CN104066497A - 具有亲水性涂层的多孔膜及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种包含接枝到多孔膜的聚合亲水性涂层的改性多孔膜。所述接枝到多孔膜的聚合亲水性涂层包含例如PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET，其中在多孔膜上的所述聚合亲水性涂层降低不期望的材料与多孔膜的非特异性结合并且在免疫测定、体外诊断测试和护理点测试中提高信号与噪声比。还公开了制备这些改性多孔膜的方法。

Description

具有亲水性涂层的多孔膜及其制备和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月30日提交的美国专利申请号13/340,793和2012年1月31日提交的13/362,793的优先权；它们的公开内容通过引用而全文结合到本文中。
发明领域
本公开总体涉及永久接枝亲水性涂层的多孔膜，使得与多孔膜的非特异性结合最小化，该多孔膜用于在多孔膜上固定一种或多种特定的生物分子供进一步分析。还描述了制备和使用具有这些亲水性涂层的改性多孔膜的方法。
背景
多孔膜(例如硝化纤维素膜)常规地用于多种过程，包括需要固定一种或多种生物分子的生物学应用。这些生物分子包括但不限于蛋白质(例如，抗体)和核酸(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。本领域描述了能够既固定关注的特定生物分子又同时使干扰性能的各种分子的非特异性结合最小化的膜，所述性能为例如免疫测定、体外诊断测试(特别是护理点诊断方法)和在生物学样品(例如，血液、尿、唾液、痰、其它身体分泌物、细胞和组织样品)中分析物或生物分子分离的性能。发现这样的膜用于多种生物学过程和医疗技术。
硝化纤维素膜呈现硝化纤维素膜和生物分子之间基本上非特异性的相互作用。研究人员传统上依赖该被动关联作为在多种“捕集”类型固定方法中使用硝化纤维素膜的基础。然而，对硝化纤维素膜和关注的生物分子之间的该被动相互作用的依赖导致在许多生物学应用中成功使用硝化纤维素膜的复杂化。该技术必然限制可在硝化纤维素膜上固定的生物分子的量，同样有问题的是，还允许不期望的分子(例如，不是关注的生物分子)与硝化纤维素膜的非特异性结合。降低非特异性结合将允许提高关注的生物分子与硝化纤维素膜的特异性结合并且还降低信号(例如，期望的生物分子与硝化纤维素膜的期望的结合)与噪声(例如，不期望的材料与硝化纤维素的非特异性结合)比。降低信号与噪声比将提高例如免疫测定、体外诊断测试(特别是护理点诊断方法)和在生物学样品(例如，血液、淋巴、尿、唾液、痰、其它身体分泌物、细胞和组织样品)中分析物或生物分子与其它材料的分离方法的性能和灵敏度。本领域中描述了在例如免疫测定中降低信号与噪声比。
本领域需要将多孔膜改性(例如，化学改性)的新的组合物和方法，以改进关注的生物分子(例如，蛋白质和核酸)与多孔膜基底的固定和结合。这样的改性多孔膜(包括改性的硝化纤维素膜)适用于例如免疫测定、体外诊断测试(例如，护理点诊断应用)和在生物学样品中分离关注的生物分子的技术。本领域需要涂布有化合物以降低与膜的非特异性结合的多孔膜，更特别是硝化纤维素膜。这样的膜将改进例如许多免疫测定的性能和灵敏度。
本领域需要将多孔膜(例如，硝化纤维素膜)改性(例如，化学改性)以降低不期望的材料与多孔膜基底的非特异性结合的新方法。涂布有化合物以降低与膜的非特异性结合的多孔膜(更特别是硝化纤维素膜)将是有利的。相对于在使用未改性的多孔(例如，硝化纤维素膜)实施的免疫测定中观察到的，通过降低与膜的非特异性结合，通过潜在地消除对于例如在免疫测定中使用以使非特异性结合最小化的传统阻断剂的需要，和通过提高信号与噪声比，这样的膜将改进例如许多免疫测定的性能和灵敏度。
概述
本文描述改性多孔膜，特别是硝化纤维素膜。在一个具体的实施方案中，硝化纤维素膜包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层。聚合亲水性涂层通常与硝化纤维素膜永久(例如，共价)键合。聚合亲水性涂层可通过任何方法与硝化纤维素膜键合，包括通过使多孔(例如，硝化纤维素)膜暴露于电子束(电子束)辐射。
本文的组合物包括改性多孔膜，例如硝化纤维素膜，其包含通常与膜永久键合的聚合亲水性涂层。所述组合物适用于依赖一种或多种生物分子例如蛋白质(例如，抗体)和核酸(例如，DNA或RNA)与多孔膜(包括但不限于硝化纤维素膜)结合的方法。在特定的方面，所述组合物用于免疫测定、体外诊断测试、从生物学样品(例如，血液、尿、唾液、痰和细胞或组织的样品)鉴定或分离关注的生物分子的技术，和需要在多孔膜基底(如硝化纤维素膜)上固定生物分子的各种其它生物学方法。多孔膜(特别是硝化纤维素膜)包含与膜键合的聚合亲水性涂层，其中所述膜降低不期望的材料与多孔膜(更特别是硝化纤维素膜)的非特异性结合。在本文描述的硝化纤维素膜上的聚合亲水性涂层可包括但不限于聚乙二醇(PEG)部分、聚乙烯醇、羟基、带负电荷的离子基团、带正电荷的离子基团、两性离子基团，或它们的任何组合。
附图
当参考附图，阅读以下详细说明时，化学改性的多孔膜的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，其中由始至终在附图中，相似的符号代表相似的部件，其中：
图1示意性表示通过电子束辐射在硝化纤维素膜上的聚合亲水性涂层的机构。
图2提供使用本文描述的改性多孔膜的受孕测试的结果。测定的细节和结果的解释在实施例4中陈述。
详述
本文提供包含至少一个与多孔膜(例如，硝化纤维素膜)键合的聚合亲水性涂层的改性多孔膜(特别是硝化纤维素膜)。多孔膜(例如硝化纤维素膜)传统上用于在多孔固体基底上固定生物分子(例如，DNA、RNA或蛋白质)。本文使用的术语“改性”，特别是提及所公开的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)时，旨在包括对膜的任何改变，例如，对初始的未改性的膜的化学改变。本发明的“改性”多孔膜(例如，硝化纤维素膜)可为包含通过电子束辐射接枝到硝化纤维素膜的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜，如以下描述。亲水性涂层包含例如聚乙二醇部分、聚乙烯醇、羟基、带负电荷的离子基团、带正电荷的离子基团、两性离子基团，或它们的任何组合。在某些方面，聚合亲水性涂层包含PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET。本公开包括所有分子量的PEG部分。
包含聚合亲水性涂层的示例性改性多孔膜的示意图在以下提供并且在图1中陈述。如图中所示，在某些方面，本公开的多孔膜具有式(I)的结构，其包括接枝到多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的聚合亲水性涂层，其中所述聚合物亲水性涂层包含：1)电子(电子束)反应性部分的可变长度链单体的聚合物(标记为聚(A)x，其中x为存在的聚合物的数量，并且范围为1、2、3、4，持续到包括所有整数；2)在(聚(A)x)之间形成键合的键；和3)标记为B基团的官能团，其促进与化学基团(例如，在关注的生物分子上存在的胺基)的反应，从而促进在多孔膜上固定生物分子。聚合亲水性涂层(例如，在以下示意图中标记的“聚(A)x-键-B”)包含数个组分(例如，聚(A)x聚合物、键和官能部分B)，并且接枝(例如，共价键合)到多孔膜。参见以下和图1关于聚合亲水性涂层的组分和功能的更详细的描述。
为了更清楚和简明地描述和指出要求保护的本发明的主题，对于用于以下说明和所附权利要求的特定术语提供以下定义。在整个说明书中，特定术语的举例应看作是非限制性实例。
本文使用的术语“非特异性结合”指在多孔膜(例如，硝化纤维素膜)上生物分子的连接，其通过生物分子和膜的被动相互作用而发生，并且独立于生物分子和膜之间的任何特定的主动相互作用。“非特异性结合”还通常称为与多孔膜(特别是硝化纤维素膜)的“背景结合”。非特异性结合的一个实例包括仅由在溶液中随机相遇而引起的DNA分子与硝化纤维素膜的连接。
本文使用的术语“改性的”，特别是提及所公开的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)时，旨在包括对膜的任何改变，例如，对初始的未改性的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)基底的化学改变。本文陈述的“改性”多孔膜(更特别是硝化纤维素膜)可为包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的改性(例如，化学改性)硝化纤维素膜。在具体的实施方案中，聚合亲水性涂层包含PEG部分，包括但不限于PEGMA、PEGDA或TMPET。
还提供了用于制备具有与多孔膜(例如，硝化纤维素膜)键合(通常永久键合)的聚合亲水性涂层的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的方法。在一些实施方案中，如下使聚合亲水性涂层在多孔膜(例如硝化纤维素膜)上键合：提供未改性的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)，在亲水性化合物的含水溶液中浸没膜，和使膜暴露于电子束辐射，从而在多孔膜(例如，硝化纤维素膜)上使亲水性涂层聚合。例如，使硝化纤维素膜浸没在亲水性化合物(例如，PEG部分，例如PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液中，随后经历电子束辐射。或者，在本发明的其它方面，如下制备改性多孔膜，首先使多孔膜(例如，硝化纤维素膜)经历电子束辐射，接着在亲水性化合物(例如PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液(例如，A-键-B的含水溶液)中浸没膜。本公开包括生产本文描述的改性多孔膜(例如，硝化纤维素膜)基底的方法，例如，采用浸没和电子束辐射步骤的方法步骤的顺序。
如以下更详细描述的，当在用于制备改性多孔膜的方法的情境中使用时，术语在例如亲水性化合物(例如PEG部分，特别是PEGMA、PEGDA或TMPET，如在权利要求书中叙述)的含水溶液中“浸没”多孔膜通常通过以下实现：在亲水性化合物(例如，PEG部分，包括但不限于PEGMA、PEGDA或TMPET)的含水溶液中浸渍整个多孔膜(更具体为硝化纤维素膜)，随后除去任何过量的溶液。
虽然在整个本申请中叙述硝化纤维素膜，但是本公开包括各种多孔膜。仅为了示例性目的并且无任何预期限制，未改性的多孔膜可包括纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚(四氟乙烯-共聚-六氟丙烯)膜，或上述多孔膜的两种或更多种的任何组合。
硝化纤维素膜目前广泛用于多种需要在固相材料上固定特定的生物分子(例如，DNA、RNA或蛋白质例如抗体)的生物学应用。“多孔膜”旨在不带限制地表示任何多孔膜，包括任何市售可得的或非市售可得的多孔膜，特别是硝化纤维素膜，更特别是市售可得的硝化纤维素膜。在本公开的某些方面，如在图1中陈述的，将硝化纤维素膜化学改性，以包含PEG的聚合亲水性涂层，其中所述聚合亲水性涂层降低与硝化纤维素膜的非特异性结合。由硝化纤维素聚合物制备的硝化纤维素膜对于DNA、RNA和蛋白质具有强亲和力，并且防止这些生物分子变性。
本申请使用的“硝化纤维素膜”包括含有任何氮浓度、多种多样的孔尺寸和可变的膜厚度的所有那些多孔膜产品。在特定的实施方案中，多孔膜的孔尺寸可在0.01-50微米范围。此外，在整个多孔膜中孔直径可为均匀的，或者，孔直径可为不规则的。选择具有适当的氮含量、孔尺寸和膜厚度的硝化纤维素膜以实现特定的期望结果，完全在本领域技术人员的技术和知识以内。此外，专业技术人员将立即理解和认识到短语“硝化纤维素膜”的含义，并且这样的硝化纤维素膜包括例如市售可得的硝化纤维素膜，可为“无背衬”膜，或者含有“背衬材料”或“背衬支撑”例如聚酯(PE)。关于是使用“无背衬”还是“背衬”多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的选择取决于要实施的具体应用，并且进行这样的选择完全在本领域普通技术人员的知识以内。
具有任何氮浓度、孔尺寸或存在或不存在背衬支撑的硝化纤维素膜均包括在本文使用的术语“硝化纤维素膜”中。硝化纤维素膜具有多种化学和物理性质，并且常规地用于需要例如将关注的生物分子(例如，DNA、RNA或蛋白质例如抗体)固定到多孔膜(例如，硝化纤维素膜)，或用于在这样的膜上收集生物分子以在待分析的生物学样品中将它们与其它蛋白质、核酸和生物分子等分离的生物学技术。任何硝化纤维素膜可用于本公开。
虽然在整个本申请中提及多孔膜，但组合物、制备方法和使用方法同样适用于可用于固定生物分子的其它固相材料，如在本文的权利要求所叙述。这样的固相材料包括但不限于玻璃珠、玻璃纤维、胶乳珠、结节、饼、纳米颗粒、空心膜管，和上述固相材料的两种或更多种的任何组合。本领域技术人员将能选择适用于特定的使用方法(例如，免疫测定)的多孔膜(特别是硝化纤维素膜)。虽然多孔膜(例如，硝化纤维素膜。在本发明的某些方面，硝化纤维素膜的孔尺寸在0.01-50 μm范围。
术语“生物学样品”包括但不限于得自人或非人生物体的血液、血清、淋巴、唾液、粘液、尿、其它身体分泌物、细胞和组织部分。生物学样品可由自身经历诊断测试(例如，血糖监测)的个体或由经过训练的医疗专业人员通过多种技术得到，所述多种技术包括例如用针吸出血液，或者刮或擦特定的区域，例如患者皮肤上的伤口。用于收集各种生物学样品的方法为本领域公知的。
本文使用的“免疫测定”在其最宽的含义内包括基于抗体及其相应的抗原之间的相互作用的任何技术。这样的测定基于抗体以高特异性与一组或非常有限组的类似分子(例如，抗原)结合的独特能力。与抗体结合的分子称为抗原。可使用抗原或抗体作为“捕获”分子来“俘获”抗体-抗原对的其它成员，进行免疫测定。本文使用的术语“免疫测定”还包括利用抗体来检测生物学样品(例如，生物化学反应的代谢物)中的非蛋白质生物分子的那些测定。
免疫测定的示例性但非穷尽的列举包括侧流测定(例如，家庭受孕测试)、放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。该领域专业技术人员具有选择和实施适当的方法用于具体的情况所需的技术，以及实施这些免疫测定的技术，以及解释结果的技术。免疫测定可产生定性或定量的结果，取决于选择的具体的检测方法。
侧流测定为常见的免疫测定，主要是由于其容易使用，并且包括例如市售可得的家庭-受孕测试和常规药物测试的产品。侧流测定是特别有利的，因为装置和方法通常简单使用并且简单解释测试结果，即使由没有接受正式医疗训练的个体进行。侧流装置和方法旨在检测在生物学样品(例如，尿)中存在或不存在靶分析物或生物分子(例如，在侧流家庭受孕测试中的人绒膜促性腺激素(hCG))。虽然在侧流装置和测定中存在变化，但这些测试常用于家庭测试、护理点测试和实验室使用。侧流测定通常以方便的“量尺”形式呈现，如在以下实施例中描述的，其中待测试的生物学样品通过毛细作用沿着固体基底(例如，多孔膜，通常为硝化纤维素膜)流动。在某些形式的侧流测定中，将量尺浸没在生物学样品中，当生物学样品向上流动到测试条纹时，其遇到事先印在量尺上的一种或多种试剂，从而遇到已事先印有例如抗体或抗原(例如，hCG)的测试条纹上的线或区域。当生物学样品遇到该试剂时，产生信号以指示对于分析物或关注的生物分子的存在，该测试为阳性还是阴性(例如，通常在家庭受孕测试中，在检测hCG中，裸眼可见的线指示患者的尿中存在hCG)。
侧流装置和方法为本领域公知的。参见，例如，美国专利号4,094,647；4,313,734；4,857,453；5,073,484；5,559,041；5,571,726；5,578,577；5,591,645；6,187,598；6,352,862；和6,485,982；均通过引用而全文结合到本文中。在已知的例如侧流装置和测定中包括本公开的改性多孔膜(例如包含亲水性聚合物的聚合涂层的改性硝化纤维素膜)将显著改进这样的侧流装置和免疫测定的性能、灵敏度和特异性，降低得到准确测试结果所需的分析物或生物分子的浓度，和降低检测存在或不存在分析物或生物分子的时间，从而使获得测试结果所需的时间最小化。
所有抗体为蛋白质，更尤其是糖蛋白，并且对关注的抗原(例如，多肽的一部分)呈现结合特异性。术语“抗体”以最宽的含义使用，并且涵盖完全装配的抗体、可结合抗原的抗体碎片(例如，Fab'、F'(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)和包含前述的重组体肽。“抗体碎片”包含完整的抗体的一部分，优选完整的抗体的抗原-结合的或可变的区域。抗体碎片的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv碎片、双抗体和线性抗体(Zapata等人(1995) Protein Eng. 8(10):1057 1062)、单链抗体分子和由抗体碎片形成的多-特异性抗体。任何抗体或抗体碎片可用于本发明的实践。
在本发明的某些方面，需要检测在固相材料(包括但不限于硝化纤维素膜)上结合或固定的抗体。所公开的发明包括本领域已知的用于检测与硝化纤维素膜结合的抗体的任何方法。适当的抗体结合检测技术的确定和优化为标准的，并且完全在本领域技术人员的常规能力以内。在一些实施方案中，通过使抗体与可检测物质偶联，可促进检测抗体结合。可检测物质的实例包括各种酶、修复基团、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。示例性合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱脂酶；合适的修复基团复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；可与抗体偶联的可检测的发光材料包括但不限于鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；而用于检测抗体结合的合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
包含例如PEG的聚合物涂层的改性多孔膜可被进一步改性，以包含在多孔膜上固定的亲水性化合物。在包含聚合涂层的改性多孔膜上引入亲水性化合物可用作阻断剂，以降低与多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的非特异性背景结合。使与多孔膜的非特异性背景结合最小化改进信号与噪声比，例如在免疫测定中，该免疫测定基于在多孔膜上固定的抗体的特定相互作用和样品(正在对其分析该生物分子的存在或量)中的关注的特定生物分子(例如，蛋白质)。
在本发明的某些方面，如上所述，使用亲水性化合物的含水溶液制备要求保护的改性硝化纤维素膜。亲水性化合物的溶液还可包含助溶剂，以改进亲水性化合物在水中的溶解度。例如，表面活性剂更特别是非离子表面活性剂(例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM))可用作助溶剂，以提高例如PEG在水中的溶解度。本领域技术人员将认识到必须通过实验确定和优化提高例如PEG (例如，PEGMA、PEGDA或TMPET)的溶解度所需的特定助溶剂(例如，非离子表面活性剂，例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM))的适当量。
选择在多孔膜(特别是硝化纤维素膜)上接枝聚合物涂层的方法中使用的电子束辐射的剂量，使得与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的量最大化，同时还限制已知由电子束辐射引起的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)的降解。本领域技术人员将认识到，用于制备本发明的改性多孔膜的电子束辐射的适当剂量需要通过实验优化。在具体的实施方案中，在制备改性多孔膜的方法中使用的电子束辐射的剂量可在小于1 kGy-约50 kGy范围。优化参数(例如聚合亲水性涂层的量、任选的表面活性剂和适用于本发明的方法的电子束辐射的剂量)的测定设计为标准的，并且完全在本领域技术人员常规能力以内。
本发明的改性多孔膜适用于各种生物学应用，其取决于在多孔膜(例如，硝化纤维素膜)上固定生物分子，包括但不限于免疫测定、体外诊断测试和用于分离关注的生物分子的技术。硝化纤维素膜由于它们固定核酸(例如，DNA和RNA)用于DNA印迹和RNA印迹的独特能力以及它们对氨基酸(例如，蛋白质)的结合亲和力而特别用于生物学技术。作为这些性质的结果，硝化纤维素膜在其中抗原-抗体结合提供测试结果(例如，家庭受孕测试)的诊断测试中广泛用作基底。
虽然未改性的硝化纤维素膜结合生物分子(例如核酸和蛋白质)的能力是有益的，但这些膜的改性降低与硝化纤维素膜的非特异性结合促进固定生物分子(例如，DNA、RNA和蛋白质)，比起未改性的多孔膜提供显著的优点。
因此，在本发明的某些方面，提供用于改进使用硝化纤维素膜用于固定生物分子的免疫测定的灵敏度的方法，其中所述用于免疫测定的硝化纤维素膜为包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜。虽然本文描述的方法可用于实践任何免疫测定，在某些实施方案中，免疫测定包括但不限于侧流免疫测定、放射性免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。
本公开包括用于改进免疫测定的性能的方法。短语“改进免疫测定的性能”旨在包括由使用本发明的改性多孔膜引起的多种有利性质，包括但不限于：使不期望的材料与改性多孔膜的非特异性结合最小化(或者称为降低背景结合)，消除对于使用免疫测定的性能传统所需的阻断剂的需要，提高信号与噪声比，和通过使非特异性结合最小化而改进将关注的特定生物分子固定到多孔膜。
在一个具体的实施方案中，用于改进使用多孔膜用于固定生物分子的免疫测定的性能的方法包括提供具有式(I)的结构的多孔膜，其中式(I)为：
其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为电子束反应性部分的聚合物，x为存在于聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中键在聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中聚(A)x-键-B为共价接枝到多孔膜的聚合亲水性涂层；在多孔膜上固定与关注的抗原结合的第一抗体；用与抗原或与第一抗体特异性结合的第二抗体培育生物学样品，其中所述第二抗体与可检测物质缀合；用包含第二抗体的生物学样品培育包含在其上固定的第一抗体的多孔膜；和从而使用与第二抗体结合的可检测物质，通过检测第二抗体是否与多孔膜结合，测定在生物学样品中是否存在抗原。专业技术人员将立即认识到在培育膜和生物学样品之后包括洗涤多孔膜，以除去未结合的材料。此外，可任选用剂洗涤多孔膜，例如非离子表面活性剂(例如，非离子表面活性剂Tween-20TM (例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯))。
如以上更详细描述的，多种可检测物质可与第二抗体缀合。示例性可检测物质包括但不限于酶、修复基团、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料和金颗粒。用于使可检测物质与抗体缀合或偶联和用于检测这些剂的方法为本领域公知的。
在本发明的另一方面，改进使用膜用于固定生物分子的免疫测定的性能的方法包括提供具有式(I)的结构的多孔膜，其中式(I)为：
其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为电子束反应性部分的聚合物，x为存在于聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中键在聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中聚(A)x-键-B为共价接枝到多孔膜的聚合亲水性涂层；在与关注的抗原结合的多孔膜上固定第一抗体，其中所述第一抗体与可检测物质缀合；用包含固定的第一抗体的多孔膜培育生物学样品；和通过检测与第一抗体结合的可检测物质是否与多孔膜结合，从而测定在生物学样品中是否存在抗原。同样，在培育膜和生物学样品后，在非离子表面活性剂(例如，Tween-20TM (例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)存在或不存在下，可任选洗涤多孔膜，以除去未结合的不期望的材料。专业技术人员将立即认识到包括洗涤多孔膜。此外，可任选用剂洗涤多孔膜，例如非离子表面活性剂(例如，非离子表面活性剂Tween-20TM (例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯))。
在使用硝化纤维素膜用于固定生物分子的免疫测定中用于降低非特异性结合的方法，其中所述用于免疫测定的硝化纤维素膜为包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜。
在另一实施方案中，公开了用于在使用硝化纤维素膜用于固定生物分子的免疫测定中降低非特异性结合的方法，其中所述用于免疫测定的硝化纤维素膜为包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜。此外，另外提供一种方法，以在使用硝化纤维素膜用于固定生物分子的免疫测定中降低信号与噪声比，其中所述用于免疫测定的硝化纤维素膜为包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜。
以上描述的方法，其中化学改性的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)包含聚合亲水性膜，其降低与硝化纤维素膜的非特异性结合，并且还能结合生物分子，例如DNA、RNA或蛋白质，所述方法赋予利用这些改性多孔膜的免疫测定多种优点。例如，相对于在使用未改性的多孔膜(例如，硝化纤维素膜)实施的免疫测定中观察到的，通过降低与膜的非特异性结合和通过提高信号与噪声比，这样的膜改进许多免疫测定的性能和灵敏度，从而允许在例如体外诊断测定中在阳性和阴性结果之间有更容易“可观察的”区别。此外，所公开的改性多孔膜可消除对使用其它阻断剂(例如，表面活性剂)的需要，在依赖于多孔膜上固定生物分子的其它测定中传统上需要所述阻断剂。
本领域存在多种免疫测定，包括用于药物测试、激素、与很多疾病相关的蛋白质、肿瘤蛋白质标记物和心脏损伤所用蛋白质标记物的那些免疫测定。免疫测定还用于对感染剂(例如嗜血杆菌(Hemophilus)、隐球菌(Cryptococcus)、链球菌(Streptococcus)、乙型肝炎病毒、HIV、莱姆病和砂眼衣原体(Chlamydia trichomatis))检测抗原。这些免疫测定测试常用于鉴定患有这些和其它疾病的患者。因此，用于在免疫测定中改进灵敏度、特异性和检测限度的组合物和方法在诊断医学领域非常重要。
本文描述的方法可进一步允许在生物学样品中检测一种或多种生物分子(例如，血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身体分泌物、细胞或组织)。使用本文描述的方法检测的生物分子可为与疾病关联的抗原，例如细菌性疾病、病毒性疾病或真菌性疾病，或与疾病(例如癌症、心脏功能不良、心脏病发作或炎性疾病)关联的蛋白质生物标记物。
术语“分析物”指通过免疫测定或其它诊断测试测定其在例如生物学样品中存在或不存在的物质或化学组成。
本文使用的“生物分子”不带限制地表示核酸(例如，DNA或RNA)或蛋白质(例如，抗体)，但是还包括存在于生物体(例如，人患者)中的任何有机分子。
提供以下实施例作为说明而不是作为限制。
实施例
实施例1：在硝化纤维素膜上键合PEG
分析PEG衍生物，尤其是分子量为300和2080 Da之内的PEGMA、分子量为300和575 Da之内的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和分子量为912 Da以下的三羟甲基丙烷乙氧基化三丙烯酸酯(TMPET)，当暴露于电子束辐射时它们与硝化纤维素键合的能力。
制备含有PEG衍生物单体的浸渍溶液，具有或不具有非离子表面活性剂Tween-20TM (例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)，用于增强单体在水中的溶解度的非离子表面活性剂。将硝化纤维素膜浸没在PEG含水溶液中，并且以10 kGy或50 kGy的剂量经历电子束辐射。硝化纤维素膜用水充分洗涤，随后真空干燥过夜。通过在上述处理后硝化纤维素膜的重量增加，测量关于接枝的初始评价。结果在表1中陈述。
表1：分析PEG与硝化纤维素膜键合的因素
通过向浸渍溶液中加入聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)，增强PEGMA300的接枝效率。通过ATR-FTIR还证实PEGMA300与硝化纤维素膜的键合效率的该提高。PEGDA300和PEGDA575二者显示在接枝(例如，键合效率)和用于浸渍溶液的单体浓度之间的线性关系。在较高浓度的PEG单体下，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)用于改进PEGDA300和PEGDA575的溶解度，实现硝化纤维素-PEGDA膜最多35.1%的重量增加。TMPET 912也显示在硝化纤维素膜上PEG衍生物良好的接枝，实现34.5%重量增加。根据本领域的标准方法，通过IR分析证实PEG衍生物的接枝。
实施例2：接枝有PEG的硝化纤维素呈现降低的非特异性结合
实施测定以确定硝化纤维素膜是否与聚合PEG 涂层结合。通过涂布最终浓度为0.2 mg/ml BSA并且光学密度为0.8的40 nm金纳米颗粒，制备运行缓冲液。
基本上如以上在实施例1中所述，制备用PEG衍生物改性的硝化纤维素膜。将改性的硝化纤维素膜浸没在运行缓冲液中，使用金标记用作在膜上存在BSA的指示剂。
金纳米颗粒在未改性的硝化纤维素膜上在流的起源中聚集，表明BSA与膜非特异性结合，而对于接枝有PEG衍生物的改性硝化纤维素膜，金溶液能平滑地在膜上流动，并且仅在改性的硝化纤维素-PEG膜的末端(例如，终点)观察到金聚集，强烈表明改性的PEG-接枝膜能阻断在蛋白质(例如，BSA)和改性膜之间的非特异性相互作用。当低至1.7% PEGDA575在硝化纤维素膜上接枝时，观察到非特异性蛋白质结合的阻断。在约~10%的PEG 接枝效率下，观察到非特异性结合的最优阻断。
实施例3：PEG-接枝的硝化纤维素膜呈现降低的非特异性结合，与使用阻断剂观察到的类似
将接枝有PEG (例如，PEGMA300或PEGDA575)的改性硝化纤维素膜装配至半杆(half stick)侧流装置中，其中吸收剂垫层压在改性的硝化纤维素膜的顶部，具有约1 mm重叠，并且侧流装置进一步使用G&L 187胶通过聚酯外壳材料支撑。未接枝任何PEG的未改性的硝化纤维素膜用作对照。
通过涂布最终浓度为0.2 mg/ml BSA并且光学密度为0.8 OD的40 nm金纳米颗粒，制备运行缓冲液。为了比较目的，通过涂布最终浓度为0.2 mg/ml BSA并且还包含0.5% 聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)溶液的40 nm金纳米颗粒，制备第二运行缓冲液，其中所述聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)用作阻断剂。将半杆浸没在上述运行缓冲液中，具有或不具有聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)，监测在硝化纤维素膜上金颗粒的毛细流动，随后通过L-a-b比色分析来分析膜的背景，其中“L,a,b”指示“亮度,红色,绿色”。
在其中运行缓冲液含有阻断剂的那些实施例中，所有的硝化纤维素膜(改性或非改性的)能允许金标记的BSA从底部到顶部平滑流动，其中所有颜色在吸收剂垫上被吸收。
当使用含有阻断剂的运行缓冲液时，由于非特异性结合，BSA-标记的金纳米颗粒在未改性的硝化纤维素膜中被截留。然而，改性的PEG-接枝的硝化纤维素膜降低与膜的非特异性结合，使得在允许BSA-标记的金纳米颗粒完全流动通过膜之后，没有可见的颜色(例如，金)在膜上累积。当将膜的背景的颜色定量时，暴露于不含阻断剂(例如，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM))的运行缓冲液的改性的PEG-硝化纤维素膜具有与对暴露于包含阻断剂聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)的运行缓冲液的未改性硝化纤维素膜观察到的类似的值。这些结果强烈表明，在改性硝化纤维素膜上的聚合PEG涂层采用与传统的阻断剂例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)类似和等同的方式起作用。
实施例4：接枝有PEG的硝化纤维素膜降低非特异性结合
与标准家庭受孕测试类似，硝化纤维素膜印有测试线(1 mg/ml 抗-HCG-α)和对照线(0.5 mg/ml 山羊-抗-小鼠-IgG)，随后装配至半杆侧流装置，其中吸收剂垫层压在硝化纤维素的顶部，具有约1 mm重叠，并且该装置进一步使用G&L 187胶通过聚酯外壳材料支撑。
对于每一个半杆，制备含有运行缓冲液，其含有：600 mIU/ml人绒膜促性腺激素(hCG；一种在受孕时升高的激素)、连同0.15 mg/ml hCG-β涂布的1.5 ng/ml 40 nm金纳米颗粒的100 μl。为了比较的目的，还制备含有阻断剂0.5%聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)的第二运行缓冲液。将半杆浸没在运行缓冲液中约30分钟，以允许完成测定。使用Image J使测试线的信号强度定量，并且针对在阻断剂聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)存在下使用未改性的硝化纤维素膜得到的结果归一化。
使用改性的PEG-接枝的硝化纤维素膜观察到的信号强度与将未改性的膜暴露于包含阻断剂聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM)的运行缓冲液所看到的相当，强烈支持使用包含聚合亲水性(例如，PEG)涂层的改性硝化纤维素膜可降低或消除对于在侧流测定(例如，家庭受孕测试)中包括传统阻断剂(如阻断剂聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween-20TM))的需要，同时保持诊断测试的灵敏度。
虽然本文已说明和描述了本发明的仅某些特征，但本领域技术人员可以想到许多修改和变化。因此，应理解的是，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这些修改和变化。
本文通过引用结合所有出版物、专利公开和专利，如同明确并且分别地指示通过引用结合每一个单独出版物或专利的相同程度。

Claims (48)

1. 一种具有式(I)的结构的多孔膜，其中式(I)为：
其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为所述电子束反应性部分的聚合物，x为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中键在所述聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中聚(A)x-键-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合亲水性涂层。
2. 权利要求1的多孔膜，其中所述膜选自硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚(四氟乙烯-共聚-六氟丙烯)膜，和上述膜中的两种或更多种的任何组合。
3. 权利要求2的多孔膜，其中所述多孔膜为包含与硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜。
4. 权利要求1的多孔膜，其中所述电子束反应性部分A选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物、基于叔碳(CHR3)的化合物，和上述官能部分的两种或更多种的任何组合。
5. 权利要求1的多孔膜，其中所述键为酯、脂族、芳族、亲水性化合物、杂芳族化合物，或上述键的两种或更多种的任何组合。
6. 权利要求1的多孔膜，其中所述B基团为亲水性化合物。
7. 权利要求6的多孔膜，其中所述亲水性化合物为PEG部分，并且其中所述PEG部分选自PEGMA、PEGDA和TMPET。
8. 权利要求1的多孔膜，其中相对于与未改性的多孔膜的非特异性结合，所述聚合亲水性涂层显示不期望的材料的非特异性结合降低。
9. 一种用于改进使用多孔膜用于固定生物分子的免疫测定的性能的方法，所述方法包括：
a)提供具有式(I)的结构的多孔膜，其中式(I)为：
其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为所述电子束反应性部分的聚合物，x为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中键在所述聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中聚(A)x-键-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合亲水性涂层；
b)在所述多孔膜上固定与关注的抗原结合的第一抗体；
c)用与所述抗原结合的第二抗体培育生物学样品，其中所述第二抗体与可检测物质缀合；
d)用包含所述第二抗体的生物学样品培育包含在其上固定的所述第一抗体的多孔膜；和
e)使用与所述第二抗体结合的可检测物质，通过检测所述第二抗体是否与所述多孔膜结合，测定在所述生物学样品中是否存在所述抗原。
10. 权利要求9的方法，所述方法还包括在步骤(d)之后洗涤所述多孔膜，以除去未结合的材料。
11. 权利要求10的方法，其中洗涤所述多孔膜还包括使用非离子表面活性剂。
12. 权利要求9的方法，其中与所述第二抗体缀合的所述可检测物质选自酶、修复基团、荧光染料、发光材料、生物发光材料、放射性材料和金颗粒。
13. 权利要求9的方法，其中所述多孔膜选自其中膜选自：硝化纤维素膜、纤维素膜、乙酸纤维素膜、再生纤维素膜、硝化纤维素混合酯膜、聚醚砜膜、尼龙膜、聚烯烃膜、聚酯膜、聚碳酸酯膜、聚丙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、聚乙烯膜、聚苯乙烯膜、聚氨酯膜、聚苯醚膜、聚(四氟乙烯-共聚-六氟丙烯)膜，和上述膜中的两种或更多种的任何组合。
14. 权利要求13的方法，其中所述多孔膜为硝化纤维素膜。
15. 权利要求9的方法，其中所述电子束反应性部分A选自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基酮、苯乙烯、乙烯基醚、含乙烯基的部分、含烯丙基的部分、基于苄基的化合物、基于叔碳(CHR3)的化合物，和上述官能部分的两种或更多种的任何组合。
16. 权利要求9的方法，其中所述键为酯、脂族、芳族、亲水性化合物、杂芳族化合物，或上述键的两种或更多种的任何组合。
17. 权利要求9的方法，其中所述B基团为亲水性化合物。
18. 权利要求17的方法，其中所述亲水性化合物为PEG部分，并且其中所述PEG部分选自PEGMA、PEGDA和TMPET。
19. 权利要求9的方法，其中所述免疫测定选自侧流免疫测定、放射性免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。
20. 权利要求9的方法，其中所述生物学样品为血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身体分泌物、细胞或组织。
21. 权利要求9的方法，其中所述抗原选自细菌、病毒、真菌、激素和用于癌症、心脏功能不良、心脏病发作或炎性过程的蛋白质标记物。
22. 权利要求9的方法，其中步骤(a)的多孔膜使用消除在所述免疫测定中对使用阻断剂的需要。
23. 权利要求9的方法，其中所述方法在固体载体上实施，其中所述固体载体为微量滴定板或载玻片。
24. 权利要求9的方法，其中所述方法允许检测所述生物学样品中的两种或更多种抗原。
25. 一种用于改进使用多孔膜用于固定生物分子的免疫测定的性能的方法，所述方法包括：
a)提供具有式(I)的结构的多孔膜，其中式(I)为：
其中A为电子束(电子束)反应性部分，其中聚(A)x为所述电子束反应性部分的聚合物，x为存在于所述聚(A)x聚合物中的A单体的数量；其中键在所述聚(A)x聚合物和B基团之间形成键合，并且其中聚(A)x-键-B为共价接枝到所述多孔膜的聚合亲水性涂层；
b)在所述多孔膜上固定与关注的抗原结合的第一抗体，其中所述第一抗体与可检测物质缀合；
c)用包含在其上固定的所述第一抗体的多孔膜培育生物学样品；和
d)通过检测所述可检测物质是否与所述多孔膜结合，测定在所述生物学样品中是否存在所述抗原。
26. 权利要求3的硝化纤维素膜，其中所述聚合亲水性涂层包含聚乙二醇(PEG)部分、聚乙烯醇、羟基、带负电荷的离子基团、带正电荷的离子基团、两性离子基团，或它们的任何组合。
27. 权利要求26的硝化纤维素膜，其中所述聚合亲水性涂层包含PEG部分。
28. 权利要求27的硝化纤维素膜，其中所述PEG部分选自PEGMA、PEGDA和TMPET。
29. 权利要求28的硝化纤维素膜，其中关注的生物分子固定在所述硝化纤维素膜上。
30. 权利要求29的硝化纤维素膜，其中所述关注的生物分子为蛋白质或核酸。
31. 权利要求30的硝化纤维素膜，其中所述关注的生物分子为蛋白质。
32. 权利要求31的硝化纤维素膜，其中所述蛋白质为抗体。
33. 权利要求29的硝化纤维素膜，其中相对于与未改性的硝化纤维素膜的非特异性结合，所述硝化纤维素膜显示非特异性结合降低。
34. 权利要求33的硝化纤维素膜，其中所述硝化纤维素膜还显示信号与噪声比提高。
35. 权利要求3的硝化纤维素膜，其中所述聚合亲水性涂层与所述硝化纤维素膜共价连接。
36. 权利要求3的硝化纤维素膜，其中所述硝化纤维素膜的孔尺寸在0.01-50微米范围。
37. 一种用于实施免疫测定的装置，所述装置包含权利要求3的硝化纤维素膜。
38. 权利要求37的装置，其中所述装置用于侧流免疫测定。
39. 一种用于制备权利要求3的硝化纤维素膜的方法，所述方法包括：
a)提供未改性的硝化纤维素膜；
b)在亲水性化合物的含水溶液中浸没所述硝化纤维素膜；
c)使所述多孔膜暴露于电子束(电子束)辐射；和
d)干燥所述硝化纤维素膜，从而制备包含与所述硝化纤维素膜键合的聚合亲水性涂层的硝化纤维素膜。
40. 权利要求39的方法，其中所述亲水性化合物的含水溶液还包含非离子表面活性剂。
41. 权利要求40的方法，其中所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
42. 权利要求25的方法，其中所述免疫测定选自侧流免疫测定、放射性免疫测定、酶免疫测定(EIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、荧光免疫测定和化学发光免疫测定。
43. 权利要求42的方法，其中所述方法允许检测生物学样品中的一种或多种生物分子。
44. 权利要求43的方法，其中所述生物学样品为血液、血清、淋巴、尿、唾液、粘液、身体分泌物、细胞或组织。
45. 权利要求44的方法，其中所述生物分子为与疾病关联的抗原。
46. 权利要求的45方法，其中所述疾病为细菌性疾病、病毒性疾病或真菌性疾病。
47. 用于在使用硝化纤维素膜用于固定生物分子的免疫测定中降低非特异性结合的方法，其中所述用于免疫测定的硝化纤维素膜如在权利要求3中陈述。
48. 用于在使用硝化纤维素膜用于固定生物分子的免疫测定中降低信号与噪声比的方法，其中所述用于免疫测定的硝化纤维素膜如在权利要求3中陈述。
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