CN114395584A - 表达方法 - Google Patents
表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114395584A CN114395584A CN202111508425.XA CN202111508425A CN114395584A CN 114395584 A CN114395584 A CN 114395584A CN 202111508425 A CN202111508425 A CN 202111508425A CN 114395584 A CN114395584 A CN 114395584A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- expression
- host cell
- poly
- secretion leader
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 61
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 41
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102100021579 Enhancer of filamentation 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000898310 Homo sapiens Enhancer of filamentation 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 6
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 claims 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 58
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 7
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 4
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013197 protein A assay Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000699679 Cricetulus migratorius Species 0.000 description 3
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 1
- QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N Ala-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O QKHWNPQNOHEFST-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N Ala-Val-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NLYYHIKRBRMAJV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100039702 Alcohol dehydrogenase class-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N Gly-Thr-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FFJQHWKSGAWSTJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000890996 Rattus norvegicus Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- JOQSQZFKFYJKKJ-GUBZILKMSA-N Val-Arg-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N JOQSQZFKFYJKKJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 101150064029 bi gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 150000002013 dioxins Chemical class 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 108010051015 glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=CC(O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N phosphono 2,3-dihydroxypropanoate Chemical compound OCC(O)C(=O)OP(O)(O)=O KCRZDTROFIOPBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本申请涉及表达方法。具体而言,本申请提供了生产靶多肽的方法。该方法包括表达在宿主细胞中,优选在哺乳动物细胞中表达靶多肽的表达载体,以及回收该靶多肽,所述表达载体包括表达盒,该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列可操作地连接的重组多肽的多核苷酸。
Description
本申请为分案申请,原申请的申请日为2014年4月29日,申请号为201480024993.4(PCT/GB2014/000165),发明名称为“表达方法”。
技术领域
本发明涉及表达重组多肽,特别是分泌重组多肽的方法。
背景技术
如果目的多肽可以从它在其中表达的细胞中输出,这在重组多肽的生产中是明显有益的。因此,将表达系统有利地设计成使得这样的输出或分泌可行。从宿主细胞中分泌重组多肽通常涉及信号肽的使用,所述信号肽存在于注定用于从细胞质中输出的大多数真核生物和原核生物蛋白质中。用于这样的表达系统中的分泌前导区通常对于表达宿主而言是天然的,例如,大肠杆菌的PhoA、MalB和OmpA信号肽已经广泛用于将多肽分泌到该生物体的胞外周质中。
US7,071,172描述了用于基因治疗的基于AAV的递送载体中的纤连蛋白分泌前导区的用途。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了生产靶多肽的方法,所述方法包括:
a)表达在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体,该表达载体包括表达盒,所述表达盒包括编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作地连接的重组多肽的多核苷酸;和
b)回收靶多肽。
可以用于本发明的纤连蛋白前导区包括哺乳动物和爬行动物纤连蛋白分泌前导区。爬行动物纤连蛋白分泌前导区的实例包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)纤连蛋白分泌前导区。哺乳动物纤连蛋白分泌前导区的实例包括人,大鼠,鼠,牛,猪,犬,猫和中国仓鼠纤连蛋白分泌前导区,和其功能等同物,例如具有序列MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA(SEQ IDNo.1)的人纤连蛋白分泌前导区。在某些实施方案中,优选具有氨基酸序列MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA(SEQ ID No.2)的中国仓鼠纤连蛋白分泌前导区和其功能等同物。
分泌前导区的功能等同物是与氨基酸序列共享70%或更大同一性,优选75%或更大同一性,更优选80%或更大同一性,和最优选90%或更大同一性,如95%或更多,并且保留了分泌重组多肽的能力的氨基酸序列。在一些实施方案中,功能等同的分泌前导区通过任何加入,缺失或替代而相差单个氨基酸。
在许多实施方案中,可操作地连接的多核苷酸序列是相邻接的,并且在分泌前导区的情况下,是邻接的并且在同一个读码框内。
优选地,编码纤连蛋白分泌前导区的多核苷酸和编码靶多肽的多核苷酸之间的连接为分泌前导区连接于重组多肽的N末端。在某些实施方案中,重组多肽包含N末端标签,分泌前导序列和编码重组多肽的多核苷酸之间的连接,其中分泌前导区附着于标签,优选附着于标签的N末端。
编码纤连蛋白分泌前导序列的多核苷酸优选地连接于编码靶多肽的多核苷酸的5’末端,并且优选具有序列ATGCTGAGAGGCCCTGGACCTGGACTGCTGCTGCTGGCTGTGCAGTGTCTGGGAACCGCCGTGCCTTCTACCGGCGCC(SEQ ID No.3)或ATGCTCAGGGGTCCGGGACCCGGGCTGCTGCTGGCCGTCCTGTGCCTGGGGACAGCGGTGCGCTGTACCGAAGCC(SEQ ID No.4)。
本发明的载体包括与分泌前导区和重组多肽的表达盒可操作地连接的启动子。
根据表达盒要在其中表达的宿主细胞来选择可以用于本发明的载体的启动子。
可以用于原核生物宿主细胞中的启动子包括噬菌体聚合酶启动子,如单个T7启动子区,包括由Studier和Moffat,在J.Mol.Biol.189:113-130(1986)中公开的那些,其通过引用并入本文之中,尤其是T7基因10启动子区和宿主聚合酶启动子,特别是大肠杆菌聚合酶启动子,如T7A1、T7A2、T7A3、λpL、λpR、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA和rrnB。
当利用T7 RNA-聚合酶依赖性启动子区时,会认识到的是需要T7 RNA聚合酶源,其通过本领域已知的方法来提供,并且通常通过向宿主菌株插入表达所需的噬菌体聚合酶的λDE3原噬菌体,以产生产噬的宿主菌株而提供。T7 RNA聚合酶也可以通过用携带T7RNA聚合酶的基因的特化的λ转导噬菌体感染而递送到细胞。
可以用于酵母宿主细胞的启动子包括gal启动子和AOX启动子,如AOX1和AOX2、GAP(甘油醛3-磷酸脱氢酶)、FLP(甲醛脱氢酶)和GAL1和GAL10。
可以用于哺乳动物宿主细胞的启动子对于宿主细胞而言是内源性的或外源性的。合适的启动子包括病毒启动子如CMV,SV40启动子和RSR-LTR。也可以使用来自管家基因的启动子如hEF1α和鼠磷酸甘油酸激酶(mPGK)的启动子。在一些实施方案中,优选的启动子是人CMV和大鼠CMV。如果一个以上的多肽要表达(例如MAbHC和LC多肽),启动子可以相同或不同。启动子可以与增强子序列组合使用,所述增强子例如巨细胞病毒,特别是人巨细胞病毒的主要即时早期增强子。
可以将表达载体整合进宿主细胞基因组或包含于染色体外元件如质粒。
表达载体通常也含有对于该载体要在其中表达的宿主细胞合适的选择性标志物。用于原核宿主细胞的选择性标志物包括抗生素抗性标志物,如四环素或卡那霉素抗性标志物。用于酵母宿主中的选择性标志物包括抗生素抗性标志物,如Zeocin、嘌呤霉素、新霉素和潮霉素抗性。用于哺乳动物细胞,特别是中国仓鼠卵巢细胞的选择性标志物包括谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶标志物系统。
所使用的载体包括本领域常规的适于在合适的宿主细胞中表达的特征。原核表达载体通常包括复制原点,限制性酶位点,转录终止子和质粒稳定性基因座,如cer稳定性序列。酵母表达载体通常包括启动子,转录终止子,选择标志物,和如果复制,包括复制原点。哺乳动物表达载体通常包括聚腺苷酸化序列,如人β珠蛋白聚A序列,牛生长激素聚A序列,和SV40早期或晚期聚A序列。
本发明的表达载体可以用于在宿主细胞内表达重组多肽,特别是蛋白质。可以利用原核生物,特别是真核生物的宿主细胞。原核生物细胞的实例包括细菌细胞,例如革兰氏阴性细菌细胞,包括大肠杆菌(E.coli),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium),粘质沙雷菌(Serratia marsescens),恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),和革兰氏阳性细菌细胞,包括枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。优选的原核宿主细胞是细菌,特别是肠细菌,优选地大肠杆菌,特别是它的B或K12菌株。
可以利用的真核宿主细胞的实例包括酵母,哺乳动物和昆虫细胞。酵母宿主细胞特别包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和多形汉森酵母(Hansenula polymorpha).
优选的宿主细胞是哺乳动物细胞,如婴仓鼠肾细胞,人胚胎肾细胞系,例如HEK293细胞,人视网膜来源细胞系,例如PER C6细胞,和鼠淋巴样细胞系,例如NS0和SP2细胞。并且最优选的是中国仓鼠卵巢细胞,并具体为CHOK1,DG44,DUXKB11和CHOpro3-细胞。
本发明的表达载体通常以质粒形式使用。质粒可以是自主复制型质粒或整合型质粒。
在本发明的某些高度优选的实施方案中,对应于所使用的宿主细胞选择纤连蛋白分泌前导区。例如,在来源于人类的细胞中使用人纤连蛋白,在大鼠细胞中使用大鼠纤连蛋白,特别是在中国仓鼠卵巢细胞中使用中国仓鼠纤连蛋白。
通过本发明的方法可以表达的多肽包括治疗性蛋白质和肽,其包括细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、免疫球蛋白样多肽、酶、疫苗、肽激素、趋化因子、受体、受体片段、激酶、磷酸酶、异构酶、水解酶、转录因子和融合多肽。
可以表达的抗体包括单克隆抗体,多克隆抗体和具有生物活性的抗体片段,其包括前面所述的任一项的多价和/或多特异性形式。
天然存在的抗体通常包括四个多肽链,通过二硫键内部连接的两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)。每条重链包括可变区(VH)和恒定区(CH),所述CH区以其天然形式包含三个区域,CH1,CH2和CH3。每条轻链包括可变区(VL)和包括一个结构域的恒定区,CL。
VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变性的区域,其散置于被称为框架区域(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL包含三个CDRs和四个FRs,其从氨基末端至羧基末端以下面的顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
可以表达的抗体片段包括完整抗体的一部分,所述部分具有所需的生物学活性。抗体片段通常包括至少一个抗原结合位点。抗体片段的实例包括:(i)具有VL,、CL、VH和CH1结构域的Fab片段,;(ii)Fab衍生物,例如在CH1结构域的C末端有一个或多个半胱氨酸残基的Fab’片段,其可以在两个Fab衍生物之间通过二硫键形成二价片段;(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段;(iv)Fd衍生物,如在CH1结构域的C末端有一个或多个半胱氨酸残基的Fd衍生物;(v)具有抗体的一个单臂的VL和VH结构域的FV片段;(vi)单链的抗体分子,如其中VL和VH结构域是共价连接的单链FV(scFv)抗体;(vii)与有或没有恒定区结构域的另一个可变区结构域(VH或VL结构域多肽)连接的没有恒定区结构域的VH或VL结构域多肽(例如VH-VH、VH-VL或VL-VL);(viii)结构域抗体片段,例如由VH结构域或VL结构域以及VH或VL结构域的抗原结合片段,例如分离的CDR区域组成的片段;(ix)所谓的“二体”,其包括两个抗原结合位点,例如在同一多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH);和(x)所谓的线性抗体,其包括一对串联的Fd片段,所述的Fd片段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
可以制备的优选的抗体片段是哺乳动物单一可变结构域抗体,其为含有折叠的多肽结构域的抗体片段,所述的折叠的多肽结构域含有免疫球蛋白可变结构域特有的序列,并且其特异性地结合抗原(即,解离常数为500nM或更少,如400nM或更少,优选地250nM或更少,最优选地100nM或更少),并且其作为单一可变结构域结合抗原,即没有任何互补的可变结构域。单一可变结构域抗体包括完整的抗体可变结构域,和经修饰的可变结构域(例如,其中一个或多个环已经被不是抗体可变结构域特有的序列所替代,或者已经被截断的或含有N-或C末端延伸的抗体可变结构域),以及可变结构域的折叠片段。可以制备的优选单一可变结构域选自VH和VL,其包括Vkappa和Vlambda。最优选地,单一可变结构域是人或骆驼(camelid)的结构域,其包括人源化骆驼的结构域。
当靶多肽含有待分泌的两个或更多个链时,特别是当靶多肽是包括两条或多条链的抗体或抗体片段时,至少一条或优选地各条链都连接到纤连蛋白分泌前导区,并且相应地设计编码这种多肽的多核苷酸。所使用的纤连蛋白分泌前导区可以是相同的或不同的。编码两条或多条链的多核苷酸可以包括在相同的表达盒中,但优选地包括在不同的表达盒中。当利用不同的表达盒时,表达盒可以位于不同的载体上,但优选位于相同的载体上。利用的启动子可以相同或不同。
表达系统是针对所使用的细胞通过本领域周知的方法而表达。优选的表达方法包括在生长培养基中培养宿主细胞,然后回收表达的多肽。术语“生长培养基”指用于生长宿主细胞的营养培养基。在许多实施方案中,利用了营养溶液。对于给定的宿主细胞的合适的生长培养基和回收多肽的方法是本领域周知的。
在许多实施方案中,多肽回收包括过滤,离心,渗滤,离子交换层析,亲和层析,如蛋白质A亲和层析、疏水相互作用层析(HIC)、凝胶过滤和HPLC中的一种或多种。
根据本发明的优选的方面,提供了生产靶多肽的方法,该方法包括:
(a)用在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体转染或转化宿主细胞,所述表达载体包括表达盒,该表达盒包括编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作地连接的靶多肽的多核苷酸;
(b)在允许宿主细胞的增殖和让靶多肽从宿主细胞表达和分泌的条件下培养宿主细胞,
(c)和回收靶多肽。
根据本发明的其它方面,提供了中国仓鼠卵巢细胞,优选CHOK1、DG44、DUXKB11或CHOpro3-细胞,其用含有表达盒的表达载体转染,该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列或其功能等同物可操作地连接的靶多肽的多核苷酸。
在本发明的其它方面中编码的靶多肽优选包括单克隆抗体。可以利用含有编码单克隆抗体的重链和轻链二者并且优选二者各自与纤连蛋白分泌前导区可操作地连接的多核苷酸的表达盒。在一些实施方案中,利用分开的含有重链和轻链的的表达盒,其可以位于分开的载体上,但经常位于同一载体上。利用的纤连蛋白分泌前导区可以是相同的或不同的,但优选地是相同的。
在许多优选的实施方案中,表达盒包括管家基因启动子,特别是与编码靶多肽的多核苷酸可操作地连接的hEF1α启动子,并且当利用两个或更多个表达盒时,每个表达盒包括管家基因启动子,优选相同启动子,最优选hEF1α启动子。
这个或各个靶多肽的表达盒优选地包括牛生长激素聚A序列。
表达载体优选地包括选择标志物,最优选二氢叶酸还原酶标志物系统。在某些情况中,二氢叶酸还原酶标志物系统包括进一步含有鼠磷酸甘油酸激酶启动子的表达盒。
包括含有在哺乳动物细胞中有效的启动子的表达盒和编码与纤连蛋白分泌前导序列可操作地连接的靶多肽的多核苷酸的DNA构建体构成本发明的另一方面。
DNA构建体优选地包括用于单克隆抗体的重链和轻链的分开的表达盒。最优选地,每个表达盒包括相同的启动子,特别是管家基因启动子,最特别的是hEF1α启动子。特别优选的是,每个表达盒进一步包括牛生长激素聚A序列。DNA构建体常常有利地包括选择标志物,最优选二氢叶酸还原酶标志物系统。在某些情况下,二氢叶酸还原酶的标志物系统包括进一步含有鼠磷酸甘油酸激酶启动子的表达盒。
附图说明
图1显示了本发明的表达盒的结构。
具体实施方式
通过下面的实施例来非限制地说明本发明。
实施例1
对于待评估的每个分泌前导区(SL),构建了两个单基因载体,其含有抗MUC-1 MAb的hγ1FL重链(HC)或抗MUC-1 MAb的λ轻链(LC)。每个表达盒由与编码分泌前导区的多核苷酸序列功能性地连接的大鼠CMV启动子组成,所述分泌前导区连接到编码HC或LC成熟多肽的多核苷酸序列和人β珠蛋白聚A序列的阅读框中。表达盒的结构在图1中说明。
利用的分泌前导区如下:
分泌前导区A:人胶原蛋白,序列为MLSFVDTRTLLLLAVTLCLATCQS(SEQ ID No.5)
分泌前导区B:人纤连蛋白,序列为MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA(SEQ ID No.1)
分泌前导区C:中国仓鼠纤连蛋白,序列为MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA(SEQ IDNo.2)
分泌前导区D:中国仓鼠白蛋白,序列为MKWVTFLLLLFVSDSAFS(SEQ ID No.6)
对CHODG44宿主细胞计数,在6孔平板的孔中,以1.2×106个细胞/孔将细胞接种到补充有10%血清,2mM谷氨酰胺和0.45%葡萄糖的MEM-α培养基中,在36.5℃,7.5%CO2下过夜温育。
对于每个转染,将4μg的HC和LC单基因载体(2μg)混合在一起,稀释于250微升的无血清的MEM-α培养基(Life Technologies)中。也包括了一个模拟转染(只有PBS)。对于每个转染,在250微升无血清MEM-а培养基中稀释12.5微升Lipofectamine 2000(LifeTechnologies)并混合。在室温(15-25℃)下温育该混合物5分钟。合并稀释的DNA和Lipofectamine 2000TM试剂,混合,并在室温下温育20分钟。加入另外的500微升MEM-а培养基到每个转染混合物中,从孔中除去生长培养基,然后将该复合物加入到含有细胞的6孔平板的孔中。在5小时后,去除培养基,加入新的生长培养基。在36.5℃,7.5%CO2温育细胞5天。获得上清液,通过离心澄清化。用Octet(Forte Bio)蛋白质A测定法确定抗体效价。
在下面的表1中给出了结果。
表1
所使用的分泌前导区 | 平均抗体效价(mg/l) |
A | 2.91 |
B | 7.79 |
C | 8.85 |
D | 1.89 |
产生的抗体通过蛋白质A捕获从上清液中回收,通过阳离子交换层析,接着阴离子交换层析在低pH洗脱并纯化。将来自阴离子交换层析的洗脱液进行病毒纳米过滤,接着缓冲液交换和浓缩。
实施例2
载体构建
构建双基因载体,其含有驱动抗-MUC-1 MAb的hγ1FL重链和抗MUC-1 MAb的人λ轻链两者表达的hEFlα启动子。
构建其它双基因启动子,其中将hEF1α启动子替换为hCMV-MIE启动子或大鼠CMV启动子。
在双基因载体中的各表达盒由与编码实施例1的CHO纤连蛋白信号肽的多核苷酸序列功能性连接的启动子组成,该编码实施例1的CHO纤连蛋白信号肽的多核苷酸序列连接在编码HC或LC成熟多肽的多核苷酸序列的阅读框中。通过牛生长激素聚A序列的存在保证正确的mRNA加工。
为了允许选择稳定的细胞系,该载体还含有处于鼠磷酸甘油酸(mPGK)启动子控制下的鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和处于胸腺嘧啶激酶(TK)启动子控制下的潮霉素抗性基因的拷贝。
CHO DG44细胞的常规亚培养
将CHO DG44细胞在悬浮液振摇烧瓶中常规培养于补充有8mM L-谷氨酰胺和1×HT补充液(Life Technologies)的EX-CELLACF CHO培养基(Sigma)中。以2x105个细胞/毫升的浓度接种细胞,每3天将细胞分板。烧瓶在37℃,7.5%CO2下于一个轨道振荡培养箱中,以140rpm培养。
稳定的细胞系传代转染
如上文详述,用于转染的细胞在细胞悬浮培养基中生长。将来自生长培养基的细胞离心,并重悬至2x107细胞/毫升的浓度。将0.1mL体积的细胞悬浮液和4微克的线性化质粒DNA加入电穿孔杯中。然后将小杯放于Amaxa核转染仪(Lonza)中,进行核转染。在转染后,将细胞加入到T75烧瓶中的补充有8mM谷氨酰胺和1x HT补充剂的20ml预热的EX-CELL ACFCHO培养基(Sigma)中。转染细胞在37℃,7.5%CO2下温育。在从培养基中除去次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)(转染后48小时),并且加入400微克/毫升潮霉素B(Invitrogen)和25nM MTX细胞(转染后144小时)后,将细胞以5000个细胞/孔(2.5x104/mL)铺入96孔的平板。在37℃,在空气中7.5%CO2的气氛中温育平板。在直至转染后约3星期时针对集落生长监测平板。收获来自多至100个含有细胞生长的孔中的上清液,使用Octet(Forte Bio)蛋白质A测定法针对抗体分析。将最高的24个表达集落扩展入24孔平板,培养10天。然后,使用Octet(ForteBio)蛋白质A测定法针对抗体测定上清液。结果在下面的表2中给出。
表2
实施例3
从CHO上清液中纯化抗体
利用蛋白质A树脂纯化来自利用实施例2中所述的hEF1α启动子双基因载体产生的重组CHO DG44细胞系的上清液。将350mL澄清化的收获物装载到含有MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare)的预装的柱上。首先用20mM的磷酸钠,1MNaCl(pH 7.0),然后用20mM的磷酸钠(pH 7.0)洗涤树脂。然后用100mM的乙酸洗脱抗体。使用Octet(Forte Bio)蛋白质A测定法定量回收的产物,并示于表3中。
表3
体积(mL) | 浓度(mg/mL) | |
澄清化的收获物 | 350 | 1.3 |
洗脱的抗体 | 50.55 | 7.7 |
<110> 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司
<120> 表达方法
<130> BIL 81024/WO
<160> 6
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人类
<400> 1
Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys
1 5 10 15
Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala
20 25
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 灰仓鼠
<400> 2
Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Ala Val Leu Cys Leu
1 5 10 15
Gly Thr Ala Val Arg Cys Thr Glu Ala
20 25
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> 人类
<400> 3
atgctgagag gccctggacc tggactgctg ctgctggctg tgcagtgtct gggaaccgcc 60
gtgccttcta ccggcgcc 78
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 灰仓鼠
<400> 4
atgctcaggg gtccgggacc cgggctgctg ctggccgtcc tgtgcctggg gacagcggtg 60
cgctgtaccg aagcc 75
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人类
<400> 5
Met Leu Ser Phe Val Asp Thr Arg Thr Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Ala Thr Cys Gln Ser
20
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 灰仓鼠
<400> 6
Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Asp Ser Ala
1 5 10 15
Phe Ser
Claims (10)
1.生产靶重组多肽的方法,其包括:
(a) 在CHO宿主细胞中表达用于表达靶重组多肽的表达载体,所述表达载体包括表达盒,该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列可操作地连接的所述靶重组多肽的多核苷酸;和
(b) 回收所述靶重组多肽。
2.生产靶多肽的方法,其包括:
(a) 用在宿主细胞中表达靶多肽的表达载体转染或转化CHO宿主细胞,该表达载体含有表达盒,该表达盒含有编码与纤连蛋白分泌前导序列可操作地连接的所述靶多肽的多核苷酸;
(b) 在允许所述宿主细胞增殖和从所述宿主细胞中表达和分泌所述靶多肽的条件下培养所述宿主细胞;和
(c) 回收所述靶多肽。
3.根据前述任一权利要求所述的方法,其中选择所述纤连蛋白分泌前导序列以对应于所述宿主细胞。
4.根据前述任一权利要求所述的方法,其中所述表达盒包括hEF1α启动子。
5.根据前述任一权利要求所述的方法,其中所述表达盒包括聚A序列。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述聚A序列选自人β珠蛋白聚A、牛生长激素聚ASV40早期或晚期聚A序列。
7.根据前述任一权利要求所述的方法,其中所述纤连蛋白分泌前导序列具有序列MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA或与MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA具有90%序列同一性并保留分泌所述靶多肽的能力的序列。
8.根据前述任一权利要求所述的方法,其中利用了两个表达盒,一个表达盒含有编码单克隆抗体的轻链的多核苷酸,第二个表达盒含有编码单克隆抗体重链的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述两个表达盒包括相同的启动子、分泌前导序列和聚A序列。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述启动子是hEF1α启动子,所述纤连蛋白分泌前导序列是中国仓鼠纤连蛋白分泌前导序列,所述聚A序列是牛β珠蛋白聚A序列。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1308017.1 | 2013-05-03 | ||
GB201308017A GB201308017D0 (en) | 2013-05-03 | 2013-05-03 | Expression process |
GB1320339.3 | 2013-11-18 | ||
GB201320339A GB201320339D0 (en) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | Expression Process |
PCT/GB2014/000165 WO2014177826A1 (en) | 2013-05-03 | 2014-04-29 | Expression process |
CN201480024993.4A CN105392889A (zh) | 2013-05-03 | 2014-04-29 | 表达方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480024993.4A Division CN105392889A (zh) | 2013-05-03 | 2014-04-29 | 表达方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114395584A true CN114395584A (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=50639794
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111508425.XA Pending CN114395584A (zh) | 2013-05-03 | 2014-04-29 | 表达方法 |
CN201480024993.4A Pending CN105392889A (zh) | 2013-05-03 | 2014-04-29 | 表达方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480024993.4A Pending CN105392889A (zh) | 2013-05-03 | 2014-04-29 | 表达方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9873891B2 (zh) |
EP (1) | EP2992104B1 (zh) |
JP (1) | JP6545153B2 (zh) |
KR (1) | KR102180660B1 (zh) |
CN (2) | CN114395584A (zh) |
BR (1) | BR112015027373A2 (zh) |
CA (1) | CA2910877C (zh) |
DK (1) | DK2992104T3 (zh) |
ES (1) | ES2732907T3 (zh) |
RU (1) | RU2731717C2 (zh) |
SG (1) | SG11201508447TA (zh) |
WO (1) | WO2014177826A1 (zh) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3323826A1 (en) * | 2016-11-21 | 2018-05-23 | Danmarks Tekniske Universitet | Native chinese hamster ovary cell secretion signal peptides for production of recombinant polypeptides |
CN111465686B (zh) | 2017-12-11 | 2024-03-22 | 富士胶片株式会社 | 动物细胞、动物细胞的制造方法及靶蛋白的制造方法 |
JP7123168B2 (ja) | 2018-12-11 | 2022-08-22 | 富士フイルム株式会社 | 動物細胞、動物細胞の製造方法および目的タンパク質の製造方法 |
CN109837277A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-06-04 | 深圳生生凡非基因技术有限公司 | 一种cpgk嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用 |
JP7352650B2 (ja) | 2019-11-29 | 2023-09-28 | 富士フイルム株式会社 | 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体 |
WO2022149607A1 (ja) | 2021-01-07 | 2022-07-14 | 富士フイルム株式会社 | 細胞の選択方法、装置、及び装置システム |
EP4310175A1 (en) | 2021-03-17 | 2024-01-24 | FUJIFILM Corporation | Cell culturing method, and method for producing useful substance |
CN112980852B (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-13 | 北京华芢生物技术有限公司 | 新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因及其应用 |
IL308766A (en) | 2021-05-27 | 2024-01-01 | Janssen Biotech Inc | Compositions and methods for treating prostate cancer |
JPWO2023054556A1 (zh) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | ||
WO2023112952A1 (ja) | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 富士フイルム株式会社 | 生産物の製造方法、及び細胞培養装置 |
WO2023238949A1 (ja) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | 富士フイルム株式会社 | 細胞の作出方法、ヘテロ多量体タンパク質の製造方法、バイスペシフィック抗体の製造方法、ベクターセット、哺乳動物細胞、cho細胞、及び細胞プールの作出方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003093295A2 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-13 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Secretion signal vectors |
CN102449153A (zh) * | 2009-03-27 | 2012-05-09 | 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 | 表达方法 |
CN102690834A (zh) * | 2006-02-03 | 2012-09-26 | 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 | 表达系统 |
WO2012173344A2 (ko) * | 2011-06-13 | 2012-12-20 | 주식회사종근당 | Csp-b 5'-sar 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7186699B2 (en) * | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
US8029783B2 (en) * | 2005-02-02 | 2011-10-04 | Genentech, Inc. | DR5 antibodies and articles of manufacture containing same |
EP1739179A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
RU2466189C2 (ru) * | 2006-12-28 | 2012-11-10 | Сентокор Орто Байотек Инк. | ВЕКТОР ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ПОЛИПЕПТИДОВ С СИАЛИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ОБЕСПЕЧЕНИЯ СИАЛИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК И СПОСОБ РЕГУЛИРОВАНИЯ СВОЙСТВ Fc-СОДЕРЖАЩИХ МОЛЕКУЛ, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ В ЛИНИИ КЛЕТОК |
KR101618767B1 (ko) * | 2008-09-02 | 2016-05-09 | 한국생명공학연구원 | 외래단백질을 고효율로 생산하는 리더서열 |
ES2740051T3 (es) * | 2008-12-31 | 2020-02-05 | Bharat Serums & Vaccines Ltd | Anticuerpos monoclonales anti-RHD |
RU2015132478A (ru) | 2009-03-05 | 2015-12-10 | Эббви Инк. | Связывающие il-17 белки |
-
2014
- 2014-04-29 EP EP14721474.6A patent/EP2992104B1/en active Active
- 2014-04-29 CN CN202111508425.XA patent/CN114395584A/zh active Pending
- 2014-04-29 SG SG11201508447TA patent/SG11201508447TA/en unknown
- 2014-04-29 CA CA2910877A patent/CA2910877C/en active Active
- 2014-04-29 DK DK14721474.6T patent/DK2992104T3/da active
- 2014-04-29 RU RU2015151626A patent/RU2731717C2/ru active
- 2014-04-29 KR KR1020157032562A patent/KR102180660B1/ko active IP Right Grant
- 2014-04-29 ES ES14721474T patent/ES2732907T3/es active Active
- 2014-04-29 BR BR112015027373A patent/BR112015027373A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-04-29 US US14/787,669 patent/US9873891B2/en active Active
- 2014-04-29 JP JP2016511126A patent/JP6545153B2/ja active Active
- 2014-04-29 CN CN201480024993.4A patent/CN105392889A/zh active Pending
- 2014-04-29 WO PCT/GB2014/000165 patent/WO2014177826A1/en active Application Filing
-
2017
- 2017-12-12 US US15/838,868 patent/US11306323B2/en active Active
-
2022
- 2022-03-15 US US17/694,760 patent/US20220213500A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003093295A2 (en) * | 2002-04-30 | 2003-11-13 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Secretion signal vectors |
CN102690834A (zh) * | 2006-02-03 | 2012-09-26 | 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 | 表达系统 |
CN102449153A (zh) * | 2009-03-27 | 2012-05-09 | 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 | 表达方法 |
WO2012173344A2 (ko) * | 2011-06-13 | 2012-12-20 | 주식회사종근당 | Csp-b 5'-sar 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6545153B2 (ja) | 2019-07-17 |
WO2014177826A1 (en) | 2014-11-06 |
RU2731717C2 (ru) | 2020-09-08 |
CA2910877C (en) | 2021-08-03 |
CA2910877A1 (en) | 2014-11-06 |
US11306323B2 (en) | 2022-04-19 |
ES2732907T3 (es) | 2019-11-26 |
EP2992104A1 (en) | 2016-03-09 |
JP2016517691A (ja) | 2016-06-20 |
DK2992104T3 (da) | 2019-07-15 |
US20220213500A1 (en) | 2022-07-07 |
EP2992104B1 (en) | 2019-04-17 |
RU2015151626A3 (zh) | 2018-03-20 |
KR20160003705A (ko) | 2016-01-11 |
US9873891B2 (en) | 2018-01-23 |
CN105392889A (zh) | 2016-03-09 |
US20160076051A1 (en) | 2016-03-17 |
RU2015151626A (ru) | 2017-06-08 |
SG11201508447TA (en) | 2015-11-27 |
KR102180660B1 (ko) | 2020-11-19 |
US20180127777A1 (en) | 2018-05-10 |
BR112015027373A2 (pt) | 2017-08-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220213500A1 (en) | Expression Process | |
WO2006069403B1 (en) | Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins | |
SG182953A1 (en) | Recombinant expression vector elements (reves) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells | |
US10227595B2 (en) | Universal protein overexpression tag comprising ramp function, and application thereof | |
JP2018108094A (ja) | 産生細胞株エンハンサー | |
CA3009880A1 (en) | Peptide tag and tagged protein including same | |
CA3141039A1 (en) | Mammalian cell lines with sirt-1 gene knockout | |
KR102647165B1 (ko) | 생물 제제 생산을 위한 범용 자체 조절 포유동물 세포주 플랫폼 | |
US9845475B2 (en) | Expression vector | |
EP1678308B1 (en) | Expression vector for secreting antibody fragment using e. coli signal sequence and method for mass-producing antibody fragment | |
JP6188574B2 (ja) | 発現プロセス | |
JP7410983B2 (ja) | Cre mRNAを使用した標的指向性組込みによるタンパク質発現細胞の作製のための方法 | |
RU2682884C2 (ru) | Оптимизированная экспрессионная кассета для экспрессии полипептида с высоким выходом | |
EP1957660B1 (en) | Materials and methods to increase peptide chain expression | |
WO2008035463A1 (fr) | Procédé de commutation de classe d'anticorps | |
WO2015033086A1 (en) | Dna construct | |
WO2022107090A1 (en) | Expression technology for antibody constructs | |
CN116536359A (zh) | 一种表达载体及其在目的基因克隆或表达中的应用 | |
WO2020139855A2 (en) | Chimeric signal peptides for protein production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |