KR20180101596A - 연결된 관류 대 연속-유동식 교반-탱크 반응기 세포 배양 시스템 - Google Patents
연결된 관류 대 연속-유동식 교반-탱크 반응기 세포 배양 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
연결된 배양 및 생산 생물반응기 시스템에서의 단백질 생산 방법이 제공된다. 이러한 방법은 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 연결된 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)를 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 (a) 연속적 관류 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 세포를 배양하는 단계; 단계 (a)로부터 수득된 세포를 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 CSTR 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
Description
대상 기술은 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 연결된 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)를 포함하는 연결된 생물반응기 시스템을 이용하여 배양된 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 단백질 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 대상 기술은 케모스탯(chemostat) 또는 연속-유동식 교반-탱크 반응기(CSTR: continuous-flow stirred-tank reactor) 생산 생물반응기에 연결된 연속 관류 배양 생물반응기에 관한 것이다.
종래 관류 세포 배양 시스템은 대용적의 배지 소비, 피크(peak) 세포 밀도에의 도달까지의 긴 시간 및 최대 규모로 사용될 때 세포 보유 장치와의 복잡화(complication)와 같은 단점이 있다.
예를 들면, WO 2008091113에 개시된 하이브리드(hybrid) 세포 배양 시스템에서, 다중 CSTR 생물반응기는 각각 세포 보유 장치(예를 들면, 충진층(packed bed))를 사용하여 일련으로 연결된다. 참조문헌은 이상적인 시스템에서 일련의 마지막 생물반응기는 완전한 세포 보유를 사용하지만 초기 생물반응기는 일부 세포가 생물반응기 외부로 나가는 것을 허용함을 시사한다. WO 2015003012에 개시된 하이브리드 세포 배양 시스템에서, 단일 '너스(nurse)' 또는 N-1 생물반응기는 세포 보유 장치를 갖는 다중 N-단계 생산 생물반응기에 주기적으로 접종한다. WO 2015095809에 개시된 하이브리드 세포 배양 시스템에서, N-1 관류 생물반응기를 사용하여 유가식(fed-batch) 또는 관류 방식으로 작동하는 생산 생물반응기용 접종물(inoculum)을 제조한다. 그러나, 이러한 참조문헌의 모든 데이터와 예시는 N-1이 짧은 시간 동안 작동하여 유가식으로서 작동하는 생산 생물반응기를 접종하는데 사용되는 단일 접종물을 생산하는 관류 생물반응기임을 시사한다. 추가로, 이러한 출원의 저자는 어디에서도 생산 생물반응기가 하류 정제 작업에서 지속적으로 수거하고 세포를 보유하지 않는 케모스탯(또는 CSTR)으로서 작동할 수 있음을 시사하지 않는다.
세포 보유 시스템은 대규모(> 1,000L)로 사용하기에 작동 및 설계가 어렵다. 예를 들면, (현재 대규모로 사용되고 있는 많은 것들과 같이) 멤브레인(membrane)을 사용하는 거의 모든 세포 보유 장치는 결국 세포 잔해(debris)로 막힐 것이다. 이러한 플러깅(plugging)은 상기 세포가 보다 취약하고 형성되는 미립자가 종종 멤브레인의 기공(0.2 내지 5 미크론)과 크기가 유사하므로 낮은 세포 생존력(viability) 배양에서 발생할 가능성이 많다. 추가로, 멤브레인이 세포 잔해로 막힘에 따라 이들은 또한 한외여과 장치로서 효과적으로 기능하기 시작하여 고 분자량 제품 단백질을 쉽게 예측가능하거나 또는 재현가능한 방식으로 생물반응기 내에 유지한다. 이는 연속적인 관류 생물반응기에서는 세포-불포함 수거물에서 생물반응기로부터 목적하는 생성물이 연속적으로 제거되어 지속적 방식으로 하류 작업에 전달되게 하는 것이 유리하기 때문에 단점이다.
결과적으로, 종래의 연속 관류 세포 배양 시스템은 통상 2,000L 미만의 작업량을 갖고, 생산성이 가장 높은 조건(예를 들면, 높은 생세포 밀도 및 높은 관류 속도) 하에 작동되는 경우, 플러깅 및 생성물 보유(한외여과)로 인하여 멤브레인 기반 세포 보유 장치의 빈번한 교체를 요구한다. 추가로, 매우 대용적인 세포-불포함 수거물을 취급할 수 있는 세포 보유 장치는 상당히 복잡할 수 있고(예를 들면, 다수의 이동 부품) 고가이고, 이는 과도한 전단력을 통해 세포에 손상을 주어 고장을 일으키기 쉽다. 세포 보유 장치는 전형적으로 생물반응기 외부에 존재하므로, 대규모의 효과적인 세정 및 살균 또한 어려울 수 있다. 이들 인자는 높은 운영 비용, 생산성의 유의한 손실 및 목적하는 단백질 생산의 비효율을 초래할 수 있다. 따라서, 현재 종래의 관류 배양 시스템과 관련된 한계를 극복하는 대안의 세포 배양 방법 또는 시스템에 대한 필요성이 여전히 남아 있다.
대상 기술은 예를 들면, 하기 열거되는 각종 양상들 및 실시형태들에 따라 설명된다.
한 양상에서, 대상 기술은 (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적하는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 양상과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서, 상기 방법은 (d) 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 생산 생물반응기는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기이며; 상기 생산 생물반응기는 세포 보유 장치를 갖지 않고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:5이며; 단계 (b)에서의 상기 접종은 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출(cell bleed)에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지고; 단계 (a)는 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하고; 상기 제2 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고; 상기 생산 생물반응기는 3주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 4주 초과의 시간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 5주 초과의 시간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 수거 단계 (d)는 연속적이고; 상기 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포이고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 20일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 30일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 1일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖고; 상기 생산 생물반응기에는 희석 용액이 공급되고; 상기 희석 용액은 물 또는 염수이다.
다른 양상에서, 대상 기술은 (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 연결된 배양 프로세스에 관한 것이다. 이러한 양상과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서, 상기 연결된 배양 프로세스는 (d) 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 연속적 생산 생물반응기는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기이며; 상기 생산 생물반응기는 세포 보유 장치를 갖지 않고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:5이며; 단계 (b)에서의 상기 접종은 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지고; 단계 (a)는 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하고; 상기 제2 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고; 상기 생산 생물반응기는 3주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 4주 초과의 시간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 5주 초과의 시간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 수거 단계 (d)는 연속적이고; 상기 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포이고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 20일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 30일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 1일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖고; 상기 생산 생물반응기에는 희석 용액이 공급되고; 상기 희석 용액은 물 또는 염수이다.
다른 양상에서, 대상 기술은 상기 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하기 위한 배양 생물반응기(N-1 생물반응기); 및 상기 배양 생물반응기에 연결되어 있고 상기 배양 생물반응기로부터 세포를 접종물(inoculum)로서 수취하는 생산 생물반응기(N 생물반응기)를 포함하는, 연결된 배양 시스템으로서, 상기 생산 생물반응기는 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 작동하는, 연결된 배양 시스템에 관한 것이다. 이러한 양상과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서, 상기 시스템은 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하기 위한 하류 정제 시스템에 연결되어 있고; 상기 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 생산 생물반응기는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기이며; 상기 생산 생물반응기는 세포 보유 장치를 갖지 않고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:5이며; 상기 접종은 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지고; 상기 시스템은 제1 배양 생물반응기와 병렬로 작동하고 생산 생물반응기로 이동시키기 위한 접종물을 교대로 생산하는 제2 배양 생물반응기를 포함하고; 상기 제2 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기이고; 상기 생산 생물반응기는 3주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 4주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 5주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 수거는 연속적이고; 상기 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포이고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 20일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 30일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 1일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖고; 상기 생산 생물반응기에는 희석 용액이 공급되고; 상기 희석 용액은 물 또는 염수이다.
다른 양상에서, 대상 기술은 (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 목적하는 단백질에 관한 것이다. 이러한 양상과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서, 상기 방법은 (d) 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계를 추가로 포함하고; 상기 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 연속적 생산 생물반응기는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기이며; 상기 생산 생물반응기는 세포 보유 장치를 갖지 않고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:5이며; 단계 (b)에서의 상기 접종은 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것이고; 단계 (a)는 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하고; 상기 제2 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고; 상기 생산 생물반응기는 3주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 4주 초과의 시간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 5주 초과의 시간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 수거 단계 (d)는 연속적이고; 상기 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포이고; 상기 생산 생물반응기에는 희석 용액이 공급되고; 상기 희석 용액은 물 또는 염수이다.
대상 기술의 추가의 이점은 하기 도면 및 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 당해 분야 숙련가들에게 쉽게 명백해질 것이다. 도면 및 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 제한적인 것으로 간주되지 않아야 한다.
청구된 방법들, 기구들 및/또는 시스템들의 이들 및 기타 특성들, 양상들 및 이점들은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 첨부된 도면을 참조하여 읽는 경우 보다 잘 이해된다:
도 1은 본 출원의 실험 섹션에서 상세히 설명되는 한 실시형태에 따른 생물반응기 구성을 도해하는 예시적 개략도이다. 이러한 구성에서, 세포 보유와 함께 관류를 사용하는 N-1 생물반응기는 연속-유동식 교반-탱크 반응기(CSTR) 또는 케모스탯으로서 작동하는 제2 생물반응기에 세포를 연속적으로 공급한다. 상기 CSTR은 또한 농축된 영양 공급물의 추가적인 스트림(stream)도 수취할 것이다. 상기 CSTR은 세포 보유 시스템을 갖지 않고 지속적으로 수거할 것이다. 벤치(bench) 규모로 수행된 실험에서, 세포 보유 장치는 표면적이 850㎠인 0.2 미크론의 미세-여과 중공 카트리지(micro-filtration hollow cartridge)(General Electric CFP-2-E-4X2MA)로 구성되었다. 세포는 6.4mm ID 및 12.7mm OD 튜빙(tubing)을 사용하는 왓슨-말로우(Watson-Marlow) 연동 펌프에 의해 중공 섬유 카트리지의 내강(lumen) 측을 통해 약 120mL/분으로 순환되었다.
도 2a는 본 출원의 실험 섹션에 기술되는 바와 같은 트립판 블루 배제에 의한 측정시 생세포 밀도를 보여주는 플롯(plot)이다. 백색 사각형은 N-1 관류 반응기에서의 세포 밀도를 나타낸다. 흑색 사각형은 CSTR 또는 생산 생물반응기에서의 세포 밀도를 나타낸다. 점선의 수직선은 표 2에 나타낸 바와 같은 N-1 관류 반응기로 흐르는 약간 상이한 관류 배지 조성물에 대한 단계 변화를 나타낸다.
도 2b는 트립판 블루 배제에 의한 측정시 생세포 백분율을 보여주는 플롯이다. 백색 사각형은 N-1 관류 반응기에서의 세포 생존력을 나타낸다. 흑색 사각형은 CSTR 또는 생산 생물반응기에서의 세포 생존력을 나타낸다.
도 3은 N-1 생물반응기의 관류 속도 및 세포 방출 속도, 및 생산(CSTR) 생물반응기의 희석 속도를 도시한다. 관류 속도(백색 사각형)는 1일 반응기 용적(RV)에 열거되고 좌측 y-축에 상응한다. 관류 속도는 1일당 N-1 관류 생물반응기로 유동된 배지의 용적이다. 세포 방출 속도(흑색 사각형)는 매일 N-1 관류 생물반응기로부터 (연속적으로) 제거된 세포를 함유하는 배양물의 용적이고 우측 y-축에 상응한다. 희석 속도(흑색 삼각형)는 매일 생산(CSTR) 생물반응기로부터 (연속적으로) 제거되는 세포(CSTR을 떠나는 유일한 스트림)를 함유하는 용적의 분획이고 우측 y-축에 상응한다.
도 4는 N-1(백색 사각형) 및 생산(CSTR, 흑색 사각형) 생물반응기에서의 잔여 글루코스 농도를 보여주는 플롯이다.
도 5는 N-1(백색 사각형) 및 생산(CSTR, 흑색 사각형) 생물반응기에서의 락테이트 농도를 보여주는 플롯이다.
도 6은 N-1 생물반응기의 벌크 유체(bulk fluid)(흑색 사각형)에서의, N-1 생물반응기 시스템을 떠나는 투과액(백색 사각형)에서의, 그리고 생산 생물반응기를 연속적으로 떠나는 벌크 유체(CSTR, 흑색 삼각형)에서의 항체 또는 생성물 농도를 보여주는 플롯이다.
도 7은 CSTR 생산 생물반응기의 용적 생산성(흑색 삼각형)을 1일 반응기 용적당 생산된 생성물 그램으로 보여주는 플롯이다.
도 8은 시간의 함수로서의 2개의 N-1 관류 생물반응기의 세포 밀도를 보여주는 플롯이다. 제1 N-1 관류 반응기에 대한 표적 정상-상태(steady-state) 생세포 밀도는 약 40 x 106 세포/mL였고, 제2 N-1 관류 반응기의 경우는 약 80 x 106 세포/mL였다. 실시예 2에 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 이러한 구성에서 이들 N-1 관류 생물반응기의 각각은 독립적으로 별개의 CSTR 생산 생물반응기로 공급한다.
도 9는 시간의 함수로서의 2개의 N-1 관류 생물반응기의 세포 생존력을 보여주는 플롯이다.
도 10은 2개의 연속적 관류 생물반응기(백색 기호)에 대한 그리고 관류 생물반응기들 중 하나에 각각 연결되어 있는 CSTR로서 작동하는 2개의 생산 생물반응기(흑색 기호)에 대한 시간의 함수로서의 잔여 글루코스를 보여주는 플롯이다.
도 11은 N-1 연속적 관류 생물반응기(백색 기호)에 대한 그리고 CSTR로서 작동하는 생산 생물반응기(흑색 기호)에 대한 시간의 함수로서의 락테이트 농도를 보여주는 플롯이다.
도 12는 N-1 연속적 관류 생물반응기의 관류 속도를 보여주는 플롯이고 - 관류 속도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 HIPCOP 기술을 이용하여 세포에 의해 제어된다.
도 13은 2개의 N-1 연속적 관류 생물반응기의 세포 방출 속도를 보여주는 플롯이다.
도 14는 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기에서의 시간의 함수로서의 생세포 밀도를 보여주는 플롯이다. 희석 속도가 일정하게 고정된 시간 간격이 도면에 나타내어져 있다. 또한, N-1 관류 생물반응기 대 CSTR의 모의 용적비도 도면에 나타내어져 있다.
도 15는 시간의 함수로서의 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기의 각각의 희석 속도를 보여주는 플롯이다.
도 16은 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기에서의 시간의 함수로서의 트립판 블루 염료 배제에 의해 측정시 세포 생존력을 보여주는 플롯이다.
도 17은 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기에 대한 시간의 함수로서의 생성물 농도 또는 역가를 보여주는 플롯이다. 희석 속도가 고정된 시간 간격이 도면에 나타내어져 있다.
도 18은 N-1 연속적 관류 생물반응기(백색 기호)에 대한 그리고 CSTR로서 작동하는 생산 생물반응기(흑색 기호)에 대한 시간의 함수로서의 삼투압 몰농도(osmolality)를 보여주는 플롯이다. 관류 배지가 나트륨 락테이트의 DL 형태를 함유하도록 변화된 시점이 도면에 나타내어져 있다.
도 19는 독립적으로 작동하는 것으로 간주한 N-1 연속적 관류 생물반응기의 순간적 용적 생산성을 보여주는 플롯이다. 계산된 값은 생성물이 세포 보유 시스템을 떠나는 세포-불포함 투과물의 양쪽 세포 방출로부터 회수됨을 추정한다.
도 20는 N-1 관류 반응기에서의 그리고 세포 보유 장치를 떠나는 세포-불포함 투과물에서의 생성물(항체)의 농도를 보여주는 플롯이다.
도 21은 생산 CSTR 희석 속도의 함수로서 도표화된, CSTR 시스템에 대해 연결된 N-1 연속 관류 생물반응기의 정상-상태 용적 생산성을 보여주는 플롯이다. N-1 연속 관류 생물반응기 대 생산 CSTR의 용적비는 몇몇의 조건에 대해 표시된다. 구체적으로 표시되지 않은 모든 점들은 1:5 용적비를 사용하였다.
도 1은 본 출원의 실험 섹션에서 상세히 설명되는 한 실시형태에 따른 생물반응기 구성을 도해하는 예시적 개략도이다. 이러한 구성에서, 세포 보유와 함께 관류를 사용하는 N-1 생물반응기는 연속-유동식 교반-탱크 반응기(CSTR) 또는 케모스탯으로서 작동하는 제2 생물반응기에 세포를 연속적으로 공급한다. 상기 CSTR은 또한 농축된 영양 공급물의 추가적인 스트림(stream)도 수취할 것이다. 상기 CSTR은 세포 보유 시스템을 갖지 않고 지속적으로 수거할 것이다. 벤치(bench) 규모로 수행된 실험에서, 세포 보유 장치는 표면적이 850㎠인 0.2 미크론의 미세-여과 중공 카트리지(micro-filtration hollow cartridge)(General Electric CFP-2-E-4X2MA)로 구성되었다. 세포는 6.4mm ID 및 12.7mm OD 튜빙(tubing)을 사용하는 왓슨-말로우(Watson-Marlow) 연동 펌프에 의해 중공 섬유 카트리지의 내강(lumen) 측을 통해 약 120mL/분으로 순환되었다.
도 2a는 본 출원의 실험 섹션에 기술되는 바와 같은 트립판 블루 배제에 의한 측정시 생세포 밀도를 보여주는 플롯(plot)이다. 백색 사각형은 N-1 관류 반응기에서의 세포 밀도를 나타낸다. 흑색 사각형은 CSTR 또는 생산 생물반응기에서의 세포 밀도를 나타낸다. 점선의 수직선은 표 2에 나타낸 바와 같은 N-1 관류 반응기로 흐르는 약간 상이한 관류 배지 조성물에 대한 단계 변화를 나타낸다.
도 2b는 트립판 블루 배제에 의한 측정시 생세포 백분율을 보여주는 플롯이다. 백색 사각형은 N-1 관류 반응기에서의 세포 생존력을 나타낸다. 흑색 사각형은 CSTR 또는 생산 생물반응기에서의 세포 생존력을 나타낸다.
도 3은 N-1 생물반응기의 관류 속도 및 세포 방출 속도, 및 생산(CSTR) 생물반응기의 희석 속도를 도시한다. 관류 속도(백색 사각형)는 1일 반응기 용적(RV)에 열거되고 좌측 y-축에 상응한다. 관류 속도는 1일당 N-1 관류 생물반응기로 유동된 배지의 용적이다. 세포 방출 속도(흑색 사각형)는 매일 N-1 관류 생물반응기로부터 (연속적으로) 제거된 세포를 함유하는 배양물의 용적이고 우측 y-축에 상응한다. 희석 속도(흑색 삼각형)는 매일 생산(CSTR) 생물반응기로부터 (연속적으로) 제거되는 세포(CSTR을 떠나는 유일한 스트림)를 함유하는 용적의 분획이고 우측 y-축에 상응한다.
도 4는 N-1(백색 사각형) 및 생산(CSTR, 흑색 사각형) 생물반응기에서의 잔여 글루코스 농도를 보여주는 플롯이다.
도 5는 N-1(백색 사각형) 및 생산(CSTR, 흑색 사각형) 생물반응기에서의 락테이트 농도를 보여주는 플롯이다.
도 6은 N-1 생물반응기의 벌크 유체(bulk fluid)(흑색 사각형)에서의, N-1 생물반응기 시스템을 떠나는 투과액(백색 사각형)에서의, 그리고 생산 생물반응기를 연속적으로 떠나는 벌크 유체(CSTR, 흑색 삼각형)에서의 항체 또는 생성물 농도를 보여주는 플롯이다.
도 7은 CSTR 생산 생물반응기의 용적 생산성(흑색 삼각형)을 1일 반응기 용적당 생산된 생성물 그램으로 보여주는 플롯이다.
도 8은 시간의 함수로서의 2개의 N-1 관류 생물반응기의 세포 밀도를 보여주는 플롯이다. 제1 N-1 관류 반응기에 대한 표적 정상-상태(steady-state) 생세포 밀도는 약 40 x 106 세포/mL였고, 제2 N-1 관류 반응기의 경우는 약 80 x 106 세포/mL였다. 실시예 2에 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 이러한 구성에서 이들 N-1 관류 생물반응기의 각각은 독립적으로 별개의 CSTR 생산 생물반응기로 공급한다.
도 9는 시간의 함수로서의 2개의 N-1 관류 생물반응기의 세포 생존력을 보여주는 플롯이다.
도 10은 2개의 연속적 관류 생물반응기(백색 기호)에 대한 그리고 관류 생물반응기들 중 하나에 각각 연결되어 있는 CSTR로서 작동하는 2개의 생산 생물반응기(흑색 기호)에 대한 시간의 함수로서의 잔여 글루코스를 보여주는 플롯이다.
도 11은 N-1 연속적 관류 생물반응기(백색 기호)에 대한 그리고 CSTR로서 작동하는 생산 생물반응기(흑색 기호)에 대한 시간의 함수로서의 락테이트 농도를 보여주는 플롯이다.
도 12는 N-1 연속적 관류 생물반응기의 관류 속도를 보여주는 플롯이고 - 관류 속도는 실시예 2에 기술된 바와 같은 HIPCOP 기술을 이용하여 세포에 의해 제어된다.
도 13은 2개의 N-1 연속적 관류 생물반응기의 세포 방출 속도를 보여주는 플롯이다.
도 14는 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기에서의 시간의 함수로서의 생세포 밀도를 보여주는 플롯이다. 희석 속도가 일정하게 고정된 시간 간격이 도면에 나타내어져 있다. 또한, N-1 관류 생물반응기 대 CSTR의 모의 용적비도 도면에 나타내어져 있다.
도 15는 시간의 함수로서의 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기의 각각의 희석 속도를 보여주는 플롯이다.
도 16은 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기에서의 시간의 함수로서의 트립판 블루 염료 배제에 의해 측정시 세포 생존력을 보여주는 플롯이다.
도 17은 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 생산 생물반응기에 대한 시간의 함수로서의 생성물 농도 또는 역가를 보여주는 플롯이다. 희석 속도가 고정된 시간 간격이 도면에 나타내어져 있다.
도 18은 N-1 연속적 관류 생물반응기(백색 기호)에 대한 그리고 CSTR로서 작동하는 생산 생물반응기(흑색 기호)에 대한 시간의 함수로서의 삼투압 몰농도(osmolality)를 보여주는 플롯이다. 관류 배지가 나트륨 락테이트의 DL 형태를 함유하도록 변화된 시점이 도면에 나타내어져 있다.
도 19는 독립적으로 작동하는 것으로 간주한 N-1 연속적 관류 생물반응기의 순간적 용적 생산성을 보여주는 플롯이다. 계산된 값은 생성물이 세포 보유 시스템을 떠나는 세포-불포함 투과물의 양쪽 세포 방출로부터 회수됨을 추정한다.
도 20는 N-1 관류 반응기에서의 그리고 세포 보유 장치를 떠나는 세포-불포함 투과물에서의 생성물(항체)의 농도를 보여주는 플롯이다.
도 21은 생산 CSTR 희석 속도의 함수로서 도표화된, CSTR 시스템에 대해 연결된 N-1 연속 관류 생물반응기의 정상-상태 용적 생산성을 보여주는 플롯이다. N-1 연속 관류 생물반응기 대 생산 CSTR의 용적비는 몇몇의 조건에 대해 표시된다. 구체적으로 표시되지 않은 모든 점들은 1:5 용적비를 사용하였다.
하기의 상세한 설명에서, 대상 기술의 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 대상 기술은 이들 특정 세부사항들 중 일부의 부재 하에 실행될 수 있음은 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다. 다른 경우, 익히 공지되어 있는 구조 및 기술은 대상 기술을 모호하게 하지 않도록 상세하게 설명되어 있지 않다.
본 발명의 대상 기술의 이해를 용이하게 하기 위해서, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다:
정의:
본원에서 사용된 문법적인 관사 "하나(one)", "한(a, an)" 및 "상기(the)"는 달리 명시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 관사는 본원에서 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 해당 관사의 문법적 대상을 나타내는 것으로 사용된다. 예로서, "구성성분"은 하나 이상의 구성성분을 의미하고, 따라서 아마도 하나 초과의 구성성분이 고려되고 기술된 실시형태들의 실행에 사용되거나 이용될 수 있다.
용어 "약"은 일반적으로 소정 신뢰 수준(통상적으로 68% C.I.의 경우 ± 1 σ) 내에 참 값을 포함하는 값의 범위로서 종종 언급되는 측정값의 근소한 오차를 나타낸다. 용어 "약"은 정수 및 정수의 ± 20%의 값으로서 설명될 수도 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "생산 생물반응기" 또는 "N 생물반응기" 또는 "CSTR 생물반응기" 또는 "CSTR 생산 생물반응기"는 세포 보유 시스템 또는 장치를 이용하지 않는 생물반응기(예를 들면, 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR))를 말한다. 생산 생물반응기는 하나 이상의 배양 생물반응기(들)에 대해 하류에 연결되고 배양 생물반응기(들)로부터 접종물을 수취한다. 생산 생물반응기는 균일하게 혼합되고, 유출(out-flow) 유체와 등가인 유입(in-flow) 유체를 가지므로 거의 일정한 용적을 유지한다. 이러한 생산 생물반응기는 충분히 긴 시간 동안 작동하는 경우 '화학적으로 정적(chemically static)' 또는 '정상-상태' 환경을 종종 달성할 것이지만, 반드시 달성하는 것은 아니고, 이는 세포 밀도 및 배양의 다른 양상들(예를 들면, 영양분의 농도 등)이 안정한(즉, 정상 또는 정적) 상태에 도달할 것임을 의미하고, 따라서 또한 일반적으로 '케모스탯'으로서도 나타낸다. 생산 생물반응기에의 유입 유체 및/또는 생산 생물반응기로부터의 유출 유체는 독립적으로 연속적 또는 반-연속적일 수 있다. 이러한 생산 생물반응기는 3, 4, 5 또는 6주와 동일하거나 이를 초과하는 기간 동안 연속적으로 작동한다.
한 실시형태에서, 대상 기술의 CSTR 생산 생물반응기는 배양된 세포가 유전적으로 안정한 상태를 유지하는 한 또는 무한정 계속해서 작동할 수 있다. 다른 실시형태에서, 대상 기술의 CSTR 생산 생물반응기는 생산 생물반응기에 신선한(즉, 유전적으로 안정한) 접종물을 교대로 공급하는 적어도 2개의 배양 생물반응기에 연결되어 있고, 이와 같이 생산 생물반응기는 1, 2, 3, 4, 5, 6개월과 동등하거나 또는 이를 초과하는 긴 시간 동안, 또는 이에 공급되는 배양된 세포가 유전적으로 안정하게 유지되는 한 무한정의 기간 동안 계속해서 운행된다. 세포 보유 장치의 부재 하에, CSTR 생산 생물반응기로부터의 유출 유체는 세포의 혼합물, 세포 잔해 및 생성물을 포함한다. 한 실시형태에서, 이러한 유출 유체는 다음 단위 조작(예를 들면, 단백질 A 컬럼)에 이동되기 전에 세포 분리 장치(예를 들면, 인-라인 원심분리(in-line centrifuge))로 보내어진다. 유출 유체의 나머지로부터 이러한 방식으로 분리된 세포 및 세포 잔해는 폐기되어 생산 생물반응기로 되돌아가지 않을 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "세포 보유 시스템" 또는 "세포 보유 장치"는 생물반응기를 떠나는 유체에서의 세포 밀도가 생물반응기 내의 유체에서의 세포 밀도보다 더 낮도록 생물 반응기 내의 생세포를 선택적으로 보유하는 수단을 말한다. 이러한 의미에서, 세포 보유 시스템 또는 장치는 상기 언급된 세포 분리 장치와 상이하다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "배양 생물반응기" 또는 "N-1 생물반응기" 또는 "N-1 관류 생물반응기"는 생산 생물반응기를 접종하기 위해 사용될 세포를 배양하기 위해 사용되는 관류 배양 또는 관류 생물반응기(예를 들면, 연속적 관류 배양 생물반응기)를 말한다. 이러한 배양 생물반응기는 세포 보유 시스템을 갖는다. 산업계에서 사용되는 다수의 상이한 형태의 세포 보유 시스템이 존재한다. 이들 세포 보유 시스템 중 일부는 생물반응기 시스템을 떠나는 액체로부터 생세포의 100%를 제거하지만, 다수의 다른 시스템들은 생물반응기 시스템을 떠나는 액체로부터 세포의 일부 가변적인 분획만을 제거할 수 있다. 배양 생물반응기로의 액체 이동 및 배양 생물반응기로부터의 액체 이동은 연속적이거나 반-연속적일 수 있다. 특히, 세포 방출 또는 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 이동은 연속적이거나 반-연속적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 생물반응기로의 그리고/또는 생물반응기로부터의 액체 이동과 관련하여 용어 "반-연속적"은 '주기적'을 의미하거나, 액체(예를 들면, 배지 단독 그리고/또는 세포, 세포 방출 포함)는 긴 기간마다 1회 생물반응기에 첨가되고/되거나 생물반응기로부터 제거되는 시나리오(scenario)를 말한다. 예를 들면, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 45 또는 60분마다 1회, 또는 1시간마다 1회, 또는 2 내지 3시간마다 1회, 1분 내지 24시간의 긴 시간마다 1회, 액체의 버스트(burst)가 수초(예를 들면, 1초, 2초, 5초 10초, 20초 또는 60초) 내지 수분(예를 들면, 2분, 5분, 10분, 25분, 50분, 120분 또는 240분)의 연장된 기간 동안 생물반응기로부터 그리고/또는 생물반응기로 이동된다. 이러한 문맥에서, 용어 "연속적"은 일정하거나 비-주기적인 액체 이동을 말한다. 한 실시형태에서, 연속적 또는 반-연속적 방식으로의 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 세포 방출/이동 속도는 배양 생물반응기에서의 세포의 성장 속도보다 더 작다. 다른 실시형태에서, 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 세포 방출/이동 속도는 약 0.1 반응기 용적/일(RV/일) 내지 약 1.3RV/일이다. 다른 실시형태에서, 연속적 또는 반-연속적 방식으로의 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 세포 방출/이동 속도는 1.3RV/일 미만이거나, 1.0RV/일 미만이거나, 0.8RV/일이거나, 0.6RV/일 미만이거나, 0.4RV/일 미만이거나, 0.2RV/일 내지 약 0.1RV/일 미만이거나, 또는 약 0.1 내지 약 1.3RV/일의 범위 내에서 다양하다.
세포 보유 시스템을 이용한 포유동물 세포의 관류 배양은 회분(batch), 유가식 또는 케모스탯/CSTR 배양에 비하여 유의한 생산성 이점을 제공할 수 있다. 세포는 생물반응기 시스템에 보유되기 때문에 이들은 큰 용적의 배지로 관류될 수 있고 높은 희석 속도로 CSTR에서 발생할 수 있는 세척제거(washout)에 대한 걱정 없이 훨씬 더 높은 세포 밀도에 도달할 수 있다. 추가로, 연속 관류 생물반응기는 연속 하류 정제 트레인(train)과 연결되어 있는 경우, 정제 트레인의 크기는 현저하게 감소될 수 있고, 이는 홀드 단계(hold stage)(및 필요한 탱크)를 제거하고 프로세스-내 풀(in-process pool)의 샘플링 및 분석을 감소시킴으로써 전체 작업을 단순화할 것이다. 그러나, 포유동물 세포의 관류 배양은 또한 특히 대규모(>1,000L)로 실행하는 경우 다수의 불이익이 있다.
전형적으로 대부분의 관류 배양은 긴 시간(>3주) 동안 작동된다. 이는 세포주가 특히 유전적으로 안정하여 세포가 계속해서 목적하는 단백질을 생산할 것, 그리고 후생적인 변화의 속도가 충분히 느릴 것을 요구한다. 이들 장기-지속기간 관류 배양은 배양물의 유전적 프로파일이 목적하는 단백질의 생산성 또는 제품 품질(사양(specification))에 부정적인 영향을 미치기에 충분히 벗어나지 않는 한 배양이 운행 가능한 것으로 간주될 수 있다는 점에서 '지속가능한' 관류 배양으로서 정의될 수 있다. 이러한 지속가능한 관류 배양에서, 높은 세포 생존력을 유지할 필요가 있고, 이는 전형적으로 세포가 계속해서 0이 아닌 성장 속도를 유지하여 아폽토시스(apoptosis) 또는 전단 또는 산화적 또는 기타 스트레스로부터 사멸되는 세포를 보충하기 위해 계속해서 분열하는 것을 필요로 한다. 대부분의 경우, 일부 세포 성장을 유지하기 위해서 그리고 배양물로부터 일부 비-생존가능한 생물체량(biomass)을 연속적으로 제거하기 위해서 유한 세포 방출 속도(세포를 함유하는 전체 배양 브로스(broth)의 제거)가 요구된다. 이러한 '세포 방출 속도'는 통상적으로 1일 제거된 배양 용적의 분획의 측면에서 또는 상호 일들의 측면에서 나타내어진다. 일반적으로 세포 방출 속도는 0.05 내지 0.5/일 범위 내이고, 보다 높은 속도가 일반적으로 보다 높은 세포 생존력, 보다 높은 세포 성장 속도 및 보다 지속가능한 관류 시스템에 대한 조건을 생성하지만, 동시에 보다 낮은 세포 밀도 및 일반적으로 보다 낮은 용적 생산성 관류 배양을 조성한다.
추가로, 세포주에 따라 CHO(Chinese hamster ovary: 차이니즈 햄스터 난소) 세포 배양은 종종 세포의 성장 속도가 낮을 경우 더 높은 특이적 생산성 속도(specific rate of productivity)(시간당 세포당 생산된 단백질 질량)를 가질 것이다. 이는 성장 속도가 높을 경우 목적하는 단백질을 생산하는 것과는 대조적으로 지속적인 세포 분열에 더 많은 공급원을 충당하는 세포로 인한 것일 수 있다. 유가식 배양은 대규모 생산 CHO 세포 배양에 사용되는 가장 일반적인 작동 방식들 중 하나이고, 전형적으로 제품의 대부분이 생산되는 정체 페이즈(stationary phase)에서 며칠 뒤에 짧은 기간의 세포 성장을 가질 것이다. 배양물의 페이즈가 분리되고 각각의 페이즈에 대한 조건이 최적화되 배양 시스템에 대한 이점이 존재한다는 결론이다; 높은 세포 밀도를 신속하게 수득하기 위한 높은 세포 성장 속도를 갖는 한 페이즈; 및 거의 0의 세포 성장 속도를 갖지만 세포 특이적 생산성의 수준이 보다 높은 별개의 페이즈.
연속적 관류 시스템은 세포 보유 시스템이 항상 대규모로 양호하게 수행되는 것은 아니기 때문에 대규모(>1,000L)로 실행하기 어려울 수 있다. 추가로, (현재 대규모로 사용되고 있는 많은 것들과 같이) 멤브레인을 사용하는 거의 모든 세포 보유 장치는 결국 세포 잔해로 막힐 것이다. 이러한 플러깅은 상기 세포가 보다 취약하고 형성되는 미립자가 종종 멤브레인의 기공(0.2 미크론)과 크기가 유사하므로 낮은 세포 생존력 배양에서 발생할 가능성이 많다. 따라서, 관류가 수행되는 혈관의 크기를 최소화하고, 멤브레인 파울링(fouling)의 문제점을 최소화하기 위해 세포 생존력을 높게 유지하는 것이 유리하다.
상기 언급된 바와 같이, 세포 미립자는 장기간 관류 배양에서 미세-여과 멤브레인을 이용하는 멤브레인-기반 세포 보유 시스템을 서서히 막을 수 있다. 또한, 세포가 용해되고 숙주-세포 단백질과 목적하는 생성물이 상호작용하여 보다 높은 분자량 물질을 형성할 수도 있다. 이들 물질은 또한 겔층 형성 또는 생성물 체별(sieving)로서 알려져 있는 현상에 기여할 수 있다. 이들 조건 하에서, 미세-여과 멤브레인을 이용하는 세포 보유 장치는 한외-여과 멤브레인으로서 작용하기 시작할 수 있고, 생물반응기 시스템 내에서 고분자량 단백질을 선택적으로 보유할 수 있다. 세포 배양에서 생산되는 가장 일반적인 단백질들 중 하나인 면역글로불린 분자는 상대적으로 높은 분자량(약 150,000Da 이상)을 가지므로, 대규모 관류 시스템을 이용한 경우 생성물 체별이 주요 문제로서 대두되었다. 연속적 관류 시스템은 종종 연속적 하류 정제 시스템에 연결되어 있으므로, 목적하는 단백질이 생물반응기에서 흘러 나올 필요가 있고, 해당 단백질이 이상적으로 일정한 양 및 품질을 가질 필요가 있다. 목적하는 단백질 보유의 최소화는 하류 시스템의 크기를 최소화하는데 특히 중요하고, 목적하는 단백질이 불안정하고 생물반응기 내부의 조건에의 과도한 노출에 의해 열화될 가능성이 있는 경우 결정적이다.
상기 언급된 다수의 이유로, 도 1에 나타낸 바와 같이 그리고 하기 방식으로 함께 연결된 2개의 생물반응기를 연속적으로 작동시키는데 유의한 이점이 존재한다. 제1 생물반응기는 높은 세포 밀도를 허용하는 높은 관류 속도를 이용하여 연속적 관류 배양으로서 작동한다. 이러한 반응기에서는, 높은 세포 성장 속도를 유지하고 또한 따라서 높은 세포 생존력을 유지할 것인 높은 세포 방출 속도가 또한 사용될 것이다. 생산 생물반응기인 제2 생물반응기는 유리하게는 제1 생물반응기의 용적의 4 내지 5배(N-1 및 생산 생물반응기에 대한 대규모 설비에서 사용되는 전형적인 용적비)일 수 있고, 대상 기술의 바람직한 방식에 따르면 세포 보유 시스템을 갖지 않는 케모스탯(또는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기[CSTR]) 반응기로서 작동할 것이다. 용어 CSTR 또는 케모스탯은, 대부분의 경우에 상기 CSTR이 대부분 또는 모든 세포 배양 파라미터가 거의 일정한 값에 도달할 것인 정상-상태 또는 '화학적으로 정적인' 조건에 신속하게 도달할 것이므로 이러한 문서에 걸쳐 생산 생물반응기를 나타내는 것으로 상호교환적으로 사용될 것이다. 한 실시형태에서, N-1 연속적 관류 배양 생물반응기 대 CSTR 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이다. 다른 실시형태에서, N-1 연속적 관류 배양 생물반응기 대 CSTR 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이다. 다른 실시형태에서, N-1 연속적 관류 배양 생물반응기 대 CSTR 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:10이다. 다른 실시형태에서, N-1 연속적 관류 배양 생물반응기 대 CSTR 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:4이다.
제1 양상에서, 대상 기술은 (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적하는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
제2 양상에서, 대상 기술은 (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 연결된 배양 프로세스에 관한 것이다.
제3 양상에서, 대상 기술은 상기 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하기 위한 배양 생물반응기(N-1 생물반응기); 및 상기 배양 생물반응기에 연결되어 있고 상기 배양 생물반응기로부터 세포를 접종물(inoculum)로서 수취하는 생산 생물반응기(N 생물반응기)를 포함하는, 연결된 배양 시스템으로서, 상기 생산 생물반응기는 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 작동하는, 연결된 배양 시스템에 관한 것이다.
제4 양상에서, 대상 기술은 (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계; (b) 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및 (c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된 목적하는 단백질에 관한 것이다.
상기 양상들 중 임의의 양상에 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있는 하나 이상의 실시형태들에서, 상기 기술된 방법, 프로세스 또는 시스템은 상기 생산 생물반응기로부터 목적하는 단백질을 수거하는 단계 (d)를 추가로 포함하고; 상기 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고 상기 생산 생물반응기는 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기이며; 상기 생산 생물반응기는 세포 보유 장치를 갖지 않고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이고; 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비는 약 1:4이고; 단계 (b)에서의 접종은 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것이고; 상기 세포 이동은 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지고; 단계 (a)는 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하고; 상기 제2 배양 생물반응기는 연속적 관류 배양 생물반응기이고; 상기 생산 생물반응기는 3주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 4주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 5주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 상기 생산 생물반응기는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하고; 수거 단계 (d)는 연속적이고; 상기 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포, 또는 이들로부터 유전적으로 유도된 임의의 세포, 예를 들면 대사 조건 및/또는 글루타민 선택과 같은 선택 시스템 하의 유도체이고, 이러한 유전적으로 유도된 세포 및/또는 대사 조건 및/또는 선택 시스템은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 원리로 이루어지며; 상기 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일 1리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 20일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 적어도 30일의 기간 동안 1일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖고; 상기 생산 생물반응기는 1일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖는다.
본 발명에 대해 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비-제한적 예는 표 1에 요약된다.
상기 생산 세포는 세포가 증식할 수 있도록 하는 조건 하에서 우선적으로 배양된다. 또한, 상기 생산 세포는 원하는 유전자(들) 및/또는 목적하는 단백질의 발현에 유리한 조건 하에서 우선적으로 배양된다. 목적하는 단백질은 세포 및/또는 세포 배양 상청액으로부터 단리된다. 바람직하게는 목적하는 단백질은 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수되거나, 분비 신호없이 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
N-1 생물반응기로부터의 배양물은 연속적이고 고정된 유속(flowrate)으로 생산 생물반응기에 진입할 것이고, 이는 N-1 생물반응기의 세포 방출 속도와 동등할 것이다. 추가로, 생산 생물반응기는 해당 생물반응기에서의 세포가 계속해서 대사하고 생성물을 생산하며 잠재적으로 소정의 제한된 세포 분열을 경험하므로 영양 배지를 연속적으로 공급받게 될 것이다. 두 생물반응기의 작업량은 일정하게 유지될 것이므로 생산 생물반응기의 유효한 희석 속도는 N-1 연속적 세포 방출 및 영양 배지의 연속적 공급의 흐름 및 생산 반응기에 직접 부가된 임의의 pH-제어 적정제(titrant)에 의해 결정될 수 있다.
이러한 생물반응기 시스템은 현재 연속적 관류 생물반응기의 다수의 과제를 완화시킬 수도 있다. 관류 생물반응기 및 이의 관련 세포 보유 시스템은 이들이 생산 생물반응기의 대략 1/5 규모로 작동할 것이므로 작동하는 것이 훨씬 더 간단해질 가능성이 있을 것이다. 세포 보유 장치에서 겔-층/생성물 체별이 발생하면, N-1 생물반응기에서 생성된 목적하는 단백질이 생산 생물 반응기로 흐를 것이고, 결과적으로 도 1에 나타내는 바와 같이 세포-불포함 투과물로 배액(drain)되기보다는 오히려 하류의 정제 프로세스로 시스템으로 흐를 것이므로 이는 단지 시스템의 전반적인 생산성을 증가시킬 것이다.
세포주가 장기간 작동에 유전적으로 충분히 안정하지 않은 상황에서, 동결된 바이알로부터 확장된 신선한 세포의 접종물로 주기적으로 시동할 수 있는 제2 N-1 생물반응기가 사용될 것이고, 일단 생물반응기가 적절한 세포 밀도까지 도달하면 제2 N-1 생물반응기는 제1 N-1 생물반응기를 대신할 수 있고, 한편 제1 N-1 생물반응기는 세척 및 재-살균을 위해 꺼낸다. 상기 N-1 배양 생물반응기(들)에서의 세포 밀도는 이들에 연결되어 있는 생산 생물반응기의 크기에 따라 다를 수 있다. 몇몇의 실시형태들에서, 상기 배양 생물반응기에서의 세포 밀도는 약 10 x 106/리터 또는 그 이상이거나, 또는 약 20 x 106/리터 또는 그 이상이거나, 또는 약 40 x 106/리터 또는 그 이상이거나, 또는 10 x 106/리터 내지 200 x 106/리터이거나, 또는 40 x 106/리터 내지 120 x 106/리터이거나, 또는 이들 범위들 중 임의의 범위 내의 특정 밀도이다. 상기 생산 생물반응기에서의 세포 분열이 매우 낮은 경향이 있으므로, 이는 유전적으로 보다 젊은 세포 집단을 갖는 단백질을 생산하는 세포의 반-연속적 재생을 가능하게 할 수 있다. 이어서, 상기 생산 생물반응기는 최소한의 방해 및 높은 세포 밀도 및 높은 생산성으로 연속적으로 작동하여 한 번에 수개월 동안 일관된 품질 파라미터로 하류 정제 작업에의 공급 스트림을 생산할 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 대상 기술의 연결된 세포 배양 시스템은 N-1 연속적 관류 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)를 포함하고, 여기서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포는 이들이 세포 보유 장치가 없는 CSTR 생산 생물반응기에 이동되기 전에 배양된다. 다른 실시형태에서, 상기 대상 기술의 연결된 세포 배양 시스템은 CSTR 생산 생물반응기로 이동시키기 위해 배양된 세포를 생산하는 대안으로 작용하는 2개의 N-1 배양 생물반응기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 대상 기술의 N-1 연속적 관류 배양 생물반응기(들)는 하기 방식으로 작동한다: 문헌[Biotechnol Bioeng. 2011 Jun;108(6):1328-37]에 기술되어 있는 글루코스의 고급 pH-제어(HIPDOG: hi-end pH-control of glucose), 또는 이러한 방법의 설명을 위한 발명의 명칭이 "Cell-Controlled Perfusion in Continuous Culture"인 공동-계류중인 출원 WO 2016/196261호에 기술되어 있는 관류 속도의 고급 pH-제어(HIPCOP: high-end pH-control of perfusion rate).
낮은 성장 속도에서 보다 높은 특정 생산성을 갖는 세포주, 또는 고 생산성인 상이한 생산 배양 환경 조건을 요구하거나 특정 생성물 품질 특성을 갖는 생성물을 생산하는 세포는 생산 생물반응기에서의 성장 속도가 상당히 낮을 것이고 유가식 생물반응기의 후기 단계에서 전형적으로 달성되는 조건과 더 유사할 가능성이 있으므로 특히 이러한 생물반응기 구성으로부터 이익을 얻어야만 한다. 이는 또한 이러한 연결된 연속적 N-1 대 CSTR 생산 생물반응기에서 생산된 목적하는 단백질의 생성물 품질이 유가식 생산된 단백질의 생성물 품질과 더 유사할 수 있음을 의미한다. 따라서, 한 실시형태에서, 상기 CSTR 생산 생물반응기는 몇몇의 경우에 세포 성장을 서행시키는 조건일 수도 있는 최고 세포 생산성을 촉진시키는 조건 하에서 작동한다. 높은 생산성 조건을 달성하기 위해, 세포당 생산성을 향상시키지만 성장을 서행시키거나 중단시키는 공지의 화학물질(chemical)을 상기 CSTR 생산 생물반응기에 부가할 수 있다. 대안으로, 상기 CSTR 생물반응기는 예를 들면, 낮은 pH 또는 높은 pH, 또는 특정 품질 속성을 갖는 단백질을 생산하는 세포를 얻기에 이로운 저온(Cu의 부가, 저 Ca, 갈락토스의 부가 등) 하에 작동하도록 제조될 수 있지만, 이들 동일한 조건은 높은 세포 성장 속도를 허용하지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 세포 특이적 생산성은 몇몇의 경우에 생산(CSTR) 생물반응기에서의 세포의 성장 속도에 반비례할 수 있다. 높은 희석 속도에서 작동하는 CSTR은 억제성 대사물질이 생물반응기로부터 보다 효과적으로 플러싱될(flushed) 수 있으므로 보다 높은 성장 속도를 초래해야만 한다. CSTR의 희석 속도는 N-1 연속적 관류 생물반응기로부터의 세포 방출 속도 및 CSTR에 직접적으로 진입하는 pH 제어에 사용되는 공급물 및 임의의 적정제의 속도에 의존할 것이다. CSTR에 대한 공급 배지 농도의 조작은 최적 성장, 영양분 유용성(availability) 및 상기 시스템으로부터의 억제성 대사물질 플러싱의 균형을 유지하도록 할 수 있다. 다수가 상호연관되어 있는 다중 인자들은 두 생물반응기에서의 세포 밀도 및 세포의 성장 속도, N-1에서의 관류 속도 및 CSTR의 희석 속도를 포함하는 조합된(combined) N-1 연속적 관류 및 CSTR 시스템의 최대 생산성에 기여할 수 있다. 단일 농축 공급 배지를 이용함으로써 CSTR의 희석 속도를 조작하고, 필요에 따라 이러한 배지를 물 또는 포화 염수 용액과 혼합된 물로 희석시키는 것이 유리하다. 다양한 농도의 공급 배지를 이용한 희석 속도의 제어는 또한 상기 시스템으로부터 생산된 재조합 단백질의 체류 시간에 대한 제어를 가능하게 할 수 있다. 높은 희석 속도는 낮은 생성물 체류 시간을 초래할 것이고 매우 불안정한 단백질에 유리할 수 있다.
업계에서 다수가 현재 포유동물 세포 배양을 위한 생산 시스템으로서 세포 보유/관류 생물반응기의 사용을 모색하고 있다. 이러한 시스템은 용적 생산성을 증가시키고 연속적 하류 정제 트레인을 가능하게 한다. 생산 생물반응기로서의 연속 관류 생물반응기와 같이, 본 발명의 연구에서 기술된 연결된 N-1 관류 생물반응기 대 케모스탯 또는 CSTR 생산 생물반응기는 하류 작동에 대한 일정한 생성물 스트림을 계속해서 생성할 것이므로, 보다 작고 연속적인 하류 작동의 이점이 계속해서 실현될 수 있다.
또한, 대상 기술은 상기 기술한 바와 같은 방법에 의해 생산된 목적하는 단백질에 관한 것이다. 이러한 목적하는 단백질로는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질 또는 항체가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 것들로는 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이들의 유도체 또는 단편, 및 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)로서 작용할 수 있고/있거나 치료학적 또는 진단학적 용도를 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드 및 스캐폴드(scaffold)일 수 있다. 목적하는 다른 재조합 단백질로는 예를 들면, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, hGH, tPA, 인터류킨(IL)과 같은 사이토킨이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 재조합 분비된 치료학적 단백질은 항체 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 따라서, 본 발명은 모노클로날 항체, 다중 특이적 항체 또는 이의 단편, 바람직하게는 모노클로날 항체, 이-특이적 항체 또는 이의 단편과 같은 항체의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 항체 단편으로는 예를 들면, "Fab 단편"(Fragment antigen-binding = Fab)이 포함된다. Fab 단편은 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 두 쇄의 가변 영역들로 이루어진다. 이들은 종래 항체로부터 프로테아제 분해(protease digestion)에 의해, 예를 들면 파파인을 이용하여 형성될 수 있지만, 유사한 Fab 단편이 또한 유전자 조작에 의해 생산될 수 있다. 추가의 항체 단편으로는 펩신을 이용한 단백질분해성 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편이 포함된다.
유전자 조작 방법을 이용하여 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역만으로 이루어지는 단축된 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편(Fragment variable = 가변 부분의 단편)으로서 나타낸다. 이들 Fv-단편에는 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 결여되어 있으므로, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 예를 들면, 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산의 짧은 펩타이드 단편에 의해 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 얻어진다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일-쇄-Fv(scFv)로서 알려져 있다. scFv-항체 단백질의 예는 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 바람직한 분비된 재조합 치료학적 항체는 이특이적 항체이다. 이특이적 항체는 전형적으로 한 분자 내에서 표적 세포(예를 들면, 악성 B 세포) 및 이펙터(effector) 세포(예를 들면, T 세포, NK 세포 또는 대식세포)에 대한 항원-결합 특이성을 조합한다. 예시의 이특이적 항체로는 디아바디(diabody), BiTE(Bi-specific T-cell Engager: 이-특이적 T-세포 인게이저) 포맷 및 DART(Dual-Affinity Re-Targeting: 이중-친화성 재-표적화) 포맷이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명과 관련하여 미니바디(minibody)가 기대된다. 미니바디란, 당해 분야 숙련가는 이가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다.
재조합 분비된 치료학적 단백질, 특히 항체, 항체 단편 또는 Fc-융합 단백질은 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수/단리되는 것이 바람직하다. 재조합 분비된 치료학적 단백질의 실질적으로 균질한 조제(preparation)를 얻기 위해 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 재조합 분비된 치료학적 단백질을 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로서, 세포 및/또는 미립자 세포 잔해(debris)를 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 또한, 재조합 분비된 치료학적 단백질은 예를 들면, 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼에 대한 분획화(fractionation), 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스(Sephadex) 크로마토그래피 및 실리카 상에서의 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해 오염성 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터 정제된다. 숙주 세포에 의해 발현된 이종성 단백질을 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
실시예
실시예 1
CHO 세포를 갖는 사람화된 IgG의 생산시 CSTR 생산 생물반응기(1 내지 2리터 규모)를 공급하는 연속 N-1 관류 생물반응기의 적용
도 1은 실험에 사용된 2-단계 연결된 생물반응기 시스템의 다이아그램을 보여준다. 실험의 목적을 위해, 관류 루프(세포-보유 시스템)를 포함하는 N-1 관류 생물반응기 작업 용적은 1.25리터였고, 생산 생물반응기의 작업 용적은 1.0리터였다. 산업 환경의 전체 규모에서, N-1 생물반응기는 생산 (CSTR 또는 케모스탯) 생물반응기 용적의 대략 1/5일 것으로 예상된다. 이러한 이유로 실험용 생물 반응기를 작동시켜 이러한 용적비를 모의실험하였다. 이는 N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출의 대다수(총 세포 방출의 약 81%)가 배액되도록 수송되었음을 의미한다. 세포 방출의 적절한 용적(전체의 약 19%)만이 생산 생물반응기로 펌핑되었다. 이러한 규칙에 대한 유일한 예외는 N-1로부터의 세포 방출의 전부가 생산 생물반응기에 부가된 생산(CSTR) 생물반응기 작동의 처음 3일에 발생하였다. 이는 생산 생물반응기가 달리 발생했을 때보다 약간 더 빠르게 고밀도를 나타내는 것을 가능하게 하였다.
도 2a는 처음에는 N-1 관류 생물반응기 세포 밀도만을 보여준다. 해당 밀도는 대략 40 x 106의 생세포/mL의 표적 밀도로 빠르게 증가하였고, 그 후 세포 방출을 시동하였고 배양 과정 동안 수동으로 조정하여 N-1 생물 반응기에서 대략 40 x 106의 생세포/mL의 일정한 생세포 밀도를 달성하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 대다수의 실험에 관해, N-1 관류 생물반응기의 세포 방출 속도는 대략 0.4/일이었거나 또는 하루에 0.4 반응기 용적이 제거되었다.
N-1 관류 생물반응기는 pH에 기초한 피드백 메커니즘(feedback mechanism)을 사용하였고, 이는 배양이 관류의 자체 속도를 결정하는 것을 가능하게 한다. 관류 배지는 소량의 나트륨-L-락테이트(표 2에 열거됨)를 함유하였다.
표 2는 N-1에 대해 사용되었던 관류 배지의 조성의 상세설명을 열거한다.
배양물은 벌크 배양물로부터 락트산을 취하기 시작함으로써 이용가능한 글루코스의 결여를 '신호전달(signal)'한다. 세포에 의한 벌크 배양액으로부터의 락트산의 제거는 생물반응기의 pH를 상승시키고, 이는 결국 N-1 관류 생물반응기에 글루코스를 함유하는 관류 배지를 전달하는 펌프를 활성화시키고, 이에 의해 배양물의 관류 속도가 증가된다(수준 제어기(level controller)가 일정한 생물반응기 용적을 유지하기 위해 중공 섬유 세포 보유 장치의 쉘(shell)측을 통해 배양물로부터 세포-불포함 배지[투과물]를 제거한다). 배양물에서의 세포가 전달되는 과량의 글루코스를 취하기 시작할 때, 이의 몇몇의 분획은 세포에 의해 락트산으로 전환되고, 이어서 세포로부터 분비됨에 따라 벌크 배양물 pH를 억제시키고, 이는 결국 pH 제어기가 관류 배지 부가 펌프를 비활성화시키도록 한다(또한 결국 투과물 펌프를 비활성화시키도록 한다). 이러한 제어 스킴(scheme)은 실험 과정 동안 몇 분마다의 사이클로서 반복해서 발생한다. 이러한 방법의 설명에 관해서는 발명의 명칭이 "Cell-Controlled Pefrusion in Continuous Culture"인 공동-계류중인 출원 번호 WO 2016/196261호를 참조한다. 간략하게, 공동-계류중인 출원 번호 WO 2016/196261호에 기술된 방법에서, 관류 펌프, 신선한 배지 및 투과물 펌프를 켜고 끄기 위한 pH 트리거(trigger)는 소정 값으로 설정된다. 이러한 소정 값은 약 pH 7(예를 들면, 6.8 내지 7.4)이다. 배지는 글루코스, L-락테이트 및 글루코스에 대한 아미노산의 특정 비를 포함한다. 기술된 방법은 또한 연속 배양 프로세스에 사용된 신선한 관류 배지에 L-락테이트를 부가하는 것을 포함한다. 관류 배지에 존재하는 L-락테이트는 약 0.1g/L 내지 7.0g/L의 양으로 존재한다. 대안으로 또는 추가로, 관류 배지에 존재하는 L-락테이트는 약 1 내지 4g/L, 약 1 내지 3g/L 또는 약 1 내지 2.5g/L의 양으로 존재한다. 한 바람직한 실시형태에서, L-락테이트는 나트륨 L-락테이트 또는 칼슘 L-락테이트이다. 다른 실시형태에서, 관류 배지에 사용된 락테이트는 나트륨 또는 칼륨 락테이트의 D/L 혼합물일 수 있다. 락테이트의 D/L 혼합물이 사용되는 경우, L-락테이트의 양이 L-락테이트만이 사용된 경우에 사용된 것과 동일할 수 있도록 충분한 혼합물이 관류 배지에 부가된다. 한 실시형태에서, L-락테이트 대신에 또는 L-락테이트에 추가하여 추가의 중탄산 나트륨이 관류 배지에 부가된다. 전형적인 세포 배양 배지는 약 1.0 내지 2.5그램/L의 중탄산 나트륨을 함유한다. 한 실시형태에서, 대상 기술의 N-1 관류 생물반응기용 관류 배지는 추가의 1 내지 3그램/L의 중탄산 나트륨을 가져 약 2 내지 5.5그램/L의 중탄산 나트륨의 총 농도를 달성한다. 이러한 방법에서의 관류 배지는 적어도 글루코스, L-락테이트(또는 대안으로 또는 추가로 중탄산 나트륨) 및 아미노산을 요구한다. 글루코스의 농도는 약 0.5 내지 약 40g/L이다. L-락테이트의 농도는 약 0.1 내지 약 7.0g/L이다. 중탄산 나트륨의 농도는 약 1 내지 5.5그램/L이다. 글루코스 대 아미노산의 몰 비는 약 0.25 내지 1.0이다. HIPCOP 모델에서, 세포 밀도가 증가함에 따라(도 2a) 세포는 실질적으로 점점 더 빈번하게 추가의 관류 배지를 요구하여 관류 속도의 증가를 초래한다(도 3).
유가식 배양에의 글루코스의 부가를 위한 유사한 제어 스킴은 문헌(Biotechnol Bioeng. 2011 Jun;108(6):1328-37)에 기술되어 있다. N-1 관류 배양은 실험 전체 기간 동안 이러한 관류 속도의 고급 pH-제어(HIPCOP) 기술을 사용한다. 필요하거나 유용한 경우, CSTR 또는 생산 생물반응기는 또한 락트산 형성을 제어하기 위한 유사한 글루코스 제한 기술을 사용한다. 세포에 의한 락트산 흡수의 결과로서 pH가 상승하는 경우의 CSTR에서, 펌프는 글루코스를 함유하는 농축 영양분 공급물 또는 물에 용해된 순수한 글루코스를 함유하는 공급물을 부가하도록 촉발된다. 표 3은 이러한 글루코스의 고급 pH-제어(HIPDOG) 전략의 부분으로서 사용된 공급 배지 또는 순수한 글루코스 용액을 열거한다.
표 3은 고급 pH-제어 시스템(HIPDOG)이 12 내지 19일째에 그리고 다시 29일 내지 33일째에 작동했던 때에 해당 시스템을 통해 필요에 따라 CSTR(케모스탯)에 전달되었던 농축된 공급 배지의 조성의 상세설명을 열거한다.
HIPDOG 전략을 이용하여 12 내지 19일째 및 29 내지 33일째 동안만 CSTR에 대해 락트산 형성을 제어하였다. 추가의 고정된 속도의 농축된 영양분 용액의 공급이 19 내지 35일째 CSTR에 발생하였다. 이들 공급물의 부가 속도는 때때로 CSTR에서의 잔여 아미노산 수준에 대한 오프-라인 샘플을 분석하고 과량(30밀리몰 초과)의 총 아미노산 또는 고갈된(30밀리몰 미만) 총 아미노산이 검출된 경우에 CSTR 로의 공급 속도를 변화시킴으로써 결정되었다. 본 발명자들은 이 단락에 기술된 공급 스킴을 이용하면, CSTR에서의 세포는 글루코스 이용가능성에 관해 과도하게 제한되지 않았을 것이고, 임의의 특정 아미노산의 이용가능성에 대해서도 제한되지 않았을 것이라고 생각한다. 정상-상태 또는 거의 정상-상태인 조건은 약 25 내지 28일째 및 또한 32 내지 35일째에 N-1 및 CSTR 조합된 반응기에서 도달되고, 도 3으로부터, N-1 생물반응기의 세포 방출이 대략 0.43/일이고 생산 CSTR 반응기의 희석 속도가 대략 0.13 내지 0.15/일임을 알 수 있다. 몇몇의 실시형태들에서, 생산 생물반응기의 희석 속도는 약 0.05 내지 0.4 또는 약 0.1 내지 0.3 또는 약 0.15 내지 0.2/일이다. 이들 2개의 연결된 생물반응기를 이용하여 모의실험된 1/5의 용적비로 인하여, N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출이 CSTR에 진입하는 액체의 용적의 대략 53 내지 62%에 기여하고, 나머지는 농축된 배지 또는 글루코스 공급물로 이루어지는 것으로 계산될 수 있다.
N-1 관류 생물반응기로부터 생산 생물반응기(CSTR 또는 케모스탯)까지의 라인을 우선 연결하고 약 12일째에 개방하였고, 이는 세포가 CSTR로 흐르기 시작하도록 하였다. 산업 환경에서는 CSTR의 시동을 지연시킬 강력한 유도장치가 존재하지 않을 수 있다. 아마도 N-1 관류 생물반응기로부터 세포 방출이 제거된 첫 번째 시점에서 시동될 수 있다. 현재 실험에서 CSTR은 N-1이 거의 정상-상태에 도달했다고 여겨진 후에 개시되었다.
12 내지 15일째에(CSTR 작동의 처음 3일) N-1로부터의 모든 세포 방출을 생산(CSTR) 생물반응기로 펌핑하였다. 이는 아마도 N-1 생물반응기가 CSTR의 대략 1/5인 산업 규모에서의 정상적인 시동 방법일 것이다. 그러나, 소규모 실험적 시스템에서 생물반응기의 용적은 거의 동일하고, 이는 이의 작동 처음 3일 내에, 대규모로 발생할 가능성이 있는 것보다 더 큰 수의 세포가 CSTR 시스템에 부가되었음을 의미한다. 이는 CSTR에서 고밀도에 도달하는 것을 가속화하기 위해 소규모로 수행되었지만, 조합된 생물반응기 시스템에 도달한 최종 정상-상태에 미치는 영향은 무시할만한 수준이어야만 한다. 15일째에 N-1 관류로부터 생산 CSTR 반응기로의 흐름을 1:5 용적비를 정확하게 모의실험하도록 조정하였다.
대부분의 파라미터들, 세포 밀도(도 2a), 세포 생존력(도 2b), 생물반응기 용적 흐름(도 3), 대사물질 농도(도 4 및 도 5), 및 생성물 농도 및 용적 생산성(도 6 및 도 7)에 관한 정상-상태는 약 23일째에 처음으로 도달하였다. 이러한 시점에서 CSTR의 용적 생산성은 대략 0.9그램/리터 반응기 용적/일이었다. 이러한 용적 생산성은 다음 12일 동안 유지되거나 약간 초과되었다(도 7). 중공-섬유 세포 보유 장치를 가로지르는 N-1 생물반응기(도 6의 흑색 및 백색 사각형)에서 일부 생성물 체별 또는 항체 생성물의 선택적 보유가 발생하지만, N-1 생물반응기로부터 CSTR에 진입하는 1일당 액체 용적(CSTR에 진입하는 총 용적의 약 65%)과 이의 생성물 농도(0.4 내지 0.6그램/L), 및 23일째에 1일당 용적 및 CSTR을 떠나는 생성물의 농도(6.4 내지 7.4그램/L)를 고려한 단순 질량 수지(simple mass balance) 계산은 CSTR에 대해 계산된 용적 생산성이 주로(약 93 내지 98%) CSTR에서의 생성물의 생성으로 인한 것임을 보여준다. 표 4는 19 내지 35일째에 수동 조작을 통해 다양한 고정 속도로 생산 (CSTR) 반응기에 전달된 농축된 공급 배지의 조성의 상세설명을 열거한다.
생산 생물반응기로서 독립적으로 작동하는 N-1 관류 생물반응기의 정상-상태 용적 생산성과 23일째에 조합된 생물반응기 시스템(약 0.9그램/리터/일)의 정상-상태 용적 생산성을 비교하는 것은 가치가 있다. N-1 관류 생물반응기를 떠나는 생성물 농도 및 용적을 사용하고, 하류 작업이 두 스트림(세포-불포함 투과물 및 세포-함유 세포 방출)으로부터 물질을 포획할 수 있다고 가정하면, 23일째의 N-1 관류 생물반응기의 용적 생산성은 대략 0.46그램/리터/일이고, 조합된 생물반응기 시스템의 용적 생산성(0.9그램/리터/일)의 거의 절반이다. 추가로, 23일째에 독립적으로 작동하는 N-1 관류 생물반응기의 배지 소비 속도는 대략 1.95 반응기 용적/일이다. 조합된 N-1/CSTR 시스템 배지 소비 속도(N-1 관류 배지 및 CSTR에의 농축된 영양분 공급물 둘 다를 포함)는 생산 생물반응기로서 독립적으로 작동하는 N-1 관류 생물반응기의 배지 소비 속도의 1/4보다 적은 단지 0.44 반응기 용적/일(CSTR의 용적 기준)이다.
한편 이러한 특정 실험에서는 N-1 관류 생물반응기에 대해 관류 속도의 고급 pH-제어(HIPCOP)가 사용되었고, 글루코스의 고급 pH-제어(HIPDOG) 전략은 CSTR 생산 생물반응기에서 간헐적으로 사용되었고, 이들 제어 방식은 대상 기술을 수행하는데 있어서 선택사항으로서 간주되어야 함에 주의해야만 한다. 대상 기술의 방법 및 시스템에 의해 배양되는 각 세포 유형에 필요한 대사 조건을 고려함으로써 대안의 또는 추가의 제어 메커니즘이 적용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 CHO 세포주 및 기타 포유동물 세포 발현 시스템은 본원에 기술된 연결된 생물반응기에 대한 글루코스 제한 기술의 사용을 선택적으로 만들 수 있는 별개의 세포 대사를 갖는다.
실시예 2
IgG(면역글로불린 G) 생산
IgG 단백질 제조에 있어서의 세포주 B - 글루타민-신테타제(synthetase) 발현 시스템 CHO 세포주의 이용
본 실시예에서 사용된 2-단계 연결된 생물반응기 시스템의 실험적 고안은 실시예 1에서 사용된 것과 동일하다. 실험 목적을 위해, 관류 루프(세포 보유 시스템)를 포함하는 N-1 관류 생물반응기 작업량은 1.36리터였고 생산 생물반응기(CSTR)의 작업량은 1.1리터였다. 산업 환경에서, N-1 생물반응기는 생산(CSTR 또는 케모스탯) 생물반응기 용적의 대략 1/5인 것으로 고려된다. 이러한 이유로(실시예 1과 유사한 방식으로), 실험의 시동시에 실험용 생물반응기를 작동시켜 상기 용적 비를 모의실험하였다. 실험의 후기(32일째)에 실험용 생물반응기 구성을 1:10의 용적 비를 모의실험하도록 하는 방식으로 변경하였고, 44일째에 1:20의 용적 비를 모의실험하기 위해 다시 변경하였다. 이들 각각의 경우, 이론적인 생물반응기 용적 차이를 모의실험하기 위한 목적을 위해서만 N-1 연속 관류 생물반응기로부터의 세포 방출의 큰 분획이 생산 생물반응기로 들어가는 대신에 배액되도록 수송되었다. 용적비 모의실험이 1:5에서 1:10으로 증가된 다음, 그리고 후에 1:20으로 증가됨에 따라, N-1 관류 생물반응기로부터 나오는 세포의 보다 큰 분획의 용적이 배액되도록 수송되었다.
이들 실험에서 사용된 생물반응기에 관한 각종 프로세스 제어 파라미터 및 설정점(pH, 용존 산소, 온도 등)은 표 5에 열거된다.
표 5에 언급된 바와 같이, 이중 스파징(sparging) 전략이 사용되었고, 여기서 배양물에 대한 대부분의 산소는 순수한 산소를 이용한 15미크론 소결된 강철 스파저(sintered steel sparger)를 통해 전달되었고, 이산화 탄소 제거의 대다수는 큰 기포를 생성시키는 천공된 구멍(7 x 1mm 구멍) 스파저를 통해 대기 공기를 스파징함으로써 달성되었다. 천공된 구멍 스파저를 통한 공기의 스파징 속도는 15미크론 스파저에서 사용된 산소의 용적의 2.5 내지 4배에서 변하였다. 이러한 전략은 공기 포화 설정점의 40%에서 용존 산소를 제어하기에 그리고 용존 이산화 탄소 수준을 배양의 처음 13일 동안 5 내지 13%로 그리고 13일째(주요 데이터의 대부분이 수집되었을 때) 이후 4 내지 8%로 유지하기에 충분하였다.
이러한 예시에 대해, 2개의 N-1 관류 생물반응기가 작동되었고, 이들 반응기의 각각은 연속-유동 교반 탱크 반응기(CSTR)로서 작동하는 하나의 생산 생물반응기에 연속적 세포 공급원을 독립적으로 공급하였다. 제1 N-1 관류 반응기에 대한 표적 정상-상태의 생세포 밀도는 약 40 x 106 세포/mL이었고, 제2 N-1 관류 반응기에 대해서는 약 80 x 106 세포/mL이었다. N-1 관류 생물반응기는 첫 번째 세포가 생산 생물반응기로 이동되기 8일 전에 개시되었다. 생산 생물반응기(CSTR)는 가득 찬(full) 용적으로 개시되었고, 이는 N-1 관류 생물반응기로부터의 첫 번째 세포 방출이 생산 생물반응기로 흐르기 시작했을 때 생물반응기가 배지로 완전히 가득 찼음을 의미한다. 생산 생물반응기는 부분적으로 가득 찬 용적으로 시동되었고, 이는 연결된 생물반응기 시스템 실험을 위한 실험 계획이 생산 생물반응기(CSTR)에서의 몇몇의 상이한 효과적인 희석 속도를 탐구하기 위해, 그리고 이들 조건 각각에 대한 정상-상태 데이터를 수집하는 것을 시도하기 위해 고안되었기 때문이다. 이러한 유형의 실험(희석 속도 연구)은 일반적으로 정상-상태 조건에 도달하는데 전형적으로 보다 긴 시간을 필요로 하는 보다 낮은 희석 속도로 이동하기 전에 우선 높은 희석 속도를 탐구함으로써 촉진된다. 또한, 낮은 희석 속도는 생존력이 보다 낮은 배양물을 초래할 가능성이 있고, 나중에 보다 바람직한 배양 조건으로 보다 높은 희석 속도로 이동할 때에 세포가 반응하는 지체 시간(lag time)이 길어질 수 있다. 이러한 이유로, 생산 생물반응기에서의 높은 희석 속도를 우선 조사하였다.
(N-1 관류 생물반응기로부터의 세포를 부가하기 전에) 생산 생물반응기를 가득 찬 용적으로 시동하는 것은 아마도 이러한 배양을 개시하는 최적의 방식은 아닐 것이다. 생물반응기를 부분적 용적으로 시동하여 생산 생물반응기로부터 첫 번째 물질이 제거될 때(생물반응기가 가득 차 있을 때) 세포 밀도, 목적하는 생성물의 농도 및 잠재적으로는 단백질의 제품 품질은 이미 거의 최종 정상-상태 값인 것이 배지 및 설비 활용 관점으로부터 이점이 존재할 수 있다. 이러한 최적의 시동 용적(이는 임의의 특정 세포주의 성장 및 생성물 생산 역학에 의존한다)는 통상적 실험 및 컴퓨터 모델링 모의실험에 의해 결정될 수 있다. 생산 생물반응기의 최적 시동 용적은 또한 N-1 관류 및 CSTR 조합된 시스템의 최적(최고 생산성 및 실제 작동 조건)의 정상-상태 조건에 의존한다.
2개의 N-1 연속 관류 생물반응기에 에를렌마이어(Erlenmeyer) 진탕 플라스크에 유지된 세포로부터 약 1.2 x 106 생세포/mL를 접종하였다. 생물반응기는 처음에 회분식(관류 없음)으로 작동하였다. 세포 밀도가 증가함에 따라(도 8) 글루코스 농도는 대략 4그램/L로부터 약 3일째에 0.4그램/L(도 10) 미만으로 떨어졌다. 동시에 락테이트는 처음에 2그램/L를 약간 초과하여 축적되었다(도 11). 일단 글루코스 수준이 충분히 낮은 농도로 떨어지면, 세포는 배양물로부터 락트산을 취하기 시작하여(3일째), 벌크 유체의 pH를 상승시키고 관류 배지의 부가(및 생물반응기 작업량을 일정하게 유지하기 위해 세포 보유 시스템을 통한 세포-불포함 투과물의 동시 제거)를 촉발시켰다. 이러한 방법에 대한 설명은 발명의 명칭이 "Cell-Controlled Perfusion in Continuous Culture"인 공동-계류 중인 출원 제62/246,774호를 참조한다. 이러한 방법은 관류의 고급 pH 제어(HIPCOP)로서 나타낼 것이다. 세포는 다음 수일 동안 이들의 관류 속도를 계속해서 제어하고 상승시켰다(도 12). 대략 8일 후, 2개의 생물반응기에 대해 관류 속도가 안정화되었고, 실험 기간 동안 상대적으로 안정하게 유지되었다. 전체 실험 동안 관류 속도는 HIPCOP 기술에 의해 제어되었다. 10 내지 51일째의 표적 40 x 106 세포/ml N-1 관류 생물반응기에 대한 평균 관류 속도는 1일당 1.76 반응기 용적인 것으로 계산될 수 있다(이는 생물반응기로 펌핑되는 배지의 총 용적으로서 정의된다). 10 내지 40일째의 표적 80 x 106 세포/ml N-1 관류 생물반응기에 대한 평균 관류 속도는 1일당 3.60 반응기 용적인 것으로 계산될 수 있다. 5일째 이후 N-1 생물반응기 둘 다에서의 잔여 글루코스 수준은 HIPCOP 기술을 이용하여 작동하는 전형적인 생물반응기와 같이 전체 실험에서 거의 제로에 가까웠다(도 10).
6일째에 N-1 관류 반응기로부터의 세포 함유 배양물(세포 방출)의 직접적인 제거를 개시하였다. 대부분의 장기-지속 또는 지속가능한 관류 생물반응기 작동은 생물반응기에서 세포 생존력을 유지하고 불활성 바이오매스(biomass)의 전반적인 수준이 문제가 되는 것을 막기 위해 일정량의 세포 방출을 필요로 한다. N-1 관류 생물반응기에 대한 세포 생존력은 도 9에 나타낸다. 배양물 둘 다에 대한 생존력은 실험 전체 길이 동안 90% 초과로 높았다. 생존력은 보다 높은 밀도 배양물에서 약간 더 낮았다. 이는 보다 높은 밀도 배양에서 용존 산소 및 이산화 탄소를 적절한 범위로 유지하는데 필요한 높은 기체 살포 수준이 거의 2배였으므로 겪었을 가능성이 있는 약간 더 높은 전단력으로 인한 것이었을 수 있다.
6 내지 8일째에 실험의 목적을 위해 N-1 관류 배양에서 세포 방출 속도 및 세포 밀도가 안정화되었을 때에 생산 반응기(CSTR)를 개시하는 것이 더 용이할 수 있는 것으로 생각되었므로 세포 방출은 폐기하도록 지시되었다. 세포 방출 속도는 N-1 관류 반응기(도 8)의 세포 밀도를 40 및 80 x 106 세포/mL의 이들의 표적 밀도에 가능한 가깝게 유지하기 위한 시도로 매일 조정하였다. 세포 방출 속도는 도 13에 나타낸다. 8일째 후 수동 조절은 중요하지 않았고, 10 내지 51일째에 표적 40 x 106 세포/ml N-1 관류 생물반응기에 대한 평균 세포 방출 속도는 1일당 0.72 반응기 용적인 것으로 계산될 수 있다. 10 내지 40일째에 표적 80 x 106 세포/ml N-1 관류 생물반응기에 대한 평균 세포 방출 속도는 1일당 0.74 반응기 용적인 것으로 계산될 수 있다.
8일째에 N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출은 2개의 독립적으로 작동하는 생산 생물반응기(CSTR)에 보내어졌다. 앞서 본문에서 언급한 바와 같이, 정확한 용적의 세포 방출을 생산 생물반응기로 보내어 N-1 대 생산 생물반응기의 1:5 용적 비를 모의실험하였다. 세포 밀도 및 세포 방출 속도의 궤도와 상기 연결된 생물반응기에 대한 최종 최적 작동 조건이 실험의 시동 전에 알려져 있는 산업적 적용에 있어서, 세포 방출을 생산(CSTR) 반응기에 즉시(세포 방출이 시동된 제1일로부터) 보내는 것이 가장 효율적일 가능성이 있다.
일단 N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출이 생산 생물반응기(CSTR)에 보내어지면, 이들 반응기의 세포 밀도는 20 x 106 생세포/mL 초과로 매우 신속하게 증가하였다(도 14). 생산 생물반응기에 직접 부가된 농축된 공급물의 유속은 필요에 연속적 세포 성장 및 단백질 생산을 위한 충분한 영양분을 유지하기 위해 증가된 세포 밀도와 같이 필요에 따라 증가되었다. 영양분은 아미노산 분석(HPLC)에 의해 모니터링되었고, 다른 대사물질(락테이트, 글루코스, 암모니아, 삼투압 강도 등)은 NovaFlex Analyzers(Nova Biomedical, Waltham, MA)에 의해 모니터링되었다. 잔여 아미노산의 합계(알라닌은 종종 대사 부산물로서 배양물에 높은 수준으로 존재하므로, 알라닌을 포함하지 않음)가 30 밀리몰 초과로 유지되도록 그리고 임의의 특정 아미노산이 0.2 밀리몰 이상이 되도록 공급 속도를 조정하였다. 공급물은 농축된 글루코스 용액(50그램/L), 아미노산(600밀리몰), 전단 보호제(shear protectant)(5.12그램/L의 폴리비닐 알콜), 비타민 및 미량 원소(표 6에 상세설명된 몇몇)로 이루어졌다.
디펩타이드 글리신-티로신은 또한 티로신 가용성의 문제(complication)를 감소시키기 위해 농축된 공급물에 사용되었다. 생산 생물반응기에 부가된 농축된 공급 배지 100mL마다 시스테인의 400밀리몰 산성 저장 용액 2.5mL도 부가하였다.
실험의 목적은 생산 생물반응기에서 상이한 희석 속도를 탐구하는 것이었기 때문에, 특히 높은 희석 속도가 탐구된 경우에 염수 희석액이 생산 생물반응기에 공급되어야 할 필요가 있음을 하는 것이 필요함이 이해되었다. 이러한 염수 희석액은 20밀리몰 염화 칼륨 및 250mOsm/kg의 최종 삼투압 강도를 갖는 평형 염화 나트륨을 갖는 물로 이루어졌다. 따라서, 한 실시형태에서, 희석 속도를 조정하는 것을 돕기 위해 그리고 CSTR 생산 생물반응기의 삼투압 강도를 제어하기 위해 생산 생물반응기에 염수 용액을 공급한다. 다른 실시형태에서, 상기 CSTR 생산 생물반응기에 생산 생물반응기에서의 배지가 세포의 증가된 생산성에 최적인 최종 삼투압 강도를 달성하기에 충분한 양의 염수 용액을 공급한다. 다른 실시형태에서, 상기 CSTR 생산 생물반응기에 생산 생물반응기에서의 배지가 약 100 내지 약 500mOsm/kg의 삼투압 강도를 달성하기에, 또는 약 150 내지 약 400mOsm/kg의 삼투압 강도를 달성하기에, 또는 약 150 내지 약 350mOsm/kg의 삼투압 강도 또는 이들 사이의 임의의 특정 값을 달성하기에 충분한 양의 염수 용액을 공급한다. 다른 실시형태에서, 생산 생물반응기에 부가된 염수 용액은 약 250mOsm/kg의 최종 삼투압 강도를 생성시키는데 충분하다.
처음에 생산 생물반응기에서 락테이트의 수준은 매우 신속하게 증가하였다(8 내지 10일째, 도 11). 이러한 이유로, 일단 생산 생물반응기에서 글루코스가 고갈되면(10일째, 도 10) 생산 생물반응기에의 글루코스의 공급이 제한되었다. 글루코스 수준은 공급물에 함유된 아미노산의 양을 평형화하는데 필요한 것보다 낮을 것으로 예상되었던 글루코스의 수준으로 존재하였던 글루코스 및 농축된 영양분의 연속적 공급물을 사용하여 제어하였다(표 6의 상세설명 및 앞서 기술된 바와 같음). 농축된 500그램/L의 글루코오스의 추가의 공급물은 pH가 7.125의 고급 설정점에 도달하였을 때에 활성화된 펌프의 수단에 의해 2개의 생산 생물반응기에 직접적으로 그리고 서서히 공급되었다. 이러한 락테이트의 제어 방법, 글루코스의 고급 pH-제어된 전달(HIPDOG)은 문헌[Gagnon et. al. 2011, Biotechnol Bioeng 108:1328-37]에 상세하게 기술되어 있다. HIPDOG 제어는 표적 40 x 106 N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출을 이용하는 생산 생물반응기에서 26일째까지, 그리고 표적 80 x 106 N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출을 이용하는 생산 생물반응기에서 22일째까지 사용되었다. 이들 시점 22일째 및 26일째 후, 생산 생물반응기에서의 잔여 글루코스 수준은 비-제안적 범위인 것으로 생각되는 범위, 일반적으로 0.3그램/L 초과로 유지되었지만, 더 빈번하게는 농축된 글루코스 용액(500그램/L)의 연속적 공급에 의해 실험의 나머지에 대해 1 내지 3그램/L 범위로 유지되었다(도 10).
도 14는 생산 생물반응기에서의 생세포 밀도를 보여준다. 세포 밀도는 처음에는 신속하게 증가했지만, 10 내지 14일째에 안정화되기 시작했다. N-1 관류 반응기로부터 생산 생물반응기에 진입하는 세포의 용적 및 농도는 약 10일째로부터 약 32일째까지 일정하게 유지되었다. 해당 시점에서 생산 생물반응기에 진입하는 세포의 용적을 1:10의 보다 큰 생물반응기 용적 비 차이(생산 생물반응기 용적에 비한 N-1)를 모의실험하기 위해 절반으로 줄였다. 상기 비는 약 43일째에 1:20의 비를 모의실험하기 위해 다시 변경되었다. 이들 변화의 시점은 생산(CSTR) 생물반응기에서의 세포 밀도의 그래프와 관련하여 표시되어 있다(도 7).
13 내지 18일째에 생산 생물반응기 둘 다에의 영양분 공급물의 용적은 대략 일정하게 유지되었다. 생산 생물반응기(도 15에 그리고 도 14 및 도 17의 텍스테에도 나타냄)의 희석 속도(1일당 또는 역 시간(reciprocal time)당 반응기 용적으로 측정됨)는 반응기 용적으로 나눈, 세포 방출, 농축된 영양분 공급물 및 염수 희석액, 농축된 글루코스 공급물, 및 소포제 및 저급으로 pH를 제어하기 위한 염기성 적정제의 임의의 미량의 부가물의 용적의 총합이다. 희석 속도는 생산 생물반응기 둘 다에 대해 13 내지 18일째에 1일당 0.64 반응기 용적의 평균값(도 15)으로 상대적으로 일정하게 유지되었다. 2개의 생산 생물반응기에 대한 희석 속도가 대략 일정하게 고정된 이러한 기간 동안, 세포 밀도(도 14), 세포 생존력(도 16), 역가 또는 생성물 농도(도 17) 및 대부분의 다른 대사물질은 정상-상태가 달성되었음을 나타내는 거의 일정한 값에 도달했다.
18일째 후 생산 생물반응기의 희석 속도는 수일의 과정에 걸쳐 표적 40 x 106 생세포/mL N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출을 수취한 배양물에 대해서는 0.30 반응기 용적/일로 그리고 표적 80 x 106 생세포/mL N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출을 수취한 배양물에 대해서는 0.33 반응기 용적/일로 서서히 감소되었다. 희석 속도의 감소는 생산 생물반응기에 직접적으로 부가된 염수 희석액 대 농축된 공급물의 용적 비를 서서히 감소시킴으로써 달성되었다. 이전과 마찬가지로, 배양물은 영양분 수준에 대해 모니터링하였고 변하는 세포 밀도에 충분한 영양분을 공급하기 위해 필요에 따라 농축된 영양분 공급 속도를 조정하였다.
21일째까지 생산 생물반응기 둘 다는 다음 표적의 희석 속도(0.30 및 0.33 반응기 용적/일)에 도달하였다. 생산 생물반응기는 대부분의 배양물 파라미터가 거의 일정한 값에 도달하였을 때까지 추가의 5일 동안 표적 희석 속도로 고정되었다. 이 시점에서 시험된 보다 낮은 희석 속도로 인하여 그리고 실험의 나머지에 대해서, 배양물이 모든 파라미터에 대해 완전히 변화없는 값에 도달할 때까지 기다리는 것은 실용적이지 못했다.
26 내지 28일째에 생산 생물반응기의 희석 속도는 생산 생물반응기에 직접적으로 부가된 염수 희석액 대 농축된 공급물의 용적 비를 감소시킴으로써 재차 감소시켰다. 28 내지 31일째에 일정하게 고정된 감소된 희석 속도(도면, 예를 들면 도 15에 나타낸 바와 같은 0.21 및 0.25 반응기 용적/일)를 달성하기 위해, 염수 희석액의 사용을 완전하게 제거할 필요가 있었다. 28일째부터 앞으로 생산 생물반응기로의 공급물은 관련 N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출, 농축된 영양 공급물, 농축된 글루코스 공급물, 및 미량의 소포제로만 이루어졌다. 세포가 순(net) 락트산이 생산되지 않는 대사 상태로 이동되었으므로 무시할만한 양의 염기성 적정제가 마너지 실험에 요구되었다. 또한, 대부분의 대사 파라미터들은 31일째까지 거의 일정한 값으로 안정화되었다.
31일째에 이들의 관련 생산 생물반응기(CSTR)에 부가되는 N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출의 용적은 N-1 반응기의 것의 10배 용적을 갖는 생산 생물반응기를 모의실험하기 위해 절반으로 감소시켰다. 이를 다시 말하면, N-1 관류 생물반응기로부터 제거되는 세포 방출 용적은 변경되지 않았지만, 해당 세포 방출의 보다 큰 분획이 현재 관련 생산 생물반응기에 첨가되기보다는 폐기물로 보내졌다. 모의실험된 용적 비에서의 이러한 변화는 배양물에 대해 영양분의 이용가능성을 제한하지 않으면서 이미 시험된 것보다 더 낮은 생산 생물반응기의 희석 속도를 연구하기 위한 시도에 필요하였다. 모의실험된 용적의 변화 후, 표적 80 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출을 수취하는 생산 생물반응기의 생세포 밀도는 50 x 106 세포/mL 바로 위로 감소되었다. 이것이 발생함에 따라, 배양물의 유효 희석 속도가 34일째에 대략 0.15 반응기 용적/일의 값에 도달할 때까지 농축된 영양분 공급물에 대한 요구는 약간 감소되었다. 이러한 희석 속도는 41일째까지 일정하게 유지되었고, 이 때 실험은 표적 80 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출을 수취하는 생산 생물반응기에 대해 완료되었다. 유사한 방식으로, 표적 40 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출을 수취하는 생산 생물반응기의 유효 희석 속도는 34일째에 약 0.14 반응기 용적/일로 감소되었고, 대다수의 파라미터들이 정상-상태 값에 도달하였다.
43일째에 N-1 관류 생물반응기 대 생산 생물반응기의 모의실험된 용적비는 이번에 1:20으로 재차 변경되었다. 이는 표적 40 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기(도 15)로부터의 세포 방출을 수취하는 생산 생물반응기에 대해 46 내지 50일째에 0.09 반응기 용적/일의 희석 속도의 탐구를 가능하게 하였다. 또한, 43일째에, 표적 40 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기에 부가되는 관류 배지의 제형을 약간 변경하였다. 43일째 이전에 관류 배지에서의 나트륨 L-락테이트 수준은 2.1그램/L이었다. 43일째에 순수한 나트륨 L-락테이트 화학물질에 대한 보다 상업적으로 입수가능하고 경제적인 대안인 나트륨 DL-락테이트를 함유하는 관류 배지를 사용하기 위한 전환이 이루어졌다. 수득된 나트륨 DL-락테이트 농축된 용액이 락테이트의 D 및 L-이성질체의 동등한 비율을 함유하였고, 배양물에서의 세포가 L-이성질체 형태만을 취할 가능성이 있는 것으로 가정하였다. 관류 배지에서의 L-락테이트의 몰 농도가 여전히 대략 18.8밀리몰이 되도록 나트륨 DL-락테이트를 4.2그램/L의 수준으로 부가하였다. 동일한 삼투압 강도를 갖는 DL-락테이트로 변경하기 전과 변경한 후에 관류 배지를 조제하기 위한 시도가 이루어졌다. 이는 관류 배지에 부가된 염화 나트륨의 양을 감소시킴으로써 부가된 나트륨 D-락테이트의 추가의 삼투압 기여를 보상함으로써 달성되었다. 배지 조제 프로세스 동안 멸균 여과하기 전에 마지막 단계로서, 삼투압 강도는 빙점 삼투압계에 의해 측정한다. 염화 나트륨은 일반적으로 용액의 삼투압 몰농도를 원하는 값에 접하게 조정하기 위해 배지 조제에 부가되고, 이러한 경우 대략 319mOsm/kg이다. 관류 배지의 삼투압 강도를 맞추기 위한 시도에도 불구하고, DL-락테이트를 함유하는 관류 배지로의 전환 직후에 대략 43일째에 N-1 생물반응기의 정상-상태 삼투압 강도가 약간 증가하였다(도 18).
순수한 형태의 나트륨-D-락테이트의 별도의 플라스크 시험에서 정상적인 사용 범위(0 내지 5그램/L) 내에서 D-락테이트 형태는 표준 분석 방법을 사용하는 분석 장비로 등록되지 않는 것으로 측정되었다. 이러한 이유로 DL-락테이트(43일째)를 함유하는 관류 배지로 변화시킨 후, 표적 40 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기에서 측정된 락테이트 수준이 현저하게 변화하지 않았다는 것은 놀랍지 않다(도 11).
관류 생물반응기로서 독립적으로 작동하는 N-1 관류 생물반응기의 용적 생산성은 도 19에 나타낸다. 이러한 도면은 관류 생물반응기가 생산 생물반응기로서 작동하고 단백질 생성물이 생물반응기를 떠나는 모든 흐름(세포 방출 및 세포 보유 시스템을 떠나는 세포-불포함 투과물)으로부터 회수된다고 가정한다. 용적 생산성은 또한 생물반응기에서 생성물의 선택적 농도가 소량 발생하였을 때에 발생한 생물반응기에서의 생성물 농도의 미량 변화를 고려한다. 이는 대부분 표적 80 x 106 세포/mL 밀도(도 20, 15 내지 25일째)의 N-1 관류 생물반응기에서만 나타났다.
관류 생물반응기의 작동 조건이 약 10일째 후에 유의하게 변하지 않더라도 세포 밀도, 세포 생존력 및 기타 배양 파라미터가 관류 생물반응기 둘 다에 대해 실험의 10일째부터 종료까지 거의 변하지 않고, 용적 생산성은 표적 40 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기(12 내지 48일째)에 대해 약 29% 그리고 표적 80 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기(12 내지 40일째)에 대해 약 36%까지 서서히 감소한다. 이러한 생산성 저하는 생산자 CHO 세포주 B의 적당한 유전적 불안정성의 결과일 가능성이 높다.
생산 생물반응기(CSTR) 시스템에 연결된 조합된 N-1 관류의 정상-상태 용적 생산성은 도 21에 나타낸다. 용적 생산성은 생산 생물반응기에서 이용된 희석 속도에 대해 그래프로 나타내어져 있다. 연결된 N-1 관류 및 CSTR 생산 생물반응기의 정상-상태 용적 생산성은 하기 방식으로 계산하였다. 생산 생물반응기에서의 생성물 단백질의 생산 속도를 측정하기 위해 물질 수지(material balance)를 수행하였다. 물질 수지는 생성물 농도 및 N-1 생물반응기로부터 생산 생물반응기로 진입하는 유체의 용적, 생산 생물반응기에서의 생성물 농도 증가 비율, 및 생산 생물반응기에서의 임의의 시점에서의 생성물 농도 및 이의 제거 비율(희석 속도)을 고려하였다. 이러한 계산은 CSTR에서 생산된 생성물의 총 질량을 산출하였고, 이어서 이를 시간에 대해 플롯팅하였다. 이어서, 희석 속도가 일정하게 유지되었고 세포 밀도가 비교적 일정한 값에 도달한 시점만을 고려하여, 선형 회귀를 사용하여 반응기 용적 값당 시간당 질량 생산을 보다 정확하게 결정하였다. 이러한 평가는 임의의 특정 희석 속도에 대한 연결된 N-1 관류 생물반응기 대 생산 CSTR 시스템의 최종 용적 생산성 추정을 위해 N-1 생물 반응기의 생산 속도(N-1 대 생산 생물반응기의 정확한 모의실험된 용적 비를 다시 가정하고, 단지 생산 생물반응기에 진입하는 유체의 용적을 고려함)에 더해졌다.
또한, 임의의 특정 정상-상태에 대한 최종 시점에서 CSTR 생산 생물반응기에서의 생성물 농도에 (역 시간으로의) 희석 속도를 곱하면 연결된 생물반응기 시스템의 전체 용적 생산성의 추정값이 산출될 것이다. 그러나, 사용된 시점에서 생성물 농도가 변하지 않는 한, 이러한 계산은 시스템의 실제 정상-상태 용적 생산성의 생산성의 추정값보다 약간 낮은 값을 제공할 것이다.
도 21에서 알 수 있는 바와 같이, 다수의 정상-상태 조건에 대해, 조합된 N-1 관류 및 생산 생물반응기의 용적 생산성은 독립적으로 작동하는 N-1 관류 생물반응기의 용적 생산량보다 상당히 높다. 이러한 일반화에 대한 하나의 예외는 도 19의 가장 초기 시점에서 표적 80 x 106 세포/mL N-1 관류 생물반응기의 용적 생산성일 수 있다. 이러한 관류 생물반응기는 3.6 반응기 용적/일 및 매우 높은 세포 밀도에서 작동하였다. 매우 큰 규모의 이러한 생물반응기의 실제 작동은 조제 및 보관이 요구될 수 있는 배지의 용적, 및 또한 매우 큰 용적에서 기능할 수 있는 세포 보유 시스템을 고안하는 어려움으로 인하여 상당한 챌린지를 수반할 수 있다. 추가로, 충분한 산소를 전달하고 충분한 이산화 탄소를 제거하는 것이 대규모에서 더 문제가 되기 때문에, 매우 높은 생세포 밀도(80 x 106 세포/mL)는 실질적인 공학적 문제를 제기할 수 있다.
연결된 N-1 관류 대 CSTR 생산 생물반응기는 관류 생물반응기의 크기를 현저하게 감소시키고 필요한 배지의 전체 용적을 현저하게 감소시킴으로써 이들 문제의 다수를 완화시킨다. 연결된 생물반응기 시스템은 높은 밀도에서 그리고 상기 높은 세포 밀도를 유지하는데 필요한 높은 관류 속도에서 작동하는 연속적 관류 생물반응기와 대략 동일한 용적 생산성을 유지한다. 도 21은 CSTR 생산 생물반응기를 작동하기 위한 최적의 희석 속도가 대략 0.1 내지 대략 0.35 반응기 용적/일의 상당히 넓은 범위에 걸쳐 발생함을 보여준다. 도 19에 표시된 바와 같은 세포주의 생산성의 느린 감소 및 실험 동안 높은 희석 속도 조건이 처음 조사되었다는 사실로 인하여, 낮은 희석 속도에 관해 도 21에 제시된 바와 같은 정상-상태의 용적 생산성은 달성가능한 실제 생산성의 추정값보다 약간 낮은 값일 수 있다.
표 7은 도 21에 나타낸 바와 같이 2개의 연결된 N-1 관류 대 CSTR 시스템에 대한 최고 용적 생산성 조건에 관한 몇몇의 추가의 상세설명을 열거한다.
배지 또는 공급물 사용의 효율성은 독립적으로 작동하는 관류 생물반응기와 비교하는 경우 연결된 생물반응기 시스템에서 유의하게 높다. 배지 사용의 최고 효율성을 갖는 조건, 연결된 시스템에 대해 시스템에 전체적으로 시스템에 사용된 배지 또는 공급물의 리터당 생산된 3.83그램의 생성물 단백질은 유가식으로 작동하는 포유동물 세포 배양 생물반응기와 비교하는 경우에도 상당히 높다.
현재 실험에서 매일 2개의 N-1 관류 배양이 익히 이해되어 있는 프로세스로의 산업적 환경에서 이들의 표적 값에 가까운 세포 밀도를 유지하도록 세포 방출 속도를 수동으로 조정하였지만, 세포 밀도는 작동중인 생물반응기에서 생세포 질량을 평가하기 위해 커패시턴스 측정(또는 다른 기술)을 이용하는 임의의 수의 살균가능한 프로브로 모니터링한다. 이어서, N-1 관류 생물반응기로부터 제거된 세포 방출량을 지속적으로 변화시키도록 컴퓨터 제어 알고리즘을 작성할 수 있다. 아마도 연결된 N-1 관류 대 CSTR 생산 생물반응기 시스템에서 모든 세포 방출은 즉시 생산 생물반응기로 이동될 것이다.
CSTR 생산 생물반응기의 유효 희석 속도는 연속적 N-1 관류 생물반응기로부터 용기로 진입하는 액체의 용적에 큰 정도로 의존하기 때문에, 한 실시형태에서, N-1 관류 생물반응기로부터의 세포 방출물은 CSTR 생산 생물반응기에 이동되기 전에 (세포 방출물로부터의 추가의 액체를 제거함으로써) 추가로 농축된다. 이러한 세포 방출물의 농축은 N-1 관류 생물반응기가 낮은 세포 밀도에서 작동하는 경우 그리고/또는 CSTR 생산 생물반응기에서 낮은 희석 속도가 전체적으로 시스템에 대해 보다 높은 용적 생산성을 산출한 실험에서 측정되는 경우에 특히 유용하다. 세포 방출의 추가의 농축(필요한 경우)은 임의의 실질적인 세포 보유 방법(연속적 미세-여과, 음파 설정, 하이드로사이클론(hydrocylone) 등)에 의해 수행된다.
N-1 관류 반응기로부터의 세포 방출이 (조건에 따라) 생산 반응기로의 유체의 총 용적의 상당한 분획을 가져오기 때문에, 한 실시형태에서, 생산 반응기로의 공급 배지의 부가를 최소화하기 위해 N-1 생물반응기를 관류하는데 매우 높은 영양분 함량의 배지를 사용한다. N-1 관류 반응기에서의 세포가 관류 배지로부터의 영양분을 전부 소비할 수 없을 것이므로, 이어서 유의한 양의 영양분이 생산 생물반응기에 흐를 것이다. 그러나 이러한 능력에는 매우 높은 수준의 일부 아미노산 존재 하의 세포의 성장 속도는 상당히 제한될 수 있다는 점에서 한계가 있다. 추가로, N-1 생물반응기에 진입하는 대부분의 관류 배지는 상실되어 세포 불포함 투과물에 폐기되므로, 큰 용적의 고 영양분 함량 관류 배지를 버리는 추가의 비용을 고려해야만 할 것이다.
이동 전 세포 방출물을 잠재적으로 농축시키는 것에 대한 추론과 유사한 방식으로, 고도로 농축된 CSTR 생산 생물반응기에 직접적으로 영양분을 공급하는 것은 연결된 시스템이 효과적으로 기능하고 높은 용적 생산성을 달성하는데 중요하다. 매우 묽은 공급 배지는 생물반응기의 유효 희석 속도를 증가시킴으로써 CSTR 생산 생물반응기에서 바이오매스를 희석시킬 수 있다. 전형적으로 최대 배가 시간(doubling time)이 1일에 가깝거나 1일 이상인 포유동물 세포를 이용하면, 1.0 반응기 용적/일(또는 1/일)에 가깝거나 1.0/일 이상인 임의의 효과적인 희석 속도는 CSTR 생산 생물반응기에서 매우 낮은 세포 밀도를 초래할 수 있고, 따라서 연결된 생물반응기 시스템에서의 낮은 생산성을 초래할 수 있다.
본 발명자들이 상기 기술한 예에서, 희석 속도가 0.20 반응기 용적/일 초과(1/일)인 조건 동안에 표 3에 기술된 염수 희석액을 사용하여 CSTR 생산 생물반응기로의 농축된 공급물을 희석시켰다. 도 21은 연결된 생물반응기 시스템을 이용하여 합리적인 용적 생산성이 1일당 0.64 반응기 용적의 높은 희석 속도에서도 달성될 수 있음을 보여준다. 높은 희석 속도는 CSTR에서의 생세포 질량을 희석시키고 생산성을 더 낮추는 경향이 있지만, 높은 희석 속도는 또한 동시에 생물반응기 시스템으로부터 세포-생성된 억제성 화합물을 플러싱(flsuhing)하고, 따라서 세포의 성장 속도를 증가시킨다. 이들 경쟁 인자들은 부분적으로 서로 균형을 이루고, 이는 높은 희석 속도에서의 세포 밀도를 여전히 상당히 높게 유지하도록 하며, 결과적으로 여전히 상당히 높은 용적 생산성을 달성할 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 생산 생물반응기의 희석 속도는 약 0.1용적/일 내지 약 1.25용적/일이다. 다른 실시형태에서, 대상 기술의 생산 생물반응기의 희석 속도는 약 0.2용적/일 내지 약 1.0용적/일; 또는 약 0.2 내지 약 0.75용적/일; 또는 약 0.2용적/일 또는 약 0.65용적/일이다. 다른 실시형태에서, 대상 기술의 생산 생물반응기의 희석 속도는 약 0.1용적/일이거나; 약 0.2용적/일이거나; 약 0.25용적/일이거나; 약 0.3용적/일이거나; 약 0.35용적/일이거나; 약 0.4용적/일이거나; 약 0.45용적/일이거나; 약 0.5용적/일이거나; 약 0.6용적/일이거나; 약 0.7용적/일이거나; 약 0.8용적/일이거나; 약 1.0용적/일이거나; 또는 약 1.25용적/일이다.
0.64 반응기 용적/일에서 생물반응기에서 생성되는 생성물의 평균 체류 시간은 대략 1.56일이다. 이러한 치류 시간은 유가식 생물반응기에서 제조된 생성물의 평균 체류 시간보다 훨씬 더 적다. 이러한 이유로, 연결된 N-1 관류 대 CSTR 생산 생물반응기 시스템은 불안정한 단백질의 경우에 생물반응기 작동의 유가 방식보다 유의한 이점을 가질 수 있다. 추가로, 생산 생물반응기에 부가된 증가된 용적의 염수 희석액의 사용을 통해, 연결된 생물반응기 시스템의 희석 속도는 전체적으로 시스템의 용적 생산성을 과도하게 감소시키지 않으면서 생성물 단백질의 체류 시간을 감소 시키도록 조작될 수 있다. 생산 생물반응기로 직접 흐르는 공급 배지의 농도를 간단히 조작함으로써 동일한 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 한 실시형태에서, 대상 기술의 생산 생물반응기에서의 생성물 체류 시간은 약 1일 내지 약 10일이다. 다른 실시형태에서, 대상 기술의 생산 생물반응기의 생성물 체류 시간은 약 1일, 또는 약 2.0일; 또는 약 2.5일; 또는 약 3.0일; 또는 약 3.5일; 또는 약 4일; 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일 또는 약 10일이다. 다른 실시형태에서, 대상 기술의 생산 생물반응기에서의 세포의 체류 시간은 약 10일 미만이다.
앞서 본문에서 언급한 바와 같이, CSTR 생산 생물반응기에서의 글루코스 이용가능성을 제한하는 전략은 실험 초기에 사용되었다(HIPDOG 기술). 이는 생물반응기에서의 락테이트의 축적을 제한하였다. CSTR에 대해 낮은 희석 속도가 가장 생산성이 높은 것으로 증명되었기 때문에, 산업적 응용 분야에서 즉시 또는 매우 신속하게 희석 속도가 낮은 조건으로 이동시키는 것이 중요할 수 있다. 아마도 첫 번째 세포가 N-1 관류 생물반응기로부터 생산 생물반응기 CSTR로 흐르는 때에 CSTR 생물반응기는 적어도 부분적으로 신선한 기초 배지로 가득찰 것이다. 자유롭게 이용가능한 글루코스의 존재 하의 고도의 증식성 상태에서, 이들 세포는 대량의 락트산을 생성하기 시작할 수 있고, pH 제어를 이용하여 이는 또한 락트산이 중화됨에 따른 높은 삼투압 강도를 의미할 것이다. 생물 반응기가 채워지는 동안 배양 초기에 CSTR에서 축적되거나 그 후에 매우 낮은 희석 속도에서 즉시 생산된 임의의 락테이트(및 이와 관련된 높은 삼투압 강도)는 배양 시스템으로부터 희석되어 나오는 것이 매우 느릴 것이다. 이러한 이유로 CSTR 생산 생물반응기의 초기 착수(startup) 페이즈에서 글루코스의 고급 pH-제어된 전달(HIPDOG)과 같은 글루코스 제한 기술을 이용시 유의한 가치가 있다. 초기 락테이트 생산을 제어하는 몇몇의 방법의 부재 하에, 생산 생물반응기에서 높은 수준의 락테이트가 축적되어 작동의 단지 수일 후에 생산 생물반응기에서의 성장은 거의 또는 전혀 달성되지 않을 것이다. 배양물에서의 CHO 세포가 높은 락테이트 농도에 노출될 때, 때때로 글루코스로부터의 락테이트 생산이 유의하게 상향조절되는 양성 피드백 조건이 발생한다. 이러한 조건은 낮은 희석 속도에서 용적 생산성이 높은 정상-상태의 성취를 유의하게 지연시키거나 심지어 달성불가능하게 만들 수 있다. HIPDOG 글루코스 제한 전략은 현재 실험에서 잘 작동했지만, 낮은 pH 제어 설정점 또는 36.5℃보다 더 낮은 온도로의 이동(shift)은 또한 또는 대안으로 이것이 처음 시작될 때의 시간 동안 CSTR 생산 생물반응기에서의 락테이트 형성을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 보다 낮은 pH 및 보다 낮은 온도 둘 다는 성장을 서행시키고 세포 생산성을 감소시키므로, 이들 설정점 제어 변화의 사용은 락테이트 형성을 제어하는 것에 대한 필요성과 균형을 이루어야만 할 것이다. 최적의 pH 설정점은 이러한 목적을 위해 아마도 7.0 미만, 아마도 6.7 내지 7.0일 것이다. 최적의 온도는 아마도 30 내지 35℃일 것이다.
청구된 방법의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 기술된 실시형태들에 대해 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있음은 당해 분야 숙련가들에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 청구된 방법은 첨부된 청구범위 및 이들의 등가 범위 내에 있는 한, 본원에 기술된 실시형태들의 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.
산업상 이용가능성
본원에 개시된 장치 및 방법은 연결된 관류-대-CSTR 세포 배양 생물 제조에 유용하고, 따라서 재조합 단백질 및/또는 치료학적 단백질을 제조하기 위한 산업적 방법을 개선시키는데 유용하다.
Claims (61)
- (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 목적하는 단백질을 생산하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 방법이 (d) 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 생산 생물반응기가 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR: continuously stirred tank reactor) 생산 생물반응기인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 세포 보유 장치를 갖지 않는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비가 약 1:1 내지 약 1:20 또는 약 1:1 내지 약 1:5 또는 약 1:5인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 접종이 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것인, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 세포 이동이 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출(cell bleed)에 의한 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 세포 이동이 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 제2 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 3주 초과의 기간 동안 또는 4주 초과의 기간 동안 또는 5주 초과의 기간 동안 또는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 수거 단계 (d)가 연속적인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포인, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 적어도 14일의 기간 동안 또는 적어도 20일의 기간 동안 또는 적어도 30일의 기간 동안 매일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖는, 방법.
- 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 매일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖는, 방법.
- (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함하는, 연결된 배양 프로세스. - 제17항에 있어서, 상기 연결된 배양 프로세스가 (d) 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계를 추가로 포함하는, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 연속적 생산 생물반응기가 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기인, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 세포 보유 장치를 갖지 않는, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비가 약 1:1 내지 약 1:20 또는 약 1:1 내지 약 1:5 또는 약 1:5인, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 접종이 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것인, 연결된 배양 프로세스.
- 제22항에 있어서, 상기 세포 이동이 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것인, 연결된 배양 프로세스.
- 제23항에 있어서, 상기 세포 이동이 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지는, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하는, 연결된 배양 프로세스.
- 제25항에 있어서, 상기 제2 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기인, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 3주 초과의 기간 동안 또는 4주 초과의 기간 동안 또는 5주 초과의 기간 동안 또는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하는, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 수거 단계 (d)가 연속적인, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포 , MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포인, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 적어도 14일의 기간 동안 또는 적어도 20일의 기간 동안 또는 적어도 30일의 기간 동안 매일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖는, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖는, 연결된 배양 프로세스.
- 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 매일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖는, 연결된 배양 프로세스.
- 상기 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하기 위한 배양 생물반응기(N-1 생물반응기); 및
상기 배양 생물반응기에 연결되어 있고 상기 배양 생물반응기로부터 세포를 접종물로서 수취하는 생산 생물반응기(N 생물반응기)
를 포함하는, 연결된 배양 시스템으로서,
상기 생산 생물반응기는 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 작동하는, 연결된 배양 시스템. - 제33항에 있어서, 상기 시스템이 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하기 위한 하류 정제 시스템에 연결되어 있는, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 생산 생물반응기가 연속적으로 교반된 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기인, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 세포 보유 장치를 갖지 않는, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비가 약 1:1 내지 약 1:20 또는 약 1:1 내지 약 1:5 또는 약 1:5인, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종이 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것인, 연결된 배양 시스템.
- 제38항에 있어서, 상기 세포 이동이 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것인, 연결된 배양 시스템.
- 제39항에 있어서, 상기 세포 이동이 2분 내지 24시간의 시간 간격마다 또는 이들 사이의 임의의 간격마다 1회의 세포 이동을 포함하는 반-연속적 방식으로 이루어지는, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 제1 배양 생물반응기와 병렬로 작동하고 생산 생물반응기로 이동시키기 위한 접종물을 교대로 생산하는 제2 배양 생물반응기를 포함하는, 연결된 배양 시스템.
- 제41항에 있어서, 상기 제2 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기인, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 3주 초과의 기간 동안 또는 4주 초과의 기간 동안 또는 5주 초과의 기간 동안 또는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하는, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수거가 연속적인, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포인, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 적어도 14일의 기간 동안 또는 적어도 20일의 기간 동안 또는 적어도 30일의 기간 동안 매일 리터당 적어도 0.6그램의 용적 생산성을 갖는, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖는, 연결된 배양 시스템.
- 제33항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 매일 약 1 내지 약 0.1용적의 희석 속도를 갖는, 연결된 배양 시스템.
- (a) 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)에서 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 수득된 세포를 생산 생물반응기(N 생물반응기)에 접종하는 단계; 및
(c) 상기 목적하는 단백질의 생산을 가능하게 하는 조건 하에 상기 생산 생물반응기에서 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생산된 목적하는 단백질. - 제49항에 있어서, 상기 방법이 상기 생산 생물반응기로부터 상기 목적하는 단백질을 수거하는 단계를 추가로 포함하는, 목적하는 단백질.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기이고, 상기 연속적 생산 생물반응기가 연속적으로 교반되는 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기인, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 세포 보유 장치를 갖지 않는, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 생물반응기 대 상기 생산 생물반응기의 용적비가 약 1:1 내지 약 1:20 또는 약 1:1 내지 약 1:5 또는 약 1:5인, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서의 상기 접종이 세포를 상기 배양 생물반응기로부터 상기 생산 생물반응기로 이동시킴에 의한 것인, 목적하는 단백질.
- 제54항에 있어서, 상기 세포 이동이 연속적 또는 반-연속적 방식의 세포 방출에 의한 것인, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 단계 (b)에서 사용하기 위한 배양 세포의 재생 및 연속적 생산을 가능하게 하기 위해 제1 및 제2 배양 생물반응기를 임의로 교차선택하는, 목적하는 단백질.
- 제56항에 있어서, 상기 제2 배양 생물반응기가 연속적 관류 배양 생물반응기인, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 3주 초과의 기간 동안 또는 4주 초과의 기간 동안 또는 5주 초과의 기간 동안 또는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동하는, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 수거 단계 (d)가 연속적인, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적하는 단백질이 항체 또는 융합 단백질인, 목적하는 단백질.
- 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포인, 목적하는 단백질.
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