DE60115420T2 - Kombinierte zellensysteme zum nachweis von viren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird in den Ansprüchen definiert und betrifft allgemein das Gebiet der diagnostischen Mikrobiologie, und insbesondere Verfahren zur Detektion und zur Differenzierung eines oder mehrerer Viren, die in einem Spezimen vorhanden sind.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Trotz jüngster Fortschritte bei Verfahren zur Detektion von Viren, unter Verwendung molekularer Verfahren, bleibt die Detektion und Identifikation dieser Organismen in Zellkulturen der „goldene Standard" mit dem die meisten viralen Krankheiten definitiv diagnostiziert werden, und das Verfahren, mit dem neuere Verfahren verglichen werden (Vgl. z. B., Wiedbrauk and Johnston, Manual of Clinical Virology, Raven Press, Inc., New York, N.Y. [1993], Seiten. 1–17). Zellkulturen werden auch zur Detektion und Identifikation anderer intrazellulärer Parasiten verwendet, insbesondere obligatorische intrazelluläre Parasiten, wie etwa Chlamydien und Rickettsien.
  • Es gibt zwei allgemeine Arten von Zellkulturverfahren, die für die Virusidentifikation verwendet werden. Das erste Verfahren verwendet die Identifikation von virusinduzierten zytopathischen Effekten (CPE) als Endpunkt für die Virusdetektion. Das zweite Verfahren nutzt Molekularverfahren, um das Vorhandensein eines Virus zu identifizieren, bevor CPE in den infizierten Kulturen evident sind. Beide Verfahren nutzen Zellkulturen, die kleinen Laboratorien mit begrenztem Fachwissen, Zellkultivierungsverfahren, Raum, Finanzierung, Ausrüstung und Betriebsstoffen, Probleme bereiten können. Abhängig von den verwendeten Zellen, können Zellkulturen schwierig zu erhalten sein, und erfordern häufig die Anstrengungen von Fachlaboratorien. Zusätzlich erfordern Zellkulturen Ausrüstung, wie etwa Zellkultur-Hoods, gestürzte Mikroskope (für die Beobachtung von Zellen), Inkubatoren mit CO2-Lines und andere Ausrüstungen, die in vielen Laboratorien nicht ohne weiteres verfügbar sind.
  • Tests auf CPE-Basis
  • Tests auf CPE-Basis erfordern häufig lange Inkubationszeiten, da virusinduzierte CPE erst nach vielen Runden viraler Replikation und Virusausbreitung in benachbarten Zellen (d. h., die Zellen sind „permissiv" für virale Infektion), evident werden. Virusausbreitung führt zur Zerstörung der Zellen, die die ursprünglich infizierten Zellen umgeben. Tests auf CPE-Basis wurden traditionell in Röhren oder Kolben durchgeführt, die einen Einzelzelltyp enthalten, der an den Seiten und/oder dem Boden der Röhre oder des Kolbens anhaftet oder verankert ist. Da der Virus eine Zelle infizieren, replizieren und sich in benachbarte Zellen ausbreiten muss, in denen der Prozess wiederholt wird, können sich Ergebnisse mindestens bis zu 28 Tagen verzögern. In der Tat sind Ergebnisse häufig 7 bis 28 Tage nach der Inokulation der Zellkultur mit der Virussuspension noch nicht verfügbar (Vgl. z. B., Leland, Clinical Virology, W. B. Saunders, Philadelphia [1996], Seiten 60–65). Die Zeit, die notwendig ist, um sichtbare CPE festzustellen, ist von der viralen Replikationsrate abhängig, die je nach Zelltyp und Viren variieren kann. Somit kann die Menge an Zeit, die benötigt wird, um einen Virus in einer Probe zu detektieren, stark variieren.
  • CPE-Vortests
  • Im Gegensatz zu Tests auf CPE-Basis erfordern CPE-Vortests nur den Eintritt des Virus in eine empfängliche Wirtszelle und die detektierbare Expression von mindestens einem frühen virusspezifischen Antigen oder einer Nukleinsäure. Die Detektion des virusspezifischen Analyts oder eines anderen Indikators wird durch eine Reihe von Verfahren (z. B., markierte Antikörper, Polymerase-Kettenreaktion [PCR], oder die Verwendung anderer Reporter, wie etwa dem ELVISTM-System) erreicht. Die Expression von frühen viralen Genen hat sich in vitro in vielen Virus-Wirtszellsystemen als sehr schnell erwiesen. Somit reduziert die Verwendung von, auf CPE-Vortests basierenden Virustests, die Zeit signifikant, die erforderlich ist, um Viren in klinischen Spezimen zu detektieren und zu identifizieren.
  • Prä-CPE-Detektion eines Virus wird häufig durch die Verwendung eines Monolayers aus anhaftenden Zellen erreicht, die auf runden 12 mm-Deckgläsern gewachsen werden, die in 1 dram Shell Vials (Flachbodengläsern) enthalten sind (d. h., mittels „Shell-Vial"-Verfahren oder -Technik). Die Shell-Vial-Technik verwendet das Zentrifugieren des Spezimens, um die virale Einführung in die Zellen zu forcieren und die virale Isolierung zu verstärken. Diese Vials werden präpariert, indem Zellen in sterile Shell Vials, die Deckgläser enthalten, dispensiert werden. Die Vials werden in senkrechter Posi tion inkubiert, bis die Zellen einen Monolayer auf dem Deckglas bilden. Für die Shell-Vial-Inokulation wird das Kulturmedium von dem Vial abgegossen, die prozessierte Probe, (d. h., das klinische Spezimen) dem Monolayer zugefügt, und das Vial wird bei niedriger Geschwindigkeit, häufig eine Stunde lang, zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird in jedes Vial frisches Kulturmedium zugefügt. Die Vials werden dann für den gewünschten Zeitraum inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit werden die Deckgläser unter Verwendung eines Antigen-Detektionsverfahrens (z. B., Immunfluoreszenz) gefärbt, oder die Zellen werden mittels molekularer Diagnosetechniken evaluiert.
  • Zusätzlich zu Viren, werden Shell Vials gewöhnlich auch zur Detektion und Identifikation von Chlamydien verwendet, da andere Verfahren, die zur Detektion und Identifikation dieser Organismen verfügbar sind, ziemlich beschwerlich sowie zeit- und reagensaufwändig sind (Vgl. z. B. Wiedbrauk und Johnston, oben, Seiten 64–76).
  • Der Hauptvorteil dieser CPE-Vortestverfahren ist, dass häufig schnelle Testergebnisse möglich sind. Ein Hauptnachteil von CPE-Vortests von Shell-Vial-Kulturen ist, dass diese Art von Test nur dann durchführbar und kostengünstig ist, wenn ein oder wenige virale Agenzien zur Identifikation gesucht werden, und wenn ein hoher Anteil der Spezimen wahrscheinlich positiv ist (Vgl. z. B. Schmidt and Emmons, „General Principles of Laboratory Diagnostic Methods for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections," in Schmidt und Emmons (eds.), Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial und Chlamydial Infections, American Public Health Association, Washington, D.C., [1989], auf Seite 4).
  • Klinische Spezimen
  • Zum Beispiel weckt das Vorhandensein von Hautbläschen im Genitalbereich eines Patienten den starken Verdacht auf eine Infektion durch einen Herpes-simplex-Virus (HSV). Typischerweise wird der Arzt ein Spezimen von der betroffenen Region erhalten (d. h. ein Bläschen) und einen CPE-Test oder einen CPE-Virusvortest auf einer einzigen HSV-empfänglichen Zelllinie bestellen. Diese Zelllinien werden häufig entweder in Röhren, Shell-Vials oder Multiwellplatten (z. B. Mikrotiterplatten) geliefert. Nach der Inokulation der Zelllinie und einer angemessenen Inkubationszeit kann die Bestätigung des Vorhandenseins von HSV in der Probe durch die Verwendung eines oder mehrerer der vielen Analyseverfahren (z. B. Immunfluoreszenz, Immunoperoxidase, DNA-Sonde oder Substraten für virusinduzierte Reportergene) erreicht werden.
  • Zur Detektion des Zytomegalovirus (CMV) werden häufig Shell Vials verwendet, die Zellen aus einer Einzelzelllinie enthalten (z. B. humane Fibroblastzelllinien, wie etwa Lungenzellen [MRC-5-Zellen] oder Vorhautzellen [HFF]). Die Zellen werden bis zur Konfluenz auf dem Deckglas innerhalb des Vials gewachsen, die Probe wird dem Vial zugefügt, das Vial wird 24 bis 48 Stunden lang oder länger inkubiert, und es wird ein Immunfluoreszenzverfahren verwendet, um die Expression von frühem CMV-Antigen zu detektieren.
  • Eine exakte Differentialdiagnose ist bei Virenkrankheiten signifikant schwieriger, die auf respirato rische, gastrointestinale, genitale oder parenterale Übertragungswege zurückzuführen sind, weil viele pathogene Viren ähnliche Symptome hervorzurufen können oder weil die Infektion subklinisch ist (d. h., die Anzeichen und Symptome sind nicht ohne weiteres wahrnehmbar).
  • Von den respiratorischen Viren sind Rhinoviren und Coronaviren für einen Großteil der Infektionen der oberen Atemwege verantwortlich. Sobald diese Viren die Schleimhaut der oberen Atemwege erreichen, lagern sie sich an Epithelzellen an und infizieren sie. Typischerweise dauern diese Infektionen nur wenige Tage und lösen sich von selbst. Andere respiratorische Viren, wie etwa die Influenzaviren, Parainfluenzaviren, das Respiratory-syncytial-Virus (RSV) und zahlreiche Adenoviren, lagern sich an Wimper- und Säulenepithelzellen an und infizieren sie. Die virusinfizierten Zellen lösen sich auf, was zu einer Freigabe von Enzymen und zur Komplementaktivierung führt, was zu einer lokalen mononuklearen Entzündungsantwort führt. Normale Reinigungsmechanismen der Atemwege versagen, da die normale Funktion der Epithelzellen versagt. Diese Zellen können auch abgestoßen werden. Zelltrümmer toter oder absterbender Zellen verstopfen die Atemwege häufig, und der Wirt wird sehr empfänglich für eine sekundäre bakterielle Infektion und/oder eine Superinfektion. Alle diese Viren können zu niedrigerer respiratorischer Beteiligung und Pneumonie führen. Nach der Replikation in den respiratorischen Epithelzellen kann ein Adenovirus über das Blut zu den lymphatischen Geweben in allen Bereichen des Körpers reisen und systemische Infektion oder Krankheit auslösen.
  • Klinische virologische Standardpraxis ist es, viele Röhren mit Zellkulturen mit dem Spezimen zu ino kulieren (z. B. Rachenabstrich, Nasenrachenabstrich oder Sputumspezimen), da der Tropismus jeder Virusart für spezifische Zelltypen häufig sehr gering ist (d. h., nur ein Virustyp kann auf einem Einzelzelltyp optimal wachsen). Dieser geringe Tropismus des Virus für eine begrenzte Anzahl von Zelltypen schafft mindestens zwei praktische Hauptprobleme sowohl für CPE- als auch für CPE-Vortests.
  • Erstens, sind primäre Affennierenzellen gegenwärtig die Zelllinie der Wahl für die Isolierung von Influenzaviren. Die Herstellung dieser Zellen erfordert die Quarantäne der Quellentiere in langen Zeiträumen vor der Schlachtung und Zellkulturpräparation. Diese Quarantänezeit wird verwendet, um die Gesundheit der Tiere zu überwachen, und gibt Zeit, die Tiere auf die Infektion durch endogene Affenviren, wie etwa Foamy-Virus, SV5 und SV40 zu testen. Die Quarantänezeit reduziert auch die Möglichkeit stark, beseitigt sie aber nicht, dass die Affen mit dem Monkey-B-Virus, einem Herpesvirus infiziert sind, der für Menschen höchst tödlich ist. Zusätzlich gibt es andere Probleme im Zusammenhang mit der Verwendung von Affen für die Produktion primärer Zellkulturen, einschließlich der Verringerung des Bestands geeigneter Tiere, die auf Import-Angelegenheiten und Rücksichtnahme auf die Affenpopulation zurückzuführen sind.
  • Zweitens, sind zusätzlich Dauerzelllinien erforderlich, um andere respiratorische Viren als den Influenzavirus zu detektieren. Somit werden viele Zelllinien verwendet, um die virale Infektion/Krankheit eines jeden Patienten zu diagnostizieren. Der Bedarf an vielen Einheiten individueller Zelllinien ist in Verfahren zusammengesetzt, die CPE-Vortests zur Detektion und I dentifikation respiratorischer Viren verwenden. Das CPE-Vortesten auf respiratorische Viren erfordert signifikanten Arbeitsaufwand bei der Handhabung der Deckgläser, zusätzliche Ausgaben für molekulare Reagenzien, die für die vielen Zelllinien verwendet werden, sowohl für positive als auch für negative Spezimen, und die signifikante Arbeit im Zusammenhang mit dem mikroskopischen Lesen jeder der vielen Zelllinien, die in dem Panel der Zelllinien inokuliert werden.
  • Jedoch trotz dieser Nachteile wird die Shell-Vial-Technologie, bei der Einzelzelltypen in vielen Einheiten (Röhren, Shell Vials usw.) verwendet werden, gegenwärtig immer noch verwendet, um respiratorische Viren zu detektieren, da es ein bewährtes Verfahren ist. Zum Beispiel ergab die Detektion von RSV in 16 Stunden unter Verwendung von Shell Vials, die nur HEp-2-Zellen enthalten, mehr positive Zellen als Antigen-Detektionsverfahren, die direkt auf dem klinischen Spezimen angewendet wurden, und genauso viele positive Zellen, wie herkömmliche Zellkulturen (Smith et al., J. Clin. Microbiol., 29: 463–465 [1991]). Die Isolierung anderer respiratorischer Viren war auch mit Shell-Vial-Kulturen möglich, die einen Monolayer eines Einzelzelltyps enthielten. Zum Beispiel wurden bei der Verwendung von Vials mit primären Affennierenzellen und A549-Zellen, die 40 Stunden lang inkubiert wurden, 83% Adenoviren, 94% Influenza-B-Viren und 80% Parainfluenzaviren vom Typ 1, 2, und 3 identifiziert (Rabalais et al., J. Clin. Microbiol., 30: 1505–1508 [1992]). In einem anderen Bericht 50% Adenoviren, 94% Influenza-A-Viren, 100% Influenza-B-Viren und 100% Parainfluenzaviren in Shell Vials mit primären Rhesusaffennierenzellen und 92% RSV in Shell Vials mit HEp-2-Zellen, die 2 bis 4 Tage lang inkubiert wurden (Vgl. z. B. Olsen et al., J. Clin. Microbiol., 31: 422–425 [1993]; und Leland, Clinical Virology, W. B. Saunders Company, Philadelphia, Pa. [1996], auf den Seiten 85–86).
  • Auch wenn diese Verfahren relativ schnell Ergebnisse bereitstellen (d. h., im Gegensatz zu den langen Inkubationszeiten, die für CPE-Tests häufig nötig sind), besteht weiterhin ein Bedarf bei klinischen Virenlaboren und Referenzvirenlaboren für Zellkulturverfahren und Zusammensetzungen für die verlässliche Detektion und Identifikation von Viren in einer einzigen, leicht zu handhabenden Einheit, die die schnelle Detektion und Identifikation auf kostengünstige Weise bereitstellt, und dabei gleichzeitig die Sensitivität eines diagnostischen Assaysystem bereitstellt.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird in den Ansprüchen definiert und betrifft allgemein das Gebiet der diagnostischen Mikrobiologie, und insbesondere Verfahren zum Nachweis und zur Differenzierung eines oder mehrerer Viren, die in einem Spezimen vorhanden sind.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die zur Detektion von Viren unter Verwendung von CPE- und CPE-Vortest-Verfahren geeignet sind. Die bevorzugten Ausführungsformen schließen gemischte Zellkulturen ein, die mindestens zwei verschiedene Zelltypen enthalten. In einigen bevorzugten Ausführungsformen enthalten die gemischten Zellkulturen zwei verschiedene Zelltypen, während in anderen Ausführungsformen, die gemischten Zellkulturen drei oder mehr verschiedene Zelltypen enthalten. Somit ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen einschließt, in denen mindestens zwei Zelltypen in einem Behälter (z. B. einem Kolben, Röhre, Shell Vial oder jedem anderen Behälter, der für das Wachsen von Zellen geeignet ist) zusammengemischt werden. Dabei ist wesentlich, dass jeder Zelltyp innerhalb dieser gemischten Zellkulturen seine Empfänglichkeit für Viren und andere intrazelluläre Parasiten behält, genauso als ob er in einer Einzelzellkultur wäre (d. h., eine Zellkultur, die nur einen Zelltyp enthält, wie dem Fachmann bekannt). Zusätzlich bleiben die gemischten Zellkulturen der vorliegenden Erfindung solange lebensfähig wie es für ihre Verwendung in diagnostischen Assays erforderlich ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Zelltypen, die in den gemischten Zellkulturen enthalten sind, in ungefähr dem gleichen Verhältnis vorhanden (d. h., in einer Mischung aus zwei Zelltypen beträgt das Verhältnis der Zelltypen 50:50). Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf irgendein bestimmtes Verhältnis von Zelltypen in einer gemischten Kultur beschränkt ist, da zahlreiche Detektionssysteme unter Verwendung verschiedener Verhältnisse optimiert werden können. Zum Beispiel kann unter gewissen Umständen eine Zweizellenmischung von 45:55, 40:60, oder sogar von 35:75 geeigneter sein als ein Verhältnis von 50:50.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die zur Detektion und Identifikation nicht viraler obligatorischer intrazellulärer und intrazellulärer Parasiten, wie etwa Mitglieder der Chlamydien- und Ricketsienfamilien, geeignet sind.
  • Die vorliegende Erfindung erwägt auch Zusammensetzungen, die eine Zellkultur umfassen, die zur Detek tion intrazellulärer Parasiten geeignet ist, wobei die Zellkultur mindestens zwei Zelltypen umfasst, die für die Infektion durch mindestens einen intrazellulären Parasiten empfänglich sind. In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Zusammensetzung umfassen die Zelltypen einen ersten Zelltyp und einen zweiten Zelltyp. In einigen Ausführungsformen besteht der erste Zelltyp aus Buffalo-Green-Affennierenzellen und der zweite Zelltyp aus Nerzlungenzellen. In anderen Ausführungsformen besteht der erste Zelltyp aus Nerzlungenzellen und der zweite Zelltyp besteht aus menschlichen mucoepidermoiden Zellen. In noch anderen Ausführungsformen besteht der erste Zelltyp aus menschlichen Lungenkarzinomzellen und der zweite Zelltyp besteht aus menschlichen mucoepidermoiden Zellen. In noch anderen Ausführungsformen besteht der erste Zelltyp aus Buffalo-Green-Affennierenzellen und der zweite Zelltyp aus menschlichen embryonalen Lungenzellen. In weiteren Ausführungsformen besteht der Zelltyp aus menschlichen epidermoiden Kehlkopf karzinomzellen und der zweite Zelltyp besteht aus McCoy-Zellen. In zusätzlichen Ausführungsformen besteht der erste Zelltyp aus Nerzlungenzellen und der zweite Zelltyp besteht aus menschlichen diploiden Lungenzellen.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Zelltypen der Zusammensetzung empfänglich für respiratorische Viren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Influenzaviren jeden Typs (z. B. Influenza A, Influenza B und Influenza C) und/oder Stamms, RSV, Zytomegalovirus, Parainfluenzaviren, Respiratorysyncytial-Virus, Rhinoviren, Coronoviren und Adenoviren. In noch anderen Ausführungsformen sind die Zelltypen der Zusammensetzung empfänglich für Enteroviren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf jeden Typ und/oder Stamm von Echovirus, Poliovirus und Coxsackievirus (z. B. Coxsackie-A- und -B-Viren) und nummerierte EV-Stämme. Zusätzlich zu den Enteroviren erwägt die vorliegende Erfindung Zelltypen, die für Picornaviren, wie etwa Hepatitis A, empfänglich sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Detektion und Identifikation intrazellulärer Parasiten in einer Probe bereit, die die Schritte des Bereitstellens einer Probe, die im Verdacht steht, eine oder mehrere intrazellulären Parasiten zu enthalten; und eine gemischte Zellkultur, die mindestens zwei Zelltypen umfasst; Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein von dem einen oder mehrerer intrazellulärer Parasiten, umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist der intrazelluläre Parasit ein Virus. In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der Virus ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zytomegalovirus, Influenzaviren, Parainfluenzaviren, Respiratorysyncytial-Virus, Rhinoviren, Coronoviren, und Adenoviren. In noch anderen Ausführungsformen des Verfahrens ist der Virus ein Enterovirus. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der Enterovirus ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Poliovirus, Coxsackieviren und Echoviren (z. B. Coxsackie-A- und -B-viren) und nummerierten EV-Stämmen. Zusätzlich zu den Enteroviren erwägt die vorliegende Erfindung Zelltypen, die für Picornaviren, wie etwa Hepatitis A, empfänglich sind. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der Virus ein Herpesvirus. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der Herpesvirus ausge wählt aus einer Gruppe bestehend aus Herpes-simplex Typ 1, Herpes-simplex Typ 2, Zytomegalovirus, Varicella-Zoster-Virus, Epstein-Barr-Virus, Human-Herpes-Virus 6, Human-Herpes-Virus 7 und Human-Herpes-Virus B. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der intrazelluläre Parasit ein Mitlied der Gattung Chlamydia. In noch anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der intrazelluläre Parasit C. trachomatis.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren umfassen die Zelltypen einen ersten Zelltyp und einen zweiten Zelltyp. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der erste Zelltyp eine Nerzlungenzelle und der zweite Zelltyp ist eine menschliche mucoepidermoide Zelle. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der erste Zelltyp eine Buffalo-green-Affennierenzelle und der zweite Zelltyp ist eine menschliche mucoepidermoide Zelle. In noch einer anderen alternativen Ausführungsform ist der erste Zelltyp eine gentechnisch hergestellte Babyhamsternierenzelle und der zweite Zelltyp ist eine Nerzlungenzelle. In noch anderen Ausführungsformen ist der erste Zelltyp ein gentechnisch hergestellter Zelltyp und der zweite Zelltyp ein zweiter gentechnisch hergestellter Zelltyp.
  • Es wird in Erwägung gezogen, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Kontrollen bekannter Positivität und Negativität für das Virus/die Viren und/oder anderer interessierender intrazellulärer Organismen verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Detektion und Identifikation intrazellulärer Parasiten in einer Probe bereit, die die Schritte umfassen des Bereitstellens: einer Probe, die im Verdacht steht, einen oder mehrere intrazelluläre Parasiten zu enthalten; und eine gemischte Zellkultur, die mindestens zwei Zelltypen umfasst; Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein von dem einen oder mehrerer intrazellulärer Parasiten, umfassen.
  • In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der intrazelluläre Parasit ein Virus. In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der Virus ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Zytomegalovirus, Influenzaviren, Parainfluenzaviren, Respiratory-syncytial-Virus, Rhinoviren, Coronoviren, und Adenoviren. In noch anderen Ausführungsformen des Verfahrens ist der Virus ein Enterovirus. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der Enterovirus ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Poliovirus, Coxsackieviren und Echoviren (z. B. Coxsackie-A- und -B-viren) und nummerierten EV-Stämmen. Zusätzlich zu den Enteroviren erwägt die vorliegende Erfindung Zelltypen, die für Picornaviren, wie etwa Hepatitis A, empfänglich sind. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der Virus ein Herpesvirus. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen wird der Herpesvirus ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Herpes-simplex Typ 1, Herpes-simplex Typ 2, Zytomegalovirus, Varicella-Zoster-Virus, Epstein-Barr-Virus, Human-Herpes-Virus 6, Human-Herpes-Virus 7 und Human-Herpes-Virus 8. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der intrazelluläre Parasit ein Mitlied der Gattung Chlamydia. In noch anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der intrazelluläre Parasit C. trachomatis.
  • In einigen bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren umfassen die Zelltypen einen ersten Zelltyp und einen zweiten Zelltyp. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der erste Zelltyp eine Nerzlungenzelle und der zweite Zelltyp ist eine menschliche mucoepidermoide Zelle. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist der erste Zelltyp eine Buffalo-green-Affennierenzelle und der zweite Zelltyp ist eine menschliche mucoepidermoide Zelle. In noch einer anderen alternativen Ausführungsform ist der erste Zelltyp eine gentechnisch hergestellte Babyhamsternierenzelle und der zweite Zelltyp ist eine Nerzlungenzelle. In noch anderen Ausführungsformen ist der erste Zelltyp ein gentechnisch hergestellter Zelltyp und der zweite Zelltyp ein zweiter gentechnisch hergestellter Zelltyp.
  • Es wird in Erwägung gezogen, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Kontrollen bekannter Positivität und Negativität für das Virus/die Viren und/oder anderer interessierender intrazellulärer Organismen verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Detektion eines Influenzavirus bereit, die die Schritte des Bereitstellens einer Probe umfassen, die im Verdacht steht, einen Influenzavirus zu enthalten, und Nerzlungenzellen; Inokulieren der Nerzlungenzellen mit der Probe; und Detektieren des Vorhandenseins von Influenza in den Nerzlungenzellen. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Nerzlungenzellen Mv1Lu-Zellen. In alternativen Ausführungsformen wird der Influenzavirus ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Influenza A, Influenza B und Influenza C.
  • Es wird in Erwägung gezogen, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Kontrollen bekannter Positivität und Negativität für das Virus/die Viren und/oder anderer interessierender intrazellulärer Organismen verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion infektiöser Viren in einem Spezimen bereit, die die Schritte umfassen: a) Bereitstellen eines Spezimen, das im Verdacht steht, einen Virus zu enthalten, eine Zelllinie, die für die Infektion mit einem Virus permissiv ist, und eine gentechnisch hergestellte Zelllinie, die ein Oligonukleotid enthält, das eine Sequenz aufweist, die eine Promotersequenz umfasst, die von dem Virus abgeleitet ist, wobei die Promotersequenz operativ mit einem Reportergen verknüpft ist, und wobei die Expression des Reportergens abhängig ist von und quantitativ proportional zum Vorhandensein des Virus; b) Zusammenmischen der permissiven Zelllinie und der gentechnisch hergestellten Zelllinie, um eine gemischte Zellkultur zu schaffen; c) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit dem Spezimen unter Bedingungen, die die Infektion der gemischten Zellkultur mit dem Virus ermöglichen; und d) Detektieren der Expression des Reportergens und dadurch Detektieren des Vorhandenseins des Virus in dem Spezimen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gemischte Zellkultur eine Mischung, bestehend aus 80 bis 99% der permissiven Zelllinie und 1 bis 20% der gentechnisch hergestellten Zelllinie. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die gemischte Zellkultur eine Mischung, bestehend aus gleichen Anteilen der Zelltypen, die in der Mischung verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens enthält die gentechnisch hergestellte Zelllinie ein Oligonukleotid, das eine Sequenz aufweist, die einen Herpesvirus-induzierbaren Promoter umfasst, der operativ mit einem Reportergen verknüpft ist, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend das Escherichia-coli-lacZ-Gen und ein Luciferasegen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die gentechnisch hergestellte Zelllinie BHKICP10LacZ. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist die gentechnisch hergestellte Zelllinie BHKICP6LacZ. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass das Reportergen auf die lacZ- und Luciferasegene beschränkt ist. Es wird in der Tat erwogen, dass jedes geeignete Reportergen, das dem Fachmann bekannt ist, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sein wird.
  • Es wird auch erwogen, dass zahlreiche permissive Zelllinien in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar sein werden. In einer Ausführungsform ist die permissive Zelllinie permissiv für die Infektion mit dem Herpesvirus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die permissive Zelllinie MRC-5.
  • Es wird erwogen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Kontrollen bekannter Positivität und Negativität für das Virus/die Viren verwendet wird. Somit wird für die gemischten Kulturen, bei denen gentechnisch hergestellte Zelllinien verwendet werden, erwogen, dass die Muster der Reportergenexpression, die in einer Testprobe vorhanden sind (z. B. von einem klinischen Spezimen) mit den Mustern der Reportergenexpression in Kontrollproben verglichen werden, von denen bekannt ist, dass sie positiv und/oder negativ für den/die interessierenden Virus/Viren sind. Es wird auch erwogen, dass Effekte, die nicht mit der Expression des Reportergens in Verbindung stehen, detektierbar sein werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CPE. Diese Effekte, allein und in Kombination mit der Reportergenexpression, können verwendet werden, um das Vorhandensein viraler Infektion zu detektieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren für die Typisierung eines infektiösen Herpesvirus in Spezimen bereit, die die Schritte umfassen: a) Bereitstellen eines Spezimens, das im Verdacht steht, einen oder mehrere Mitglieder der Herpesvirusfamilie zu enthalten, eine Zelllinie, die permissiv ist für die Infektion durch einen oder mehrere Mitglieder der Herpesvirusfamilie, eine gentechnisch hergestellte Zelllinie, die ein Oligonukleotid mit einer Sequenz aufweist, die eine Promotersequenz umfasst, die abgeleitet ist von einem Mitglied der Herpesvirusfamilie, wobei die Promotersequenz operativ mit einem Reportergen verknüpft ist, und die Expression des Reportergens abhängig ist von und quantitativ proportional zum Vorhandensein des Herpesvirus und wobei die Expression des Reportergens auf unterscheidbare Weise variiert, als Ergebnis des Vorhandenseins verschiedener Mitglieder der Herpesvirusfamilie; b) Zusammenmischen der permissiven Zelllinie und der gentechnisch hergestellten Zelllinie, um eine gemischte Zellkultur zu schaffen; c) Inokulieren dieser gemischten Zellkultur mit dem Spezimen unter Bedingungen, die die Infektion der gemischten Zellkultur durch Mitglieder der Herpesvirusfamilie ermöglichen, wobei die Infektion zu einem unterscheidbaren Expressionsmuster durch das Reportergen führt; d) Detektieren der Expression des Reportergens und dadurch Detektieren des Vorhandenseins eines oder mehrerer Mitglieder der Herpesvirusfamilie in dem Spezimen; und e) Identifizie ren des Vorhandenseins eines spezifischen Mitglieds der Herpesvirusfamilie auf der Basis des resultierenden unterscheidbaren Musters. Es wird erwogen, dass dieses Expressionsmuster beobachtbar sein wird durch zahlreiche unterstützte und nicht unterstützte Verfahren, einschließlich visueller Beobachtung durch das Auge, spektrophotometrischer Beobachtung usw. Es ist nicht beabsichtigt, dass die Detektion des/der unterscheidbaren Musters) auf irgendein besonderes Detektionsverfahren beschränkt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Typisierungsverfahrens ist die gemischte Zellkultur eine Mischung bestehend aus 80 bis 99% der permissiven Zelllinie und 1 bis 20% der gentechnisch hergestellten Zelllinie. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Zelltypen in ungefähr gleichen Anteilen in den gemischten Zellkulturen. Wie beim ersten Verfahren beschrieben, ist es nicht beabsichtigt, dass sich die vorliegende Erfindung auf irgendeinen besonderen Herpesvirus beschränkt. In einer besonderen Ausführungsform wird das Mitglied der Herpesvirusfamilie, das unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung detektiert und typisiert wird, ausgewählt aus der Gruppe, die HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, EBV, und menschliche Herpesviren wie etwa HHV-6, HHV-7 und HHV-8, umfasst. Es ist beabsichtigt, dass einer oder mehrere Herpesviren in einem Spezimen detektiert und typisiert werden können. Auf diese Weise kann die Co-Infektion mit mehreren Herpesviren diagnostiziert werden. Es wird zum Beispiel erwogen, dass gemischte Infektionen mit HSV-1 und HSV-2 unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung detektierbar sein können und die Infektionen unterschieden werden können.
  • In einer Ausführungsform des Typisierungsverfahrens umfasst das Reportergen das E.-coli-lacZ-Gen. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass das Reportergen auf das lacZ-Gen beschränkt ist. Es wird in der Tat erwogen, dass jedes Reportergen in diesem Verfahren verwendet werden kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Detektion des Reportergens durch die Verwendung histochemischer Färbung erreicht. Es wird erwogen, dass ein Mitglied der Herpesvirusfamilie ein histochemisches Expressionsmuster produzieren wird, das von den histochemischen Mustern, die von anderen Mitgliedern der Herpesvirusfamilie produziert werden, unterscheidbar ist. Auf diese Weise ist es möglich, die Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwenden, um die Infektion mit einem Herpesvirus von der Infektion mit einem anderen Herpesvirus zu unterscheiden.
  • Es wird erwogen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit Kontrollen bekannter Positivität und Negativität für das Virus/die Viren verwendet wird. Somit wird erwogen, dass die Expressionsmuster, die in einer Testprobe vorhanden sind (z. B. von einem klinischen Spezimen) mit den Expressionsmustern in Kontrollproben verglichen werden, von denen bekannt ist, dass sie positiv und/oder negativ für den/die interessierenden Virus/Viren sind. Es wird auch erwogen, dass Effekte, die nicht mit der Expression des Reportergens in Verbindung stehen, detektierbar sein werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CPE. Diese Effekte, allein und in Kombination mit der Reportergenexpression, können verwendet werden, um das Vorhandensein von viraler Infektion zu detektieren, sowie Information bereitzustellen, um zwischen den Viren zu unterscheiden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die eine gemischte Zellkultur umfasst, wobei die gemischte Zellkultur die Kombination einer gentechnisch hergestellten Zelllinie, die mit einer Promotersequenz eines Virus transformiert wurde, wobei die Promotersequenz operativ verknüpft ist mit einem Reportergen, und wobei die Expression des Reportergens abhängig ist von und quantitativ proportional zum Vorhandensein des Virus, und eine nicht gentechnisch hergestellte Zelllinie, die für die Infektion mit dem Virus permissiv ist, umfasst.
  • In einer Ausführungsform der Zusammensetzung ist die gemischte Zellkultur eine Mischung, bestehend aus 1 bis 20% der gentechnisch hergestellten Zelllinie und 80 bis 99% der permissiven Zelllinie. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Zelltypen in ungefähr gleichen Anteilen in den gemischten Zellkulturen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Zusammensetzung kann die gentechnisch hergestellte Zelllinienkomponente einen Promoter für ein Gen umfassen, dass Ribonukleotidreductase kodiert. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann der Promoter Gene umfassen, die eine oder mehrere Untereinheiten der Ribonukleotidreductase kodieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die gentechnisch hergestellte Zelllinie, BHKICP10LacZ, während in einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform die gentechnisch hergestellte Zelllinie, BHKICP6LacZ ist. In einer al-ternativen Ausführungsform der Zusammensetzung umfasst die gentechnisch hergestellte Zelllinie ein E.-coli-lacZ-Gen, das 3' zu einem virusinduzierbaren Promoter positioniert ist. Es wird erwogen, dass dieses lacZ-Gen direkt 3' zu diesem virusinduzierbaren Promoter positi oniert ist. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass diese Sequenzen angrenzend sein werden. Es wird in der Tat nur erwogen, dass das Reporter- und das Promotergen operativ verknüpft sind. Außerdem wird erwogen, dass die Zusammensetzung Promotersequenzen von irgendeinem Virus umfassen wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Mitglieder der Herpesvirusfamilie. Es wird auch erwogen, dass die nicht gentechnisch hergestellte Zelllinie für die Infektion durch jede Anzahl von Viren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Mitglieder der Herpesvirusfamilie permissiv ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Zusammensetzung eine gentechnisch hergestellt Zelllinie, die einen Promoter für ein Gen beinhaltet, der eine große Ribonukleotidreductase-Untereinheit beinhaltet, und der Virus ist ein Mitglied der Herpesvirusfamilie, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7 und HHV-8. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Herpesvirus beschränkt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die gentechnisch hergestellte Zelllinienkomponente einen ICP10-Promoter und das Herpesvirusfamilienmitglied ist HSV-2, während in einer anderen bevorzugten Ausführungsform die gentechnisch hergestellte Zelllinie einen ICP6-Promoter umfasst und das Herpesvirusfamilienmitglied HSV-1 ist.
  • Es wird erwogen, dass die Detektion der Reportergenexpression durch die Verwendung zahlreicher Verfahren erreicht wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf kolorimetrische, fluorimetrische oder luminometrische Assays oder Assaysysteme. In einer bevor zugten Ausführungsform kodiert das Reportergen R-Galactosidase.
  • In einer Ausführungsform beinhaltet die Zusammensetzung eine gentechnisch hergestellte Zelllinie, die eine Säugerzelllinie ist, die empfänglich für eine Virusinfektion ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die gentechnisch hergestellte Zelllinie Babyhamsternierenzellen (z. B. Zelllinien, die von BHK-Zellen abgeleitet sind). In einer Ausführungsform beinhaltet die Zusammensetzung eine permissive Zelllinie, die für die Infektion mit Herpesviren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf HSV-1 und HSV-2 permissiv ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die permissive Zelllinie MRC-5. Es ist nicht beabsichtigt, dass die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auf die Detektion einer viralen Infektion auf der Basis der Expression des Reportergens beschränkt ist, da Effekte, wie etwa CPE auch detektierbar sein können.
  • Die vorliegenden Erfindung stellt auch ein Kit zum Analysieren des Vorhandenseins eines infektiösen Herpesvirus in einem Spezimen bereit. Der Kit umfasst: a) eine Lieferung einer gemischten Zelllinie, umfassend eine Zelllinie aus gentechnisch hergestellten Säugerzellen, die für die Infektion mit einem Herpesvirus empfänglich sind, wobei die Zelllinie ein Oligonukleotid enthält, das eine Sequenz aufweist, die eine Viruspromotersequenz umfasst, die operativ mit einem Reportergen verknüpft ist, und wobei die Expression des Reportergens abhängig ist von und quantitativ proportional zum Vorhandensein des Virus in dem Spezimen; und eine für den Virus permissive Zelllinie; und b) eine Lieferung von Reagenzien, um die Expression des Reportergens zu detektieren. Es ist nicht beabsichtigt, dass die Promotersequenzen, die in der gentechnisch hergestellten Zelllinie vorhanden sind, auf irgendeinen besonderen Virus oder eine Virusfamilie beschränkt sind. Es wird erwogen, dass jeder Viruspromoter im Kit der vorliegenden Erfindung verwendbar sein wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind jedoch Herpesviruspromotersequenzen in den gentechnisch hergestellten Zelllinien vorhanden.
  • Es wird erwogen, dass zahlreiche Promotersequenzen im Kit der vorliegenden Erfindung verwendbar sein werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert der Promoter jedoch entweder ein vollständiges Ribonukleotidreductaseenzym, oder als Alternative, Untereinheiten von Ribonukleotidreductase. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Promotersequenz einen Promoter für ein Gen, der eine große Ribonukleotidreductase-Untereinheit kodiert, und der Herpesvirus ist ein Herpesvirusfamilienmitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7 und HHV-8. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass der Kit auf diese Liste von Herpesviren beschränkt sein wird. Es wird in der Tat erwogen, dass jeder Herpesvirus unter Verwendung des vorliegenden Kits detektiert werden kann. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kits enthält die Promotersequenz einen ICP10-Promoter und das Herpesvirusfamilienmitglied ist HSV-2, während in einer alternativen bevorzugten Ausführungsform, die Promotersequenz einen ICP6-Promoter enthält, und das Herpesvirusfamilienmitglied HSV-1 ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits umfasst die Promotersequenz, die in der gentechnisch hergestellten Zelllinie vorhanden ist, ein E.-coli-lacZ-Gen, das operativ mit einem Herpesvirus- induzierbaren Promoter verknüpft ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die gentechnisch hergestellten Säugerzellen BHKICP10LacZ-Zellen, während in einer alternativen Ausführungsform, die Zellen BHKICP6LacZ-Zellen sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das Reportergen β-Galactosidase. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Reportergen beschränkt ist. Es wird auch erwogen, dass das Reportergen eine Anzahl von Enzymen kodiert, die zur Detektion mittels zahlreicher Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf solche Verfahren, wie kolorimetrische, fluorimetrische oder luminometrische Assaysysteme geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Kits, können die Reagenzien, die zur Detektion der Reportergenexpression bereitgestellt werden, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Lösungen von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, o-Nitrophenyl-galactopyranosid-Lösung und Fluorescein-di-β-D-galactopyranosid. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, den Kit auf diese Assaysysteme zu begrenzen, da andere Systeme (z. B. radiometrische Assaysysteme) verwendbar sein können.
  • Es wird erwogen, dass der Kit der vorliegenden Erfindung auch zusätzliche Komponenten beinhalten kann, wie etwa Materialien, die für positive und negative Kontrollen geeignet sind, und Gebrauchsanleitungen. Es ist nicht beabsichtigt, dass der Kit der vorliegenden Erfindung auf die gemischte Zelllinie und Reagenzien zur Detektion der Reportergenexpression beschränkt ist. Es ist auch beabsichtigt, dass der Kit zur Detektion viraler Effekte auf andere Zellen als und nicht mit der Reportergenexpression verbundene Zellen verwendbar sein wird. Zum Beispiel wird erwogen, dass der Kit zur Detektion von CPE verwendbar sein kann.
  • Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Detektion und Identifikation eines Enterovirus in einer Probe bereit, indem gemischte Zelltypkulturen, die RD Zellen und menschliche mucoepidermoide Zellen enthalten, verwendet werden. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion und Identifikation eines Enterovirus in einer Probe bereit, umfassend: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Enterovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die mindestens zwei Zelltypen umfasst, wobei die Zelltypen RD-Zellen und menschliche mucoepidermoide Zellen umfassen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit mindestens einem Teil der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein eines Enterovirus. Ohne die Absicht, die Erfindung auf irgendeine bestimmte mucoepidermoide Zelle zu begrenzen, ist in einer bevorzugten Ausführungsform die menschliche mucoepidermoide Zelle H292. Ebenfalls ohne die Absicht, die Erfindung auf die Art des Enterovirus zu beschränken, wird in einer alternativen bevorzugten Ausführungsform der Enterovirus aus Coxsackieviren, Echoviren und Polioviren ausgewählt.
  • Ebenso werden hier Verfahren zur Detektion und Identifikation eines Enterovirus in einer Probe bereitgestellt, indem gemischte Zelltypkulturen verwendet werden, die Caco-2-Zellen in Kombination mit anderen Zelltypen enthalten. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion und Identifikation eines Enterovirus in einer Probe bereit, umfassend: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, ei nen Enterovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die mindestens zwei Zelltypen umfasst, wobei die Zelltypen Caco-2-Zellen umfassen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit mindestens einem Teil der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Enterovirus. Es ist nicht beabsichtigt, dass die Erfindung auf den Typ oder die Quelle der Zelltypen beschränkt ist, die in einer gemischten Zellkultur mit Caco-2-Zellen vorhanden sind. Dennoch werden in einer Ausführungsform Zelltypen, die nicht Caco-2-Zellen sind, ausgewählt aus RD-Zellen, H292-Zellen, BGMK-Zellen und A549-Zellen. Es ist nicht beabsichtigt, dass die hier bereitgestellten Verfahren auf den Enterovirustyp beschränkt sind. In einer Ausführungsform wird der Enterovirus jedoch ausgewählt aus Coxsackieviren, Echoviren, Polioviren, Rotaviren, Astroviren und Adenoviren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Detektion und Identifikation von Zytomegalovirus in einer Probe bereit, die die Schritte umfassen a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Zytomegalovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die MRC-5-Zellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der ausgewählt ist aus McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, HEp-2-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Zytomegalovirus.
  • Hier wird ebenfalls ein Verfahren zur Detektion und Identifikation von Enterovirus in einer Probe be reitgestellt, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Enterovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die CV-1-Zellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der ausgewählt ist aus MRC-5-Zellen McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, HEp-2-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Enterovirus.
  • Die Erfindung offenbart zusätzlich ein Verfahren zur Detektion und Identifikation von Enterovirus in einer Probe, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Enterovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die Buffalo-Green-Affenzellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der ausgewählt ist aus MRC-5-Zellen CV-1-Zellen, McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, HEp-2-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Enterovirus.
  • Ferner wird mit dieser Offenbarung ein Verfahren zur Detektion und Identifikation von Herpes-simplex-Virus in einer Probe bereitgestellt, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Herpes-simplex-Virus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die gentechnisch hergestellte Babyhamsternierenzellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der einen ersten Zelltyp umfasst, ausgewählt aus MRC-5-Zellen CV-1-Zellen, Buffalo-green- Affennierenzellen, McCoy-Zellen, A549-Zellen, HEp-2-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Herpessimplex-Virus.
  • Es wird ein weiteres Verfahren zur Detektion und Identifikation von Adenovirus in einer Probe bereitgestellt, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen von: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Adenovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die A549-Zellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der einen ersten Zelltyp umfasst, ausgewählt aus MRC-5-Zellen CV-1-Zellen, Buffalo-Green-Affennierenzellen, McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, HEp-2-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Adenovirus.
  • Hier wird ebenfalls ein Verfahren zur Detektion und Identifikation von Respiratory-syncytial-Virus in einer Probe bereitgestellt, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Respiratory-syncytial-Virus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die Hep-2-Zellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der einen ersten Zelltyp umfasst, ausgewählt aus MRC-5-Zellen CV-1-Zellen, Buffalo-Green-Affennierenzellen, McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Respiratory-syncytial-Virus.
  • Zusätzlich wird ein Verfahren zur Detektion und Identifikation eines Virus bereitgestellt, ausgewählt aus Influenzavirus und Parainfluenzavirus in einer Probe, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Virus zu enthalten, ausgewählt aus Influenzavirus und Parainfluenzavirus; und ii) eine gemischte Zellkultur, die Mv1Lu-Zellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der einen ersten Zelltyp umfasst, ausgewählt aus MRC-5-Zellen CV-1-Zellen, Buffalo-Green-Affennierenzellen, McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, Hep-2-Zellen und H292-Zellen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Virus, ausgewählt aus Influenzavirus und Parainfluenzavirus.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Detektion und Identifikation eines Virus, ausgewählt aus Respiratory-syncytial-Virus, Adenovirus, Zytomegalovirus und Parainfluenzavirus in einer Probe bereit, das die Schritte umfasst: a) Bereitstellen: i) einer Probe, die im Verdacht steht, einen Virus zu enthalten, ausgewählt aus Respiratory-syncytial-Virus, Adenovirus, Zytomegalovirus und Parainfluenzavirus; und ii) eine gemischte Zellkultur, die H292-Zellen und mindestens einen Zelltyp umfasst, der einen ersten Zelltyp umfasst, ausgewählt aus MRC-5-Zellen CV-1-Zellen, Buffalo-Green-Affennierenzellen, McCoy-Zellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, Hep-2-Zellen und Mv1Lu-Zellen und einem zweiten Zelltyp; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein des Virus, ausgewählt aus Respiratory-syncytial-Virus, Adenovirus, Zytomegalovirus und Parainfluenzavirus. Ohne die Absicht, den zweiten Zelltyp auf irgendeine bestimmte Zelle zu beschränken, wird in einer Ausführungsform der zweite Zelltyp ausgewählt aus MRC-5 Zellen, CV-1-Zellen, Buffalo-Green-Affennierenzellen, gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen, A549-Zellen, HEp-2-Zellen, Mv1Lu-Zellen und H292-Zellen.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird in den Ansprüchen definiert und betrifft allgemein das Gebiet der diagnostischen Mikrobiologie, und insbesondere Verfahren zum Nachweis und zur Differenzierung eines oder mehrerer Viren, die in einem Spezimen vorhanden sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Detektion und Identifikation von mehreren verschiedenen Viren sowie anderer intrazellulärer Organismen bereit, die in klinischen und anderen Spezimen in einer Einzelzellkultureinheit vorhanden sind, umfassend eine Mischung aus Zellen, die auf eine Weise gewachsen wurden, um als Monolayer mit einem relativ äquivalenten Verhältnis zu co-existieren und komplementäre Empfänglichkeiten auf ein größeres Spektrum von Viren und/oder anderen Organismen zu beweisen, als von jeder einzelnen Zelllinie detektiert werden könnte. Zum Beispiel involvieren die viralen Assays das Inokulieren einer Zellmischung mit einem Spezimen, das im Verdacht steht, einen Virus zu enthalten, der den Virus-Infektionszyklus für einen ausreichenden Zeitraum ablaufen lässt, gefolgt von der Detektion und/oder Quantifizierung der Anzahl der virusinfizierten Zellen, um die Anzahl der infektiösen Virionen in dem Spezimen zu bestimmen. Dieser Detektionsschritt kann unter Verwendung einer beliebigen Anzahl an verfügbaren Bestätigungsverfahren erreicht werden, einschließlich spezifischer viraler Antigendetektion unter Verwendung antigenspezifischer Antikörper, DNA-Sonden und Reportergendetektion. Der Assay stellt auch verlässliche Verfahren und Zusammensetzungen für die Quantifizierung einer Anzahl infektiöser Virionen bereit, die in einer Probe vorhanden sind. Zusätzlich sind die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausreichend sensitiv, so dass das Vorhandensein eines einzigen Virions in einem Spezimen detektiert werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die neuartige Mischungen zahlreicher Zelltypen umfassen, die traditionell in Einzelzellen-Assays verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zellen gemischt, um gemischte Monolayer-Zellkulturen zu erhalten. Eine solche gemischte Zellkultur beinhaltet Nerzlungenzellen (z. B. Mv1Lu), die mit menschlichen mucoepidermoiden Zellen (z. B. NCI-H292; auch als „H292-Zellen" bezeichnet) co-kultiviert werden. Diese Zellmischung ist empfänglich für Viren, wie etwa Influenza A, Influenza B, RSV, Parainfluenzatyp 1, 2 und 3, Adenovirus und CMV (d. h., die Gruppe von Viren, die am häufigsten im Zusammenhang mit viralen Atemswegserkrankungen steht). In anderen gemischten Kulturen werden Buffalo-green-Affennierenzellen (BGMK) mit NCI-H292-Zellen zur Detektion und Identifikation von Enteroviren, wie etwa Poliovirus, Echoviren und Coxsackie-B-Virus (z. B. Coxsackie-A- und -B-Viren) und nummerierten EV-Stämmen co-kultiviert. Zusätzlich zu den Enteroviren erwägt die vorliegende Erfindung Zelltypen, die für Picornaviren, wie etwa Hepatitis A, empfänglich sind.
  • Die vorliegenden Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die neuartige Mischungen verschiedener Zelltypen umfasst, die traditionell in Einzelzellen-Assays verwendet werden, die mit gentechnisch hergestellten Zellen co-kultiviert werden. In besonders bevorzugten Ausführungsformen, ist die gentechnisch hergestellte Zelllinie eine DNA-transfizierte Zelllinie, die für die Infektion durch einen Virus empfänglich ist, wobei die Zelllinie mit einem chimären Gen stabil transformiert worden war, das einen virusinduzierbaren Promoter und ein Gen umfasst, dass für ein Enzym kodiert, wobei die Expression des Enzyms vom Vorhandensein des Virus abhängt. Solche gentechnisch hergestellten Zellen werden zum Beispiel in der US-Patentschrift Nr. 5,418,132 beschrieben, die hier als Bezugsdokument beigefügt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet eine Zellmischung menschliche Lungenfibroblasten (z. B. MRC-5-Zellen) die mit einer stabilen Babyhamsternierenzelllinie (BHK) co-kultiviert werden, wobei deren Genom gentechnisch so hergestellt wurde, dass es das E.-coli-lacZ-Gen hinter (d. h., 3' zu) einem induzierbaren HSV-Promoter, HSV-1-ICP6-Promoter enthält (BHK/ICP6LacZ-5-Zellen sind über ATCC als CRL-12072 erhältlich). Diese Zellmischung ist für die Infektion mit CMV und HSV-Typ 1 und 2 empfänglich.
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen bereit, die neuartige Mischungen verschiedener Typen gentechnisch hergestellter Zellen umfasst. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die gentechnisch hergestellte Zelllinie eine DNA-transfizierte Zelllinie, die für die Infektion durch einen Virus empfänglich ist, wobei die Zelllinie mit einem chimären Gen stabil transformiert worden war, das einen virusinduzierbaren Promoter und ein Gen umfasst, dass für ein Enzym kodiert, wobei die Expression des Enzyms vom Vorhandensein des Virus abhängt. Die zweite gentechnisch hergestellte Zelllinie ist eine DNA-transfizierte Zelllinie, die für virale Infektion empfänglich ist, die mit einem chimären Gen stabil transformiert wurde, das einen virusinduzierbaren Promoter umfasst, und ein Gen, das ein zweites Enzym kodiert (d. h., ein Enzym, dass verschieden ist von dem, dass mit der ersten Zelllinie verbunden ist), bei dem die Expression des zweiten Enzyms vom Vorhandensein eines zweiten Virus abhängig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Zellmischung präpariert, in der gentechnisch hergestellte BHK-Zellen (z. B. BHK/ICP6/LacZ-5-Zellen) mit einer stabilen Nerzlungenzelllinie (Mv1Lu-) co-kultiviert werden, deren Genom gentechnisch hergestellt wurde, um einen induzierbaren CMV-Promoter (den CMV-UL45-Promoter) zu enthalten; diese Zellen werden „MLID5"-Zellen genannt und sind in der US-Patentanmeldung Ser.-Nr. 08/846,026 offenbart, die hier als Bezugsdokument beigefügt wird. Diese Zellmischung ist empfänglich für die Infektion mit CMV und HSV-Virus Typ 1 und 2 (HSV-1 und HSV-2), wobei CMV die gentechnisch hergestellten BHK-Zellen infiziert und HSV-1 und HSV-2 vorzugsweise die Nerzlungenzellen infizieren. In einer anderen Ausführungsform erwägt die vorliegenden Erfindung die Verwendung gentechnisch hergestellter Zellen (z. B. Nerzlungenzellen) bei denen das Zellgenom gentechnisch so hergestellt wurde, dass es das Glühwürmchenluciferasegen hinter (d. h., 3' zu) einem induzierbaren CMV-Promoter enthält; diese Zellen werden auch in der US-Patentanmeldung Ser.-Nr. 08/846,026 beschrieben. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf irgendwelche bestimmten Zelltypen oder Zelllinien beschränkt ist, noch ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf irgendwelche bestimmten Kombinationen von Zellen beschränkt ist. Es ist auch nicht beabsichtigt, dass die vorliegenden Erfindung auf die Form von gentechnisch hergestellten Zellen beschränkt ist.
  • Die folgende Tabelle stellt eine Matrix bereit, die die Fähigkeit zahlreicher Zellen angibt, konfluente Einzelzellen-Monolayer sowie co-kultivierte konfluente Monolayer aus gemischten Zellen zu bilden.
  • Figure 00360001
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  • In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegenden Erfindung Kits zur Analyse von Proben auf das Vorhandensein infektiöser Viren bereit. In diesen Kits werden gemischte Zellkulturen bereitgestellt, die die Detektion und Identifikation bestimmter Virusgruppen (z. B. Viren, die mit Atemwegsinfektionen/-erkrankungen verbunden sind) erleichtern. In den Kits werden co-kultivierte Zellen entweder in gefrorener oder dispensierter Form (d. h., gebrauchsfertig) in Shell Vials, Röhren oder Multiwellplatten geliefert. Diese Zellen sind, wie durch den Probentyp angegeben, empfänglich für die Infektion durch die interessierende Virusgruppe. In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Kits auch Reagenzien, die notwendig sind, um die Expression viraler Antigene oder virusinduzierter Reportergenexpression zu detektieren.
  • Eine der vielen Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, dass sie schnelle und sensitive Assaysysteme zur Detektion und Identifikation eines Einzelvirustyps aus einer Vielzahl von Möglichkeiten in einer gemischten Einzelzelleinheit bereitstellt, die für diagnostische Assays geeignet ist. Somit beseitigt die vorliegenden Erfindung den Bedarf an vielen Zelllinien, die in einzelnen Behälter kultiviert werden, stellt verlässliche Ergebnisse innerhalb von 1 bis 3 Tagen nach dem Inokulieren der Zellkulturen bereit, anstelle von 1 bis 28 Tagen, beseitigt die Notwendigkeit mit primären Zellkulturen zu arbeiten, stellt ein effizientes Screeningverfahren für die Gruppierung und vorläufige Identifikation von Viren bereit, und stellt Assaysysteme bereit, die höchst spezifisch für Viren sind, die eine Reportergenexpression induzieren können. Somit erfüllt die vorliegende Erfindung einen Bedarf, der bisher auf dem Feld der diagnostischen Virologie nicht abgedeckt wurde.
  • Definitionen
  • Die Begriffe „Probe" und „Spezimen" werden in der vorliegenden Spezifikation und den Ansprüchen in ihrem weitesten Sinn verwendet. Einerseits sollten sie ein Spezimen oder eine Kultur beinhalten. Andererseits sollten sie sowohl biologische Proben als auch Umweltproben beinhalten. Diese Begriffe schließen alle Typen von Proben ein, die von Menschen und anderen Tieren erhalten werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Körperflüssigkeiten, wie etwa Urin, Blut, Kot, Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), Sperma, Sputum und Speichel, sowie festes Gewebe. Diese Begriffe beziehen sich auch auf Abstrichtupfer und andere Probennahmegeräte, die gewöhnlich verwendet werden, um Proben für die Kultur von Mikroorganismen zu erhalten.
  • Biologische Proben können tierisch, einschließlich menschlich sein, Flüssigkeiten oder Gewebe, Nahrungsmittelprodukte und Inhaltsstoffe, wie etwa Molkereiprodukte, Gemüse, Fleisch- und Fleischnebenprodukt und Abfall. Umweltproben beinhalten Umweltmaterial, wie etwa Oberflächenstoffe, Boden, Wasser und industrielle Proben sowie Proben, die von Instrumenten zur Verarbeitung von Nahrungsmitteln und Milchprodukten, Instrumenten, Ausrüstung, Ein- oder Mehrwegartikeln stammen. Diese Beispiele sind nicht als Beschränkung der Probentypen zu verstehen, die für die vorliegende Erfindung zutreffen.
  • Unabhängig davon, ob es sich um eine biologische Probe oder eine Umweltprobe handelt, kann (aber muss nicht) eine Probe, die im Verdacht steht, Mikroorganismen zu enthalten, einem Anreicherungsmittel ausgesetzt werden, um eine „reine Kultur" der Mikroorganismen zu schaffen. Mit „Anreicherungsmittel" oder „Anreicherungsbehandlung" erwägt die vorliegenden Erfindung (i) herkömmliche Techniken zur Isolierung eines bestimmten interessierenden Mikroorganismus von anderen Mikroorganismen mittels irgendeines Kulturmediums und/oder einer Kulturtechnik, und (ii) neuartige Techniken für die Isolierung bestimmter Mikroorganismen von anderen Mikroorganismen. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung nur auf einen Anreicherungsschritt oder Typ eines Anreicherungsmittels beschränkt ist. Zum Beispiel fällt es in den Umfang der vorliegenden Erfindung, dass eine Probe, nachdem sie einem herkömmlichen Anreicherungsmittel ausgesetzt wurde, das daraus resultierende Präparat einer weiteren Reinigung unterzogen wird, so dass eine reine Kultur eines Stammes einer interessierenden Gattung produziert wird. Diese reine Kultur kann dann mit dem Medium und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung analysiert werden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Organismus" und „Mikroorganismus" auf jede Gattung oder jeden Typ von Mikroorganismus, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Viren und Bakterien, einschließlich Rickettsien und Chlamydien. Somit schließt der Begriff DNA- und RNA-Viren sowie Organismen, innerhalb der Ordnung der Rickettsien und Chlamydien ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Kultur" auf jede Probe oder jedes Spezimen, das im Verdacht steht, einen oder mehrere Mikroorganismen zu enthalten. „Reine Kulturen" sind Kulturen, in denen die Organismen nur in einem Stamm einer bestimmten Gattung oder Spezies vorhanden sind. Dies steht im Gegensatz zu den „gemischten Kulturen", die Kulturen sind, in denen mehr als eine Gattung und/oder Spezies von Mikroorganismen vorhanden ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Zelltyp" auf jede Zelle, unabhängig von ihrer Quelle oder ihren Eigenschaften.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Zelllinie" auf Zellen, die in vitro kultiviert werden, einschließlich primärer Zelllinien, finiter Zelllinien, Dauerzelllinien und transformierter Zelllinien.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „primäre Zellkultur" und „primäre Kultur" auf Zellkulturen, die direkt aus Tier- oder Insektengewebe erhalten wurden. Diese Kulturen können sowohl von adultem als auch fötalem Gewebe abgeleitet sein.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „finite Zelllinien" auf Zellkulturen, die zu einer begrenzten Anzahl von Populationsverdopplungen vor Seneszenz fähig sind.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Dauerzelllinien" auf Zellkulturen, die eine „Krisen"-Phase durchgemacht haben, bei der eine Zellpopulation in einer primären oder finiten Zelllinie anscheinend zu wachsen aufhört, aber dennoch eine Zellpopulation mit den allgemeinen Merkmalen einer reduzierten Zellgröße, höheren Wachstumsrate, höherer Klonierungseffizienz, erhöhter tumorerzeugender Wirkung und einem variablen Chromosomenkomplement auftritt. Diese Zellen resultie ren häufig aus einer spontanen Transformation in vitro. Diese Zellen haben eine unbegrenzte Lebensdauer.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „transformierte Zelllinien" auf Zellkulturen, die in Dauerzelllinien mit den oben beschriebenen Eigenschaften transformiert wurden. Transformierte Zelllinien können direkt aus Tumorgewebe abgeleitet werden und auch durch In-vitro-Transformation von Zellen mit dem gesamten Virus (z. B. SV40 oder EBV), oder DNA-Fragmente, die von einem transformierenden Virus, der ein Vektorsysteme verwendet, abgeleitet sind.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Hybridome" auf Zellen, die durch die Fusion von zwei Zelltypen produziert wurden. Gewöhnlich verwendete Hybridome beinhalten solche, die durch die Fusion von Antikörper-sekretierenden B-Zellen von einem immunisierten Tier, mit einer bösartigen Myelomzelllinie, die in vitro unbegrenzt wachsen kann, geschaffen wurden. Diese Zellen werden kloniert und verwendet, um monoklonale Antikörper zu präparieren.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „gemischte Zellkultur" auf eine Mischung aus zwei Zelltypen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Zellen Zelllinien, die nicht gentechnisch hergestellt sind, während in anderen bevorzugten Ausführungsformen, die Zellen gentechnisch hergestellte Zelllinien sind. In einigen Ausführungsformen sind einer oder mehrere der Zelltypen „permissiv" (d. h., der Virus ist zur Replikation und zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle innerhalb der Kultur fähig). Die vorliegenden Erfindung schließt jede Kombination von Zelltypen ein, die zur Detektion, Identifikation und/oder quantitati ven Bestimmung von Viren in Proben geeignet ist, einschließlich gemischte Zellkulturen, in denen alle verwendeten Zelltypen nicht gentechnisch hergestellt sind, Mischungen, in denen eine oder mehrere der Zelltypen gentechnisch hergestellt sind, und die verbleibenden Zelltypen nicht gentechnisch hergestellt sind, und Mischungen, in denen alle Zelltypen gentechnisch hergestellt sind.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „geeignet zur Detektion intrazellulärer Parasiten" auf Zellkulturen, die erfolgreich verwendet werden können, um das Vorhandensein eines intrazellulären Parasiten in einer Probe zu detektieren. In bevorzugten Ausführungsformen können die Zellkulturen ihre Empfänglichkeit für die Infektion erhalten und/oder die Replikation des intrazellulären Parasiten unterstützen. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf einen bestimmten Zelltyp oder intrazellulären Parasiten beschränkt ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „empfänglich für Infektion" auf die Fähigkeit einer Zelle, mit einem Virus oder einem anderen intrazellulären Organismus infiziert zu werden. Auch wenn sie „permissive" Infektionen einschließt, ist es nicht beabsichtigt, dass der Begriff so beschränkt ist, da es beabsichtigt ist, dass der Begriff Umstände einschließt, in denen eine Zelle infiziert wird, aber der Organismus sich nicht zwangsläufig repliziert und/oder die infizierte Zelle sich zu anderen Zellen ausbreitet. Der Wendung „virale Proliferation", wie hier verwendet, beschreibt die Ausbreitung oder Passage eines infektiösen Virus von einem permissiven Zelltyp zu zusätzlichen Zellen mit entweder permissivem oder empfänglichem Merkmal.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Monolayer" „Monolayer-Kultur" und „Monolayer-Zellkultur" auf Zellen, die sich an ein Substrat anhaften und in einer Schicht gewachsen werden, die die Dicke einer Zelle hat. Monolayer können in jedem Format gewachsen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kolben, Röhren, Deckgläser (z. B. Shell Vials), drehende Flaschen usw. Die Zellen können auch angelagert an Mikroträger, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kügelchen, gewachsen werden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Suspension" und „Suspensionskultur" auf Zellen, die ohne an ein Substrat angelagert zu sein, überleben und proliferieren. Suspensionskulturen werden typischerweise unter Verwendung blutbildender Zellen, transformierter Zelllinien und Zellen aus bösartigen Tumoren produziert.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Kulturmedien" und „Zellkulturmedien" auf Medien, die geeignet sind, das Wachstum von Zellen in vitro zu unterstützen (d. h., Zellkulturen). Es ist nicht beabsichtigt, dass der Begriff auf irgendein bestimmtes Kulturmedium beschränkt ist. Zum Beispiel ist es beabsichtigt, dass die Definition Keimungsmedien ebenso einschließt wie Erhaltungsmedien. In der Tat ist es beabsichtigt, dass der Begriff jedes Kulturmedium einschließt, das für das Wachstum der interessierenden Zellkulturen geeignet ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „obligatorischer intrazellulärer Parasit" (oder obligatorischer intrazellulärer Organismus) auf jeden Organismus, der eine intrazelluläre Umwelt für sein Überleben und/oder seine Replikation erfordert. Obligatorische intrazellulären Parasiten beinhalten Viren sowie viele andere Organismen, einschließlich gewisser Bakterien (z. B. die meisten Mitglieder der Ordnungen der Rickettsien [z. B. Coxiella, Rickettsia und Ehrlichia] und der Chlamydien [z. B. C. trachomatis, C. psittaci], usw.). Der Begriff „intrazellulärer Parasit" bezieht sich auf jeden Organismus, der innerhalb der Zellen eines Wirtstiers gefunden werden kann, einschließlich aber nicht beschränkt auf die oben kurz beschriebenen obligatorischen intrazellulären Parasiten. Zum Beispiel beinhalten intrazellulären Parasiten Organismen, wie etwa Brucella, Listerien, Mycobacterium (z. B. M. tuberculosis und M. leprae) und Plasmodium sowie Rochalimea.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „antimikrobiell" auf jede Verbindung, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmt oder die Mikroorganismen abtötet. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff in seinem weitesten Sinn verwendet wird, und Verbindungen, wie etwa Antibiotika, die natürlich oder synthetisch produziert werden, beinhaltet, aber nicht auf sie beschränkt ist. Es ist auch beabsichtigt, dass der Begriff Verbindungen und Elemente beinhaltet, die für die Hemmung des Wachstums oder die Abtötung von Mikroorganismen verwendbar sind.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „chromogene Verbindung" und „chromogenes Substrat" auf jede Verbindung, die in Detektionssystemen durch ihre leichten Absorptions- oder Emissionsmerkmale verwendbar sind. Es ist beabsichtigt, dass der Begriff alle enzymatischen Spaltungsprodukte, lösliche ebenso wie unlösliche, einschließt, die entweder visuell oder mit optischen Gerätschaften detektierbar sind. Die Bezeichnung „chromogen" beinhaltet alle enzymatischen Substrate, die ein Endprodukt produzieren, dass als Farbänderung detektierbar ist. Dies beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf, jede Farbe, wie im traditionellen Sinn von „Farben" verwendet, wie etwa indigo, blau, rot, gelb, grün, orange, braun usw. sowie fluorochrome oder fluorogene Verbindungen, die Farben produzieren, die mit Fluoreszenz (z. B. das gelb-grün von Fluorescenn, das rot von Rhodamin usw.) detektierbar sind. Es ist beabsichtigt, dass solche anderen Indikatoren, wie Farbstoffe (z. B. pH-Wert) und luminogene Verbindungen, in diese Definition eingeschlossen sind.
  • Wie hier verwendet ist die gebräuchlich verwendete Bedeutung der Begriffe, „pH-Indikator" „Redox-Indikator" und „Oxidations-Reduktions-Indikator" beabsichtigt. Somit schließt „pH-Indikator" alle Verbindungen ein, die gewöhnlich zur Detektion von pH-Änderungen verwendet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Phenolrot, Neutralrot, Bromthymolblau, Bromcresolpurpur, Bromcresolgrün, Bromchlorphenolblau, m-Cresolpurpur, Thymolblau, Bromcresolpurpur, Xylenolblau, Methylrot, Methylorange und Cresolrot. Die Begriffe „Redox-Indikator" und „Oxidations-Reduktions-Indikator" schließen alle Verbindungen ein, die gewöhnlich zur Detektion des Oxidations-/Reduktionspotentials (d. h., „eH") verwendete werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf zahlreiche Typen oder Formen von Tetrazolium, Resazurin und Methylenblau.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „inokulierende Suspension" oder „Inokulum" auf eine Suspension, die mit den Organismen, die getestet werden sollen, inokuliert werden kann. Es ist nicht beabsichtigt, dass der Begriff „inokulierende Suspension" auf eine bestimmte Flüssigkeit oder eine flüssige Substanz beschränkt ist. Zum Beispiel können inokulierende Suspensionen Wasser, Kochsalzlösung oder eine wässrige Lösung umfassen. Es wird auch erwogen, dass eine inokulierende Suspension eine Komponente beinhalten kann, zu der Wasser, Kochsalzlösung oder irgendein wässriges Material zugefügt werden kann. Es wird in einer Ausführungsform erwogen, dass die Komponente mindestens eine Komponente umfasst, die für die betreffenden Mikroorganismen verwendbar ist. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf eine bestimmte Komponente beschränkt ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Kit" auf eine Kombination von Reagenzien und anderer Materialien.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „primäre Isolierung" auf einen Kulturprozess von Organismen direkt aus einer Probe. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Isolierung" auf jede Kultivierung von Organismen, unabhängig davon, ob es eine primäre Isolierung oder irgendeine nachfolgende Kultivierung ist, einschließlich der „Passage" oder des „Transfers" von Bestandskulturen von Organismen zur Erhaltung und/oder Verwendung.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „präsumtive Diagnose" auf eine vorläufige Diagnose, die dem behandelten Arzt eine gewisse Orientierung im Hin blick auf die ätiologischen Organismen gibt, die in die Krankheit des Patienten involviert sind. Präsumtive Diagnosen basieren häufig auf „präsumtiven Identifikationen", die sich, wie hier verwendet, auf die vorläufige Identifikation eines Mikroorganismus beziehen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „definitive Diagnose" auf eine endgültige Diagnose, in der das ätiologische Ages der Krankheit des Patienten identifiziert wurde. Der Begriff „definitive Identifikation" wird mit Bezug auf die endgültige Identifikation eines Organismus zu einem Level einer Gattung und/oder Spezies verwendet.
  • Der Begriff „rekombinantes DNA-Molekül", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein DNA-Molekül, das Segmente von DNA umfasst, die mit Mitteln molekularbiologischer Techniken zusammengefügt wurden.
  • Von DNA-Molekülen wird gesagt, dass sie „5'-Enden" und „3'-Enden" haben, weil Mononukleotide reagiert werden, um Oligonukleotide auf eine Weise zu schaffen, dass 5'-Phosphat eines Mononukleotid-Pentoserings an den 3'-Sauerstoff seines Nachbarn in einer Richtung mittels einer Phosphodiester-Verknüpfung angelagert wird. Daher wird das Ende eines Oligonukleotids als das „5'-Ende" bezeichnet, wenn sein 5'-Phosphat nicht mit dem 3'-Sauerstoff eines Mononukleotid-Pentoserings verknüpft ist, und als „3'-Ende", wenn sein 3'-Sauerstoff nicht mit einem 5'-Phosphat eines nachfolgenden Mononukleotid-Pentoserings verknüpft ist. Wie hier verwendet, kann von einer Nukleinsäuresequenz sogar dann gesagt werden, dass sie 5'- und 3'-Enden aufweist, wenn sie innerhalb eines größeren Oligonukleotids liegt. Sowohl in einem linearen als auch in einem zirkulären DNA-Molekül werden diskrete Elemente als „stromaufwärts" oder 5' von den „stromabwärts" oder 3' Elementen liegend, bezeichnet. Diese Terminologie spiegelt die Tatsache wider, dass die Transkription entlang des DNA-Strangs von 5' bis zu 3' fortschreitet. Die Promoter- und Verstärkerelemente, die die Transkription eines verknüpften Gens lenken, liegen im Allgemeinen 5' oder stromaufwärts der kodierenden Region (Verstärkerelemente können ihre Wirkung sogar dann ausüben, wenn sie 3' von dem Promoterelement und der kodierenden Region entfernt liegen). Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale liegen 3' oder stromabwärts der kodierenden Region.
  • Der Begriff „ein Oligonukleotid, dass eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Gen kodiert" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die die kodierende Region eines Gens umfasst, oder, anders ausgedrückt, die DNA-Sequenz, die ein Genprodukt kodiert. Die kodierende Region kann entweder in Form einer cDNA oder einer genomen DNA vorhanden sein. Geeignete Kontrollelemente, wie etwa Verstärker, Promoter, Spleißstellen, Polyadenylierungssignale usw., können, wenn notwenig, ganz nah an der kodierenden Region des Gens platziert sein, um die einwandfreie Initiation der Transkription und/oder das korrekte Processing des primären RNA-Transkripts zu ermöglichen. Alternativ kann die kodierende Region, die in den Vektoren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, endogene Verstärker und/oder Promoter, Spleißstellen, Intervening-Sequenzen, Polyadenylierungssignale usw. oder eine Kombination sowohl von endogenen als auch von exogenen Kontrollelementen enthalten.
  • Der Begriff „Transkriptionseinheit", wie hier verwendet, bezieht sich auf das DNA-Segment zwischen den Initiations- und Terminationsstellen der Transkription und auf die Regulatorelemente, die für die effiziente Initiation und Termination notwendig sind. Zum Beispiel umfasst ein DNA-Segment, das einen Verstärker/Promoter, eine kodierende Region und eine Terminations- und Polyadenylierungssequenz umfasst, eine Transkriptionseinheit.
  • Der Begriff „Regulator", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein genetisches Element, das gewisse Aspekte der Expression von Nukleinsäuresequenzen kontrolliert. Zum Beispiel ist ein Promoter ein Regulatorelement, das die Initiation der Transkription einer operativ verknüpften kodierenden Region erleichtert. Andere Regulatorelemente sind Spleißsignale, Polyadenylierungssignale, Terminationssignale usw. (unten definiert).
  • Die Begriffe „Reportergenkonstrukt" oder „Reportergenvektor", wie hier verwendet, beziehen sich auf ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Sequenz enthält, die das Produkt des Reportergen und geeignete Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression der operativ verknüpften kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus kodiert. Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promoter, Verstärker und Terminations- sowie Polyadenylierungssignale nutzen.
  • Der Begriff „Reportergen" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das eine Sequenz aufweist, die ein Genprodukt (typischerweise ein Enzym) kodiert, das leicht und quantifizierbar analysiert werden kann, wenn ein Konstrukt, das die Reportergensequenz umfasst, die operativ mit einem heterologen Promoter- und/oder Verstärkerelement verknüpft ist, in Zellen eingeführt wird, die die Faktoren enthalten (oder die dazu gebracht werden können, zu enthalten), die für die Aktivierung der Promoter- und/oder Verstärkerelemente notwendig sind. Beispiele für Reportergene beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, bakterielle Gene, die β-Galactosidase (lacZ) kodieren, die bakteriellen Chloramphenicol-Acetyltransferasegene (cat), Glühwürmchenluciferasegene und Gene, die β-Glucuronidase (GUS) kodieren.
  • Transkriptionale Kontrollsignale in Eukaryoten umfassen „Promoter"- und „Verstärker"-Elemente. Promoter und Verstärker bestehen aus kurzen Anordnungen von DNA-Sequenzen, die mit zellulären Proteinen, die in die Transkription involviert sind, spezifisch interagieren (Maniatis, et al., Science 236: 1237 [1987]). Promoter- und Verstärkerelemente aus einer Auswahl eurkaryotischer Quellen wurden isoliert, einschließlich Genen in Hefe-, Insekten und Säugerzellen, und Viren (analoge Kontrollelemente [d. h., Promoter sind auch in Prokaryoten zu finden]). Die Auswahl eines bestimmten Promoters und Verstärkers hängt davon ab, auf welchem Zelltyp er verwendet wird, um das interessierende Protein zu exprimieren. Einige eukaryotische Promoter und Verstärker haben ein breites Spektrum an Wirten, während andere in einem begrenzten Subset von Zelltypen funktionsfähig sind (für einen Überblick, vgl. Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11: 287 [1986], und Maniatis, et al., oben [1987]). Zum Beispiel ist der frühe Genverstärker SV40 sehr aktiv in einer breiten Auswahl von Zelltypen aus vielen Säugerspezies und wurde in großem Umfang für die Expression von Proteinen in Säugerzellen verwendet (Dijkema, et al., EMBO J. 4: 761 [1985].). Zwei andere Beispiele für Promoter-, bzw. Verstärkerelemente, die in einem breiten Spektrum von Säugerzelltypen aktiv sind, sind jene aus dem menschlichen Elongations faktor-la-Gen (Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264: 5791 [1989]; Kim et al., Gene 91: 217 [1990]; und Mizushima and Nagata, Nuc. Acids. Res., 18: 5322 [1990]) und die lange terminale Wiederholung des Rous Sarkom-Virus (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 [1982]), und der menschliche Zytomegalovirus (Boshart et al., Cell 41: 521 [1985]).
  • Der Begriff „Promoter/Verstärker" bezeichnet ein DNA-Segment, das Sequenzen enthält, die sowohl Promoter- als auch Verstärkerfunktionen bereitstellen können (zum Beispiel enthalten die langen terminalen Wiederholungen von Retroviren sowohl Promoter- als auch Verstärkerfunktionen). Die Verstärker/Promoter können „endogen" oder „exogen" oder „heterolog" sein. Ein endogener Verstärker/Promoter ist einer, der mit einem gegebenen Gen im Genom natürlich verknüpft ist. Ein exogener (heterologer) Verstärker/Promoter ist einer, der mit Mitteln genetischer Manipulation (d. h., molekularbiologischer Techniken) in Juxtaposition zu einem Gen platziert ist.
  • Das Vorhandensein eines „Spleißsignals" auf einem Expressionsvektor führt häufig zu höheren Expressionsleveln des rekombinanten Transkripts. Spleißsignale vermitteln die Entfernung von Introns von dem primären RNA-Transkript und bestehen aus einer Donor-Spleißstelle und einer Akzeptorstelle (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], Seiten 16.7–16.8). Eine gewöhnlich verwendete Donor-Spleiß- und Akzeptorstelle ist die Spleißstelle von der 16S-RNA von SV40.
  • Die effiziente Expression rekombinanter DNA-Sequenzen in eukaryotischen Zellen erfordert Signale, die die effiziente Termination und Polyadenylierung des resultierenden Transkripts lenken. Transkriptionsterminationssignale befinden sich im Allgemeinen stromabwärts des Polyadenylierungssignals und sind längs einige hundert Nukleotide entfernt. Der Begriff „Poly-A-Stelle" oder „Poly-A-Sequenz", wie hier verwendet, bezeichnet eine DNA-Sequenz, die sowohl die Termination als auch die Polyadenylierung des entstehenden RNA-Transkripts lenkt. Die effiziente Polyadenylierung des rekombinanten Transkripts ist wünschenswert, da Transkripts, denen ein Poly-A-Schwanz fehlt, instabil sind, und sich schnell abbauen. Das Poly-A-Signal, das in einem Expressionsvektor genutzt wird, kann „heterolog" oder „endogen" sein. Ein endogenes Poly-A-Signal ist eines, das natürlich an den 3'-Enden der kodierenden Region eines gegebenen Gens im Genom zu finden ist. Ein heterologes Poly-A-Signal ist eines, das aus einem Gen isoliert wurde und 3' auf einem anderen Gen platziert wurde. Ein gewöhnlich verwendetes heterologes Poly-A-Signal ist das SV40-Poly-A-Signal. Das SV40-Poly-A-Signal ist auf einem 237bp-BamHI/BcII-Restriktionsfragment enthalten und lenkt sowohl die Termination als auch die Polyadenylierung (Sambrook, oben, at 16.6–16.7). Dieses 237bp-Fragment ist in einem 671bp-BamHI/PstI-Restriktionsfragment enthalten.
  • Der Begriff „gentechnisch hergestellte Zelllinie" bezieht sich auf eine Zelllinie, die eine heterologe DNA enthält, die in die Zelllinie mit Mitteln molekularbiologischer Techniken (d. h., rekombinante DNA-Technologie) eingeführt wurde.
  • Der Begriff „stabile Transfektion" oder „stabil transfiziert" bezieht sich auf die Einführung und Integration fremder DNA in das Genom der transfizierten Zelle. Der Begriff „stabiler Transfektant" bezieht sich auf eine Zelle, die fremde DNA stabil in die genomische DNA integriert hat.
  • Der Begriff „stabile Transfektion" oder „stabil transfiziert" bezieht sich auf die Einführung und Integration fremder DNA in das Genom der transfizierten Zelle. Der Begriff „stabiler Transfektant" bezieht sich auf eine Zelle, die fremde DNA stabil in die genomische DNA integriert hat.
  • Der Begriff „selektierbarer Marker", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Verwendung eines Gens, das eine Enzymaktivität kodiert, die Resistenz gegen ein Antibiotikum oder einen Wirkstoff in der Zelle verleiht, in der der selektierbare Marker exprimiert wird. Selektierbare Marker können „dominant" sein; ein dominanter selektierbarere Marker kodiert eine Enzymaktivität, die in jeder Säugerzelllinie detektiert werden kann. Beispiele dominanter selektierbarer Marker beinhalten das bakterielle Aminoglycosid-3'-phosphotransferasegen (auch als Neogen bezeichnet), das Resistenz gegen den Wirkstoff G418 in Säugerzellen verleiht, das bakterielle Hygromycin-G-phosphotransferasegen (hyg), das Resistenz gegen anti-biotisches Hygromycin verleiht und das bakterielle Xanthin-guanin-phosphoribosyltransferasegen (auch als gpt-Gen bezeichnet), das die Fähigkeit verleiht, bei Vorhandensein vom Mycophenolsäure zu wachsen. Andere selektierbarer Marker sind nicht dominant, dahingehend, dass ihre Verwendung in Verbindung mit einer Zelllinie erfolgen muss, der es an relevanter Enzymaktivität fehlt. Beispiele für nicht dominante selektierbarer Marker beinhalten das Thymidinkinasegen (tk), das in Verbindung mit tk-Zelllinien verwendet wird, das CAD-Gen, das in Verbindung mit CAD-defizienten Zellen verwendet wird, und dem Säuger-Hypoxanthin-guaninphosphoribosyltransferasegen (hprt), das in Verbindung mit den hprt-Zelllinien verwendet wird. Ein Überblick über die Verwendung selektierbarer Marker in Säugerzelllinien wird in Sambrook et al., oben, auf den Seiten 16.9–16.15, bereitgestellt.
  • Die Begriffe „Nukleinsäuremolekül-kodierend", „DNA-Sequenz-kodierend" und „DNA-kodierend" beziehen sich auf die Ordnung oder Sequenz von Desoxyribonukleotiden entlang eines Desoxyribonukleinsäurestrangs. Die Ordnung dieser Desoxyribonukleotide bestimmt die Ordnung der Aminosäuren entlang der Polypeptid-(protein)-kette. Die DNA-Sequenz kodiert somit für die Aminosäuresequenz.
  • Die Begriffe „konfluent" oder „Konfluenz", wie hier bezogen auf eine anhaftenden Zelllinie verwendet, definieren eine Bedingung, bei der Zellen überall in einer Kultur miteinander in Kontakt sind, und das schaffen, was eine durchgehende Schicht oder „Monolayer" von Zellen zu sein scheint.
  • Die Begriffe „zytopathischer Effekt" oder „CPE", wie hier verwendet, beschreiben Veränderungen der zellulären Struktur (d. h., einen pathologischen Effekt), der aus externen Agenzien, wie Viren resultiert. Übliche zytopathische Effekte beinhalten Zellzerstörung, Synzytia-Bildung (d. h., fusionierte Riesenzellen), Zell-abrundende Vakuolenbildung und Bildung von Einschlusskörperchen. CPE resultiert aus Wirkungen eines Virus auf permissiven Zellen, die die Fähigkeit des permissiven zellulären Wirts beeinträchtigen, die Funktionen durchzuführen, die erforderlich sind, um lebensfähig zu bleiben. In In-vitro-Zellkultursystemen ist CPE evident, wenn Zellen, als Teil einer konfluenten Monolayer nach dem Kontakt mit einen Spezimen, das einen Virus enthält, Regionen von Nicht-Konfluenz zeigen. Der beobachtete mikroskopische Effekt ist im Allgemeinen fokaler Natur und die Fokusse werden durch ein einzelnes Virion initiiert. In Abhängigkeit von der viralen Belastung in der Probe, kann CPE jedoch nach einer ausreichenden Inkubationszeit überall im Monolayer beobachtet werden. Zellen, die induzierte CPE aufweisen, verändern ihre Morphologie normalerweise in eine abgerundete Form und können über einen verlängerten Zeitraum sterben, und von ihren Ankerpunkten in der Monolayer freigegeben werden. Wenn viele Zellen den Punkt fokal Zerstörung erreichen, wird der Bereich virale Plaque genannt, der als Loch im Monolayer erscheint. Zytopathische Effekte sind von Fachleuten schnell zu erkennen und zu unterschieden.
  • Die Abkürzung „ONPG" bedeutet o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid. ONPG ist ein Substrat für das Enzym β-Galactosidase (β-gal). Die Reaktion zwischen ONPG und β-gal produziert ein gelbes Produkt, das spektrophotometrisch bei 405 nm quantifiziert werden kann.
  • Die Abkürzung „X-gal" bedeutet die chemische Verbindung 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, ein Substrat für das Enzym β-Galactosidase. Die Reaktion zwischen X-gal und β-Galactosidase führt zur Bildung eines blauen Präzipitats, das visuell wahrnehmbar ist.
  • Der Begriff „HYBRIWIXTM" bedeutet ein Produkt von Diagnostic Hybrids, Inc., Athens, Ohio, das die Quantifizierung gewisser viraler DNA in einem infizierten Monolayer von Zellen mittels DNA-Hybridisierung ermöglicht. „DNA-Hybridisierung" ist das Annealing von zwei komplementären DNA-Molekülen, deren Basensequenzen gemäß den Regeln der Basenpaarung zusammenpassen. DNA-Hybridisierung wird verwendet, um unbekannte oder „Target"-DNA zu identifizieren oder zu quantifizieren, mittels Hybridisierung in eine bekannte DNA oder „Sonde". Die Sonde wird typischerweise mit einem Reportermolekül markiert, wie etwa 125I, einem Radioisotop, das mit einem Gammazähler detektiert und quantifiziert werden kann.
  • Die Wendung „Plaquereduktionsassay" oder „PRA,", wie hier verwendet, beschreibt ein Standardverfahren, das verwendet wird, um die Wirksamkeit anti-viraler Wirkstoffe zu bestimmen, indem eine Abnahme der Plaquebildung in einem Zell-Monolayer, der einem Wirkstoff ausgesetzt war, detailliert aufgelistet wird. Eine „Plaque" ist ein definierter Bereich von „CPE." Sie ist normalerweise das Ergebnis der Infektion der Zell-Monolayer mit einem einzelnen infektiösen Virus, der sich dann repliziert und in die angrenzenden Zellen des Monolayer ausbreitet. Eine Plaque kann auch als ein „Fokus viraler Infektion" bezeichnet werden.
  • Der Begriff „permissiv", wie hier verwendet, beschreibt die Sequenz von interaktiven Ereignissen zwischen einem Virus und dessen mutmaßlicher Wirtszelle. Der Prozess beginnt mit der Adsorption zur Wirtszellenoberfläche und endet mit der Freigabe infektiöser Virionen. Eine Zelle ist „permissiv", wenn sie die Verbreitung eines Virus oder anderer Zellen schnell ermög licht. Für die Bestimmung der Permissivität einer gegebenen Zelllinie sind viele Verfahren verfügbar, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Plaquereduktionsassays, Vergleiche der Produktion und/oder Quantifizierung viraler Proteine auf der Basis von Ergebnissen, die aus der Gel-Elektrophorese erhalten werden, relative Vergleiche, die die Hybridisierungsanalyse verwenden, um den Gehalt an DNA oder RNA zu analysieren usw.
  • Der Begriff „empfänglich", wie hier verwendet, beschreibt den Umfang, in dem eine permissive oder nicht permissive Wirtszelle einen Virus absorbieren oder von ihm penetriert werden kann. Eine Zelllinie kann empfänglich sein, ohne permissiv zu sein, dahingehend, dass sie penetriert werden kann, jedoch keine Virionen freigibt. Eine permissive Zelllinie muss jedoch empfänglich sein.
  • Die Wendung „aufimpfen", wie hier verwendet, beschreibt den Akt des Transfers einer wässrigen Lösung mit suspendierten Zellen in ein Gefäß, dass Zellen enthält, die an einer Oberfläche anhaften, danach wird das Gefäß für einen ausreichend langen Zeitraum gelagert, damit sich die suspendierten Zellen oder „Keime" mittels Schwerkraft abscheiden können und sich auf relativ einheitliche Weise an die anhaftenden Zellen anlagern können, und als Mischung in den endgültige Zell-Monolayer integriert werden. Ein „gemischter Zell-Monolayer" resultiert aus einem „Aufimpfungs"-Prozess.
  • Die Wendung „animpfen", wie hier verwendet, beschreibt das Mischen von zwei oder mehreren wässrigen Lösungen von suspendiertem Gewebekulturzellen, wobei jede Zellsuspension verschiedene zelluläre Eigenschaften aufweist, und der Transfer einer solchen Zellmi schung in ein Gefäß, dass für einen ausreichen langen Zeitraum gelagert wird, damit sich die suspendierten Zellen mittels Schwerkraft abscheiden, und sich auf relativ einheitliche Weise anlagern können, so dass, die Distribution eines jeden Einzelzelltyps für das relative Verhältnis der Zellen in der Originalmischung anzeigend ist.
  • Der Begriff „Starts", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Reporterzellen, die eine primäre Virusinfektion darstellen. Der Virus infiziert eine Reporterzelle (eine gentechnisch hergestellte Zelle) und induziert die Expression des Reportergens. Eine Reporterzelle kann nicht permissiv sein (d. h. die Permissivität der Reporterzellen ist nicht erforderlich), um dennoch Starts produzieren.
  • METHODIK
  • Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und genauer zu illustrieren und sind nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung zu verstehen.
  • In der nachfolgenden Offenbarung der Versuche werden die folgenden Abkürzungen verwendet: eq (Val); M (molar); μM (mikromolar); N (normal); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); 1 oder L (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); × g (Vielfaches von g (Schwerkraft)); °C (Grad Celsius); FBS (fötales Rinderserum); PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung; HEPES (N-[2- Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethanesulfonsäure]); HBSS (Hank's Balanced Salt Solution); MEM (Minimal Essential Medium); EMEM (Eagle's Minimal Essential Medium); BBL (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.); DIFCO (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); U.S. Biochemical (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio); Chemicon (Chemicon, Inc., Temecula, Calif.); Dako (Dako Corporation, Carpinteria, Calif.); Fisher (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.); ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, Md.); Bartel's (Bartels, Issaquah, Wash.); und BioWhittaker (BioWhittaker, Walkersville, Md.).
  • Die Zellen, die während der Entwicklung der vorliegenden Erfindung verwendet wurden und die in den folgenden Beispielen beschrieben werden, wurden von der ATCC bezogen, abgesehen von den BGMK- und PRMK-Zellen, die von BioWhittaker bezogen wurden, und den MRC-5-Zellen, die sowohl von ATCC als auch von BioWhittaker bezogen wurden. Die ATCC-Nummern der Zellen sind in der folgenden Tabelle angegeben.
  • TABELLE 2
    Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • BEISPIEL 1
  • Co-Kultivierung von Zellen
  • In diesem Beispiel wurden gemischte Zellkulturen etabliert, in denen dimorphe Einzelzellschichten zur Konfluenz produziert wurden.
  • In diesen Versuchen wurden alle Zellenlinien zur Konfluenz in sterilen Polystyrolkolben in EMEM (Eagle's Minimal Essential Medium) mit 25 mM HEPES, 7% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten/100 μg je ml jeden Mediums) kultiviert.
  • Die zu kultivierenden Zellen wurden geerntet, indem zuerst die Quellzellen-Monolayer mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Magnesium oder Calcium gespült wurden. Abhängig von den Zelllinien wurden die Zellen abgelöst, indem Trypsin (0,125% in HBSS, ohne Calcium oder Magnesium) oder Trypsin-EDTA (0,25% in 1 mM EDTA in HBSS, ohne Calcium oder Magnesium), oder direkt zur Zellen-Monolayer zugegeben, und ungefähr 5 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert wurde. Zehn Mengen an Zellkulturmedium wurden jeder trypsinisierten Zellsuspension zugefügt und die Zellen wurden wiederholt pipettiert, um beinahe-Einzelzellsuspensionen (d. h., ohne Zellaggregate) zu produzieren. Jede trypsinisierte Zellsuspension wurde in einer geeigneten Menge Kulturmedium verdünnt, um eine optische Dichte der Zellsuspension zu produzieren, die geeignet ist, um innerhalb von 2 bis 3 Tagen Inkubation in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen einen konfluenten Monolayer von Zellen zu produzieren. Für Einzelzellen-Monolayer (d. h., ein Zelltyp je Vertiefung, wurden 0,2 ml Suspension verwendet, um jede Vertiefung zu inokulieren. Zum Beispiel reichten die endgültigen Zellpräparate von einer endgültigen optischen Dichte bei 500 nm von 0,012 OD-Einheiten/ ml für CV-1-Zellen bis zu 0,03 OD-Einheiten/ ml für HEp-2-Zellen.
  • Zellmischungsmonolayer wurden mittels Co-Pflanzung von zwei unterschiedlichen Zelltypen in einer gleichen Menge in jeder verdünnten Zellsuspension (d. h., 0,1 ml jedes Typs wurde verwendet, um jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen zu inokulieren) hergestellt. Die Zellen durften sich 30 bis 60 Minuten lang mittels Schwerkraft an der Oberfläche der Vertiefung anheften und die inokulierten Mikrotiterplatten wurden bis zu drei Tage lang bei 36°C in 5% CO2 mit 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
  • Während der Inkubation wurden die Monolayer der Einzelzellen und der gemischten Zellen regelmäßig auf Gesamtlebensfähigkeit überprüft. Die Monolayer mit den gemischten Zellkulturen wurden auch daraufhin überprüft, ob die Zelllinien co-existieren und sich als Einzelzellschicht (d. h., als einzige Monolayer), mit zwei unterschiedlichen Zellmorphologien (d. h., dimorphe Zellschichten), bei einer ungefähr gleichen Dichte jedes Zelltyps, entwickeln können. Bei Konfluenz wurden die Zellen mit einer methylenblauen Färbelösung behandelt, um die Zellen zu fixieren und sie leicht blau zu färben, um einen Kontrast für die Visualisierung unter Verwendung von Lichtmikroskopie bereitzustellen.
  • Einige der gemischten Monolayer wuchsen erfolgreich als Monolayer aus gemischten Zellen, die an der Vertiefungsoberflächen anhaftete, und einen glatten, gleichmäßig verteilten Monolayer zeigten. Diese gemischten Kulturen wurden als „morphologische Kategorie 1" bezeichnet. In diesen Kulturen konnte jeder Zelltyp leicht unterschieden werden und schien in einem gemischten Monolayer gut zu überleben, der das Erscheinungsbild einer Einzelzelldistribution vermittelte. Gemischte Monolayer, die sich aus HEp-2- und McCoy-Zellen zusammensetzten, wiesen diese Morphologie auf.
  • Einige der gemischten Monolayer wuchsen erfolgreich als Monolayer aus gemischten Zellen, die an der Vertiefungsoberflächen anhaftete, zeigten jedoch bei Konfluenz zwei unterschiedliche Morphologien. Diese gemischten Kulturen wurden als „morphologische Kategorie 2" bezeichnet. In diesen Kulturen co-existierten separate, unterschiedliche Flächen jeder Zelllinie innerhalb der Monolayer, die das Erscheinungsbild von mit Wasser vermischtem Öl vermittelte. Auch wenn es für die Verwendung der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, den Mechanismus zu verstehen, ist es wahrscheinlich, dass dieses Erscheinungsbild höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer Kontakthemmung zwischen zwei spezi fischen Zelltypen ist. Es wurde festgestellt, dass die relativen Größen der Flächen primär davon abhingen, wie gleichmäßig die Zellen bei der Zellpflanzung verteilt wurden. Je gleichmäßiger die Zellverteilung bei der Pflanzung, umso kleiner waren die Flächen und Inseln, wenn der Monolayer die Konfluenz erreichte. Beispiele für Monolayer, die dieses Erscheinungsbild produzierten, waren Nerzlungenzellen, die mit NCI-H292-Zellen co-kultiviert wurden, Nerzlungenzellen, die mit Buffalo-green-Affennierenzellen (BGMK) co-kultiviert wurden, und menschliche Lungenkarzinomzellen A549, die mit NCI-H292-Zellen co-kultiviert wurden.
  • Einige Zelltypen konnten jedoch keine Monolayer aus gemischten Zellen produzieren, wenn sie beim Pflanzen in das gleiche Kulturmedium aus einer relativ gleichen Anzahl von Zellen gemischt wurden. Es wurde festgestellt, dass bei einigen dieser Kulturen nur ein Zelltyp lebensfähig war (d. h., die Kultur war tatsächlich ein Einzelzelltyp). Beispiele für gemischte Zellkulturen, für die festgestellt wurde, dass sie für die Produktion von gemischten Monolayern ungeeignet sind, beinhalten menschliche embryonale Lungenfibroblasten (MRC-5-Zellen), die mit BGMK-Zellen co-kultiviert wurden. In dieser Mischung werden die MRC-5-Zellen toxisch und bilden bald nach der Pflanzung Aggregate toter Zellen. Somit enthält der Monolayer bei Konfluenz nur einen funktionellen, lebensfähigen Zelltyp, die BGMK-Zellen. Somit wurde festgestellt, dass die Zellmischung für die Produktion von Monolayern gemischter Zellen ungeeignet ist, da die Zellen weder in der Lage waren, Monolayer gemischter Zellen glatten noch dimorphen morpholischen Typs zu bilden.
  • BEISPIEL 2
  • Detektion von respiratorischen Viren in gemischten Zellkulturen
  • In diesem Beispiel wurden gemischte Zellkulturen verwendet, um zahlreiche respiratorische Viren zu detektieren, einschließlich Influenza A, RSV, Adenoviren, Parainfluenzaviren und Influenza B, die in klinischen Spezimen vorhanden waren. Die gemischten Zellen, die in diesen Versuchen verwendet wurden, waren Mv1Lu (Nerzlungenzellen) und NCI-H292 (menschliche mucoepidermoide Zellen).
  • Zelllinien
  • Konfluente T-225-Kolben mit Mv1Lu- und H292-Zellen wurden in EMEM mit HEPES, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin präpariert. Die Zellen wurden geerntet, indem sie zuerst in 30 ml HBSS ohne Magnesium und Calcium gespült wurden. Die Zellen wurden dann vom Kolben abgelöst, indem sie (d. h., bis sich die Zellen vom Boden des Kolbens lösten) kurz 7 ml Trypsin-EDTA-Lösung ausgesetzt wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Dann wurde den Zellen 30 ml Medium zugefügt, um ein Zellsuspensionskonzentrat zu präparieren. Die optische Dichte jeder Zellsuspension wurde bei 500 nm unter Verwendung von 3 ml der Zellen bestimmt. Typischerweise betrug die Ablesung der optischen Dichte 0,2/ml sowohl für die Mv1Lu- als auch für die H292-Zellen. Zusätzlich zu den Mv1Lu- und H292-Zellen, wurden in dem vorliegenden Beispiel Rhesusaffennierenzellen (PRMK), A549-Zellen und MDCK-Zellen verwendet. Diese zusätzlichen Zelllinien wurden in Einzelzellkulturen präpariert, wie dem Fachmann bekannt.
  • Gemischte Zellkulturen
  • Wenn für jedes Zellsuspensionskonzentrat ein Verhältnis 0,2 OD-Einheiten/ ml festgestellt worden war, wurden 5,2 ml Mv1Lu- und 8,7 ml H292-Zellsuspensionen zu 86,1 ml Kulturmedium zugefügt, um ein akzeptables Arbeitsverhältnis jedes Zelltyps bereitzustellen (d. h., es war ein Präparat auf verdünnten gemischten Zellen). Dieses Verhältnis wurde erdacht, um eine konfluente Monolayer zu erreichen, in der jeder Zelltyp jeweils eine im Wesentlichen gleiche Oberfläche innerhalb von 1 bis 3 Tagen nach der Pflanzung der verdünnten gemischten Zellen bedeckte. Vor der Dispensierung wurde sorgfältig darauf geachtet, dass homogene Suspensionen der verdünnten gemischten Zellen präpariert wurden. Die gemischten Zellen wurden mit 0,75 ml je Glas-Vial-Shell dispensiert (d. h., ein Glas-Vial, das ein steriles Deckglas enthält). Nach der Pflanzung durften die Vials 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur ruhen, so dass sich die Zellen mittels Scherkraft abscheiden und eine und optimalere Zelldistribution jedes Zelltyps produzieren konnten. Die gemischten Zellen wurden dann 1 bis 3 Tage lang bei 36°C in 5% CO2 bei 95% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Danach wurden die Shell Vials bei Raumtemperatur gelagert, um jeden Zelltyp im Wesentlichen bei gleichen Oberflächenverhältnissen bis zu 10 Tage nach dem Erreichen der Konfluenz zu erhalten.
  • Proben und Processing
  • Nasopharyngeale Spezimen, die einem virologischen Diagnoselabor übermittelt wurden, wurden von Patienten erhalten, die Influenza-ähnliche Symptome zeigten. Die Spezimen wurden zentrifugiert, um ein Zellpel let für direkte Antigentests und einen Spezimen-Überstand für die Inokulation zahlreicher Zellkulturen zu produzieren. Das Zellpellet wurde in Phosphatpuffer resuspendiert, um eine Zellsuspension zu präparieren und 25 μl-Anteile der Zellsuspension wurden auf einen Objektträger getropft und getrocknet. Jeder Zellfleck auf dem Objektträger wurde dann mit Fixierungsmittel (z. B. Aceton) fixiert, und 30 Minuten lang mit individuellen Antikörperlösungen (Bartel's) inkubiert, die zahlreiche respiratorische Viren erkennen können, einschließlich Influenza A und RSV sowie anderer respiratorischer Viren. Eine zweite Antikörperlösung, die Fluorescein-(FITC)-markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper enthält und Kontrastfärbung (Bartel's) wurde zugefügt, um jeden Zellfleck auf den Objektträgern zu fixieren, und wurden für weitere 30 Minuten bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Kontrastfärbung in der FITC-Ziege-anti-Maus-Antikörperlösung enthält Evans Blue, das die Zellen färbt und unter Fluoreszenz rot erscheint. Die Objektträger, die von den Nasopharyngeal-Spezimen präpariert wurden, wurden auf positiven (d. h. virusinfizierten), apfelgrünen fluoreszierende Färbezellen beobachtet, unter Verwendung von Auflichtfluoresenz bei 100- bis 400-facher Vergrößerung.
  • Zusätzlich wurden 0,2 ml Aliquots des Spezimenüberstands auf zahlreichen Zellkulturen in Shell Vials, die Deckgläser enthalten, präpariert. Die Zellkulturen beinhalteten primäre Rhesusaffennierenzellen (PRMK; ViroMed oder BioWhittaker), Mv1Lu-Zellen (Diagnostic Hybrids) HEp-2-Zellen (Diagnostic Hybrids), MDCK-, A549-, und H292-Zellen, als Einzelzellen-Monolayer, sowie Monolayer gemischter Zellen von Mv1Lu- und H292-Zellen, die wie oben beschrieben, produziert wurden.
  • Jedes inokulierte Shell Vial wurde 60 Minuten lang bei 700 × g zentrifugiert, und dann 1 bis 3 Tage lang bei 36 °C in einem geeigneten Kulturmedium (z. B. EMEM, das 0,5 bis 2% FBS, 2 mM L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin [100 Einheiten/100 μg pro ml jedes Mediums]) enthält, inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium abgegossen, und die Zellen wurden mit einer Lösung aus Aceton und Methanol (50:50, v/v) an das Deckglas fixiert. Eine Antikörperlösung (Chemicon oder Bartel's), die einen Pool monoklonaler Antikörper zu vielen respiratorischen Viren, einschließlich Influenza A und RSV, sowie anderer respiratorischer Viren enthält, wurde zugefügt, um jedes Deckglas abzudecken. Die Deckgläser wurden dann 30 Minuten lang bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Antikörperlösung wurde dann entfernt und die Deckgläser wurden mit PBS gespült. Eine zweite Antikörperlösung, die Fluorescein-(FITC)-markierte Ziege-anti-Maus-Antikörper enthält, und Kontrastfärbung (Bartel's) wurde zugefügt, um jedes Deckglas abzudecken, und für weitere 30 Minuten bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Kontrastfärbung in der FITC-Ziege-anti-Maus-Antikörperlösung enthält Evans Blue, das die Zellen färbt und unter Fluoreszenz rot erscheint. Shell-Vial-Deckgläser, die von den nasopharyngealen Spezimen präpariert wurden (d. h., inokulierte Kulturen) wurden auf positiven (d. h. virusinfizierten), apfelgrünen fluoreszierenden Färbezellen beobachtet, unter Verwendung von Auflichtfluoresenz bei 100- bis 400-facher Vergrößerung.
  • Ergebnisse
  • Einige Spezimen wiesen eine positive direkte Antigenreaktion auf dem Zellfleck auf, der mit monoklonalem Influenza-A-Antikörper inkubiert wurde. Diese Spe zimens wiesen auch Fluoreszenzfärbung auf dem Einzelzellen-Mv1Lu-Deckglas und auf dem Deckglas mit den gemischten Mv1Lu/H292-Zellen auf, aber keine oder nur sehr wenig Fluoreszenz auf dem Einzelzellen- H292-Deckglas. Die H292-Zellen sind entweder nicht empfänglich für diesen Influenza-A-Stamm oder sind signifikant weniger empfänglich, so dass die Infektion nicht detektierbar ist. Außerdem waren in einigen Fällen (d. h., in Spezimen mit niedrigen Virustitern) die Kultursysteme sensitiver als das direkte Antigendetektionsverfahren. Während zudem die PRMK-Einzelzellkulturen (d. h., die Zellen des „goldenen Standards", verwendet wurden, um Influenza A zu detektieren) für das Vorhandensein von Influenza A bei vielen Spezimen positiv waren, war die Anzahl der infizierten Zellen und die Gesamtanzahl der positiven Spezimen niedriger, als jene, die durch die Monolayer aus gemischten Zellen als positiv identifiziert wurden.
  • Zusätzlich erkannten sowohl die MDCK- als auch die PRMK-Zellen ein Spezimen mit niedrigem Titer nicht, das bei einem direkten Antigentest (IFA) positiv auf Influenza A war, und ein anderes Spezimen, das mittels IFA ebenfalls positiv auf Influenza A war, während die Mv1Lu-Zellen den Virus in allen Proben detektierten, die auf der Basis der direkten Antigendetektion (IFA) als positiv bestimmt worden waren.
  • Einige Spezimen wiesen eine positive direkte Antigenreaktion auf dem Zellfleck auf, der mit monoklonalem RSV-Antikörper inkubiert wurde. Diese Spezimen wiesen auch Fluoreszenzfärbung auf dem Einzelzellen-H292-Deckglas und auf dem Deckglas mit den gemischten Mv1Lu/H292-Zellen auf, aber keine oder nur sehr wenig Fluoreszenz auf dem Einzelzellen-MV1Lu-Deckglas. Die H292-Zellen sind empfänglich für eine RSV-Infektion, während die Mv1Lu-Zellen nicht empfänglich sind (oder sie sind signifikant weniger empfänglich, so dass die Infektion nicht detektierbar ist). Zusätzlich zu den gemischten Zellkulturen wurden auch HEp-2-Zellen (d. h., die Zellen des „goldenen Standards" verwendet, um RSV zu detektieren) auf das Vorhandensein von RSV hin beobachtet; die Leistung der HEp-2-Zellen war im Allgemeinen weniger sensitiv als die der Mv1Lu- und H292-Monolayer aus gemischten Zellen, oder der H292-Einzelzellen-Monolayer. Diese Ergebnisse mit Influenza A, das in Nerzlungenzellen getestet wurde, war sehr überraschend, da die Detektion von Influenza A unter Verwendung dieser Zellen zuvor noch nicht beschrieben worden war.
  • Adenoviren, die aus fünf klinischen Spezimen auf der Basis eines direkten Antigentests (IFA) identifiziert wurden, wurden in den H292- und Zellkulturmischungen detektiert, während die PRMK-Zellen zwei der Spezimen mit niedrigem Titer nicht erkannten (d. h., es gab zwei falsche Negativ-Bewertungen). Somit waren die H292-Kulturen und die gemischten Kulturen zur Detektion von Adenoviren sensitiver als PRMK. Während die A549-Zellen etwas mehr positive Zellen bereitstellen können, detektierten die 292-Zellen, die gemischten Zellkulturen und die A549-Zellen, eine gleiche Anzahl positiver Spezimen.
  • Parainfluenzaviren wurden auch in den H292-Kulturen und den gemischten Zellkulturen detektiert, während die PRMK-Zellen ein Spezimen mit niedrigem Titer nicht erkannten.
  • Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die gemischten Zellkulturen die gleiche Sensitivität aufweisen, wie die Einzelzellenkulturen (H292 und Mv1Lu). Somit stellen die gemischten Zellen Einsparungen an Material, Zeit, Raum und Labor bereit, und stellen dabei den gleichen Sensitivätslevel zur Detektion respiratorischer Viren bereit, wie Einzelzellkulturen, die gegenwärtig üblicherweise in virologischen Diagnoselaboratorien verwendet werden.
  • Influenza-B-Spezimen
  • Zusätzlich zu den oben diskutierten Proben wurden zahlreiche Verdünnungen vieler Influenza-B-Stämme, bezogen von ATCC, in MDCK-, Mv1Lu- und PRMK-Zellen getestet. Die folgende Tabelle stellt die Ergebnisse dieser Versuche bereit. In dieser Tabelle bezieht sich „MD" auf den „Maryland"-Stamm, „HK" bezieht sich auf den „Hongkong"-Stamm, „TW" bezieht sich auf den „Taiwan"-Stamm und „MA" bezieht sich auf den „Massachusetts"-Stamm.
  • TABELLE 3
    Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Diese Ergebnisse zeigen an, dass Mv1Lu, MDCK und PRMK zur Detektion vieler Influenza-B-Virenstämme vergleichbar sind. Somit wurden diese Zelllinien als gute Kandidaten für gemischte Zellkulturen identifiziert, sowie einige Einzelzellkulturen für die Identifikation dieses Virus.
  • BEISPIEL 3
  • Detektion von CMV in gemischten Zellkulturen
  • In diesem Beispiel wurden gemischte Zellkulturen von Mv1Lu- und NCI-H292-Zellen verwendet, um das Vorhandensein eines menschlichen Zytomegalovirus (HCMV) zu detektieren.
  • Der Towne-Stamm von HCMV (ATCC #VR977) wurde in MRC-5-Zellen zu einem Titer von mehr als 106/ml amplifiziert, und bei –85°C in einem EMEM-enthaltenden 10% FBS gefroren. Verdünnungsreihen von HCMV wurden präpariert und in Einzelzellen-Monolayer von Nerzlungenzellen (Mv1Lu), MRC-5-Zellen und Monolayern gemischter Zellen von Mv1Lu- und H292-Zellen inokuliert. Jedes infizierte Zellkultursystem wurde 60 Minuten lang bei 700 × g zentrifugiert, und dann 24 Stunden lang bei 36°C in 5% CO2 in einem geeigneten Kulturmedium (z. B. EMEM, das 10% FBS enthält) inkubiert. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen wurden unter Verwendung einer Lösung von 80% Aceton in Wasser an das Deckglas fixiert. Eine ausreichende Menge an HCMV-Antikörperlösung (Chemicon) wurde zugegeben, um jedes Deckglas abzudecken und 30 Minuten lang bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Antikörperlösung wurde entfernt und das Deckglas wurde mit PBS gespült. Eine zweite Antikörperlösung, die aus FITC-markiertem Ziege-anti-Maus-Antiserum besteht, wurde zugefügt, um jedes Deckglas abzudecken und weitere 30 Minuten lang bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Spezimen wurden dann unter Aufsichtfluoreszenz bei 100 bis 400-facher Vergrößerung auf positive (d. h., CMV-infizierte), kerngefärbte, fluoreszierende Zellen hin, beobachtet.
  • Wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, enthält die Kontrastfärbung in der FITC-markierten Ziege-anti-Maus-Antikörperlösung Evans Blue, das die Zellen färbt und rot erscheint, wenn es von fluoreszierendem Licht angeregt wird. Fluoreszierender apfelgrüner Kernfarbstoff wurde in der Mv1Lu-Einzelzellen-Monolayer und in den Monolayern aus gemischten Zellen beobachtet, aber nicht in den H292-Zellen, da die Mv1Lu-Zellen für eine HCMV-Infektion empfänglich sind, während die H292-Zellen es nicht sind (oder die H292-Zellen sind signifikant weniger sensitiv). Die MRC-5-Zellen (d. h., die Zellen des „goldenen Standards" zur Detektion von HCMV) leisteten etwa das Gleiche wie die Monolayer aus gemischten Zellen, da diese Kulturen eine ähnliche Anzahl an infizierten Zellen aufwiesen, wie die Zellen in der gemischten Monolayer.
  • BEISPIEL 4
  • Detektion von Enteroviren in gemischten Zellkulturen
  • In diesem Beispiel wurden gemischte Zellkulturen verwendet, um die Enteroviren, Coxsackie-B-Virus und Echovirus, zu detektieren. In diesen Versuchen wurde ein Monolayer mit gemischten Zellen von BGMK und NCI-H292-Zellen verwendet.
  • Konfluente T-225-Kolben mit BGMK und H292-Zellen wurden in EMEM mit 25 mM HEPES, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin präpariert. Die Zellen wurden geerntet, indem sie zuerst in 30 ml HBSS ohne Magnesium und Calcium gespült wurden, und dann von den Kolben mittels einer kurzen Behandlung mit 7 ml Trypsin-EDTA-Lösung (wie in Beispiel 1 beschrieben) abgelöst wurden. Dann wurden zusätzliche 30 ml Kulturmedium (EMEM mit HEPES, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin) zur Lösung zugefügt, um ein Zellsuspensionskonzentrat zu produzieren. Die optische Dichte bei 500 nm wurde für jede Suspension unter Verwendung von 3 ml der Zellen bestimmt. Typischerweise betrug die Ablesung der optischen Dichte 0,2/ml sowohl für die BGMK- als auch für die H292-Zellsuspension.
  • Als nächstes wurden 3 ml BGMK-Zellsuspension und 8 ml H292-Zellsuspension (beide Suspensionen hatten eine optische Dichte von 0,2 OD-Einheiten/ml) dann zu den 29 ml Kulturmedium (25 mM HEPES, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 50 μg/ml Gentamicin) zugefügt, um ein akzeptables Arbeitsverhältnis jedes Zelltyps in einer verdünnten gemischten Zellsuspension bereitzustellen. Dieses Verhältnis war gedacht, um einen konfluenten Monolayer zu erreichen, bestehend aus jedem Zelltyp, der jeweils eine im Wesentlichen gleiche Oberfläche inner halb von 1 bis 3 Tagen nach der Pflanzung der verdünnten gemischten Zellen bedeckt. Es wurde Sorgfalt geübt, um eine homogene Suspension der verdünnten gemischten Zellen zu präparieren, bevor 0,75 ml auf jede der 100 Glas-Shell-Vials dispensiert wird, die jeweils ein steriles Deckglas enthielten. Die Vials durften nach der Pflanzung 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur ruhen, um es den Zellen zu ermöglichen, sich mittels Schwerkraft abzuscheiden und eine optimalere Zelldistribution zu erhalten. Die Vials wurden dann zur Inkubation bei 36°C 1 bis 3 Tage lang in 5% CO2 bei 95% relativer Luftfeuchtigkeit in einen Inkubator gestellt.
  • Lagervirussuspensionen und klinische Spezimen, die gezeigt haben, dass sie Coxsackie-B-Virus oder Echovirus enthalten, wurden verwendet, um BGMK/H292-Zellmischungen sowie Einzelzellen-Monolayer von BGMK-, H292-, MRC-5- und PRMK-Zellen zu infizieren. Für klinische Proben wurden Rachenabstrich, Nasenrachenabstrich, Sputum, Stuhl und Rektalabstriche von Patienten gesammelt, in ein virales Transportmedium gegeben und durch einen 0,45 μm-Filter gefiltert, um mögliche bakterielle und fungale Kontaminanten vor der Inokulation der Zellkulturen zu entfernen. Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), die von Patienten gesammelt wurde, wurde in ein virales Transportmedium gegeben und direkt für die Inokulation von Zellen verwendet. Für die Inokulation von Shell Vials wurden die Medien, die in den Vials vorhanden waren entfernt, und frische Medien zugefügt. Dann wurde 0,2 ml Spezimen in jedes Vial inokuliert. Die inokulierten Vials wurden bei 700 × g 45 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Danach wurden die Vials bei 37°C 1 bis 3 Tage lang inkubiert, und das Vorhandensein von Viren wurde unter Verwendung von Immunfluoreszenzfärbung detektiert.
  • Für die Färbung wurde das Medium aus jedem Vial entfernt, und die Zellen wurden auf dem Deckglas mit Aceton fixiert. Das Deckglas wurde von jedem Vial entfernt und mit 25 μl primärem Antikörper (monoklonaler Maus-Antikörper, der gegen Enteroviren gerichtet ist [Dako]) 30 Minuten lang bei 37°C gefärbt. Nach dem Waschen mit PBS, wurden 25 μl des FITC-konkugiertem Anti-Maus-Ig (Dako) als ein sekundärer Antikörper für die Färbung verwendet und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach einer weiteren Wäsche wurden die Deckgläser auf Objektträger gegeben und unter Fluoreszenz beobachtet. Das Vorhandensein von einer oder mehrerer fluoreszenz-gefärbter Zellen auf dem Deckglas wurde als positiv eingestuft. Wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, enthält die Kontrastfärbung in der FITC-markierten Ziege-anti-Maus-Antikörperlösung Evans Blue, das die Zellen färbt und rot erscheint, wenn es fluoreszierendem Licht ausgesetzt wird. Für die Coxsackie-B-Virus-Detektion wurden fluoreszierende, apfelgrün gefärbte Färbung in vielen der BGMK-Zellen in der BGMK-Einzelzellen-Monolayer und in der Monolayer gemischter Zellen, primär in den BGMK-Zellen beobachtet, aber nicht in so vielen H292-Zellen, da die BGMK-Zellen empfänglicher für eine Coxsackie-B-Virusinfektion sind. Für einige Typen der Coxsackie-B-Virus-Isolate sind die H292-Zellen nicht empfänglich (oder die H292-Zellen sind signifikant weniger empfänglich). Die Zelllinie des „goldenen Standards" (d. h., PRMK-Zellen) wiesen nicht die gleiche Anzahl an infizierten Zellen auf, wie die Monolayer aus gemischten Zellen.
  • Zur Detektion des Echovirus, wurde fluoreszierende, apfelgrüne Färbung in vielen H292-Zellen in der H292 Einzelzellen-Monolayer und in den Monolayern aus gemischten Zellen beobachtet, primär in den H292-Zellen, aber nicht in so vielen BGMK-Zellen, da H292-Zellen empfänglicher für eine Echovirus-Infektion sind, während BGMK-Zellen nicht so empfänglich sind (oder die BGMK-Zellen sind signifikant weniger sensitiv). Die Linie des „goldenen Standards" (d. h., MRC-5-Zellen) erfüllte ihre Aufgabe, schien aber nicht so viele infizierte Zellen zu haben wie der Monolayer aus gemischten Zellen. In dem Fall der BGMK/H292-Monolayer aus gemischten Zellen, die mit Enterovirenproben mit hohem Titer infiziert waren, war ein zellspezifischer virus-vermittelter zytopathischer Effekt (CPE) evident (d. h., CPE wurde in BGMK-Zellen beobachtet, wenn Coxsackie-B-Virus mit einem hohen Titer vorhanden war, und CPE wurde in H292-Zellen beobachtet, wenn ein Echovirus mit einem hohen Titer vorhanden war).
  • BEISPIEL 5
  • Detektion von Herpes-simplex-Virus und HCMV in gemischten Zellkulturen
  • In diesem Beispiel werden gemischte Zellkulturen verwendet, um den Herpes-simplex-Virus (HSV) und HCMV unter Verwendung einer Monolayer aus gemischten Zellen aus gentechnisch hergestellten Babyhamsternierenzellen (BHK) (z. B. ATCC #CCL-12072) und Mv1Lu-Zellen, zu detektieren.
  • Die BHK und Mv1Lu-Zellen werden in Kolben gewachsen, trypsinisiert und wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, gemischt, so dass eine geeignete Verdünnung gemischter Zellen produziert wird. Diese gemischten Zellverdünnungen werden dann verwendet, um sterile Glas-Shell-Vials zu inokulieren, die wie oben beschrieben, Deckgläser enthalten. Die Zellen werden dann zentrifugiert und mit Virus oder klinischen Proben inokuliert, inkubiert und wie oben beschrieben fixiert.
  • HCMV wird in den Mv1Lu-Zellen detektiert, unter Verwendung von Antikörper, wie in dem oben genannten Beispiel 3 beschrieben, und HSV (HSV-1 und HSV-2) werden identifiziert unter Verwendung eines β-Galactosidase-Färbekits (d. h., Detektieren des Reportergens, das durch den Virus induziert wird, der die gentechnisch hergestellten BHK-Zellen infiziert).
  • BEISPIEL 6
  • Detektion von respiratorischen Viren in gemischten Zellkulturen
  • In diesem Beispiel werden die gemischten Zellkulturen verwendet, um ein Panel respiratorischer Viren zu detektieren. In diesen Versuchen werden drei Zelltypen kombiniert, um eine gemischte Zellkultur zu produzieren, die mindestens drei Viren detektieren kann.
  • Zuerst werden A549-, H292- und Nerzlungenzellen (z. B. Mv1Lu) in Kolben gewachsen, trypsinisiert und wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, gemischt, so dass eine geeignete Verdünnung gemischter Zellen produziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zellen verdünnt, so dass die gemischten Zellen in ungefähr den gleichen Verhältnissen (d. h., 1:1:1) in der Kultur sein werden. Diese gemischten Zellverdünnungen werden dann verwendet, um sterile Glas-Shell-Vials zu inokulieren, die wie oben beschrieben, Deckgläser enthalten. Die Zellen werden dann zentrifugiert und mit Virus oder klinischen Proben inokuliert, inkubiert und wie oben beschrieben fixiert.
  • Die Viren, die diese Zellen infizieren können, werden unter Verwendung der Verfahren, die in Beispiel 2 oben beschrieben wurden, detektiert und identifiziert. In diesen gemischten Zellkulturen werden die 292-Zellen verwendet, um das Vorhandensein von Parainfluenzaviren und RSV zu detektieren, während die A549-Zellen verwendet werden, um das Vorhandensein von Adenoviren zu detektieren, und die Nerzlungenzellen werden verwendet, um das Vorhandensein von Influenzaviren (z. B. Influenza A und B) zu detektieren.
  • BEISPIEL 7
  • Detektion von HSV und Chlamydien in gemischten Zellkulturen
  • In diesem Beispiel werden gemischte Zellkulturen bereitgestellt, die die Detektion von zwei Organismen ermöglichen, die gewöhnlich mit sexuell übertragenen Krankheiten verbunden werden. In diesen Versuchen werden Nerzlungenzellen (z. B. Mv1Lu), die zur Detektion von HSV verwendbar sind, mit McCoy-Zellen gemischt, die zur Detektion von C. trachomatis verwendbar sind.
  • Zuerst werden McCoy-Zellen und Nerzlungenzellen (z. B. Mv1Lu) in Kolben gewachsen, trypsinisiert und wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, gemischt, so dass eine geeignete Verdünnung gemischter Zellen produziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Zellen verdünnt, so dass die gemischten Zellen in ungefähr den gleichen Verhältnissen in der Kultur sein werden. Diese gemischten Zellverdünnungen werden dann verwendet, um sterile Glas-Shell-Vials zu inokulieren, die wie oben beschrieben, Deckgläser enthalten. Die Zellen werden dann zentrifugiert und mit Proben (z. B. klinischen Proben) inokuliert, inkubiert und wie oben beschrieben, fixiert.
  • Die Organismen, die diese Zellen infizieren können (z. B. infiziert HSV die Nerzlungenzellen, während C. trachomatis die McCoy-Zellen infiziert), werden unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren detektiert und identifiziert. Wie bei den anderen gemischten Zellkultursystemen kann das Vorhandensein von Virus und/oder C. trachomatis durch andere Verfahren detektiert werden, wie etwa die Beobachtung von CPE, tierische Inokulation usw. Somit ist es nicht beabsichtigt, dass die gemischten Zellkulturassaysysteme dieses Beispiels oder irgendeines der vorstehenden Beispiele auf ein bestimmtes Verfahren zur Detektion, Identifikation und/oder Quantifikation von Mikroorganismen beschränkt ist.
  • BEISPIEL 8
  • Detektion von Enteroviren in gemischten Zellkulturen von menschlichen embryonalen Rhabdomyosarkomzellen (RD) und H292-Zellen und in gemischten Zellkulturen von BGMK- und A549-Zellen
  • In diesem Beispiel wurden zwei verschiedene gemischte Zellkulturen [Mischung A enthält RD-Zellen (ATCC #CCL 136) und H292-Zellen; Mischung B enthält BGMK-Zellen und A549-Zellen] verwendet, um achtzig (80) verschiedene Isolate von Enteroviren zu detektieren. Die gemischten Zellkulturen wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 1 oben beschrieben, präpariert. Die achtzig Isolate waren gelagerte (gefrorene) klinische Isolate, die aus Zerebrospinalflüssigkeit, Rachen und Kot auf MRC5 und/oder PMK geerntet wurden. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
  • TABELLE 4
    Figure 00810001
  • Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass alle 80 Enteroviren auf Shell Vials von Mischung A oder Mischung B wuchsen. Ungefähr 80% aller Enteroviren wuchsen auf Mischung A; 66% wuchsen auf Mischung B. Über die Hälfte der Coxsackieviren (64%) wuchs in Mischung A; 75% wuchs in Mischung B. Von den Echoviren wuchsen 95% auf Mischung A; 51% wuchsen auf Mischung B. Alle Polioviren wuchsen sowohl auf Mischung A als auch auf Mischung B.
  • Diese Ergebnisse beweisen, dass sowohl Mischung A als auch Mischung B bei der Detektion der großen Mehrheit (81% bzw. 60%) aller getesteten Enteroviren erfolgreich waren. Die Daten beweisen auch, dass die Kombination aus Mischung A und Mischung B 100% aller klinischen Isolate der getesteten Enteroviren detektierte. Somit ermöglicht die Kombination von Mischung A und Mischung B die Detektion aller Enteroviren von klinischen Quellen, wie etwa Zerebrospinalflüssigkeit, Rachen, und Kot.
  • BEISPIEL 9
  • Detektion von Enteroviren in gemischten Zellkulturen die menschliche Kolonadenokarzinomzellen (Caco-2) enthalten
  • In diesem Beispiel werden gemischte Zellkulturen, die menschliche Kolonadenokarzinomzellen (Caco-2) (ATCC #HTB 37) enthalten, verwendet, um enterische Viren, einschließlich Coxsackieviren, Echoviren, Polioviren, Rotaviren, Astroviren und Adenoviren, zu detektieren und zu identifizieren. Rotaviren, Astroviren und Adenoviren sind für 80% der viralen Gastroenteritis verantwortlich, die bei kleinen Kindern auftreten [Pinto et al. (1994) J. Medical Virol. 44: 310.315].
  • Gemischte Zellkulturen
  • Gemischte Zellkulturen, die menschliche Kolonadenokarzinomzellen (Caco-2) (ATCC #HTB 37) in Kombination mit einem, zwei oder drei anderen Zelltypen enthalten, ausgewählt aus RD-Zellen, H292-Zellen, BGMK-Zellen und A549-Zellen (Tabelle 5), werden verwendet, um achtzig (80) verschiedene Isolate von Enteroviren zu detektieren, die wie in Beispiel 8 oben beschrieben präpariert wurden. Die gemischten Zellkulturen werden auch verwendet, um den Poliovirus 1, Coxsackievirus A24, Enterovirus 70, Reovirus 3, menschlichen Rotavirus, Adenovirus 5, Adenovirus 40 und Adenovirus 41, Astrovirus 1 und den HAV-Stamm HM175 zu detektieren. Diese Viren wurden bereits von Pinto et al. (1994), oben, beschrieben. Die gemischten Zellkulturen, die in der folgenden Tabelle 5 beschrieben werden, werden im Wesentlichen so präpariert wie in Beispiel 1 oben beschrieben, und werden mit Einzelzellkulturen verglichen, die Caco-2-, RD-, H292-, BGMK- oder A549-Zellen enthalten.
  • TABELLE 5
    Figure 00830001
  • Während der Inkubation wurden die Monolayer mit Einzelzellen und gemischten Zellen regelmäßig auf die Gesamtlebensfähigkeit und die Fähigkeit der Zelllinien zu co-existieren und sich als Einzelzellschicht (d. h., als Einzel-Monolayer), mit zwei unterschiedlichen Zellmorphologien (d. h., dimorphe Zellschichten), bei einer ungefähr gleichen Dichte jedes Zelltyps, entwickeln können, überprüft. Es wurden die erfolgreichen gemisch ten Kulturen ausgewählt, in denen Monolayer gemischter Zellen an den Vertiefungsoberflächen anhaften, die einen glatten, gleichmäßig verteilten Monolayer aufweisen, in dem jeder Zelltyp leicht unterschieden werden kann (d. h., der „Morphologischen Kategorie 1"). Alternativ sind erfolgreiche gemischte Kulturen jene, in denen gemischte Monolayer an den Vertiefungsoberflächen anhaften, jedoch bei Konfluenz zwei unterschiedliche Morphologien aufweisen (d. h., der „morphologischen Kategorie 2").
  • Proben und Processing
  • Enterische Viren werden detektiert mittels Identifikation des virusinduzierten zytopathischen Effekts (CPE), und/oder mittels Detektion der Expression von mindestens einer frühen virusspezifischen Nukleinsäure, bevor CPE in den infizierten Kulturen evident wird. Das Vorhandensein enterischer Viren wird durch Dot-blot-Hybridisierung vor und nach der Infektion der gemischten Zellkulturen analysiert, die Caco-2-Zellen enthalten, wie zuvor oben beschrieben [Pinto et al. (1994). Kurz gesagt wird Virus-RNA und -DNA 48 Stunden nach der Infektion (p.i.) aus Stuhlsuspensionen von gemischten Zellkulturen extrahiert. Eine Sonde, die 2.300 bp von Gen 4 eines Rotavirus Wa entspricht, wird verwendet, um den menschlichen Rotavirus zu detektieren; eine Sonde, die 1 kb des 3'-Endes des menschlichen Astrovirus Typ 1 entspricht, wird verwendet, um die menschlichen Astroviren zu detektieren; und eine Sonde, die dem 1.800 bp-PstI-Fragment H des Adenovirus 40 entspricht, und eine Sonde, die dem 6.500 bp-PstI-Fragment B des Adenovirus 41 entspricht, wird verwendet, um Adenovirus 40 bzw. Adenovirus 41 zu detektieren [Pinto et al. (1994), oben. Alle cDNA-Sonden sind mit Digoxigenin-11-UTP (Boehringer Mannheim), gemäß den Angaben des Herstellers, markiert. Ein Dot-blot-Hybridisierungsassay mit den verschiedenen cDNA-Sonden wird gemäß Standardverfahren durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die Detektion von CPE und/oder Virusnukleinsäuren unter Verwendung von Dot-blot-Hybridisierung in gemischten Zellkulturen, die Caco-2-Zellen enthalten, beweist, dass diese Zellen für die enterischen Viren empfänglich sind, (d. h., Coxsackieviren, Echoviren, Polioviren, Rotaviren, Astroviren und Adenoviren) mit denen die gemischten Zellkulturen inokuliert wurden.
  • Aus dem Vorstehenden ergibt sich eindeutig, dass die vorliegenden Erfindung viele Vorteile gegenüber den gegenwärtig in der diagnostischen Mikrobiologie verwendeten Verfahren bereitstellt.

Claims (4)

  1. Verfahren zur Detektion von Enterovirus in einer Probe, das umfasst a) Bereitstellen von i) einer Probe, die im Verdacht steht, Enterovirus zu enthalten; und ii) eine gemischte Zellkultur, die mindestens zwei Zelltypen umfasst, wobei diese Zelltypen RD Zellen und menschliche mucoepidermoide Zellen, oder Caco-2 Zellen und einen anderen Zelltyp umfassen; b) Inokulieren der gemischten Zellkultur mit mindestens einem Teil der Probe, um eine inokulierte Kultur zu erhalten; und c) Beobachten der inokulierten Kultur auf das Vorhandensein von dem Enterovirus.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die menschliche mucoepidermoide Zelle H292 ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Enterovirus ausgewählt ist aus Coxsackieviren, Echoviren, Polioviren, Rotaviren, Astroviren und Adenoviren.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der andere Zelltyp ausgewählt ist aus RD Zellen, H292 Zellen, BGMK Zellen und A549 Zellen.
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