PT85151B - Celulas hibridas e processo para a sua preparacao - Google Patents

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Description

A fusão de células de mieloma de rsto com células de baço } de ratos imunizados realizada por Kohler e Milstein em 1975 (“Nature; 256$ 1975» pég. ^95-^97)? demonstrou, pela primeira vez, que era possível a obtenção de uma linha de células contínua tornada homogénea (chamada '‘monoclonal) e utilizou-se os anticor pos elaborados por estes hibridomas para diversos fins de diagnóg. tico e de investigação científica em medicina.
processo para a preparação de., hibridomas, de um modo geral, compreende as seguintes fases:
a) imunização, por exemplo, de ratos ou murganhos por meio de um agente imunogénico. 0 protocolo de imunização deve ser fei to de modo a propocionar a obtenção de quantidades apreciáveis de esplenócitos preparados;
b) remoção dos baços dos animais imunizados e preparação de uma suspensão do baço em um meio apropriado;
c) fusão da suspensão de células de baço com células de mieloma provenientes de uma linha de células adequada, na presença de um agente de fusão apropriado;
agente promotor de fusão pode ser um virus Sendai , um agente de fusão químico, por exemplo, polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular médio compreendido entre cerca de 1000 e cerca (
de *+000 (comercializado com o nome de PEG 1000, etc).
Uma outra técnica que é útil para realizar a fusão, é a electro-fusão, de acordo com métodos conhecidos tais como os utilizados por Zimmermann e Scheurich, Planta; 1?1; 1981; pag. 26-32; Vienken et al.; Planta; 175; 1983; pag. 331 e ^Tacob et al.; Sbud. Biophys; 9^; 1983; pag. 99.
A linha de células de mieloma utilizada deve ser, de preferencia, do tipo chamado resistente a fármacos, de tal forma I que as células de mieloma não fundidas não possam sobreviver em um meio selectivo, enquanto as células híbridas sobrevivem.
A classe mais usual é a linha de células resistentes à 8-azaquanina, que não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforibasil-transferase ê, por isso, não podem ser mantidas em meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina);
d) diluição e cultura em recipientes separados da mistura de células de baço não fundidas, células de mieloma não fundidas e células fundidas, no meio selectivo, que não pode manter as cé) lulas de mieloma não fundidas por tempo suficiente, para permitir a morte das células não fundidas (cerca de tuna semana).
A diluição pode ser do tipo que limite na qual o volume de diluente é calculado estatisticamente, para isolar um certo número de células (e. g., cada cavidade de uma placa microtituladora). No meio selectivo as células de mieloma não fundidas perecem.
Una vez que as células de baço não fundidas não são malignas, têm apenas um número finito de gerações. Portanto, após um certo período de tempo, (cercs de uma semana), essas células de baço não fundidas não conseguem reproduzir-se.
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Por outro lado, as células fundidas continuam a reproduzir-se porque possuem uma qualidade de malignidade relacionada com o mieloma e a capacidade para sobreviverem no meio selectivo das células de baço originais;
e) avaliação da fase sobrenadante de cada cavidade que con tém um hibridoma no que respeita à presença de anticorpos dirigidos contra o antigénio originalmente utilizado.
f) selecção (por exemplo, par meio de diluição) e clonagem de hibriaomas que produzem o anticorpo procurado.
Uma vez que o hibridoma procurado foi seleccionado e clonado, podem obter-se os anticorpos por uma de duas vias.
anticorpo monoclonal mais puro obtém-se in vitro por meio de cultura do hibridoma desejado, em um meio apropriado durante um período de tempo suficiente seguida da recuperação do anticorpo desejado a partir da fase sobrenadante.
meio e o tempo de cultura adequados ou são conhecidos ou facilmente determinados.
Esta técnica in vitro produz essencialmente anticorpos monoclonais monoespecíficos, essencialmente isentos de outras imunoglobulinas anti-humanas específicas.
Verifica-se a presença de uma pequena quantidade de outra imunoglobulina, uma vez que o meio contém soro xenogeno (por exemplo, soro fetal de vitela). Contudo, este método in vitro pode não produzir uma quantidade suficiente ou uma concentração suficiente de anticorpos para vários fins, uma vez que a concentração de enticorpo monoclonal é apenas de cerca de
Para a produção de uma concentração muito maior de anti
corpo monoclonal ligeiramente impuro, o hibridoma desejado pode ser injectado em ratos de preferência singénicos ou semi-singénicos.
hibridoma provocará a formação de tumores, após um te& po de incubação apropriado, o que resultará numa elevada concentração dos anticorpos desejados (cerca de 5 a 20 mg/ml) na corren te sanguínea e no exsudado peritoneal (ascite)) do rato hospedeiro.
Este método está exaustivamente descrito na literatura mas possui aspectos particulares e sérios inconvenientes.
PEG tem ganho uma crescente aceitação como agente de fusão porque existe disponível sob uma forma pura, numa escala de pesos moleculares convenientes e porque a sua manipulação é fácil comparada com a do virus . Sendai . No entanto, a escala de concentração para que o PEG seja efectivo é muito estreita. A con centração óptima é de 5θ ± 5 % peso/volume. A esta concentração o PEG exibe um efeito citotóxico significativo contra todas as células a serem fundidas e contra as células híbridas fundidas.
Por outro lado, quando se utiliza o PEG em uma concentração abaixo do valor óptimo, este exibe apenas uma citotoxidade moderada, mas eficiência de fusão e, consequentemente a formação de hibridoma é reduzida.
Em contrapartida com o vírus Sendai , os agentes de fusão químicos conhecidos, como o polietilenoglicol (PEG) e a electro-fusão não efectuam a aglutinação das células destinadas à fusão e, portanto, as membranas celulares não se aproximam tanto quanto o necessário para que se efectue uma fusão eficiente.
Deste modo, um objectivo da presente invenção é fornecer
novas células híbridas fundidas, capazes de produzizirem um produto útil.
Um outro objectivo da presente invenção é desenvolver um processo para a purificação de células híbridas por meio de fusão de uma célula de mamífero ou planta capaz de produzir um produto útil que não constitua um anticorpo, por exemplo, células dos ilhéus de Langerhans que, devido à fusão com um parceiro adequa do são capazes de se propagar de um modo contínuo.
Uma outra finalidade da presente invenção consiste em reduzir o efeito citotéxico de agentes de fusão químicos convencionais, tais como, o PEG , lisolecitinadextrano, dimetilsulfóxido, álcool polivinílico, poliornitina-L e sais conhecidos utilizáveis tais como o nitrato de sódio ou uma combinação destes ageii tes.
No processo de fusão isto resulta em um rendimento mais elevado das células híbridas desejadas.
Um outro objectivo consiste na produção de células aglutinadas destinadas a serem fundidas por meio de técnicas de elec tro-fusão.
Estes e outros objectivos tornar-se-ão claros através da descrição seguinte.
A presente invenção, no seu conceito genérico descreve uma célula híbrida capaz de produzir um produto útil, por meio de fusão de uma célula de mamífero produtora de um produto, que não constitui um anticorpo, com uma célula de mamífero capaz de se propagar continuamente, tendo sido a referida fusão facilitada por uma primeira aglutinação seguida da fusão das células aglutinadas.
Noutro aspecto da presente invenção descreve-se, generica mente, a aglutinação e a fusão de células de plantas para produzir células híbridas capazes de produzirem produtos úteis. A pre sente invenção descreve também um método para a preparação de uma célula híbrida por meio de fusão de uma célula de mamífero produtora de um produto que não constitui um anticorpo, capaz de produ zir um produto útil, com uma. célula de mamífero capaz de se propa gar continuamente, em condições selectivas e que consiste em fazer contactar uma mistura de células destinadas a fundirem-se, com uma quantidade efectiva de um agente aglutinogénio e, seguidamente, submeter as células aglutinadas, à fusão.
Um outro aspecto da presente invenção, refere-se à agluti nação e fusão de células de plantas para se obterem células híbri das capazes de produzirem produtos úteis.
Portanto, a presente invenção também se refere a um método para a preparação de uma célula híbrida fundida, que consiste em se fazer contactar uma célula de uma planta capaz de produzir um produto útil com uma célula de uma planta capaz de se reproduzir inlnterruptamente, com uma quantidade efectiva de um agente aglutinante e submeter, em seguida, as células aglutinadas à fusão.
Um outro aspecto da presente invenção consiste na fusão de protoplastos de células de plantas cppazes de produzirem produtos úteis, com protoplastos de células capazes de propagação contínua (por exemplo células de tumores do vértice da vesícula), por meio de técnicas de fusão conhecidas, com ou sem o benefício de uma aglutinação prévia concomitante destas células aptas para produzirem um produto útil desejado.
Um agente aglutinante (aglutinogénio”) é uma designação utilizada para referii qualquer agente capaz de aglutinar células destinadas a fundirem-se. Embora todos os aglutinogénios típicos estejam abrangidos : fitohemaglutinina (ΡΗΛ), concanavalina A e aglutinina de amendoim, o aglutinogénio preferido, de acordo com a presente invenção, é a fitohemaglutinina (PHA).
A concentração do agente aglutinante deve ser de tal for ma ajustada que o efeito citotóxico não se observa e que a aglutinação ocorra num grau significativo.
Uma escala adequada de aglutinogénio PHA situa-se entre
A concentração apropriada de outros aglutinogénios pode ser determinada facilmente por meio de técnicas padrão bem conhe cidas pelos especialistas na matéria.
tratamento de aglutinação realiza-se a temperaturas fisiológicas, por exemplo, à temperatura de 37° C e durante o tempo suficiente, por exemplo, entre 5 a 15 minutos, submetendo-se as células a fusão após ter ocorrido uma aglutinação suficiente.
Em um outro aspecto, um agente de fusão químico convencional, de preferêrcia o PEG , adiciona-se e incuba-se na mistu ra em condições fisiológicas para que a fusão das células agluti nadas se realize.
Quando se utiliza polietilenoglicol (PEG)aconcentração deve estar compreendida entre cerca de 30 a b-O % em peso/volume.
A concentração preferida é de ce^c? de ^0 + 5 / peso/volume.
tempo de fusão óptimo é de cerca de 1 minuto. Tempos
mais prolongados podem utilizar-se mas existe o risco de aumentar a citotoxicidade com o tempo, especialmente acima de 2 minutos.
Noutros casos a fusão das células aglutinadas é realizada por meio de electro-fusao.
Esta nova técnica de fusão da presente invenção, implica um aumento significativo da formação de células híbridas viáveis comparativamente aos resultados obtidos anteriormente por meio de outras técnicas.
A designação produto útil” aorange todos os produtos que numa célula de niamífero ou uma célula de planta a ser fundida, podem produzir. São exemplos típicos as proteínas biologicamente activas, glicoproteínas, polipéptidos, enzimas e compostos não proteicos, tais como alcaloides, esteroides, diosgenina, antraquinonas, piretrinas, óleos essenciais, polissacáridos, gli cósidos cardiotónicos, componentes de perfumes e de cosméticos.
Exemplos de substâncias biologicamente activas, que podem ser produzidas por células a serem fundidas, estão representados nos quadros I até V.
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Quadro II (Continuação)
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Quadro IV
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Podem utilizar-se células eucarióticas de mamífero ou de origem vegetal; as células de plantas têm, de preferência, a forma de protoplastos. A formsção dos protoplastos é perfeitamente conhecida pelos especialistas.
Além disso, podem utilizar-se células que produzem subs tâncias biologicamente activas para slém das proteínas, tal como hormonas esteroides. No caso de células de plantas, podem-se utilizar células que produzem alcaloides, como quinina, reserpiI na, cocaína, atropina, escopolamina, digitalina e substâncias aparentadas com a morfina.
Podem também utilizar-se células que produzem óleos essenciais e aromas, como muscona, civetona, geraniol e outras subs tâncias aparentadas com terpenos utilizáveis na indústria de per fumes.
Exemplos de células de propagação contínua (permanente utilizáveis como agentes de fusão e para a imortalização de células de mamíferos e de plantas, são as células de mieloma de origem diversa tal como células de murganho, de rato ou de origem humana.
Exemplos típicos de células de desenvolvimento permanen te são as células tumorais, como as células de mieloma, células derivadas de neoplasia humana, como as células Hela, as células HE p-2 derivadas de células de cancro da faringe e células KB derivadas de cancro da rino-faringe, linfoblastoides, células transformadas de vírus Epostein-Barr, células de embrião que se propagam de forma intensa, células de hepatoma e células de carcinoma renal.
Sao de especial importância para a presente invenção, as '7.
células de mieloma fármaeo-resistentes, incluindo células de mieloma murinas e humanas.
De um modo geral, também são preferidas as células de mieloma que se utilizam sob a designação do tipo ”não-secretoras” ainda que se possam utilizar células de tipos secretores.
Nameliiente, as células de plantas de desenvolvimento contínuo, são as células tumo rosas de cicídio em forma de coroa, isto é, células de plantas transformadas por uma estirpe virulen ta de Agrobacterium tumefaciens e seus protoplastos.
De um modo similar, a presente invenção também abrange, genericamente, a formação de células híbridas obtidas por meio de fusão de células do tipo procariótico ou eueariótico (capazes de produzirem um produto útil) com qualquer célula imortal apropriada quer esta seja uma célula imortal de um mamífero quer seja de uma planta.
As células fundidas desenvolvem-se ou propagam-se em meios nutrientes convencionais que contêm as fontes habituais de carbono, azoto e sais minerais. A propagação realiza-se geralmente em condições aeróbicas, isto é, na presença de uma mistura de 95 % de oxigénio com 5 % de dióxido de carbono.
tí evidente que a reprodução e todas as fases precedentes se realizam sob condições estéreis.
Podem obter-se quantidades maiores de células híbridas por meio de um murganho singénico ou stimico nú, de acordo com métodos convencionais. Tais células podem proliferar sob a for ma de ascite ou de tumores sólidos e reproduzirem-se em culturas celulares convencionais.
Estas culturas de células podem ser induzidas a produzir
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Iftn exemplo típico consiste na indução de células híbridas derivadas das células dos ilhéus de Langerhans, por meio de glicose, para produzirem maiores quantidades de insulina.
De um modo análogo, pode estimular-se a produção de uro quinase mediante a adição de glicina a células híbridas produto ras de uroquinase.
É particularmente importante um novo aspecto da presente ) invenção que consiste num processo que facilita a produção de uma variedade de células híbridas, cada uma das quais é capaz de produzir, no mesmo meio, um produto correspondente útil. Por exemplo, (como se descreve no exemplo 1) a fusão de células, obtidas a partir dos ilhéus do pâncreas (a referida mistura contendo células do tipo A, B, G e D) com uma célula imortal, capaz de produzir uma mistura de células híbridas, algumas das quais produzem glucagom, outras produzem somatostatina, outras produzem insulina, etc.
. Realiza-se o isolamento do produto útil produzido pelas células híbridas por meios convencionais, por exemplo, retirando o meio nutriente das células híbridas ou por meio de extracção, distribuição em contra-corrente, cromatografia de afinidade, precipitação, filtração por gel, cromatografia de permuta iónica, CLEP, etc.ou uma associação destes métodos.
Os produtos são, em geral, bem conhecidos e identificados, assim como a sua utilização.
A presente invenção fica explicitada detalhadamente atra vés dos exemplos seguintes.
Exem-
Exemplo 1
Removeu-se tecido pancreático de murganhos recem-nascidos (de uma semana) e recolheu-se em 10 ml de uma solução estéril de Hank numa placa de petri de 100 mm. 0 tecido do pâncreas estava isento de tecido conjuntivo e gordura e dividiu-se em pequenas porções(lxl mm), lavou-se duas vezes com uma solução salina estéril antes de ser submetido a digestão com colagenase e tripsina.
Transferiu-se o tecido pancreético para um pequeno recipiente de 25 ml e adicionou-se 10 ml de tripsina (em solução de cloreto de sódio a 2,5 %> da Gibco) e 2 ml de colagenase ( 3 mg/ /ínl, Sigma). Incubou-se durante 15 minutos, sob agitação magnéti ca cuidadosa à temperatura de 37°C e separou-se a fracção sobrenadante obtida deste modo.
Repetiu-se o tratamento com colagénio e tripsina 3 vezes e guardou-se as fracções sobrenadantes obtidas de cada vez, à temperatura de 4°C. Fez-se uma suspensão das células obtidas por centrifugação (600 g) em 30 ml de meio MEM com 16,7 mM de glucose em uma placa de 100 mm e incubou-se à temperatura de 37°U com 95 % de oxigénio e 5 % de anidrido carbónico durante 22 horas.
Recolheram-se as células flutuantes dos ilhéus não ligados, centrifugaram-se e lavaram-se com solução de Hanks.
Misturaram-se as células dos ilhéus obtidas deste modo (6 x 10? células) com células, de mieloma de murganho (ΒΌΧ-ΝΥ) (6 x 10 ) em um tubo estéril (15 ml Corning). Lavou-se a mistu ra de células, uma vez, com solução de Hank por centrifugação.
Fez-se uma suspensão da massa obtida cuidadosamente e adlcionou-se 0,2 ml de PHA (20^ig/nl e incubou-se o tubo durante 10 minutos à temperatura de 37°C.
No fim da incubação adicionou-se 0,8 ml de PEG , no tubo, a 50 % p/v (média do peso molecular 1000) de solução, para se obter uma concentração final de PEtr de 4o Após 1 minuto de incubação a 37°C> adicionou-se 10 ml de meio MEM e incubou-se durante 1 hora ã temperatura de 37°C.
| Lavaram-se as células por centrifugação (600 g) e suspenderam-se em 20 ml de meio HAT e distribuíram-se 0,2 ml/cavidade em placas de 96 cavidades (Coming). Incubaram-se as placas
Λ à temperatura de 37 C em um incubador com dióxido de carbono.
Mudou-se o meio após uma semana e após duas semanas, ensaiaram-se as cavidades para detectar a presença de insulina por radioimuno-análise (RIA). As cavidades positivas destinaram-se a. sub-cultura e b. manutenção das células.
Este processo permitiu que 24 cavidades positivas produ| zissem entre 80 e 200 microunidades de insulina após 48 horas de cultura.
Nesta experiência as cavidades também foram analisadas para detectar a presença de somatostatina e glucagom por meio de técnicas de radioimuno-análise (RIA).
A sub-cultura e a manutenção das células provenientes das cavidades positivas mostraram que 21 cavidades continham células híbridas que produziam entre 3θθ ® 400 f-moles/ínl de glucagem, após 48 horas de cultura preparada por meio deste exemplo e 3 cavidades continham células híbridas que produziram aproximadamente entre 100 e 500 f-moles/ml de somatostanina após 48 ho
ras de cultura.
Exemplo 2
Fez-se a fusão de macrófagos peritoneais activados, obtidos a partir de murganhos tratados com Corynebacterium parvum, com células de mieloma de murganho, de acordo com o método descrito no exemplo 1. As células híbridas obtidos foram sondadas jsõa in terleucina-Ij ^-interferon, factor de necrose de tumor e factor de activação de macrófagos, produzindo, aproximadamente 100-300 unidades por ml dejf-interferon.
Exemplo 3
Activaram-se linfócitos-T obtidos a partir do baço de murganho, por meio de mistura com linfócitos reactivos e fundiram-se de acordo com o método descrito no exemplo 1.
As células híbridas obtidas foram sondadas para interleucina-2, interleucina-3 e factor de crescimento de células B.
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Exemplo ΛFundiram-se células provenientes da glândula pituitária de acordo com o método descrito no exemplo 1, para se obterem células híbridas que se sondaram para hormonas do crescimento e para prolactina.
Exemplo 5
Fundiram-se protoplastos de tumores crowngall” (induzidos por uma estirpe virulenta de Agrobacterium tumefaciens da
planta do tabaco) com protoplastos obtidos da Rauwolfia serpenti. na de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.
As células híbridas, que se dividiam rapidamente, foram extraídas por meio de métodos habituais para se obter reserpina.
Exemplo 6
Fundiram-se protoplastos de tumores crown gall“ da plan ta do tabaco com protoplastos obtidos d? digitalis purpurea, de acordo com o procedimento descrito no exemplo 1 e extrairam-se as células híbridas obtidas deste modo, para se ooter uma mis tura de glicosidos digitálicos,
Exemplo 7
Fundiram-se protoplastos de tumores crown gall” da planta do tabaco com protoplastos obtidos a partir de Atropa belladonna, de acordo com o processo descrito no exemplo 1.
As células híbridas obtidas deste modo, foram extraídas para se obter atropina.

Claims (47)

  1. Reivindicações
    1. - Célula híbrida fundida capaz de produzir um produto útil, caracterizada pelo facto de ser obtida mediante fusão de uma célula de mamífero produtora de um nao-anticorpo com uma célula de mamífero capaz de se reproduzir continuamente, sendo a referida fusão favorecida por uma aglutinação prévia e de, em seguida, se realizar a fusão das células aglutinadas.
  2. 2. - Célula híbrida fundida capaz de produzir um produto útil, caracterizada pelo facto de se obter mediante fusão de uma célula de planta com uma célula de uma planta capaz de se reproduzir continuamente, de se favorecer a referida fusão por meio de aglutinação prévia e de se realizar, em seguida, a fusão das células aglutinadas.
  3. 3. - Método para a preparação de uma célula híbrida caracterizado pelo facto de se fundir uma célula de mamífero produtora de um não-anticorpo com uma célula de mamífero capaz de se reproduzir continuamente, sob condições de fusão e de, sob certas condições selectivas, se fazer contactar a mistura das células a serem fundidas com uma quantidade efectiva de um agente de aglutinação e de se efectuar, por consequência, a fusão das células aglutinadas.
  4. 4. - Método para a preparação de uma célula híbrida fundida, caracterizado pelo facto de se fazer contactar uma célula de planta, capaz de produzir um produto útil, com uma célula de planta capaz de se reproduzir continuamente, com uma quantidade efectiva de um agente de aglutinação e de se efectuar, consequentemente, a fusão das células aglutinadas.
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  5. 5. - Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo facto de o agente de aglutinação ser a fitohemaglutinina.
  6. 6. - Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo facto de se efectuar a fusão mediante fusão-química.
  7. 7. - Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo facto de se efectuar a fusão mediante electro-fusão.
  8. 8. - Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de ser o polietilenoglicol (PEG) o agente de fusão, que possui um peso molecular compreendido entre cerca de 1000 e cerca de 4000.
  9. 9. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a célula capaz de se reproduzir continuamente ser uma célula tumurosa de cecídio em .forma de coroa (crown gall) .
  10. 10. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a célula de reprodução contínua ser uma célula de mieloma.
  11. 11. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindica ção 1, earacterizada pelo facto de ser um produto obtido mediante fusão de uma célula de um ilhéu de pâncreas com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir insulina.
  12. 12. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, earacterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de um ilhéu de pâncreas com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir glucagon.
  13. 13. - Célula híbrida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de um ilhéu de pâncreas com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir somatostatina.
  14. 14. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula da pituitária anterior com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir ACTH.
  15. 15. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir hormona luteinizante (gonadotrofina B).
  16. 16. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir a hormona que estimula os folículos (gonadotrofina A).
  17. 17. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir hormona de crescimento.
  18. 18. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária e uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir LH-RH (Lutenizing Hormone-Releasing Hormone).
  19. 19. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser um produto de fusão de uma célula de pituitária e uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir prolactina.
  20. 20. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir tirotropina (ISH).
  21. 21. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula do timo com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir hormonas tímicas.
  22. 22. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de rim com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir eritropoietina.
  23. 23. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de glândula sub-maxilar com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor de crescimento epidérmico.
  24. 24. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária posterior com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir ocitocina.
  25. 25. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindi cação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de pituitária posterior com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir vasopressina.
  26. 26. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula cromafina de supra-renal com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir encefalina.
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  27. 27. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de coração com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir o factor nutritivo atriol.
  28. 28. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de cérebro ou de glândula pituitária com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir endorfinas.
  29. 29. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula granulosa (ovãrica) com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir inibina.
  30. 30. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindi cação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de tiroide com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir calcitonina.
  31. 31. - Célula.híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de paratiroide com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir hormona da paratiroide.
  32. 32. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de macrõfago com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir interleuquina-1.
  33. 33. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindi cação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula T auxiliar com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir interleuquina-2.
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  34. 34. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula T auxiliar com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir interleuquina-3.
  35. 35. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindica ção 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de leucócitos com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir
    -interferon.
  36. 36. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindi cação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula T com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor 2 de estimulação de colónias.
  37. 37. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindica ção 1, caracterizada pelo facto de ser' um produto de fusão de um fibróblasto com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir CSF-1.
  38. 38. - Célula híbrida.fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula T auxiliar com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor de crescimento de células B.
  39. 39. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de macrófago com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor anti-tumoral.
  40. 40. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de macrófago ou célula auxiliar T com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir -interferon.
    (.__,χ' / *
  41. 41. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de um fibroblasto com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir -interferon.
  42. 42. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula de macrõfago com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor de activação de macrõfagos.
  43. 43. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de células de carcinoma com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir angiogenina.
  44. 44. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de uma célula.do córtex supra-renal com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir esteroides.
  45. 45. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de células de glândula salivar com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor de crescimento do nervo.
  46. 46. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de plaquetas endotina e uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir factor de crescimento (GF) derivado de plaquetas.
  47. 47. - Célula híbrida fundida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de ser um produto de fusão de um pinealcito (célula da epífise ou glândula pineal) com uma célula de mieloma e de ser capaz de produzir hormona estimulante de melanóforos (MSH) e melatonina.
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