CN107372463A

CN107372463A - 杂交瘤细胞冻存保种的新方法

Info

Publication number: CN107372463A
Application number: CN201710654654.XA
Authority: CN
Inventors: 牛晓旭; 李桂林; 张文婧; 赵巧辉; 付光宇; 吴学炜
Original assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Immuno Biotech Co Ltd
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞冻存保种的新方法，将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养至对数生长期，然后进行收集离心，弃上清，保留杂交瘤细胞沉淀；取冻存液对杂交瘤细胞进行细胞重悬并计数，用冻存液将杂交瘤细胞密度调控至2‑5×10⁶个/ml；按1ml/管分装至冻存管内，密封后竖立放置在百孔盒内，立即放入4℃层析柜中，计时1小时；然后将其转放至‑20℃冰柜中，计时1‑2小时；继续将其转放至‑80℃冷柜中，计时12‑24小时；最后将其放置在液氮液面10cm以下，长期保存待用。本发明的优点在于流程简单，操作便捷，安全性高，整个流程所用工时一天内可顺利完成，保证了杂交瘤细胞虽暂时脱离生长状态但能将其杂交瘤细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏杂交瘤细胞用于实验。

Description

杂交瘤细胞冻存保种的新方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备，尤其是涉及一种复苏后细胞成活率较高的杂交瘤细胞冻存保种的新方法。

背景技术

1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术，将小鼠骨髓瘤细胞与产生绵羊红细胞的小鼠脾细胞融合，形成的杂交瘤细胞既能产生抗体又能进行分裂繁殖，且产生的抗体只能识别一种抗原决定簇，称为单克隆抗体。目前单抗主要应用于疾病的预防、诊断和治疗，生物物质的纯化及蛋白结构功能的研究中。治疗性单抗的市场在新药开发中有逐年增长的趋势，1997年单抗的销售额是50亿美金，此后每年都有40%到50%的增长，至2003年已达到1997年的10倍，达500亿美金，由此可见单抗技术是生物技术领域中升起的一颗新星。

单克隆抗体是未来治疗学上的一大研究热点，有报道称单克隆抗体药物将成为生物医药研究的主旋律。迄今为止世界上已经研制出了数以千计的单克隆抗体，并广泛应用于生物学、医学领域，在疾病的诊断和治疗方面发挥着重要作用。随着对单克隆抗体药物研究的不断深入以及新药的不断推出，单克隆抗体药物一直处于较高的增长率；同时单克隆抗体不仅在体外诊断试剂上得以广泛应用，还可直接用于对人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔的前景。

2010年全球治疗用单抗药物的销售总额达到440亿美元，如果加上100亿美元的单抗诊断和研究试剂，单抗药物的市场总量达到550亿美元。2011年单抗药物的市场总量已经达到628亿美元。未来，全球单克隆抗体药依旧会保持较高的增长率。到2015年，全球单克隆抗体药销售额有望达980亿美元左右。我国的单克隆抗体药物从无到有，每年以50%以上的速度递增，在我国医药市场发挥越来越重要的作用。

2011年，单克隆抗体药物继续领跑全球药品市场。2000-2010年10年间，全球单克隆抗体药物市场的复合增长率高达32%。2011年，全球处方药前20位中，有6个为单克隆抗体药物，其中有5个销售额超过50亿美元。而在此前的2009年和2008年，该数字分别为400亿美元和370亿美元。当前，几乎所有大型制药公司都有单抗研发项目。在2011年全球最畅销的20种药品中。2011年，全球生物制药产品的市场规模超过1550亿美元，占制药/生物制药产品的25%。不过，有研究数据表明，生物制药产品今后几年在全球市场上的占比将明显上升。

目前国内外实验室广泛采用的大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是体外培养法；二是动物体内生产法。

杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchorage dependent cell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含20%小牛血清的培养基培养，杂交瘤细胞浓度以1×10⁶-2×10⁶/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养，单位体积内细胞数量越多，杂交瘤细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中采用的悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器（美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产），其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中采用的微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以Cytodex I，Biosilon和Superbeads为好。微载体培养的基本方法与悬浮培养相同。近来的研究表明，该法是杂交瘤细胞大量培养的理想途径之一。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中采用的中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。用于细胞培养的中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合物、多聚碳酸硅等材料制成，外径一般为100-500um，壁厚25-75um，壁呈海绵状，上面有许多微孔。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，其孔径只允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单抗等）有滞留作用。目前使用的中空纤维生物反应器分为柱式、板框式和中心灌流式。尽管该培养系统在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，但由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。

目前在杂交瘤细胞的大量培养采用的中微囊化细胞培养系统：该系统是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中采用的杂交瘤细胞的无血清培养：杂交瘤细胞的体外培养绝大多数应用DMEM或RPMI-1640为基础培养基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。基础培养基主要提供各种氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐、各种合成核酸和脂质的前体物质；而血清主要供给杂交瘤细胞等各种营养成分，血清中的激素可刺激细胞生长，其中的许多蛋白质能结合有毒性的离子和热源质而起解毒作用，同时这些蛋白质对激素、维生素和脂类有稳定和调节作用。但是，血清中含有上百种的蛋白质，这给单抗的纯化带来很大麻烦，而未纯化的含有异种蛋白的单抗用于动物治疗可诱发变态反应；加之，血清来源有限，且每批血清之间质量差异较大，直接影响结果的稳定性，同时血清是杂交瘤细胞发生支原体污染的最主要来源之一，而且价格较贵。为了克服血清的这些缺点，采用无血清培养基培养杂交瘤细胞越来越受到广泛重视。

无血清培养的实质就是用各种不同的添加剂来代替血清，然后进行杂交瘤细胞的培养。目前已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基，其中一部分已有产品出售。综合这些无血清培养基，约有几十种不同的添加剂可用于无血清培养基，但是在其中至少必须添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠这四种成分，才能起到类似血清的作用，其他较重要的添加剂包括白蛋白、亚油酸和油酸、抗坏血酸以及锰等一些微量元素。

采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单抗，有利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；同时无血清培养基还缺少血清中保护细胞免受环境中蛋白酶损伤的抑制因子等。尽管如此，无血清培养基终究会成为杂交瘤细胞培养的理想的培养基。

总之，上述几种体外培养生产单抗的方法仍处在发展之中；随着研究的不断深入和技术的完善，它们将会在单抗生产的产业化进程中发挥越来越大的作用。

目前，随着杂交瘤细胞融合技术和检测方法的致敏性的提高，一次成功的融合，可产生上百个阳性克隆，此时要了解单抗的性质和用途是困难的，因此必须解决短期内大批样品的冻存和复苏问题，否则就会丧失若干有用的杂交瘤细胞株。

另外，杂交瘤细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使杂交瘤细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏杂交瘤细胞用于实验，而且适度地保存一定量的杂交瘤细胞，可以防止因正在培养的杂交瘤细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些杂交瘤细胞。杂交瘤细胞冻存虽然常规采用“慢冻快融”的方法能较好地保证杂交瘤细胞存活率，但是效果一直很不理想。由于常规的冻存方法中，冻存液是由DMSO、DMEM/RPMI-1640培养基和胎牛血清按一定比例配制而成。DMSO有毒，在常温下对细胞有一定伤害，但是在细胞冻存中又能起到保护作用；而胎牛血清可以为细胞提供大量营养物质，能保证长期冻存中杂交瘤细胞缓慢代谢中所需的营养物质，如果几种成分配制比例欠缺，会直接影响冻存液中杂交瘤细胞的存活率；同时现有的冻存步骤在4℃或-20℃放置时间一般需要8-12小时，不仅周期过长，还会导致杂交瘤细胞在该过程中受损严重（DMSO对杂交瘤细胞本身的毒性及冰晶的形成），使后期复苏时杂交瘤细胞存活率很低。

杂交瘤细胞培养的传代及日常维持过程中，各方面（培养器具、培养液及做准备工作时）不但需要耗费大量的细胞，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断出现新的变化，因此及时进行高效的杂交瘤细胞冻存十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、便捷，复苏后细胞成活率较高的杂交瘤细胞冻存保种的新方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的杂交瘤细胞冻存保种的新方法，包括下述步骤：

第一步，将克隆筛选出的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养至对数生长期，然后对杂交瘤细胞进行收集离心，弃上清，保留杂交瘤细胞沉淀；

第二步，取一定量的冻存液对杂交瘤细胞进行细胞重悬并计数，然后再用该冻存液将杂交瘤细胞密度调控至2-5×10⁶个/ml；

第三步，将第二步调控好的杂交瘤细胞悬液按1ml/管分装至冻存管内，密封后竖立放置在百孔盒内，立即放入4℃层析柜中，计时1小时；然后将其转放至-20℃冰柜中，计时1-2小时；继续将其转放至-80℃冷柜中，计时12-24小时；最后将其放置在液氮液面10cm以下，长期保存待用。

第二步所用的冻存液由8%DMSO+32%DMEM/RPMI-1640培养基+60%胎牛血清（按体积比）配制而成。

本发明所用的冻存管优选康宁430658外旋冻存管1.2ml，圆底，自立式，外旋密盖PP（聚丙烯）材质，其耐低温-196--221℃。

本发明为无菌操作。

本发明的优点在于流程简单，操作便捷，安全性高，整个流程所用工时一天内可顺利完成，保证了杂交瘤细胞虽暂时脱离生长状态但能将其杂交瘤细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏杂交瘤细胞用于实验。本发明杂交瘤细胞的冻存过程采用按一定的温度梯度“慢冻”，与常规实验及文献中采用在4℃或-20℃放置8-12小时的冻存步骤相比，不仅缩短了冻存周期，而且多次实验验证：在4℃放置1小时，已保证DMSO完全渗入到杂交瘤细胞内；将其转放至-20℃冰柜中放置1-2小时，可避免杂交瘤细胞内冰晶过大，造成杂交瘤细胞壁受损；然后转至-80℃进行12-24小时后再放置液氮中进行冻存后，杂交瘤细胞复苏后的存活率最高。

将杂交瘤细胞置于本发明配制的冻存液中，在液氮中可保存5~10年，采用“快融”的方法复苏后，杂交瘤细胞的存活率可达96%以上，有效避免了正在培养的细胞被污染或由于其他意外事件而使细胞丢种的现象，起到了细胞保种的作用，且节约人力及物力等资源；本发明采用的细胞冻存液中加入的保护剂8% DMSO (二甲基亚砜)，可使溶液冰点降低，保证在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤，以确保杂交瘤细胞复苏后的成活率；而较高含量（60%）的胎牛血清则足以维护杂交瘤细胞的细胞活力。实验证明，采用8%DMSO+32%DMEM/RPMI-1640培养基+60%胎牛血清的比例配制的冻存液进行杂交瘤细胞冻存效果最佳。

具体实施方式

下面对本发明方法作更加详细的说明，以便于本领域技术人员对本申请的理解。

一、本发明杂交瘤细胞冻存保种的新方法包括下述步骤：

第一步，将克隆筛选出的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从九十六孔板培养至对数生长期的时候（一般在倒置显微镜下观察细胞数量覆盖平皿底部的3/4面积，并且细胞状态良好即为细胞生长对数期），对杂交瘤细胞进行重悬（因为杂交瘤细胞为半贴壁半悬浮型细胞），然后一对一直接Z字形接种到六孔板内（六孔板需每孔添加含有0.3~0.5ml饲养细胞的6ml完全培养基，饲养细胞必须提前一天制备，第二天观察无污染方可使用），然后每天观察细胞状态及数量，一般培养三天左右，杂交瘤细胞在六孔板内培养至对数生长期的时候（在倒置显微镜下观察细胞数量覆盖平皿底部的3/4面积，并且细胞状态良好），再次对杂交瘤细胞进行重悬（因为杂交瘤细胞为半贴壁半悬浮型细胞），然后转移至15ml无菌离心管内1500r/min，3min离心去除上清培养基，按每孔使用1ml完全培养基进行杂交瘤细胞重悬，然后Z字形接种到100mm平皿内（每皿添加含有2~3ml饲养细胞的30ml完全培养基，饲养细胞必须提前一天制备，第二天观察无污染方可使用），扩大培养至对数生长期（在倒置显微镜下观察细胞数量覆盖平皿底部的3/4面积，并且细胞状态良好），然后将杂交瘤细胞转移至50ml无菌离心管内2000r/min，3min离心去除上清培养基，保留杂交瘤细胞沉淀；

第二步，取一定量的冻存液（4℃保存）对杂交瘤细胞进行细胞重悬并计数（一般采用每平皿杂交瘤细胞对应2ml冻存液进行重悬，细胞计数采用有限稀释法），然后用冻存液将杂交瘤细胞密度调控至2-5×10⁶个/ml（建议杂交瘤细胞冻存密度3×10⁶个/ml）；

为避免细胞损伤，本发明的冻存液由8%DMSO+32%DMEM/RPMI-1640培养基+60%胎牛血清（按体积比）配制而成，其中添加的8%DMSO可使溶液冰点降低，保证在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤以确保杂交瘤细胞复苏后的成活率；而较高含量的胎牛血清则足以保证维护杂交瘤细胞的活力；

第三步，将第二步调控好需要冻存的杂交瘤细胞悬液按1ml/管分装至冻存管内（冻存管优选康宁430658外旋1.2ml冻存管，圆底，自立式，外旋密封盖为聚丙烯材质，可耐低温-196 ~ -221℃），密封后竖立放置在百孔盒内，立即放入4℃层析柜中，计时1小时；1小时后立即将放置有冻存管的百孔盒转放至-20℃冰柜中，计时1-2小时；1-2小时后再将其迅速转放至-80℃冷柜中，计时12-24小时；12-24小时后即可将放置有冻存管的百孔盒放置在液氮液面10cm以下，保证冻存管内的杂交瘤细胞处于-196℃的环境内，在此低温环境下杂交瘤细胞理论上可长期保存待用。

为确保杂交瘤细胞保种的成功率，本发明方法中各步骤均为无菌操作或至少在千级洁净室内的超净工作台内操作实验。

二、不同的冻存方法和不同配比的冻存液对杂交瘤细胞的冻存效果对比

1、冻存液采用常规的配比：10%DMSO+40%DMEM/RPMI-1640培养基+50%胎牛血清。

a组冻存过程：4℃层析柜（8--12小时），-20℃冰柜（8--12小时），-80冰柜（过夜），液氮长期储存。

b组冻存过程：4℃层析柜（0.5--1小时），-20℃冰柜（8--12小时），-80冰柜（过夜），液氮长期储存。

c组冻存过程：4℃层析柜（0.5--1小时），-20℃冰柜（1--2小时），-80冰柜（过夜），液氮长期储存。

d组冻存过程：4℃层析柜（0.5--1小时），-20℃冰柜（1--2小时），-80冰柜（2--4小时），液氮长期储存。

e组冻存过程：直接放置液氮长期储存。

不同冻存过程对杂交瘤细胞的冻存效果：

注：杂交瘤细胞冻存一定时间后，取出杂交瘤细胞复苏，观察活细胞百分率（台盼蓝法：用台盼蓝染色后进行细胞计数(活细胞数/细胞总数）*100%）。

结论：c组冻存过程可使杂交瘤细胞在液氮中冻存五年内其细胞活率在74%以上。

2、不同配比的冻存液对杂交瘤细胞的冻存效果对比

①号冻存液--10%DMSO+40%DMEM/RPMI-1640培养基+50%胎牛血清

②号冻存液--5%DMSO+45%DMEM/RPMI-1640培养基+50%胎牛血清

③号冻存液--8%DMSO+42%DMEM/RPMI-1640培养基+50%胎牛血清

④号冻存液--5%DMSO+35%DMEM/RPMI-1640培养基+60%胎牛血清

⑤号冻存液--8%DMSO+32%DMEM/RPMI-1640培养基+60%胎牛血清

⑥号冻存液--10%DMSO+90%胎牛血清

冻存过程为：4℃层析柜（0.5--1小时），-20℃冰柜（1--2小时），-80冰柜（过夜），液氮长期储存。

不同冻存液对杂交瘤细胞的冻存效果：

结论：⑤号冻存液可使杂交瘤细胞在液氮中冻存五年中其细胞活率在93%以上。

Claims

1.一种杂交瘤细胞冻存保种的新方法，其特征在于：包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存保种的新方法，其特征在于：所述第二步用的冻存液由8%DMSO+32%DMEM/RPMI-1640培养基+60%胎牛血清配制而成。