CN101993856A - 抗鸭源性冠状病毒zz2004单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杂交瘤细胞株、抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体及其应用。本发明通过细胞的融合、筛选和克隆，获得保藏编号为CGMCCNO.4171杂交瘤细胞株，将筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，注入经产母鼠腹腔，制备出了高效价的腹水抗体，该抗体能够中和鸭源性冠状病毒；以本发明杂交瘤细胞株制备单克隆抗体成本低、操作简单、生产周期短，生产的抗体含量高、特异性强；该发明为建立鸭源性冠状病毒感染禽类的诊断方法奠定良好的基础，具有重要的经济价值和社会意义。

Description

抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株、抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体及其应用。

背景技术

1937年，冠状病毒（Coronaviruses）首先从鸡身上分离出来。1965年，分离出第一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒科分为冠状病毒和环曲病毒两个属。冠状病毒科的代表株为禽传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）。该病毒为有囊膜、呈中等多形性球状或椭圆形的病毒粒子，表面有杆状突起。

禽传染性支气管炎(IB)是由冠状病毒科的禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种常见多发的急性高度接触性传染病，表现为呼吸型、肾型、肠型、腺胃型等多种病型。该病可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低。IBV往往引起复合感染，如新城疫（Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可继发细菌性疾病，如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，从而加重了对鸡群的危害。据《世界家禽》1999年资料，全世界的禽病中，以呼吸系统疾病最为严重，其中IB是世界大多数地区危害养鸡业的主要疾病。1988年以来，IB在我国大部分地区相继流行，疫区的发病率可达100％，死亡率可达10～30％。国内外已报道的IBV有26种以上血清型，因血清型及新变型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护，新的变异株不断出现和流行，是造成鸡群免疫失败的原因，这使得IB对养鸡业造成的威胁持续存在，因此要建立快速而又有效的检测方法。

2004年5月，河南省郑州某养殖场发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达10% 以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病，但没有造成大量死亡。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落,腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其它鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的调查、研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株可疑病毒，经鉴定为一种新IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株，保藏编号为 CGMCC NO.3842，其专利申请号为201010225577.4，此为第一次有关家鸭感染IBV的报道。本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场，其不仅引起鸡的大批发病及死亡，还感染了鸭群，严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，鸭源性冠状病毒ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更广。目前，对于该病毒还缺乏有效的检测方法，而在检测方法的建立中，取得有效的抗体尤为关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种杂交瘤细胞株、抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体及其制备与应用，该杂交瘤细胞株产生的抗体特异性强，其生产方法操作简单、生产周期短，生产的抗体含量高，且生产成本低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种分泌抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H10，其保藏编号为 CGMCC NO.4171。

所述杂交瘤细胞株3H10用于制备抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的用途。

所述杂交瘤细胞株3H10产生的抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体。

所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体在快速检测鸭源性冠状病毒ZZ2004中的应用。

所述杂交瘤细胞株3H10的制备方法包括以下步骤：

（1）小鼠免疫  将鸭源性冠状病毒ZZ2004接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中进行繁殖，72h后，收取鸡胚病毒尿囊液，梯度离心，分别为：4000rpm，30分钟，取上清；8000rpm，30分钟，取上清；200000g，4小时，用生理盐水稀释沉淀，用分光光度计测量病毒蛋白含量为3.5毫克/毫升，然后根据50微克病毒蛋白/只的病毒量和200微升/只的免疫抗原量，计算出所需要的病毒量为14微升，用生理盐水稀释至100微升，再与100微升的佐剂行充分乳化，用乳化的免疫抗原对小鼠进行背部皮下多点免疫，分4次免疫；

（2）细胞融合

①对免疫小鼠的效价进行测定，选择效价高（1：4000）的小鼠，置于超净台内取其脾脏，制备脾细胞；

②将骨髓瘤细胞和制备的脾细胞按照1：10的比例混合，加入1毫升的诱导剂PEG-1500，促进细胞融合，用HAT培养基进行培养；

（3）杂交瘤细胞的筛选和克隆

①采用间接ELISA方法，对融合细胞进行多次筛选，找出强阳性细胞，其OD(光密度)值为1.105，P/N（待测样品OD值/阴性对照的OD值）值达到12.5，且为最大，P/N大于2即判为阳性；

②对筛选到的强阳性细胞，用有限稀释克隆的方法进行多次克隆，使得每个孔内最多只有一个杂交瘤细胞，最后获得能分泌单抗的杂交瘤细胞

（4）杂交瘤细胞冻存

及时冻存筛选到的杂交瘤细胞，当细胞长至瓶底70%且处于对数生长期时，轻轻吹打细胞，离心，800rpm，5分钟，弃上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，分装入细胞冻存管中，每管加细胞悬液1毫升，然后放置于4℃/30分钟，-20℃/2小时，-80℃/过夜，最后放入液氮中长期冻存。

本发明具有积极有益的效果：

本发明利用单克隆抗体技术，通过细胞的融合、筛选和克隆，获得杂交瘤细胞株，将筛选到的杂交瘤细胞扩大培养，注入经产母鼠腹腔，制备出了高效价的腹水抗体，该抗体能够中和鸭源性冠状病毒；以本发明杂交瘤细胞株制备单克隆抗体成本低、操作简单、生产周期短，生产的抗体含量高、特异性强；该发明为建立鸭源性冠状病毒感染禽类的诊断方法奠定良好的基础，具有重要的经济价值和社会意义。

本发明所述杂交瘤细胞株3H10，建议的分类命名为抗鸭源性冠状病毒ZZ2004毒株的单克隆抗体细胞，已于2010年9月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该鸭源性冠状病毒的保藏编号为 CGMCC NO.4171。

 

具体实施方式

实施例1  杂交瘤细胞株制备

（1）小鼠免疫    

将鸭源性冠状病毒ZZ2004接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中进行繁殖，72h后，收取鸡胚病毒尿囊液，梯度离心，分别为：4000rpm，30分钟，取上清；8000rpm，30分钟，取上清；200000g，4小时，用生理盐水稀释沉淀，用分光光度计测量病毒蛋白含量为3.5毫克/毫升，然后根据50微克病毒蛋白/只的病毒量和200微升/只的免疫抗原量，计算出所需要的病毒量为14微升，用生理盐水稀释至100微升，再与100微升的佐剂行充分乳化，用乳化的免疫抗原对小鼠进行背部皮下多点免疫，分4次免疫。

（2）细胞融合

对免疫的小鼠进行效价测定，选择效价高（1：4000）的小鼠，取其脾脏，制备脾细胞，将骨髓瘤细胞和脾细胞按照1：10的比例混合，加入1毫升诱导剂PEG-1500促进细胞融合，在HAT选择性的培养基的环境下进行培养。

（3）杂交瘤细胞的筛选和克隆

对出现克隆的细胞孔，用间接ELISA方法进行多次筛选，选择阳性强的细胞孔，其OD(光密度)值为1.105，P/N（待测样品OD值 / 阴性对照的OD值）值达到12.5，且为最大。P/N大于2即判为阳性。

对筛选到的强阳性细胞进行扩大培养，并进行有限稀释克隆，使得每个孔内最多只有一个杂交瘤细胞；最后获得了一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，命名为3H10，测得细胞上清液的ELISA效价为1：320。

（4）杂交瘤细胞的冻存

对筛选到的杂交瘤细胞3H10，要及时冻存。当细胞长至瓶底70%且处于对数生长期时，轻轻吹打细胞，离心，800rpm，5分钟，弃上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，分装入1.5毫升的细胞冻存管中，每管加入细胞悬液1毫升，然后放置于4℃/30分钟，-20℃/2个小时，-80℃/过夜，最后放入液氮中长期冻存。

实施例2  腹水单抗的制备

①将扩大培养的杂交瘤细胞3H10注射到经产Balb/c小鼠腹腔内，每只小鼠注射1×10⁶个细胞；

②20天后收集腹水，测其抗体效价为1：8.2×10⁶ 。

实施例3  单抗对病毒的中和作用

将实施例2所获得的单抗进行鸡胚中和试验，首先测得病毒的EID₅₀=10^-4.88次方，经换算等于2.1×10^-6次方，将病毒稀释为200个EID₅₀，同时将腹水抗体进行倍比稀释，稀释后的抗体和稀释后的病毒各0.1毫升，并进行混合，使得混合后的抗体稀释度分别为：1:5、1:10、1:20、1:40、1:80和1:160，再将各个梯度的混合液在37℃温箱中作用1h，每个抗体稀释度的混合液接种6枚鸡胚，同时设立病毒对照（0.1毫升的病毒夜,100 ELD₅₀+0.1毫升的生理盐水）和抗体对照（1:5稀释的抗体稀释液+0.1毫升的生理盐水），接种后24小时照蛋一次，取出死亡的鸡胚，为非特异性死亡。之后，每天照蛋一次，取出死亡的鸡胚放于4度冰箱；其它鸡胚孵化至第18日龄。按Reed-Muench法计算，得出腹水单抗的中和效价为1:29，即1:29倍稀释的腹水单抗能保护50%的鸡胚免受病毒感染。

实施例4  用单抗建立检测病毒的免疫组化法

用实施例2获得的腹水抗体建立免疫组化法，来检测组织中的病毒。取感染鸡的肝、肾组织，按照常规方法制作组织切片，进行免疫组化染色，对染色条件进行优化后，进行以下操作：二甲苯和酒精进行脱蜡与复水、3%的甲醇H₂O₂溶液消除内源性过氧化物酶、pH6.0的柠檬酸+柠檬酸钠的缓冲溶液抗原修复、5%的BSA封闭、加入1:80倍稀释的腹水单抗、加入1:1000倍稀释的羊抗鼠二抗、DAB显色5分钟、苏木素复染、60℃温水中蓝化、酒精梯度脱水、中性树脂封片，显微镜下观察，肝、肾组织均有阳性出现，用该腹水单抗建立的免疫组化法能够对病毒进行有效的检测。

Claims (5)

1.一种分泌抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H10，其保藏编号为 CGMCC NO.4171。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株3H10用于制备抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体的用途。

3.权利要求1所述杂交瘤细胞株3H10产生的抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体。

4.权利要求3所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004单克隆抗体在快速检测鸭源性冠状病毒ZZ2004中的应用。

5.根据权利要求1所述杂交瘤细胞株3H10，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

（1）小鼠免疫  将鸭源性冠状病毒ZZ2004接种于10日龄SPF鸡胚的尿囊腔中进行繁殖，72h后，收取鸡胚病毒尿囊液，梯度离心，分别为：4000rpm，30分钟，取上清；8000rpm，30分钟，取上清；200000g，4小时，用生理盐水稀释沉淀，用分光光度计测量病毒蛋白含量为3.5毫克/毫升，然后根据50微克病毒蛋白/只的病毒量和200微升/只的免疫抗原量，计算出所需要的病毒量为14微升，用生理盐水稀释至100微升，再与100微升的佐剂行充分乳化，用乳化的免疫抗原对小鼠进行背部皮下多点免疫，分4次免疫；

（2）细胞融合

①对免疫小鼠的效价进行测定，选择效价高（1：4000）的小鼠，置于超净台内取其脾脏，制备脾细胞；

②将骨髓瘤细胞和制备的脾细胞按照1：10的比例混合，加入1毫升的诱导剂PEG-1500，促进细胞融合，用HAT培养基进行培养；

（3）杂交瘤细胞的筛选和克隆

①采用间接ELISA方法，对融合细胞进行多次筛选，找出强阳性细胞，其OD(光密度)值为1.105，P/N（待测样品OD值/阴性对照的OD值）值达到12.5，且为最大，P/N大于2即判为阳性；

②对筛选到的强阳性细胞，用有限稀释克隆的方法进行多次克隆，使得每个孔内最多只有一个杂交瘤细胞，最后获得能分泌单抗的杂交瘤细胞

（4）杂交瘤细胞冻存

及时冻存筛选到的杂交瘤细胞，当细胞长至瓶底70%且处于对数生长期时，轻轻吹打细胞，离心，800rpm，5分钟，弃上清，打散细胞团，加入细胞冻存液，分装入细胞冻存管中，每管加细胞悬液1毫升，然后放置于4℃/30分钟，-20℃/2小时，-80℃/过夜，最后放入液氮中长期冻存。