JP7352650B2 - 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体 - Google Patents

細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体 Download PDF

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Description

本発明は、細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体に関する。
バイオ医薬品製造において、その生産性向上のため、細胞の代謝物であるアンモニアを培養液から除去しながら培養する方法が知られている（例えば、特許文献１）。また、血液や培養液等の生体由来液から特定の物質を除去する方法は特許文献２等にも開示されている。
特開昭６１－６３２８４号公報 国際公開第２０１６／０１３５４０号
フェドバッチ培養では細胞から分泌される老廃物が蓄積することにより培養後半で細胞数が低下し、細胞増殖性が不十分となる場合がある。一方、これらの蓄積する老廃物を除去する目的で培養液を連続的に濾過・排出し、一方で培養液を連続的に培養槽に供給する灌流培養法が用いられている。灌流培養法では細胞数がフェドバッチ培養に比較して大きくなるが培養液を大量に使用するため、コストが高くなることが問題となっている。
そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、細胞増殖性に優れる細胞培養方法、上記方法を用いた抗体製造方法、上記方法を用いた有機酸除去方法、及び、上記方法を用いて製造した抗体を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーで処理した培養液を用いて細胞を培養することで上記課題が解決できることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明者らは、以下の構成により上記課題が解決できることを見出した。
（１） 老廃物を含有する培養液と、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーと、を接触させることで、上記培養液から上記老廃物を除去して、精製培養液を得る、老廃物除去工程と、
上記精製培養液を用いて細胞を培養する、培養工程とを備える、細胞培養方法。
（２） 上記老廃物を含有する培養液が、上記培養工程中の培養液から取り出した培養液である、上記（１）に記載の細胞培養方法。
（３） 上記老廃物を含有する培養液が、細胞を含有しない、上記（１）又は（２）に記載の細胞培養方法。
（４） 上記老廃物を含有する培養液が、上記培養工程中の培養液から取り出した培養液をろ過した培養液である、上記（３）に記載の細胞培養方法。
（５） 上記老廃物除去工程が、上記ろ過した培養液を、上記ポリマーが充填された精製ユニットに通すことで、上記培養液から老廃物を除去して、上記精製培養液を得る工程であり、
上記培養工程が、培養槽の中で、上記精製培養液を用いて細胞を培養する工程であり、
上記精製ユニットの入口側と上記培養槽とが、途中に分離膜を有する流路によって繋がれ、
上記ろ過した培養液は、上記培養工程中の培養液から取り出した培養液を、上記流路を経て、上記分離膜によってろ過した培養液である、上記（４）に記載の細胞培養方法。
（６） さらに、
上記老廃物除去工程で得られた精製培養液に栄養成分を添加することで、栄養成分が添加された精製培養液を得る、栄養成分添加工程を備える、上記（１）～（５）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（７） 上記栄養成分が、アミノ酸類、ビタミン類、エネルギー源、浸透圧調節剤、ｐＨ緩衝剤、微量金属元素、界面活性剤、及び、増殖補助因子からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、上記（６）に記載の細胞培養方法。
（８） 上記栄養成分が、ビタミン類、エネルギー源、ｐＨ緩衝剤、及び、微量金属元素からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、上記（６）又は（７）に記載の細胞培養方法。
（９） 上記老廃物が、有機酸である、上記（１）～（８）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（１０） 上記有機酸が、イソ吉草酸、酪酸、及び、クエン酸の少なくともいずれかを含有する、上記（９）に記載の細胞培養方法。
（１１） 上記ポリマーが、４級アンモニウム塩基を有する水不溶性ポリマーである、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（１２） 上記水不溶性ポリマーが、後述する一般式（ｐ１）で表される部分構造を有する、上記（１１）に記載の細胞培養方法。
（１３） 上記一般式（ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立に、メチル基、又は、ヒドロキシエチル基であり、Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６である、上記（１２）に記載の細胞培養方法。
（１４） 上記水不溶性ポリマーが、後述する一般式（Ｐ１）又は（Ｐ２）で表される繰り返し単位を有する、上記（１１）に記載の細胞培養方法。
（１５） 上記水不溶性ポリマーが、上記一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する、上記（１４）に記載の細胞培養方法。
（１６） 上記一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、メチル基であり、Ｘが、Ｃｌ、又は、Ｂｒである、上記（１５）に記載の細胞培養方法。
（１７） 上記細胞が、浮遊細胞である、上記（１）～（１６）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（１８） 上記細胞が、動物細胞である、上記（１）～（１７）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（１９） 上記細胞が、ＣＨＯ細胞である、上記（１）～（１８）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（２０） 上記細胞が、産生細胞である、上記（１）～（１９）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（２１） 上記産生細胞が、抗体産生細胞である、上記（２０）に記載の細胞培養方法。
（２２） 上記（２１）に記載の細胞培養方法を用いた、抗体製造方法。
（２３） 上記（１９）に記載の細胞培養方法を用いて、培養液から、イソ吉草酸、酪酸、及び、クエン酸からなる群より選択される少なくとも１種の有機酸を除去する、有機酸除去方法。
以下に示すように、本発明によれば、細胞増殖性に優れる細胞培養方法、上記方法を用いた抗体製造方法、上記方法を用いた有機酸除去方法、及び、上記方法を用いて製造した抗体を提供することができる。
図１は、本発明の方法の好適な態様の一態様を模式的に表す図面である。 図２は、本発明の方法の好適な態様の一態様を模式的に表す図面である（Ｎ－１培養との組み合わせ）。 図３は、本発明の方法の好適な態様の一態様を模式的に表す図面である（灌流培養との組み合わせ）。 図４は、限外濾過膜の分画分子量と平均孔径推算値である。
以下に、本発明の細胞培養方法及び抗体製造方法について説明する。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
また、各成分は、１種を単独でも用いても、２種以上を併用してもよい。ここで、各成分について２種以上を併用する場合、その成分について含有量とは、特段の断りが無い限り、合計の含有量を指す。
また本明細書において「質量％」を用いて表される老廃物含有培養液に対する特定吸着剤の量は培養液１ｍｌを１ｇとして換算した場合、特定吸着剤量（ポリマー分、ｇ）を老廃物含有培養液量（ｇ）で割ったものである。
［１］細胞培養方法
本発明の細胞培養方法（以下、単に「本発明の方法」とも言う）は、
老廃物を含有する培養液と、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーと、を接触させることで、上記培養液から上記老廃物を除去して、精製培養液を得る、老廃物除去工程と、
上記精製培養液を用いて細胞を培養する、培養工程とを備える、細胞培養方法である。
本発明の方法はこのような構成をとるため、上述した効果が得られるものと考えらえる。その理由は明らかではないが、およそ以下のとおりと推測される。
上述のとおり、本発明の方法では、老廃物を含有する培養液を４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーで処理した培養液を用いて細胞を培養する。ここで、本発明者らの検討から、老廃物の中でも、特に、イソ吉草酸、酪酸、クエン酸等の有機酸が細胞の培養を阻害するという知見が得られている。上述のとおり、本発明の方法では４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーを用いて老廃物を含有する培養液を処理するため、培養液中の老廃物（特に有機酸）が効率的に除去されるものと推測される。すなわち、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーは老廃物（特に有機酸）に対して極めて有効な吸着剤として働くものと考えられる。結果として、このような吸着剤で処理した培養液（精製培養液）を用いて細胞を培養する本発明の方法は優れた細胞増殖性を示すものと推測される。
また、培養後の液から細胞を除去する場合、通常デプスフィルターでろ過するがその目詰まりも問題となる。一般に老廃物が少ない環境で培養した場合、老廃物が多い状態で培養した場合と比較して全細胞（生細胞＋死細胞）のうちの死細胞の比率が低くなる。本発明を用いた培養の培養液は、用いない培養と比較して精製時の目詰まりのしにくさが向上することが推測される。なお、本明細書中おいて特に記載がない場合、細胞は生細胞を意味する。
以下、本発明の方法が備える各工程について説明する。
［老廃物除去工程］
老廃物除去工程は、老廃物を含有する培養液と、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーと、を接触させることで、上記培養液から上記老廃物を除去して、老廃物の少ない精製培養液を得る工程である。
〔老廃物を含有する培養液〕
老廃物除去工程で使用される培養液は老廃物を含有する。以下、「老廃物を含有する培養液」を「老廃物含有培養液」とも言う。
＜老廃物＞
老廃物とは、細胞を培養する際に生成される不要な物質のことであり、細胞から産生されるものを含む。例えば、有機酸等が挙げられる。
上記老廃物は、本発明の効果がより優れる理由から、有機酸であることが好ましく、イソ吉草酸、酪酸、及び、クエン酸の少なくともいずれかを含有するのがより好ましい。
培養液中のイソ吉草酸の濃度は特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、１０μＭ以上であることが好ましく、５０μＭ以上であることがより好ましく、２５０μＭ以上であることがさらに好ましい。また、本発明の効果がより優れる理由から、１０μＭ以上１０ｍＭ以下であることが好ましく、５０μＭ以上５ｍＭ以下であることがより好ましく、２５０μＭ以上５ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
培養液中の酪酸の濃度は特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、１０μＭ以上であることが好ましく、２００μＭ以上であることがより好ましく、３５０μＭ以上であることがさらに好ましい。また、本発明の効果がより優れる理由から、１０μＭ以上１００ｍＭ以下であることが好ましく、２００μＭ以上２０ｍＭ以下であることがより好ましく、３５０μＭ以上２０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
培養液中のクエン酸の濃度は特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、５０μＭ以上であることが好ましく、５００μＭ以上であることがより好ましく、８００μＭ以上であることがさらに好ましい。また、本発明の効果がより優れる理由から、５０μＭ以上５００ｍＭ以下であることが好ましく、５００μＭ以上１００ｍＭ以下であることがより好ましく、８００μＭ以上１００ｍＭ以下であることがさらに好ましい。
＜培養液＞
培養液とは、細胞の生育に必要な物質を含有する液体であり、細胞の培養に従来使用されているものが適宜使用できる。培養液は、例えば、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、ｐＨ緩衝剤を含有する。上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシドなどを含有していてもよい。
培養液は、液体状のもののみならず、ゾル状のものも含み、流動性のあるものであればよい。市販の動物細胞培養用培地、例えば、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、ＢＭＥ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１０培地、Ｆ１２培地などの培地も好適に用いられるが、これらに限られない。
＜老廃物含有培養液の好適な態様＞
上記老廃物含有培養液は、本発明の効果がより優れる理由から、後述する培養工程中の培養液から取り出した培養液であることが好ましい。
上記老廃物含有培養液は、本発明の効果がより優れる理由から、細胞を含有しないことが好ましい。細胞を含有しないことにより、細胞生存率を向上させることができる。
上記老廃物含有培養液は、本発明の効果がより優れる理由から、後述する培養工程中の培養液から取り出した培養液をろ過した培養液であることが好ましい。
後述する培養工程中の培養液には、通常、細胞が含まれているため、ろ過することで細胞を除去することができる。ろ過は、例えば、分離膜を用いることによって行うことができる。
〔特定吸着剤〕
上述のとおり、老廃物除去工程では、老廃物含有培養液と４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーとを接触させる。これにより、老廃物（特に有機酸）は４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーに吸着され、老廃物の少ない培養液（精製培養液）が得られる。すなわち、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーは極めて有効な吸着剤として働く。以下、「４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマー」を「特定吸着剤」とも言う。
＜水不溶性ポリマー＞
特定吸着剤は、本発明の効果がより優れる理由から、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有する水不溶性ポリマーであることが好ましく、４級アンモニウム塩基を有する水不溶性ポリマーであることがより好ましい。
上記水不溶性ポリマーは、本発明の効果がより優れる理由から、３７℃において水不溶性であるのが好ましい。ここで、水不溶性とは、ポリマー１ｇを３７℃で水１００ｇに溶解させ、濾過したのち水を揮発させ得られた水溶分が０．０５ｇ以下であるものであることを言う。
上記水不溶性ポリマーの形状は特に限定されるものではなく、粒子状、中空糸状、不織布状、繊維状、シート状、メッシュ状、多孔質状、スポンジ状、不定形状のいずれでもよい。精製の効率を向上させるためには、表面積を増大させる形状がよく、多孔質状のものが好ましい。
上記水不溶性ポリマーは担体と組み合わせてもよい。上記特定吸着剤が水不溶性ポリマーと担体を含む場合、担体は、活性炭、ポリエステル、またはポリスルホンを含んでいてもよい。
＜官能基＞
特定吸着剤は、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーであれば特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、４級アンモニウム塩基を有するポリマーであることが好ましい。
上記４級アンモニウム塩基は、本発明の効果がより優れる理由から、トリアルキルアンモニウム塩基、又は、ジアルキルヒドロキシエチルアンモニウム塩基であることが好ましく、トリアルキルアンモニウム塩基であることがより好ましく、トリメチルアンモニウム塩基であることがさらに好ましい。
＜主鎖＞
特定吸着剤の主鎖は特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、アクリル系、又は、スチレン系であることが好ましく、スチレン系であることがより好ましい。
＜アニオン＞
特定吸着剤が４級アンモニウム塩基を有するポリマーである場合の対アニオンは特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６であることが好ましく、Ｃｌ、又は、Ｂｒであることがより好ましく、Ｃｌであることがさらに好ましい。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。
＜特定吸着剤の好適な態様＞
特定吸着剤は、本発明の効果がより優れる理由から、４級アンモニウム塩基を有する水不溶性ポリマーであることが好ましい。
上記４級アンモニウム塩基を有する水不溶性ポリマーは、本発明の効果がより優れる理由から、下記一般式（ｐ１）で表される部分構造を有するのがより好ましい。
一般式（ｐ１）
一般式（ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は、フェニル基を表し、置換基として水酸基を有していてもよい。Ｘは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６を表す。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。
一般式（ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、本発明の効果がより優れる理由から、それぞれ独立に、メチル基、又は、ヒドロキシエチル基であることが好ましい。
一般式（ｐ１）中、Ｘは、本発明の効果がより優れる理由から、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６であるのが好ましい。
上記４級アンモニウム塩基を有する水不溶性ポリマーは、本発明の効果がより優れる理由から、下記一般式（Ｐ１）又は（Ｐ２）で表される繰り返し単位を有するのが好ましく、下記一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有するのがより好ましい。
一般式（Ｐ１）
一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は、フェニル基を表す。Ｘは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６を表す。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。
一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、本発明の効果がより優れる理由から、メチル基であることが好ましい。
一般式（Ｐ１）中、Ｘは、本発明の効果がより優れる理由から、Ｃｌ、又は、Ｂｒであることが好ましい。
一般式（Ｐ２）
一般式（Ｐ２）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は、フェニル基を表す。ｎは、１～８の整数を表す。Ｘは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６を表す。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。
特定吸着剤は、本発明の効果がより優れる理由から、細胞の増殖を妨げないものが好ましい。
特定吸着剤は、本発明の効果がより優れる理由から、細胞の栄養に用いられるもの（栄養成分）を吸着しない方がよい。栄養成分の具体例は後述のとおりである。
特定吸着剤の表面積は、大きい方が、有機酸の吸着率を向上させるため、使用量が少なくなり、コスト上好ましいが、小さいものでも使用量を増やすことで同様の効果が得られる。
吸着材の表面積は、液体窒素温度（７７Ｋ）における窒素吸着等温線を測定した後に、ＢＥＴ（ＪＩＳ Ｚ ８８３０；気体吸着による粉体（固体）の比表面積測定方法）解析法を用いて算出した表面積を指す。窒素吸着等温線の測定法には、セル内に充填した窒素ガスの圧力低下により担体へ吸着した窒素の量を算出する容量法、担体の重量変化を測定する重量法の２種があるが、どちらを用いて測定してもよい。なお、表面積を測定することができる方法であれば、全て用いることができる。
＜特定吸着剤の量＞
老廃物含有培養液に対する特定吸着剤の量は、本発明の効果がより優れる理由から、０．５～４０質量％であることが好ましく、１．０～３０質量％であることがより好ましく、２．０～２０質量％であることがさらに好ましく、２．０～１０質量％であることが特に好ましい。
後述する培養工程で使用される培養液に対する特定吸着剤の量は、本発明の効果がより優れる理由から、１質量％以上であることが好ましく、２質量％以上であることがより好ましく、４質量％以上であることがさらに好ましい。
〔接触させる方法〕
老廃物含有培養液と特定吸着剤とを接触させる方法は特に制限されず、両者を混合して撹拌する方法、特定吸着剤が充填された精製ユニットに老廃物含有培養液を通す方法等が挙げられる。例えば、溜めた老廃物含有培養液に特定吸着剤を接触させてもよいし、流動している老廃物含有培養液に吸着剤を接触させてもよい。
上記精製ユニットは、特定吸着剤が出ていかないことが好ましく、その場合、特定吸着剤を固定することやガラスフィルターなどの隔離フィルター（特定吸着剤を隔離するフィルター）で精製ユニットから出ていかないようにすることが好ましい。シングルフローのポンプであれば、例えば流れの向かう方向のみに隔離フィルターを設置すればよいかもしれないが、ＡＴＦ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ）用ポンプを用いる場合には、精製ユニットの入口側と出口側の両方に隔離フィルターを設置することが好ましい。
特定吸着剤は、化学合成により製造してもよいし、購入してもよい。例えば三菱ケミカル、オルガノ、ピュロライトから購入することができる。
〔老廃物除去工程の好適な態様〕
本発明の効果がより優れる理由から、老廃物除去工程において、特定吸着剤と細胞とが直接接しないのが好ましい。
特定吸着剤と細胞が直接接しないとは、全く接しないことに限定されるものではなく、特定吸着剤と細胞とが接さないような処置を行っていればよい。例えば、後述する培養工程の培養槽内に特定吸着剤を設置する場合には、特定吸着剤の周りをメッシュもしくはマイクロフィルトレーション膜や限外ろ過膜をはじめとする隔離膜で覆うことができる。隔離膜は分離膜とも呼ぶ。他にも培養槽に流路を設け、流路の途中に分離膜ユニット（細胞を分離することができる分離膜を有するユニット）を設ける。ここで分離膜ユニットは細胞を分離する目的のため流路の培養容器（培養槽）側に設定することが好ましい。その後に精製ユニットを設け、精製ユニットで分離膜ユニットを通過した培養液を特定吸着剤と接触させることもできる。さらに、培養系から培養液を取り出し、これを特定吸着剤と作用させて老廃物（特に有機酸）を除去した後の培養液を再び培養系へ戻すこともできる。
タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、細胞へのダメージを低減し、生産物透過率の低下を抑制するための有効な手段である。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理を採用することにより、デッドエンド方式による膜分離処理を行うのに比べて細胞が膜に強く押しつけられることによるダメージを低減することができる。
本発明の細胞培養方法及び本発明の細胞培養方法を用いた生産物（例えば、抗体）の製造方法（以下、まとめて「本開示に係る生産物の製造方法」とも言う）における分離処理工程では、培養容器から細胞懸濁液（細胞を含有する培養液）を抜き出して、分離膜を用いて、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度（細胞密度）を有する戻り液と、細胞をほとんど含まない透過液とにタンジェンシャルフィルトレーション方式により分離することが好ましいがこれに限られない。タンジェンシャルフィルトレーション方式とは、膜分離処理の対象となる液体を分離膜の膜面に沿って流すことにより、サイズの小さい成分を液体成分と共に分離膜の透過側へと移動させ、サイズの大きい成分及び残りの液体成分を分離膜の未透過側に保持する方式である。本開示においては、分離膜の未透過側、つまり供給側を１次側と、分離膜の透過側を２次側とも称する。
本開示においては、タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理は、培養容器から抜き出された細胞懸濁液が分離膜の膜面に沿って平行な一方向の流れを形成してもよいし、培養容器から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させて、往復する流れを形成してもよい。
本開示に係る生産物の製造方法において、細胞を培養する工程、吸着剤による処理工程、戻り液を培養容器に戻す工程、生産物を回収する工程などにおける「工程」の語は、一つの処理が完了したら次の処理を開始するといったバッチで順次行われる処理だけでなく時間的に並行して行われる処理の意味も含まれる。このため、例えば培養工程を行いながら、培養容器からの細胞懸濁液を抜き出して分離処理工程が行うことも含まれる。また、戻り液の培養容器への送液、培養容器内への新鮮培地の供給、及び生産物の回収も培養工程及び分離処理工程と時間的に並行して行うことも含まれる。各工程を時間的に並行して行うことにより、生産された生産物を効率よく分離及び回収することも可能である。なお、各工程は連続して行うようにしてもよいが、例えば分離処理工程におけるタンジェンシャルフィルトレーションの流れ方向の切り替えなどのために一時的な停止時間が存在していてもよい。
培養容器からの細胞懸濁液の抜き出しは、通常、ポンプを用いて行うことができるが、利用可能な他の送液手段を用いてもよい。培養容器から抜き出された細胞懸濁液は、分離膜ユニットと送液される。培養容器から分離膜ユニットへの細胞懸濁液の抜き出しは、間欠的に行っても連続的に行ってもよいが、系の状態を安定に保つ観点からは連続的に行うことが好ましい。
分離膜ユニットは、例えば、容器と、分離膜とを備え、分離膜は容器内の空間を供給側と透過側とに隔て、培養容器から抜き出された細胞懸濁液に膜分離処理を施す。分離膜の供給側においては、分離膜ユニットは配管にそれぞれ接続された流入口及び流出口とを有する。タンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理において、培養容器から抜き出された細胞懸濁液の流れの方向を所定の時間毎に逆転させる場合は、流入口と流出口とは流れの方向の逆転により入れ替わることになる。
分離膜として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができる。
また、分離膜として、中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減できる。また、分離膜に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減できる。これらにより、細胞のロスを低減できる。この場合、中空糸膜として精密濾過膜（ＭＦ膜）あるいは限外濾過膜（ＵＦ膜）を用いることができるが、これに限られない。
分離膜の孔径Ｄｐは、分離膜がＭＦ膜（ＭＦ膜：Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）もしくはＵＦ膜（ＵＦ膜：Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）の場合、水銀圧入法により平均孔径として測定することができる。例えば、株式会社島津製作所製のオートポアＩＶ９５２０を用いて、分離膜に高圧で水銀を圧入することで孔径Ｄｐを測定することができる。なお、限外濾過膜（ＵＦ膜（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）とも称することがある）とは、精密濾過膜（ＭＦ膜（Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）とも称することがある）より平均孔径が小さく、平均孔径が０．００１～０．０１μｍであり、その分離性能が分画分子量で定義される濾過膜である。孔径が小さい限外濾過膜においては、水銀圧入法では、平均孔径の測定が難しい場合がある。その場合、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｅｎｇ．ｉｎ．ｃｏｏｃａｎ．ｊｐ／ｍｅｍｂ／ｍ＿ｍｂ４．ｈｔｍｌに記載されているように、既知の分子量を有する複数種類の標準物質を、対象となる限外濾過膜に透過させ、阻止率が９０％となるときの標準物質の分子量を、当該限外濾過膜の分画分子量とする。標準物質の分子量から分子径を推算することができるため、限外濾過膜の平均孔径は、分画分子量に基づいて推算することができる。具体的には、図４に記載のように、分画分子量から平均孔径を推算することができる。分画分子量が標準物質の分子量と一致しない場合には、分画分子量と平均孔径をプロットし、線形補間等により内挿することによって、平均孔径を推算することができる。
生産物を生産する細胞の透過を抑制する観点からは、分離膜の孔径Ｄｐは１μｍ以下であることが好ましく、０．８μｍ以下であることがさらに好ましく、０．２３μｍ以下であることがさらにより好ましく、０．２μｍ以下であることが最も好ましい。さらに、本法において、本発明の効果がより優れる理由から、分離膜としてＭＦ膜、ＵＦ膜を用いることが好ましく、ＵＦ膜を用いることがさらに好ましい。
また、用いるＵＦ膜の分画分子量としては１００ｋＤａ以下が好ましく、０．１ｋＤａ～５０ｋＤａがさらに好ましく０．１ｋＤａ～１０ｋＤａがさらにより好ましく、１ｋＤａ～５ｋＤａが最も好ましい。
分離膜は、細胞懸濁液中の生細胞は透過させないが、イソ吉草酸、酪酸、クエン酸などの老廃物は透過させる。生細胞と生産物とで透過性に違いが生じる理由は、生細胞のサイズと除去したい老廃物との間に差異があるためである。例えば、抗体を動物細胞に生産させる場合、老廃物の分子量は１ｋＤ以下であり、図４からは１．５ｎｍ以下であるのに対し、動物細胞の大きさは１０μｍオーダー程度であるため、例えば分離膜としての精密濾過膜や限外濾過膜を用いることで、生細胞を１次側に留めつつ、老廃物を分離膜を通して２次側に移行させることができる。また、液体成分、例えば水分子の大きさは微小であるため、液体成分も一部の量が抗体と共に２次側に移行する。この結果、１次側に残った液体中における細胞濃度は上昇する。このように、タンジェンシャルフィルトレーション方式による分離を行うことにより、分離膜ユニットに送液された細胞懸濁液は、分離膜を透過せずに１次側に留まり、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、分離膜を透過して２次側に移行した、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離される。なお、ここでいう細胞懸濁液中の細胞濃度とは、培養容器内の細胞懸濁液中の生細胞の濃度を意味する。また、本開示において「細胞濃度」とは特段の断りが無い限り「生細胞濃度」を指す。
１次側に留まった戻り液は、分離膜ユニットから流出して吸着剤の入ったカラムを通過し培養容器に戻る。例えば、タンジェンシャルフィルトレーションにおける分離膜ユニット供給側空間中の流れの向きを一方向に固定する場合には、細胞懸濁液を、培養容器から分離膜ユニットに供給したのと別のポンプにより２次側から減圧にして液を引き込むことで、留出口と吸着剤の入ったカラムと培養容器とを連絡する配管を通して培養容器に戻してもよい。この場合は、戻り液は、培養容器中の細胞懸濁液が分離膜ユニットの流入口に移動する際に通った配管とは異なる配管を通って、培養容器に戻ることとなり、循環する流れが形成される。これはタンジェンシャルフィルトレーションにおける分離膜ユニット供給側空間中の流れの向きを、時間の経過と共に逆転させる、つまり流れを往復させる場合にも次側から同様にポンプにより減圧にして液を引き込むことで分離膜ユニット供給側空間中の流れの向きを一方向に固定することができる。
循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のＫｒｏｓＦｌｏ灌流培養フローパス装置（ＫＭＬ－１００、ＫＰＳ－２００、ＫＰＳ－６００）又はＬｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖシリーズを好適に用いることができる。また往復する流れを形成する場合、ＲＥＰＬＩＧＥＮ社のＡＴＦｓｙｓｔｅｍを好適に用いることができる。
分離膜を用いて吸着剤カラム（精製ユニット）へ送液する速度としては、好ましくは０．１ｖｖｄ以上１００ｖｖｄ以下であり、より好ましくは０．３ｖｖｄ以上２０ｖｖｄ以下である。ここでｖｖｄとは、１日当たりのカラムを通過する液量を培養槽液の全量で除したものを表す。
〔精製培養液〕
上述のとおり、老廃物除去工程では、老廃物の少ない精製培養液を得られる。
精製培養液は、老廃物（例えば、イソ吉草酸、酪酸、クエン酸）の濃度が低減していればよいが、本発明の効果がより優れる理由から、イソ吉草酸の濃度としては２００μＭ以下、酪酸の濃度としては４００μＭ以下、クエン酸の濃度としては９００μＭ以下であることが好ましく、イソ吉草酸の濃度としては１５０μＭ以下、酪酸の濃度としては２００μＭ以下、クエン酸の濃度としては５００μＭ以下であることがより好ましい。
［培養工程］
培養工程は、上述した老廃物除去工程で得られた精製培養液を用いて細胞を培養する工程である。培養工程では、上記精製培養液の一部を用いても全部を用いてもよい。培養工程では、上記精製培養液に加えて、他の培養液を用いてもよい。
なお、細胞培養とは微生物または動物や植物から細胞を分離し、体外で増殖、維持することである。生体から分離し、最初の植え替えを行うまでを初代培養、既存の培養細胞を新たな培養容器へと移し替えて増殖、維持することを継代培養と呼ぶ。
〔細胞〕
細胞は特に制限されないが、大腸菌や酵母や植物細胞、動物細胞、枯草菌などの原核細胞であってもよく、本発明の効果がより優れる理由から、動物細胞であることが好ましく、哺乳類細胞であることがより好ましく、ＢＨＫ（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞、２９３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ハイブリドーマ細胞であることがさらに好ましく、ＣＨＯ細胞であることが特に好ましい。
細胞は、本発明の効果がより優れる理由から、浮遊細胞であることが好ましい。
細胞は、産生細胞であることが好ましい。
細胞の産生物としては、細胞が産生するものであれば特に限定されるものではないが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、ウイルス、アルコール、酵素、抗生物質、組換えタンパク質であってもよく、好ましくはタンパク質、より好ましくは抗体である。すなわち、細胞は、抗体産生細胞であることが好ましい。
動物細胞に産生させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ－６レセプター抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗グリピカン－３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ及びサル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体及びｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体など人為的に改変した抗体も含む。
〔細胞を培養する方法〕
細胞を培養する方法は特に制限されないが、本発明の効果がより優れる理由から、フェドバッチ培養やバッチ培養、かん流培養（灌流）が好ましく、フェドバッチ培養が特に好ましい。
上記フェドバッチ培養とは流加培養、半回分培養とも呼ばれ、微生物または動物や植物の細胞をバイオリアクター（培養槽）で培養する際に、培養中にある特定の栄養源や培養液成分をバイオリアクターへ供給するが、菌体や細胞は収穫時までバイオリアクターから抜きとらないような培養法である。フェドバッチ培養は老廃物の蓄積量が多い培養方法であるため、特に本発明の効果がより優れる。
上述のようにフェドバッチ培養およびかん流培養、Ｎ－１培養を組み合わせた培養を行うことも可能である。ここで本明細書においてかん流培養とは培養液中に細胞を残したまま、新しい培地を連続的に供給し、古い培地を連続的に廃棄しながら培養する培養方法である。また、Ｎ―１培養とは前半かん流培養を行い、細胞数を十分に増やした段階で新しい培地の供給と古い培地の廃棄を停止しフェドバッチ培養に移行する培養方法とする。
播種細胞濃度、および培養における最大細胞濃度は、細胞数を常法により測定し、細胞数を培養液量で割ることにより求めることができる。最大生細胞濃度は培養期間中における生細胞濃度の最大値であり、培養条件により異なる。
培養期間中の生細胞率（生存率）は、生細胞数を（生細胞数＋死細胞数）で除算することで求められる。たとえば、生細胞数及び死細胞数の測定はトリパンブルー染色法による生死判定を用いている商品名Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて測定することができる。
培養後の培養液中には、目的とする生産物が含まれている。透過液中の生産物を回収して医薬品の製造及び食品の製造など様々な用途に用いることができる。例えば、生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。生産物が抗体又はその断片などのポリペプチドである場合、生産物の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、ポリペプチドを分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られたポリペプチドの濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；高速液体クロマトグラフィー）またはＦＰＬＣ（ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
細胞の成長を継続させるための栄養添加方法としてフィードを培養容器内に供給することが好ましい。フィードを培養容器内に供給することで、培養容器内の細胞の状態を健康な状態に保つことができる。この供給は、間欠的に行っても連続的に行ってもよい。また、培養容器内の細胞懸濁液量は常時完全に一定である必要はなく、略一定、例えば±１０％、又は±５％、又は±１％程度の変動が生じるものであってもよい。培養容器内の細胞懸濁液量の測定も、常時行う必要は必ずしもなく、間欠的に行うものであってもよい。
本開示に係る生産物の製造方法における生産物を生産する細胞を培養する工程は、培養容器内の細胞培養液を撹拌翼により撹拌することを含んでいてもよい。
撹拌翼を回転させることで、培養容器の内部に収容された細胞懸濁液が撹拌され、細胞懸濁液の均質性が向上する。
本開示に係る生産物の製造方法において、生産物を生産する細胞を培養する工程は、細胞懸濁液にスパージャーによりガス通気することを含んでいてもよい。
＜播種細胞密度＞
播種細胞密度（培養液中の初期の細胞密度）（初期細胞数）は、本発明の効果がより優れる理由から、０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましく、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがより好ましく、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ～２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることがさらに好ましい。
＜温度等＞
細胞を培養する温度は、本発明の効果がより優れる理由から、２９℃以上４０℃以下が好ましく、３５℃以上３８℃以下がより好ましい。培養期間中、温度を変更してもよい。
培養は、二酸化炭素濃度が０～４０％、好ましくは２～１０％の雰囲気下で行うことが好ましい。
＜期間＞
細胞を培養する期間は、本発明の効果がより優れる理由から、０日以上５０日未満が好ましく、７日以上４０日未満がより好ましく、１０日以上２５日未満がさらに好ましい。
＜培養スケール＞
培養スケールとしては０．００１Ｌ以上であれば好適に用いることは可能であるが、培養液の節約の観点から大規模である方がコスト削減効果は高く、培養スケールは、本発明の効果がより優れる理由から、０．１Ｌ以上が好ましく、１Ｌ以上が好ましく、５０Ｌ以上がより好ましく、３００Ｌ以上がさらに好ましい。培養スケールは、本発明の効果がより優れる理由から、０．１Ｌ以上２５０００Ｌ以下が好ましく、１Ｌ以上２５０００Ｌ以下が好ましく、１０Ｌ以上５０００Ｌ以下がより好ましく、４０Ｌ以上３０００Ｌ以下がさらに好ましい。
［栄養成分添加工程］
本発明の方法は、本発明の効果がより優れる理由から、（例えば、上述した老廃物除去工程後、上述した培養工程前に）、さらに、上述した老廃物除去工程で得られた精製培養液に栄養成分を添加することで、栄養成分が添加された精製培養液を得る、栄養成分添加工程を備えるのが好ましい。
上記栄養成分とは、培養液に含まれる、細胞の生育に必要な物質であり、後述する栄養成分が適宜使用でき、例えば、ピルビン酸ナトリウム、葉酸、パントテン酸、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン等が挙げられる。上記栄養成分はカルボン酸基を有するものであることが好ましいが、これに限定されない。
上記に記載の添加する栄養成分とは、培養液に含まれる、細胞の生育に必要な物質であり、通常動物細胞培養培地で使用されている各成分が適宜使用でき、下記に示すアミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、ｐＨ緩衝剤、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオシド、塩類のうち少なくとも１種以上含むことが好ましい。
具体的には、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン等、好ましくはＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン等のアミノ酸類；ｉ?イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、ｐ－アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、アスコルビン酸等、好ましくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、アスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、コレステロール等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、ピルビン酸ナトリウム等のエネルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等の浸透圧調節剤；炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、また、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムなどのリン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等のｐＨ緩衝剤、ＥＤＴＡ鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等の鉄イオンの塩、銅イオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、スズイオンもしくはその塩である硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケイ酸ナトリウム等の微量金属元素；Ｔｗｅｅｎ８０、プルロニックＦ６８等の界面活性剤；および組換え型インシュリン、組換え型ＩＧＦ、組換え型ＥＧＦ、組換え型ＦＧＦ、組換え型ＰＤＧＦ、組換え型ＴＧＦ－α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、塩酸プトレッシン、デキストラン硫酸もしくはその塩、へパラン硫酸もしくはその塩、コンドロイチン硫酸もしくはその塩、デルマタン硫酸もしくはその塩、ペントサン硫酸もしくはその塩、その他プロテオグリカンもしくはその塩等のポリ硫酸化化合物ならびにポリスルホン酸化合物からなる増殖補助因子；デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のヌクレオシドなどを添加してもよい。
なお上記本発明の好適例においては、ストレプトマイシン、ペニシリンＧカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フェノールレッド等のｐＨ指示薬、魚肉抽出物又は魚肉の酵素分解物を含んでいてもよい。
さらに好ましくは、アミノ酸類、ビタミン類、エネルギー源、浸透圧調節剤、ｐＨ緩衝剤、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子のうち少なくとも１種以上含むことであり、さらに好ましくは、ビタミン類、エネルギー源、ｐＨ緩衝剤、及び、微量金属元素からなる群より選択される少なくとも１種を含むことであり、最も好ましくはビタミン類、微量金属元素のうち少なくとも１種以上含むことである。
また、栄養分として乳酸を加えることが好ましい。培養槽１Ｌあたりに乳酸を０．０５～２．０ｇ加えることが好ましく、さらに０．１～１．０ｇ加えることが好ましく、０．２～１．０ｇ加えることが最も好ましい。
［本発明の方法の好適な態様］
本発明の方法は、本発明の効果がより優れる理由から、
上述した老廃物を含有する培養液が上述した培養工程中の培養液から取り出した培養液をろ過した培養液であり、
上述した老廃物除去工程が、上記ろ過した培養液を、上述した特定吸着剤が充填された精製ユニットに通すことで、上記ろ過した培養液から老廃物を除去して、上述した精製培養液を得る工程であり、
上述した培養工程が、培養槽の中で、上記精製培養液を用いて細胞を培養する工程であり、
上記精製ユニットの入口側と上記培養槽とが、途中に分離膜を有する流路によって繋がれ、
上記ろ過した培養液は、上記培養工程中の培養液から取り出した培養液を、上記流路を経て、上記分離膜によってろ過した培養液である、細胞培養方法であることが好ましい。
以下、図面を用いて、上記好適な態様について具体的に説明する。
図１は、本発明の方法の好適な態様の一態様を模式的に表す図面である。
図１において、培養槽１０の中には、細胞１２を含有する培養液２０が存在する。培養液２０には、細胞１２の培養により生成した老廃物（図示せず）が含有される。
また、図１において、精製ユニット３０の入口側と培養槽１０とが流路１によって繋がれている。精製ユニット３０には上述した特定吸着剤３２が充填されている。また、精製ユニット３０は、特定吸着剤３２が精製ユニット３０から流出しないようにフィルター３４（入口側）及びフィルター３６（出口側）を有する。ここで、流路１は、流路１ａと分離膜ユニット１ｂと流路１ｃとからなり、流路１ａの入口側は培養槽１０の培養液２０に浸かり、流路１の出口側は分離膜ユニット１ｂの入口側に繋がり、分離膜ユニット１ｂの出口側は流路１ｃの入口側に繋がり、流路１ｃの出口側は精製ユニット３０の入口側に繋がる。また、分離膜ユニット１ｂは、その入口側と出口側との間に分離膜３を有する。分離膜３は上記細胞１２を通さないように培養液と細胞とを分離することができる膜である。分離膜ユニット１ｂは空気圧作動式の膜ポンプであるＡＴＦ用ポンプ４２に繋がれている。ＡＴＦ用ポンプ４２は往復する流れを発生させるため、流路２２において流れの方向は変化し得る。そのため、培養液２２は分離膜ユニット１ｂに流入することと、培養槽１０に戻ることがある。流路１ｃの途中にはポンプ４０が存在する。ポンプ４０によって、流路１の入口側（流路１ａの入口側）から培養液（細胞及び老廃物を含有する培養液）が取り出され、取り出された培養液２２は流路１を経て、流路１の出口側（流路１ｃの出口側）から精製ユニットに注入される。ここで、流路１の出口側から精製ユニットに注入される培養液２４は分離膜３によってろ過したものであるため、細胞１２を含有しない（ただし、老廃物を含有する）。
また、図１において、精製ユニット３０の出口側には流路２（流路２の入口側）が繋がる。精製ユニット３０中の培養液は精製ユニット３０の出口側から取り出され、取り出された培養液２６は流路２を経て、流路２の出口側から流出し、培養槽１０の培養液２０に注入される。ここで、精製ユニット３０の出口側から取り出された培養液２６は上述した特定吸着剤が充填された精製ユニット３０を通ったものであるため、老廃物が除去された精製培養液である。
〔老廃物除去工程〕
図１において、老廃物除去工程では、上述のとおり、分離膜３によってろ過した培養液２４（細胞を含有しない培養液）（ただし、老廃物を含有する）を精製ユニット３０に通すことで培養液２４から老廃物を除去して培養液２６（精製培養液）を得る。培養液２６（精製培養液）は、上述のとおり、培養槽１０の培養液２０に注入される。
〔培養工程〕
また、図１において、培養工程では、培養槽１０の培養液２０中で細胞を培養する。ここで、上述のとおり、培養槽の培養液には、流路２から流出した培養液２６（精製培養液）が注入される。すなわち、培養工程では、培養槽１０の中で、培養液２６（精製培養液）を用いて細胞１２を培養する。
なお、培養工程は、本発明の効果がより優れる理由から、培養槽１０に培養液２６とは別にさらに未使用の培養液を適宜供給することも好ましい様態となる（かん流培養）（図３）。この場合、老廃物を除去するのに未使用の培養液の必要量を低下させることができるため通常のかん流培養より使用する培地の量を減らす効果を得ることができる。
さらに、培養工程として、本発明の効果がより優れる理由から、Ｎ－１培養を組み合わせることも可能である。Ｎ－１培養とは、細胞増殖初期をかん流培養で実施し、細胞数を十分に増やしたところでフェドバッチに移行するものである。Ｎ－１培養と組み合わせることで、初期の細胞を迅速に増やすことができ、かん流終了後の細胞数低下を通常フェドバッチと比較して抑えることができる。初期に行うかん流培養からフェドバッチに移行する細胞数としては特に限定はないが、好ましくは８Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１３０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好ましくは１０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬ～１００Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬ、最も好ましくは２０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬ～９０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍＬである。
フェドバッチに移行した後に特定吸着剤の入ったカラムに液を循環させるタイミングは特に限られないが、１０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上であることが好ましく、１５Ｍｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上であることがさらに好ましく、２０Ｍｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上であることがさらに好ましい。
図２、図３は、本発明の方法の好適な態様の一態様を模式的に表す図面であり、かん流培養やＮ－１培養に特定吸着剤の処理工程を組み合わせたものである。
以降、図面を参照しながら、本開示に係る生産物の製造方法をさらに詳しく説明する。
図２はＮ－１培養、並びに図３はかん流培養と組み合わせた装置の本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す図であり、中空糸型の分離膜を用いた場合のタンジェンシャルフィルトレーション方式による膜分離処理の一例の様子が模式的に示される。
図２は図１の装置に加えて、培養槽１０に新鮮な培地２８をポンプ４１で供給する流路５４が接続されており、さらに分離膜ユニット１ｂと精製ユニット３０の間の流路の途中に流路を切り替えできる流路切り替えコネクタ６６が存在し、流路５６を介し回収タンク６５につながっている。培養初期は流路切り替えコネクタ６６の切り替えにより流路１ｃと流路５６がつながっており流路１ｄにはつながっていない。そこで、流路５４を介し培養槽１０に新鮮な培地２８が供給され、流路５６を通じて回収タンク６５に培地が回収される。
図３は図１の装置に加えてもう１つの分離膜ユニット４ｂを有する。分離膜ユニット１ｂは精製ユニット３０につながり、老廃物を吸着するが、一方、分離膜ユニット４ｂは連続的に回収タンク６５につながり、新鮮な培地２８が流路５４から培養槽１０に送られたとき、分離膜ユニット４ｂを介して回収タンク６５で培地を回収する。
分離膜ユニット１ｂ、４ｂはいずれも図１における分離膜ユニット１ｂと同じく２次側に細胞を通過させない。
分離膜ユニット１ｂ、４ｂはともにＭＦ膜であってもＵＦ膜であってもよいが、分離膜ユニット１ｂはＵＦ膜であることが好ましく、分離膜ユニット４ｂはＭＦ膜であることが好ましい。
培養容器（培養槽）１０の内部には、撹拌翼を有する撹拌装置（図示せず）が設けられていることが好ましい。撹拌翼を回転させることで、培養容器１０の内部に収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。
細胞培養装置は、フィード、ならびに栄養成分を培養容器１０に供給するための流路を有する（図示せず）。
特定吸着剤は、培養期間中交換してもよく、交換しなくてもよい。交換する場合には無菌状態を保ったまま交換することが好ましく、予め精製ユニットに設置しておくこと、又は、無菌的に交換することが考えられる。ハンドリングのしやすさからは、交換しない方が好ましい。交換しない場合は、予め十分量の水不溶性ポリマーを設置しておいてもよい。他にも例えば、特定吸着剤として緩衝作用があるものを用い、有機酸濃度が低い溶液を加えたとき有機酸を脱離させ、有機酸濃度が高まったときに有機酸を吸着する性質をもつ特定吸着剤を用いることで長時間にわたって、高い細胞増殖率を保った状態を維持することができる。そのため、２０日以上の長期に渡る培養を行う際には、緩衝作用のある特定吸着剤を用いることが好ましい。
また、精製ユニットは常に流路につながれていてもよいが、有機酸濃度が低い状況の際やフィードを加える際の前かつ／または後は精製ユニットを一時的に閉鎖した状態としてもよい。この場合の有機酸濃度が低い状況の際は例えば細胞増殖初期の２～１０日目まで、好ましくは２～５日目まで閉鎖し、翌日から開放するなどである。また、フィードを加える際の前かつ／または後とは前５時間以内、後２４時間以内のことをいう。好ましくは前２時間以内、後２２時間以内とする。
以上説明したように、本開示によれば、抗体などの生産物の製造方法を提供する。製造された生産物は、例えばバイオ医薬品及び再生医療等において用いることができる。
［２］抗体製造方法
本発明の抗体製造方法は、上述した本発明の方法を用いた抗体を製造する方法である。
上述した本発明の方法において、細胞として抗体産生細胞を用いることで、抗体を製造することができる。
以下、実施例により本開示の実施形態を更に具体的に説明するが、本開示の実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。
［１］細胞の老廃物として有機酸を培養液に強制添加した培養液を使用した実験
〔有機酸を含有する培養液Ｂの調製〕
１０００ｍＬメスフラスコにイソ吉草酸２３．２ｍｇ（２２８μｍｏｌ）、酪酸２９．２ｍｇ（３３１μｍｏｌ）、クエン酸１５１．４ｍｇ（７８８μｍｏｌ）を加え、市販の培養液Ａ（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でメスアップし全量を１０００ｍＬとして、有機酸を含有する培養液Ｂを調製した。
〔栄養成分Ｃの調製〕
１０００ｍＬメスフラスコにピルビン酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬（株）製）１．０ｇ、葉酸（富士フイルム和光純薬（株）製）１０ｍｇ、パントテン酸カルシウム（富士フイルム和光純薬（株）製）１０ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩（富士フイルム和光純薬（株）製）１０ｍｇ、ビオチン（富士フイルム和光純薬（株）製）１０ｍｇ、リン酸水素２ナトリウム１２水和物（富士フイルム和光純薬（株）製）５．０ｇを加え、イオン交換水でメスアップし全量を１０００ｍＬとして、栄養成分Ｃを調製した。
〔実施例１〕
以下のとおり、実施例１の細胞培養を行った。
＜老廃物除去工程＞
５０ｍＬねじ蓋付きサンプル瓶に、培養液Ｂ（２０ｍＬ）、及び、４級アンモニウム塩基を有するポリマー（ダイヤイオンＳＡ１０Ａ、三菱ケミカル製、トリメチルアンモニウム塩（Ｉ型）、主鎖：スチレン系、中性塩分解容量１．３ｍｅｑ／ｍｌ、上述した一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する水不溶性ポリマー（ここで、一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はメチル基を表し、ＸはＣｌを表す））（上述した特定吸着剤に該当）（１．９６ｇ）（ポリマー分として１．０８ｇ）を加え、３７℃の振盪器付き恒温槽に入れて２時間撹拌した。培養液に対する４級アンモニウム塩基を有するポリマーの量は、５質量％である。
その後、処理した培養液を０．２μｍのフィルターでろ過してポリマーを除去した。このようにして、精製培養液Ｅを得た。
＜培養工程＞
５０ｍＬ培養用遠心チューブに、老廃物除去工程で得られた精製培養液Ｅ（９．５ｍＬ）を加え、さらに、４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの抗体産生ＣＨＯ細胞液を０．５ｍｌ加え、細胞数が２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで液の全量が１０ｍＬになるように播種した。なお、抗体産生ＣＨＯ細胞は下記のとおり作製した。
その後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１８０ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）で振盪培養を行った。播種した日を０日目としてその後４日間培養を行った。
（抗体産生ＣＨＯ細胞）
キメラＩｇＧ１（リツキシマブ）をコードする核酸配列を含むベクターを構築し、構築したベクターをＣＨＯ－ＤＧ４４細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック）へ導入することにより、ＩｇＧ１を発現させたＣＨＯ－ＤＧ４４細胞（ＩｇＧ１細胞）を作製した。ベクターの構築および細胞への導入は、特表２０１６－５１７６９１号公報の実施例２に準じて行った。このＩｇＧ１細胞を抗体産生ＣＨＯ細胞として培養に用いた。
〔実施例２〕
以下のとおり、実施例２の細胞培養を行った。
＜老廃物除去工程＞
実施例１と同様の手順に従って老廃物除去工程を行い、精製培養液Ｅを得た。
＜栄養成分添加工程＞
得られた精製培養液Ｅに栄養成分Ｃ（１．０ｍＬ）を添加することで、栄養成分Ｃが添加された精製培養液Ｆを得た。
＜培養工程＞
精製培養液Ｅの代わりに精製培養液Ｆを用いた点以外は実施例１と同様の手順に従って培養工程を行った。
〔参考例〕
５０ｍＬ培養用遠心チューブに、上述した培養液Ａ（９．５ｍＬ）を加え、さらに、上述した抗体産生ＣＨＯ細胞液（４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を０．５ｍｌ加え、細胞数が２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで液の全量が１０ｍＬになるように播種した。
その後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１８０ｒｐｍで振盪培養を行った。播種した日を０日目としてその後４日間培養を行った。
〔比較例１〕
老廃物除去工程を行わずに、培養工程において精製培養液Ｅの代わりに培養液Ｂを用いた点以外は実施例１と同様の手順に従って細胞培養を行った。
〔比較例２〕
老廃物除去工程を行わずに、栄養成分添加工程において精製培養液Ｅの代わりに培養液Ｂを用いた点以外は実施例２と同様の手順に従って細胞培養を行った。なお、栄養成分添加工程で得られた、栄養成分Ｃが添加された培養液Ｂを培養液Ｇとする。
〔評価〕
培養４日後の各液について、以下のとおり評価を行った。
＜細胞増殖性＞
培養４日後の各液について、Ｖｉ－ＣＥＬＬ （ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を用いて、細胞数を測定した。細胞数とは生細胞の数を示す。以下、同様である。
播種細胞数（初期細胞数）、及び、培養４日後の細胞数（培養後細胞数）を表１に示す。評価はＡ～Ｅの５段階で示し、培養後細胞数が２．１×１０６以上をＡ、２．１×１０６未満１．９×１０６以上をＢ、１．９×１０６未満１．７×１０６以上をＣ、１．７×１０６未満１．６×１０６以上をＤ、１．６×１０６未満をＥとした。実用上、Ａ～Ｄであることが好ましく、Ａ～Ｃであることがより好ましく、Ａ～Ｂであることがさらに好ましく、Ａであることが特に好ましい。
＜抗体濃度＞
培養４日後の各液について、ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ ５４３０（日立） ＨＰＬＣ及びＰＯＲＯＳ ５０Ａ ４．６×５０ｍｍ（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）を用いて、抗体濃度を測定した。
結果を表１に示す。
＜有機酸含有量＞
使用された各培養液（抗体産生ＣＨＯ細胞液を含まない）について、ＤＩＯＮＥＸ製ＩＣＳ－２１００および Ｉｏｎ Ｐａｃ ＡＳ１１－ＨＣカラムを用いたクロマト分離を用いて、有機酸（イソ吉草酸、酪酸、クエン酸）の含有量を測定した。
結果を表１に示す。例えば、実施例１の有機酸含有量（７０３μＭ）は精製培養液Ｅの有機酸含有量である。
Figure 0007352650000004
表１中、培養液及び抗体産生ＣＨＯ細胞液の欄の数値は培養工程で使用された量を表し、単位はｍＬである。
表１から分かるように、老廃物除去工程を行わなかった比較例１～２と比較して、老廃物除去工程を行った実施例１～２は、優れた細胞増殖性を示した。なかでも、栄養成分添加工程を備える実施例２は、より優れた細胞増殖性を示した。
［２］特定吸着剤の評価
以下のとおり、特定吸着剤の評価を行った。
〔実験Ａ：特定吸着剤の有機酸吸着能の評価〕
種々の特定吸着剤について、有機酸吸着能を評価した。
５０ｍｌねじ蓋付きサンプル瓶に、上述した培養液Ｂ（５ｍＬ）、及び、下記表２に示す特定吸着剤（ポリマー分として０．２７ｇ又は０．５４ｇ）を加え、３７℃の振盪器付き恒温槽に入れて２時間攪拌した。その後、処理後の培養液を０．２μｍのフィルターでろ過して特定吸着剤を除去した。このようにして、各精製培養液（実験例Ａ１～Ａ７）を調製した。
得られた各精製培養液についてイオンクロマトグラフィーを用いて有機酸の量を測定した。そして、処理前の有機酸の量を１００％として、処理後の有機酸残存率（処理後の有機酸の量／処理前の有機酸の量）を求めた。
結果を表２に示す。評価はＡ～Ｅの５段階で示し、有機酸残存率が４０％未満をＡ、４０％以上５０％未満をＢ、５０％以上７０％未満をＣ、７０％以上８０％未満をＤ、８０％以上をＥとした。実用上、Ａ～Ｃであることが好ましく、Ａ～Ｂであることがより好ましく、Ａであることが特に好ましい。
表２中、特定吸着剤の詳細は以下のとおりである。
・Ｄ－１：ダイヤイオンＳＡ１０Ａ、三菱ケミカル製、トリメチルアンモニウム塩（Ｉ型）、主鎖：スチレン系、中性塩分解容量１．３ｍｅｑ／ｍｌ、上述した一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する水不溶性ポリマー（ここで、一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はメチル基を表し、ＸはＣｌを表す）
・Ｄ－２：ダイヤイオンＳＡ１１Ａ、三菱ケミカル製、トリメチルアンモニウム塩（Ｉ型）、主鎖：スチレン系、中性塩分解容量０．８５ｍｅｑ／ｍｌ、上述した一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する水不溶性ポリマー（ここで、一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はメチル基を表し、ＸはＣｌを表す）
・Ｄ－３：ダイヤイオンＳＡ２０Ａ、三菱ケミカル製、ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩（ＩＩ型）、主鎖：スチレン系、上述した一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する水不溶性ポリマー（ここで、一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうち２つはメチル基を表し、１つはヒドロキシエチル基を表し、ＸはＣｌを表す）
・Ｄ－４：アンバーライトＩＲＡ４５８ＲＦ、オルガノ製、トリメチルアンモニウム塩（Ｉ型）、主鎖：アクリル系、上述した一般式（Ｐ２）で表される繰り返し単位を有する水不溶性ポリマー（ここで、一般式（Ｐ２）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はメチル基を表し、Ｒ４は水素原子を表し、ｎは１～３を表し、ＸはＣｌを表す）
・Ｄ－５：ダイヤイオンＰＡ３１６、三菱ケミカル製、トリメチルアンモニウム塩（Ｉ型）、主鎖：スチレン系、多孔質型、上述した一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する水不溶性ポリマー（ここで、一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はメチル基を表し、ＸはＣｌを表す）
・Ｄ－６：ダイヤイオンＷＡ３０、三菱ケミカル製、ジメチルアミン、主鎖：スチレン系
実験例Ａ１～Ａ７の対比から、アミノ基を有するポリマーよりも４級アンモニウム塩基を有するポリマーの方が優れた有機酸吸着能を有することが分かる。
また、実験例Ａ１と実験例Ａ５との対比から、特定吸着剤の使用量を２倍にしても吸着量がほとんど変わらないことが分かる。そのため、この特定吸着剤は、緩衝作用を有することが分かる。
また、実験例Ａ１と実験例Ａ６との対比から、吸着部位の広い多孔質の吸着剤を用いても吸着量がほとんど変わらないことが分かる。このことからも、この特定吸着剤は、緩衝作用を有する。
〔実験Ｂ：特定吸着剤が培養液に与える影響の評価〕
培養液と特定吸着剤とを接触させた場合、培養液中の栄養成分を特定吸着剤が吸着する可能性がある。各種特定吸着剤について培養液に与える影響を評価した。
＜参考例Ｂ１＞
５０ｍＬ培養用遠心チューブに上述した培養液Ａ（９．５ｍＬ）を加え、さらに、４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＣＨＯ細胞液を０．５ｍｌ加え、細胞数が２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで液の全量が１０ｍＬになるように播種した。
その後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１８０ｒｐｍで振盪培養を行った。播種した日を０日目としてその後４日間培養を行った。
そして、上述のとおり、細胞増殖性を評価した。結果を表３に示す。
＜実験例Ｂ１～Ｂ５＞
培養液Ａの代わりに、表３に示される特定吸着剤（ポリマー分として０．２７ｇ）で処理（３７℃の振盪器付き恒温槽に入れて２時間撹拌）した培養液Ａを使用した点以外は、参考例Ｂ１と同様の手順に従って細胞培養を行い、同様に細胞増殖性を評価した。結果を表３に示す。
〔まとめ〕
実験Ａ（有機酸吸着能の評価）と実験Ｂ（細胞増殖性の評価）で共通する実験例を下記表４にまとめて示す。
表４から、官能基が４級アンモニウム塩基である特定吸着剤は、より優れた有機酸吸着能及び細胞増殖性を示すことが分かる。なかでも、主鎖がスチレン系である特定吸着剤は、さらに優れた細胞増殖性を示すことが分かる。そのなかでも、官能基がトリメチルアンモニウム塩基である特定吸着剤は、さらに優れた有機酸吸着能及び細胞増殖性を示すことが分かる。
［３］連続培養
図１に示す細胞培養装置を用いて、細胞の培養及び生産物（抗体）の製造を行った（比較例１～３、実施例３～１１）。具体的には以下のとおりである。
まず、全容２Ｌの培養容器（培養槽）に培地（培養液Ａ）（商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）６００ｍＬを入れ３７℃で保持し、培養容器上面から空気を１．８ｍＬ／分、ＣＯ２を０．２ｍＬ／分で通気し１日間放置した。次に、抗体産生ＣＨＯ細胞液を培養容器内の細胞濃度（細胞数）が５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養容器内の液量が０．８Ｌになるように播種した。播種した日を０日として、播種から３日目より毎日フィード（新鮮培地）（商品名Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び７ｂ、ＧＥヘルスケア製の混合物）を供給（新鮮培地を供給する工程）し、４日後にポンプによる吸着剤カラム（精製ユニット）への培養液の循環（老廃物除去工程）、タンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過（分離処理工程）、及び、表６に記載の栄養成分の添加（毎日０．０８Ｌ添加）（栄養成分添加工程）を行った。特定吸着剤は表６に記載の種類のものを２５０ｇ（ポリマーとして１２５ｇ）使用した。栄養成分の詳細は表５に記載のとおりである。吸着剤カラム（精製ユニット）への循環と表６に記載の栄養成分の添加は培養開始後２０日まで行った。栄養成分の添加は一括で行い、精製ユニットへ循環する循環速度は０．４Ｌ／ｈ（時間）で実施した。タンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物としての抗体を含む透過液とに分離し、戻り液は培養容器に戻した（戻り液を培養液に戻す工程）。フィードを毎日添加、２１日間培養を続けた。また播種から３日後から、培養容器内に一端が挿入された内径２ｍｍの単管を用いて、培養容器下面側から酸素を１ｍＬ／分の流量で培養容器内に供給した。
なお、比較例１では老廃物除去工程を行わなかった。また、比較例１及び実施例３～４では栄養成分添加工程を行わなかった。
〔栄養成分Ｃ１～Ｃ６の調製〕
１０００ｍＬメスフラスコに表５に記載の量（記載の量は［ｍｇ］）を秤量し、イオン交換水を適量添加後０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを０．５５～０．７の範囲に調製した。その後、イオン交換水でメスアップして全量を１０００ｍＬとして、栄養成分Ｃ１～Ｃ６を調製した。
〔ポンプ〕
上記の実験においては、細胞懸濁液抜出濾過ポンプとして、ダイアフラム式往復ＡＴＦポンプ（商品名ＡＴＦ２、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製）を用いた。
〔抗体濃度の測定〕
抗体濃度の定量には液体高速クロマトグラフ（商品名Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製）を用いた。培養槽にサンプリング口を設け（図示せず）、サンプリングしたものを濾過したものを測定した。カラムとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＯＲＯＳ ５０Ａ 内径４．６ｍｍ×５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を用いた。また溶離液として、２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）および２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用い、グラジエント溶出法により測定した。
〔細胞〕
上記の実験において用いた細胞は抗体を産生するＣＨＯ細胞であった。
〔分離膜〕
分離処理工程の分離膜として、中空糸型ＭＦ膜であるＲｅｐｌｉｇｅｎ社の孔径（Ｄｐ）０．２μｍのＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルター、または、中空糸型ＵＦ膜であるＲｅｐｌｉｇｅｎ社のＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルターを用いた。ＵＦ－Ａは分画分子量１０ｋＤ、ＵＦ－Ｂは分画分子量１ｋＤ、ＵＦ－Ｃは分画分子量５０ｋＤを表す。各実施例及び比較例において使用した分離膜を表６に示す。
〔有機酸含有量〕
培養１０日目の培養槽中の培養液について有機酸含有量を測定した。結果を表６に示す。有機酸含有量の測定方法は上述のとおりである。
〔ピーク細胞数〕
培養の継続日数の間における生細胞濃度の測定値のうちの最大値をピーク細胞数として表６中に示した。ピーク細胞数が多い程、細胞増殖性に優れると言える。また、抗体濃度は培養開始後２１日後の値を記載した。
比較例１と実施例１１において、培養後の細胞入りの液８００ｍＬをミリスタックデプスフィルター（表面積２３ｃｍ２）を用いてフィルター濾過した場合の濾過性確認した。比較例１の濾過フィルターが５個必要であったのに対し、実施例１１で用いた濾過フィルターは３個で全量を濾過できた。本特定吸着剤を用いた培養方法で得られた培養液は濾過性にも優れることがわかる。
表６において、比較例１と実施例３との対比、及び、比較例１と実施例４との比較から、老廃物除去工程によって阻害物（老廃物）（有機酸）質量が減少し細胞数が増えたことが分かる。
表６において、実施例３と実施例４との対比、及び、実施例９と実施例１３との対比から、分離膜としてはＭＦ膜よりＵＦ膜の方が良い結果が得られた。これは培地中の低分子成分が特定吸着剤と接触することを抑制することで培養性が良化したためと考えられる。通常、抗体を抑制するために用いられる分画分子量５０ｋＤのＵＦ膜であるＵＦ－Ｃを用いた実施例１２と比較して、分画分子量１０ｋＤまたは１ｋＤのＵＦ膜である、それぞれＵＦ膜－Ａ、ＵＦ膜－Ｂの方が良い結果が得られた。このことから、培地中の抗体よりも小さい成分の抑制が特に重要であることを示唆している。
また、栄養成分は添加しないより添加した方が良い結果が得られ、Ｃ１～Ｃ６を添加した実施例５～１０は無添加の実施例４より優れる結果であった。栄養を添加すると効果があることから、培養状態をモニタリングし、毎日添加する栄養を制御して培養することは特に効果があると考えられる。
［４］Ｎ－１培養との組み合わせ
図２に示す細胞培養装置を用いて、細胞の培養及び生産物（抗体）の製造を行った（比較例４～５、実施例１５～１６）。具体的には以下のとおりである。
まず、培養容器（培養槽）１０として全容２Ｌの培養容器を用いた。培地（培養液Ａ）（商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）６００ｍＬを入れ３７℃で保持し培養容器上面から空気を１．８ｍＬ／分、ＣＯ２を０．２ｍＬ／分で通気し１日間放置した。次に、抗体産生ＣＨＯ細胞液を培養容器内の細胞濃度（細胞数）が５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養容器内の液量が０．８Ｌになるように播種した。培養期間中、培養容器１０内において上面から流量０．１Ｌ／ｍｉｎの空気を供給した。
播種から３日後にタンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過を行い、流路切り替えコネクタ６６によって、培地を回収タンク６５に廃棄した。濾過には、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製のＵＦ膜の中空糸膜フィルター（分画分子量１０ｋＤ）を用いた。培養初期において、系から失われる液量を補充するため、流路５４から新鮮培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯで表される培地と、ＧＥヘルスケア製の商品名Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び７ｂで表される培地との混合物）の供給（培養容器内に新鮮培地を供給すること）を行い、培養を行った。上記の濾過（回収タンク６５への培地の廃棄）及び新鮮培地の供給は、１．０Ｌ／日で行った。タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離し、戻り液は培養容器内に戻した（戻り液を培養容器内に戻すこと）。また播種から３日後から、培養容器内に一端が挿入された内径２ｍｍの単管を用いて、培養容器下面側から酸素を１ｍＬ／分の流量で培養容器内に供給した。
上記の培養において、細胞濃度が７０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した９日目からは、流路５４からの培地供給、回収タンク６５への培地の廃棄は停止した。流路切り替えコネクタ６６を切り替えて、そのままポンプによる精製ユニット３０への培養液の循環（老廃物除去工程）を０．４Ｌ／ｈで行い、及びタンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過（分離処理工程）を行った。特定吸着剤は表７に記載の種類のものを２５０ｇ（ポリマーとして１２５ｇ）使用した。タンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有し生産物としての抗体を含む透過液とに分離し、戻り液は培養容器に戻した（戻り液を培養液に戻す工程）。
精製ユニット３０への循環中は表７に記載の栄養成分を毎日０．０８Ｌ添加した（栄養成分添加工程）。栄養成分の詳細は表５に記載のとおりである。精製ユニットへの循環は培養開始後２０日まで行った。この状態のまま、２１日間培養を続けた。
なお、比較例４～５では老廃物除去工程及び分離処理工程を行わなかった。また、比較例４及び実施例１５では栄養成分添加工程を行わなかった。
〔抗体濃度の測定〕
抗体濃度の定量には液体高速クロマトグラフ（商品名Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、株式会社島津製作所製）を用いた。カラムとして、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＯＲＯＳ ５０Ａ 内径４．６ｍｍ×５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を用いた。また溶離液として、２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）および２０ｍＭのリン酸バッファー＋３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用い、グラジエント溶出法により測定した。
〔２１日目の生細胞数〕
２１日目の生細胞数を表７に示した。２１日目の生細胞数が多い程、細胞増殖性に優れると言える。
表７において、２１日目の生細胞数は比較例４、比較例５では生細胞数が大きく低下するが、老廃物除去工程を行う実施例１５、実施例１６において、生細胞数の低下はすくなく、培養期間中生細胞数を高く維持することができ（細胞増殖性に優れ）、抗体濃度も上昇する。
［５］灌流培養との組み合わせ
図３に示す構成の細胞培養装置を用いて灌流培養方式による細胞培養を行った（比較例６～７、実施例１７～１８）。具体的には以下のとおりである。
まず、培養容器（培養槽）１０として全容２Ｌのエイブル株式会社製培養容器に培地（培養液Ａ）（商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）６００ｍＬを入れ３７℃で保持し、培養容器上面から空気を１．８ｍＬ／分、ＣＯ２を０．２ｍＬ／で通気し１日間放置した。次に、抗体産生ＣＨＯ細胞液を培養容器内の細胞濃度（細胞数）が５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養容器内の液量が０．８Ｌになるように播種した。新鮮培地の供給及び培養容器１０からの細胞懸濁液の抜き取り（回収タンク６５への培地の廃棄）は、培養開始から３日目以降に行った。播種から３日後にタンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過を行い、培地を回収タンク６５に廃棄した。分離膜ユニット４ｂの分離膜４にはＲｅｐｌｉｇｅｎ社製の中空糸膜フィルター（ＭＦ）を用いた。濾過により培養系から失われる液量を補充するため、流路５４から新鮮培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製の商品名ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯで表される培地と、ＧＥヘルスケア製の商品名Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び７ｂで表される培地との混合物）の供給（培養容器内に新鮮培地を供給すること）を行った。上記の濾過（回収タンク６５への培地の廃棄）及び新鮮培地の供給は、表８の「新鮮培地供給速度」の欄に記載の速度で行った。
さらに、培養開始４日目よりタンジェンシャルフィルトレーション方式による濾過（分離膜３）（分離処理工程）、及び、精製ユニット３０への培養液の循環（老廃物除去工程）を０．４Ｌ／ｈの速度で行った。濾過には、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ社製のＵＦ膜の中空糸膜フィルター（分画分子量１０ｋＤ）を用いた。特定吸着剤は表８に記載の種類のものを２５０ｇ（ポリマーとして１２５ｇ）使用した。精製ユニット３０への循環は培養開始後２０日まで行った。また、表８に記載の栄養成分を循環中毎日０．０８Ｌ添加した（栄養成分添加工程）。栄養成分の詳細は表５に記載のとおりである。
タンジェンシャルフローフィルトレーション方式による濾過においては、細胞懸濁液を、細胞懸濁液よりも高い細胞濃度を有する戻り液と、細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する透過液とに分離し、戻り液は培養容器内に戻した（戻り液を培養容器内に戻すこと）。また同日（播種から３日後）から、培養容器内に一端が挿入された内径２ｍｍの単管を用いて、培養容器下面側から酸素を１ｍＬ／分の流量で培養容器内に供給した。
上記の培養において、細胞濃度が１１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した日からは、平均細胞濃度（１日２回の細胞濃度測定による２時点での細胞濃度の平均値）が約１１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように１日に１回、流路５５を通して培養容器内から所定量の細胞懸濁液を抜き出す操作（セルブリーディング操作）を行い、播種から２１日目まで培養を継続した。
なお、比較例６～７では老廃物除去工程を行わなかった。また、比較例６及び実施例１７では栄養成分添加工程を行わなかった。
Figure 0007352650000011
かん流培養との組み合わせにおいて、維持細胞数（設定細胞数）を同じ数字に設定した場合、比較例６、比較例７に示す通常のかん流培養での総使用培地量に対して、老廃物除去工程を行った実施例１７、実施例１８においては、同量以上の抗体を得るために必要な総使用培地量を半分程度に抑えることが可能である。このことから、比較例６～７と比較して、実施例１７～１８の方が使用培地が削減できており、コスト、環境的に優れる。
１１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを維持するために１日に必要な新鮮な培地の量は培養槽液量０．８Ｌに対し、比較例６、７は１.０Ｌ必要であるのに対し、実施例１７、１８は０．５Ｌ以下で良い。すなわち、１１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを維持するために必要な培地量は通常１．１ｖｖｄのところ、０．６３ｖｖｄ以下にすることができる。ここでｖｖｄとは、１日当たりの培地液量を培養槽液の全量で除したものを表す。
１ 流路１
１ａ 流路
１ｂ、４ｂ 分離膜ユニット
１ｃ、１ｄ 流路
２ 流路２
３、４ 分離膜
１０ 培養槽
１２ 細胞
２０ 培養液
２２、２３ 培養液
２４ 培養液
２６ 培養液（精製培養液）
２８ 新鮮な培地（新鮮培地）
３０ 精製ユニット
３２ 特定吸着剤
３４ フィルター
３６ フィルター
４０、４１ ポンプ
４２、４３ ＡＴＦ用ポンプ
５３、５４、５５、５６ 流路
６５ 回収タンク
６６ 流路切り替えコネクタ

Claims (19)

  1. 老廃物を含有し、細胞を分離することができる分離膜によってろ過された培養液と、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーと、を接触させることで、前記培養液から前記老廃物を除去して、精製培養液を得る、老廃物除去工程と、
    前記精製培養液を用いて細胞を培養する、培養工程とを備え、
    前記老廃物が、イソ吉草酸、酪酸、及び、クエン酸からなる群より選択される少なくとも１種の有機酸である、細胞培養方法。
  2. 老廃物を含有し、細胞を分離することができる分離膜によってろ過された培養液と、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーと、を接触させることで、前記培養液から前記老廃物を除去して、精製培養液を得る、老廃物除去工程と、
    前記細胞が培養される培養容器内に前記精製培養液を供給する工程とを備え、
    前記老廃物が、イソ吉草酸、酪酸、及び、クエン酸からなる群より選択される少なくとも１種の有機酸である、細胞培養方法。
  3. 前記ろ過された培養液が、細胞を含有しない、請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
  4. 前記老廃物除去工程が、前記ろ過された培養液を、前記ポリマーが充填された精製ユニットに通すことで、前記ろ過された培養液から老廃物を除去して、前記精製培養液を得る工程であり、
    前記培養工程が、培養槽の中で、前記精製培養液を用いて細胞を培養する工程であり、
    前記精製ユニットの入口側と前記培養槽とが、途中に細胞を分離することができる分離膜を有する流路によって繋がれ、
    前記ろ過された培養液は、前記流路を経て、前記分離膜によってろ過された培養液である、請求項１または３に記載の細胞培養方法。
  5. さらに、
    前記老廃物除去工程で得られた精製培養液に栄養成分を添加することで、栄養成分が添加された精製培養液を得る、栄養成分添加工程を備える、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  6. 前記栄養成分が、アミノ酸類、ビタミン類、エネルギー源、浸透圧調節剤、ｐＨ緩衝剤、微量金属元素、界面活性剤、及び、増殖補助因子からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項５に記載の細胞培養方法。
  7. 前記栄養成分が、ビタミン類、エネルギー源、ｐＨ緩衝剤、及び、微量金属元素からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項５又は６に記載の細胞培養方法。
  8. 前記ポリマーが、４級アンモニウム塩基を有する水不溶性ポリマーである、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  9. 前記水不溶性ポリマーが、下記一般式（ｐ１）で表される部分構造を有する、請求項８に記載の細胞培養方法。

    一般式（ｐ１）
    一般式（ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は、フェニル基を表し、置換基として水酸基を有していてもよい。Ｘは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６を表す。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。
  10. 前記一般式（ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、それぞれ独立に、メチル基、又は、ヒドロキシエチル基であり、Ｘが、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６である、請求項９に記載の細胞培養方法。
  11. 前記水不溶性ポリマーが、下記一般式（Ｐ１）又は（Ｐ２）で表される繰り返し単位を有する、請求項８に記載の細胞培養方法。

    一般式（Ｐ１）
    一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は、フェニル基を表す。Ｘは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６を表す。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。

    一般式（Ｐ２）
    一般式（Ｐ２）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は、フェニル基を表す。ｎは、１～８の整数を表す。Ｘは、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＴｓ、又は、ＰＦ６を表す。ここで、ＴｓはＣＨ３－Ｃ６Ｈ４－ＳＯ２－を表す。
  12. 前記水不溶性ポリマーが、前記一般式（Ｐ１）で表される繰り返し単位を有する、請求項１１に記載の細胞培養方法。
  13. 前記一般式（Ｐ１）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が、メチル基であり、Ｘが、Ｃｌ、又は、Ｂｒである、請求項１２に記載の細胞培養方法。
  14. 前記細胞が、動物細胞である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  15. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  16. 前記細胞が産生細胞であり、前記産生細胞が抗体産生細胞である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  17. 請求項１６に記載の細胞培養方法を用いた、抗体製造方法。
  18. 老廃物を含有し、細胞を分離することができる分離膜によってろ過された培養液と、４級アンモニウム塩基又はアミノ基を有するポリマーと、を接触させることで、培養液から前記老廃物を除去して、精製培養液を得る、老廃物除去工程と、
    ＣＨＯ細胞が培養される培養容器内に前記精製培養液を供給する工程とを備える、抗体製造方法。
  19. 前記老廃物が、イソ吉草酸、酪酸、及び、クエン酸からなる群より選択される少なくとも１種の有機酸である、請求項１８に記載の抗体製造方法。
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