CN113950532A - 哺乳动物表达载体 - Google Patents
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Abstract
用于哺乳动物细胞的表达载体包括具有编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列的选择盒，该编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列可操作地连接至PGK启动子和pA信号。载体可以包括已知促进表达盒稳定整合到基因组中的EASE元件。该载体还包括具有编码作为细菌选择标记的将抗生素抗性赋予细菌宿主的酶的核苷酸序列的选择盒，该核苷酸序列可操作地连接至合适的启动子。该载体还包括用于目标多肽的表达盒，该表达盒具有编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点，该插入位点可操作地连接至CMV启动子和pA信号。载体还包括细菌复制起点。
Description
技术领域
本公开涉及哺乳动物表达载体及其用途。本发明还提供了一种产生多肽的方法。
参考序列表
本申请包括序列表。
背景技术
以下背景介绍仅用于促进读者对本发明的理解，并不应理解为描述或构成本发明的现有技术。
哺乳动物细胞已成为用于治疗或诊断用途的蛋白质(例如单克隆抗体)的生物加工中的主力军。现今，在上游加工中，哺乳动物细胞表达系统是主要的生产工具。期望的糖基化模式与无血清和无蛋白质培养基的开发相结合，为以合适的细胞系和表达载体为特征的该表达平台铺平了道路。世界范围内最常用的细胞系是CHO。大规模生产，再加上对哺乳动物细胞营养需求的深入了解，已经在提高效率和产量方面实现了实质性的优化。
治疗性蛋白质在治疗用途中的剂量通常在几微克到毫克蛋白质的范围内，因此需要进一步提高效率和产量。此外，制造成本部分取决于所达到的表达水平。哺乳动物表达平台的一个关键组成部分是所使用的表达载体。
发明内容
本公开可以被认为大致涉及诸如哺乳动物多肽的多肽的生产。提供了适合于表达相应多肽的载体。
在第一方面，提供了一种表达载体。该表达载体是哺乳动物表达载体。该表达载体包括带有真核选择标记的选择盒、带有细菌选择标记的选择盒、用于目标多肽的表达盒和细菌复制起点。带有真核选择标记的选择盒包括编码作为真核选择标记的谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列。编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列可操作地连接至3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglycerate kinase，PGK)启动子和多腺苷酸化(Polyadenylation，pA)信号。带有细菌选择标记的选择盒包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码作为细菌选择标记的将抗生素抗性赋予细菌宿主的酶，并且该核苷酸序列可操作地连接至合适的启动子。用于目标多肽的表达盒包括编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点。插入位点可操作地连接至巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子和多腺苷酸化(pA)信号。
根据一些实施方式，表达载体是哺乳动物表达载体。根据一些实施方式，表达载体是用于鼠或仓鼠细胞系例如CHO细胞系或NS0(非分泌型)骨髓瘤细胞系的载体。根据一些实施方式，表达载体是用于CHO细胞的表达载体。
CMV启动子通常是立早人巨细胞病毒。例如，它存在于pcDNA3.1或pCMV载体中。
如上所述，表达载体包括包含编码赋予细菌宿主抗生素抗性的酶的核苷酸序列的选择盒。在一些实施方式中，相应的抗生素是氨苄青霉素。可以作为赋予细菌宿主氨苄青霉素抗性的细菌选择标记编码的合适的酶是β-内酰胺酶。
根据表达载体的一些实施方式，由表达载体中包含的序列编码的谷氨酰胺合成酶具有与SEQ ID NO:5具有98％或更多同一性的序列并且能够催化谷氨酸和氨向谷氨酰胺的ATP依赖性转化。
根据一些实施方式，带有真核选择标记的选择盒包括编码作为真核选择标记的哺乳动物谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，谷氨酰胺合成酶具有与SEQ IDNO:3的序列具有至少90％同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，作为真核选择标记被包括的谷氨酰胺合成酶是CHO谷氨酰胺合成酶。在一些实施方式中，谷氨酰胺合成酶具有与SEQ ID NO:3的序列具有至少96％同一性的核酸序列。
在一些实施方式中，表达载体还包括表达增强序列元件(Expression augmentingsequence element，EASE)。在一些实施方式中，表达载体还包括：包括编码作为真核选择标记的赋予抗生素嘌呤霉素抗性的酶的核苷酸序列的选择盒，该核苷酸序列可操作地连接至3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和多腺苷酸化(pA)信号。在一些实施方式中，赋予抗生素嘌呤霉素抗性的酶是嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puromycin-N-acetyltransferase，pac)。
根据表达载体的一些实施方式，细菌复制起点是pUC复制起点。
根据一些实施方式，PGK启动子具有与SEQ ID NO：2具有至少98％同一性的序列并且是功能性启动子。根据一些实施方式，谷氨酰胺合成酶是具有SEQ ID NO:3的序列的CHO谷氨酰胺合成酶。根据一些实施方式，PGK启动子包括SEQ ID NO:2的序列。根据一些实施方式，谷氨酰胺合成酶是包括SEQ ID NO:3的序列的CHO谷氨酰胺合成酶。根据一些实施方式，包括相应的CHO谷氨酰胺合成酶的序列和与其可操作地连接的3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的序列的序列具有SEQ ID NO:1的序列。根据一些实施方式，CMV启动子具有SEQ IDNO:4的序列。
根据一些实施方式，pA信号是猿猴病毒40pA信号。在一些实施方式中，猿猴病毒40pA信号可以是早期pA和晚期pA信号。
根据一些实施方式，赋予细菌宿主氨苄青霉素抗性的细菌选择标记是与SEQ IDNO:6的序列具有95％同一性的β-内酰胺酶。
在第二方面，提供了一种重组宿主细胞。该宿主细胞包括根据第一方面的表达载体。
在一些实施方式中，该重组宿主细胞是CHO细胞。在一些实施方式中，该重组宿主细胞是NS0细胞。在一些实施方式中，该重组宿主细胞是COS-7猴肾细胞。在一些实施方式中，该重组宿主细胞是3T3细胞。在一些实施方式中，该重组宿主细胞是幼仓鼠肾(Babyhamster kidney，BHK)细胞。在一些实施方式中，该重组宿主细胞是人胚胎肾293细胞。
在第三方面，提供了一种产生多肽的方法。该方法包括在适合表达异源目标多肽的条件下培养根据第二方面的重组宿主细胞。根据第二方面的重组宿主细胞包括表达载体，其中在编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点上包含编码作为异源目标多肽的多肽的核苷酸序列。
在根据第三方面的方法的典型实施方式中，编码作为异源目标多肽的多肽的核苷酸序列可操作地连接至CMV启动子和pA信号。
在一些实施方式中，根据第三方面的方法包括将宿主细胞，例如CHO细胞或NS0细胞，作为悬浮物维持在合适的培养基中。在一些实施方式中，根据第三方面的方法包括将宿主细胞，例如CHO细胞或NS0细胞，维持在33℃至38℃的温度范围。温度可以例如选择为约37℃。
在第四方面，提供了根据第一方面的表达载体用于高水平表达多肽的用途。
在第五方面，提供了根据第二方面的宿主细胞用于高水平表达多肽的用途。
附图说明
图1A是已知载体pcDNA 3.1(+)的载体图谱，它是GA片段1的亲本载体；图1B是pMBLC-GS的载体图谱；图1C是pMBL CE-GS的载体图谱；图1D是载体pMBL CE-GS的线性展示；
图2A描绘了SEQ ID NO：1的序列，其包括作为真核选择标记的CHO谷氨酰胺合成酶的可操作地连接至PGK启动子的序列。图2B描绘了为PGK启动子的SEQ ID NO：2的序列。图2C描绘了SEQ ID NO：3的序列，其是编码作为真核选择标记的谷氨酰胺合成酶的开放阅读框；图2D描绘了SEQ ID NO：4的序列，其是CMV启动子的序列；图2E描绘了SEQ ID NO：14的序列，其是表达增强序列元件的序列；
图3是pMBL CE-Puro的载体图谱；
图4是pMBL C-Puro的载体图谱；
图5A描绘了载体pMBL C-GS的凝胶电泳限制酶切分析；图5B描绘了载体pMBL CE-GS的凝胶电泳限制酶切分析；图5C描绘了载体pMBL CE-Puro的凝胶电泳限制酶切分析；图5D描绘了载体pMBL C-Puro的凝胶电泳限制酶切分析；
图6是提供了使用根据本公开的载体表达的单克隆抗体的概览的表格；
图7A描绘了与共转染在两个单独的pCHO 1.0载体中的同一抗-CTLA4抗体的HC和LC后的表达(c)和使用HC和LC两者均被克隆到其中的单个pCHO 1.0载体的表达(d)相比，使用载体pMBL CE-GS(a)和载体pMBL C-GS(b)表达的抗CTLA4抗体Bmab700的滴度。图7B描绘了使用pMBL CE-GS表达的四种不同的抗CD20融合抗体在第5、7、9、12和14天的滴度。已将HC和LC在XhoI-NotI位点克隆到载体pMBL CE-GS中。天数显示在条形上方。瞬时转染以共转染模式进行。所有转染均使用ExpiCHOTM表达系统(来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific Inc.，货号A29133)进行，这是一种基于悬浮适应的中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)细胞的高产率瞬时表达系统。按照expiCHO-S表达系统手册解冻ExpiCHO-S细胞。在解冻后至少传代2次后，在转染前一天以3.5×106个细胞/ml接种细胞进行转染。在接种后的第1天，对于每个转染，估计细胞计数，并通过用新鲜预热的培养基稀释，将细胞计数调整至6.0×106个细胞/ml。按照expiCHO-S表达系统手册进行转染。在培养物中以1μg/ml的终浓度转染DNA。按照制造商的方案添加Expifectamine和补料。所有转染均遵循最大滴度方案。将转染烧瓶在8％CO2的加湿气氛下在定轨振荡器上于37℃培养箱中进行培养。在第0、2、5、7、9和12天估计VCD和活力。当活力降至50％以下或在D-12时收获培养物；
图8A描绘了使用载体pMBL CE-GS瞬时表达以下的CHO细胞的活细胞密度的时间进程以及图8B描绘了使用载体pMBL CE-GS瞬时表达以下的CHO细胞的的细胞活力(以％表示)的时间进程：抗CD20 HC-C-TGF RII融合抗体(Fmab25/1和Fmab25/2)、抗CD20 LC-C-TGFRII融合抗体(Fmab26/1和Fmab26/2)、抗CD20 HC-N-TGF RII融合抗体(Fmab27/1和Fmab27/2)、以及抗-CD20 LC-N-TGF RII融合抗体(Fmab28/1和Fmab28/2)。图8C描绘了产生的产物的滴度的时间进程。在第0天、第2天、第5天、第7天、第9天、第12天和第14天进行了测量。条形上的数字表示培养物的相应培养日，a＝第12天，b＝第14天。图8D示出了第14天产生的产物的收获滴度。收获滴度分析是基于第14天样本的HPLC方法进行的。如第[0032]段中所述进行瞬时表达研究；
图9A描绘了表达抗CD-20野生型抗体、抗CD20 HC-C-TGFβRII融合抗体(Fmab25)以及抗CD20 TIM3LC-C-Terminus融合抗体(Fmab30)的CHO细胞的活细胞密度的时间进程，以及图9B描绘了表达抗CD-20野生型抗体、抗CD20 HC-C-TGFβRII融合抗体(Fmab25)以及抗CD20 TIM3LC-C-Terminus融合抗体(Fmab30)的CHO细胞的细胞活力(以％表示)的时间进程。在第0天、第2天、第5天、第7天和第9天监测了生长曲线。条形上的数字表示培养物的相应培养日。图9C描绘了产生的产物的滴度的时间进程。在第5天、第7天和第9天进行了测量。条形上的数字表示培养物的相应培养日；图9D示出了第9天产生的产物的收获滴度。条形上的数字表示获得的滴度。基于HPLC进行分析；
图10A描绘了表达抗PDL-1抗体的CHO细胞的活细胞密度的时间进程，以及图10B描述了以表达抗PDL-1抗体的CHO细胞的细胞活力(以％表示)的时间进程。在第0天、第2天、第5天、第7天、第9天和第12天进行了测量。条形上的字母表示相应的表达的抗体链：a-c：阿替利珠单抗(Atezolizumab)，d-f：抗PDL-1抗体。图10C示出了第14天产生的产物的收获滴度。条形上的数字表示获得的滴度。基于HPLC进行分析；
图11A描绘了表达另一种抗PDL-1抗体的CHO细胞的活细胞密度的时间进程，以及图11B描绘了以表达另一种抗PDL-1抗体的CHO细胞的细胞活力(以％表示)的时间进程。在第0天、第5天、第9天和第12天进行了测量。条形上的数字表示培养物的相应培养日。图11C描绘了产生的产物的滴度的时间进程。在第9天和第12天进行了测量。条形上的数字表示培养物的相应培养日。图11D示出了第12天产生的产物的收获滴度。条形上的数字表示获得的滴度。基于HPLC进行分析；
图12A示出了在不存在谷氨酰胺的情况下选择阶段期间六个烧瓶中的活力(％)，以及图12B示出了在不存在谷氨酰胺的情况下选择阶段期间的活细胞密度。烧瓶2A、2B、3A和3B包含通过电穿孔用pMBL CE-GS稳定转染的不同的CHO-S GS敲除宿主的CHO细胞，以及烧瓶5和6代表包含在分别没有C12-1和C#26-2的DNA的情况下电穿孔的CHO细胞的模拟细胞对照。烧瓶2A和2B以及烧瓶3A和3B各自是相同细胞系的重复的烧瓶。pMBL CE-GS编码依那西普(etanacerpt)，依那西普是p75 TNF受体的细胞外配体结合结构域和人IgG1的Fc部分的融合蛋白。每个第0天是接种当天。第7/6天、第6天、第3天和第4天分别是进行选择的天数；
图13A描绘了与图12A和图12B相同的烧瓶中稳定表达依那西普的CHO细胞的活细胞密度的时间进程，以及图13B描绘了与图12A和图12B相同的烧瓶中稳定表达依那西普的CHO细胞的细胞活力(以％表示)的时间进程。在简易补料分批培养下使用葡萄糖作为补料，在第5代收集数据。图13C描绘了产生的产物的滴度的时间进程。在第5天、第7天、第10天和第14天进行了测量。条形上的数字表示培养物的相应培养日。图13D示出了第14天产生的产物的收获滴度。通过使用HPLC估计滴度；
图14A描绘了与图12A、图12B和图13相同的池中稳定表达依那西普的CHO细胞的活细胞密度的时间进程，以及图14B描绘了以与图12A、图12B和图13相同的池中稳定表达依那西普的CHO细胞的细胞活力(以％表示)的时间进程。使用CB4(来自GE Healthcare LifeSciences的Hyclone的Cell Boost-4)和EFC(来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific Inc.的Efficient feed C)用作补料分批培养下的补料，在第7代收集数据。图14C描绘了产生的产物的滴度的时间进程。在第7天和第12天进行了测量。条形上的数字表示培养物的相应培养日；图14D示出了第12天产生的产物的收获滴度；
图15描绘了图13和图14中提供了数据的收获样本的蛋白质印迹分析(Westernblot analysis)。对来自补料分批(参见图14)和简易补料分批(参见图13)的未纯化的收获上清液进行了分析。
具体实施方式
为了更容易理解对本文公开的核酸分子、载体、宿主细胞、方法和用途的解释，首先定义一些术语。
定义
除非另有说明，否则包括说明书和权利要求的本文件中使用的以下术语具有以下给出的定义。
如本文所用，词语“约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值在可接受误差范围内的值，这将部分取决于如何测量或确定该值，即对测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可表示在1个标准偏差以内或超过1个标准偏差。术语“约”还用于表示所讨论的数量或值可以是指定的值或大致相同的一些其他值。该短语旨在传达类似的值促进根据本发明的等效结果或效果。在上下文中，“约”可以指高于和/或低于至多10％的范围。在一些实施方式中，词语“约”是指高于和低于某个值至多5％的范围，例如高于或低于该值至多2％、至多1％或至多0.5％。在一个实施方式中，“约”是指在给定值上下至多0.1％的范围。
术语“基本上由……组成”被理解为允许在样品或组合物中存在不影响该样品或组合物的性质的额外组分。作为说明性实例，如果药物组合物基本上由活性成分组成，则它可以包括赋形剂。
关于多肽的术语“表达”和“表现”旨在以如本领域所用的普通含义来理解。细胞通过将核酸转录成mRNA，然后翻译成多肽，多肽被折叠并可能进一步加工，从而表达多肽。关于各个生物过程本身，术语“表达”、“基因表达”或“表现”是指将基因的核酸序列中编码的信息首先转化为信使RNA(messenger RNA，mRNA)然后转化为蛋白质的整个调控途径。因此，基因的表达包括：将基因转录为初级hnRNA、将该hnRNA加工为成熟RNA、以及将mRNA序列翻译为多肽的相应氨基酸序列。在上下文中，还应注意术语“基因产物”不仅指多肽，包括例如由该基因编码的最终多肽(包括其剪接变体)和相应的前体多肽(如果适用)，还指相应的mRNA，该mRNA可被视为基因表达过程中的“第一基因产物”。
术语“表达载体”或“表达构建体”是指核酸载体，例如质粒，通过该载体可以使用宿主细胞的转录和翻译机制在宿主细胞中表达所需的目标多肽。核酸分子可被引入各自的宿主细胞并且包括一个或多个与编码目标多肽的核酸序列可操作地连接的调节序列。
关于多肽例如免疫球蛋白或蛋白质结合分子的“片段”意指存在于相应多肽中的任何氨基酸序列，只要它比全长序列短并且只要它能够执行多肽的目的功能——在免疫球蛋白与所需目标(例如抗原，如PDL-1)特异性结合的情况下。术语“免疫球蛋白片段”是指免疫球蛋白的显示对特定分子的特异性结合亲和力的一部分，通常是高变区以及周围重链和轻链的部分。高变区是与多肽目标物理结合的免疫球蛋白的一部分。
如本文所用，术语“核酸分子”是指任何可能构型(例如单链、双链或其组合)的任何核酸。核酸的实例包括：例如，DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA的类似物、锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)分子、蛋白质核酸(Proteinnucleic acid，PNA)分子、烷基膦酸酯和烷基磷酸三酯核酸分子和tecto-RNA分子(例如Liu,B.,et al.,J.Am.Chem.Soc.(2004)126,4076-4077)。LNA具有修饰的RNA骨架，其中在C4'和O2'之间有一个亚甲基桥，为各自的分子提供更高的双链稳定性和核酸酶抗性。烷基膦酸酯和烷基磷酸三酯核酸分子可被视为DNA或RNA分子，其中通过将核酸骨架中磷酸基团的P-OH基团分别交换为烷基和烷氧基来中和核酸骨架的磷酸基团。DNA或RNA可以是基因组来源的或合成来源的，并且可以是单链的或双链的。这种核酸可以是，例如，mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA合成的DNA、DNA与RNA的共聚物、寡核苷酸等。相应的核酸可以进一步包含非天然核苷酸类似物和/或可以连接至亲和标签或标记物。
许多核苷酸类似物是已知的并且可用于本发明方法中使用的核酸中。核苷酸类似物是在例如碱基、糖或磷酸部分含有修饰的核苷酸。作为说明性实例，已知用2'F、2'O-Me或2'H残基取代siRNA的2'-OH残基来提高相应RNA的体内稳定性。碱基部分的修饰可以是不同的嘌呤或嘧啶碱基A、C、G和T/U的天然或合成修饰，例如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基，以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸碱基。其他核苷酸类似物用作通用碱基。通用碱基的例子包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用碱基能够与任何其他碱基形成碱基对。碱基修饰通常可以与例如糖修饰结合，例如2'-O-甲氧乙基，例如以实现独特的性能，例如提高的双链稳定性。
术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，不限于产物的某个最小长度。在同时使用这两个术语的情况下，这种双重命名说明在本领域中并列地使用这两个术语。
如本文所用，术语“多腺苷酸化位点”、“poly A位点”或“poly A序列”是指允许指导新生RNA转录物(例如DNA序列)的终止和多腺苷酸化的核酸序列。重组转录物的有效多腺苷酸化是有利的，因为缺少poly A尾的转录物通常不稳定并且会迅速降解。本文公开的载体中使用的poly A信号可以是任何来源的，并且可以是“内源的”。内源性poly A信号是在基因组中给定基因的编码区的3'端天然存在的信号。常用的异源poly A信号是SV40 polyA信号。合适的多腺苷酸化序列的例子还包括但不限于牛生长激素(bovine growthhormone，bGH)多腺苷酸化信号、β-珠蛋白poly A位点和单纯疱疹病毒胸苷激酶poly A位点。
术语“纯化的”被理解为与细胞的原始环境相比的相对指示，从而代表细胞比在自然环境中相对更纯的指示。因此，它包括但不仅限于来自其他细胞(例如同质细胞群)的绝对纯度意义上的绝对值。与自然水平相比，纯化细胞后的水平通常至少高出2倍至5倍(例如，以细胞数/ml计)。明确考虑了至少一个数量级，例如约两个或三个数量级，包括例如约四个或五个数量级的纯化。可以期望的是，获得在功能显著水平上至少基本上没有污染、特别是没有其他细胞的细胞，例如约90％、约95％或99％纯。上述内容作必要修改后对核酸、肽或蛋白质适用。在这种情况下，核酸、肽或蛋白质的纯化将例如通常高出至少2倍至5倍(例如，以mg/ml计)。
本文件中使用“重组”一词来描述一种核酸分子，该核酸分子由于其来源、操纵或两者而与自然界中与之相关的核酸分子的全部或部分不相关。通常，重组核酸分子包括在相应的野生型生物体或细胞中不天然存在的序列。通常重组核酸分子是通过基因工程获得的，通常在细胞外构建。通常，重组核酸分子与自然界中存在的相应核酸分子的至少一部分基本上相同和/或基本上互补。重组核酸分子可以是任何来源的，例如基因组、cDNA、哺乳动物、细菌、病毒、半合成或合成来源的。关于蛋白质/多肽而使用的术语“重组”意指通过表达重组多核苷酸而产生的多肽。
术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等应被广泛地或开放式地且没有限制地理解。除非上下文另有明确说明，否则诸如“一”、“一个”或“该”等单数形式包括复数引用。因此，例如，对“载体”的引用包括单个载体以及多个载体，它们要么相同(例如相同的操纵子)，要么不同。同样，对“细胞”的引用包括单个细胞以及多个细胞。除非另有说明，否则一系列元件之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元件。术语“至少一个”和“其中的至少一个”包括例如一个、两个、三个、四个或五个或更多个元件。还应理解的是，在规定范围之上和之下的轻微变化可用于实现与该范围内的值基本上相同的结果。此外，除非另有说明，否则范围的公开旨在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。
术语的任何使用的范围和含义将从使用该术语的特定上下文中显而易见。在适当的情况下，在详细说明的适当上下文中给出了整个本文件中使用的选定术语的某些进一步定义。除非另有定义，否则说明书、附图和权利要求中使用的所有其他科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的普通含义。
提供了能够在哺乳动物细胞，特别是CHO细胞中驱动高水平异源蛋白质表达的载体，即环状核酸分子，以及基于其的方法和用途。载体可在细菌细胞中复制。
作为表达载体，根据本公开的载体通常包括启动子、转录终止子序列、复制起点、选择标记、核苷酸序列的插入位点和调控元件。
启动子是启动特定基因转录的DNA区域。巨细胞病毒启动子是哺乳动物表达启动子的例子，其源自巨细胞病毒。CMV启动子通常用于在哺乳动物细胞中进行的基因工程工作中使用的载体，因为它是一个强启动子并驱动其控制下的基因的组成型表达。启动子可操作地连接至编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点。
转录终止子是核酸序列的标记基因组DNA中用于转录过程的基因或操纵子的末端的一部分。这种序列通过在新合成的mRNA中提供信号来介导转录终止，该信号触发从转录复合物中释放mRNA的过程。
转录终止子序列可以与编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点可操作地连接。
复制起点，也称为复制起始点，是基因组中在此启动复制的特定序列。DNA复制通常从单个复制起点开始。在大肠杆菌(E.coli)中，复制起点称为oriC。该区域被包含在能够在大肠杆菌中自我复制以形成多个拷贝的表达载体中。
选择标记是引入细胞(例如细菌)的赋予适合人工选择的特性的基因。
真核基因的转录受多种顺式和反式作用调控元件的调控。两个表征最好的顺式元件是启动子和增强子。启动子，见上文，是紧邻基因的编码序列5'的核酸序列；它包括多个用于反式作用转录因子的结合位点，从而形成基础转录装置。增强子通常包括多个用于反式作用转录因子的结合位点，但它们可以在编码序列的远上游或远下游甚至内含子内找到。包括在本文公开的载体的一些实施方式中的顺式元件是表达增强序列元件(EASE)。EASE元件有助于载体的稳定性，这对于稳定细胞系的开发很重要。
本文公开的表达载体包括三个不同的表达盒。第一盒是用于表达允许选择包含载体的真核细胞的选择标记蛋白的表达盒。该表达盒在本文中也称为选择盒。第二盒是用于表达允许选择包含表达载体的细菌细胞的选择标记蛋白的表达盒。该表达盒在本文中同样也称为选择盒。第三盒是用于表达目标多肽的表达盒。该表达盒通常包括用于插入在表达盒的启动子下游并与表达盒的启动子可操作地连接的编码目标多肽的核苷酸序列的位点。
第三盒的插入位点通常含有至少一个限制酶识别序列。它可以包括两个或多个限制酶识别序列并限定多克隆位点。在一些实施方式中，插入位点包括Not I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Xho I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括BamH I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Nhe I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括EcoR I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括EcoR V酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Pme I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Afl II酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Hind III酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Kpn I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Xba I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括BstX I酶的识别序列。在一些实施方式中，插入位点包括Pme I酶的识别序列。使用任何一种或两种存在其限制酶识别序列的酶来切割环状载体，产生线性载体，具有适当末端的编码目标多肽的核苷酸序列可以连接至该线性载体。
三个表达盒可以相对于彼此以任何顺序排列在载体中。在一些实施方式中，用于表达允许选择真核细胞的选择标记蛋白的第一表达盒和用于表达允许选择细菌细胞的选择标记蛋白的第二表达盒在载体中以相反方向排列。在一些实施方式中，第一表达盒和第二表达盒以相同方向排列在载体中。在一些实施方式中，用于表达允许选择真核细胞的选择标记蛋白的第一表达盒和用于表达目标多肽的第三表达盒在载体中以相同方向排列。在一些实施方式中，第一表达盒和第三表达盒以相反方向排列在载体中。在一些实施方式中，用于表达允许选择细菌细胞的选择标记蛋白的第二表达盒和用于表达目标多肽的第三表达盒以相反方向排列在载体中。在一些实施方式中，第二表达盒和第三表达盒以相同方向排列在载体中。
三个表达盒的顺序和方向的说明性示例如图1B、图1C、图3和图4所示。
根据本公开的载体中存在的真核选择标记是编码谷氨酰胺合成酶的核酸序列。谷氨酰胺合成酶是负责从谷氨酸和氨生物合成谷氨酰胺的酶。这种酶促反应提供了在哺乳动物细胞中合成谷氨酰胺的唯一途径。在生长培养基中不存在谷氨酰胺的情况下，GS酶对于培养基中的哺乳动物细胞的存活至关重要。哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，表达足够的GS以在没有外源性谷氨酰胺的情况下存活。GS是最常用的选择标记，用于在创建稳定细胞系的同时选择转染子。对于宿主中内源性GS由于失活突变或缺失而无功能的细胞系，通过载体补充外源性GS允许选择包含目的载体的转染群体。可以在不含谷氨酰胺的培养基中筛选所得的重组细胞系，从而减少获得高滴度克隆的时间并增加获得高滴度克隆的可能性。
在本文公开的载体上，谷氨酰胺合成酶由可操作地连接至PGK启动子的核酸序列编码。在一些实施方式中，PGK是PGK-1。PGK-1基因编码糖酵解途径的一种酶，即管家酶，3-磷酸甘油酸激酶。因此，它无处不在地表达。该基因位于哺乳动物的X染色体上。在雌性哺乳动物的体细胞中，只有活性X染色体上的PGK-1等位基因被转录，非活性X上的另一个PGK-1等位基因是惰性的。因此，PGK-1总是表达的，除非它与雌性体细胞或雄性生殖细胞的失活X染色体上的大多数其他基因一起沉默。因此，PGK-1启动子用于高组成型水平的基因表达，因为它在几乎所有体细胞和生殖细胞类型中都有活性。
在一些实施方式中，PGK-1启动子具有SEQ ID NO:2的序列。SEQ ID NO：2的PGK-1启动子例如包含在WO 2014/200557的表2中描述的载体中。它还被包含在GenBank登录号KJ796485.1(版本1，2014年8月16日)的克隆载体PGK1p-Csy4-pA中，或被包含在GenBank登录号KU179219.1(版本1，2017年1月17日)的克隆载体PBDGTV中。
在一些实施方式中，PGK启动子具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少98％同一性的序列。作为说明性示例，GenBank登录号为AB535097.1(版本1，2009年12月4日)的突变引入载体pMtKCNQ2 DNA在第2984至3491位具有PGK启动子序列，该PGK启动子序列缺少SEQ IDNO:2的第371至382位碱基。作为另一个例子，GenBank登录号LT726831.1(版本1，2017年2月6日)的载体pROSA26-DV3的第6435至6924位的mPGK1启动子相对于SEQ ID NO:2的序列缺失六个单碱基。在一些实施方式中，PGK启动子具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少99％同一性的序列。例如，GenBank登录号X76683.1(版本1，1994年2月9日)的质粒载体pHM2的第6566至7056位的小鼠磷酸甘油酸激酶启动子相对于SEQ ID NO:2的序列具有五个缺失的碱基和一个取代。作为另一个例子，GenBank登录号KY447298.1(版本1，2017年2月22日)的克隆载体pGZ-DSB-CO的第4395至4888位的PGK-1启动子的互补序列相对于SEQ ID NO:2的序列缺失2个碱基。
在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列是SEQ ID NO:5的序列。该序列以登录号2002年6月3日AJHYQ在GenPept中找到。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列是与SEQ ID NO:5具有99％或更多同一性的序列。该序列例如可以是SwissProt/UniProt登录号G3HG36(序列版本1，2011年11月16日，条目版本30，2018年5月23日)的序列编码的序列，其是由GenBank登录号RLQ66161.1(版本1，2018年10月21日)的序列编码的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列是与SEQ ID NO:5具有97％或更多同一性的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列是与SEQID NO:5具有96％或更多同一性的序列。作为说明性示例，该序列可以是SwissProt/UniProt登录号P04773(序列版本4，2007年1月23日，条目版本107，2018年12月5日)的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列包括SEQ ID NO:5的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列包括与SEQ ID NO:5具有99％同一性的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列包括与SEQ ID NO:5具有99％或更高同一性的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列包括与SEQ ID NO:5具有97％或更高同一性的序列。在一些实施方式中，编码为CHO谷氨酰胺合成酶的序列包括与SEQ ID NO:5具有96％或更高同一性的序列。在一些实施方式中，该序列可以是SwissProt/UniProt登录号G3IH33(序列版本1，2011年11月16日，条目版本22，2018年12月5日)的序列。
在一些实施方式中，编码CHO谷氨酰胺合成酶的序列具有SEQ ID NO:3的序列。SEQID NO：3的编码CHO谷氨酰胺合成酶的序列例如作为第147至1268位被包括在GenBank登录号X03495.1(版本1，1993年4月21日)的编码中国仓鼠谷氨酰胺合成酶的mRNA序列中，数据库条目最后更新于2011年2月4日。作为另一个示例，该序列作为SEQ ID NO:10见于WO2013/186371或作为SEQ ID NO:1见于EP2825641。
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)基因表达系统(Birch J.R.andRacher A.J.,Advanced Drug Delivery Reviews 2006；58:671-685)是单克隆抗体生产中两种常用的表达载体系统之一。另一种常见的表达系统基于二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)基因。GS系统对CHO和NS0细胞特别有用，它基于谷氨酸和铵到谷氨酰胺的代谢途径，用于选择重组细胞。CHO细胞已经表达了内源性GS。将选择性GS抑制剂(例如氨基亚砜蛋氨酸(Methionine sulphoximine，MSX))添加到不含谷氨酰胺的培养基中，选择了整合了包含GS基因的基因构建体的细胞克隆。
编码谷氨酰胺合成酶的序列，例如在一些实施方式中，CHO谷氨酰胺合成酶具有与SEQ ID NO:3的序列至少97％相同的序列。NCBI登录号NM_001246770.1(版本1，2011年10月9日)的CHO谷氨酰胺合成酶的序列在第1至1116位包含与SEQ ID NO:3的序列有39个取代碱基不同的启动子序列。在一些实施方式中，编码CHO谷氨酰胺合成酶的序列具有与SEQ IDNO:3的序列至少92％相同的序列。作为示例，GenBank登录号X16314.1(版本1，1995年4月4日)的鼠谷氨酰胺合成酶的序列相对于SEQ ID NO:3的序列有91个碱基取代。在一些实施方式中，编码CHO谷氨酰胺合成酶的序列具有与SEQ ID NO:3具有90％同一性的序列。作为示例，的GenBank登录号BC051726(版本1，2003年5月14)的人谷氨酰胺合成酶在第1307至2422位具有与SEQ ID NO:3的序列有106个取代不同的序列。作为另一个例子，GenBank登录号AK390323.1(版本1，2012年1月11日)的猪谷氨酰胺合成酶在第252至1367位具有与SEQ IDNO:3的序列有116个取代不同的序列。
本公开的载体包括细菌选择标记。该标记是编码为细菌宿主提供抗生素抗性的酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，酶提供对氯霉素或卡那霉素和遗传霉素的抗性。在一些实施方式中，酶提供对氨苄青霉素的抗性。在一些实施方式中，酶提供对链霉素和壮观霉素的抗性。
对细菌宿主提供氨苄青霉素抗性的酶的示例是β-内酰胺酶。在一些实施方式中，酶β-内酰胺酶具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其尤其是,SwissProt/UniProt登录号Q79DR3的大肠杆菌(序列版本1，2004年7月5日，条目版本116，2018年12月5日)的β-内酰胺酶的序列。该序列也与SwissProt/UniProt登录号Q285M4(序列版本1，2006年4月4日，条目版本36，2017年5月10日)的合成β-内酰胺酶构建体相同。在一些实施方式中，β-内酰胺酶可以是与SEQ ID NO:6的序列具有99％或更高同一性的蛋白质。例如，它可以是由具有的SwissProt/UniProt登录号Q799Y1(序列版本1，2004年7月5日，条目版本42，2017年5月10)的氨基酸序列的质粒pPV编码的β-内酰胺酶蛋白。它也可以是来自禽波氏杆菌(Bordetellaavium)的具有SwissProt/UniProt登录号A0A3A0YVF2(序列版本1，2018年12月5日，条目版本1，2018年12月5日)的氨基酸序列的A类广谱β-内酰胺酶TEM-1。
在一些实施方式中，β-内酰胺酶可以是与SEQ ID NO:6的序列具有98％或更高同一性的蛋白质。例如，它可以是来自大肠杆菌(Escherichia coli)的具有的SwissProt/UniProt登录号R9URM7(序列版本1，2013年9月18日，条目版本19，2018年12月5日)的氨基酸序列的β-内酰胺酶蛋白。在一些实施方式中，β-内酰胺酶可以是与SEQ ID NO:6的序列具有96％或更高同一性的蛋白质。例如，它可以是来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的SwissProt/UniProt登录号O33677(序列版本1，1998年1月1日，条目版本74，2018年12月5日)的氨基酸序列的β-内酰胺酶蛋白。在一些实施方式中，β-内酰胺酶可以是与SEQ ID NO:6的序列具有95％或更高同一性的蛋白质。例如，它可以是来自鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的具有SwissProt/UniProt登录号H9AXM0(序列版本1，2012年5月16日，条目版本29，2018年12月5)的氨基酸序列的β-内酰胺酶蛋白。
在一些实施方式中，β-内酰胺酶可以是与SEQ ID NO:6的序列具有40％或更高同一性的蛋白质。作为说明性示例，来自结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的菌株CDC1551的具有SwissProt/UniProt登录号P9WKD2(序列版本1，2014年4月16日，条目版本23，2018年12月5日)的序列的酶β-内酰胺酶具有381个氨基酸的序列，其中的93个氨基酸与SEQ ID NO:6的序列相同。在一些实施方式中，β-内酰胺酶可以是与SEQ ID NO:6的序列具有2％或更高同一性的蛋白质。作为说明性示例，来自阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的具有SwissProt/UniProt登录号P05364(序列版本1，1988年11月1日，条目版本109，2018年12月5)的序列的酶β-内酰胺酶具有381个氨基酸的序列，其中的5个氨基酸与SEQ ID NO:6的序列相同。
此外，本文公开的载体包括编码赋予抗生素嘌呤霉素抗性的酶的序列。相应的酶可以是氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotransferase，aph)。赋予抗生素嘌呤霉素抗性的酶也可以是杀稻瘟菌素S脱氨酶(blasticidin S deaminase，bsd)。相应的酶也可以是嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(pac)。
在一些实施方式中，编码嘌呤霉素-N-乙酰转移酶的序列可以是GenBank登录号KF955552.1(版本1，2014年3月3日)的克隆载体pL1F-3的第3094至3954位碱基的序列。该序列是SEQ ID NO:7，并且还作为美国专利US10,113,179的SEQ ID NO:87的载体的第6391至7251位碱基或同一项专利的SEQ ID NO:88的载体的第6565至7425位碱基或SEQ ID NO:221的修复供体盒的第6979至7839位碱基而存在。在一些实施方式中，该序列是SEQ ID NO:7的互补序列，即SEQ ID NO:8。在一些实施方式中，编码嘌呤霉素-N-乙酰转移酶的序列可以是大肠杆菌菌株SRT41的超广谱β内酰胺酶(TEM)基因的序列，该序列具有GenBank登录号MG653169.1(版本1，2018年5月8日)。两个序列都编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
用于对细菌宿主提供氨苄青霉素抗性的酶的启动子可以是β-内酰胺酶启动子，例如SEQID NO:9的序列的启动子。互补序列是SEQ ID NO:10的序列。
载体包括编码要表达的目标多肽的核苷酸序列的插入位点。该插入位点包括一个或多个用于限制酶的限制识别位点。通常，载体具有多克隆位点，也称为多接头。多克隆位点是包含多个限制位点的一小段核酸序列。它可以包括多达约20个限制位点。多克隆位点内的限制位点通常是唯一的，在给定的质粒中仅出现一次。多克隆位点允许将目的基因插入到多克隆位点的区域中。多克隆位点通常紧跟在启动子之后，并在转录终止子之前结束。
由可以被包含在插入位点中的序列表达的目标多肽可以是任何所需的多肽。两个说明性示例是包括功能性抗体片段的抗体和酶。两个另外的说明性示例是生长因子和凝血因子。
插入位点与CMV启动子可操作地连接。CMV启动子可以具有SEQ ID NO:4的序列。CMV启动子还可以具有与SEQ ID NO:4具有99％或更高同一性的序列。CMV启动子可以例如具有或包括在GenBank登录号AF105229.1(1998年12月17日，序列版本1)的克隆载体pHR'-CMVLacZ的第8186至8389位处的hCMV立早启动子的序列。作为进一步的例子，CMV启动子可以具有或包括在GenBank登录号EU753858.1(序列版本1，2009年5月31日)的逆转录病毒表达载体L149的第366至569位处的CRU5嵌合CMV启动子的序列。在一些实施方式中，CMV启动子可以具有与SEQ ID NO:4具有98％或更高同一性的序列。例如，它可以具有或包括在GenBank登录号MH107058.1(序列版本1，2018年10月30日)的表达载体pDEST152的第8806至9009位处的启动子的序列。作为另一个例子，CMV启动子可以具有或包括在GenBank登录号LT727056.1(序列版本1，2017年2月6日)的哺乳动物表达载体pACCMVpLpA-E-hRac1-DN的第1053至1256位处的hCMV-IE启动子的序列。
载体可以包括一个或多个与限制酶的限制性识别位点可操作地连接的另外的启动子，以便能够表达期望的蛋白质，该启动子的序列可以插入到相应的限制位点。例如，载体中可以包括T7噬菌体的启动子，例如T7 RNA聚合酶的启动子。SEQ ID NO:16的序列是T7启动子的示例。
可以根据需要选择载体的细菌复制起点。它通常是质粒起点。通常复制起点是高拷贝数起点。在一个实施方式中，起点是pMB1起点。在一个实施方式中，细菌复制起点是高拷贝数pUC起点。pUC起点是细菌载体所使用的最常见的复制起点。它源自质粒pBR322的pMB1起点，但在起点内包含点取代并且缺失Rop/Rom基因。字母“p”表示起点是环状双链DNA分子(即质粒)的起点。字母“UC”代表“加州大学”。
在一些实施方式中，载体进一步包含表达增强序列元件。这种元件已在WO 1997/025420中公开。通过连接WO 1997/025420的SEQ ID NO:1的两个序列(即WO 1997/025420的SEQ ID NO:1的第8672至12273位核苷酸和第14290至14507位核苷酸)而形成的DNA序列已被描述为具有表达增强活性，参见WO 1997/025420的工作实施例7。同样地，公开了WO1997/025420的SEQ ID NO:1的核苷酸第10100至14293位的序列具有表达增强活性。Aldrich,T.L.,et al,Cytotechnology(1998)28,1-3,9-17公开了称为“截短的EASE元件”的EASE元件。在本公开的上下文中，对应于相应DNA序列的核酸序列可以用作EASE。
在一些实施方式中，表达增强序列元件可以是已知EASE的一部分。在一些实施方式中，EASE可以包括SEQ ID NO:13的序列。SEQ ID NO:13的表达增强序列元件序列例如见于美国专利US6,596,514，见于该文件的长度为14507个碱基的SEQ ID NO:1的第8672至12273位。SEQ ID NO:13的EASE序列也被包括在长度为14462个碱基的GenBank登录号AF193761.1(版本1，1998年11月8日)的CHO序列中。在该序列中，SEQ ID NO:13的EASE序列限定了数据库条目序列的第8627至12228位。在一些实施方式中，EASE由SEQ ID NO:13限定。在一些实施方式中，EASE由SEQ ID NO:14限定。
将EASE包括到含有PGK启动子(例如PGK1启动子，其与编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列可操作地连接)的载体中导致框内插入表达盒插入位点的编码目标多肽的核苷酸序列的表达增加。在一些实施方式中，表达是瞬时表达。因此，在一些实施方式中，将EASE包括到载体中导致目标多肽的高瞬时表达。在这方面，发明人已经发现，EASE促进稳定整合的能力导致载体的瞬时基因产生期相对于缺乏EASE的相同载体延长的状态。由于导致目标多肽表达的质粒在宿主细胞中保留的时间更长，导致产生更多的目标多肽，所以产生的目标多肽的总量增加。
可以由根据本公开的表达载体表达的目标多肽可以是，例如，治疗性多肽。治疗性多肽的两个说明性示例是粘附分子和细胞因子。治疗性多肽的另外两个示例是酶和受体。治疗性多肽的另一个示例是淋巴因子。抗体轻链和/或重链是治疗性多肽的又一个例子。在一些实施方式中，表达载体适于表达两个目标多肽，例如异二聚体蛋白质的各个多肽链。
在一些实施方式中，如本文所公开的载体可以包含两个目标多肽表达盒。在一些实施方式中，这两个目标多肽表达盒的组成可以是相同的。一旦编码相应的目标多肽的序列插入载体中，则在这种情况下目标多肽表达盒仅在编码目标多肽的序列上不同。在一些实施方式中，两个这种目标多肽表达盒在载体中串联排列。
采用本文公开的表达载体的方法以及用途可以分别是产生多肽的方法或用途。这种多肽在本文中也称为“目标多肽”。该方法或用途可以是用于实现目标蛋白质产量提高的方法或用途。这种方法或用途可以涉及培养重组宿主细胞，例如包括如本文公开的表达载体的CHO或NS0宿主细胞。在这种实施方式中，表达载体通常包括编码目标多肽的序列。如上所述，这种序列被包含在编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点处。相应的序列通常与巨细胞病毒(CMV)启动子一起在框内。在一些实施方式中，编码目标多肽的核苷酸序列与被包括在选择盒中的PGK启动子和编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列一起在框内。
相应的方法或用途可以涉及以分批或补料分批过程培养宿主细胞。相应的方法或用途还可以涉及以连续模式培养宿主细胞。通常在允许或促进多肽表达的条件下培养细胞。相应的方法或用途可以包括回收多肽。
相应的方法或用途还可以包括基于包含编码谷氨酰胺合成酶的序列的选择盒的存在来选择宿主细胞，从而导致谷氨酰胺合成酶表达。在这方面，可以在培养基中不存在谷氨酰胺的情况下培养宿主细胞。
根据本公开的方法的任何数量的步骤，包括整个方法，可以自动化方式执行，也可以重复执行，例如使用市售机器人。计算机可执行指令可以例如控制数据分析或控制在相应方法中采用的运动的机械过程。
本说明书中先前公布的文件的列表或讨论不应被视为承认该文件是现有技术的一部分或公知常识。
本文说明性地描述的发明可以在缺少任何一种或多种本申请未具体公开的要素或限定的情况下适当地实施。另外，本文所用的术语和表达是用作描述性而非限制性的术语，且使用这种术语和表达无意排除所述和所示的特征或其部分的任何等同物，但是，应当认识到可以在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，虽然已经通过优选实施方式和可选特征具体公布了本发明，但是本领域技术人员仍然可以对在此公开的本发明进行修改和变化，并且这种修改和变化被认为是在本发明的范围内。
本文对本发明进行了广泛且一般性的描述。属于一般公开内容的每种较窄的种类和亚类也构成本发明的一部分。这包括本发明中的一般性描述，带有附带条件或从属类中排除任何主题的否定性限制，无论所去除的材料是否在本申请中具体记载。
其它实施方式也包含在所附权利要求的范围内。此外，在根据马库什(Markush)组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本发明因此也根据马库什组的任何个体成员或成员子组来描述。
为了使本发明可以被容易地理解并付诸实际效果，现在将通过下列非限制性实施例来描述具体的实施方式。
实施例
实施例说明了基于载体pcDNA 3.1(+)生成并使用表达载体。
材料
酶列表：
试剂盒列表：
| 编号 | 试剂盒名称 | 制造商 | 目录号 |
| 1 | Qiagen快速凝胶提取试剂盒 | Qiagen | K210012 |
| 2 | Qiaprep Spin Mini prep试剂盒 | Qiagen | 27106 |
| 3 | Endofree-Maxi prep试剂盒 | Qiagen | 12362 |
试剂：
| 编号 | 试剂 | 制造商 | 目录号 |
| 1 | 溴化乙锭 | SIGMA | E8751-1G |
| 2 | 1kb标记 | Thermo Scientific | SM0311 |
使用的培养基成分：
| 编号 | 培养基名称 | 制造商 | 目录号 |
| 1 | LB琼脂 | Himedia | M557 |
| 2 | LB肉汤 | Himedia | M575 |
使用的菌株：
| 编号 | 菌株和载体 | 公司 | 目录号 |
| 1 | E coli Top-10 | Invitrogen | NAP |
过程
为了组装四种载体，设计并由geneart合成了三个片段，命名为：GA片段1：pMBL C-GS；GA片段2：嘌呤霉素基因片段；和GA片段3：EASE。
这三个片段的引用/来源如下：
GA片段1：pMBL C-GS的来源
表1
pcDNA 3.1(+)的载体图如图1A所示，它是GA片段1的亲本载体。使用Vector NTI版本11.5.1对亲本内部载体进行了修改。所得载体pMBL C-GS的内部载体图谱如图1B所示。具体修改见上表。
嘌呤霉素参考(GA片段2)：
嘌呤霉素基因盒来源于Invitrogen的pCHO1.0载体。嘌呤霉素的基因是从GA合成的，在序列的5'端带有SalI位点，在序列的3'端带有SmaI位点。
EASE参考(GA片段3)：
EASE片段来源于GenBank登录号AF193761.1的8672bp至12274bp。该序列是订购自Geneart，在序列的5'端有带有BglII位点，在序列的3'端带有BamHI位点。
方法工作流程
这三个片段是由geneart合成的，每个片段的参考在上表1中给出：
下表2提供了组装载体的概要。
表2：
载体pMBL C-GS的表征
将从Geneart获得的载体pMBL C-GS(GA片段1)在25μL无菌水中重悬，以获得最终浓度200ng/μL。
将1μL转化到CCB00024/CHE化学感受态细胞。将单菌落划线并接种以进行质粒分离。然后将过夜培养物作为甘油储备液储存。分离了质粒。
通过限制消化和随后的琼脂糖凝胶电泳分析质粒储备液。图5A描绘了获得的凝胶。
载体pMBL CE-GS的表征
EASE片段从Geneart获得(GA片段3)。EASE元件已被亚克隆到CMV启动子的上游的BglII位点，从而获得载体pMBL C-GS。将EASE片段在50μL无菌水中重悬，以获得最终浓度100ng/μL。
将1μL转化到CCB00024化学感受态细胞。
将获得的单菌落划线并分离质粒。通过使用BglII+BamHI位点将EASE片段从GA片段3中释放出来，并在BglII位点克隆到pMBL C-GS(PLB00876)中。获得的载体是pMBL CE-GS。
通过限制消化和随后的琼脂糖凝胶电泳分析载体pMBL CE-GS的特性。图5B描绘了获得的凝胶。
载体pMBL CE-Puro的表征
嘌呤霉素基因(GA片段2)从Geneart获得。EASE元件已被亚克隆到CMV启动子的上游的BglII位点，并且如前所述GS ORF已在SmaI/SalI位点被CHO的嘌呤霉素选择标记替换。将片段在50μL无菌水中重悬，以获得最终浓度100ng/μL。
将1μL转化到CCB00024化学感受态细胞。将单菌落划线并分离质粒。
将来自GA片段2的嘌呤霉素基因克隆到载体pMBL CE-GS的SmaI+SalI位点。获得的载体是载体pMBL CE-Puro。
通过限制消化和随后的琼脂糖凝胶电泳分析载体PMBL CE-Puro的特性。图5C描绘了获得的凝胶。
载体pMBL C-Puro的表征
嘌呤霉素基因(GA片段2)从Geneart获得。如上所述，GS ORF已在SmaI/SalI位点被CHO的嘌呤霉素选择标记替代。将片段在50μL无菌水中重悬，以获得最终浓度100ng/μL。
将1μL转化到CCB00024/CHE化学感受态细胞。将单菌落划线并分离质粒。
来自GA片段2的嘌呤霉素片段通过使用SmaI+SalI位点进行释放，并在SmaI+SalI位点克隆到载体pMBL C-GS中。获得的载体是载体pMBL C-Puro。
通过限制消化和随后的琼脂糖凝胶电泳分析载体PMBL C-Puro的特性。图5D描绘了获得的凝胶。
载体评估
根据它们在基于CHO的细胞系中驱动异源基因表达的能力，进一步评估组装的载体。首先，选择pMBL CE-GS进行评估。在pMBL CE-GS中创建了以下构建体：
表3：为载体评估所测试的构建体
实验1：
将GFP在XhoI-NotI位点克隆到载体pMBL CE-GS中。该质粒作为转染效率对照以评估pMBL CE-GS。通过瞬时基因表达评估质粒。瞬时转染以共转染模式进行。所有转染均使用ExpiCHOTM表达系统(来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific Inc.，货号A29133)进行，这是一种基于悬浮适应的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的高产率瞬时表达系统。按照expiCHO-S表达系统手册解冻ExpiCHO-S细胞。在解冻后至少传代两次后，在转染前一天以3.5×106个细胞/ml接种细胞进行转染。在接种后的第1天，对于每个转染，估计细胞计数，并通过用新鲜预热的培养基稀释，将细胞计数调整至6.0×106个细胞/ml。根据expiCHO-S表达系统手册进行转染。在培养物中以1μg/ml的终浓度转染DNA。根据制造商的方案添加Expifectamine和补料。所有转染均遵循最大滴度方案。将转染烧瓶在8％CO2的加湿气氛下在定轨振荡器上于～37℃培养箱中进行培养。在第0、2、5、7、9和12天估计VCD和活力。当活力降至50％以下时收获培养物。
实验2：
将抗CTLA4抗体(Bmab700)的重链和轻链克隆到载体pMBLCE-GS和pMBLC-GS的XhoI-NotI位点。将所得构建体与Bmab700-SSC/pCHO1.0 M(HC和LC克隆在两个单独的载体中并共转染)和Bmab700-DGC/pCHO1.0(HC和LC克隆在单个载体中)进行比较评估。四种构建体通过瞬时基因表达进行比较。
瞬时转染以共转染模式进行。所有转染均使用ExpiCHOTM表达系统(来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific Inc.，货号A29133)进行，这是一种基于悬浮适应的CHO细胞的高产率瞬时表达系统。根据expiCHO-S表达系统手册解冻ExpiCHO-S细胞。在解冻后至少传代两次后，在转染前一天以3.5×106个细胞/ml接种细胞进行转染。在接种后的第1天，对于每个转染，估计细胞计数，并通过用新鲜预热的培养基稀释，将细胞计数调整至6.0×106个细胞/ml。按照expiCHO-S表达系统手册进行转染。在培养物中以1μg/ml的终浓度转染DNA。根据制造商的方案添加Expifectamine和补料。所有转染均遵循最大滴度方案。将转染烧瓶在8％CO2的加湿气氛下在定轨振荡器上于～37℃培养箱中进行培养。在第0、2、5、7、9和12天估计VCD和活力。在第15天收获培养物，结果描述于图7A中。
培养在容量为125ml的摇瓶中进行，其中使用了25ml的运行体积。
结果描述于图7A中。
实验3：
将抗CD20融合mabs的HC和LC在XhoI-NotI位点克隆到载体pMBL CE-GS中。通过瞬时基因表达评估所得构建体的滴度分析。以共转染模式进行瞬时转染。所有转染均使用ExpiCHOTM表达系统(来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific Inc.，货号A29133)进行，这是一种基于悬浮适应的CHO细胞的高产率瞬时表达系统。按照expiCHO-S表达系统手册解冻ExpiCHO-S细胞。在解冻后至少传代2次后，在转染前一天以3.5×106个细胞/ml接种细胞进行转染。在接种后的第1天，对于每个转染，估计细胞计数，并通过用新鲜预热的培养基稀释，将细胞计数调整至6.0×106个细胞/ml。按照expiCHO-S表达系统手册进行转染。在培养物中以1μg/ml的终浓度转染DNA。按照制造商的方案添加Expifectamine和补料。所有转染均遵循最大滴度方案。将转染烧瓶在8％CO2的加湿气氛下在定轨振荡器上于～37℃培养箱中进行培养。在第0、2、5、7、9和12天估计VCD和活力。在第14天收获培养物。结果描述于图7B中。
序列表
<110> 拜康生物制品印度有限公司
<120> 哺乳动物表达载体
<130> PCT00887
<150> IN 201941022723
<151> 2019-06-07
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1624
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CHO glutamine synthetase linked to a PGK promoter
<400> 1
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcctttct cgatggccac ctcagcaagt tcccacttga acaaaaacat 540
caagcaaatg tacttgtgcc tgccccaggg tgagaaagtc caagccatgt atatctgggt 600
tgatggtact ggagaaggac tgcgctgcaa aacccgcacc ctggactgtg agcccaagtg 660
tgtagaagag ttacctgagt ggaattttga tggctctagt acctttcagt ctgagggctc 720
caacagtgac atgtatctca gccctgttgc catgtttcgg gaccccttcc gcagagatcc 780
caacaagctg gtgttctgtg aagttttcaa gtacaaccgg aagcctgcag agaccaattt 840
aaggcactcg tgtaaacgga taatggacat ggtgagcaac cagcacccct ggtttggaat 900
ggaacaggag tatactctga tgggaacaga tgggcaccct tttggttggc cttccaatgg 960
ctttcctggg ccccaaggtc cgtattactg tggtgtgggc gcagacaaag cctatggcag 1020
ggatatcgtg gaggctcact accgcgcctg cttgtatgct ggggtcaaga ttacaggaac 1080
aaatgctgag gtcatgcctg cccagtggga attccaaata ggaccctgtg aaggaatccg 1140
catgggagat catctctggg tggcccgttt catcttgcat cgagtatgtg aagactttgg 1200
ggtaatagca acctttgacc ccaagcccat tcctgggaac tggaatggtg caggctgcca 1260
taccaacttt agcaccaagg ccatgcggga ggagaatggt ctgaagcaca tcgaggaggc 1320
catcgagaaa ctaagcaagc ggcaccggta ccacattcga gcctacgatc ccaagggggg 1380
cctggacaat gcccgtcgtc tgactgggtt ccacgaaacg tccaacatca acgacttttc 1440
tgctggtgtc gccaatcgca gtgccagcat ccgcattccc cggactgtcg gccaggagaa 1500
gaaaggttac tttgaagacc gccgcccctc tgccaattgt gacccctttg cagtgacaga 1560
agccatcgtc cgcacatgcc ttctcaatga gactggcgac gagcccttcc aatacaaaaa 1620
ctaa 1624
<210> 2
<211> 496
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> PGK promoter
<400> 2
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcct 496
<210> 3
<211> 1122
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> GS ORF
<400> 3
atggccacct cagcaagttc ccacttgaac aaaaacatca agcaaatgta cttgtgcctg 60
ccccagggtg agaaagtcca agccatgtat atctgggttg atggtactgg agaaggactg 120
cgctgcaaaa cccgcaccct ggactgtgag cccaagtgtg tagaagagtt acctgagtgg 180
aattttgatg gctctagtac ctttcagtct gagggctcca acagtgacat gtatctcagc 240
cctgttgcca tgtttcggga ccccttccgc agagatccca acaagctggt gttctgtgaa 300
gttttcaagt acaaccggaa gcctgcagag accaatttaa ggcactcgtg taaacggata 360
atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta tactctgatg 420
ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc ccaaggtccg 480
tattactgtg gtgtgggcgc agacaaagcc tatggcaggg atatcgtgga ggctcactac 540
cgcgcctgct tgtatgctgg ggtcaagatt acaggaacaa atgctgaggt catgcctgcc 600
cagtgggaat tccaaatagg accctgtgaa ggaatccgca tgggagatca tctctgggtg 660
gcccgtttca tcttgcatcg agtatgtgaa gactttgggg taatagcaac ctttgacccc 720
aagcccattc ctgggaactg gaatggtgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 780
atgcgggagg agaatggtct gaagcacatc gaggaggcca tcgagaaact aagcaagcgg 840
caccggtacc acattcgagc ctacgatccc aaggggggcc tggacaatgc ccgtcgtctg 900
actgggttcc acgaaacgtc caacatcaac gacttttctg ctggtgtcgc caatcgcagt 960
gccagcatcc gcattccccg gactgtcggc caggagaaga aaggttactt tgaagaccgc 1020
cgcccctctg ccaattgtga cccctttgca gtgacagaag ccatcgtccg cacatgcctt 1080
ctcaatgaga ctggcgacga gcccttccaa tacaaaaact aa 1122
<210> 4
<211> 204
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CMV promoter
<400> 4
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 5
<211> 373
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> CHO glutamine synthetase
<400> 5
Met Ala Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Asn Ile Lys Gln Met
1 5 10 15
Tyr Leu Cys Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp
20 25 30
Val Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp
35 40 45
Cys Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Thr Phe Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Pro Val Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Arg Asp Pro Asn Lys Leu
85 90 95
Val Phe Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Lys Pro Ala Glu Thr Asn
100 105 110
Leu Arg His Ser Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His
115 120 125
Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly
130 135 140
His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro
145 150 155 160
Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Lys Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val
165 170 175
Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Thr Gly
180 185 190
Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro
195 200 205
Cys Glu Gly Ile Arg Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile
210 215 220
Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro
225 230 235 240
Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe
245 250 255
Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys His Ile Glu Glu
260 265 270
Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Arg Tyr His Ile Arg Ala Tyr
275 280 285
Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Gly Leu Thr Gly Phe His
290 295 300
Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Ser
305 310 315 320
Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr
325 330 335
Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ala Val Thr
340 345 350
Glu Ala Ile Val Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro
355 360 365
Phe Gln Tyr Lys Asn
370
<210> 6
<211> 286
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> AmpR
<400> 6
Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala
1 5 10 15
Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys
20 25 30
Asp Ala Glu Asp Gln Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp
35 40 45
Leu Asn Ser Gly Lys Ile Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe
50 55 60
Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser
65 70 75 80
Arg Ile Asp Ala Gly Gln Glu Gln Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser
85 90 95
Gln Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr
100 105 110
Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala Ile Thr Met Ser
115 120 125
Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr Ile Gly Gly Pro Lys
130 135 140
Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu
145 150 155 160
Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Asp Glu Arg
165 170 175
Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu
180 185 190
Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gln Gln Leu Ile Asp Trp
195 200 205
Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro
210 215 220
Ala Gly Trp Phe Ile Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser
225 230 235 240
Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile
245 250 255
Val Val Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gln Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn
260 265 270
Arg Gln Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp
275 280 285
<210> 7
<211> 861
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AmpR
<400> 7
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggttct 720
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840
tcactgatta agcattggta a 861
<210> 8
<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AmpR, complementary sequence
<400> 8
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 60
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 120
cagtgctgca atgataccgc gagaaccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 180
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 240
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 300
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 360
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 420
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 480
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 540
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 600
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 660
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 720
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 780
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 840
acggaaatgt tgaatactca t 861
<210> 9
<211> 105
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AmpR promoter
<400> 9
cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60
caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagt 105
<210> 10
<211> 105
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> AmpR promoter, complementary sequence
<400> 10
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcg 105
<210> 11
<211> 589
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ori
<400> 11
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 420
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589
<210> 12
<211> 589
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> ori, complementary sequence
<400> 12
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420
taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaa 589
<210> 13
<211> 3603
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> EASE
<400> 13
caattctaca gaaaattgtt gcacctgttc agagtctaat tattgttttg caggcacagt 60
atgacaagta agtatctgtt gaatacattg taattcctaa attctatgga acttaaattt 120
gttctcagga tacaaaatgt acttgaaatt ttccttattt accttgtaaa cataataaaa 180
gttggtatta aaccataaag tttataacac caagcaaata attcaaacta acatggctca 240
tacatgaagt catctggcta aagaatgttt cttgaagttt atttctagaa cagcaaatgc 300
caactatctt ttaaaaaaat aatttaagaa aatgagcaaa agagcagttt aattaagtaa 360
cacctaatta gctttaagga gaccaaggca aagcctgcca aaagattaac accattactt 420
atctgttcga aaactactga cgacttacat tctggatgta tttaaaaaaa aaaaaaaaaa 480
ctaaattgct ttatcctatc aagttgtaca agatacccac gagacagaca atatagtatg 540
tcaatcagtt aagacgttaa atgacaaaaa catgttaaat caaaaataat tcttctttcc 600
tgctattttt aaatgttata aaatgcagct aggagctttt actattactc tgtggtgcaa 660
agtctacatg gtaattggca gcagccaaaa cagaatggca taccggcact tgatattgct 720
gtgtaaagaa aatataagtt tccagaggta caaaaatact actttgcagg tgccaaccaa 780
ccaccaggac tttagctggc tgtaaaggca gcttatttct gcaatcaaac cgaaagcatt 840
ttcacacaga agatggagtc tgcagcccta tgtgatctga agcagggcta atctgcacag 900
agcaaacaat cagggagggc cagccctgct gggaaggtcg cattctccca cagcaacaag 960
gcagggcaac taagcagcac attgcagcaa gaggacaaca gacagcctgt ccccagaacc 1020
gcccagccgc atgcacaaca accaacagag gattcagagc aaggggatgc tcttacctct 1080
tttatgtaat tccctcaagg ggatattgtc tcctcccccg tcataaggca aatagggatc 1140
ggaagaagca tccatgatca gaattttttt aaaagaaaaa aaaaaagatg aagaaaagag 1200
aagcttgcta gattaaaaag atggtggcat tttttcctcc ccctgctata gcaggcaagg 1260
gagatgccat atttgatgag gttggaactg tatagttcga ctggctgaag caactgggtt 1320
cttccacagt ggatgatgtc atcaaaggga aattattgca gcctggttgc tagtggctac 1380
aatctagccc ggcttagagg cagcacagcc ttcttaatca ggtcctgttg tgtacgacga 1440
tgactaagcg ccaagtataa caggcgaaac tgctttgaga aatttaaagt gctcacaacg 1500
tagtttcagt agtaagacag cagaaacatt tatttttatt tggaaaaaat ataagacata 1560
aaaaggtaat tccaaatgct aacaatggca ctttagccaa acagaaaact ctaaaaaggc 1620
tatgttttta taaatgtact aatttatgca taaattcatg agtcataaca gtgaaaacta 1680
aagcacacca acaagtttct ccagagtctt ggctttaaga atttgtttaa ttttccttta 1740
atccttttat ggaaaattta aatgctgagt cactgagttg aatgagtggt gttttatctc 1800
atttaccaat cccctccagc ggcctcccgt tccctttttc aaacccagcc acaagacact 1860
ccagttgggg gaaaaagtga aaacttaccc gtatactaat aactcctaca tgtgcaaatt 1920
atgcaaaaag attaactacg taggagacgt tctattttgc tgttttccaa cttacagaag 1980
attatgtact tagaaagact tttagtagaa aaatgtctat caaagttagc tactcccact 2040
gtctctgtgc tagaaaattt taagtttaga aatgtaactt ttgttttaat acggcattcc 2100
aaacataact agtgctcatg agtgatagga gttcagggtt tacagattcc tctaaggcgg 2160
ggtctctgac tggagcagtc ttctaaaatg cctgttatgt agtgcaatta gtaaataaag 2220
ggtgatgtcc accacgaact tgggcacagg gtctataaaa tgtgttttct tcaggcatga 2280
atgaatcaac ctctaagatc cgctccaact ctgcatatct gaaaactgca ggtaagaaga 2340
gaggaataaa gtctattcat ttagcctggt ctgttttcag ttgttctgga gtcttttctc 2400
tcccaagttt gttaagttag ataggtttct atatttcaaa agcttgaaac tcaaacaaaa 2460
gtccacaggg aatctggaag tcaagactcc aggaaaagaa tccagaccag aactaggatg 2520
acagggaatt acattttaag caaggaaagc tttgacaaag ccaattttac tgaactagtt 2580
cagtgtgaat ttggtcattt gctgttctct ggtataatat atactgcata gcactcattt 2640
cacctgcatg agactatttt cttactcgcc ttaccagaac atgagaaacc ttcccacaaa 2700
cctccctggc atttgtgcac tctctccaaa cttggtcaca aagaatgaag aggacagtac 2760
tagaggagga atattacgcc tgtgaaatgt tgacaatgcc aagtgaactt tgtagctata 2820
ctgacttact tttcaagata aaaaaaaaat catgtgcata tgatatatat tattgtgcta 2880
gcatttgcac agaggtagtt ttagaataag acaaagttta acagctgtta tcactgagca 2940
atgaggcaga agaggaaagt gggcttgcac tcactactaa tcagctagag atcaggttaa 3000
ctgagaggag attccaagat tggacccagg gcctcctgca tgctgagtgt gtgctctacc 3060
cctgggttgc atctccagct cttcattaga attttttaaa cgaacatatt acttttataa 3120
taatgaaagt gaatttcttt ctatttcctg ttattcatgc ataacaggat tcacagaaga 3180
cacttcctct tcggacacat ttggaaacac aaggcagtaa gccttacttt acagttagcc 3240
ctcttgccta agagaaagcc gagggggaag aaagagagca aagctttcag aaaaggaatc 3300
cattaaagct acagagatgc ttcgaagtta gaacaccatg aaacaaagaa gcactaagag 3360
gtctaagacg taaaccctcc ccaaaaagcc aagcctacaa taaactgaaa ttacaaagta 3420
attctgtgat gttcgtacct cataaagttt tagatcctca cctacgcaaa catactttgc 3480
agtcgctctt tagaaaaggg caaggtacaa tggaaggaga gacaggactg tgaccaggaa 3540
attaaaatgg attacaatta gggtgtggta gaagggaagg gaacaaaaga aaagttcaga 3600
att 3603
<210> 14
<211> 3603
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> EASE, complementary sequence
<400> 14
aattctgaac ttttcttttg ttcccttccc ttctaccaca ccctaattgt aatccatttt 60
aatttcctgg tcacagtcct gtctctcctt ccattgtacc ttgccctttt ctaaagagcg 120
actgcaaagt atgtttgcgt aggtgaggat ctaaaacttt atgaggtacg aacatcacag 180
aattactttg taatttcagt ttattgtagg cttggctttt tggggagggt ttacgtctta 240
gacctcttag tgcttctttg tttcatggtg ttctaacttc gaagcatctc tgtagcttta 300
atggattcct tttctgaaag ctttgctctc tttcttcccc ctcggctttc tcttaggcaa 360
gagggctaac tgtaaagtaa ggcttactgc cttgtgtttc caaatgtgtc cgaagaggaa 420
gtgtcttctg tgaatcctgt tatgcatgaa taacaggaaa tagaaagaaa ttcactttca 480
ttattataaa agtaatatgt tcgtttaaaa aattctaatg aagagctgga gatgcaaccc 540
aggggtagag cacacactca gcatgcagga ggccctgggt ccaatcttgg aatctcctct 600
cagttaacct gatctctagc tgattagtag tgagtgcaag cccactttcc tcttctgcct 660
cattgctcag tgataacagc tgttaaactt tgtcttattc taaaactacc tctgtgcaaa 720
tgctagcaca ataatatata tcatatgcac atgatttttt ttttatcttg aaaagtaagt 780
cagtatagct acaaagttca cttggcattg tcaacatttc acaggcgtaa tattcctcct 840
ctagtactgt cctcttcatt ctttgtgacc aagtttggag agagtgcaca aatgccaggg 900
aggtttgtgg gaaggtttct catgttctgg taaggcgagt aagaaaatag tctcatgcag 960
gtgaaatgag tgctatgcag tatatattat accagagaac agcaaatgac caaattcaca 1020
ctgaactagt tcagtaaaat tggctttgtc aaagctttcc ttgcttaaaa tgtaattccc 1080
tgtcatccta gttctggtct ggattctttt cctggagtct tgacttccag attccctgtg 1140
gacttttgtt tgagtttcaa gcttttgaaa tatagaaacc tatctaactt aacaaacttg 1200
ggagagaaaa gactccagaa caactgaaaa cagaccaggc taaatgaata gactttattc 1260
ctctcttctt acctgcagtt ttcagatatg cagagttgga gcggatctta gaggttgatt 1320
cattcatgcc tgaagaaaac acattttata gaccctgtgc ccaagttcgt ggtggacatc 1380
accctttatt tactaattgc actacataac aggcatttta gaagactgct ccagtcagag 1440
accccgcctt agaggaatct gtaaaccctg aactcctatc actcatgagc actagttatg 1500
tttggaatgc cgtattaaaa caaaagttac atttctaaac ttaaaatttt ctagcacaga 1560
gacagtggga gtagctaact ttgatagaca tttttctact aaaagtcttt ctaagtacat 1620
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cataatttgc acatgtagga gttattagta tacgggtaag ttttcacttt ttcccccaac 1740
tggagtgtct tgtggctggg tttgaaaaag ggaacgggag gccgctggag gggattggta 1800
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gattaaagga aaattaaaca aattcttaaa gccaagactc tggagaaact tgttggtgtg 1920
ctttagtttt cactgttatg actcatgaat ttatgcataa attagtacat ttataaaaac 1980
atagcctttt tagagttttc tgtttggcta aagtgccatt gttagcattt ggaattacct 2040
ttttatgtct tatatttttt ccaaataaaa ataaatgttt ctgctgtctt actactgaaa 2100
ctacgttgtg agcactttaa atttctcaaa gcagtttcgc ctgttatact tggcgcttag 2160
tcatcgtcgt acacaacagg acctgattaa gaaggctgtg ctgcctctaa gccgggctag 2220
attgtagcca ctagcaacca ggctgcaata atttcccttt gatgacatca tccactgtgg 2280
aagaacccag ttgcttcagc cagtcgaact atacagttcc aacctcatca aatatggcat 2340
ctcccttgcc tgctatagca gggggaggaa aaaatgccac catcttttta atctagcaag 2400
cttctctttt cttcatcttt ttttttttct tttaaaaaaa ttctgatcat ggatgcttct 2460
tccgatccct atttgcctta tgacggggga ggagacaata tccccttgag ggaattacat 2520
aaaagaggta agagcatccc cttgctctga atcctctgtt ggttgttgtg catgcggctg 2580
ggcggttctg gggacaggct gtctgttgtc ctcttgctgc aatgtgctgc ttagttgccc 2640
tgccttgttg ctgtgggaga atgcgacctt cccagcaggg ctggccctcc ctgattgttt 2700
gctctgtgca gattagccct gcttcagatc acatagggct gcagactcca tcttctgtgt 2760
gaaaatgctt tcggtttgat tgcagaaata agctgccttt acagccagct aaagtcctgg 2820
tggttggttg gcacctgcaa agtagtattt ttgtacctct ggaaacttat attttcttta 2880
cacagcaata tcaagtgccg gtatgccatt ctgttttggc tgctgccaat taccatgtag 2940
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gcaggaaaga agaattattt ttgatttaac atgtttttgt catttaacgt cttaactgat 3060
tgacatacta tattgtctgt ctcgtgggta tcttgtacaa cttgatagga taaagcaatt 3120
tagttttttt tttttttttt aaatacatcc agaatgtaag tcgtcagtag ttttcgaaca 3180
gataagtaat ggtgttaatc ttttggcagg ctttgccttg gtctccttaa agctaattag 3240
gtgttactta attaaactgc tcttttgctc attttcttaa attatttttt taaaagatag 3300
ttggcatttg ctgttctaga aataaacttc aagaaacatt ctttagccag atgacttcat 3360
gtatgagcca tgttagtttg aattatttgc ttggtgttat aaactttatg gtttaatacc 3420
aacttttatt atgtttacaa ggtaaataag gaaaatttca agtacatttt gtatcctgag 3480
aacaaattta agttccatag aatttaggaa ttacaatgta ttcaacagat acttacttgt 3540
catactgtgc ctgcaaaaca ataattagac tctgaacagg tgcaacaatt ttctgtagaa 3600
ttg 3603
<210> 15
<211> 3608
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> EASE
<400> 15
gatctaattc tgaacttttc ttttgttccc ttcccttcta ccacacccta attgtaatcc 60
attttaattt cctggtcaca gtcctgtctc tccttccatt gtaccttgcc cttttctaaa 120
gagcgactgc aaagtatgtt tgcgtaggtg aggatctaaa actttatgag gtacgaacat 180
cacagaatta ctttgtaatt tcagtttatt gtaggcttgg ctttttgggg agggtttacg 240
tcttagacct cttagtgctt ctttgtttca tggtgttcta acttcgaagc atctctgtag 300
ctttaatgga ttccttttct gaaagctttg ctctctttct tccccctcgg ctttctctta 360
ggcaagaggg ctaactgtaa agtaaggctt actgccttgt gtttccaaat gtgtccgaag 420
aggaagtgtc ttctgtgaat cctgttatgc atgaataaca ggaaatagaa agaaattcac 480
tttcattatt ataaaagtaa tatgttcgtt taaaaaattc taatgaagag ctggagatgc 540
aacccagggg tagagcacac actcagcatg caggaggccc tgggtccaat cttggaatct 600
cctctcagtt aacctgatct ctagctgatt agtagtgagt gcaagcccac tttcctcttc 660
tgcctcattg ctcagtgata acagctgtta aactttgtct tattctaaaa ctacctctgt 720
gcaaatgcta gcacaataat atatatcata tgcacatgat ttttttttta tcttgaaaag 780
taagtcagta tagctacaaa gttcacttgg cattgtcaac atttcacagg cgtaatattc 840
ctcctctagt actgtcctct tcattctttg tgaccaagtt tggagagagt gcacaaatgc 900
cagggaggtt tgtgggaagg tttctcatgt tctggtaagg cgagtaagaa aatagtctca 960
tgcaggtgaa atgagtgcta tgcagtatat attataccag agaacagcaa atgaccaaat 1020
tcacactgaa ctagttcagt aaaattggct ttgtcaaagc tttccttgct taaaatgtaa 1080
ttccctgtca tcctagttct ggtctggatt cttttcctgg agtcttgact tccagattcc 1140
ctgtggactt ttgtttgagt ttcaagcttt tgaaatatag aaacctatct aacttaacaa 1200
acttgggaga gaaaagactc cagaacaact gaaaacagac caggctaaat gaatagactt 1260
tattcctctc ttcttacctg cagttttcag atatgcagag ttggagcgga tcttagaggt 1320
tgattcattc atgcctgaag aaaacacatt ttatagaccc tgtgcccaag ttcgtggtgg 1380
acatcaccct ttatttacta attgcactac ataacaggca ttttagaaga ctgctccagt 1440
cagagacccc gccttagagg aatctgtaaa ccctgaactc ctatcactca tgagcactag 1500
ttatgtttgg aatgccgtat taaaacaaaa gttacatttc taaacttaaa attttctagc 1560
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tacataatct tctgtaagtt ggaaaacagc aaaatagaac gtctcctacg tagttaatct 1680
ttttgcataa tttgcacatg taggagttat tagtatacgg gtaagttttc actttttccc 1740
ccaactggag tgtcttgtgg ctgggtttga aaaagggaac gggaggccgc tggaggggat 1800
tggtaaatga gataaaacac cactcattca actcagtgac tcagcattta aattttccat 1860
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cttagtcatc gtcgtacaca acaggacctg attaagaagg ctgtgctgcc tctaagccgg 2220
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tgtggaagaa cccagttgct tcagccagtc gaactataca gttccaacct catcaaatat 2340
ggcatctccc ttgcctgcta tagcaggggg aggaaaaaat gccaccatct ttttaatcta 2400
gcaagcttct cttttcttca tctttttttt tttcttttaa aaaaattctg atcatggatg 2460
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tgtttgctct gtgcagatta gccctgcttc agatcacata gggctgcaga ctccatcttc 2760
tgtgtgaaaa tgctttcggt ttgattgcag aaataagctg cctttacagc cagctaaagt 2820
cctggtggtt ggttggcacc tgcaaagtag tatttttgta cctctggaaa cttatatttt 2880
ctttacacag caatatcaag tgccggtatg ccattctgtt ttggctgctg ccaattacca 2940
tgtagacttt gcaccacaga gtaatagtaa aagctcctag ctgcatttta taacatttaa 3000
aaatagcagg aaagaagaat tatttttgat ttaacatgtt tttgtcattt aacgtcttaa 3060
ctgattgaca tactatattg tctgtctcgt gggtatcttg tacaacttga taggataaag 3120
caatttagtt tttttttttt tttttaaata catccagaat gtaagtcgtc agtagttttc 3180
gaacagataa gtaatggtgt taatcttttg gcaggctttg ccttggtctc cttaaagcta 3240
attaggtgtt acttaattaa actgctcttt tgctcatttt cttaaattat ttttttaaaa 3300
gatagttggc atttgctgtt ctagaaataa acttcaagaa acattcttta gccagatgac 3360
ttcatgtatg agccatgtta gtttgaatta tttgcttggt gttataaact ttatggttta 3420
ataccaactt ttattatgtt tacaaggtaa ataaggaaaa tttcaagtac attttgtatc 3480
ctgagaacaa atttaagttc catagaattt aggaattaca atgtattcaa cagatactta 3540
cttgtcatac tgtgcctgca aaacaataat tagactctga acaggtgcaa caattttctg 3600
tagaattg 3608
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> T7 promoter
<400> 16
taatacgact cactatagg 19
Claims (15)
1.一种用于哺乳动物细胞的表达载体，包括：
(a)包含编码作为真核选择标记的谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列的选择盒，所述核苷酸序列可操作地连接至3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和多腺苷酸化(pA)信号；
(b)包含编码作为细菌选择标记的将抗生素抗性赋予细菌宿主的酶的核苷酸序列的选择盒，所述核苷酸序列可操作地连接至合适的启动子；
(c)用于目标多肽的表达盒，所述表达盒包含编码目标多肽的核苷酸序列的插入位点，所述插入位点可操作地连接至巨细胞病毒(CMV)启动子和多腺苷酸化(pA)信号；和
(d)细菌复制起点。
2.根据权利要求1所述的表达载体，还包括表达增强序列元件(EASE)。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，还包含：包括编码作为真核选择标记的赋予抗生素嘌呤霉素抗性的酶的核苷酸序列的选择盒，所述核苷酸序列可操作地连接至3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子和多腺苷酸化(pA)信号。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述赋予抗生素嘌呤霉素抗性的酶是嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(pac)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，其中，所述细菌选择标记赋予的抗性所针对的抗生素是氨苄青霉素，并且其中为细菌宿主赋予针对氨苄青霉素的抗性的酶是β-内酰胺酶。
6.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，其中，所述细菌复制起点是pUC复制起点。
7.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，其中，作为真核选择标记的所述谷氨酰胺合成酶具有与编码能够催化谷氨酸和氨向谷氨酰胺的ATP依赖性转化的谷氨酰胺合成酶的SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的序列，或其中作为真核选择标记的所述谷氨酰胺合成酶是哺乳动物谷氨酰胺合成酶。
8.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，其中，所述谷氨酰胺合成酶具有与SEQID NO:5的序列具有至少96％同一性的氨基酸序列并且能够催化谷氨酸和氨向谷氨酰胺的ATP依赖性转化。
9.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，其中，所述3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少98％同一性的序列并且是功能性启动子，和/或其中作为真核生物选择标记的所述谷氨酰胺合成酶是与编码能够催化谷氨酸和氨向谷氨酰胺的ATP依赖性转化的谷氨酰胺合成酶的SEQ ID NO：3的序列具有至少97％同一性的CHO谷氨酰胺合成酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，其中，所述pA信号是猿猴病毒40pA信号。
11.根据前述权利要求中任一项所述的表达载体，所述表达载体被包含在重组CHO或NS0宿主细胞中。
12.一种产生多肽的方法，所述方法包括在适合表达异源目标多肽的条件下培养根据权利要求11所述的重组CHO或NS0宿主细胞，其中用于目标多肽的表达盒的插入位点包含编码作为异源目标多肽的多肽的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述多肽包含抗体或其片段。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的表达载体用于高水平表达多肽的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述多肽包含抗体或其片段。
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