RU2015151626A - Способ экспрессии - Google Patents

Claims (30)

1. Способ получения целевого полипептида, где способ включает:

(a) экспрессию экспрессирующего вектора для экспрессии целевого полипептида в клетке-хозяине, причем экспрессирующий вектор содержит экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный полипептид, функционально связанный с лидерной последовательностью секреции фибронектина или с его функциональным эквивалентом; и

(b) извлечение целевого полипептида.

2. Способ получения целевого полипептида, где способ включает:

(a) трансфекцию или трансформацию клетки-хозяина экспрессирующим вектором для экспрессии целевого полипептида в клетке-хозяине, причем экспрессирующий вектор содержит экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, функционально связанный с лидерной последовательностью секреции фибронектина или с его функциональным эквивалентом;

(b) культивирование клетки-хозяина при условиях, которые позволяют пролиферацию клетки-хозяина и экспрессию и секрецию целевого полипептида из клетки-хозяина; и

(c) извлечение целевого полипептида.

3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где лидер секреции фибронектина выбирают для соответствия клетке-хозяину.

4. Способ по п. 3, где клетка-хозяина представляет собой клетку млекопитающего.

5. Способ по п. 4, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.

6. Способ по п. 5, где экспрессирующая кассета содержит промотор hEF1a.

7. Способ по п. 6, где экспрессирующая кассета содержит последовательность поли-A.

8. Способ по п. 7, где последовательность поли-A выбирают из последовательности поли-А бетаглобина человека, последовательности поли-А бычьего гормона роста, ранней или поздней последовательности поли-А SV40.

9. Способ по п. 3, где лидер секреции фибронектина имеет последовательность MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVPSTGA или MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA.

10. Способ по п. 1, где применяют две экспрессирующие кассеты, причем одна экспрессирующая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь моноклонального антитела, и вторая экспрессирующая кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь моноклонального антитела.

11. Способ по п. 10, где две экспрессирующие кассеты содержат одинаковые промотор, лидер секреции и последовательность поли-А.

12. Способ по п. 11, где клетка-хозяин представляет собой клетку CHO, промотор представляет собой промотор hEF1a, лидер секреции фибронектина представляет собой лидер секреции фибронектина китайского хомяка, и последовательность поли-А представляет собой последовательность поли-А бычьего бетаглобина.

13. Клетка яичника китайского хомяка, предпочтительно, CHOK1, DG44, DUXKB11 или CHO pro3-клетка, трансфецированная экспрессирующим вектором, содержащим экспрессирующую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, функционально связанный с лидерной последовательностью секреции фибронектина или с ее функциональным эквивалентом.

14. Клетка яичника китайского хомяка по п. 13, где целевой полипептид содержит моноклональное антитело.

15. Клетка яичника китайского хомяка по п. 14, где применяют отдельные экспрессирующие кассеты, содержащие тяжелую и легкую цепи.

16. Клетка яичника китайского хомяка по п. 15, где экспрессирующие кассеты располагаются на одном векторе.

17. Клетка яичника китайского хомяка по п. 16, где каждая экспрессирующая кассета содержит промотор гена домашнего хозяйства, особенно промотор hEF1a, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим целевой полипептид.

18. Клетка яичника китайского хомяка по п. 17, где каждая экспрессирующая кассета содержит последовательность поли-А бычьего гормона роста.

19. Клетка яичника китайского хомяка по п. 18, которая дополнительно содержит маркерную систему дигидрофолатредуктазы.

20. Клетка яичника китайского хомяка по п. 19, где маркерная система дигидрофолатредуктазы содержит промотор мышиной фосфоглицераткиназы.

21. Клетка яичника китайского хомяка по п. 20, где лидер секреции фибронектина представляет собой фибронектин CHO.

22. Клетка яичника китайского хомяка по п. 21, где лидер секреции фибронектина имеет последовательность MLRGPGPGLLLAVLCLGTAVRCTEA.

23. Способ получения полипептида, который включает культивирование клетки яичника китайского хомяка по любому из пп. 13-22.

24. ДНК-конструкт, содержащий экспрессирующую кассету, содержащую промотор гена домашнего хозяйства, эффективный в клетке млекопитающего, и полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, функционально связанный с лидерной последовательностью секреции фибронектина.

25. ДНК-конструкт по п. 24, где промотор гена домашнего хозяйства, предпочтительно промотор hEF1a, и экспрессирующая кассета дополнительно содержит последовательность поли-А бычьего гормона роста.