RU2818001C1 - Способ повышения чувствительности мультиплексного иммунохроматографического анализа - Google Patents
Способ повышения чувствительности мультиплексного иммунохроматографического анализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818001C1 RU2818001C1 RU2023111073A RU2023111073A RU2818001C1 RU 2818001 C1 RU2818001 C1 RU 2818001C1 RU 2023111073 A RU2023111073 A RU 2023111073A RU 2023111073 A RU2023111073 A RU 2023111073A RU 2818001 C1 RU2818001 C1 RU 2818001C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane
- analytical
- microzones
- sample
- analytes
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title abstract description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 51
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 7
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 4
- 229910021644 lanthanide ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 abstract description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 abstract 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- -1 for example Chemical class 0.000 description 7
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 5
- 208000004023 Legionellosis Diseases 0.000 description 4
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 4
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N Lysergic acid diethylamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010048233 Procalcitonin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N procalcitonin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CSSC1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 CWCXERYKLSEGEZ-KDKHKZEGSA-N 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области лабораторной диагностики. Раскрыт способ проведения мультиплексного иммунохроматографического анализа определения нескольких аналитов в пробе, включающий инкубацию пробы с мембранным хроматографическим композитом в виде тест-полоски и проявляющими реагентами и последующую регистрацию сигнала люминесценции в аналитических и контрольных зонах на хроматографической мембране в режиме временного разрешения, и после инкубации мембранного композита с проявляющими реагентами вводится дополнительная стадия инкубации мембранного композита с промывающим буфером анализа, при этом в качестве проявляющих реагентов используют смесь из конъюгатов лигандов с длительно люминесцирующими метчиками, люминесцентные характеристики которых отличаются по крайней мере длиной волны максимума эмиссии и постоянной времени затухания, а аналитическая мембрана содержит микрозоны для связывания аналитов в низкой и высокой концентрации, при этом в месте расположения аналитических микрозон для выявления низких концентраций выполнена зауженной по сравнению с шириной до и после места расположения аналитических микрозон для выявления низких концентраций, при этом емкость сорбирующей подушечки обеспечивает впитывание всей пробы и дополнительного объема промывающего буфера анализа, регистрацию люминесценции осуществляют в стробоскопическом режиме в нескольких спектральных диапазонах, соответствующих максимумам эмиссии метчиков с выделением сигнала во временном интервале, эквивалентном времени затухания соответствующего метчика. Изобретение позволяет повысить чувствительность мультиплексного анализа и расширить динамический диапазон выявляемых концентраций аналитов. 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.
Description
Изобретение относится к области иммунохимической (молекулярно-биологической) диагностики аналитов, используемых в качестве клинически значимых маркеров инфекционных, соматических и генетических заболеваний. Данная технология позволяет проводить тестирование образцов биологической природы, включая цельную кровь, плазму, сыворотку, мочу, слюну, пот и другие биологические и физиологические жидкости (Schramm Е.С. et al. // Anal. Biochem. - 2015. - Vol. 477. - P. 78-85; Ang S.H., et al. // Biosens. Bioelectron. - 2015. - Vol. 78. - P. 187-193; Magambo K.A. et al. // J. Int. AIDS Soc. - 2014. - Vol. 17. - P. 19040; De Giovanni N. et al. // Curr. Med. Chem. - 2013. - Vol. 20. - P. 545-561).
В патенте (US 2020/0348298 A1, МПК: G01N 33/54388, публикация: 5.11.2020) описан способ определять точные концентрации аналитов, если в образце присутствует один или несколько аналитов в высокой концентрации и один или несколько аналитов в низкой концентрации. Использование данного формат может быть полезным для случая, когда необходимо провести анализ нескольких биоаналитов в одинаковых условиях, или анализ взаимозависимых биоаналитов. Каждый из выявляемых аналитов определяется на хроматографической мембране в виде окрашенной, люминесцирующей или магниточувствительной полосы в зоне специфического связывания искомого аналита (Zhang X. et al. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2017. - Vol. 65. N. 36. - P. 8063-8071). Мультиплексность подобных тестов, как правило, не превышает 4-5 аналитов при ширине аналитической зоны 1 мм и расстоянии между зонами 2 мм (Kong D. et al. // Nanoscale. - 2016. - Vol. 8. N. 9. - P. 5245-5253).
Для увеличения мультиплексности анализа и снижения расхода иммунореагентов используют зоны специфического связывания аналитов в виде микрозон (микроточек) на мембране, площадь которых существенно меньше, чем площадь реагентов нанесенных в виде аналитической полоски, перпендикулярной латеральному потоку жидкости пробы. Известны мультиплексные тест-системы с точечным нанесением иммунореагентов, позволяющие определять семь вирусных и один бактериальный фитопатоген (Safenkova I.V. et al. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2016. - Vol. 408. N. 22. - P. 6009-6017), четыре психоактивных вещества в моче (Taranova N.A. et al. // Microchimica Acta. - 2013. - Vol. 180. N. 11-12. - P. 1165-1172).
Формирование аналитических зон на хроматографической мембране в виде микрозон практически не ограничивает чувствительность анализа, так как удельный сигнал на единицу площади эквивалентен уровню сигнала, наблюдаемому при формировании аналитической зоны в виде полоски, расположенной перпендикулярно латеральному потоку жидкости.
Детектирование сигнала в микрозонах, как правило, осуществляется с помощью светопоглощающих или люминесцирующих наночастиц, содержащих на поверхности ковалентно связанные лиганды (антитела, антигены, олигонуклеотиды и т.п.). Существенно более высокую чувствительность (по сравнению со светопоглощающими материалами) обеспечивают люминесцирующие наночастицы. Известно применение флуоресцирующих наночастиц (Sakurai A. et al. // PLoS One. - 2015. - Vol. 10. N. 2. - P. e0116715), квантовых точек (Taranova N.A. et al. // Biosensors and Bioelectronics. - 2015. - Vol. 63. - P. 255-261), антистоксовых люминесцирующих наночастиц, а также наночастиц с длительно люминесцирующими соединениями, например комплексонами ионов европия, время затухания люминесценции которых составляет несколько сотен микросекунд (Chen K. et al. // Int J Environ Res Public Health. - 2021. - Vol. 18. N. 9. - P. 4574. doi: 10.3390/ijerph18094574; Valanne A. et al. // J. Clin. Virol. - 2005. - Vol. 33. - P. 217-223; Jaakohuhta S. et al. // Int. J. Food Microbiol. - 2007. - Vol. 114. - P. 288-294). Иммунохроматографический анализ с использованием наночастиц с комплексонами ионов европия в качестве проявляющего реагента нашел широкое применение в in vitro диагностике инфекционных и соматических заболеваний.
Наиболее близким аналогом предлагаемому нами способу является способ проведения иммунохроматографического анализа с использованием регистрации сигнала люминесценции ионов европия в режиме временного разрешения (Wang Q. et al. // Food Control - 2019, - Vol. 109, - P. 106894; Zhou, Y.L. et al. // Anal. Chim. Acta - 2012, - Vol. 722, - P. 95-99). На мировом рынке представлен ряд компаний выпускающих иммунохроматографические диагностические тесты и соответствующее оборудование для выявления инфекционных и соматических заболеваний на основе этой технологической платформы (Polysciences, Inc; Thermo Fisher Scientific Inc.; EPRUI Biotech Co. Ltd.; Innova Biosciences, Ltd; Novus Biologicals, LLC; Ocean NanoTech, LLC; Suzhou Vdo Biotech Co., Ltd; GeTein BioMedical Inc; Medisensor, Inc.; Precision Biosensor; Sugentech, Inc; Nano-Ditech Corp.; Quidel Corporation Headquarters; ABINGDON HEALTH; Bioscience (Tianjin) Diagnostic Technology Co., Ltd).
Способ проведения мультиплексного иммунохроматографического анализа определения нескольких аналитов в пробе, включает инкубацию пробы на мембранном хроматографическом композите (тест-полоске) и последующую регистрацию сигнала люминесценции от комплексов ионов европия в аналитических и контрольных микрозонах. Мембранный хроматографический композит (фигура 1) представляет собой узкую полоску пластика шириной 3-5 мм (позиция 1) на которой располагаются: стартовая всасывающая мембрана с нанесенными на нее наночастицами (позиция 3), содержащими комплексы ионов европия и специфичные к искомым аналитам биолиганды; контактирующая с ней хроматографическая нитроцеллюлозная мембрана (позиция 2) для тонкослойной хроматографии (длиной 4-5 см) на которой иммобилизованы реагенты для связывания аналитов в виде аналитических и контрольных микрозон размером 0,5-1 мм (позиции 4, 5, 6); и сорбирующая подушечка (позиция 7) необходимая для адсорбции пробы прошедшей по хроматографической тонкослойной мембране. Сорбирующая подушечка имеет свободный объем сопоставимый с объемом анализируемой пробы (100-150 мкл).
Регистрация сигнала осуществляется в режиме временного разрешения люминесценции, за счет чего существенно снижается фоновая люминесценция хроматографической мембраны и других компонентов пробы, люминесценция которых имеет более короткое время затухания. Режим временного разрешения обеспечивает более высокую чувствительность анализа по сравнению с использованием традиционных видов флуорохромов, время затухания которых не превышает (1-2)×10-7 с и регистрация сигналов которых осуществляется без режима временного разрешения.
Ключевой проблемой, ограничивающей чувствительность мультиплексного анализа с использованием длительно люминесцирующих наночастиц остается достаточно высокий уровень фоновой люминесценции самих проявляющих наночастиц, находящихся в свободном объеме мембраны. По оценке производителей иммунохроматографических мембран в свободном объеме (вне аналитических зон) может оставаться до 4% от общего количества проявляющих наночастиц. При проведении мультиплексного анализа концентрация наночастиц в свободном объеме мембраны возрастает пропорционально числу выявляемых аналитов, так как для каждого аналита используются наночастицы, покрытые биоспецифическими реагентами для связывания с данным аналитом и общее число наночастиц в пробе увеличивается пропорционально числу выявляемых аналитов и уровню их концентрации в пробе.
Проблема детектирования становится еще более сложной, когда в мультиплексном тесте необходимо выявлять аналиты кардинально различающиеся по их содержанию в пробе, например при анализе маркеров воспалительного процесса (С-реактивного белка (уровень нормы несколько мкг/мл) и прокальцитонина (уровень нормы не более 4 нг/мл), содержание которых в пробе различается на 3 порядка. Аналогичная проблема возникает при необходимости одновременного определения в пробе иммуноглобулинов (антител) и антигенов возбудителей инфекционных заболеваний. В этом случае, концентрация проявляющих наночастиц должна коррелировать с содержанием аналитов в пробе. При этом уровень фоновой люминесценции наночастиц для выявления аналитов в высокой концентрации (мкг/мл) оказывается столь высоким, что практически исключает регистрацию аналитов в низких концентрациях (нг/мл, пг/мл).
Проблема повышения чувствительности мультиплексного иммунохроматографического анализа и совмещения в формате одной тест-полоски анализа аналитов с высоким и низким уровнем их содержания может быть решена предлагаемым способом.
Суть предлагаемого способа заключается в использовании не одного, а нескольких видов длительно люминесцирующих соединений, отличающихся спектральными и временными характеристиками, исключающими или кардинально снижающими их взаимовлияние. Суть предлагаемого способа заключается также в том, что после инкубации иммунохроматографической тест-полоски с анализируемой пробой и проявляющими реагентами в буфере анализа, ее инкубируют с буфером анализа без проявляющих реагентов, чтобы кардинально снизить их концентрацию вне аналитических зон. При этом емкость сорбирующей подушечки (обеспечивающей за счет капиллярных сил движение пробы по аналитической части мембраны) подбирается с таким расчетом, чтобы впитать всю пробу, а также дополнительный объем промывающего буфера анализа. Суть предлагаемого способа заключается также в том, что хроматографическая мембрана в области расположения аналитических микрозон для выявления низких концентраций аналитов имеет ширину в 3-4 раза более узкую, чем ширина хроматографической мембраны до и после места расположения аналитических микрозон. Объем пробы проходящей через аналитическую микрозону в зауженной части мембраны увеличивается прямо пропорционально по сравнению с исходной шириной мембраны. Пропорционально увеличивается масса связавшихся аналитов в соответствующей микрозоне.
При необходимости определения аналитов как в высокой, так и в низкой концентрации аналитические микрозоны располагают соответственно либо в широкой (где взаимодействующий с аналитической микрозоной объем пробы меньше), либо зауженной (где взаимодействующий с аналитической микрозоной объем пробы больше).
Технический результат: совокупность предлагаемых приемов позволяет повысить отношение сигнала в аналитической зоне к сигналу фоновой люминесценции мембраны вне аналитических микрозон не менее чем в 10 раз, повысить чувствительность и расширить динамический диапазон выявляемых концентраций аналитов в формате мультиплексных тестов, аналитические реагенты которых нанесены на аналитическую мембрану в виде микрозон (микроточек).
Заявленный технический результат достигается за счет того, что в способе проведения мультиплексного иммунохроматографического анализа для определения нескольких аналитов в пробе, включающем инкубацию пробы с мембранным хроматографическим композитом и проявляющими реагентами и последующую регистрацию сигнала люминесценции в аналитических и контрольных микрозонах на хроматогрфической мембране в режиме временного разрешения, после инкубации мембранного композита с проявляющими реагентами вводится дополнительная стадия инкубации мембранного композита с промывающем буфером анализа при этом в качестве проявляющих реагентов используют смесь из конъюгатов лигандов с длительно люминесцирующими соединениями, люминесцентные характеристики которых отличаются по крайней мере длиной волны максимума эмиссии и постоянной времени затухания, а аналитическая мембрана в месте расположения аналитических микрозон выполнена зауженной по сравнению с шириной до и после места расположения аналитических микрозон, при этом сорбирующая подушечка для впитывания пробы после ее прохождения по аналитической мембране выполнена такого размера (объема), чтобы полностью впитать заданный объем пробы и впитать дополнительный объем жидкости при последующей инкубации с промывным буфером анализа. Регистрацию люминесценции осуществляют в стробоскопическом режиме в нескольких спектральных диапазонах, соответствующих максимумам эмиссии метчиков с выделением сигнала во временном интервале эквивалентном времени затухания соответствующего метчика. В качестве люминесцентных метчиков для коньюгатов с лигандами используют наночастицы диаметром 40-200 нм, включающие хелаты с ионами лантанидов, а также водорастворимые металлопорфирины с центральными атомами платины. Аналитические микрозоны мембранного композита получают нанесением на мембранный носитель, нитроцеллюлозу, антигенов или антител в количестве 20-200 нл с концентрацией 20-100 мкг/мл. Контрольные микрозоны мембранного композита получают нанесением на мембранный носитель, нитроцеллюлозу, антигенов или антвидовых антител в количестве 20-200 нл с концентрацией 20-100 мкг/мл.
Заявленная совокупность приемов является новой и позволяет выявлять в пробе с помощью одной тест-полоски несколько аналитов, различающихся по концентрации в 100 и более раз и обеспечивает повышение чувствительности обнаружения аналитов не менее чем в 10 раз.
Для реализации способа используют коммерчески выпускаемые компоненты для конструирования мембранных хроматографических композитов (тест-полосок), имеются регламенты получения биоспецифических реагентов с длительно люминесцирующими соединениями, включая наночастицы, для регистрации сигнала люминесценции от микрозон с аналитическими реагентами, а также выпускаются зарегистрированные в Росздравнадзоре РФ и серийно выпускаемые биочип-анализаторы ИФИ-03 и ИФИ-05 (Производитель ООО «ИММУНОСКРИН»). Предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.
На фигуре 1 представлен внешний вид мембранного хроматографического композита (тест-полоски) для мультиплексного иммунохроматографического анализа.
Тест-полоска, представленная на фигуре 1 имеет пластиковую основу (1) на которой размещена иммунохроматографическая мембрана из нитроцеллюлозы и мембрана для сорбции пробы (3). В узкой части мембраны размещают микрозоны с аналитическими реагентами для связывания аналитов в низкой концентрации (4), в широкой части размещают микрозоны или полоски для связывания аналитов с высокой концентрацией в пробе (5), а также контрольные микрозоны (6) и сорбирующую элюент подушечку (7).
На фигуре 2 представлена схема способа проведения анализа на модели сыворотки крови, включающей антигены возбудителей чумного и туляремийного микроорганизмов и антитела к возбудителю легионеллеза. Обозначения на фигуре 2: антитела к антигену фракции Ф1 чумного микроба (4.1); антитела к антигену липополисахарида туляремийного микроба (4.2); антиген к возбудителю легионеллеза (5.1); контрольные микрозоны с локализованными антителами к моноклональным антителам кролика (К1) и мыши (К2).
Последовательность операций предлагаемого способа, представленная на фигуре 2, включает:
- приготовление на нитроцеллюлозной мембране тест-полоски микрозон с аналитическими реагентами для связывания аналитов в низкой и высокой концентрации и контрольными микрозонами для улавливания непрореагировавших длительно люминесцирующих лигандов (позиция 11);
- внесение тест-полоски свободным концом (без улавливающей мембраны) в емкость, содержащую анализируемую пробу (8), лиганды, меченные длительно люминесцирующими соединениями (9), буфер анализа (10) (позиция 12);
- инкубацию тест-полоски в емкости в течение 10-15 минут (позиция 12);
- внесение тест-полоски свободным концом (без улавливающей мембраны) в емкость содержащую буфер анализа (10) и инкубацию тест-полоски в емкости в течение 3-5 минут (позиция 13);
- регистрацию сигнала люминесценции при сканировании области расположения микрозон в режиме временного разрешения (позиция 14).
На фигуре 3 представлены диаграммы сканирования тест-полосок, изготовленных по предлагаемому способу, с использованием одного и двух типов метчиков и регистрации сигнала в двух спектральных диапазонах в режиме временного разрешения. Обозначения, представленные на фигуре 3 следующие: позиция 15 - использование для детектирования антигенов возбудителей чумного и туляремийного микроорганизмов и антител к возбудителю легионеллеза одной метки (на основе хелатов Eu), регистрация на 615 нм; позиция 16 - использование для детектирования двух меток (хелаты Eu для чумного и туляремийного микроорганизмов, комплексы Pt для выявления антител к возбудителю легионеллеза), регистрация на 615 нм; позиция 17 - использование для детектирования двух меток (аналогично позиции 16), но регистрация на 645 нм.
Результаты анализа на тест-полосках, полученные с минимальным содержанием антигенов и антител в аналитических зонах (нанесение 20 нл с концентрацией 20 мкг/мл) и детектированием с использованием хелатов Eu (хелаты Eu включены в наночастицы диаметром 40-50 нм) представлены в таблице 1.
Результаты анализа на тест-полосках, полученные с максимальным содержанием антигенов и антител в аналитических зонах (нанесение 200 нл с концентрацией 100 мкг/мл) и детектированием с использованием хелатов Eu (хелаты Eu включены в наночастицы диаметром 200 нм) представлены в таблице 2.
Результаты сканирования тест-полосок стандартной конфигурации и с конфигурацией по предлагаемому способу с использованием одного типа меток представлены в таблице 1 и таблице 2 (прототип (1) и варианты 2 и 3).
Результаты сканирования тест-полосок с использованием двух типов меток (по предлагаемому способу) представлены в таблице 1 и 2 (вариант 4).
Результаты сканирования тест-полосок подготовленных как в варианте 4, но с применением дополнительной процедуры отмывки представлены в таблице 1, 2 (вариант 5).
Из данных таблицы 1 и 2 следует, что предлагаемый способ обеспечивает повышение чувствительности (улучшение соотношения сигнал фон) по сравнению с прототипом при проведении мультиплексного иммунохроматографического анализа с содержанием аналитов в широком диапазоне концентраций.
Claims (5)
1. Способ проведения мультиплексного иммунохроматографического анализа определения нескольких аналитов в пробе, включающий инкубацию пробы с мембранным хроматографическим композитом в виде тест-полоски и проявляющими реагентами и последующую регистрацию сигнала люминесценции в аналитических и контрольных зонах на хроматографической мембране в режиме временного разрешения, и после инкубации мембранного композита с проявляющими реагентами вводится дополнительная стадия инкубации мембранного композита с промывающим буфером анализа, при этом в качестве проявляющих реагентов используют смесь из конъюгатов лигандов с длительно люминесцирующими метчиками, люминесцентные характеристики которых отличаются по крайней мере длиной волны максимума эмиссии и постоянной времени затухания, а аналитическая мембрана содержит микрозоны для связывания аналитов в низкой и высокой концентрации, при этом в месте расположения аналитических микрозон для выявления низких концентраций выполнена зауженной по сравнению с шириной до и после места расположения аналитических микрозон для выявления низких концентраций, при этом емкость сорбирующей подушечки обеспечивает впитывание всей пробы и дополнительного объема промывающего буфера анализа, регистрацию люминесценции осуществляют в стробоскопическом режиме в нескольких спектральных диапазонах, соответствующих максимумам эмиссии метчиков с выделением сигнала во временном интервале, эквивалентном времени затухания соответствующего метчика.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве люминесцентных метчиков для конъюгатов с лигандами используют наночастицы диаметром 40-200 нм, включающие хелаты с ионами лантанидов.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве люминесцентных метчиков для конъюгатов с лигандами используют водорастворимые металлопорфирины с центральными атомами платины (Pt).
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитические микрозоны мембранного композита получают нанесением на мембранный носитель, нитроцеллюлозу, антигенов или антител в количестве 20-200 нл с концентрацией 20-100 мкг/мл.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что контрольные микрозоны мембранного композита получают нанесением на мембранный носитель, нитроцеллюлозу, антигенов или антивидовых антител в количестве 20-200 нл с концентрацией 20-100 мкг/мл.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818001C1 true RU2818001C1 (ru) | 2024-04-23 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2184970C1 (ru) * | 2001-07-09 | 2002-07-10 | Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения | Способ многоаналитного иммуноанализа |
| EP2215450B1 (en) * | 2006-02-21 | 2013-07-31 | Nexus DX, Inc. | Methods and compositions for analyte detection |
| EP2666018B1 (en) * | 2011-01-18 | 2017-04-05 | Symbolics, LLC | Lateral flow assays using two dimensional features |
| RU2710262C1 (ru) * | 2019-08-01 | 2019-12-25 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Способ проведения биологического микроанализа |
| WO2021053206A1 (en) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | Momm Diagnostics Gmbh | Immunoassay analyzer, immunoassay kit and method for detecting analyte in liquid sample |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2184970C1 (ru) * | 2001-07-09 | 2002-07-10 | Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения | Способ многоаналитного иммуноанализа |
| EP2215450B1 (en) * | 2006-02-21 | 2013-07-31 | Nexus DX, Inc. | Methods and compositions for analyte detection |
| EP2666018B1 (en) * | 2011-01-18 | 2017-04-05 | Symbolics, LLC | Lateral flow assays using two dimensional features |
| RU2710262C1 (ru) * | 2019-08-01 | 2019-12-25 | Закрытое акционерное общество "ИММУНОСКРИН" (ЗАО "ИММУНОСКРИН") | Способ проведения биологического микроанализа |
| WO2021053206A1 (en) * | 2019-09-20 | 2021-03-25 | Momm Diagnostics Gmbh | Immunoassay analyzer, immunoassay kit and method for detecting analyte in liquid sample |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020233741B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US10379121B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US9933423B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| AU2007332776B2 (en) | Multiple analyte immunoassay | |
| CN100420947C (zh) | 用单一捕获剂定量检测特异性分析物的方法及其试剂盒 | |
| US8962260B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US20100015634A1 (en) | In situ lysis of cells in lateral flow immunoassays | |
| EP2797679B1 (en) | Porous membranes having a hydrophilic coating and methods for their preparation and use | |
| Wang et al. | A novel immunochromatographic assay based on a time-resolved chemiluminescence strategy for the multiplexed detection of ractopamine and clenbuterol | |
| JP6328655B2 (ja) | 反応時間を使用してアッセイを較正すること | |
| CN1720455A (zh) | 基于膜的测定装置中钩效应的减小 | |
| JP4274944B2 (ja) | ダイナミックレンジが拡張された粒子利用リガンドアッセイ | |
| WO2010009206A2 (en) | In situ lysis of cells in lateral flow immunoassays | |
| JP2005510706A5 (ru) | ||
| Lu et al. | Rapid, quantitative and sensitive immunochromatographic assay based on stripping voltammetric detection of a metal ion label | |
| JP6832160B2 (ja) | 多重分析法を実行するための対照 | |
| RU2818001C1 (ru) | Способ повышения чувствительности мультиплексного иммунохроматографического анализа | |
| KR102172016B1 (ko) | 항-cyfra21-1 자가항체-항원 결합체 및 cyfra21-1 항원 마커의 검출방법 및 이들 마커의 비율을 이용한 폐암 진단키트 | |
| US20130217015A1 (en) | Hmga2 as a biomarker for diagnosis and prognosis of ovarian cancer | |
| RU2710262C1 (ru) | Способ проведения биологического микроанализа | |
| RU2519023C2 (ru) | Способ детектирования концентрации аналита с широким динамическим диапазоном | |
| JP2024519013A (ja) | 標的分析物を含有するエキソソームに特異的な抗体を使用したサンドイッチイムノアッセイデバイス |