JPS633787A - 改良された融合生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は改良された融合生成物に間する。

［先行技術〕 ケーラー（にｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉ　１ｓ
ｔｅｉｎ）は１９７５年、免疫化されたハツカネズミの
ひｍ細胞にハツカネズミの骨髄腫くミエロマ）細胞を初
めて融合させた［Ｎａｔｕｒｅ、　２５６巻（１９７５
年）４９５−４９７頁コ。

これは、均質なくいわゆる「モノクローナル」の）抗体
をつくる連続的な細胞系が人手可能であること、またこ
れらのハイブリドーマによってつくられる抗体を種々の
科学研究や医学上の診断目的に使用できることを示すも
のであった。ハイブリドーマをつくる方法は、−般に以
下の段階からなる。

（ａ）例えばハツカネズミ又はラットを免疫原性薬剤で
免疫化する。免疫化手順は、有用な量の適当に準備され
たひ臓細胞をつくるような手順とする。

（ｂ）免疫化された動物からひ臓を除き、適当な媒体中
のひ臓の懸濁液をつくる。

（Ｃ）適当な融合プロモーターの存在下に適当な細胞系
からの骨髄腫細胞に、懸濁したひ臓細胞を融合させる。

融合プロモーターはセンダイ・ウィルス、化学的融合層
、例えば約１０００〜約４０００の平均分子量をもつポ
リエチレングリコール（ＰＥＧＸ市販のＰＥＧ　１００
０なと）でありうる、融合の実施に有用なもう一つの手
法は、ジンマーマン（Ｚｉ＋ｉｍｅｒ−ｍａｎｎ）及び
ショイリヒ（Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ）、　Ｐｌａｎｔａ　
１５１巻（１９８１年）２６−３２頁；ビーンケン（Ｖ
ｉｅｎｋｅｎ）ら、Ｐｌａｎｔａ１５７巻（１９８３年
）３３１頁；及びジェイコブ（Ｊａｃｏｂ）ら、５ｂｕ
ｄ、　８ｉｏｐｈｙｓ、　９４巻（１９８３年）９９頁
、に利用されたような既知方法による電気的融合である
。使用の骨髄腫細胞系は、ハイブリッド細胞が生存する
一方で、選択培地中で未融合骨髄腫細胞が生存しないよ
うに、いわゆる「薬剤耐性型」のものが好ましい。最も
一般的な部類は８−アザグアニン耐性細胞系で、これは
酵素ハイボキサンチングアニンホスホリベイシルトラン
スフェラーゼを欠き、従ってＨＡＴ（ハイポキサンチン
、アミノプテリン、及びチミジン）媒地に支持されない
。

（ｄ）未融合骨髄腫細胞を支持しない選択培地中の未融
合び臓細胞、未融合骨髄腫細胞及び融合細胞の混合物を
、未融合細胞を死滅させるさせるのに十分な期間（約１
週間）、別個の容器に希釈して培養する。希釈は限定的
な形のものであって、希釈容量はある数の細胞（例えば
微量滴定板の各人（ウェル）の細胞数）を単離するため
に統計的に計算されている０選択培地中で未融合骨髄腫
細胞は死滅する。未融合ひ臓細胞は悪性ではないから、
限定的な世代数しかない。このため、ある期間（約１週
間）後、これらのび臓細胞は増殖しなくなる。他方、融
合細胞は親骨髄腫の悪性の性質と、親ひ臓細胞の選択培
地中で生存する能力とをもっているため、増殖を続ける
。

（ｅ）ハイブリドーマを含有する各容器（穴）中の上澄
みを検査し、もともと使用した抗原に対して指向性のあ
る抗体がいるかどうかを見る。

（ｆ）所望の抗体を生産するハイブリドーマを、（限定
的希釈などによって）選択し、クローン化する。

所望のハイブリドーマが選択されクローン化されたら、
生ずる抗体は二通りのいずれかで生産できる。最も純粋
なモノクローナル抗体は、所望のハイブリドーマを適当
な媒地中で適当な期間に生体外で培養し、続いて所望の
抗体を上澄み液から回収することによって生産される。

適当な媒体及び適当な培養期間の長さは既知であり、容
易に決定される。この生体外手法は、本質的に他の特異
的抗ヒト免疫グロブリンを含まない本質的に単一特異的
なモノクローナル抗体を生産する。媒地は異種発生性血
清（例えば牛胎児血清）を含有するため、少量の他の免
疫グロブリンが存在する。しかし、モノクローナル抗体
の濃度は約５０μｇ／ｍ　Ｉ程度であるので、この生体
外方法は何かの目的に十分な量又は濃度の抗体をつくれ
ないこともある。

純度はやや劣るがもっと高濃度のモノクローナル抗体を
つくるには、所望のハイブリドーマをハツカネズミ、好
ましくは同質遺伝子型又は半同質遺伝子型のハツカネズ
ミに注射できる。ハイブリドーマは適当な培養期間後、
抗体生産性腫瘍の形成をもたらす。その結果、ホストハ
ツカネズミの血流及び腹膜浸出液（腹水）中に高濃度（
約５−５−２Ｏ／１）の所望抗体ができる。

［発明が解決しようとする問題点コ この方法は文献中に広く明らかにされている。

同法は特定的かつ重大な欠点をもっている。ＰＥＧは純
粋な形で、所望の分子量範囲で入手できるため、またセ
ンダイウィルスに比べて取り扱いが容易なため、融合環
として次第に受は入れられるようになった。しかし、Ｐ
ＥＧにとって有効な濃度範囲は非常に狭い。最適濃度範
囲は５０±５！（ν／ｖ）である、この濃度でＰＥＧは
融合しようとする全細胞に対して、また融合ハイブリッ
ド細胞に対して著しい細胞毒性効果を示す。他方、最適
水準を下回る濃度のＰＥＧを使用すると、中程度の細胞
毒性のみが観察されるが、融合効率が低く、そのためハ
イブリドーマの形成率も低い。センダイウィルスとは対
照的に、ＰＥＧのような既知の化学的融合層や電気的融
合は、融合させようとする細胞の凝集を起こさないため
、細胞膜が融合にとって効率的な近接度にない。

［問題点を解決する手段］ 従って、本発明の一つの目的は、有用な生成物を生産で
きる新規な融合ハイブリッド細胞を提供することにある
。発明のもう一つの目的は、有用な生成物を生産できる
、非抗体・生産哺乳類細胞又は植物細胞、例えばランゲ
ルハンス島細胞を、連続的に増殖できる適当な融合相手
と融合させることによってハイブリッド細胞をつくる方
法を開発することにある０発明のもう一つの目的は、Ｐ
ＥＧ、リソレシチン、デキストラン、［ＩＭＳＯ、ポリ
ビニルアルコール、ポリ−し一オルニチン、及び硝酸ナ
トリウムのような有用であることが知られた塩類、又は
それらの組合わせなどの慣用の化学的融合原の細胞毒性
効果を低下させることにある。融合過程でこれが所望の
ハイブリッド細胞の収量を高める結果となる。もう一つ
の目的は、電気的融合手法で融合させるための凝集細胞
をつくるにある。

これらとその他の目的は、以下の説明から明らかになろ
う０本発明はその一般的概念において、非抗体・生産哺
乳類細胞と連続的に増殖できる哺乳［１胞との融合によ
って得られる、有用な生成物を生産できる融合ハイブリ
ッド細胞に関する。

この融合は、初めに凝集を起こしてから、凝集細胞の融
合を行なうことによって促進された。もう一つの面で、
本発明はその一般的概念において、有用な生成物を生産
できるハイブリッド細胞をつくるための植物細胞の凝集
と融合に間する。本発明は抗体でない有用な生成物を生
産できる哺乳類細胞を、連続的に増殖できる哺乳ｇ細胞
と選択的条件下に融合させることによって、融合ハイブ
リッド細胞をつくる方法に間する。この方法は、融合さ
せようとする細胞混合物を有効量の凝集原と接触させ、
次に凝集細胞を融合させることからなる。もう一つの面
で、本発明は有用な生成物を生産できるハイブリッド細
胞をつくるための植物細胞の凝集と融合に間する０本発
明は更に融合ハイブリッド細胞の製法に間しており、こ
の製法は有用な生成物を生産できる植物細胞及び連続的
に増殖できる植物細胞を有効量の凝集原と接触させ、次
に凝集細胞を融合させることからなる。

本発明のもう一つの面は、事前の又は同時的な凝集の利
点を伴った、又は伴わない場合の、有用な生成物を生産
できる植物細胞からのプロトプラストと連続的に増殖で
きる細胞（例えば植物えい（埼）瘤腫１ｍｌ細胞）から
のプロトプラストとの、既知融合手法による融合であっ
て、これらのハイブリッド細胞が所望の有用生成物を生
産できるようにするものである。

「凝集原」は、融合させようとする細胞を凝集させるこ
とができる任意の薬剤を記述するために使用される用語
である。すべての凝集原が包含されるが、典型的な凝集
原はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリン
Ａ及び落花生凝集素である。本発明による好ましい凝集
原はＰ）ＩＡである。

凝集原濃度を調整して、細胞毒性が見られず、凝集が有
意の程度に起こるようにすべきである。

凝集原ＰＨＡの適当な範囲は２２５−４００ｕ／ｓ＋ｌ
である。

好ましいＰＨＡ濃度は約１５０−２００μ８／１てあり
、２００μｇ１０ｆが最も好ましい、他の凝集原の適当
な濃度はこの技術で周知の標準的手法によって容易に決
定できる。凝集処理は生理学的温度、例えば３７℃で十
分な時間、例えば５・１５分間実施される。十分な凝集
が起きた後、細胞を融合にかける。一つの態様で、慣用
の化学的融合原、好ましくはＰＥＧを添加し、混合物を
生理的条件下に培養して、凝集細胞の融合を行なわせる
。　ＰＥＧを使用する時は、濃度は約３０−５０！（ｗ
／ｖ）である、　ＰＥＧの好ましい濃度は約４０±５Ｘ
（ν／ｖ）である。最適融合時間は約１分である。それ
より長い時間、例えば２分を超えた時間を使用できるが
、時間の増加につれて細胞毒性が高まる危険がある。も
う一つの態様で、凝集細胞の融合は電気的融合によって
行なわれる。

本発明の新規な融合手法は、先行技術の結果に比べて著
しく増加した生育可能なハイブリッド細胞の形成をもた
らした。

用語「有用な生成物」は、融合させようとする哺乳類細
胞又は植物細胞がつくりだせるすべての生成物を包含し
ている０銭型的な例は生物学的に活性のあるタンパク類
、グリコタンパク類、ポリペプチド類、酵素類、及びア
ルカロイド、ステロイド、ジオスゲニン、アントラキノ
ン、ピレトリン、精油、多糖類、強心配糖体、香水及び
化粧品成分のような非タンパク性化合物類である。

融合させようとする細胞から生産できる生物学的に活性
のある物質の典型的な例を、以下の第１−５表に示す。

（上１ アルカロイド類　　　　　殺虫剤 アレルゲン類　　　　　　ラテックス アントラキノン類　　　　脂質 抗白血病薬　　　　　　　ナフトキノン類抗腫瘍剤　　
　　　　　　核酸 抗ウィルス剤　　　　　　ヌクレオチド類芳香剤　　　
　　　　　　油類 ベンゾキノン類　　　　　アヘン剤 炭水化物（多糖類を含む）有機酸類 強心配糖体　　　　　　　ペプチド類 チャルコン類　　　　　　香水 ジアンスレン類　　　　　フェノール類酵素　　　　　
　　　　　顔料 酵素抑制剤　　　　　　　植物成長調整剤フラバノイド
、フラボン類　タンパク類風味料（甘み料を含む）　　
ステロイド及び誘導体フルラックマリン類　　　糖類 ホルモン類　　　　　　　タニス テルペン、テルペノイ ド類 ビタミン類 インシュリン　　　　　　　　ランケ゛恩ハシス島細胞
　　抗糖尿病薬り゛ルカコ゛ン　　　　　　　ランｌ−
ルハンス島細胞　　インシュリン生産調整ソマトスタチ
ン　　　　　　　ラシケ′ルハンス島細胞　　インシュ
リン生産調整ＡＣＴＨ下垂体前葉細胞　抗炎症 黄体形成ホルモン　　下垂体細胞　　　生殖調整卵胞刺
激ホルモン　　下垂体細胞　　　生殖調整成長ホルモン
　　　下垂体細胞　　　成長促進黄体形成ホルモン　　
下垂体細胞　　　受精力の調整放出ホルモン ブロラクチシ　　　下垂体細胞　　　乳生産の刺激ｆＯ
）０ヒ”シ（ＴＳＨ）　　下垂体細胞　　　甲状腺低下
胸腺ｕｔ：／　　　ａ腺細胞　　　　免疫変調因子Ｉ　
Ｑ　２０本゛イＸｆン　　腎臓　　　　　　赤血球形成
刺激表皮成長因子　願下線　　　　　細胞増殖刺激と胃
酸分泌の抑制 ｔＳシトシン　　　　　下垂体後置　　　子宮収縮と乳
生産の制御 ハーソフ＠しマリン　　　　　下垂体後置　　　　　　
抗利尿ホルモンニジケファリン　　　副腎クロム親和　
鎮痛性細胞 心房す）＋７ウム排泄心ａｍ胞　　　　血管拡張剤増加
因子（ＡＮＦ） β　−エンドルフィン　　　脳、　下垂体　　　　　　
鎮痛インヒヒ゛ン　　　　顆粒膜細胞　　　受精調節（
卵巣） ｈｎシトニジ　　　　甲状腺細胞　　　骨（＠　＋　＋
沈着増加傍甲状腺本ルモン　傍甲状腺（主細胞）骨吸収
の発生インターロイキシ−！　　　　大食細胞　　　　
　　　　抗腫瘍インターロイ４）−２Ｔヘルパー細胞　
抗腫瘍インターロイキン・３　　Ｔヘルパー細胞　幹細
胞増殖α−インターフェロシ　　　白血球　　　　　　
　　　　抗ウィルス、　抗腫瘍］０ニー刺激因子２Ｔ’
ｌ胞　　　　　ＭＱと顆粒球増殖Ｃ３Ｆ−１ｍａｍ芽細
胞　　　ＭＱ成長と活性化Ｂ細胞成長因千Ｔヘルパー細
胞　免疫不全腫瘍壊死因子　大食細胞　　　　抗！！瘍
γ　−イシターフｘＯン　　　大食細胞　　　　　　　
　抗ウィルス、　抗腫瘍Ｔヘルパー細胞 β　−イシターフェロン　　　線維芽細胞　　　　　　
抗ウィルス、　抗腫瘍大食細胞活性　大食細胞　　　　
抗腫瘍、抗つィ３２化因子 １″！シ゛オケーニン　　癌細胞　　　　　傷治癒、血
管新生 ステロイド類　　　副腎皮質　　　　生殖神経成長因子
　唾液腺細胞　　　神経細胞再生血小板由来の　くエン
ドチン血　偶の治癒成長因子　　　小板） メラニシ細胞刺激　松果体細胞　　　色素形成の制御参
ルモン及びメラトニシ 第しａ−表 仕一合二初」洋　　　　ＩＬ１１１ヱＩＪ殉薬品　　　
　アルカロイド、ステロイド、アントラキノン 酵素　　　　プロテアーゼ（例えば、パパイン）ラテッ
クス　イソプレノイド（例えばゴム）ワックス　　ワッ
クスエステル（例えばジョジョバ） 顔料　　　　スティン及び染料 油　　　　　脂肪酸（例えば種油） 農薬　　　　殺虫剤（例えばピレトリン）化粧品材料　
精油（例えばモノテルペン）食品添加物　風味化合物、
非栄養性甘味料（例えばタウマチン） ガム　　　　多糖類（例えばアラビアゴム）第」Ｌ表 」１ 植ＪＬ生」Ｌ物　　植１種　　　　　　　　　　１Ｊ１
１途ｊ コテ゛イン　　　　　　　１１°ハ０ヘール拳ソムニフ
エルム　　　　　　ｉｌ！（７１１カロイト＋）　　　
　（Ｐａｐａｖｅｒ　　ｓｏａ＋ｎｉｆｅｒｕｍ）シー
オスケ一二シ　　　　シ゛オス］　１７７−テ゛ルトイ
シ”？　　　　　抗受精剤（ステロイド）　　　　　（
Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　　ｄｅｌｔｏｉｄｉａ）キニン　
　　　　　　　　１シチコナ−＆シ゛エリアす　　　　
　　　　抗マラリ？（ｒＡ力０イト−）　　　　（Ｃｉ
ｎｃｈｏｎａ　　ｌｅｄｇｅｒｉａｎａ）シ゛］゛鳥シ
ン　　　　　シ゛鳥゛タリス・ラナタ　　　　　　　　
　　強心（強心配糖体）（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ　１ａｎ
ａｔａ）スコポラミン　　　　　ターフラ・ストラモニ
ウム　　　　　　　　　抗高血圧（７Ａ力０イト−）　
　　　（Ｄａｔｕｒａ　　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）ヒ”
ンクリスチン　　　　力タラシプスφ０セ゛ウス　　　
　　　　　　抗白血病（アルカロイド−）　　　　（Ｃ
ａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　　ｒｏｓｅｕｓ）農二笈 七〇レトリン　　　　　　クリ号ンセマム中４ネラリエ
フォリウム　　　殺虫剤（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕａ
＋ ｃｉｎｅｒａｒｉａｅｆｏｌ　ｉｕｍ）食ｊＬ二」【料 キニン　　　　　　　　　キンチョナ４シ゛エリ１す　
　　　　　　　苦み剤（アルカロイド）　　　　（Ｃｉ
ｎｃｈｏｎａ　　Ｉｅｄ３ｅｒｉａｎａ）タウマチン　
　　　　　　タウマドコツカス・り゛ニエリ　　　　　
　　非栄養性（チャルコン）　　　　　　（Ｔｈａｕｍ
ａｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　　　　　甘味料ｄａｎｉｅｌ
ｌｉ） シ“ヤスミシ　　　　　　シーヤスミナム種香水シ゛オ
スタ゛ニンか　　抗受精剤　　　　シーオスコリア・テ
ールチオテ゛７ら　のステ０イド　　　　　　　　　　
　　　（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、ｄｅｌｔｉｏｄｅａ）コ
テ゛イン　　　　　　　鎮痛　　　　　　　　　ハ０ハ
９ヘールｅソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ　ｓｏｍｎ
ｉｆｏｒｕｍ）？ト０ヒ０ン　　　　　　抗コリン作用
　　　７トロ」ピ赤へ゛ラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　　ｂ
ｅｌｌａｄｏｎｎａ）しセル上０シ　　　　　　抗高血
圧　　　　ラウウォルフィ？・セルへ０ンチナ（Ｒａｕ
ｗｏｌｆｉａ　　５ｅｒｐｅｎｔｉｎａ）ヒヨスシアミ
ン　　　　　抗コリン作用　　　　ヒヨスシアミンくシ
ーエール（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）シ゛コ
”鳥シン　　　　　強心作用　　　　シ゛キ゛タリス番
うナタスコ本０ラミン　　　　　抗コリシ作用　　　　
夕゛ブラ・メタｈ（Ｄａｔｕｒａ　　ａ＋ｅｔｅｌ） シ）゛目シシ　　　　心臓血管　　　　シ゛鳥゛タリス
Φフ＠恩フ″１７（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ　　ｐｕｒｐｕ
ｒｅａ）ヒ０ロカルヒ０ン　　　　コリン作用　　　　
　　ヒ″０カルフ０スφシ“ヤ本−ナンＪ−（Ｐｉｌｏ
ｃａｒｐｕｓ　　ｊａｂｏｎａｎｄｉ）鳥ニジ゛ン　　
　　　　　抗マラリ？　　　　　　１ンチ３す・１ン゛
工１１７す（Ｃｉｎｃｈｏｎａ　　ｌｅｄｇｅｒｉａｎ
ａ）哺乳類起源の非抗体・生産細胞と植物細胞を使用で
き、植物細胞はプロトプラストの形のものが好ましい、
プロトプラスト形成は当業者に周知である。

更に、ステロイドホルモンのようなタンパク以外の生物
活性物質を生産する哺乳類細胞を使用できる。植物細胞
の場合、キニン、レセルピン、コカイン、アトロビン、
スコポラミン、ジギタリス、モルヒネ様物質のようなア
ルカロイド類を生産する細胞を使用できる。

更に、ムスコン、シベトン、ゲラニオール、及び香水業
界に有用な他のテルペン様物質などの精油及び香料を生
産する細胞を使用できる。

融合相手として、モして哺乳類及び植物細胞の永続化の
ために使用される継続的に増殖する（永久的な）細胞の
例は、ハツカネズミ、ラット又はヒト起源なとの種々の
起源の骨髄腫細胞である。

永久的に成長する細胞の典型的な例は腫瘍細胞であり、
例えば骨髄腫細胞、ＨｅＬａ細胞を含めたヒトの腫瘍形
成から誘導される細胞、咽頭がんから誘導されるＨＥ　
１）−２、及び鼻−咽頭がん細胞、リンパ芽球様細胞、
エプスタイン＝バーウオルス形質転換細胞、高度増殖す
る胎児細胞、肝がん細胞、腎臓がん細胞から誘導される
ＫＢである。本発明に特に重要なものは、ねずみ及びヒ
ト骨髄腫細胞を含めた薬剤耐性骨髄腫細胞である。使用
骨髄腫細胞がいわゆる「非分泌」型であるのが一般的に
好ましいが、分泌型も使用できる。

連続成長する典型的な植物細胞は腫瘍性植物えい瘤細胞
、すなわちアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
の毒性菌株によって形質転換された植物細胞、及びその
プロトプラストである。

同様に、本発明の一般的な面が、任意の原核型又は真核
型の細胞（有用物質を生産できるもの）を、永続化細胞
が哺乳類細胞か植物細胞かによらず、任意適当な永続化
細胞と融合させることによって得られるハイブリッド細
胞の生成を包含することも意図されている。

融合細胞は、慣用の炭素、窒素及びミネラル塩類の給源
を含有する慣用的な栄養培地中で生育又は増殖する。増
殖は好気的条件下に、すなわち９５Ｘ酸素と５ｚ炭酸ガ
スとの混合物の存在下に実施される。増殖とすべての前
段階が無菌条件下に実施されることは自明である。より
多量のハイブリッド細胞は、慣用方法により、同質遺伝
子型又は無胸腺型のヌードマウスで生産できる。細胞を
腹水又は腫瘍塊の形で取入れ、慣用の細胞培養基として
増殖させることができる。より多量の所属生成物をつく
るために、このような細胞培養基を誘発できる。典型的
な例で、ランゲルハンス島細胞に由来するハイブリッド
細胞をグルコースで誘発し、インシュリンの生成量を高
めている。同様な方法で、ウロキナーゼを生産するハイ
ブリッド細胞にグリシンを添加することにより、ウロキ
ナーゼの生産を刺激できる。

それぞれ特定の青用生成物を生産できる種々のハイブリ
ッド細胞を同一培地中でつくることが本方法で容易にで
きる点は、特に重要であり本発明の新規な特徴である。

例えば（実施例１に示すように）、膵臓から得られる島
細胞（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ型細胞を含有する細胞混合物）
を永続化細胞と融合させると、ハイブリッド細胞の混合
物をつくることができ、そのあるものはグルカゴンを生
産し、あるものはソマトスタチンを生産し、また別のも
のはインシュリン等を生産する。

ハイブリッド細胞で生産される有用生成物の車離は、任
意慣用の方法で、例えばハイブリッド細胞から栄養培地
を除くことによって、また抽出、向流分配、親和性クロ
マトグラフィ、沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグ
ラフィ、ＨＰＬＣ等、及びそれらの組合わせによって実
施される。

生成物は一般に周知のもので確認されており、従ってそ
の用途も周知である。

本発明は以下の実施例に詳細に説明されている。

実施例１ 新生ハツカネズミ（生後１週間）から膵臓組織を取り出
し、１００１ベトリ皿中の無菌バンク液１０１中に集め
る。膵臓Ｍ織から結合組織や脂肪を除き、小片（ｌｘｌ
ｍｍ）に刻み、無菌食塩水で２回洗ってから、コラゲナ
ーゼとトリプシンで消化させる。膵臓組織を小さなフラ
スコ（２５ｍｌ）に移し、トリプシン（食塩水中２．５
ｚ、ギブコ社）１０１及びコラゲナーゼ（３Ｂ／ｓｌ、
シグマ社）２１を加える。３７℃で穏和な磁気かきまぜ
をしながら１５分培養し、得られる上澄み液を捨てる。

トリプシン−コラゲナーゼ処理を３回くり返し、各回に
得られる上澄み液を４℃で蓄える。１００１０１ペトリ
皿中で１６．７　ｉＭグルコースを加えたＭＥＭ培地３
０１に、遠心分離（６００ｇ）から得た細胞ペレットを
懸濁し、３７℃で９５χ酸素及び５χＣ０２下に２２時
間培養する。結合せずに浮遊している高細胞を集め、遠
心分離し、ハング液で１回洗う。こうして得られる高細
胞（６ｘｌＯ’個）を無菌の管（１５１、コーニング社
）中で、ハツカネズミ骨髄１１　（ＦＯＸ−ＮＹ）細胞
（６ｘｌＯ’個）と混合する。細胞混合物をバンク液で
遠心分離により１回洗う。得られるペレットをおだやか
に懸濁し、ＰＨＡ　Ｏ，２ｍｌ（２００μ８／１）を加
え、管を３７℃で１０分培養する。培養終了時にＰＥＧ
５０！（ν／ｖ）液（平均分子量１０００）０．８　ｍ
ｌを管に加えると、４０１　ＰＥＧ（７）最終濃度が得
られる。３７℃で１分間培養後、ＭＥＭ培地１０１を管
に加え、３７℃で１時間培養する。細胞を遠心分離（６
００ｇ）で洗い、）ＩＡＴ培地２０１に懸濁し、９６大
のプレート（コーニング社）に穴（ｗｅｌｌ）当たり０
．２１を分配する。プレートを３７℃のＣＯ２培養器中
で培養する。１週間後に培地を変え、２週の終わりに穴
を放射線免疫検定（ＲＩＡ）で検査してインシュリンが
あるかどうかを見る。ｌｌｌ性の穴（ｗｅｌｌ）からの
細胞を二次培養し、保存する。この手順は４８時間の培
養後、８０−２００マイクロ単位のインシュリンを生産
する２４個の陽性穴を生ずる。

この同じ実験で、ソマトスタチンとグルカゴンについて
も放射線免疫検定（ＲＩＡ）手法で穴を検定した。陽性
穴からの細胞の二次培養と保存は、４８時間の培養後、
グルカゴン３００−４０Ｏｆ−モル／１を生産するハイ
ブリッド細胞を含有する穴２１個が本実施例で得られた
こと、及び４８時間の培養後にソマトスタチン約１００
−５０Ｏｆ−モル／１を生産するハイブリッド細胞を含
有する３穴が得られたことを示した。

実施例２ コリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅ−ｒｉｕＩｌｐａｒｖｕｍ）で処理したハツカネズミ
から得られた活性化腹膜大食細胞を、実施例１の手順に
従ってハツカネズミの骨髄１１ｍ１胞と融合させる。得
られるハイブリッド細胞を、インターロイキン−１、タ
ーフェロン陽性穴６個を生じた。生産されたγインター
フェロンは１当たり約１００−３００単位であった。

実施例３ ハツカネズミのひ臓から得られるＴリンパ球を混合リン
パ球反応によって活性化し、次いで実施例１に記載のと
おりに融合させる。得られるハイ゛実施例４ 下垂体からの細胞を実施例１に記載のとおりに融合させ
、得られるハイブリッド細胞を成長ホルムつ°リー″−
づ？ モン及びプロラクチン利用ホルモンについてｌｌ−する
。

実施例５ 植物えい８！瘍（タバコ苗でアグロバクテリウム・ツメ
ファシェンス毒性菌株によって誘発したもの）からのプ
ロトプラストを、実施例１の手順により、ラウウォルフ
ィア・サーベンチナから得られるプロトプラストと融合
させ、急激に分裂するハイブリッド細胞を確立された手
順によって抽出すると、レセルピンが得られる。

実施例６ タバコ苗の植物えい瘤ｌ１１１］Ｉからのプロトプラス
トを、実施例１の手順により、ジギタリス・ブルブレア
から得られるプロトプラストと融合させ、こうして得ら
れるハイブリッド細胞を抽出するとジギタリス・グリコ
シド混合物が得られる。

実施例７ タバコ苗の植物えい瘤腫瘍のプロトプラストを、実施例
１の手順により、アトロバ・ベラドンナから得られるプ
ロトプラストと融合させ、こうして得られるハイブリッ
ド細胞を抽出すると、アトロピンが得られる。

出願人　メレル　ダウ　フ７−マスーティカルズインコ
ーボレーテッド ＋−”−”　−：。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非抗体・生産哺乳類細胞と連続的に増殖できる哺乳
   類細胞、又は植物細胞と連続的に増殖できる植物細胞の
   融合によって得られ、その融合は、初めに凝集を起こし
   、次に凝集細胞の融合を行なうことによつて促進された
   ものである、有用な生成物を生産できる融合ハイブリッ
   ド細胞。 ２、非抗体・生産哺乳類細胞と連続的に増殖できる哺乳
   類細胞との融合によって得られ、その融合は、初めに凝
   集を起こし、次に凝集細胞の融合を行なうことによって
   促進されたものである、有用な生成物を生産できる特許
   請求の範囲第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ３、植物細胞と連続的に増殖できる植物細胞との融合に
   よって得られ、その融合は、初めに凝集を起こし、次に
   凝集細胞の融合を行なうことによって促進されたもので
   ある、有用な生成物を生産できる特許請求の範囲第１項
   に記載の融合ハイブリッド細胞。 ４、ランゲルハンス島細胞と骨髄腫細胞との融合生成物
   である、インシュリンを生産できる特許請求の範囲第１
   項の融合ハイブリッド細胞。 ５、ランゲルハンス島細胞と骨髄腫細胞との融合生成物
   である、グルカゴンを生産できる特許請求の範囲第１項
   に記載の融合ハイブリッド細胞。 ６、ランゲルハンス島細胞と骨髄腫細胞との融合生成物
   である、ソマトスタチンを生産できる特許請求の範囲第
   １項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ７、下垂体前葉細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である
   、ＡＣＴＨを生産できる特許請求の範囲第１項に記載の
   融合ハイブリッド細胞。 ８、下垂体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、黄
   体形成ホルモンを生産できる特許請求の範囲第１項に記
   載の融合ハイブリッド細胞。 ９、下垂体細胞と骨髄腫細胞との触合生成物である、卵
   胞刺激ホルモンを生産できる特許請求の範囲第１項に記
   載の融合ハイブリッド細胞。 １０、下垂体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   成長ホルモンを生産できる特許請求の範囲第１項に記載
   の融合ハイブリッド細胞。 １１、下垂体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   ＬＨ−ＲＨを生産できる特許請求の範囲第１項に記載の
   融合ハイブリッド細胞。 １２、下垂体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   プロラクチンを生産できる特許請求の範囲第１項に記載
   の融合ハイブリッド細胞。 １３、下垂体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   チロトロピン（ＴＳＨ）を生産できる特許請求の範囲第
   １項に記載の融合ハイブリッド細胞。 １４、胸腺細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、胸
   腺ホルモンを生産できる特許請求の範囲第１項に記載の
   融合ハイブリッド細胞。 １５、腎細胞と骨髄腫細胞との融合生成物であるエリス
   ロボイエチンを生産できる、特許請求の範囲第１項に記
   載の融合ハイブリッド細胞。 １６、顎下腺細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   表皮成長因子を生産できる特許請求の範囲第１項に記載
   の融合ハイブリッド細胞。 １７、下垂体後葉細胞と骨髄腫細胞との融合生成物であ
   る、オキシトシンを生産できる特許請求の範囲第１項に
   記載の融合ハイブリッド細胞。 １８、下垂体後葉細胞と骨髄腫細胞との融合生成物であ
   る、バソプレッシンを生産できる特許請求の範囲第１項
   に記載の融合ハイブリッド細胞。 １９、副腎クロム親和性細胞と骨髄腫細胞との融合生成
   物である、エンケフアリンを生産できる特許請求の範囲
   第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ２０、心臓細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、ア
   トリオール・ニュートリバイト因子（ＡＮＦ）を生産で
   きる特許請求の範囲第１項に記載の融合ハイブリッド細
   胞。 ２１、脳又は下垂体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物で
   ある、エンドルフィンを生産できる特許請求の範囲第１
   項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ２２、顆粒膜細胞（卵巣）と骨髄腫細胞との融合生成物
   である、インヒビンを生産できる特許請求の範囲第１項
   に記載の融合ハイブリッド細胞。 ２３、甲状腺細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   カルシトニンを生産できる特許請求の範囲第１項に記載
   の融合ハイブリッド細胞。 ２４、傍甲状腺細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である
   、傍甲状腺（上皮小体）ホルモンを生産できる特許請求
   の範囲第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ２５、大食細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、イ
   ンターロイキン−１を生産できる特許請求の範囲１項に
   記載の融合ハイブリッド細胞。 ２６、Ｔヘルパー細胞と骨髄腫細胞との融合生成物であ
   る、インターロイキン−２を生産できる特許請求の範囲
   第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ２７、Ｔヘルパー細胞と骨髄腫細胞との融合生成物であ
   る、インターロイキン−３を生産できる特許請求の範囲
   第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ２８、白血球と骨髄腫細胞との融合生成物である、α−
   インターフェロンを生産できる特許請求の範囲第１項に
   記載の融合ハイブリッド細胞。 ２９、Ｙ細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、コロ
   ニー刺激因子（ＣＳＦ）−２を生産できる特許請求の範
   囲第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ３０、線維芽細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   ＣＳＦ−１を生産できる特許請求の範囲第１項に記載の
   融合ハイブリッド細胞。 ３１、Ｔヘルパー細胞と骨髄腫細胞との融合生成物であ
   る、Ｂ細胞成長因子を生産できる特許請求の範囲第１項
   に記載の融合ハイブリッド細胞。 ３２、大食細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、腫
   瘍壊死因子を生産できる特許請求の範囲第１項に記載の
   融合ハイブリッド細胞。 ３３、大食細胞又はＴヘルパー細胞と骨髄腫細胞との融
   合生成物である、γ−インターフェロンを生産できる特
   許請求の範囲第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ３４、線維芽細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   β−インターフェロンを生産できる特許請求の範囲第１
   項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ３５、大食細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、大
   食細胞活性化因子を生産できる特許請求の範囲第１項に
   記載の融合ハイブリッド細胞。 ３６、がん細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、ア
   ンジオゲニンを生産できる特許請求の範囲第１項に記載
   の融合ハイブリッド細胞。 ３７、副腎皮質細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である
   、ステロイド類を生産できる特許請求の範囲第１項に記
   載の融合ハイブリッド細胞。 ３８、唾液腺細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   神経成長因子を生産できる特許請求の範囲第１項に記載
   の融合ハイブリッド細胞。 ３９、エンドチン血小板と骨髄腫細胞との融合生成物で
   ある、血小板に由来する成長因子（ＧＦ）を生産できる
   特許請求の範囲第１項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ４０、松果体細胞と骨髄腫細胞との融合生成物である、
   ＭＳＨ及びメラトニンを生産できる特許請求の範囲第１
   項に記載の融合ハイブリッド細胞。 ４１、非抗体・生産哺乳類細胞と、連続的に増殖できる
   哺乳類細胞とを、又は有用な生成物を生産できる植物細
   胞及び連続的に増殖できる植物細胞とを、融合条件及び
   選択的条件下に融合させることによってハイブリッド細
   胞をつくる方法であつて、融合させようとする細胞混合
   物を有効量の凝集原と接触させてから、凝集細胞の融合
   を行なわせることからなる方法。 ４２、非抗体・生産哺乳類細胞と、連続的に増殖できる
   哺乳類細胞とを、融合条件及び選択的条件下に融合させ
   ることによってハイブリッド細胞をつくる方法であって
   、融合させようとする細胞混合物を有効量の凝集原と接
   触させてから、凝集細胞の融合を行なわせることからな
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４３、有用な生成物を生産できる植物細胞及び連続的に
   増殖できる植物細胞を有効量の凝集原と接触させてから
   、凝集細胞の融合を行なわせることからなる、特許請求
   の範囲第１項に記載の融合ハイブリッド細胞の製法。 ４４、凝集原がフィトヘマグルチニンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第４２項又は第４３項に記載の方
   法。 ４５、融合が化学的融合によって行なわれる、特許請求
   の範囲第４２項又は第４３項に記載の方法。 ４６、融合が電気的融合によって行なわれる、特許請求
   の範囲第４２項又は第４３項に記載の方法。 ４７、融合原が約１０００ないし約４０００の平均分子
   量をもつＰＥＧであることを特徴とする、特許請求の範
   囲第４５項に記載の方法。 ４８、連続的に増殖できる植物細胞が腫瘍性の植物えい
   （■）瘤細胞であることを特徴とする、特許請求の範囲
   第４３項に記載の方法。 ４９、連続的に増殖する細胞が骨髄腫である、特許請求
   の範囲第４２項に記載の方法。 ５０、特許請求の範囲第１項又は第２項のハイブリッド
   細胞によつてつくられる有用な生成物。