CN108378019A

CN108378019A - 一种人精原干细胞的冻存液

Info

Publication number: CN108378019A
Application number: CN201810206197.2A
Authority: CN
Inventors: 杨骏; 张丽
Original assignee: Luoyang Xuan Zhi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Nuosa Union (Beijing) Biomedical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-08-10
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108378019B

Abstract

本发明涉及一种人精原干细胞的冻存液，具体的，本发明的人精原干细胞的冻存液由基础培养液和活性保持肽组成。本发明成分简单，制备方便，成本低廉，而且没有特殊的刺激物质导致人精原干细胞的无序分化，特别是活性保持肽的加入，能够大幅度的提高人精原干细胞的冻存安全性和稳定性，从而使得细胞活率提高，冻存效果明显优于常规细胞冻存液，可以用于人精原干细胞的长期保存及应用。

Description

一种人精原干细胞的冻存液

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种人精原干细胞的冻存液。

背景技术

精原干细胞(SSCs)指位于曲精细管基膜上既能自我更新维持自身适量恒定，又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞。随着雄性动物的出生，原始生殖细胞转化为生殖母细胞，迁移到生精小管基膜部，并分化为精原干细胞。

在体内,精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是位于曲细精管基膜上、能通过自我更新维持自身数量并分化形成精母细胞,进一步形成成熟精子的一类原始精原细胞。1994年,Brinster等通过生殖细胞移植实验验证了SSCs的存在。SSCs和卵原干细胞分别是雄性或雌性成年哺乳动物体内唯一能通过自然生殖过程将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs具有高度的自我更新能力和分化潜能。

人们不断尝试将SSCs体外分化形成精子。2011年,Sato等用改进的无血清培养体系进行睾丸组织培养并观察到了精子的形成,获得了圆形精子及具有尾部的精子。进一步通过圆形精子注射(round spermatid injection,ROSI)技术和卵胞浆内单精子显微注射(intra cytoplasmic sperm injection,ICSI)技术均获得了健康子代。6个月以后,Sato等在体外成功地把小鼠SSCs诱导为精子,为睾丸组织微环境异常导致的不育治疗提供了一个革命性的途径。Sato等的一系列实验证明,即使没有循环系统,在适当条件下睾丸组织仍然能够为SSCs提供必要的微环境从而维持其自我更新和分化形成精子,在此过程中同样观察到了移植后SSCs的归巢行为和集落形成能力。2012年,Kanatsu-Shinohara等证实了SSCs的归巢行为和集落形成能力均与微环境分泌趋化因子有关,其中GDNF和CXCL12是SSCs体内的趋化因子。这一结果为研究SSCs在曲细精管中的行为提供了线索,也为ES或iPS等其他干细胞向生殖细胞的诱导研究提供新的思路。

SSCs像其他成体干细胞一样具有体外向其他成体组织细胞转分化的潜能。2004年,Kanatsu-Shinohara等利用MEF作为饲养层细胞,将新生小鼠SSCs培养于含有GDNF的培养液内,4～7周后出现ES样细胞。该细胞在诱导ES细胞分化的条件下可以产生包括造血细胞、神经元细胞、肌细胞以及血管内皮细胞在内的多种成体细胞,同样将该细胞注射到囊胚后能形成生殖系嵌合体。2006年,Guan等证明成年小鼠SSCs也可在体外培养中诱导为ES细胞样细胞,注射到囊胚后可成功传到子代的生殖细胞中。2007年,Seandel等发现,小鼠SSCs可改变其精子发生的发育方向,形成“多能成体精原干细胞(multipotent adultspermatogonial-derived stem cells,MASCs)”。MASCs具有三个胚层的分化潜能,能够体外分化形成心肌细胞等多种细胞类型。2008年,Conrad等从成人睾丸中成功分离培养SSCs,体外培养后形成人ES样细胞。这些细胞可稳定地分化为分泌胰岛素的细胞或肌性细胞系、成骨细胞系及与神经细胞相似的细胞。将上述ES样细胞进行皮下移植时,会在裸鼠体内形成畸胎瘤,进一步证明了它们具有多能性,也反映了这些细胞在再生治疗中所具有的潜力。

2016年中国科学院昆明动物研究所科学家最近首次建立树鼩精原干细胞体外培养体系，并利用体外培养的树鼩精原干细胞成功获得世界首只转基因树鼩，实现了树鼩基因修饰技术的重大突破。这也充分的证明SSCs在医学、干细胞生物学、转基因研究等领域具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

正是基于精原干细胞的重要作用，如何批量获得、并持续保存获得的精原干细胞变得尤为重要。现有技术已经有如何构建并获得精原干细胞的方法，但是如何长期保存所述精原干细胞并保持所述干细胞的活性在现有技术中并没有过多涉及，CN102246745A中公开了用于动物精原干细胞冷冻保存的抗冻剂及其冷冻方法，可以是低密度脂蛋白，或者为3mg/ml的低密度脂蛋白和0.5mg/ml的海藻糖按照1∶1体积比配伍，或者为5mg/ml的低密度脂蛋白和0.5mg/ml的卵磷脂按照1∶1体积比配伍，但是该方法存在着诸多的弊端，针对人精原干细胞的复苏率以及活性率均存在提高的空间。因此，开发一种能够高效保存精原干细胞活性以及存活率的冻存液变得尤为重要。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种维持细胞原始功能，同时又能很好的保持冻存活性的细胞冻存液，用于冻存人精原干细胞。

本发明还提供一种制备所述人精原干细胞的冻存液的方法。

本发明通过以下技术方案实现该目的：

一种人精原干细胞的冻存液，由基础培养液和活性保持肽组成。

其中细胞活性肽由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的活性肽组成。该活性肽能够特异性的刺激精原干细胞产生抗冻蛋白以及胶原蛋白，从而使得细胞的结构在低温环境下能够保证更好的细胞器官稳定性继而达到维持细胞低温完整性的效果。

其中基础培养液组成如下：蔗糖1.0％、右旋糖酐40O.5％，谷胱甘肽O.2％，谷氨酰胺O.6％，，海藻糖0.5％，左旋谷氨酰胺0.1％，甘油15％(V/V)，1640无菌培养基余量。

作为优选的，所述人精原干细胞的冻存液中活性保持肽的添加量为0.1％-0.3％。

本发明还提供了一种人精原干细胞的冻存液的制备方法，包括以下步骤：按照现有技术的方法分离并获得人精原干细胞，将干细胞培养于1640无菌培养基和活性肽中，于37℃、5％CO₂的条件下培养2-3天，随后将细胞转移到添加有活性肽的基础培养液中培养，于30℃、5％CO₂的条件下培养12h，随后于液氮直接冷冻保存即可。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的人精原干细胞的冻存液由基础培养液和活性保持肽组成。本发明成分简单，制备方便，成本低廉，而且没有特殊的刺激物质导致人精原干细胞的无序分化，特别是活性保持肽的加入，能够大幅度的提高人精原干细胞的冻存安全性和稳定性，从而使得细胞活率提高，冻存效果明显优于常规细胞冻存液，可以用于人精原干细胞的长期保存及应用。

附图说明

图1为制备获得的精原干细胞显微成像图。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。但是不能理解为对本发明的限制，其他只要能够实现本发明效果的方式，都在本发明的保护范围内。

实施例1、人精原干细胞的制备

合法引产的男性胎儿睾丸组织先后应用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法，Percoll密度梯度离心，差异贴壁法，进行人精原干细胞的分离及培养，用细胞免疫荧光法进行人精原干细胞的鉴定；流式细胞免疫荧光法对Oct-4标记阳性的细胞进行筛选，最终获得精原干细胞(如图1所示)。当然，也可以采用本领域其他的精原干细胞的获得方式进行获得，这属于现有技术的常规选择。

实施例2细胞冷冻液的制备

人工合成SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的活性肽。

基础培养液的配置：在1640无菌培养基中添加蔗糖1.0％，右旋糖酐40O.5％，谷胱甘肽O.2％，谷氨酰胺O.6％，海藻糖0.5％，左旋谷氨酰胺0.1％，甘油15％(V/V)，采用1640无菌培养基定容到1L。

所述基础培养液中活性保持肽的添加量为0.3％。

对照冷冻液1的制备：5mg/ml低密度脂蛋白和0.5mg/ml的卵磷脂配伍抗冻剂。

对照冷冻液2的制备：细胞膜保护剂1％：由蔗糖O.5％、高分子糖酐-500O.5％组成，DMSO 8％；细胞沉降稳定剂25％：由甲基纤维素4000CP 15％、羟乙基淀粉10％组成；抗氧化剂O.2％：由维生素C O.1％、谷胱甘肽O.1％组成；细胞营养剂1.0％，由谷氨酰胺O.4％、丙酮酸钠O.6％组成；PBS缓冲液，余量。

实施例3人精原干细胞冻存1

将实施例1制备得到的人精原干细胞，培养于1640无菌培养基和SEQ IDNO：1的活性肽0.3％中，于37℃、5％CO₂的条件下培养2天(多肽能够刺激细胞生成抗冻物质)，收集细胞，在实施例2的基础培养液+SEQ ID NO：1的活性肽0.3％中培养，于30℃、5％CO₂的条件下培养12h，液氮直接冷冻保存即可。

实施例4人精原干细胞冻存2

将实施例1制备得到的人精原干细胞，培养于1640无菌培养基和SEQ IDNO：2的活性肽0.3％中，于37℃、5％CO₂的条件下培养2天(多肽能够刺激细胞生成抗冻物质)，收集细胞，在实施例2的基础培养液+SEQ ID NO：2的活性肽0.3％中培养，于30℃、5％CO₂的条件下培养12h，液氮直接冷冻保存即可。

实施例5人精原干细胞冻存(对照)

将实施例1制备得到的人精原干细胞，培养于1640无菌培养基，于37℃、5％CO₂的条件下培养2天，收集细胞，在实施例2的对照1和对照2中培养，于30℃、5％CO₂的条件下培养12h，液氮直接冷冻保存即可。

实施例6冷冻细胞的复苏及活率检测

细胞冻存2周后进行复苏，每个Group小组复苏3支，从液氮取出冻存管直接放入37℃温水中，并不时摇动使其在短时间内尽快融化，融化后在720RPM的离心机中离心5min，弃上清液，每支管中加入1mL细胞培养液(1640无菌培养基)，计数并计活取平均值。具体的，细胞计数及细胞活率的测定方法为：1、胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释；2、染色：细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀(终浓度为0.04％)；3、计数：在3min内，分别计数活细胞和死细胞；4、镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。5、统计细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。测得的活率分布如表1所示：

表1各组活率结果

组数	活率(100％)
		冻存1	98.93
冻存2	97.86
		对照1	80.56
对照2	87.65

由表1所示的细胞活率实验结果可知：本发明提供的冻存液的加入明显提高了复苏细胞的活率。具有显著地效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 洛阳轩智生物科技有限公司

<120> 一种人精原干细胞的冻存液

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Ser Glu His Lys Val Gly Met Asn Tyr Arg Pro Val Cys Trp Asn Trp

1 5 10 15

Gly Pro Met Asp Asp Glu Gln Gln Leu Ile Trp

20 25

<210> 2

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Arg Leu Arg Val Ser Gly Pro Leu His Met Arg His Met Cys Ile Trp

1 5 10 15

Gln Ser Gln Met Val Thr Trp Ile Trp Arg Ile

20 25

Claims

1.一种人精原干细胞冻存液，其特征在于：由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的活性肽以及基础培养液组成，其中基础培养液的配置为：在1640无菌培养基中添加蔗糖1.0％(重量百分比)，右旋糖酐40O.5％(重量百分比)，谷胱甘肽O.2％(重量百分比)，谷氨酰胺O.6％(重量百分比)，海藻糖0.5％(重量百分比)，左旋谷氨酰胺0.1％(重量百分比)，甘油15％(V/V)，采用1640无菌培养基定容到1L即可；所述基础培养液中活性肽的添加量为0.3％。

2.一种人精原干细胞的冻存方法，包括以下步骤：分离并获得人精原干细胞，将干细胞培养于1640无菌培养基和活性肽中，于37℃、5％CO₂的条件下培养2-3天，随后将细胞转移到添加有活性肽的基础培养液中培养，于30℃、5％CO₂的条件下培养12h，随后于液氮直接冷冻保存即可；其中基础培养液组分如权利要求2中的基础培养液所示。

3.如权利要求2所示的方法，其中将干细胞培养于1640无菌培养基和活性肽中，于37℃、5％CO₂的条件下培养2天。

4.如权利要求2所示的方法，其中将干细胞培养于1640无菌培养基和活性肽中，于37℃、5％CO₂的条件下培养3天。