JPS6163284A - 動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、初物細胞の培養方法に関するものである。更
に詳しくは、動物Ｉｌｌ胞を効率的に増殖し、殊に高田
度で培養することが可能な培養方法にＩＩＩする。

大規模による動物細胞大Ｇ培養は、例えばウィルス、ワ
クヂン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、あるい
はホルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に近
年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体
の生産は抗体産生細胞とミニローフ″ｑによるハイプリ
ドーマ人は培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

従来、動物ｌＩＩ胞培養は一般にシャーレ、試験管。

培養びんなどを用いて実験室的規模で行なわれている。

近年動物［１［の大量培養法及びそのための装置として
、いく）かの提案がなされている。

一般に動物細胞の培養に当っては、子牛或いは牛胎児等
から得られる血清を培地として使用されているが、この
血清は、高価である。

一方、この高価な血清を用いないで、人為的に合成され
た所謂無血清培地の開発も盛んに行なわれている。無血
清培地は、種々の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類、
糖類、抗生物質、時には成長促進物質などを人為的に種
類と割合を組合けて　　　′合成したものであり、品質
の安定性、大帛供給性、価格の安さ、培養生成物の精製
・回収の容易性など優れた利点がある。

上記血清酸いは無血清培地を用いて＃Ｊ物ｍ飽を培養す
るに当って、大規模殊に高密度にて培養しようとする場
合、種々の技術的問題があり、その一つは細胞が代謝す
る生育阻害物質の除去である。

そこで本発明者らは、動物細胞の培養において、生育阻
害物質について研究を進めたところ、培養系中のアンモ
ニアの濃度が高まると次第に細胞の生育に悪影響を及ぼ
す割合が多くなること、また培養系中のアンモニア濃度
を低下させれば再び細胞は生育速度を増大することを見
出した。

本発明は、かかる知見に塁いて到達されたものであって
、動物細胞を培養する方法において、培養液をアンモニ
ア吸着剤と連続的或いは間歇的に接触させることによっ
て培養することによる動物細胞の培養方法である。

かかる本発明方法においては、培養系中の培養液に含ま
れるｗＵ胞が代謝した数多くの産出物のうち、アンモニ
アを吸着剤の使用によって吸着させ、結果的に培養液中
のアンモニア濃度を高くならないように、低い水準に維
持することによって動物細胞の生育を増大させ、また高
密度培養が容易に可能となる。

水明ｍ書において゛培養液”とは、培地を用いて動物細
胞が生育している液状物のことであって、その中には培
地成分のみならず、代謝成分、生産成分など数多くの成
分が含まれている。

本発明方法の実施に当って、培養液とアンモニア吸着剤
との接触は種々の方式によることができる。例えば細胞
を培養している系中へ吸着剤を存在させてもよく、また
その場合吸着剤と細胞とが直接接触してもよいし、直接
接触しないように多孔膜或いはバッファーを介して培養
液と吸着剤とを接触するようにしてもよい。

さらに培養系から培養液を取り出し、これを吸着剤と接
触させて、かくしてアンモニアを吸着除去した後の培養
液を再び培養系へ戻すことによって、本発明の培養液と
吸着剤との接触を行うこともできる。上記いずれの方式
による場合であっても培養液と吸着剤との接触、は連続
的に行うこともできるし、またアンモニア濃度の検出し
て一定水準に維持するように間歇的に行うこともできる
。　　　・アンモニアの吸着に使用される吸着剤として
は、アンモニアを物理的或いは化学的に吸着し得る固体
状のものであればよいが、アンモニアを選択的吸着し得
るものが一層好ましい。また吸着剤は細胞の生育に悪影
響を与えないものであることが望ましい。

アンモニア吸着剤としては、粉末状、ビーズ。

ベレット、膜状なといずれの形態であってもよく、いず
れにするかは、培養液と吸着剤との接触方式によって主
として決められる。アンモニア吸着剤としては、無機物
、有機高分子（イオン交換樹脂）いずれも用いられる。

例えば選択的にアンモニアを吸着しうるちのとして、比
較例均一な微細孔径を有する天然又は合成ゼオライトが
好ましい例として挙げられる。具体例と示すと、触媒化
成に、に、製合成ゼオライトＺ　ＣＰ　−５０や天然ゼ
オライトであるクリノプチロライトがあるが必ずしもこ
れらに限られるものではない。

かくして本発明方法において、前記吸着剤の使用によっ
て培養系中のアンモニア濃度を４０μｇ／ｎｔｌｌ以下
、好ましくは３０μｇ／ｄ以下特に好ましくは２０μ９
／ｄ以下に維持することができる。

本発明の培養方法の対象となる動物ｌｌ１ｖｉとしては
、人間を含む種々の動物の組織由来の培養細胞であり、
好ましくは、株化細胞、ミエローマ、ハイブリドーマな
どが挙げられる。就中本発明の培養方法はハイブリドー
マの生育に適している。ハイブリドーマとしては、例え
ばマウス×マウス。

マウス×ヒト、ヒトＸマウスなどが、特に好ましい。

本発明の培養のために使用される培地としては血清培地
のいずれでもよいが、本発明方法は、無血清培地を用い
る場合にその効果が顕著である。

かかる無血清培地としては、通常動物細胞の培養のため
に開発され、或いは使用される血清を含まない培地であ
ればよい。

無血清培地を形成するり礎培地としては、前述したよう
に動物細胞の培養に使用されるものであればよいが、具
体的には、中井準之助ら編集による「組織培養」　（朝
食書店発行：　１９８１年）の７〜２４頁に記載されて
いる合成培地を基礎培地とじて使用することが出来る。

またこれら基礎培地にエタノールアミン（５〜３０μＭ
）、ホスホリピド（１０〜１００μＣＪ／ｒｄ、）、イ
ンシュリン（２〜１０μｇ／ｍ）、トランスフェリン（
１０〜３５μ９／ｉ）。

セレニウム（１０−〜１０−’　Ｍ　）　、ピルビン酸
（０，５〜５ｍＭ＞、チミジン（１Ｘ１０−７〜１ｘ１
０’３Ｍ＞。

ヒボキサンチン（１×１０″６〜１×１０ＡＭ）などの
一種又はそれ以上を添加すると一層望ましい。具体的培
地としてはＴＥＳ、ＩＴＥＳ、ＭＩＴＥＳ［（Ｄ　　Ｈ
，Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ、　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、７９．　
　ｐｐ１１５８−１１６２゜Ｆ　ｅｂｒｕａｒｙ　１９
８２．　Ｃｅ１ｌ　３１ｏｌｏａｙ、　（ｉ）Ｈ、Ｍｕ
ｒａｋａｍｉ　ｅｔ、ａｔ、　Ａｇｒｉｃ、３　ｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、、　４６［力　１８３１−１８３７　（１
９８２）　、　＠　　村上、下材、“組織培養゛′９　
（１３１、５１５−５１９（１９８３）参照］などを挙
げることが出来る。これらのうちエタノールアミンを添
加したちのがより好ましいものとして挙げることが出来
る。また上記培地にリボ蛋白質を添加したものであって
もよい。

本発明の培養方法の実施に当っては、種々の培養方式を
採用することが可能である。すなわち、培地を装入した
シャーレ、その他容器中に細胞を播種して培養する所謂
静置培養であってもよく、培地を含む水性媒体中で細胞
を浮遊状態で培養する所謂サスペンション培ｒｋ（スピ
ナー培ＴＩ）でもよい。殊に培養容器中で細胞をサスペ
ンション状態で生育し、連続的或いは間歇的に該容器中
に新しい培地を供給しながら、培養液を容器外へ排出す
ることによって培養する所謂バーヒユージョン培養が本
発明の実施に適している。

以上本発明において、動物ｍ胞が培養中に代謝したアン
［ニアを吸着剤によって吸着除去することによって、細
胞の増殖が活発に行なわれ、細胞の大量培養、高密度培
養を容易に可能とすることができる。

以下実施例を掲げて本発明を説明するが、本発明はそれ
に限定されるものではない。

実施例１．比較例１ 径３５ＩＩｕＲのカルデジーディツシュに２ｄの培地を
入れた。このカルチャープッシュに１Ｘ１０ｇｃｅｌｌ
ｓ　／ｄの細胞密度になるように、ヒト×ヒトハイブリ
ドーマＨＦ株を播種した。

一方、１００ｍｇのシリカ７）Ｉレミｊ−、ＺＣＰ−５
０（触媒化成■製）をＰＢＳ中に累法し６２５りに調製
したものを透析チューブ（Ｓ　ｐｅｃｔｒａｐｏｒ　６
　Ｍ　ＷＣＯ１０００）に挿入しこれを上記カルチャー
プッシュ中に入れた。

上記のカルチャーディツシュを、３７℃Ｃ０２５％にセ
ットしたＣＯ２インキユベータに入れて培養を行った。

上記の培養の結果をシリカルアミナＺＣＰ−５０を共存
をせなかった比較例とともに次竪示す。

（以下余白） ［ （以下余白） 実施例２ マウスミエローマＭ　Ｐ　Ｃ−１１株を及びヒト×ヒト
ハイブリドーマＨＦ株を下記条件以外は実施例１と同じ
条件で６日間培養を行った。その結果を次表に示ず。

（以下余白）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 動物細胞を培養する方法において、培養液をアンモニア
   吸着剤と連続的或いは間歇的に接触させることによって
   培養することを特徴とする動物細胞の培養方法。