CN102221611A - 鸭源性冠状病毒夹心elisa试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒及其应用。该试剂盒包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液、包被抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗的酶标板、捕获抗体及酶标抗体;其检测方法为将待检样品放入包被抗体的酶标板,再依次添加捕获抗体、酶标抗体反应后加显色剂显色,测OD值。本发明中所用的包被抗体为单克隆抗体,有力地排除了多种非特异性的干扰,特异性强,精确度高;本发明仅涉及的简单的检测仪器,操作步骤简便,普通技术人员也易于操作使用,易于推广普及;本发明适用于大量样品的检测,快速便捷,且检测成本低。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术,具体涉及一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
河南省郑州某养殖场2004年5月发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病,感染鸡主要表现精神沉郁,下痢,生长缓慢及抵抗力下降,发病率为100%,死亡率达10% 以上,感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示,与鸡舍相距仅150米左右处有一个1700只的肉鸭群,在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病。死亡鸡病变主要为小肠出血,肠壁变薄,有的有溃荡,小肠绒毛脱落,腺胃乳头肿大、粘膜脱落,有的肌胃和腺胃交界处有出血,肌胃有出血或溃荡,肾脏肿大,呈“花斑肾”,肺脏无明显变化,法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩;病鸭剖检以肾脏肿大,苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病,虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工作,结果从发病鸭体内分离到一株病毒,鉴定为IBV,命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株(保藏编号:CGMCC NO.3842),其专利文献公开号为CN 101906404A,此为首次有关家鸭感染IBV的报道。本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场,其不仅引起鸡的大批发病及死亡,还感染了鸭群,严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病毒相比,鸭源性冠状病毒ZZ2004变异的程度较大,对动物的感染谱更广。
目前,国内外已建立了许多IBV相关的诊断技术,主要分为抗体检测和抗原检测两大类。抗体检测方法包括间接免疫荧光法、ELISA法、免疫过氧化物酶单层细胞试验、中和试验等。目前所有针对抗体的检测方法都无法区分免疫鸡群和感染鸡群,从而影响疫病的及时、有效防控。而抗原检测方法则结果较直接,能明确病毒感染。针对IBV抗原检测的方法主要有RT-PCR法、病毒分离、免疫组化等,各方法均存在一些不足之处。例如,病毒分离方法耗时、费力;免疫组化方法操作繁琐,影响因素较多,并且结果判断具有一定的主观性;RT-PCR方法对检测人员实验操作技能要求较严格,且成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、精确度高、操作简便、检测快速的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒,并公开了其应用方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:
一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒,包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液,其还包括:
(1)包被抗体的酶标板:以抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体,用包被液将单抗稀释到10μg/ml,每孔加入100μL,4℃冰箱中过夜,用洗涤液PBST洗涤2~4次,再向酶标板中加入5%(g/mL)的BSA封闭液,100μL/孔,37℃反应2h,洗涤液PBST洗涤2~4次;
(2)捕获抗体:兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗;
(3)酶标抗体:HRP标记的羊抗兔IgG。
所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为 CGMCC NO.4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得。
所述兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗的制备方法如下:
将病毒进行纯化,选择2.0~2.5㎏之间的大白兔进行四次免疫,时间分别为第1天,第14天,第28天和第30天,第4次免疫后一周进行心脏采血,分离血清,即得兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。
所述鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法,包括以下步骤:
(1)加待检样品:取试剂盒中的包被抗体的酶标板,向其中加入经过处理的待检样品,100μL/孔,同时分别设立阳性对照和阴性对照,37℃下反应25~35min,洗涤液PBST洗涤2~4次;
(2)添加捕获抗体:取试剂盒中的捕获抗体,按1:100倍稀释后加入到上述酶标板中,100μL/孔,37℃反应25~35min,洗涤液PBST洗涤2~4次;
(3)添加酶标抗体:取试剂盒中的酶标抗体,用洗涤液PBST按照1:1000的比例进行稀释并混匀,100μL/孔, 37℃下反应25~35min,以洗涤液PBST洗涤2~4次;
(4)显色:加入TMB显色液,100μL/孔,在室温下显色8~12min,用2M的H2SO4为终止液终止显色;
(5)测OD值:用酶标仪进行测量,测OD值。
所述待检样品的前处理方法如下:
采集相应的待检组织器官1.0g,进行研磨,加入1ml灭菌的PBS缓冲液,1000rpm离心10min,取上清,8000rpm离心10min,取上清。
在所述步骤(5)中,当P/N值>2时,待检样品为阳性,其中P为待检样品的OD值,N为阴性对照的OD值。
本发明具有积极有益的效果:
1.本发明中所用的包被抗体为单克隆抗体,有力地排除了多种非特异性的干扰,特异性强,精确度高;
2.本发明仅涉及的简单的检测仪器,操作步骤简便,普通技术人员也易于操作使用,易于推广普及;
3.本发明适用于大量样品的检测,快速便捷,且检测成本低。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中的试验方法,如无特别说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料及试剂,如无特别说明,均购自常规生化试剂商店。
实施例1 一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒,包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液,以及:
(1)包被抗体的酶标板:用抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体,用包被液将单抗稀释到10μg/ml,每孔加入100μL,4℃冰箱中过夜,用洗涤液PBST洗涤3次;向酶标板中加入5%的BSA封闭液,100μl/孔,37℃反应2h,洗涤液PBST洗涤3次;
上述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为 CGMCC NO.4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得,详细制备方法可参见发明人的另一项专利文献 CN 101993856A。
(2)捕获抗体:兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗;其制备方法为:将病毒进行纯化,选择2.0~2.5㎏之间的日本大白兔进行免疫,免疫分四次,时间分别为第1天,第14天,第28天和第30天,第4次免疫后一周进行心脏采血,分离血清,即为兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。
(3)酶标抗体:HRP标记的羊抗兔IgG(购于宝赛生物公司);
以上述鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒应用方法如下:
(1)加待检样品:分别采集人工感染鸭源性冠状病毒ZZ2004株的鸡的心脏、肝脏和肾脏组织1.0g,进行研磨,加入1ml灭菌的PBS缓冲液,1000rpm离心10min,取上清,8000rpm离心10min,取上清;取试剂盒中的包被抗体的酶标板,向其中加入上步所得上清,每孔中加入100μL,同时分别设立阳性对照和阴性对照,37℃反应30min,洗涤液PBST洗涤3次。
(4)添加捕获抗体:用兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗作为捕获抗体,1:100倍稀释,100μL/孔,37℃下反应30min,洗涤液PBST洗涤3次。
(5)添加酶标抗体:取HRP标记的羊抗兔IgG,用PBST按照1:1000的比例进行稀释并混匀,100μL/孔,37℃下反应30min,洗涤液PBST洗涤3次。
(6)显色:每孔中加入TMB显色液100μl,在室温下显色10分钟,用2M的H2SO4终止显色。
(7)测OD值:用酶标仪进行测量,测OD值,测得各样品及阳性对照、阴性对照的OD值如表1所示。
其阳性判定标准为:P/N大于2即为阳性(其中P为待检样品的OD值,N为阴性对照的OD值),从表1中可知,人工感染的鸡的心脏、肝脏和肾脏中均含有鸭源性冠状病毒ZZ2004株。
表1各待检样品及阳性对照、阴性对照酶标仪测量的OD值
OD值 | OD值 | OD值 | OD值 | OD值 | OD值 | 阳性对照 | 阴性对照 | |
心脏 | 2.4839 | 2.3219 | 2.2244 | 2.4030 | 2.5105 | 2.2869 | 2.3153 | 0.2381 |
肝脏 | 2.3012 | 2.3118 | 2.1827 | 2.0924 | 2.6296 | 2.1196 | 2.4047 | 0.3125 |
肾脏 | 2.2354 | 2.2587 | 2.5461 | 2.0476 | 2.3258 | 2.8451 | 2.5204 | 0.2579 |
Claims (6)
1.一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒,包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液,其特征在于,它还包括:
(1)包被抗体的酶标板:以抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体,用包被液将单抗稀释到10μg/ml,每孔加入100μL,4℃冰箱中过夜,用洗涤液PBST洗涤2~4次,再向酶标板中加入5%的BSA封闭液,100μL/孔,37℃下反应2h,洗涤液PBST洗涤2~4次;
(2)捕获抗体:兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗;
(3)酶标抗体:HRP标记的羊抗兔IgG。
2.根据权利要求1所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒,其特征在于,所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为 CGMCC NO.4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得。
3.根据权利要求1所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒,其特征在于,所述兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗的制备方法如下:
将病毒进行纯化,选择2.0~2.5㎏之间的大白兔进行四次免疫,时间分别为第1天,第14天,第28天和第30天,第4次免疫后一周进行心脏采血,分离血清,即得兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。
4.权利要求1所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法,包括以下步骤:
(1)加待检样品:取试剂盒中的包被抗体的酶标板,向其中加入经过处理的待检样品,100μL/孔,同时分别设立阳性对照和阴性对照,37℃下反应25~35min,洗涤液PBST洗涤2~4次;
(2)添加捕获抗体:取试剂盒中的捕获抗体,按1:100的体积比稀释后加入到上述酶标板中,100μL/孔,37℃下反应25~35min,洗涤液PBST洗涤2~4次;
(3)添加酶标抗体:取试剂盒中的酶标抗体,用洗涤液PBST按照1:1000的比例进行稀释并混匀,100μL/孔,37℃下反应25~35min,以洗涤液PBST洗涤2~4次;
(4)显色:加入TMB显色液,100μL/孔,在室温下显色8~12min,用2M的H2SO4为终止液终止显色;
(5)测OD值:用酶标仪进行测量,测OD值。
5.根据权利要求4所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法,其特征在于,所述待检样品的前处理方法如下:
采集相应的待检组织器官1.0g,进行研磨,加入1ml灭菌的PBS缓冲液,1000rpm离心10min,取上清,8000rpm离心10min,取上清。
6.根据权利要求5所述的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法,其特征在于,在所述步骤(5)中,当P/N值>2时,待检样品为阳性,其中P为待检样品的OD值,N为阴性对照的OD值。
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