kaori Miyazaki, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897069180) y similares.

La presente invención ha sido descrita anteriormente mostrando formas de realización preferentes de la misma en aras de la fácil comprensión. En adelante, la presente invención se describe basándose en ejemplos, aunque las explicaciones anteriormente proporcionadas y los ejemplos, posteriormente, se proporcionan meramente con fines de ejemplificación y no con fines limitativos de la invención. De acuerdo con ello, el alcance de la presente invención no se encuentra limitado a las formas de realización y ejemplos que se describen específicamente en la presente memoria, sino que se encuentra limitada según las reivindicaciones únicamente.

En adelante, se muestran ejemplos para describir adicionalmente la presente memoria específicamente aunque la presente invención no se encuentra limitada a la descripción de dichos ejemplos.

Se llevaron a cabo diversas técnicas experimentales relacionadas con la recombinación descrita a continuación, tales como la clonación y similares, de acuerdo con las técnicas de ingeniería genética descritas en Molecular Cloning, 2a edición, editada por J. Sambrook, E.F. Frisch y T. Maniatis, Current Protocols in Molecular Biology, editado por Frederick M. Ausubel et al., publicado por Current Protocols, y similares.

Ejemplos

[Ejemplo 1] Preparación de un vector de transposón que expresa gen de resistencia a la neomicina y anticuerpo anti-CD98 humano

(1) Preparación de un vector de transposón que expresa gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y anticuerpo anti-CD98 humano.

Un plásmido que comprendía un casete de expresión génica para la utilización con células de mamífero que comprendía un gen de anticuerpo humano arbitrario y un gen marcador de resistencia a fármaco insertado entre un par de secuencias de nucleótidos derivadas de Tol2 se utilizó como vector plásmido para la expresión de proteínas.

El ADN del gen que debía utilizarse se obtuvo llevando a cabo síntesis química de manera artificial basándose en una secuencia de nucleótidos convencionalmente conocida o mediante la preparación de cebadores de las secuencias de ambos extremos y llevando a cabo de esta manera una PCR utilizando una fuente de ADN apropiada. Con el fin de realizar estás ultimas manipulaciones génicas, se añadió un sitio de digestión con enzima de restricción al extremo del cebador. En la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 no autónomo (SEC ID nº 1) dado a conocer en el documento nº JP-A-2003-235575, se utilizó una secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (secuencia de Tol2-L) (SEC ID nº 2) y una secuencia de nucleótidos en las posiciones

2.285 a 2.788 (secuencia de Tol2-R) (SEC ID nº 3) como las secuencias de transposón.

Se sintetizó un fragmento de ADN que comprendía la secuencia de Tol2-R y la secuencia de Tol2-L.

Se preparó un fragmento de ADN que incluía una secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 15) que codificaba la cadena H de anticuerpo bajo el control del promotor del CMV, amplificado basándose en el vector del anticuerpo anti-CD98 humano N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L (patente japonesa nº 4324637) como casete génico de cadena pesada de anticuerpo y un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 17) que codificaba cadena ligera de anticuerpo bajo el control del promotor del SV40, amplificado basándose en el vector de anticuerpo anti-CD98 humano N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L, como casete génico de cadena ligera de anticuerpo.

Como casete génico de resistencia a la neomicina, se preparó un fragmento de ADN que comprendía un ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante de un gen de resistencia a la neomicina bajo el control de promotor del SV40 (un ADN que codifica una fosfotransferasa de neomicina que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 7 y GenBank nº de acceso U47120.2).

Se preparó un vector de expresión A de anticuerpo anti-CD98 mediante la conexión del casete de expresión génica de cadena pesada de anticuerpo anteriormente indicado, el casete de expresión génica de cadena ligera de anticuerpo y el casete de expresión génica de resistencia a la neomicina y conectando adicionalmente sus dos extremos con un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de Tol2-R y un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de Tol2-L (figura 1).

(2)

Preparación de vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprendía un gen 1 de resistencia la neomicina de tipo modificado.

Se preparó un vector B de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector A de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en

(1)

que comprendía un gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje se sustituyó por el gen 1 de resistencia a neomicina de tipo modificado que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 9.

El gen 1 de resistencia a neomicina de tipo modificado codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y fue modificada para presentar una secuencia de nucleótidos en la que 167 bases correspondientes a 22% de la secuencia entera habían sido modificados. Específicamente, de entre el total de 32 residuos de leucina, los codones correspondientes a 25 residuos de leucina habían sido modificados de manera que fuesen TTA.

(3)

Preparación de vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprendía un gen 2 de resistencia a neomicina de tipo modificado.

Un vector C de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector A de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en (1) que comprendía un gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje se sustituyó por un gen 2 de resistencia a neomicina de tipo modificado que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 11.

El gen 2 de resistencia a neomicina de tipo modificada codificaba la secuencia de aminoácidos idéntica al gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y presentaba una secuencia de nucleótidos en la que las 180 bases correspondientes a 23% de la secuencia entera habían sido modificadas. Específicamente, de entre el total de 32 residuos de leucina, los codones correspondientes a 28 residuos de leucina habían sido modificados de manera que fuesen TTA.

(4)

Preparación de vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que presentaba un gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado.

(1)

que comprendía un gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje se sustituyó por un gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 13.

Se preparó un vector D de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector A de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en

El gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado codificaba una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y presentaba una secuencia de nucleótidos en la que 203 bases correspondientes a 26% de la secuencia entera habían sido modificados. Específicamente, de entre el total de 32 residuos de leucina, los codones correspondientes a 30 residuos de leucina se habían modificado de manera que

5 fuesen TTA.

[Ejemplo 2] Producción de anticuerpos por células de CHO productoras de anticuerpos que expresan gen de resistencia a neomicina de tipo modificado.

10 Se prepararon células A a D productoras de anticuerpos mediante la introducción de cada uno de los vectores A a D de transposón de expresión de anti-CD98 humano preparados en los Ejemplos 1(1) a (4) en las células de CHO-K1 en suspensión junto con un vector pCAGGS-T2TP que expresa una transposasa Tol2 que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 5 [Kawakami K. y Noda T., Genetics 166:895-899, 2004].

15 La introducción de vectores en las células de CHO en suspensión se llevó a cabo mediante la suspensión de células de CHO (4x106 células) en 400 µl de tampón PBS y la cotransfección del vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano (10 µg) y del vector de expresión de transposasa Tol2 llamado pCAGGS-T2TP (20 µg) directamente en forma de ADN circular mediante electroporación.

20 En este caso, el vector de expresión de transposasa Tol2 también se introdujo directamente como ADN circular con el fin de expresar transitoriamente la transposasa Tol2.

Además, como control que no utilizaba transposasa Tol2, el vector D de transposón de expresión de anticuerpo 25 anti-CD98 humano (10 µg) del Ejemplo 1(4) se linearizó utilizando el enzima de restricción PciI (TAKARA BIO INC.) y después se introdujo en células de CHO-K1 en suspensión mediante electroporación.

La electroporación se llevó a cabo utilizando un electroporador [sistema Gene Pulser Xcell (fabricado por Bio-Rad)] bajo las condiciones de 300 V de voltaje y 500 µF de capacidad electrostática y a temperatura ambiente 30 utilizando una cubeta de 4 mm de hueco (fabricada por Bio-Rad).

Tras la introducción génica mediante electroporación, se inocularon las células en cada cubeta en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 3 días en un incubador de CO2 utilizando un medio CD OptiCHO (Invitrogen) complementado con 5% de hidrolizado de soja.

35 A continuación, a partir del intercambio de medio tras 4 días de la introducción génica, se llevó a cabo el cultivo en presencia de G418 (Geneticin®, Invitrogen) mediante la adición de G418, proporcionando una concentración final de 500 µg/ml y se llevó a cabo el cultivo durante 3 semanas mientras se cambiaba el medio a intervalos de una semana.

40 Tras el cultivo, se determinó la expresión del anticuerpo utilizando el ensayo LANCE® (Perkin-Elmer Corp.) mediante un procedimiento de tipo sándwich al que se aplicó FRET (Transferencia por resonancia de energía fluorescente). Se muestran los resultados en la Tabla 1.

45 [Tabla 1]

Células productoras de anticuerpos

A (tipo salvaje)

B (tipo modificado 1) C (tipo modificado 2) D (tipo modificado 3) Células de control

Nivel de expresión de anticuerpos (mg/l) de células que mostraban la expresión máxima

0,5 2,0 1,6 5,1 -

Nivel de expresión medio de anticuerpos (mg/l) de las 10 células superiores

0,5 0,7 0,7 1,7 -

Tal como se muestra en la Tabla 1, los niveles de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano de las células B a D que expresaban los genes de resistencia a neomicina de tipo modificado eran más elevados que el de la célula

50 A que expresaba el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje.

En particular, en el caso de la célula D productora de anticuerpo anti-CD98 humano que expresaba el gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado, se obtuvo una línea celular que mostraba un nivel de expresión 10 veces más elevado que el de la célula A productora de anticuerpo anti-CD98 humano que expresaba el gen de

55 resistencia a neomicina de tipo salvaje.

Además, incluso al utilizar el gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado, no se pudo obtener una célula que expresase el anticuerpo anti-CD98 humano a partir de una célula de control en la que no se había cotransfectado el vector de expresión de transposasa Tol2, a pesar de linearizar el vector.

[Ejemplo 3] Preparación de vector de transposón que expresaba gen de resistencia a puromicina y anticuerpo anti-CD98 humano.

(1) Preparación de vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprendía el gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado.

Se preparó el vector E de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que se había sustituido el gen de resistencia a neomicina del vector A de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en el ejemplo 1(1), que comprendía el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje, por un gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado que consistía en la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 21.

El gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado codificaba una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje que consistía en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 19 (un gen de puromicín-N-acetiltransferasa, que consiste en la secuencia de nucleótidos dada a conocer en GenBank nº de acceso U07648.1) y presentaba una secuencia de nucleótidos en la que se habían modificado 17 bases, que corresponde a 3% del total de bases.

Específicamente, de entre el total de 28 residuos de alanina contenidos en el gen de resistencia a puromicina, los codones correspondientes a los 17 residuos de alanina se modificaron por GCG mediante modificación y, junto con los codones que ya eran GCG en el tipo salvaje, los codones que correspondían a todos los residuos de alanina fueron modificados a GCG.

(2) Preparación de vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprendía el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado.

Se preparó el vector F de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano, en el que el gen de resistencia a neomicina del vector A de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en el Ejemplo 1(1) que comprendía el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje se sustituyó por el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 23.

El gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado codificaba una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje y presentaba una secuencia de nucleótidos en la que 79 bases, correspondiente a 14% del total de bases, habían sido modificadas. Específicamente, además de la modificación de los codones que correspondían a los residuos de alanina del gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado, se modificaron los codones correspondientes a los residuos de alanina de manera que fuesen TTA, y los codones correspondientes a los residuos de valina se modificaron de manera que fuesen GTA y el codón de serina se modificó para que fuese TCG.

[Ejemplo 4] Producción de anticuerpos por células de CHO productoras de anticuerpos que expresan gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado

Se prepararon las células E y F productoras de anticuerpos mediante la introducción del vector E de transposón de expresión de anticuerpo antI-CD98 humano del Ejemplo 3(1), que comprendía el gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado, el vector F de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano del Ejemplo 3(2) que comprendía el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado y el vector de expresión de transposasa Tol2 llamado pCAGGS-T2TP en células de CHO-K1 en suspensión.

La introducción de los vectores en las células en suspensión se llevó a cabo mediante la suspensión de las células de CHO en suspensión (4x106 células) en 400 µl de tampón PBS y cotransfectando el vector de transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprendía el gen de resistencia a puromicina de tipo modificado en forma de ADN circular (10 µg) y pCAGGS-T2TP (20 µg) directamente mediante electroporación.

En este caso, el vector de expresión de transposasa Tol2 llamado pCAGGS-T2TP también se introdujo directamente en forma de ADN circular con el fin de expresar transitoriamente la transposasa Tol2.

La electroporación se llevó a cabo utilizando un electroporador (sistema Gene Pulser Xcell, fabricado por Bio-Rad)) bajo las condiciones de 300 V de voltaje y 500 µF de capacidad electrostática y a temperatura ambiente, utilizando una cubeta de 4 mm de camino óptico (fabricada por Bio-Rad).

Tras la introducción génica mediante electroporación, las células en cada cubeta fueron inoculadas en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante 3 días en un incubador de CO2 utilizando un medio CD OptiCHO (Invitrogen) complementado con 5% de hidrolizado de soja.

A continuación, tras el cambio de medio 2 días después de la introducción génica, se llevó a cabo el cultivo durante 4 semanas añadiendo simultáneamente puromicina (P9620, Sigma-Aldrich), proporcionando una concentración final de 5 µg/ml y realizando el cambio de medio a medio que contenía puromicina a intervalos de una semana.

Tras el cultivo, se determinó el nivel de expresión del anticuerpo utilizando el ensayo LANCE® (Perkin-Elmer Corp.) mediante un procedimiento de tipo sándwich al que se aplicó FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia). Se muestran los resultados en la Tabla 2.

[Tabla 2]

Células productoras de anticuerpos

E (Modificación 1)

F (Modificación 2)

Nivel de expresión de anticuerpo (mg/l) de células que mostraban la expresión máxima

1,0 2,2

Nivel promedio de expresión de anticuerpo (mg/l) de las 10 células superiores

0,7 1,6

Tal como se muestra en la Tabla 2, la célula F productora de anticuerpos que expresaba el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado mostraba una productividad de anticuerpos dos o más veces superior a la de la célula E productora de anticuerpos, que expresaba el gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado.

[Ejemplo 5] Producción de anticuerpos por células de CHO productoras de anticuerpos que expresaban gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado.

La célula F productora de anticuerpos obtenida en el Ejemplo 4 que expresaba el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado se cultivó en un matraz cónico para producir anticuerpo anti-CD98 humano.

Específicamente, la célula F productora de anticuerpos se cultivó para la expansión utilizando una placa de 96 pocillos, una placa de 24 pocillos y un aplaca de 6 pocillos, en este orden. Se seleccionaron dos líneas celulares de la célula F productora de anticuerpos en la que el número de células se había incrementado en grado suficiente (líneas celulares 1 y 2) y se suspendieron en 35 ml de medio CD OptiCHO (Invitrogen) complementado con 5% de hidrolizado de soja de manera que se alcanzase una densidad celular de 2x105 células/ml y se cultivaron durante 1 semana en un agitador utilizando un matraz cónico de 125 ml de capacidad (con una tapa doblada, Corning Glassworks) en una atmósfera con 5% de CO2 a 37ºC, produciendo de esta manera el anticuerpo anti-CD98 humano.

Se determinó la cantidad del anticuerpo en el medio después del cultivo mediante HPCL (Waters Associates, Inc.). Se muestran los resultados en la Tabla 3.

[Tabla 3]

Los resultados anteriormente proporcionados demuestran que en la suspensión, las células de CHO, el gen de anticuerpo insertado entre un par de secuencias de transposón y el gen de resistencia a fármaco de tipo modificado, son introducidos eficientemente en el cromosoma del hospedador y también resultan eficaces para la selección de una célula de expresión elevada. Además, se encontró que la célula obtenida de esta manera podía cultivarse para la expansión y que resultaba posible la producción de la proteína de interés bajo condiciones de cultivo en suspensión.

[Ejemplo de referencia] (1) Preparación de células de CHO en suspensión.

Se desprendieron células de CHO-K1 adhesivas EC85051005 (Colección Europea de Cultivos Celulares) que habían sido cultivadas en medio α-MEM (Invitrogen) que contenía 10% de suero (FCS), mediante un tratamiento de tripsina y después fueron recuperadas, seguido de un cultivo bajo agitación a 37ºC en un incubador con 5% de CO2 utilizando medio α-MEM fresco que contenía 10% de FCS. Varios días después se confirmó el crecimiento de estas células y seguidamente se llevó a cabo un cultivo bajo agitación mediante la inoculación de las mismas en medio α-MEM que contenía 5% de FCS a una densidad de 2x105 células/ml, seguido del cultivo bajo agitación.

Varios días más después, se llevó a cabo la inoculación de manera similar utilizando medio α-MEM que contenía 5% de FCS. Finalmente, se prepararon células adaptadas al cultivo en suspensión mediante la repetición del subcultivo y con el cultivo bajo agitación con el medio α-MEM sin suero, confirmando que las células presentaban la misma capacidad de crecimiento que el cultivo de las mismas en presencia de suero.

La presente solicitud se basa en la solicitud de patente japonesa (nº 2010-279850), presentada el 15 de diciembre de 2010.

Aplicabilidad industrial

Según el procedimiento de producción de la proteína de la presente invención, puede producirse eficientemente una proteína de interés utilizando una célula de mamífero. La célula de la presente invención puede utilizarse como célula productora de proteínas para la producción de una proteína recombinante.

[Listado de secuencias]

SEC ID nº 1 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de transposón Tol2 no autónomo.

SEC ID nº 2 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de Tol2-L.

SEC ID nº 3 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de Tol2-R.

SEC ID nº 7 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a neomicina

de tipo salvaje.

SEC ID nº 8 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos codificada por el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje. SEC ID nº 9 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a neomicina

de tipo modificado. SEC ID nº 10 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. SEC ID nº 11 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a

neomicina de tipo modificado. SEC ID nº 12 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. SEC ID nº 13 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a

neomicina de tipo modificado. SEC ID nº 14 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. SEC ID nº 15 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de

cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano. SEC ID nº 16 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. SEC ID nº 17 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de

cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano. SEC ID nº 18 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. SEC ID nº 19 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a

puromicina de tipo salvaje.

SEC ID nº 20 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos codificada por el gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje. SEC ID nº 21 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a

puromicina de tipo modificado. SEC ID nº 22 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. SEC ID nº 23 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a

puromicina de tipo modificado. SEC ID nº 24 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético.

5 SEC ID nº 25 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a puromicina de tipo modificado. SEC ID nº 26 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético.

10 SEC ID nº 27 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a zeocina de tipo modificado. SEC ID nº 28 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. 15 SEC ID nº 29 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a zeocina de tipo modificado. SEC ID nº 30 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. 20 SEC ID nº 31 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a higromicina de tipo modificado. SEC ID nº 32 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. 25 SEC ID nº 33 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos del gen de resistencia a higromicina de tipo modificado. SEC ID nº 34 -Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de constructo sintético. 30 Listado de secuencias

<110> Inter-University Research Institute Corporation Research Organization of Information and Systems Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

35 <120> Procedimiento de producción de proteínas mediante la utilización de un gen de resistencia a fármaco atenuado

<130> W503695 40 <150> JP2010-279850

<151> 2010-12-15

<160> 37 45

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 2788 50 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: transposón Tol2 no autólogo 55

<400> 1

<210> 2

<211> 200 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia del transposón To12-L

10 <400> 2

<210> 3

<211> 504 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia del transposón To12-R 10

<400> 3

<210> 4 15 <211> 2156

<212> ADN

<213> Oryzias latipes

<220> 20 <221> CDS

<222> (85)..(2034)

<400> 4

<210> 5

<211> 649

<212> PRT

<213> Oryzias latipes

<400> 5

<210> 6

<211> 4682

<212> ADN

<213> Oryzias latipes

<400> 6

<210> 7

<213> desconocido

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje

10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(795)

<400> 7

<210> 8

<211> 264

<212> PRT

<213> desconocido

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 8

<210> 9

<213> Artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina modificado 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(795)

15 <400> 9

<210> 10

<213> Artificial

<220>

<223> Constructo sintético 10

<400> 10

<210> 11

<211> 795 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina modificado 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(795)

<400> 11

<210> 12

<211> 264

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 12

<210> 13

<213> artificial

<220>

<223> gen de resistencia a neomicina modificado 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(795)

15 <400> 13

<210> 14

<211> 264 5 <212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Constructo sintético 10

<400> 14

<210> 15

<211> 417

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(417)

<400> 15

10

<210> 16

<211> 139

<212> PRT

<213> artificial

15

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 16

<210> 17

<213> artificial

<220>

<223> cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(387)

15 <400> 17

<210> 18

<213> artificial

<220>

<223> Constructo sintético 10

<400> 18

<210> 19

<211> 600

<212> ADN

<213> desconocido 5

<220>

<223> gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje

<220> 10 <221> CDS

<222> (1)..(600)

<400> 19

<210> 20

<213> desconocido

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 20

<210> 21 10 <211> 600

<212> ADN

<213> artificial

<220> 15 <223> gen de resistencia a puromicina modificado

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(600) 20

<400> 21

5 <210> 22

<211> 199

<212> PRT

<213> artificial

10 <220>

<223> Constructo sintético

<400> 22

5 <210> 23

<211> 600

<212> ADN

<213> artificial

10 <220>

<223> gen de resistencia a puromicina modificado

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(600)

<400> 23

5 <210> 24

<211> 199

<212> PRT

<213> artificial

10 <220>

<223> Constructo sintético

<400> 24

5 <210> 25

<211> 600

<212> ADN

<213> artificial

10 <220>

<223> gen de resistencia a puromicina modificado

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(600)

<400> 25

5 <210> 26

<211> 199

<212> PRT

<213> artificial

10 <220>

<223> Constructo sintético

<400> 26

5 <210> 27

<211> 375

<212> ADN

<213> artificial

10 <220>

<223> gen de resistencia a zeocina modificado

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(375)

<400> 27

5 <210> 28

<211> 124

<212> PRT

<213> artificial

10 <220>

<223> Constructo sintético

<400> 28

<210> 29

<211> 375

<212> ADN 5 <213> artificial

<220>

<223> gen de resistencia a zeocina modificado

10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(375)

<210> 30

<211> 124

<212> PRT 20 <213> artificial

<220>

<223> Constructo sintético

25 <400> 30

5 <210> 31

<211> 1026

<212> ADN

<213> artificial

10 <220>

<223> gen de resistencia a higromicina modificado

<220>

<221> CDS 15 <222> (1)..(1026)

<400> 31

<210> 32

<213> artificial

<220>

<223> Constructo sintético 10

<400> 32

<210> 33

<211> 1026 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> gen de resistencia a higromicina modificado 10

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1026)

15 <400> 33

5 <210> 34

<211> 341

<212> PRT

<213> artificial

10 <220>

<223> Constructo sintético

<400> 34

<210> 35

<213> artificial

<220>

<223> secuencia del transposón Tol1-L 10

<400> 35

<210> 36 15 <211> 505

<212> ADN

<213> artificial

<220> 20 <223> secuencia del transposón Tol1-R

<400> 36 <210> 37

<211> 1855 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> transposón Tol1 no autólogo 10

<400> 37

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende:

   (i)

   introducir un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de CHO en suspensión que puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender unos codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se reduce y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2;

   (ii)

   integrar el fragmento génico que comprende el ADN que codifica la proteína de interés insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO;

   (iii) obtener una célula de CHO que expresa la proteína de interés; y

   (iv) cultivar en suspensión la célula de CHO.
2. 2. Procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende las etapas (A) y (B) siguientes:

   (A)

   una etapa de introducir simultáneamente los vectores de expresión (a) y (b) siguientes en una célula de CHO en suspensión que puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; integrar un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de CHO mediante una transposasa expresada de manera transitoria; y obtener una célula de CHO en suspensión que expresa la proteína de interés:

   (a)

   un vector de expresión que comprende el fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y comprende asimismo el par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender unos codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que se reduce el nivel de expresión en la célula de CHO y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2,

   (b)

   un vector de expresión que comprende un ADN que codifica la transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en el cromosoma,

   (B)

   una etapa de cultivar en suspensión la célula de CHO en suspensión que expresa la proteína de interés para producir la proteína de interés.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la célula de CHO en suspensión es cualquiera de las células seleccionadas de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.

4. 4.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gen marcador seleccionable es:

   (a)

   modificado en 10% o más de la secuencia de nucleótidos que codifica el gen marcador seleccionable antes de la modificación; y/o

   (b)

   modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA de entre los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen; y/o

   (c)

   modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de alanina son GCG de entre los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen; y/o

   (d)

   modificado de manera que todos los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen son TTA o todos los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen son GCG.

5. 5.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gen marcador seleccionable es un gen marcador seleccionable seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a

   zeocina y un gen de resistencia a blasticidina.

6. 6.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

   (a)

   las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol2 son la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID nº: 2 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID nº: 3; o

   (b)

   las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 son la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID nº: 35 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID nº: 36.

7. 7.

   Célula de CHO en suspensión que puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, en la que se introduce un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en la que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender unos codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que se reduce el nivel de expresión en la célula de CHO y en la que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2, y en la que el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón se integra en un cromosoma de la célula de CHO en suspensión y la célula de mamífero en suspensión produce la proteína de interés.

8. 8.

   Célula de CHO en suspensión que puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero, que presenta un cromosoma en el que se integra un fragmento génico insertado entre un par de transposones y que produce una proteína de interés y que puede obtenerse introduciendo simultáneamente los vectores (a) y (b) siguientes:

   (a)

   un vector de expresión de proteínas que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y un gen marcador seleccionable atenuado y comprende asimismo el par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en la que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender unos codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se reduce y en la que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2,

   (b)

   un vector de expresión que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en el cromosoma.

9. 9.

   Célula de CHO según la reivindicación 7 u 8, que es cualquiera de las células seleccionadas de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 o CHO-S.

10. 10.

    Célula de CHO según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que el gen marcador seleccionable es:

    (a)

    modificado en 10% o más de la secuencia de nucleótidos que codifica el gen marcador seleccionable antes de la modificación; y/o

    (b)

    modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA de entre los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen; y/o

    (c)

    modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de alanina son GCG de entre los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen; y/o

    (d)

    modificado de manera que todos los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen son TTA o todos los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen son GCG.

11. 11.

    Célula de CHO según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que:

    (a)

    el gen marcador seleccionable es un gen marcador seleccionable seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a zeocina y un gen de resistencia a blasticidina; y/o

    (b)

    (i)

    las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol2 son la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 2 y la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 3; o

    (ii)

    las secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 son la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 35 y la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 36.

12. 12.

    Vector de expresión, que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un marcador seleccionable atenuado, y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en el que el gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable modificado para codificar la misma secuencia de aminoácidos que el gen marcador seleccionable antes de la modificación y para comprender codones utilizados a una frecuencia baja en la célula de CHO de manera que el nivel de expresión en la célula de CHO se reduce y en el que el par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos derivadas de un par de transposones Tol1 o Tol2.

13. 13.

    Vector de expresión según la reivindicación 12, en el que:

    (a)

    el par de secuencias de transposón derivadas de un par de transposones Tol2 son la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 2 y la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 3; o

    (b)

    el par de secuencias de transposón derivadas de un par de transposones Tol1 son la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº: 35 y la secuencia de nucleótidos representada en la SEC ID nº:

14. 36.

15. 14.

    Vector según la reivindicación 12 o 13, en el que el gen marcador seleccionable es:

    (a)

    modificado en 10% o más de la secuencia de nucleótidos que codifica el gen marcador seleccionable antes de la modificación; y/o

    (b)

    modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de leucina son TTA de entre los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen; y/o

    (c)

    modificado de manera que 70% o más de los codones correspondientes al residuo de alanina son GCG de entre los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen; y/o

    (d)

    modificado de manera que todos los codones correspondientes al residuo de leucina incluidos en el gen son TTA o todos los codones correspondientes al residuo de alanina incluidos en el gen son GCG.

16. 15.

    Vector según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el gen marcador seleccionable es un gen marcador seleccionable seleccionado de entre el grupo que consiste en un gen de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a zeocina y un gen de resistencia a blasticidina.