DE102020117636A1

DE102020117636A1 - Kits und Verfahren zur Anreicherung und zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae

Info

Publication number: DE102020117636A1
Application number: DE102020117636.8A
Authority: DE
Inventors: Bastian Hülsmann
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-01-05
Also published as: CA3185631A1; US20230228752A1; WO2022003180A1; EP4176265A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Kits und Verfahren zum Nachweis und Anreicherung von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae. Das Nachweisverfahren umfasst das- Koppeln eines Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt und daran bindet, an ein Trägermaterial,- Inkubieren des mit dem Bindeagens gekoppelten Trägermaterials mit einer virushaltigen Probe,- Färben der an dem Trägermaterial immobilisierten Viren mit einem Färbemittel für das Virus,- Detektieren von gefärbten Viruspartikeln über ein physikalisches, chemisches oder biologisches Detektionsmittel.Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für den schnellen und effizienten Nachweis von SARS-CoV-2, dem Erreger der Covid-19 Pandemie. Mit den erfindungsgemäßen Kits ist es möglich, groß angelegte Schnelltests in einer großen Bevölkerungspopulation durchzuführen. Das Anreichungsverfahren ermöglicht es wiederum, virale Proben, z.B. aus einem Rachenabstrich eines Patienten, für eine nachgeschaltete PCR anzureichen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kits und Verfahren zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae.
Coronaviren gehören zur Familie Coronaviridae und verursachen hauptsächlich respiratorische Infektionen unterschiedlicher Schweregrade (Buford F., Spiegel M., Coronaviren: Von der banalen Erkältung zum schweren Lungenversagen, Chronologie einer Pandemie, Monatsschrift Kinderheilkunde, April 2020). Zu den humanen Coronaviren gehören die Virenarten 229E, NL63, OC43 und HKU1. Sie sind für ein Drittel aller Erkältungskrankheiten weltweit verantwortlich. Daneben gibt es neuartige Coronaviren, zu denen das im Jahr 2002 in der menschlichen Population auftretende SARS-CoV (SARS: severe acute respiratory syndrom), das im Jahr 2012 in Saudi-Arabien aufgetretene MERS-CoV (MERS: middle east respiratory syndrom) und das Ende 2019 in Wuhan, China, erstmals aufgetretene SARS-CoV-2 gehören. Das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 verursacht die Lungenkrankheit COVID-19. Neuartige humane Coronaviren sind zoonotischen Ursprungs, d.h. sie gehen von Tieren auf den Menschen über. Als natürliche Reservoire für SARS-CoVs gelten Fledermäuse, für MERS-CoV das Dromedar. Häufige Anzeichen einer Infektion sind Atemwegsbeschwerden, Fieber, Husten, Kurzatmigkeit. In schweren Fällen kann die Infektion auch zu Lungenentzündung oder Nierenversagen führen.
Coronaviren der Subfamilie Orthocoronavirinae werden in α-, β-, γ- und δ-Coronaviren eingeteilt und bestehen aus einem helikalen Nucleocapsid, das von einer Lipidmembran umhüllt ist, in der die Strukturproteine E (Envelope-Protein), S (Spike-Glycoprotein) und M (Membran-Protein) eingelagert sind. Das S-Protein ist für die Bindung an zelluläre Rezeptoren und an den nachfolgenden Eintritt des Virus in die Zielzellen verantwortlich. Dieser kann nur erfolgen, wenn das S-Protein durch zelluläre Proteasen funktional gespalten wird. Aufgrund seiner Funktion ist dieses Protein das Ziel für neutralisierende Antikörper.
Coronaviren sind hochvariable RNA-Viren, die mit Hilfe des Nukleotidaustausches und der Rekombination sehr schnell neue Varianten entwickeln können. Diese stellen die Basis für einen zoonotischen Austausch zwischen Spezies dar. Das RNA-Genom der Coronaviren ist zwischen 26 und 32 Kilobasen groß. Zwei Drittel des Genoms bestehen aus zwei überlappenden Leserastern, die den komplexen viralen Replikase-Transkriptase-Enzymkomplex kodieren und nach Zelleintritt das Virus direkt vom viralen Genom als Vorläuferpolyprotein translatieren. Nach autokatalytischer Spaltung entstehen die Mischstrukturproteinuntereinheiten, die den funktionsfähigen Transkriptase-Polymerase-Komplex bilden. Seine Aufgaben sind die Transkription viraler subgenomischer mRNA und die Replikation der viralen genomischen RNA. Das letzte Drittel des Genoms kodiert für die Virusstrukturproteine, die jeweils mit Hilfe der entsprechenden subgenomischen mRNA translatiert werden
Der in-vitro-Nachweis von RNA von β-Coronaviren erfolgt bislang zuverlässig nur mit Hilfe der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (real-time-PCR, RT-PCR) mittels einer Panel-Diagnostik, die verschiedene Erreger simultan nachweisen kann. Die biologischen Proben werden u.a. über einen Abstrich aus dem Rachenraum oder Sputum erhalten. Der Test weist eine systemische Kontrolle auf, die auf humanen β-Aktin-Genen beruht.
Die aktuellen RT-PCR-Testverfahren weisen unterschiedliche Genabschnitte des Coronavirus nach. Aufgrund der hohen Mutationsraten von RNA-Viren werden zum Ausschluss von falschnegativen Ergebnissen häufig zwei Genabschnitte analysiert.
Die COVID-19 Pandemie hat gezeigt, dass die bestehende Diagnostik schnell an ihre Grenzen stößt, zum einen da die Probenanzahl die Testkapazitäten der Labore übersteigt, zum anderen ist ein Nachweis von RNA-basierten Viren über die RT-PCR sehr material- und zeitaufwändig und erfordert Fachpersonal. Zwischen dem Zeitpunkt der Probenentnahme und dem Testergebnis liegen üblicherweise mehrere Tage, ein Zeitraum, in dem sich der Krankheitsverlauf der getesteten Personen drastisch verschlechtern kann oder in dem symptomfreie, jedoch infektiöse Testpersonen andere Menschen anstecken können. Ferner stehen häufig nicht genügend PCR-Reagenzien zur Verfügung, und auch viele Krankenhäuser sind nicht mit einer PCR-Infrastruktur zur Testung ausgestattet. Aus diesem Grund wird versucht, alternative Testverfahren zu entwickeln. Nukleinsäuretests unter Verwendung einer isothermalen Amplifikation sind im Moment für das SARS-CoV-2 in Entwicklung. Die isothermale Amplifikation wird bei einer bestimmten Temperatur durchgeführt und umfasst eine LAMP (loop-mediated isothermal amplification) Polymerase-Reaktion, d.h. eine Schleifen-vermittelte isothermale Amplifikation unter Einsatz einer DNA-Polymerase.
Mittlerweile wurde SARS-CoV-2 auch im Stuhl von Patienten nachgewiesen und in einer vorläufigen Studie konnten Viruspartikel sogar aus Proben von Abwässern amplifiziert werden (G. Medema et al., 2020, Presence of SARS-Coronavirus-2 in sewage, https://doi.org/10.1101/2020.03.29.20045880).
Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit der Kits und der Falsch-Negativ-Rate einer RT-PCR wurden auch alternative Verfahren zur Diagnose von Coronavirus-bedingten Erkrankungen, insbesondere COVID-19, entwickelt. Hierzu gehören beispielsweise die Computertomografie sowie das Testen von Nukleinsäuren oder Proteinen, beispielsweise anhand des Nachweises viraler Protein-Antigene durch Antikörper. Daneben sind auch serologische Tests in der Entwicklung. Point-of-Care-Test werden verwendet, um Patienten einer Diagnostik zu unterziehen, ohne dass diese Proben zu einer zentralisierten Stelle eingesendet werden müssen. Hierfür werden Nanopartikel-Antikörper-Konjugate verwendet, um in einer Patientenprobe (z.B. Blut oder Urin) SARS-CoV-2 nachzuweisen. Dabei wird der Komplex durch einen Membranstreifen im Rahmen eines kommerziellen lateralen Flow-Assays laufen gelassen, so dass der Komplex durch die Antikörper immobilisiert und als rote oder blaue Linie sichtbar wird. Daneben gibt es auch microfluidische Vorrichtungen, die mit Micrometer-Kanälen und Reaktionskammern in einem Chip ausgerüstet sind.
Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Coronaviren sind beispielsweise beschrieben in der EP 1 493 822 A1 und ein Testkit für die immunologische Diagnose einer SARS-Virusinfektion anhand eines Nukleocapsidproteins N ist Bestandteil der EP 2 023 142 A1 . Ein Nachteil bei den bestehenden Methoden ist deren komplexe und zum Teil auch sehr zeitaufwändige und materialintensive Durchführung, was den Einsatz von Fachpersonal bei der Probennahme und der Ausführung des Verfahrens erforderlich macht. Falsch entnommene Proben sind häufig die Hauptursache für ein falsch-negatives Testergebnis. Immunologische Nachweismethoden auf das Virus sind in der Regel nicht sensitiv genug, um vorhandene Viren sicher nachzuweisen. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Reagenzien für diese Art des Tests limitiert sind und durch die globale Anwendung bei einer Pandemie immer mit Engpässen gerechnet werden muss. Auch sind spezielle Laborgeräte für die Durchführung der Verfahren notwendig, die nicht überall verfügbar sind. Viele der Tests sind darauf ausgerichtet, das virale Genom nachzuweisen, was jedoch noch nichts über die Infektiosität der Virenpartikel aussagt. Dies bedeutet, dass bei den Testverfahren im Allgemeinen kein infektiöses Virus nachgewiesen werden, da virale Gene in der Regel länger nachweisbar sind, als tatsächlich Ansteckungsgefahr besteht. Zum Nachweis der Infektiosität muss eine Virusisolierung in einer Zellkultur erfolgen.
Ferner ist bei den bekannten Verfahren die Durchführung einer Differentialdiagnostik nur mit erheblichem Aufwand möglich, beispielsweise um festzustellen, ob ein Patient an einer Influenza-Erkrankung oder einer bestimmten Art einer Coronavirus-Erkankung leidet.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, alternative Kits und Nachweisverfahren bereitzustellen, die zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere von Viren der Familie Coronaviridae geeignet sind. Gelöst wird diese Aufgabe durch den Gegenstand des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsvarianten finden sich in den Unteransprüchen wieder.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von RNA-Viren (d.h. entweder sRNA- oder dsRNA-Viren) umfasst das

1. Koppeln eines Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt und an das Bindeagens bindet, an ein Trägermaterial,
2. Inkubieren des mit dem Bindeagens gekoppelten Trägermaterials mit einer virushaltigen Probe,
3. Färben der an dem Trägermaterial immobilisierten Viren mit einem Färbemittel für das Virus,
4. Detektieren von gefärbten Viruspartikeln über ein physikalisches, chemisches oder biologisches Detektionsmittel.

Das Trägermaterial kann ein beliebiges sein, welches zur Kopplung des Bindeagens geeignet ist. Die Kopplung kann hierbei spezifisch oder unspezifisch erfolgen, wobei eine kovalente Kopplung bevorzugt ist. Hierzu können die an sich bekannten Kopplungsverfahren, beispielsweise Carboxylat-Bindung, zur Anwendung kommen. Bevorzugte Trägermaterialien sind ausgewählt aus Mikrosphären, Mikropartikeln, Membranen, Filter, Vliese, Sinterplatten, Wafer, Glas, Metall, Kunststoff, massenspektrometrische Targets, Matrix, Chips, Beads, beispielsweise beschichtete oder markierte Beads, magnetischen Beads, Fluoreszenz-markierten Beads oder Luminex-Beads. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Trägermaterial um Polymethylmethacrylat (PMMA)-Mikropartikel, Polyethylen (PE)-Mikropartikel, Polypropylen (PP)-Mikropartikel, Polystyrol (PS)-Mikropartikel, carboxylierte oder animierte Latex-Partikel, Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mikropartikel, Celluloseacetat-Mikropartikel, zyklisches Olefin-Copolymer- (COC) Mikropartikel, Protein A/G-Partikel, Agarose-Mikropartikel, Sepharose-Mikropartikel, magnetische Mikropartikel, ein Hydrogel, ein Sol-Gel, ein poröses Polymer-Monolith, ein poröses Silikon oder eine Membran.
Die Beads können mit unterschiedlichen Farbstoffen oder Farbstoffgemischen markiert und mit Coatings versehen werden. An ihre Oberfläche erfolgt die Kopplung des Bindeagens, d.h. die Immobilisierung von Biomolekülen bzw. Bioagentien. Dafür stehen unterschiedliche Kopplungsmethoden zur Verfügung, die dem Fachmann an sich bekannt sind, beispielsweise Adsorption oder kovalente Kopplung. Die Oberfläche der Mikropartikel kann modifiziert sein, so dass eine gerichtete Kopplung der Biomoleküle auf der Oberfläche möglich ist, wodurch die analytische Sensitivität weiter erhöht werden kann. Dies kann beispielsweise mittels Spacer, Tags, Markern oder anderen Modifikationen erfolgen. Als Trägermaterial einsetzbar sind ferner auch Proteinbiochips, die zur Kopplung eines Bindeagens geeignet sind. In einer Ausführungsvariante sind ferner auch Filter, Vliese, Sinterplatten oder Membranen als Trägermaterial möglich. Als Filter können beispielsweise PVDF, Nitrocellulose, Nylon, Polycarbonate oder Al2O3 Anodisc Filter zum Einsatz kommen.
In einem weiteren Schritt erfolgt das Inkubieren des mit dem Bindeagens gekoppelten Trägermaterials mit einer virushaltigen Probe. Anschließend wird das Trägermaterial mit den daran immobilisierten Viren mit einem Färbemittel für das Virus gefärbt. Schließlich erfolgt das Detektieren von gefärbten Viruspartikeln über ein physikalisches, chemisches oder biologisches Detektionsmittel. Das biologische Detektionsmittel umfasst u.a. enzymatische Detektionsmittel oder Antikörper-gekoppelte Detektionsmittel wie sekundäre Antikörper oder Antikörpermarker. Ein Beispiel eines enzymatischen Detektionsmittels ist die Detektion gebundener Viren mit Hilfe eines spezifischen Bindeagens (z.B. anti-Spike-Antikörper), an das ein Enzym gekoppelt ist, das über einen Farbumschlag eine sensitive Detektion des Virus ermöglicht. In einer bevorzugten Variante erfolgt die Detektion über sekundäre Bindeagentien, wie z.B. Antikörper, die mit Markern oder Konjugaten als Färbemittel gekoppelt sind, die ein detektierbares Signal aussenden. Die damit verbundenen Farbreaktionen oder Lichtemissionen erlauben eine Erkennung der an das Trägermaterial gekoppelten Bindeagentien, z.B. die Erkennung primärer Antikörper. Die Marker oder Konjugate bestehen beispielsweise aus Enzymen (vorzugsweise Peroxidase, alkaline Phosphatase), Fluoreszenzmarkern (z.B. FITC, Alexa-Fluor, Qdot) oder Biotin. Eine Auswertung im Sinne der vorliegenden Erfindung erfolgt vorzugsweise kolorimetrisch, z.B. über eine Analyse des Farbumschlags.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass es einfach durchführbar und robust ist und gleichzeitig eine hohe Sensitivität aufweist. Auf diese Weise sind schnelle Tests mit hohem Durchsatz möglich. Je nach Anwendungsfall und Größenordnung können Mikrotiterplatten mit 8-12 Wells, 96 Wells, 384 Wells oder mehr verwendet werden. Auch der Einsatz eines Silicium-Wafers, eines Chips, eines Mikroarray-Objektträgers oder einer Matrix ist möglich. Bei der Verwendung von Kügelchen (Beads) als Trägermaterial können Bead-basierte Multiplex-Assays zum Einsatz kommen. Die Analyse und Auswertung der Multiplex-Assays kann beispielsweise mit einem Luminex-Analysesystem, über ein FACS-Analysegerät oder mikrofluidische Systeme (z.B. auch „lab-on-a-chip“ - Systeme) erfolgen. Für eine schnelle und kostengünstige Analyse ist das Färbemittel jedoch so gewählt, dass es mit der Kamera eines Smartphones oder mit bloßem Auge nachweisbar ist. Für genauere Analysen kann eine Vergrößerungseinrichtung wie ein Mikroskop oder ein FACS-Analysegerät als Detektionsmittel eingesetzt werden. Für den einfachsten Anwendungsfall ist die Verwendung von Beads bevorzugt, da die Herstellung und Verarbeitung von Chips oder anderen alternativen Trägermaterialien einen größeren maschinellen Aufwand erfordert. Für eine „Point-of-Care-Diagnostik“ kann die Analyse der Beads mit einfachen Hilfsmitteln vor Ort erfolgen. Dazu zählen insbesondere geeignete Linsen, Beleuchtungssysteme und Filter, die eine Detektion gebundener Virenpartikel mit Hilfe der Kamera eines handelsüblichen Smartphones oder mit bloßem Auge erlauben. Im Falle einer kamerabasierten Aufnahme kann die Interpretation des aufgenommenen Bildes automatisiert erfolgen.
Die Einfachheit des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht die Durchführung einer großen Menge von Tests in kostengünstiger und vor allem zeiteffizienter Weise. Spült man das Trägermaterial mit geeigneten Spülmitteln und Waschreagenzien, lassen sich die Beads oder Glasoberflächen des Trägermaterials auch mehrfach verwenden. Erforderlich ist eine Elution der Viren von dem Trägermaterial, ohne das daran gebundene Bindeagens zu denaturieren. Ein solches Recycling würde die Materialkosten weiter senken. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt es zu, dass eine Vor-Ort-Analyse ganzer Personengruppen möglich ist, beispielsweise der Mitarbeiter eines Betriebs, der Passagiere eines Verkehrsmittels (z.B. Flugzeug) oder den Kindern und Jugendlichen in Kitas und Schulen. In einfachsten Fall handelt es sich bei dem physikalischen oder biologischen Detektionsmittel um das menschliche Auge, über das beispielsweise ein Farbumschlag detektierbar ist.
Ziel des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anreicherung von RNA-Viren aus einem großen Probevolumen. Die Probe wird hierfür von einer Testperson bereitgestellt bzw. von dieser entnommen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Probe um ein Körpersekret wie Speichel, Blutserum, Vollblut, Sputum, Urin, Tränenflüssigkeit oder Faezes. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die Analyse von Proben, die über eine Spülung oder einen Abstrich (beispielsweise aus Mund, Nase, Rachen, Darm, Harnröhre, Scheide oder Ohr) entnommen werden. Zum Nachweis von Viren, die im Rachen replizieren (wie beispielswiese SARS-CoV-2), wird die zu analysierende Probe bevorzugt durch Gurgeln einer wässrigen Lösung gewonnen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, auch gepoolte Tests ganzer Personengruppen durchzuführen, um beispielsweise Personen zu erkennen, die teilweise asymptomatisch sind, sich aber dennoch in einer infektiösen Phase einer viralen Erkrankung befinden. Die zum Einsatz kommenden Reagenzien können kurzfristig in großer Menge produziert und einfach verbreitet werden. Da der Virusnachweis nicht durch die Vervielfältigung des viralen Genoms erfolgt, kann der hier vorgestellte Weg auch nicht zu einer Verknappung von Reagenzien führen, wie sie beispielsweise bei PCR-basierten Tests beobachtet wurde. Die eigentliche Durchführung des erfindungsgemäßen Tests erfolgt an Geräten, die weltweit verbreitet und zugänglich sind. Die Bindung von RNA-Viren an Oberflächen des Trägermaterials ermöglicht eine Anreicherung auch aus großer Verdünnung, so dass auch gepoolte Tests oder Tests von großen Probenvolumen mit geringen Virusmengen (wie beispielsweise Abwasser) möglich sind, ohne dass ein signifikanter Verlust an Sensitivität zu befürchten wäre. Dabei kann die Sensitivität durch die Art der nachfolgenden Detektion und im Falle einer mikroskopischen Detektion durch die Wahl des Färbemittels beeinflusst werden. Vorzugsweise kommen Färbemittel zum Einsatz, welche die RNA des RNA-Virus anfärben. Dabei handelt es sich beispielsweise um Färbemittel wie SYBR™, SYTOX™, Acridin-Orange (3-N,3-N,6-N,6-N-Tetramethylacridin-3,6-diamin), Thiazol-Orange, DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol), 7-AAD (7-Aminoactinomycin D), Ethidiumbromid, Propidium-Iodid. Alternativ kann auch ein Membran-Färbemittel verwendet werden, das die Virusmembranen anfärbt oder Färbemittel, die gekoppelt an sekundäre Bindeagentien sind, beispielsweise Antikörper mit daran gekoppelten Markern oder Konjugaten. In einer weiteren Ausführungsvariante ist deshalb vorgesehen, dass der Verfahrensschritt des Färbens auch Methoden für eine kolorimetrische Auswertung einschließt. Dazu kommt vorzugsweise ein enzymatisches oder Fluoreszenz-gekoppeltes Färbemittel zum Einsatz.
Für den Nachweis immobilisierter Viruspartikel an dem Trägermaterial sind normalerweise keine quantitativen Analysen erforderlich, da es lediglich darauf ankommt festzustellen, ob ein Patient in einer von ihm entnommenen Probe Viruspartikel enthält oder nicht. Denn dadurch lassen sich infektiöse Personen identifizieren und durch eine frühzeitige Isolation dieser Personen Ansteckungen verhindern. Großflächig angewandt verhindert diese Maßnahme die Verbreitung von Viren, die eine Epidemie oder Pandemie auslösen können. Sofern auch quantitative Aussagen zu an dem Trägermaterial gebundenen Viruspartikeln getroffen werden sollen, kann dies beispielsweise über eine quantitative PCR- oder FACS-Analyse erfolgen. Der labortechnische Aufwand ist hierbei allerdings um ein Vielfaches höher, da hierfür entsprechende Geräte und Fachpersonal bereitgestellt werden muss. Auch die mikroskopische Quantifizierung der an das Trägermaterial gebundenen Virenpartikel ist möglich. Gebundene Virenpartikel können entweder einzeln gezählt oder anhand der Intensität des Gesamtsignals quantifiziert werden. Über eine geeignete Bildanalyse-Software kann dies automatisiert erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial markiert, um beispielsweise Proben bestimmten Testpersonen zuordnen zu können. Dies kann beispielsweise durch Kopplung von Oligonukleotiden mit spezifischen Nukleotid-Sequenzen oder anhand einer Strichcode-Technologie erfolgen. Das Trägermaterial ist dadurch adressierbar und kann verwendet werden, um spezifische Bindungsereignisse, die auf seiner Oberfläche auftreten, zu identifizieren. Die Verwendung von Markersequenzen für die Identifizierung ist bevorzugt.
In einer bevorzugten Variante kann in einem einzigen Test das Vorhandensein verschiedener Krankheitserreger getestet werden, so dass eine differentielle Diagnostik bei Erkältungssymptomen möglich ist, um beispielsweise auch das Vorliegen von Influenza-, SARS-CoV-2, Erkältungs-Coronaviren sowie RSV-Viren zu testen. Eine Diagnose im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet den Nachweis der an dem Trägermaterial immobilisierten RNA-Viren bei der Probe einer Testperson.
Das Bindeagens ist vorzugsweise ein Antikörper oder ein Antikörperfragment. Vorzugsweise findet das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von SARS-CoV-2-Viren in der Probe einer Testperson Anwendung. Demnach ist das Bindeagens vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörperfragment, gerichtet gegen virale Komponenten wie dem Spike S-Protein, u.a. SpikeS1-Protein, Spike-S2-Protein, Envelope-Protein, Membran-Protein, S-Glycoprotein. Bevorzugte Antikörper sind CR3022, CR3022-RB, anti-Spike-Antikörper, anti-Spike S1-Antikörper, anti-Spike S2-Antikörper, anti-Envelope-Antikörper, anti-M-Antikörper, anti-S-Glykoprotein-Antikörper oder Antikörper aus Seren von Personen, die eine Infektion überstanden haben. Es sind sämtliche polyklonale, monoklonale Antikörper oder Nanobodies von der Erfindung mit umfasst, die als Bindeagens geeignet sind und zur Kopplung des Virus, insbesondere des SARS-CoV-2-Virus, an das Trägermaterial führen. Dazu gehören insbesondere Einzelketten-Antikörper, Nanobodies und Antikörper-Mimetika wie beispielsweise Adhirons, Affibodies, Affifine, Affiline, Anticaline, Avimere, Armadillo Repeat Proteins, DARPins, Fynomere, Kunitz-Domänen, Monomere und Peptid-Aptamere. Solche Mimetika entstehen beispielsweise durch eine in-vitro-Selektion oder in-silico-Vorhersagen. Dabei bilden Strukturen von Fibronektin III das Rückgrat von Monobodies. Nanopartikel eignen sich insbesondere für hochauflösende lichtmikroskopische Aufnahmen und somit als Detektionsmittel für die Anfärbung der Viruspartikel.
Die Coronaviren HCOV - NL63, SARS-COV und die neuen SARS-COV-2-Viren binden alle an den ACE2 (Angiotensin-konvertierendes Enzym 2)-Rezeptor. Im Gegensatz dazu bindet das MERS-COV-Virus selektiv an den DPP4 (Dipeptidylpeptidase 4)-Rezeptor. Bindungsrezeptor für das HCOV-229E Virus ist der APN (Aminopeptidase N)-Rezeptor. HKU1 und OC43 hingegen binden an O-ac Sia. Somit sind diese Rezeptoren oder deren Hybride, Fusionsproteine oder Mutanten davon an das Trägermaterial zur Anreicherung oder zum Nachweis von RNA-Viren über das erfindungsgemäße Verfahren koppelbar.
Ein bevorzugtes Bindeagens, insbesondere für SARS-CoV-2, ist Angiotensin-Convertierendes-Enzym 2 (ACE2), sowie daraus abgeleitete Konstrukte, Multimere, Hybride, Derivate oder Fusionsproteine. Bevorzugt für die Kopplung an das Trägermaterial ist ein modifiziertes, mutiertes oder natives ACE2-Fusionsprotein, vorzugsweise ein Fc-ACE2-Fusionsprotein oder ein sonstiges Tag-markiertes ACE2-Fusionsprotein, das an das Tägermaterial bindet. Bei dem ACE2-Konstrukt kann es sich beispielsweise um ein modifiziertes ACE2-Fusionsprotein handeln, beispielsweise biotinyliertes Fc-ACE2 oder um Multimere.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Multimerisierung von Bindemolekülen vorgesehen. Jedes Oberflächenprotein eines erfindungsgemäßen RNA-Virus, vorzugsweise eines Coronavirus, liegt in einer Vielzahl von Kopien vor und kann zu einer gezielten Multimerisierung der Bindungspartner und demnach zu einer deutlich stärkeren Bindung von Viruspartikeln führen. Dies erfolgt zum einen durch direkte Bindung an in enger Nachbarschaft immobilisierte Moleküle auf dem Trägermaterial oder den Trägermaterialien, zum anderen alternativ oder zusätzlich über eine künstliche Multimerisierung dieser Moleküle. Im einfachsten Fall findet eine Dimerisierung statt (z.B. über den Fc-Teil). Denkbar sind auch komplexere Multimere, beispielsweise hervorgerufen über dendritische Strukturen. Bei einer genaueren Kenntnis der Virusoberfläche können zudem DNA-Origami gezielt angewendet werden, um das Bindeagens gezielt und virenspezifisch zu positionieren. Auch eine Kombination unterschiedlicher Bindeagensien ist möglich.
Die Kombination mehrerer Bindeagenzien führt über Aviditätseffekte zu einer stärkeren Bindung der RNA-Viruspartikel. Im Falle von SARS-CoV-2 ist eine einfache Umsetzung die gleichzeitige Immobilisierung von Fc-ACE2 und CR3022 an Protein A/G-Partikel. Zudem ist eine Bindung an Beads, d.h. Mikropartikeln, unterschiedlicher Größen möglich.
Die Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung sind auch für eine Multiplex-Anwendung bzw. einen Multiplex-Schnelltest geeignet, da das Verfahren den Nachweis von mehreren verschiedenen Krankheitserregern ermöglicht. Alternativ oder zusätzlich können in einer bevorzugten Variante fluoreszente Trägermaterialien eingesetzt werden, beispielsweise mit Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Beads. Das Multiplexing lässt sich über Oberflächen wie Glas oder Plastik auf einfache Weise realisieren, wenn die Probe auf unterschiedlichen Positionen auf der Oberfläche aufgetragen wird und eine anschließende Testung auf verschiedene Erreger erfolgt.
Das Detektieren von gefärbten Viruspartikeln erfolgt über physikalische, chemische oder biologische Detektionsmittel, wobei auch biotechnologische Detektionsmittel eingeschlossen sind. Ein Beispiel eines physikalischen Detektionsmittels ist die optische Erfassung von angefärbten Viruspartikeln, die an dem Trägermaterial gekoppelt sind. Dies kann beispielsweise über ein Mikroskop, FACS-Analysegerät oder über die Kamera eines Smartphones erfolgen. Über einen mikroskopischen Nachweis ist eine unspezifische Sichtbarmachung gebundener Viruspartikel möglich. Vorzugsweise kommen zum Nachweis der Viruspartikel RNA-Färbemittel oder Membran-Färbemittel zum Einsatz. Bevorzugte RNA-Färbemittel sind SYTOX™, SYBR™, insbesondere SYBR™-Gold, Acridin-Orange (3-N,3-N,6-N,6-N-Tetramethylacridin-3,6-diamin), Thiazol-Orange, DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol), 7-AAD (7-Aminoactinomycin D), Ethidiumbromid, Propidium-Iodid. Bevorzugte Membran-Färbemittel sind lipophile Membran-Farbstoffe wie Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorate), oder Carbocyanin-Farbstoffe wie DiOC5 und DiOC6.
Über einen mikroskopischen Nachweis kann die Spezifität der Detektion erhöht werden. Beispielhaft gezeigt wurde dies anhand der Bindung von Viren über ACE2 und die nachfolgende Sichtbarmachung gebundener Viren über Antikörper zum hochspezifischen Nachweis von SARS-CoV-2.
In einer bevorzugten Ausführungsform können auch mehrere Nachweisverfahren kombiniert werden, was zu einem stärkeren Fluoreszenzsignal bei Verwendung von fluoreszierenden Färbemitteln führt. Alternativ kann durch getrenntes Messen und darauffolgende Analyse der räumlichen Colokalisation die Spezifität des Nachweises erhöht werden.
Über die quantitative Untersuchung ist zudem eine Extraktion des Genoms aus den an dem Trägermaterial immobilisierten Virenpartikeln und ein Nachweis des Genoms beispielsweise über Sequenzierung, Multiplex- und Echtzeit-PCR oder sogenannter „loop-mediated isothermal amplification“ (LAMP) möglich. Die Vorbindung und damit verbundene Anreicherung der Viren erhöht die Spezifität und Sensitivität nachfolgender Nachweismethoden, was bedingt ist durch die Anreicherung aus einem hohen Probevolumen wie beispielsweise Umweltproben (beispielsweise bestehend aus Abwasser). Die starke spezifische Bindung der Krankheitserreger erlaubt es, durch die Art der zu analysierenden Probe immer vorhandene Unreinheiten durch die Durchführung von Waschschritten zu eliminieren. Dies ersetzt aufwändige Aufreinigungsschritte und erleichtert nachgeschaltete Nachweisverfahren, wie beispielsweise die quantitative PCR, die eine hohe Reinheit des zu analysierenden Materials erfordert.
Eine native Elution spezifisch angereicherter Krankheitserreger und die nachfolgende Analyse der Erreger oder deren Bestandteile vorzugsweise über Elektronenmikroskopie, Fluoreszenz-Mikroskopie, Massenspektrometrie, Proteomics, Sequenzierung, PCR, ELISA, Western Blotting, SDS PAGE, Chromatographie. Die auf diese Weise angereicherten Viren können selbst Ausgangspunkt für neue Methoden werden, beispielsweise zum Nachweis von Antikörpern in Seren von Patienten oder zur Anreicherung von Krankheitserregern im Rahmen der Herstellung von Impfstoffen. Die über spezifische Bindeagentien angereicherten Viruspartikel können auch ohne Elution, ähnlich einem ELISA, in einem weiteren Verfahrensschritt Antikörper von Testpersonen binden. Die gezielte Detektion gebundener Antikörper einer Testperson ermöglicht die Detektion von potentiell neutralisierenden Antikörpern in der untersuchten Probe. Der Nachweis des gebundenen Antikörpertyps (z.B. IgM, IgA oder IgG) erlaubt weitere Rückschlüsse über Zeitpunkt und Art des Infektionsverlaufs. Da das erfindungsgemäße Verfahren eine spezifische Anreicherung von Viruspartikeln in hoher Reinheit für nachfolgende Analysen erlaubt, ist auch eine milde Elution gebundener Viruspartikel durch Einführen einer Protease-Schnittstelle (z.B. TEV-Protease, SUMO-Protease) möglich. Alternative Methoden sind beispielsweise Strep-Tag/Strep-Tactin™ mit anschließender Elution über Biotin, geeignete Tags wie ALFA-Tag (Nano-Tag), FLAG-Tag und nachfolgende Elution durch das freie Peptid. Auch ein Poly-His-Tag und Elution über Imidazol sind vorstellbar.
Primäres Ziel der Erfindung ist der einfache, robuste, schnelle und gleichzeitig kostengünstige Nachweis von SARS-CoV-2-Viren im Speichel von Testpersonen, um infektiöse Personen zu identifizieren und eine weitere Ausbreitung von COVID-19 zu verhindern. Vorzugsweise werden die Verfahren und Kits der Erfindung daher zum Nachweis von SARS-CoV-2 eingesetzt, wobei als Bindeagens vorzugsweise Fc-ACE2 Fusionsprotein oder spezifische Antikörper gegen Oberflächenproteine von SARS-CoV-2 (wie beispielsweise CR3022) verwendet werden. Beim Nachweis von SARS-CoV-2 hat sich das Verfahren als überraschend effektiv herausgestellt, was ein gleichzeitiges Screening von vielen Testpersonen mit hohem Durchsatz in schneller und einfacher Weise möglich macht.
Für den Nachweis von SARS-CoV-2 wurden als Trägermaterial Streptavidin-Agarose oder Streptavidin-PMMA-Beads verwendet. Als Färbemittel kommt beispielsweise SYBR™-Gold für die Anfärbung viraler RNA zum Einsatz. Erfindungsgemäß wurde der Zelloberflächen-Rezeptor ACE2 als primäres Ziel für die Kopplung gewählt, da es sich um einen essentiellen Rezeptor für die Verbreitung der Viren in den Zielzellen handelt. Daher wird das Virus seiner Detektion auch nicht durch Mutation entkommen können. Bei der Nutzung von humanen Antikörpern ist von einem Selektionsdruck auszugehen, um der Erkennung durch das humane Immunsystem zu entgehen. Die Bindung an ACE2 wird davon nicht betroffen sein, möglicherweise jedoch andere Antikörper-Epitope.
Für den Nachweis wurde ein Fragment (Gln 18 - Ser 740) von humanem ACE2 verwendet, das mit SARS-CoV-2 interagiert. Anders gestaltete Fragmente des Proteins, die beispielsweise die ersten 17 Aminosäuren beinhalten und das Virus binden, sind in bevorzugten Ausführungsvarianten der Erfindung möglich. Zufällige oder gezielt erzeugte Varianten von ACE2 (wie beispielsweise Proteinfragmente oder Punktmutationen), die das Virus binden sind in bevorzugten Varianten der Erfindung einsetzbar, insbesondere wenn sie vorteilhafte Eigenschaften aufweisen wie beispielsweise eine höhere Bindungsstärke an SARS-CoV-2, eine höhere Stabilität oder eine einfachere Herstellung. Zu den möglichen Varianten zählen auch ACE2 Proteine aus anderen Organismen wie beispielsweise das ACE2 der Fledermäuse, die das natürliche Reservoir von SARS-CoV-2 darstellen oder ACE2 aus dem Rind.
Daraus folgt, dass der Test auch die Infektiosität der Viren widerspiegelt, denn sollte ein Faktor die Bindung der Viren an ACE2 verhindern, beispielsweise durch vorhandene IgA-Antikörper, ist davon auszugehen, dass die abgesonderten Viren eine deutlich geringere Infektiosität aufweisen. Als Negativkontrollen dienen zum einen Trägermaterialien ohne Agens, zum anderen Trägermaterialien, an denen ein Bindeagens gekoppelt ist, welches nicht spezifisch für den zu isolierenden Virus ist. Alternativ können Punktmutationen im humanen ACE2 gezielt eingeführt werden, um eine Bindung von SARS-CoV-2 zu unterbinden. Auch die Verwendung natürlich vorkommender ACE2-Sequenzen aus anderen Organismen, die nicht infiziert werden können, z.B. ACE2 der Maus, sind als Kontrollen möglich.
Für den Fachmann ist ersichtlich, dass die Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung nicht auf eine bestimmte Art von RNA-Viren beschränkt sind, sondern sich prinzipiell für den Nachweis unterschiedlicher Virusstämme eignen. Da insbesondere Stämme der Familie Coronaviridae ein hohes Gefährdungspotential für menschliche Populationen bergen, werden vorzugsweise Oberflächenproteine der Stämme HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV, SARS-CoV-2 als Target für die an das Trägermaterial zu koppelnden Bindeagensien gewählt.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae, umfassend ein Trägermaterial mit einem daran gekoppelten Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt, ein für eine Vergrößerungseinrichtung detektierbares Färbemittelmittel für das Virus zum Färben der an dem Trägermaterial immobilisierten Viren. Vorzugsweise ist zum Sichtbarmachen des Färbemittels für das menschliche Auge eine Vergrößerungseinrichtung vorgesehen. Diese kann auch Bestandteil eines Systems zum Nachweis von RNA-Viren sein, das die Merkmale des zuvor beschriebenen Kits aufweist. Für eine Identifizierung kann das Trägermaterial, wie anfangs beschrieben, mit Markersequenzen, insbesondere Oligonukleotiden, markiert sein.
Das Trägermaterial beim Kit liegt vorzugsweise in Form von Beads, Mikrosphären oder Mikropartikeln vor. Üblicherweise bestehen sie aus Glas, Polysterol, PMMA oder Copolymeren. Daneben sind auch Membranfragmente, Membranvesikel in Form von Kolloiden oder Kombinationen daraus vorstellbar. Die Partikel können beschichtet und/oder magnetisch, elektrisch leitfähig und/oder halbleitend sein. Die erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden Beads, Mikrosphären oder Mikropartikel können aus unterschiedlichen Materialien bestehen und sind vorzugsweise in etwa gleich große Partikel.
Die Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung schaffen die Voraussetzungen dafür, infektiöse Personen schnell nachzuweisen, was insbesondere für die Verhinderung einer Coronavirus-bedingten Ausbreitung essentiell ist. Es schafft die Voraussetzung dafür, langfristig auf drastische Maßnahmen wie die eines Lock-Downs verzichten zu können und ermöglicht einer Gesellschaft, trotz Fortbestehen der Pandemie zu einem weitgehend normalen Alltag zurückzukehren. Tests können großflächig angelegt werden, beispielsweise in Schulen oder Kitas, da Erkrankungen wie COVID-19 bei den dort anzutreffenden Personengruppen häufig asymptomatisch verlaufen.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Anreicherung von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae, umfassend

- Koppeln eines Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt und daran bindet, an ein Trägermaterial,
- Inkubieren des mit dem Bindeagens gekoppelten Trägermaterials mit einer virushaltigen Probe.

Vorzugsweise ist das Virus SARS-CoV-2 und das Bindeagens ACE2. Mit dem Verfahren lassen sich beispielsweise Proben von Abwässern analysieren, indem die darin enthaltenen Viruspartikel zunächst erfindungsgemäß angereichert und anschließend analysiert werden.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Figurenliste

1 zeigt SARS-CoV-2-Viruspartikel, die mit biotinyliertem Fc-ACE2 präinkubiert und mit PFA fixiert wurden. Die Virenpartikel binden an die Oberflächen von Streptavidin-Agarose-Trägermaterial.
2 zeigt, dass die über Fc-ACE2 gebundenen Virenpartikel über einen Antikörper gegen ein Oberflächenprotein von SARS-CoV-2 nachgewiesen werden können.
3 zeigt Beads als Trägermaterial, die mit Fc-ACE2 beschichtet sind und deren Eignung zur spezifischen Bindung von SARS-CoV-2, nicht jedoch von Adeno- oder Influenzavirus-Partikeln

Beispiele:
Bindung von SARS-CoV-2-Partikeln an Streptavidin-Agarose
0,5 ml Zellkulturüberstand mit 10⁶ SARS-CoV-2-Partikeln wurden aufgetaut. Um endogenes Biotin zu entfernen, wurde dieser mit 10 µl (Bettvolumen) HC-Streptavidin-Agarose gemischt und für 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Beads mit gebundenem Biotin wurden entfernt, indem die Suspension über eine Mobicol-Minisäule mit eingesetztem 10 µm-Filter geleitet wurde. Der Durchfluss wurde in einem 2 ml Eppendorf-Röhrchen aufgefangen und 1,1 µg biotinyliertes Fc-ACE2 hinzugefügt. Die Lösung wurde gründlich gemischt und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die gesamte Mischung, die das Virus mit gebundenen biotinylierten Fc-ACE2 enthielt, wurde durch Zugabe von 0,5 ml 4%igem PFA (gelöst in PBS) fixiert, gefolgt von einer 30 Min.-Inkubation bei Raumtemperatur.
Nichtreagiertes PFA wurde durch Zugabe von 1 ml PBS mit 750 mM Tris/HCI pH 7,5 und Inkubation für 30 Min. bei Raumtemperatur gequencht. 0,5 µl (Bettvolumen) HC-Streptavidin-Agarose wurden zugegeben und die Mischung für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter konstanter sanfter Bewegung inkubiert. Die Beads wurden durch milde Zentrifugation (15' 500 rcf im Ausschwingrotor) gesammelt und anschließend 5x mit 500 µl PBS gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen. Die Beads wurden in 500 µl PBS resuspendiert.
Bindung von SARS-CoV-2-Partikeln an PMMA-Mikropartikel
40 µl Streptavidin-PMMA-Beads wurden mit 6 µg biotinyliertem Fc-ACE2 in einem Gesamtvolumen von 100 µl PBS inkubiert. Zur Entfernung ungebundener Proteine wurden die Beads mit PBS in Mobicol-Minisäulen mit eingesetzten 10 µm Filtern gewaschen. Die Beads wurden in 0,5 ml PBS mit 0,1% BSA resuspendiert.
0,5 ml Zellkulturüberstand mit 10⁶ SARS-CoV-2-Partikeln wurden aufgetaut und zu 12,5 µl PMMA-Beads (mit ca. 2000 Beads) mit vorgebundenem Fc-ACE2 gegeben. Die Suspension wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter konstanter sanfter Bewegung inkubiert. Beads mit gebundenen Viruspartikeln wurden gesammelt und mit PBS mit 0,1% BSA in Mobicol-Minisäulen mit eingesetzten 10 µm Filtern gewaschen. Die Beads wurden in 250 µl PBS mit 0,1% BSA resuspendiert und zur Inaktivierung der Viren durch Zugabe von 250 µl 4%igem PFA (gelöst in PBS) fixiert, gefolgt von einer 30 Min.-Inkubation bei Raumtemperatur. Die Beads wurden mit PBS mit 0,1% BSA sowie mit PBS mit 50 mM Tris/HCI pH 7.5 gewaschen.
Sichtbarmachung von SARS-CoV-2 Partikeln über Anfärbung des viralen Genoms
Gebundene Viruspartikel wurden mit SYBR™ Gold in einer Endverdünnung von 1:50.000 in einem Endvolumen von 200 µl PBS angefärbt. 50 µl der Bead-Suspension wurden in eine Vertiefung eines µ-Slides überführt und Bilder der abgesetzten Beads wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica TCS SP5) aufgenommen.
Sichtbarmachung von SARS-CoV-2 Partikeln über Immunmarkierung
Beads mit gebundenen Viruspartikel wurden für 30' in PBS mit 0,2% BSA bei Raumtemperatur inkubiert. Darauf folgte eine zweistündige Inkubation mit dem Erstantikörper (monoklonaler SARS-CoV-2 Spike Antikörper [1A9] aus der Maus, angewandt in einer Endkonzentration von 5 µg/ml in PBS mit 0,2% BSA) bei Raumtemperatur. Nach zwei kurzen Waschschritten (2x 250 µl, jeweils 10') wurden die Beads mit Zweitantikörper (Alexa488-markierter anti-Maus IgG (H+L), gewonnen in der Ziege, in einer Endkonzentration von 5 µg/ml in PBS mit 0,2% BSA) inkubiert. Nach zwei kurzen Waschschritten (2x 250 µl, jeweils 10') wurde die Beadsuspension in eine Vertiefung eines µ-Slides überführt und Bilder der abgesetzten Beads wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica TCS SP5) aufgenommen.
Materialien
Biotinyliertes humanes Fc-ACE2: ACE2 (Gln 18 - Ser 740, Q9BYF1-1) - Fc (Pro 100 - Lys 330, P01857) - Avi; ACROBiosysteme (Kat. AC2-H8F9)
HC (High Capacity) Streptavidin-Agarose: Vernetzte 6%ige Perl-Agarose, mittlere Partikelgröße 45 - 165 µm, Volumenharz, Kapazität > 100 µg Biotin/ml Harz; ThermoScientific (Kat. 20357)
Streptavidin-PMMA-Kügelchen, 21 µm funktionalisierte monodisperse PMMA-Mikropartikel (PolyAn Kat. 105 21 020)
Mobicol Mini-Säulen mit eingesetztem kleinen 10 µm Filter und Luer-Lock-Kappe; MoBiTec (Kat. M105010S und Kat. M3009)
SYBR Gold-Nukleinsäurefärbung, Konzentrat in DMSO; ThermoScientific (Kat. S11494)
SARS-CoV / SARS-CoV-2 (COVID-19) spike antibody [1A9]; Biozol (Kat. GTX-GTX632604); Hersteller: Genetex; Wirt: Maus; Klon 1A9, Isotyp IgG1
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488; ThermoScientific (Kat. #A-11029)
µ-Objektträger Angiogenese Glasboden; Ibidi Kat. 81507
Ausführliche Figurenbeschreibung:
1 zeigt die spezifische Anreicherung und Färbung von SARS-CoV-2 Viren. Die spezifische Interaktion zwischen humanem ACE2 und den Spikes von SARS-CoV-2 ist unabdingbar für die virale Bindung an humane Zellen und deren nachfolgende Infektion. Um zu testen ob diese Interaktion für die Anreicherung von Viren an Trägermaterialien genutzt werden kann, wurden in Zellkultur gewonnene SARS-CoV-2 Viren mit rekombinantem biotinyliertem Fc-ACE2 inkubiert. Die Lösung wurde fixiert und überschüssiges Fixativ gequencht. Anschließend wurde die Lösung mit Streptavidin-Agarose-Partikeln inkubiert, nichtgebundenes Material wurde abgetrennt und auf den Beads gebundene Viren mit SYBR Gold angefärbt. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse erfolgte durch konfokale Laserscanning Mikroskopie. Zu sehen ist eine Maximumprojektion eines aufgenommenen Bildstapels (verschiedene Ebenen in z). Diese vermittelt einen repräsentativen Eindruck von der Oberfläche eines Streptavidin-Agarosepartikels. Die für RNA-Viren typischen punktförmigen Fluoreszenzsignale befanden sich stets auf der Oberfläche und wie aufgrund der Größe der SARS-CoV-2 Viren zu erwarten nie im Innern der porösen Agarosepartikel. Diese Beobachtung legt nahe, dass es sich um eine spezifische Färbung intakter SARS-CoV-2 Viren handelt. Darüber hinaus zeigten Viren, die nicht mit biotinyliertem Fc-ACE2 präinkubiert wurden, keine Anreicherung auf der Oberfläche von Streptavidin-Agarosepartikeln (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass ACE2 genutzt werden kann, um Viren aus einer verdünnten Lösung spezifisch anzureichern und über fluoreszente Markierung des viralen Genoms sichtbar zu machen.
2 zeigt die Immunmarkierung von angereicherten SARS-CoV-2 Viren. Neben der Färbung des viralen Genoms stellt die Immunmarkierung von gebundenen Viren eine einfache Alternative zur Detektion von an einem Trägermaterial (hier: Agarose Beads) gebundenen Virenpartikeln dar. Die Verwendung von Antikörpern erhöht dabei die Spezifität des Virusnachweises. Darüber hinaus kann in Abhängigkeit des gewählten Detektionsverfahren auch eine Steigerung der Sensitivität erzielt werden. Die Machbarkeit eines solchen Verfahrens wurde an Agarose-Beads geprüft, an denen im Vorfeld mit der für 1 beschriebenen Methode Viren angereichert wurden. Im Rahmen einer Immunfluoreszenz wurden die mit SARS-Cov-2 bedeckten Viren mit einem monoklonalem Maus-Antikörper gegen SARS-CoV-2 Spikes inkubiert. Als Zweitantikörper fungierte ein Alexa488-markierter polyklonaler Antikörper gegen Maus IgGs. Die Analyse erfolgt durch konfokale Laserscanning Mikroskopie. Zu sehen ist eine Maximumprojektion eines aufgenommenen Bildstapels (verschiedene Ebenen in z). Diese vermittelt einen repräsentativen Eindruck von der Oberfläche eines Streptavidin-Agarosepartikels. Das aufgenommene punktförmige Muster entspricht der Dichte an Viren, die in parallel durchgeführten Färbungen des viralen Genoms bestätigt werden konnte. Dabei ist das durch die Immunmarkierung erzielte Signal stärker als das durch SYBR Gold erhaltene Signal, bei geringerem Hintergrund. Dies zeigt, dass eine nachträgliche Detektion gebundener Viren mit Hilfe eines spezifischen Bindeagens (hier ein Antikörper) eine Alternative zur in 1 gezeigten Färbung des viralen Genoms darstellen kann. Die Signalstärke lässt sich hierbei weiter erhöhen, beispielsweise indem zusätzliche Fluoreszenzfarbstoffe eingebracht werden oder verschiedene Färbemethoden kombiniert werden. Auch die Nutzung enzymatischer Aktivitäten wie beispielsweise der Meerrettich-Peroxidase, der Luciferase oder der alkalischen Phosphatase erlaubt eine gezielte Verstärkung des Signals für die hochsensitive Detektion von an das Trägermaterial gebundener Viren.
3 zeigt die hochspezifische Bindung von SARS-CoV-2 an Fc-ACE2-beschichtete Beads als Anreicherungsmethode und diagnostisches Werkzeug. Die in 1 und 2 beschriebenen Experimente beinhalten eine Vorinkubation zwischen SARS-CoV-2 mit einem Überschuss an rekombinantem biotinyliertem Fc-ACE2. Um diesen Arbeitsschritt zu umgehen und um mit einer geringeren Konzentration von Bindeagens (hier: biotinyliertes Fc-ACE2) auszukommen, wurde getestet, ob Partikel, die bereits mit Bindeagentien beschichtet sind, geeignet sind, Viren auf ihrer Oberfläche anzureichern. Zu diesem Zweck wurden Streptavidin-PMMA Beads mit biotinyliertem Fc-ACE2 beschichtet. Die so beschichteten Beads wurden mit SARS-CoV-2 inkubiert, um die Bindung von Viren zu ermöglichen. Zur Analyse der Spezifität wurden die gleichen Beads mit Influenzaviren oder Adenoviren inkubiert. Als weitere Negativkontrolle dienten Streptavidinpartikel, die nicht mit Fc-ACE2 vorbeschichtet wurden. Nach Inkubation wurden die Beads gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen. Die Beads mit gebundenen Viren wurden mit PFA fixiert. Gebundene Viren wurden über den Nukleinsäurefarbstoff SYBR Gold angefärbt und fluoreszenzmikroskopisch durch konfokale Laserscanning Mikroskopie sichtbar gemacht. Für eine bessere Vergleichbarkeit ist jeweils nur ein einzelner konfokaler Schnitt gezeigt, der mit identischen Mikroskopeinstellungen aufgenommen wurde. Die Abbildungen zeigen PMMA Partikel, das jeweils repräsentativ für andere analysierte Partikel der jeweiligen experimentellen Bedingung sind. Gebundene Viren erscheinen als fluoreszente Partikel auf der Beadoberfläche. Die Bindung von SARS-CoV-2 Viren benötigte die Anwesenheit von Fc-ACE2. Weder Influenzaviren noch Adenoviren wurden über Fc-ACE2 an Beads gebunden. Fc-ACE2 beschichtete Beads erlauben somit die selektive Anreicherung von SARS-CoV-2 Viren und bilden die Grundlage für eine sensitive Diagnostik z.B. über die Anfärbung des viralen Genoms mittels SYBR Gold, über eine Immunmarkierung der Viren oder über nukleinsäurebasierte Diagnostik wie etablierte PCR-basierte Nachweisverfahren.
Das Experiment zeigt die hochspezifische Bindung von Viren an Partikel, die mit einem Bindeagens vorbeschichtet sind. Das durch die Vorbeschichtung Entfallen eines Arbeitsschrittes vereinfacht den Test und macht ihn weniger fehleranfällig. Zudem ist im Vergleich zum vorigen Experiment der Materialaufwand für einen einzelnen Test um einen Faktor von 10-100x verringert. Die Nutzung von ACE2-beschichteter Beads schafft darüber hinaus die Voraussetzung, über eine mögliche Regeneration und annähernd unbegrenzter Wiederverwendung der Partikel den Bedarf an Bindeagens auf ein Minimum zu reduzieren.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1493822 A1 [0010]
EP 2023142 A1 [0010]

Claims

Verfahren zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae, umfassend - Koppeln eines Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt und daran bindet, an ein Trägermaterial, - Inkubieren des mit dem Bindeagens gekoppelten Trägermaterials mit einer virushaltigen Probe, - Färben der an dem Trägermaterial immobilisierten Viren mit einem Färbemittel für das Virus, - Detektieren von gefärbten Viruspartikeln über ein physikalisches, chemisches oder biologisches Detektionsmittel.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindeagens ein Antikörper oder ein Antikörperfragment gegen ein Oberflächenprotein des Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Virus um einen Virus der Stämme HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV, SARS-CoV-2.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindeagens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Antikörpern oder Antikörperfragmenten CR3022, CR3022-RB, Spike-Antikörper, Spike S1-Antikörper, Spike S2-Antikörper, Envelope-Antikörper, anti-M-Antikörper, anti-S-Glykoprotein-Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindeagens das Zelloberflächenprotein Angiotensin-Convertierendes-Enzym 2 (ACE2), ein ACE2-Konstrukt oder ein ACE2-Fusionsprotein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägermaterial um Polymethylmethacrylat (PMMA)-Mikropartikel, Polyethylen (PE)-Mikropartikel, Polypropylen (PE)-Mikropartikel, Polystyrol (PS)-Mikropartikel, carboxylierte oder aminierte Latex-Partikel, Polydimethylsiloxan (PDMS)-Mikropartikel, Celluloseacetat-Mikropartikel, zyklisches Olefin-Copolymer- (COC) Mikropartikel, Protein A/G-Partikel, Agarose-Mikropartikel, magnetische Mikropartikel, ein Hydrogel, ein Sol-Gel, ein poröses Polymer-Monolith, ein poröses Silikon, Beads oder eine Membran handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Färbemittel um SYTOX™, SYBR™, Acridin-Orange (3-N,3-N,6-N,6-N-Tetramethylacridin-3,6-diamin), Thiazol-Orange, DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol), 7-AAD (7-Aminoactinomycin D), Ethidiumbromid, Propidium-Iodid, ein enzymatisches oder Fluoreszenz-gekoppeltes Färbemittel oder ein Membran-Färbemittel handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem physikalischen Detektionsmittel um ein FACS-Analysegerät, ein Mikroskop oder eine Kamera und/oder das menschliche Auge und/oder bei dem biologischen Detektionsmittel um ein Konjugat- oder Marker- gekoppeltes weiteres sekundäres Bindeagens handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Probe um ein Körpersekret wie Speichel, Blutserum, Vollblut, Sputum, Urin, Tränenflüssigkeit, Faezes, eine Spülung oder Abstrich (insbesondere aus Mund, Nasen und/oder Rachen) oder eine Gurgelprobe handelt.
Kit zum Nachweis von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae, umfassend - ein Trägermaterial mit einem daran gekoppelten Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt, - ein für eine Vergrößerungseinrichtung detektierbares Färbemittelmittel für das Virus zum Färben der an dem Trägermaterial immobilisierten Viren.
Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zum Sichtbarmachen des Färbemittels für das menschliche Auge eine Vergrößerungseinrichtung vorgesehen ist.
Kit nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial mit Oligonukleotiden markiert sind.
Verfahren zur Anreicherung von RNA-Viren, insbesondere Viren der Familie Coronaviridae, umfassend - Koppeln eines Bindeagens, das spezifisch eine Proteinkomponente des Virus erkennt und daran bindet, an ein Trägermaterial, - Inkubieren des mit dem Bindeagens gekoppelten Trägermaterials mit einer virushaltigen Probe.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus SARS-CoV-2 und das Bindeagens ACE2 oder ein davon abgeleitetes Konstrukt ist.