CN109837277A - 一种cpgk嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

一种cpgk嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用 Download PDF

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CN109837277A CN201910155588.0A CN201910155588A CN109837277A CN 109837277 A CN109837277 A CN 109837277A CN 201910155588 A CN201910155588 A CN 201910155588A CN 109837277 A CN109837277 A CN 109837277A
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吕斌
柳青慕
孙招金
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Abstract

本发明提供了一种CPGK嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用，所述CPGK嵌合型启动子包括CMV增强子与鼠源mPGK启动子，所述CMV增强子与鼠源mPGK启动子连接。采用本发明的技术方案，所述CPGK嵌合型启动子应用于rAAV载体后转染细胞，其序列在原核细胞和真核细胞中均稳定，而且外源基因的转录效率显著高于携带mPGK启动子的AAV载体。

Description

一种CPGK嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种CPGK嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-associated virus，简称AAV)因发现于腺病毒制品而得名。AAV是属于微小病毒科的一种依赖性病毒，包含多种血清型，基因组为单链DNA，需要其它病毒或辅助因素才能复制。在没有辅助因素时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中以潜伏状态存在，而不产生子病毒。随着对AAV病毒生活周期和相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。AAV载体具有安全程度高，无致病性；免疫原性低，基本不会引起机体免疫排斥和炎症反应，能保持持久的体内留存能力和表达能力；表达时程长，至少可以持续半年；靶向性强，可针对特异性器官工作的特点。由于上述特点，AAV载体逐渐成为了一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具，在2012年，欧洲药监局就已经批准基于AAV载体的脂蛋白酶基因治疗药物Glybera上市。
启动子是位于基因5’端的多聚脱氧核糖核苷酸序列，属于基因的一部分。其上有RNA聚合酶识别和结合位点，在基因转录时，可以与转录因子相互作用，控制基因表达的起始时间和表达量，因此启动子是细胞中高效表达基因的关键。根据启动子的转录模式可分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指在其调控下，不同组织、器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，哺乳动物常用的组成型启动子有病毒来源的鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子、猴空泡病毒SV40启动子和人基因组来源的EF1α启动子、泛素启动子(Ubiquitin，简称Ubi)、β-actin启动子及PGK-1启动子等。组织或器官特异性启动子是指在这类启动子的调控下，基因往往只在某些特定器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。哺乳动物常用的组织或器官特异性启动子有B29启动子(B细胞特异性)、CD14启动子(单个核细胞特异性)和CD43启动子(淋巴细胞及血小板特异性)等。诱导型启动子是指在某些特定信号刺激下，这种类型启动子可以大幅度地提高基因转录水平。常用诱导型启动子有基于四环素(Tet)系统的诱导型启动子(包括Tet-on或Tet-off)、脱皮激素类诱导系统的诱导型启动子、RU486诱导系统的诱导型启动子和纳巴霉素诱导系统的诱导型启动子等。
在AAV载体引入外源基因进行基因治疗时，维持外源基因的高效稳定表达非常重要。但一些天然组成型启动子由于表观修饰被抑制或天然活性相对较弱，难以满足需求。因而，研究人员又设计开发了一类人工合成的嵌合型启动子，主要包含能发挥稳定表达作用的启动子核心序列和能增强表达效率的上游增强子或下游内含子，如CAG启动子就是人工将CMV增强子(CMV enhancer)、鸡β-肌动蛋白启动子(chicken beta actin promoter)和兔β-珠蛋白剪接受体拼接组装而成的嵌合型启动。由此可见，开发可用于AAV载体并在细胞内广谱高效表达外源基因且序列稳定即不会在原核细胞和真核细胞转移过程中发生序列丢失的启动子对于引入外源基因进行基因治疗是十分必要的。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种CPGK嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用，采用包含CPGK嵌合型启动子的腺相关病毒载体转染细胞后，显著提高了外源基因的转录效率，其转录效率显著高于转染携带mPGK启动子的AAV载体的细胞。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种CPGK嵌合型启动子，其包括CMV增强子与鼠源mPGK启动子，所述CMV增强子与鼠源mPGK启动子连接。进一步的，所述CMV增强子位于鼠源mPGK启动子的上游。该CPGK嵌合型启动子用于腺相关病毒载体中。将其应用于AAV载体转染细胞后，下游基因的转录水平显著提高。
进一步的，采用重叠PCR技术(Overlap PCR)将CMV增强子与鼠源mPGK启动子两个元件进行连接。
进一步的，所述CMV增强子的序列如SEQ ID No.1所示，所述鼠源mPGK启动子的序列如SEQ ID No.2所示，所述CPGK嵌合型启动子的序列如SEQ ID No.3所示。
具体而言，CMV增强子286bp，序列如下：
CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG。
mPGK启动子500bp，序列如下：
GGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCG。
CPGK嵌合型启动子，786bp，序列如下：
CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCG。
本发明还公开了一种包含上述CPGK嵌合型启动子的腺相关病毒载体，其制备方法如下，包括以下步骤：
步骤S1，在所述CPGK嵌合型启动子和mPGK启动子的5’端设计KpnI内切酶位点，3’端设计BstXI内切酶位点；所述KpnI内切酶位点的序列如SEQ ID No.4所示，所述BstXI内切酶位点的序列如SEQ ID No.5所示；根据上述酶切位点序列设计PCR引物序列，并合成启动子引物；
其中，KpnI内切酶位点的序列为：GGTACC；BstXI内切酶位点的序列为：CCACCGCGGTGG；
启动子引物包括K-CMV引物和PGK-B引物。
K-CMV的序列如SEQ ID No.6所示，即为：
SEQ ID No.6：GGGGTACCCCCGTTACATAACTTACGGTA。
PGK-B的序列如SEQ ID No.8所示，即为：
SEQ ID No.8：CTGCAGAACCACCGCGGTGGCGAAAGGCCCGGAGATGAGG。
进一步的，采用PGK-overlap和CMV-overlap两条引物用于重叠PCR，引物采用商业公司合成。其中，PGK-overlap的引物序列如SEQ ID No.9所示，即为：
SEQ ID No.9：ATCGCTATTACCATGGGGTAGGGGAGGCGCTTT；
CMV-overlap的引物序列如SEQ ID No.10所示，即为：
SEQ ID No.10：AAAGCGCCTCCCCTACCCCATGGTAATAGCGAT。
步骤S2，以携带mPGK启动子和CMV增强子的质粒载体为模板，加入启动子引物，高保真酶PCR克隆KpnI-CPGK-BstXI脱氧核糖核酸片段，对PCR产物进行回收，对回收产物进行KpnI-BstXI双酶切，37℃酶切过夜，回收得到回收产物KpnI-BstXI双酶切粘性末端CPGK片段；
步骤S3，将步骤S2的回收产物与事先制备好的KpnI-BstXI双酶切的线性pAAV-EGFP载体进行混合连接；
步骤S4，将步骤S3得到的连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜；
步骤S5，进行菌落PCR鉴定；
步骤S6，将菌落PCR鉴定为阳性的克隆接种到含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，培养过夜；
步骤S7，提取质粒，然后进行KpnI-BstXI双酶切，37℃酶切过夜，1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并测序，得到包含CPGK嵌合型启动子的rAAV腺相关病毒载体。
进一步的，步骤S3中，采用T4连接酶粘性末端连接法进行连接。
进一步的，所述连接的条件为16℃连接4小时。
作为本发明的进一步改进，所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID No.11所示。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，所述的pAAV载体携带荧光绿蛋白基因EGFP。采用此技术方案，便于进行检测和分析。
本发明还公开了一种如上所述的腺相关病毒载体的应用，其用于制备基因治疗的药物中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，在AAV载体中使用该CPGK嵌合型启动子，该AAV载体转染细胞后，CPGK嵌合型启动子在原核细胞和真核细胞中序列稳定；而且大大提高了外源基因的转录效率，带有CPGK嵌合型启动子的AAV载体转染细胞后，基因表达效率明显高于携带mPGK启动子的AAV载体转染的细胞。
附图说明
图1是本发明的CPGK嵌合型启动子的结构示意图。
图2是本发明的CPGK嵌合型启动子和mPGK启动子的5’端设计KpnI限制性内切酶位点、及3’端设计BstXI限制性内切酶位点的结构示意图。
图3是本发明的携带CPGK嵌合启动子的AAV载体pAAV-CPGK-EGFP的结构示意图。
图4是本发明的携带mPGK启动子的AAV载体pAAV-PGK-EGFP的结构示意图。
图5是本发明实施例的等量pAAV-PGK-EGFP和pAAV-CPGK-EGFP载体分别转染HEK293细胞的荧光检测示意图；其中，a)为转染pAAV-PGK-EGFP载体的荧光量图，b)为转染pAAV-CPGK-EGFP载体的HEK293细胞的荧光量图。
图6是本发明实施例的以β-actin基因作为内参实时荧光定量PCR结果对比图。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
一种CPGK嵌合型启动子，即一种分离的脱氧核糖核酸，元件一：CMV增强子；元件二：鼠源mPGK启动子。元件一位于元件二的上游，采用重叠PCR技术(OverlapPCR)将上述两个元件进行连接，使CMV增强子位于mPGK启动子的上游。CPGK嵌合型启动子的结构示意图如图1所示。
其中，CMV增强子286bp，序列如SEQ ID No.1所示，具体为：
CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG。
mPGK启动子500bp，序列如SEQ ID No.2所示，具体为：
GGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCG。
嵌合型启动子CPGK启动子，786bp，序列如SEQ ID No.3所示，具体为：
CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCG。
一种包含上述CPGK嵌合型启动子的腺相关病毒载体，其采用以下步骤制备得到，本实施例以含有mPGK启动子的腺相关病毒载体作为对比例。
在上述CPGK嵌合型启动子和mPGK启动子5’端设计KpnI内切酶位点GGTACC，3’端设计BstXI内切酶位点CCACCGCGGTGG，如图2所示，2a)为CPGK嵌合型启动子的示意图，2b)为mPGK启动子的示意图。
根据上述酶切位点，设计带有KpnI和BstXI限制性酶切位点的CMV增强子和mPGK启动子引物，序列如表1所示，K-CMV引物的序列如SEQ ID No.6所示，K-PGK引物的序列如SEQID No.7所示，PGK-B的序列如SEQ ID No.8所示。
并采用PGK-overlap和CMV-overlap两条引物用于重叠PCR，引物采用商业公司合成。PGK-overlap的引物序列如SEQ ID No.9所示，CMV-overlap的引物序列如SEQ ID No.10所示。
表1引物序列
引物名称 序列(5‘—3’)
K-CMV GGGGTACCCCCGTTACATAACTTACGGTA
K-PGK GGGGTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTC
PGK-B CTGCAGAACCACCGCGGTGGCGAAAGGCCCGGAGATGAGG
PGK-overlap ATCGCTATTACCATGGGGTAGGGGAGGCGCTTT
CMV-overlap AAAGCGCCTCCCCTACCCCATGGTAATAGCGAT
以公司已有的携带mPGK启动子和CMV增强子的质粒载体为模板，高保真酶PCR克隆KpnI-CPGK-BstXI和KpnI-PGK-BSTXI脱氧核糖核酸片段，PCR产物直接商业试剂盒进行回收，回收产物KpnI-BstXI双酶切，37℃酶切过夜，商业试剂盒回收。
回收产物与已经进行KpnI-BstXI双酶切的pAAV载体(为了便于检测、分析，载体携带荧光绿蛋白基因EGFP)混合连接。连接采用T4连接酶粘性末端连接法，16℃连接4小时。
连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。
每个平板挑取8个克隆进行菌落PCR鉴定。
每个平板选取4个菌落PCR鉴定为阳性的克隆接种到4mL含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜。
提取质粒。
KpnI-BstXI双酶切，37℃酶切过夜，1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。
阳性克隆所对应的质粒送商业公司测序。
测序正确的为新开发的rAAV载体pAAV-CPGK-EGFP，即包含CPGK嵌合型启动子的rAAV腺相关病毒载体，其序列如SEQ ID No.11所示。对于包含m PGK启动子的腺相关病毒载体pAAV-PGK-EGFP的序列如SEQ ID No.12所示。pAAV-CPGK-EGFP载体的结构示意图如图3所示，pAAV-PGK-EGFP载体的结构示意图如图4所示。
包含CPGK嵌合型启动子的rAAV腺相关病毒载体的序列如SEQ ID No.11所示，具体为：
包含m PGK启动子的腺相关病毒载体pAAV-PGK-EGFP的序列如SEQ ID No.12所示，具体为：
扩增含正确CPGK和mPGK序列的pAAV-CPGK-GEFP及pAAV-PGK-EGFP质粒载体。
嵌合型启动子CPGK调控下游基因表达效率的定性鉴定。
对扩增得到的pAAV-GPGK-EGFP载体和pAAV-PGK-EGFP载体进行浓度测定。
将等量(2ug)两种rAAV载体瞬时转染到HEK293细胞系中，直径为9cm的培养皿，每培养皿细胞数量不低于1*107。将培养皿放入37℃含5％CO2培养箱内进行培养，每隔24小时观察荧光和细胞情况，直至72小时后，培养细胞中荧光不在有明显变化时进行EGFP蛋白表达定性和定量比较，如图5所示。结果表明，pAAV-CPGK-EGFP载体转染的HEK293细胞培养液(见附图5b))中的荧光量明显多于pAAV-PGK-EGFP载体转染的(见附图5a))，表明CPGK嵌合型启动子调控基因表达的效率高于mPGK启动子。
对CPGK嵌合型启动子调控下游基因表达效率的定量鉴定，包括如下步骤：
分别收集上述荧光定性分析后的细胞，200rpm，5分钟离心后去除细胞培养液，商业化培养细胞RNA提取试剂盒提取RNA。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA样品质量。商业化RNA逆转录试剂盒合成CDNA。实时荧光定量PCR分析分别转染pAAV-CPGK-EGFP及pAAV-PGK-EGFP载体的HEK细胞中EGFP基因的相对表达量。
EGFP基因相对表达量的具体计算方法如下：
β-actin基因作为内参，转染pAAV-CPGK-EGFP和pAAV-PGK-EGFP的细胞样品中，其Ct值分别表示为Ct(β-actin-CPGK)和Ct(β-actin-PGK)，两个待测样本的Ct值分别为Ct(CPGK)和Ct(PGK)。
ΔCt(PGK)＝Ct(PGK)-Ct(β-actin-PGK)；
ΔCt(CPGK)＝Ct(CPGK)-Ct(β-actin-CPGK)；
ΔΔCt＝ΔCt(CPGK)-ΔCt(PGK)
pAAV-CPGK-EGFP转染细胞中EGFP的表达量就是pAAV-PGK-EGFP转染样品的2-ΔΔCt。
如图6的结果显示，pAAV-CPGK-EGFP载体转染细胞中EGFP的表达量是pAAV-PGK-EGFP转染细胞的2.4倍，即表明本发明实施例的CPGK嵌合型启动子调控下游基因的效率是mPGK启动子的2.4倍，转录水平显著提高，解决了现有技术带有鼠源PGK(mPGK)启动子的AAV载体转染细胞后，基因的转录水平低的问题。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳生生凡非基因技术有限公司
<120> 一种CPGK嵌合型启动子、腺相关病毒载体及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 286
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 60
ttgacgtcaa taatgaccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 120
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 180
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 240
tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatg 286
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
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gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
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ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc 240
ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct 300
tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt 360
cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca 420
ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct 480
tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc 540
tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa 600
agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg ccaccgcggt 660
ggcggcccta gagtcgacga ggaactgaaa aaccagaaag ttaactggta agtttagtct 720
ttttgtcttt tatttcaggt cccggatccg gtggtggtgc aaatcaaaga actgctcctc 780
agtggatgtt gcctttactt ctaggcctgt acggaagtgt tacttctgct ctaaaagctg 840
cggaattgta cccgcggccg atccaccggt cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct 900
gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt 960
cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat 1020
ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg 1080
cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc 1140
catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa 1200
gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg 1260
catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag 1320
ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat 1380
ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc 1440
catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct 1500
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cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaagc ggccatcaag cttatcgata 1620
ccgtcgacta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1680
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1740
taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tcgcggccgc 1800
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 1860
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 1920
gagcgcgcag ctgcctgcag gggcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 1980
gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 2040
cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 2100
cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 2160
tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 2220
aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 2280
ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 2340
actcaaccct atctcgggct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 2400
ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac 2460
gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca 2520
gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 2580
cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 2640
atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt 2700
catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 2760
ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 2820
ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 2880
cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 2940
ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 3000
tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 3060
cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 3120
actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 3180
aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 3240
tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 3300
ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 3360
tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 3420
gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 3480
gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 3540
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tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 4500
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ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct 300
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acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgt 4538

Claims (7)

1.一种CPGK嵌合型启动子，其特征在于：其包括CMV增强子与鼠源mPGK启动子，所述CMV增强子与鼠源mPGK启动子连接；所述CMV增强子位于鼠源mPGK启动子的上游。
2.根据权利要求1所述的CPGK嵌合型启动子，其特征在于：所述CPGK嵌合型启动子的序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种包含如权利要求1~2任意一项所述的CPGK嵌合型启动子的腺相关病毒载体，其特征在于：其采用以下步骤制备得到：
步骤S1，在所述CPGK嵌合型启动子的5’端设计KpnI内切酶位点， 3’端设计BstXI内切酶位点；所述KpnI内切酶位点的序列如SEQ ID No.4所示，所述BstXI内切酶位点的序列如SEQ ID No.5所示；根据上述酶切位点序列设计PCR引物序列，并合成启动子引物；
步骤S2，以携带mPGK启动子和CMV增强子的质粒载体为模板，加入步骤S1得到的启动子引物，高保真酶PCR克隆KpnI-CPGK-BstXI脱氧核糖核酸片段，对PCR产物进行回收，对回收产物进行KpnI-BstXI 双酶切，37℃酶切过夜，回收得到KpnI-BstXI双酶切的CPGK脱氧核糖核酸片段；
步骤S3，将步骤S2的回收产物与事先制备好的KpnI-BstXI双酶切的线性pAAV-EGFP载体进行混合连接；
步骤S4，将步骤S3得到的连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜；
步骤S5，进行菌落PCR鉴定；
步骤S6，将菌落PCR鉴定为阳性的克隆接种到含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，培养过夜；
步骤S7，提取质粒，然后进行KpnI-BstXI双酶切，37℃酶切过夜，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并测序，得到包含CPGK嵌合型启动子的rAAV腺相关病毒载体。
4.根据权利要求3所述的腺相关病毒载体，其特征在于：所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID No.11所示。
5.根据权利要求3所述的腺相关病毒载体，其特征在于：步骤S3中，采用T4连接酶粘性末端连接法进行连接，所述连接的条件为16℃连接4小时。
6.根据权利要求3所述的腺相关病毒载体，其特征在于：步骤S2中，所述的pAAV载体携带荧光绿蛋白基因EGFP。
7.一种如权利要求3~6所述的腺相关病毒载体的应用，其特征在于：其用于制备基因治疗的药物。
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