CN116083345A - 对连续流动搅拌釜反应器细胞培养系统的连接灌注 - Google Patents

对连续流动搅拌釜反应器细胞培养系统的连接灌注 Download PDF

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Abstract

提供了在连接的培养和生产生物反应器系统中的蛋白质生产的方法。此类方法包括与生产生物反应器(N生物反应器)连接的培养生物反应器(N‑1生物反应器)。更具体地，该方法包括(a)在连续灌注培养生物反应器(N‑1生物反应器)中，培养具有编码目的蛋白质的基因的细胞；用从步骤(a)获得的细胞接种连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器(N生物反应器)；并且在允许目的蛋白质产生的条件下，在CSTR生产生物反应器中培养细胞。

Description

对连续流动搅拌釜反应器细胞培养系统的连接灌注
本申请为申请日为2017年01月25日、申请号为201780019302.5、发明名称为“对连续流动搅拌釜反应器细胞培养系统的连接灌注”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
主题技术涉及使用连接的生物反应器系统在培养的动物细胞，优选哺乳动物细胞中的蛋白质生产方法，所述生物反应器系统包括与生产生物反应器(N生物反应器)连接的培养生物反应器(N-1生物反应器)。更具体地，主题技术涉及与恒化器或连续流动搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器连接的连续灌注培养生物反应器。
背景技术
常规灌注细胞培养系统具有例如大体积培养基消耗，达到峰值细胞密度的长时间，以及当以最大规模使用时细胞保留装置的复杂性的缺点。
例如，在WO 2008091113中公开的混合细胞培养系统中，多重CSTR生物反应器串联连接，每个生物反应器使用细胞保留装置(例如，填充床)。该参考文献提示在理想系统中，该系列中的最后一个生物反应器将使用完全细胞保留，但较早的生物反应器将允许一些细胞从生物反应器中排出。在WO 2015003012中公开的混合细胞培养系统中，单个‘护理’或N-1生物反应器定期接种具有细胞保留装置的多重N阶段生产生物反应器。在WO 2015095809中公开的混合细胞培养系统中，N-1灌注生物反应器用于制备用于以补料分批或灌注模式操作的生产生物反应器的接种物。然而，该参考文献中的所有数据和实施例提示N-1是操作短时间段的灌注生物反应器，产生用于接种生产生物反应器的单个接种物，所述生产生物反应器作为补料分批操作。另外，本申请的作者没有提示生产生物反应器可以作为恒化器(或CSTR)操作而无细胞保留，其对下游纯化操作产生连续收获物。
细胞保留系统难以操作和设计用于以大规模(>1,000L)使用。例如，几乎任何使用膜的细胞保留装置(如目前以大规模使用的许多细胞保留装置一样)最终被细胞碎片堵塞。这种堵塞更可能对于低细胞活力培养物发生，因为细胞更脆弱，并且形成的微粒经常在尺寸上与膜的孔(0.2-5微米)相似。另外，当膜被细胞碎片堵塞时，它们也开始有效地充当超滤装置，以不易预测或可重复的方式将高分子量产物蛋白质保留在生物反应器内。这是一个缺点，因为在连续灌注生物反应器系统中，有利的是使目的产物在无细胞收获物中从生物反应器中连续取出，并且以一致的方式递送到下游操作。
因此，常规的连续灌注细胞培养系统通常具有低于2,000L的工作体积，并且如果在其中生产率最高的条件(例如高活细胞密度和高灌注速率)下操作，则由于堵塞和产物保留(超滤)，需要频繁更换掉基于膜的细胞保留装置。另外，能够处理非常大体积的无细胞培养收获物的细胞保留装置可能是非常复杂(例如许多活动零件)且昂贵的，通过过度的剪切力对细胞造成损害且易于故障。由于细胞保留装置通常在生物反应器外部，因此有效的清洁和灭菌在大规模下也可能是挑战性的。这些因素可以导致高操作成本，显著的生产力损失和目的蛋白质生产中的无效率。因此，仍然需要克服与当前常规灌注培养系统相关的限制的替代细胞培养方法或系统。
发明内容
例如，根据下文列出的各个方面和实施方案说明了主题技术。
在一个方面，主题技术涉及产生目的蛋白质的方法，其包括：(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞；(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；并且(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在生产生物反应器中培养细胞。在直接或间接涉及该方面的一个或多个实施方案中，该方法进一步包括步骤(d)从生产生物反应器中收获目的蛋白质；培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器，并且生产生物反应器是连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器；生产生物反应器不具有细胞保留装置；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:5；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:5；步骤(b)中的接种是通过将细胞从培养生物反应器转移到生产生物反应器中；细胞转移是通过以连续或半连续模式的细胞流出(cell bleed)；细胞转移处于半连续模式，包括以每2分钟至24小时的时间段或其间的任何间隔一次的细胞转移；步骤(a)任选地在第一培养生物反应器和第二培养生物反应器之间交替，以允许更新和连续生产用于步骤(b)中的培养细胞；第二培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器；生产生物反应器连续操作大于3周的时期；生产生物反应器连续操作大于4周的时期；生产生物反应器连续操作大于5周的时期；生产生物反应器连续操作大于6周的时期；收获步骤(d)是连续的；细胞为CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、NSO细胞、PER.C6细胞、Sp2/0细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞或COS细胞；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少14天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少20天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少30天的时期；生产生物反应器具有约1至约10天的产物停留时间；生产生物反应器具有约1至约0.1体积/天的稀释速率；生产生物反应器用稀释溶液进料；稀释溶液是水或盐水。
在另一个方面，主题技术涉及连接的培养方法，其包括：(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞；(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；并且(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在生产生物反应器中培养细胞。在直接或间接涉及该方面的一个或多个实施方案中，连接的培养方法进一步包括步骤(d)从生产生物反应器中收获目的蛋白质；培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器，并且连续生产生物反应器是连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器；生产生物反应器不具有细胞保留装置；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:5；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:5；步骤(b)中的接种是通过将细胞从培养生物反应器转移到生产生物反应器中；细胞转移是通过以连续或半连续模式的细胞流出；细胞转移处于半连续模式，包括以每2分钟至24小时的时间段或其间的任何间隔一次的细胞转移；步骤(a)任选地在第一培养生物反应器和第二培养生物反应器之间交替，以允许更新和连续生产用于步骤(b)中的培养细胞；第二培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器；生产生物反应器连续操作大于3周的时期；生产生物反应器连续操作大于4周的时期；生产生物反应器连续操作大于5周的时期；生产生物反应器连续操作大于6周的时期；收获步骤(d)是连续的；细胞为CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、NSO细胞、PER.C6细胞、Sp2/0细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞或COS细胞；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少14天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少20天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少30天的时期；生产生物反应器具有约1至约10天的产物停留时间；生产生物反应器具有约1至约0.1体积/天的稀释速率；生产生物反应器用稀释溶液进料；稀释溶液是水或盐水。
在另一个方面，主题技术涉及连接的培养系统，其包括：用于培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞的培养生物反应器(N-1生物反应器)；以及生产生物反应器(N生物反应器)，其与培养生物反应器连接并且从培养生物反应器接收细胞作为接种物，其中所述生产生物反应器在允许目的蛋白质产生的条件下操作。在直接或间接涉及该方面的一个或多个实施方案中，该系统与下游纯化系统连接，用于从生产生物反应器中收获目的蛋白质；培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器，并且生产生物反应器是连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器；生产生物反应器不具有细胞保留装置；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:5；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:5；接种是通过将细胞从培养生物反应器转移到生产生物反应器中；细胞转移是通过以连续或半连续模式的细胞流出；细胞转移处于半连续模式，包括以每2分钟至24小时的时间段或其间的任何间隔一次的细胞转移；该系统包括第二培养生物反应器，其与第一培养生物反应器平行操作，并且交替产生接种物用于转移至生产生物反应器；第二培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器；生产生物反应器连续操作大于3周的时期；生产生物反应器连续操作大于4周的时期；生产生物反应器连续操作大于5周的时期；生产生物反应器连续操作大于6周的时期；收获是连续的；细胞为CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、NSO细胞、PER.C6细胞、Sp2/0细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞或COS细胞；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少14天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少20天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少30天的时期；生产生物反应器具有约1至约10天的产物停留时间；生产生物反应器具有约1至约0.1体积/天的稀释速率；生产生物反应器用稀释溶液进料；稀释溶液是水或盐水。
在另一个方面，主题技术涉及通过包括以下的方法产生的目的蛋白质：(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞；(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；并且(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在生产生物反应器中培养细胞。在直接或间接涉及该方面的一个或多个实施方案中，该方法进一步包括步骤(d)从生产生物反应器中收获目的蛋白质；培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器，并且生产生物反应器是连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器；生产生物反应器不具有细胞保留装置；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:5；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:5；步骤(b)中的接种是通过将细胞从培养生物反应器转移到生产生物反应器中；细胞转移是通过以连续或半连续模式的细胞流出；步骤(a)任选地在第一培养生物反应器和第二培养生物反应器之间交替，以允许更新和连续生产用于步骤(b)中的培养细胞；第二培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器；生产生物反应器连续操作大于3周的时期；生产生物反应器连续操作大于4周的时期；生产生物反应器连续操作大于5周的时期；生产生物反应器连续操作大于6周的时期；收获步骤(d)是连续的；目的蛋白质是抗体或融合蛋白；细胞为CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、NSO细胞、PER.C6细胞、Sp2/0细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞或COS细胞；生产生物反应器用稀释溶液进料；稀释溶液是水或盐水。
根据下述附图和详细描述，主题技术的另外优点对于本领域技术人员将变得显而易见。附图和描述本质上视为说明性的，而不是限制性的。
附图说明
当参考附图阅读下述详细描述时，可以更好地理解所请求保护的方法、仪器和/或系统的这些及其他特点、方面和优点：
图1是示出根据在本申请的实验部分中详细描述的一个实施方案的生物反应器配置的示例性图解。在该配置中，使用具有细胞保留的灌注的N-1生物反应器将连续细胞供应至作为连续流动搅拌釜反应器(CSTR)或恒化器操作的第二生物反应器。CSTR还将接受另外的浓缩营养物进料流。CSTR没有细胞保留系统，并且可以连续收获。在以实验室规模进行的实验中，细胞保留装置由表面积为850cm2的0.2微米的微过滤中空筒(General ElectricCFP-2-E-4X2MA)组成。细胞通过使用6.4mm ID和12.7mm OD管道的Watson-Marlow蠕动泵，以～120mL/分钟循环通过中空纤维筒的管腔侧。
图2A是显示如通过如本申请的实验部分中所述的台盼蓝排除测量的活细胞密度的图。空心方块表示N-1灌注反应器中的细胞密度。实心方块表示CSTR或生产生物反应器中的细胞密度。虚线垂直线表示如表2中所示，流入N-1灌注反应器内的略微不同的灌注培养基组成的阶跃变化。
图2B是显示如通过台盼蓝排除测量的活细胞百分比的图。空心方块表示N-1灌注反应器中的细胞活力。实心方块表示CSTR或生产生物反应器中的细胞活力。
图3示出了N-1生物反应器的灌注速率和细胞流出速率，以及生产(CSTR)生物反应器的稀释速率。灌注速率(空心方块)在反应器体积(RV)/天中列出，并且对应于左手y轴。灌注速率是流入N-1灌注生物反应器内的培养基体积/天。细胞流出速率(实心方块)是每天从N-1灌注生物反应器中(连续)取出的含有细胞的培养物体积，并且对应于右手y轴。稀释速率(实心三角形)是每天从生产(CSTR)生物反应器中(连续)取出的含有细胞的体积(离开CSTR的唯一流)分数，并且对应于右手y轴。
图4是显示N-1(空心方块)和生产(CSTR，实心方块)生物反应器中的残留葡萄糖浓度的图。
图5是显示N-1(空心方块)和生产(CSTR，实心方块)生物反应器中的乳酸盐浓度的图。
图6是显示N-1生物反应器(实心方块)的大量流体、离开N-1生物反应器系统的渗透物(空心方块)、以及连续离开生产生物反应器的大量流体(CSTR，实心三角形)中的抗体或产物浓度的图。
图7是显示以每反应器体积每天产生的产物克数(实心三角形)表示的，CSTR生产生物反应器的体积生产率的图。
图8是显示根据时间的两个N-1灌注生物反应器的细胞密度的图。关于第1个N-1灌注反应器的靶稳态活细胞密度为～40x106个细胞/mL，并且关于第2个N-1灌注反应器的靶稳态活细胞密度为～80x106个细胞/mL。如实施例2中更详细地描述的，在该配置中，这些N-1灌注生物反应器中的每一个独立地进料到分开的CSTR生产生物反应器内。
图9是显示根据时间的两个N-1灌注生物反应器的细胞活力的图。
图10是显示关于两个连续灌注生物反应器(空心符号)和作为CSTR操作的两个生产生物反应器(实心符号)的根据时间的残留葡萄糖的图，每个生产生物反应器连接到灌注生物反应器之一。
图11是显示关于N-1连续灌注生物反应器(空心符号)和作为CSTR操作的生产生物反应器(实心符号)的根据时间的乳酸盐浓度的图。
图12是显示N-1连续灌注生物反应器的灌注速率的图-使用如实施例2中所述的HIPCOP技术通过细胞控制灌注速率。
图13是显示两个N-1连续灌注生物反应器的细胞流出速率的图。
图14是显示在作为连续流动搅拌釜反应器(CSTR)操作的生产生物反应器中，根据时间的活细胞密度的图。在图上指出其中稀释速率保持恒定的时间间隔。还在图上指出N-1灌注生物反应器与CSTR的模拟体积比。
图15是显示根据时间，作为连续流动搅拌釜反应器(CSTR)操作的生产生物反应器中的每一个的稀释速率的曲线图。
图16是显示在作为连续流动搅拌釜反应器(CSTR)操作的生产生物反应器中，根据时间如通过台盼蓝染料排除测量的细胞活力的图。
图17是显示对于作为连续流动搅拌釜反应器(CSTR)操作的生产生物反应器，根据时间的产物浓度或滴度的图。在图上指出其中稀释速率保持恒定的时间间隔。
图18是显示关于N-1连续灌注生物反应器(空心符号)和作为CSTR(实心符号)操作的生产生物反应器，根据时间的同渗重摩的图。在图上指出的是在其下灌注培养基更换为含有DL形式的乳酸钠的时间点。
图19是显示当视为独立操作时的N-1连续灌注生物反应器的瞬时体积生产率的图。计算值假定产物从细胞流出物和离开细胞保留系统的无细胞渗透物两者中回收。
图20是显示N-1灌注反应器和离开细胞保留装置的无细胞渗透物中的产物(抗体)浓度的图。
图21是显示根据生产CSTR稀释速率绘制的，与CSTR系统连接的N-1连续灌注生物反应器的稳态体积生产率的图。对于几种条件指出了N-1连续灌注生物反应器与生产CSTR的体积比。未具体指出的所有点都使用1:5的体积比。
具体实施方式
在下述详细描述中，阐述了众多具体细节，以提供主题技术的完全理解。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是，主题技术可以无需这些具体细节中的一些进行实践。在其他情况下，没有详细显示众所周知的结构和技术，以免模糊主题技术。
为了促进主题技术的理解，下文定义了许多术语和短语：
定义：
除非另有说明，否则如本文使用的，语法冠词“一个/种”、“一个”、“一种”和“该/所述”预期包括“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”。因此，冠词在本文中用于指冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。例如，“组分”意指一个或多个组分，并且因此，考虑了多于一个组件，并且可以在所述实施方案的实现中采用或使用。
术语“约”一般指测量中的轻微误差，经常陈述为包含特定置信水平内的真值的一系列值(对于68％ C.I，通常为±1)。术语“约”也可以描述为整数和整数±20％的值。
如本文可互换使用的，术语“生产生物反应器”、或“N生物反应器”、或“CSTR生物反应器”、或“CSTR生产生物反应器”指不利用细胞保留系统或装置的生物反应器(例如，连续流动搅拌釜反应器(CSTR)。生产生物反应器在下游与一个或多个培养生物反应器连接，并且从培养生物反应器接收接种物。生产生物反应器是均匀混合的，并且具有等价于流体输出的流体流入，因此，维持接近恒定的体积。当操作足够长的时间段时，此类生产生物反应器经常(尽管不一定)实现‘化学静态’或‘稳态’环境，这意味着细胞密度和培养物的其他方面(例如，营养物的浓度等)将达到稳定(即稳态或静止)状态，并且因此通常也称为‘恒化器’。从生产生物反应器流入和/或流出的流体可以是独立连续的或半连续的。此类生产生物反应器连续操作等于或大于3、4、5或6周的时期。
在一个实施方案中，主题技术的CSTR生产生物反应器可以无限地持续操作，或者只要培养的细胞保持遗传稳定。在另一个实施方案中，主题技术的CSTR生产生物反应器与至少两个培养生物反应器连接，所述至少两个培养生物反应器交替将新鲜(即，遗传稳定的)接种物进料给生产生物反应器，并且像这样，生产生物反应器持续运行长时间段，例如，等于或大于1、2、3、4、5、6个月或无限的时间段，只要进料给它的培养细胞保持遗传稳定。如果没有细胞保留装置，来自CSTR生产生物反应器的流体流出物包括细胞、细胞碎片和产物的混合物。在一个实施方案中，在转移至下一单元操作(例如蛋白A柱)之前，将该流体流出物导向细胞分离装置(例如，线内离心机)。以这种方式与剩余的流体流出物分离的细胞和细胞碎片将被弃去，并且不返回到生产生物反应器。
如本文使用的，术语“细胞保留系统”或“细胞保留装置”指在生物反应器内选择性地保留活细胞的装置，使得离开生物反应器的流体中的细胞密度低于生物反应器内的流体中的细胞密度。在这个意义上，细胞保留系统或装置不同于上述细胞分离装置。
如本文可互换使用的，术语“培养生物反应器”、或“N-1生物反应器”、或“N-1灌注生物反应器”指用于培养细胞的灌注培养或灌注生物反应器(例如，连续灌注培养生物反应器)，所述细胞将用于接种生产生物反应器。此类培养生物反应器具有细胞保留系统。存在在工业中使用的许多不同形式的细胞保留系统。这些细胞保留系统中的一些从离开生物反应器系统的液体中去除100％的活细胞，然而许多其他细胞保留系统可以从离开生物反应器系统的液体中仅去除一些可变部分的细胞。进出培养生物反应器的液体转移可以是连续的或半连续的。特别地，从培养生物反应器到生产生物反应器的细胞流出或转移可以是连续的或半连续的。
在转进和/或转出生物反应器的液体转移的背景下，如本文使用的，术语“半连续的”意指‘周期性的’，或指其中液体(例如，单独的培养基和/或具有细胞，细胞流出物)每隔长时间段加入生物反应器中和/或从生物反应器中取出一次。例如，每1、2、5、10、15、30、45或60分钟一次，或每小时一次，或每2-3小时一次，或每隔1分钟至24小时的长时间段一次，对于从几秒钟(例如1秒、2秒、5秒、10秒、20秒或60秒)延伸到几分钟(例如2分钟、5分钟、10分钟、25分钟、50分钟、120分钟或240分钟)的时期，一股液体从生物反应器转移和/或转移到生物反应器。在该上下文中，术语“连续”指恒定或非周期性的液体转移。在一个实施方案中，以连续或半连续模式从培养生物反应器到生产生物反应器的细胞流出/转移速率小于培养生物反应器中细胞的生长速率。在另一个实施方案中，从培养生物反应器到生产生物反应器的细胞流出/转移速率为约0.1反应器体积/天(RV/天)至约1.3RV/天。在另一个实施方案中，以连续或半连续模式，从培养生物反应器到生产生物反应器的细胞流出/转移速率小于1.3RV/天、或小于1.0RV/天、或小于0.8RV/天、或小于0.6RV/天、或小于0.4RV/天、或小于0.2RV/天至约0.1RV/天，或在约0.1至约1.3RV/天的范围内变化。
使用细胞保留系统对哺乳动物细胞的灌注培养可提供超过分批、补料分批或恒化器/CSTR培养的显著生产率优点。因为细胞保留在生物反应器系统中，所以它们可以用大体积的培养基灌注，并且可以达到高得多的细胞密度，而无需担心在高稀释速率下CSTR中将发生的洗出。另外，当连续灌注生物反应器连接到连续的下游纯化串(train)时，纯化串的大小可以急剧降低，这将通过去除保持步骤(和所需的罐)，并且降低工序中的池的采样和分析来简化总体操作。然而，特别是当以大规模(>1,000L)实施时，哺乳动物细胞的灌注培养也具有许多缺点。
通常，大多数灌注培养物操作长时间段(>3周)。这要求细胞系是特别遗传稳定的，使得细胞继续产生目的蛋白质，并且表观遗传变化的速率足够慢。这些长持续时间的灌注培养可以被定义为“可持续的”灌注培养，因为只要培养物的遗传概况并未远远漂移到足以负面影响目的蛋白质的生产率或产物质量概况(规格)，培养物就可以视为能够运行。在此类可持续的灌注培养中，有必要维持高细胞活力，并且这通常需要细胞继续维持非零生长速率以继续分裂，以弥补死于细胞凋亡、或者剪切或者氧化或其他应力的细胞。在大多数情况下，需要有限的细胞流出速率(取出含有细胞的完整培养液)，以维持一些细胞生长并且从培养物中连续去除一些无活力的生物量。这种‘细胞流出速率’通常指依据每天去除的培养物体积的分数，或依据倒数天数。通常细胞流出速率在0.05-0.5/天的范围内，其中较高的比率一般产生用于较高的细胞活力、较高的细胞生长速率和更可持续的灌注系统的条件，但同时促进较低的细胞密度和一般较低体积生产率的灌注培养物。
另外，取决于细胞系，当细胞的生长速率很低时，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞培养物通常具有更高的比生产率(每个细胞每次产生的蛋白质质量)。这可能是由于细胞将其资源中的更多贡献给持续的细胞分裂，与当生长速率很高时产生目的蛋白质相反。补料分批培养是用于大规模生产CHO细胞培养物的最常见操作模式之一，并且通常具有短时期的细胞生长，随后为在其中产生大部分产物的静止期中的几天。结果是其中培养物的时期分开并且关于每个时期的条件得到优化的培养系统存在优点；一个时期具有高细胞生长速率以快速获得高细胞密度，并且一个分开的时期具有接近零的细胞生长速率，但具有更高水平的细胞比生产率。
连续灌注系统可能难以以大规模(>1,000L)实施，因为细胞保留系统在大规模下不一定表现良好。另外，几乎任何使用膜的细胞保留装置(如目前以大规模使用的许多细胞保留装置一样)最终被细胞碎片堵塞。这种堵塞更可能对于低细胞活力培养物发生，因为细胞更脆弱，并且形成的微粒经常在尺寸上与膜的孔(0.2微米)相似。因此，最小化在其中进行灌注的容器的尺寸，并且保持细胞活力高以最小化关于膜结垢的问题是有利的。
如上所述，细胞微粒可以缓慢地堵塞基于膜的细胞保留系统，其对长期灌注培养利用微过滤膜。细胞裂解以及宿主细胞蛋白质和目的产物相互作用且形成更高分子量的物质也是可能的。这些物质也可以促成称为凝胶层形成或产物筛分的现象。在这些条件下，利用微过滤膜的细胞保留装置可以开始充当超滤膜，并且选择性地保留生物反应器系统内的高分子量蛋白质。因为免疫球蛋白分子(细胞培养中产生的最常见蛋白质之一)具有相对较高的分子量(～150,000Da及以上)，所以产物筛分已成为大规模灌注系统的主要问题。通常连续灌注系统与连续的下游纯化系统连接，所以目的蛋白质必须从生物反应器中流出并且该蛋白质理想地具有一致的数量和质量。目的蛋白质保留的最小化对于最小化下游系统的大小是特别重要的，并且当目的蛋白质不稳定并且可能因过度暴露于生物反应器内的条件而降解时是关键的。
出于上述许多原因，以下述方式且如图1所示连续操作连接在一起的两个生物反应器具有显著的优点。第一生物反应器作为利用高灌注速率的连续灌注培养操作，其允许高细胞密度。在该反应器中，还将使用高细胞流出速率，其将维持高细胞生长速率并且因此也维持高细胞活力。第二生物反应器，生产生物反应器，可以有利地是第一生物反应器体积的4-5倍(在用于N-1和生产生物反应器的大规模设施中使用的典型体积比)，并且根据主题技术的优选模式-作为恒化器(或连续搅拌釜反应器[CSTR])反应器操作，而无需细胞保留系统。术语CSTR或恒化器可互换使用，以在本文件自始至终指生产生物反应器，因为在大多数情况下，CSTR将快速达到稳态或‘化学静态’条件，其中大多数或所有细胞培养参数将达到几乎恒定的值。在一个实施方案中，N-1连续灌注培养生物反应器与CSTR生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20。在另一个实施方案中，N-1连续灌注培养生物反应器与CSTR生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:5。在另一个实施方案中，N-1连续灌注培养生物反应器与CSTR生产生物反应器的体积比为约1:10。在另一个实施方案中，N-1连续灌注培养生物反应器与CSTR生产生物反应器的体积比为约1:4。
在第一个方面，主题技术涉及产生目的蛋白质的方法，其包括：(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包括编码目的蛋白质的基因的细胞；(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；并且(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在生产生物反应器中培养细胞。
在第二个方面，主题技术涉及连接的培养方法，其包括：(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包括编码目的蛋白质的基因的细胞；(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；并且(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在生产生物反应器中培养细胞。
在第三个方面，主题技术涉及连接的培养系统，其包括：用于培养包括编码目的蛋白质的基因的细胞的培养生物反应器(N-1生物反应器)；以及生产生物反应器(N生物反应器)，其与培养生物反应器连接并且从培养生物反应器接收细胞作为接种物，其中所述生产生物反应器在允许目的蛋白质产生的条件下操作。
在第四个方面，主题技术涉及通过包括以下的方法产生的目的蛋白质：(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包括编码目的蛋白质的基因的细胞；(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；并且(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在生产生物反应器中培养细胞。
在直接或间接涉及上述方面中任一的一个或多个实施方案中，所述方法、过程或系统进一步包括步骤(d)从生产生物反应器中收获目的蛋白质；培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器，并且生产生物反应器是连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器；生产生物反应器不具有细胞保留装置；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:5；培养生物反应器与生产生物反应器的体积比为约1:4；步骤(b)中的接种是通过将细胞从培养生物反应器转移到生产生物反应器中；细胞转移是通过以连续或半连续模式的细胞流出；细胞转移处于半连续模式，包括以每2分钟至24小时的时间段或其间的任何间隔一次的细胞转移；步骤(a)任选地在第一培养生物反应器和第二培养生物反应器之间交替，以允许更新和连续生产用于步骤(b)中的培养细胞；第二培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器；生产生物反应器连续操作大于3周的时期；生产生物反应器连续操作大于4周的时期；生产生物反应器连续操作大于5周的时期；生产生物反应器连续操作大于6周的时期；收获步骤(d)是连续的；细胞为例如CHO细胞、HEK-293细胞、VERO细胞、NSO细胞、PER.C6细胞、Sp2/0细胞、BHK细胞、MDCK细胞、MDBK细胞或COS细胞或由其遗传衍生的任何细胞，如例如具有特定代谢条件和/或选择系统如谷氨酰胺选择的衍生物，所述遗传衍生的细胞和/或代谢条件和/或选择系统原则上是本领域技术人员已知的；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少14天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少20天的时期；生产生物反应器具有至少0.6克/升/天的体积生产率，至少30天的时期；生产生物反应器具有约1至约10天的产物停留时间；生产生物反应器具有约1至约0.1体积/天的稀释速率。
可以用于本发明的哺乳动物细胞的非限制性实例概括于表1中。
表1：合适的示例性哺乳动物生产细胞系
Figure BDA0004142268040000101
Figure BDA0004142268040000111
优先在允许细胞增殖的条件下培养所述生产细胞。此外，所述生产细胞优先在有利于所需基因和/或目的蛋白质表达的条件下培养。然后从细胞和/或细胞培养上清液中分离目的蛋白质。优选地，目的蛋白质作为分泌的多肽从培养基中回收，或者如果没有分泌信号而表达，则它可以从宿主细胞裂解产物中回收。
来自N-1生物反应器的培养物将以连续且固定的流速进入生产生物反应器，所述流速将等于N-1生物反应器的细胞流出速率。另外，生产生物反应器将具有营养培养基的连续进料，因为该生物反应器中的细胞将继续代谢、产生产物、且可能经历一些有限的细胞分裂。两个生物反应器的工作体积均可能保持恒定，因此生产生物反应器的有效稀释速率将由N-1连续细胞流出的流动和营养培养基的连续进料以及直接加入生产反应器中的任何pH控制滴定剂决定。
此类生物反应器系统可以减轻当前连续灌注生物反应器的许多问题。灌注生物反应器及其相关的细胞保留系统可能明显更简单操作，因为它们将以生产生物反应器的大约五分之一的规模操作。如果在细胞保留装置中发生凝胶层/产物筛分，则这将仅增加系统的总体生产率，因为现在在N-1生物反应器中生成的目的蛋白质将流入生产生物反应器内，且最终进入下游纯化过程，而不是与无细胞渗透物一起排出，如图1中所示。
在其中细胞系并非足够遗传稳定以用于长期操作的情况下，将使用第二N-1生物反应器，其将用从冷冻小瓶中扩增的新鲜细胞的接种物定期开始，并且一旦该生物反应器已达到适当的细胞密度，第二N-1生物反应器就可以取代第一N-1生物反应器，同时取下第一N-1生物反应器用于清洁和重新灭菌。N-1培养生物反应器中的细胞密度可以根据它与之连接的生产生物反应器的大小而变化。在一些实施方案中，培养生物反应器中的细胞密度为约10x106/升或更高、或约20x106/升或更高、或约40x106/升或更高、或在10x106和200x106/升之间、或在40x106至120x106/升之间、或为在这些范围中任一内的特定密度。因为生产生物反应器中的细胞分裂可能很低，所以这将允许产生蛋白质的细胞由遗传上更年轻的细胞群体的半连续更新。然后，生产生物反应器可能能够以最小的中断且以高细胞密度和高生产率连续操作，每次对下游纯化操作产生具有一致质量参数的进料流数月。因此，在一个实施方案中，主题技术的连接细胞培养系统包括N-1连续灌注培养生物反应器(N-1生物反应器)，其中包括编码目的蛋白质的基因的细胞在它们转移至没有细胞保留装置的CSTR生产生物反应器之前进行培养。在另一个实施方案中，主题技术的连接细胞培养系统包括两个N-1培养生物反应器，其交替操作以产生培养细胞用于转移至CSTR生产生物反应器。在另一个实施方案中，主题技术的N-1连续灌注培养生物反应器以下述模式操作：Biotechnol Bioeng.2011Jun；108(6):1328-37中描述的葡萄糖的高端pH控制(HIPDOG)，或用于描述这种方法、名称为“Cell-Controlled Perfusion in Continuous Culture”的共同未决申请WO 2016/196261中描述的灌注速率的高端pH控制(HIPCOP)。
在低生长速率下具有较高比生产率的细胞系，或者需要不同的细胞培养环境条件以是高生产率的或产生具有特定产物质量特征的产物的细胞，应该特别受益于此类生物反应器配置，因为很可能生产生物反应器中的生长速率将非常低，并且更类似于在补料分批生物反应器的后期阶段中通常实现的条件。这也可能意味着在这种连接的连续N-1至CSTR生产生物反应器中产生的目的蛋白质的产物质量可能更类似于补料分批生产的蛋白质的产物质量。因此，在一个实施方案中，CSTR生产生物反应器在促进最高细胞生产率的条件下操作，这在某些情况下也可能是减缓细胞生长的条件。为了实现高生产率条件，可以向CSTR生产生物反应器中添加改善每细胞生产率但减缓或停止生长的已知化学品。可替代地，CSTR生物反应器可以例如在低pH或高pH或低温(具有Cu的添加、低Ca、半乳糖的添加等)下操作，这有益于获得产生具有特别质量属性的蛋白质的细胞，但那些相同的条件不允许高速率的细胞生长。
如上所述，细胞比生产率在某些情况下可能与生产(CSTR)生物反应器中细胞的生长速率成反比。以高稀释速率操作的CSTR应该导致更高的生长速率，因为抑制性代谢产物将更有效地从生物反应器中冲洗出来。CSTR的稀释速率将取决于来自N-1连续灌注生物反应器的细胞流出速率、以及直接进入CSTR的进料速率和用于pH控制的任何滴定剂。操纵对CSTR的进料培养基的浓度将允许平衡最佳生长、营养物可用性和从系统中冲洗的抑制剂代谢产物。其中许多是相关的多重因素可能促成组合的N-1连续灌注和CSTR系统的最大生产率，包括两个生物反应器中细胞密度和细胞的生长速率、N-1中的灌注速率以及CSTR的稀释速率。通过使用单一浓缩进料培养基操纵CSTR的稀释速率，并且根据需要用水或与饱和盐水溶液混合的水稀释该培养基是有利的。用可变浓度的进料培养基控制稀释速率也可以允许控制从系统产生的重组蛋白的停留时间。高稀释速率将导致低产物停留时间，并且对于高度不稳定的蛋白质可能是有利的。
工业中的许多目前正在探索使用细胞保留/灌注生物反应器作为用于哺乳动物细胞培养物的生产系统。此类系统增加了体积生产率，并且使得连续的下游纯化串成为可能。因为与作为生产生物反应器的连续灌注生物反应器一样，本文工作中所述的与恒化器或CSTR生产生物反应器连接的N-1灌注生物反应器将继续生成对下游操作恒定的产物流，可以继续实现更小和连续的下游操作的优点。
另外，主题技术涉及通过如上所述的方法产生的目的蛋白质。此类目的蛋白质包括但不限于抗体或融合蛋白，例如Fc-融合蛋白。其他可以是例如酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的任何其他多肽和支架。其他目的重组蛋白例如但不限于胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子例如白细胞介素(IL)。
优选的重组分泌的治疗性蛋白质是抗体或其片段或衍生物。因此，本发明可以有利地用于产生抗体，例如单克隆抗体、多特异性抗体或其片段，优选单克隆抗体、双特异性抗体或其片段。抗体片段包括例如“Fab片段”(片段抗原结合＝Fab)。Fab片段由两条链的可变区组成，所述可变区由相邻的恒定区保持在一起。这些可以通过例如用木瓜蛋白酶的蛋白酶消化从常规抗体形成，但也可以通过基因工程产生类似的Fab片段。其他抗体片段包括F(ab')2片段，其可以通过胃蛋白酶的蛋白水解切割来制备。
使用基因工程方法，能够产生缩短的抗体片段，其仅由重链(VH)和轻链(VL)的可变区组成。这些被称为Fv片段(片段可变＝可变部分的片段)。因为这些Fv片段缺乏通过恒定链的半胱氨酸的两条链的共价键合，所以Fv片段经常是稳定的。通过例如具有10至30个氨基酸，优选15个氨基酸的短肽片段，将重链和轻链的可变区连接是有利的。以这种方式，获得通过肽接头连接的由VH和VL组成的单条肽链。这种抗体蛋白质被称为单链-Fv(scFv)。scFv-抗体蛋白的实例是本领域技术人员已知的。根据本发明的优选分泌的重组治疗性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体通常在一个分子中组合对于靶细胞(例如恶性B细胞)和效应细胞(例如T细胞、NK细胞或巨噬细胞)的抗原结合特异性。示例性双特异性抗体是双抗体、BiTE(双特异性T细胞接合体)形式和DART(双重亲和性再靶向)形式，但不限于此。在本发明的上下文中还预期的是微型抗体。通过微型抗体，技术人员意指二价同型二聚体scFv衍生物。
重组分泌的治疗性蛋白质，尤其是抗体、抗体片段或Fc-融合蛋白优选作为分泌的多肽从培养基中回收/分离。有必要从其他重组蛋白和宿主细胞蛋白中纯化重组分泌的治疗性蛋白，以获得重组分泌的治疗性蛋白的基本上同质的制剂。作为第一步，从培养基或裂解产物中去除细胞和/或微粒细胞碎片。此外，例如通过在免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex色谱以及在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱，从污染物可溶性蛋白质、多肽和核酸中纯化重组分泌的治疗性蛋白质。用于纯化由宿主细胞表达的异源蛋白质的方法是本领域已知的。
实施例
实施例1应用进料CSTR生产生物反应器(以1-2升规模)的连续N-1灌注生物反应器，用CHO细胞生产人源化IgG
图1显示了在实验中使用的两阶段连接的生物反应器系统的简图。出于实验目的，包括灌注回路(细胞保留系统)的N-1灌注生物反应器工作体积为1.25升，并且生产生物反应器的工作体积为1.0升。在工业环境中的全规模下，考虑N-1生物反应器将为生产(CSTR或恒化器)生物反应器体积的大约五分之一。出于这个原因，操作实验生物反应器以模拟此类体积比。这意味着来自N-1灌注生物反应器的大部分细胞流出物(～81％的总细胞流出物)被送去排出。仅将适当体积(总体的～19％)的细胞流出物泵送到生产生物反应器内。该规则的唯一例外发生在生产(CSTR)生物反应器操作的前3天，其中所有来自N-1的细胞流出物被加入生产生物反应器中。这允许生产生物反应器以比用其他方法发生略微更快地达到高密度。
图2a最初仅显示了N-1灌注生物反应器细胞密度。该密度快速增加至大约40x106个活细胞/mL的靶密度，这之后细胞流出起始并且在培养过程中手动调整，以在N-1生物反应器中获得大约40x106个活细胞/mL的恒定活细胞密度。如图3中所示，对于大多数实验，N-1灌注生物反应器的细胞流出速率为大约0.4/天，或每天取出0.4反应器体积。
N-1灌注生物反应器使用基于pH的反馈机制，其允许培养物确定其自身的灌注速率。灌注培养基含有少量的L-乳酸钠(在表2中列出)。
表2列出了用于N-1生物反应器的灌注培养基的组成的细节。
表2.N-1生物传感器中的灌注培养基的组成。
Figure BDA0004142268040000141
该培养物通过开始从大量培养物中摄取乳酸来发出缺乏可用的葡萄糖的‘信号’。通过细胞从大量培养液中去除乳酸导致生物反应器的pH升高，这依次又激活泵，所述泵将含有葡萄糖的灌注培养基递送到N-1灌注生物反应器，从而增加培养物的灌注速率(水平控制器通过中空纤维细胞保留装置的壳侧，从培养物中去除无细胞培养基[渗透物]，以维持恒定的生物反应器体积)。当培养物中的细胞开始摄取正在递送的过量葡萄糖时，其中的一部分被细胞转换为乳酸，当所述乳酸从细胞中分泌时，它随后压制大量培养物pH，这依次又促使pH控制器停用灌注培养基添加泵(也依次又停用渗透泵)。该控制方案在实验过程期间每几分钟作为循环反复发生。关于该方法的描述，参见名称为“Cell-ControlledPerfusion in Continuous Culture”的共同未决申请号WO 2016/196261。简言之，在共同未决申请号WO 2016/196261中描述的方法中，用于打开和关闭灌注泵、新鲜培养基和渗透泵的pH触发器设为预定值。该预定值为约pH 7(例如，在6.8-7.4之间)。培养基包含葡萄糖、L-乳酸盐和特定比的氨基酸与葡萄糖。所述方法还包括将L-乳酸盐加入用于连续培养过程中的新鲜灌注培养基中。存在于灌注培养基中的L-乳酸盐以约0.1g/L至7.0g/L的量。可替代地或另外地，存在于灌注培养基中的L-乳酸盐以约1至4g/L、约1至3g/L、或约1至2.5g/L的量。在一个优选实施方案中，L-乳酸盐是L-乳酸钠或L-乳酸钾。在另一个实施方案中，灌注培养基中使用的乳酸盐可以是乳酸钠或乳酸钾的D/L混合物。在其中使用乳酸盐的D/L混合物的情况下，向灌注培养基中加入足够的混合物，使得L-乳酸盐的量与仅使用L-乳酸盐时使用的量相同。在一个实施方案中，代替L-乳酸盐或除L-乳酸盐之外，将另外的碳酸氢钠加入灌注培养基中。典型的细胞培养基含有约1.0至2.5克/L的碳酸氢钠。在一个实施方案中，用于主题技术的N-1灌注生物反应器的灌注培养基具有另外的1至3克/L的碳酸氢钠，以达到约2至5.5克/L碳酸氢钠的总浓度。该方法中的灌注培养基需要至少葡萄糖、L-乳酸盐(或者可替代地或另外地，碳酸氢钠)和氨基酸。葡萄糖的浓度为约0.5至约40g/L。L-乳酸盐的浓度为约0.1至约7.0g/L。碳酸氢钠的浓度为约1至5.5克/L。葡萄糖与氨基酸的摩尔比在约0.25和1.0之间。在HIPCOP模式中，随着细胞密度增加(图2a)，细胞在越来越频繁的基础上有效地‘需要’另外的灌注培养基，导致灌注速率的上升(图3)。
用于向补料分批培养物中添加葡萄糖的类似控制方案已在文献(BiotechnolBioeng.2011Jun；108(6):1328-37)中描述。N-1灌注培养对于实验的整个持续时间使用灌注速率的高端pH控制(HIPCOP)的这种技术。当必要或有用时，CSTR或生产生物反应器也使用类似的葡萄糖限制技术来控制乳酸形成。在CSTR中，当pH由于通过细胞的乳酸摄取而升高时，触发泵以添加含有葡萄糖的浓缩营养物进料、或含有溶解在水中的纯葡萄糖的进料。表3列出了用作葡萄糖的这种高端pH控制(HIPDOG)策略的部分的进料培养基或纯葡萄糖溶液。
表3列出了当该系统从第12-19天开始，并且再次从第29-33天开始操作时，经由高端pH控制系统(HIPDOG)按需递送至CSTR(恒化器)的浓缩进料培养基的组成的细节。
表3.浓缩进料培养基的组成。
Figure BDA0004142268040000151
Figure BDA0004142268040000161
HIPDOG策略仅从第12-19天和第29-33天开始用于控制关于CSTR的乳酸形成。从第19-35天开始，对CSTR发生了浓缩营养液的另外固定速率进料。通过就CSTR中的残留氨基酸水平偶尔分析离线样品，并且如果检测到过量的(超过30毫摩尔)总氨基酸或耗尽的(低于30毫摩尔)总氨基酸，则改变对CSTR的进料速率，来确定这些进料的添加速率。使用本段落中描述的进料方案，我们认为CSTR中的细胞不太可能在葡萄糖可用性方面受到过度限制，它们对于任何特定氨基酸的可用性也不受限制。当在约第25-28天以及第32-35天之间，在N-1和CSTR组合反应器达到稳态或接近稳态条件时，从图3我们可以看到N-1生物反应器的细胞流出为大约0.43/天，并且生产CSTR反应器的稀释速率为大约0.13-0.15/天。在一些实施方案中，生产生物反应器的稀释速率为约0.05-0.4或约0.1-0.3或约0.15-0.2/天。由于用这两个连接的生物反应器模拟的1/5体积比，可以计算出来自N-1灌注反应器的细胞流出物促成进入CSTR的液体体积的大约53-62％，并且剩余部分由浓缩培养基或葡萄糖进料组成。
从N-1灌注生物反应器到生产生物反应器(CSTR或恒化器)的管线首先连接并且在约第12天时打开，这允许细胞开始流入CSTR内。在工业环境中，不存在强大的驱动器来延迟CSTR的启动。据推测，可以在细胞流出物从N-1灌注生物反应器中取出的第一时间点开始。在目前的实验中，CSTR在认为N-1已达到接近稳态条件后开始。
从第12天到第15天(CSTR操作的前3天)，将来自N-1的所有细胞流出物泵送到生产(CSTR)生物反应器内。这可能是在工业规模下的正常启动方法，其中N-1生物反应器为CSTR体积的大约1/5。然而，在小规模实验系统中，生物反应器的体积几乎相同，并且这意味着在其操作的前3天，向CSTR系统中加入比在大规模下可能发生的数量大得多的细胞。这在小规模下进行，以在CSTR中加速达到高密度，但对组合生物反应器系统中达到的最终稳态应该具有可忽略不计的作用。在第15天时，调整从N-1灌注到生产CSTR反应器的流动，以精确模拟1:5的体积比。
在约第23天时首次达到相对于大多数参数：细胞密度(图2a)、细胞活力(图2b)、生物反应器体积流动(图3)、代谢产物浓度(图4和5)、以及产物浓度和体积生产率(图6和7)的稳态。此时CSTR的体积生产率为大约0.9克/升反应器体积/天。对于接下来的12天，这种体积生产率得以维持或略微超过(图7)。虽然一些产物筛分或抗体产物的选择性保留跨越中空纤维细胞保留装置在N-1生物反应器中发生(图6的实心和空心方块)，但考虑到每天从N-1生物反应器进入CSTR的液体体积(进入CSTR的总体积的～65％)及其产物浓度(0.4-0.6克/L)、以及每天的体积和在第23天时离开CSTR的产物浓度(6.4-7.4克/L)的简单质量平衡计算显示，对于CSTR计算的体积生产率主要是(～93-98％)由于在CSTR中的产物生成。表4列出了浓缩进料培养基的组成的细节，所述浓缩进料培养基从第19-35天开始经由手动操作以各种固定速率递送至生产(CSTR)反应器。
表4.生产反应器中的浓缩进料培养基的组成。
Figure BDA0004142268040000171
比较在第23天时的组合生物反应器系统的稳态体积生产率(～0.9克/升/天)与作为生产生物反应器独立操作的N-1灌注生物反应器的那种是有价值的。使用离开N-1灌注生物反应器的产物浓度和体积，并且假定下游操作可以从两个流(无细胞渗透物和含细胞的细胞流出物)中捕获材料，在第23天时N-1灌注生物反应器的体积生产率为大约0.46克/升/天，大致是组合生物反应器系统的体积生产率(0.9克/升/天)的一半。另外，在第23天时独立操作的N-1灌注生物反应器的培养基消耗速率为大约1.95反应器体积/天。组合的N-1/CSTR系统培养基消耗速率(包括N-1灌注培养基和对CSTR系统的浓缩营养物进料两者)仅为0.44反应器体积/天(基于CSTR的体积)，小于作为生产生物反应器独立操作的N-1灌注生物反应器的培养基消耗速率的四分之一。
应该注意，在这个特定的实验中，灌注速率的高端pH控制(HIPCOP)用于N-1灌注生物反应器，并且在CSTR生产生物反应器中间歇性地使用葡萄糖的高端pH控制(HIPDOG)策略时，这些控制模式在进行主题技术中视为任选的。通过考虑对于通过主题技术的方法和系统培养的每种细胞类型所需的代谢条件，可以应用替代或另外的控制机制。例如，各种CHO细胞系和其他哺乳动物细胞表达系统具有独特的细胞代谢，这可以利用对于本文所述的连接生物反应器任选的葡萄糖限制技术。
实施例2IgG(免疫球蛋白G)产生
在制备IgG蛋白中利用细胞系B-谷氨酰胺合成酶表达系统CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系
本实施例中使用的两阶段连接的生物反应器系统的实验设计与实施例1中使用的那种相同。出于实验目的，包括灌注回路(细胞保留系统)的N-1灌注生物反应器工作体积为1.36升，并且生产生物反应器(CSTR)的工作体积为1.1升。在工业环境中，N-1生物反应器考虑为生产(CSTR或恒化器)生物反应器体积的大约五分之一。出于这个原因(以与实施例1类似的方式)，操作实验生物反应器以在实验开始时模拟此类体积比。在实验的后期(第32天)，实验生物反应器配置以这样的方式改变，使得它们模拟1:10的体积比，并且在第44天时再次改变以模拟1:20的体积比。在这些情况中的每一种下，仅仅出于模拟理论生物反应器体积差异的目的，来自N-1连续灌注生物反应器的大部分细胞流出物被送去排出，而不是进入生产生物反应器内。随着体积比模拟从1:5增加到1:10然后再增加到1:20，来自N-1灌注生物反应器的大部分细胞体积被送去排出。
对于这些实验中使用的生物反应器，表5中列出了各种工艺控制参数和设定点(pH、溶解氧、温度等)。
表5.N-1连续灌注和CSTR生产生物反应器中使用的操作参数和控制设定点。
Figure BDA0004142268040000181
如表5中所提及的，使用双重喷射策略，其中对培养物的大部分氧通过使用纯氧的15微米烧结钢喷射器递送，并且二氧化碳去除的大部分通过经由产生大气泡的钻孔(7x1mm孔)喷射器喷射大气来实现。通过钻孔喷射器的空气喷射速率在15微米喷射器中使用的氧体积的2.5至4倍之间变化。该策略足以将溶解氧控制在40％的空气饱和度设定点下，并且对于培养的前13天，保持溶解二氧化碳水平在5-13％之间，并且从第13天开始(当收集大部分关键数据时)保持在4-8％之间。
对于该实施例，操作两个N-1灌注生物反应器，并且这些反应器中的每一个向作为连续流动搅拌釜反应器(CSTR)操作的一个生产生物反应器独立地供应连续的细胞源。靶稳态活细胞密度对于第1个N-1灌注反应器为～40x106个细胞/mL，并且对于第2个N-1灌注反应器为～80x106个细胞/mL。在将第一细胞转移到生产生物反应器之前8天启动N-1灌注生物反应器。生产生物反应器(CSTR)以全体积启动，这意味着当来自N-1灌注生物反应器的第一细胞流出物开始流入生产生物反应器内时，生物反应器完全充满培养基。生产生物反应器以全体积启动，部分是因为关于连接的生物反应器系统实验的实验计划设计为探索生产生物反应器(CSTR)中的几种不同的有效稀释速率，并且尝试对于这些条件中的每一种收集稳态数据。这类实验(稀释速率研究)一般通过在移动到较低稀释速率之前首先探索高稀释速率来促进，所述较低稀释速率通常需要较长时间段来达到稳态条件。另外，低稀释速率可能导致较低活力的培养物，并且在以后移动到具有更有利的培养条件的更高稀释速率时，可以导致关于细胞反应的长滞后时间。出于这个原因，首先调查了生产生物反应器中的高稀释速率。
以全体积启动生产生物反应器(在添加来自N-1灌注生物反应器的细胞之前)很可能不是起始此类培养的最佳方式。从培养基和设施利用的角度来看，以部分体积启动生物反应器可能是有益的，使得当从生产生物反应器中取出第一材料时(当生物反应器充满时)，细胞密度、目的产物浓度、以及潜在的蛋白质的产物质量已经接近最终的稳态值。该最佳起始体积(其取决于任何特定细胞系的生长和产物生产动力学)可以通过常规实验和计算机建模模拟来确定。生产生物反应器的最佳启动体积还取决于N-1灌注和CSTR组合系统的最佳(最高生产率和实际操作条件)稳态条件。
两个N-1连续灌注生物反应器从维持在Erlenmeyer摇瓶中的细胞以～1.2x106个活细胞/mL接种。生物反应器最初以分批模式(无灌注)操作。随着细胞密度增加(图8)，葡萄糖浓度在第3天从约4克/L降至0.4克/L以下(图10)。同时，乳酸盐最初累积至略微高于2克/L(图11)。一旦葡萄糖水平降至足够低的浓度，细胞就开始从培养物中摄取乳酸(第3天)，升高大量流体的pH且触发灌注培养基的添加(以及通过细胞保留系统的无细胞渗透物的同时去除，以维持生物反应器的工作体积恒定)。关于该方法的描述，参见名称为“Cell-Controlled Perfusion in Continuous Culture”的共同未决申请号62/246,774。该方法被称为灌注的高端pH控制(HIPCOP)。在接下来的几天内，细胞继续控制并且提高其自身的灌注速率(图12)。在大约第8天之后，灌注速率对于两个生物反应器得到稳定并且对于实验的持续时间保持相对稳定。在整个实验期间，灌注速率由HIPCOP技术控制。从第10天到第51天，关于靶40x106个细胞/ml N-1灌注生物反应器的平均灌注速率可以计算为1.76反应器体积/天(这被定义为泵送到生物反应器内的培养基的总体积)。从第10天到第40天，关于靶80x106个细胞/ml N-1灌注生物反应器的平均灌注速率可以计算为3.60反应器体积/天。超出第5天，两个N-1生物反应器中的残留葡萄糖水平对于整个实验非常接近零，如用HIPCOP技术操作的生物反应器通常的(图10)。
在第6天时，起始从N-1灌注反应器中直接去除含有细胞的培养物(细胞流出物)。大多数长持续时间或可持续的灌注生物反应器操作需要一定量的细胞流出物，以帮助维持生物反应器中的细胞活力并且保持惰性生物量的总体水平不成为问题。关于N-1灌注生物反应器的细胞活力显示于图9中。关于两种培养物的活力均很高，对于整个实验长度高于90％。活力在较高密度的培养物中略微更低。这可能是由于略微更高的剪切力，其可能由于在高密度培养物中，将溶解氧和二氧化碳维持在适当范围内所必需的几乎两倍高的气体喷射水平而经历。
从第6天到第8天，将细胞流出物导向废物，因为认为出于实验目的，当N-1灌注培养物中的细胞流出速率和细胞密度已稳定时，可能更容易起始生产反应器(CSTR)。每天调整细胞流出速率，以试图保持N-1灌注反应器的细胞密度(图8)尽可能接近其40和80x106个细胞/mL的靶密度。细胞流出速率在图13中指出。在第8天后，手动调整较小，并且从第10天到第51天，关于靶40x106个细胞/ml N-1灌注生物反应器的平均细胞流出速率可以计算为0.72反应器体积/天。从第10天到第40天，关于靶80x106个细胞/ml N-1灌注生物反应器的平均细胞流出速率可以计算为0.74反应器体积/天。
在第8天时，将来自N-1灌注反应器的细胞流出物导向两个独立操作的生产生物反应器(CSTR)。如正文较早提及的，将正确体积的细胞流出物导入生产生物反应器内，使得模拟N-1与生产生物反应器的1:5体积比。在其中细胞密度和细胞流出速率的轨迹、以及关于连接生物反应器的最终最佳操作条件在实验开始之前已知的工业应用中，将细胞流出物立即导向(从细胞流出开始的第一天)生产(CSTR)反应器可能是最有效的。
一旦来自N-1灌注反应器的细胞流出物被导入生产生物反应器(CSTR)内，那些反应器的细胞密度就非常快速地增加至高于20x106个活细胞/mL(图14)。随着细胞密度增加，直接加入生产生物反应器中的浓缩进料的流速在必要时增加，以便维持足够的营养物用于持续的细胞生长和蛋白质生产。通过氨基酸分析(HPLC)监测营养物，并且借助于NovaFlex分析仪(Nova Biomedical，Waltham，MA)监测其他代谢产物(乳酸盐、葡萄糖、氨、渗透强度等)。调整进料速率，使得残留氨基酸的总和(不包括丙氨酸，因为丙氨酸经常作为代谢副产物在培养物中处于高水平)维持高于30毫摩尔，并且任何特定氨基酸不小于0.2毫摩尔。进料由葡萄糖(50克/L)、氨基酸(600毫摩尔)、剪切保护剂(以5.12克/L的聚乙烯醇)、维生素和微量元素(表6中详述的一些)的浓缩溶液组成。
表6.培养基和进料组成细节
Figure BDA0004142268040000201
Figure BDA0004142268040000211
二肽甘氨酸-酪氨酸也用于浓缩进料中，以降低酪氨酸溶解度的复杂性。对于加入生产生物反应器中的每100mL浓缩进料培养基，还加入2.5mL的400毫摩尔酸性胱氨酸储备溶液。
因为实验的目的是探索生产生物反应器中的不同稀释速率，所以认识到还需要将盐水稀释溶液进料给生产生物反应器，特别是当正在探索高稀释速率时。该盐水稀释剂由具有20毫摩尔氯化钾的水和最终渗透强度为250mOsm/kg的平衡氯化钠组成。因此，在一个实施方案中，生产生物反应器用盐水溶液进料，以帮助调整稀释速率并且还控制CSTR生产生物反应器的渗透强度。在另一个实施方案中，CSTR生产生物反应器用盐水溶液进料，其量足以使生产生物反应器中的培养基达到对于细胞的生产率增加最佳的最终渗透强度。在另一个实施方案中，CSTR生产生物反应器用盐水溶液进料，其量足以使生产生物反应器中的培养基达到约100至约500mOsm/kg的最终渗透强度、或达到约150至约400mOsm/kg的最终渗透强度、或达到约150至约350mOsm/kg的最终渗透强度、或其间的任何特定值。在另一个实施方案中，加入生产生物反应器中的盐水溶液足以产生约250mOsm/kg的最终渗透强度。
最初，生产生物反应器中的乳酸盐水平非常快速地增加(第8-10天，图11)。出于这个原因，一旦葡萄糖在生产生物反应器中耗尽(第10天，图10)，葡萄糖对生产生物反应器的进料是有限的。通过使用浓缩营养素和葡萄糖的连续进料来控制葡萄糖水平，所述葡萄糖处于预测为低于平衡进料中包含的氨基酸量所需的葡萄糖水平(表6中的细节和如先前所述的)。借助于当pH达到7.125的高端设定点时被激活的泵，将浓缩的500克/L葡萄糖的另外进料直接且缓慢地进料至两个生产生物反应器。控制乳酸盐的这种方法，葡萄糖的高端pH控制递送(HIPDOG)在Gagnon等人2011,Biotechnol Bioeng 108:1328-37中详细描述。HIPDOG对照在使用来自靶40x106N-1灌注生物反应器的细胞流出物的生产生物反应器中使用直至第26天，并且在使用来自靶80x106N-1灌注生物反应器的细胞流出物的生产生物反应器中使用直至第22天。在这些时间点之后，第22天和第26天，生产生物反应器中的残留葡萄糖水平维持在认为是非限制的范围内，一般高于0.3克/升，但通过浓缩葡萄糖溶液(500克/L)的连续进料对于实验的剩余部分更通常在1-3克/L范围内(图10)。
图14显示了生产生物反应器中的活细胞密度。细胞密度最初快速增加，但随后到第10天至第14天时开始稳定。从N-1灌注反应器进入生产生物反应器的细胞的体积和浓度从约第10天直到约第32天保持恒定。此时将进入生产生物反应器的细胞体积减半，以便模拟1:10的更大生物反应器体积比差异(N-1与生产生物反应器体积相比)。该比率在约第43天时再次改变，以模拟1:20的比率。这些变化的时机在生产(CSTR)生物反应器中的细胞密度的图表上用文字指出(图7)。
从第13天到第18天，对两个生产生物反应器的营养物进料体积保持大致恒定。生产生物反应器的稀释速率(以反应器体积/天或倒数时间测量)(图15以及图14和17上的文字中所示)是细胞流出物、浓缩营养物进料和盐水稀释剂、浓缩葡萄糖进料、以及将pH控制在低端下的消泡剂和碱性滴定剂的任何少量添加的体积总和除以反应器体积。对于两个生产生物反应器，从第13-18天开始，稀释速率保持相对恒定在0.64反应器体积/天的平均值下(图15)。在关于两个生产生物反应器的稀释速率保持大致恒定的该时间段期间，细胞密度(图14)、细胞活力(图16)、滴度或产物浓度(图17)、以及大多数其他代谢产物达到几乎恒定的值，指示已达到稳态条件。
在第18天后，生产生物反应器的稀释速率在几天的过程中对于接受来自靶40x106个活细胞/mLN-1灌注反应器的细胞流出物的培养物缓慢降低至0.30反应器体积/天，并且对于接受来自靶80x106个活细胞/mLN-1灌注反应器的细胞流出物的培养物缓慢降低至0.33反应器体积/天。通过缓慢减少盐水稀释剂与直接加入生产生物反应器中的浓缩进料的体积比来实现稀释速率中的降低。如前，监测培养物的营养水平，并且需要时调整浓缩营养物进料速率，以对于变化的细胞密度进料足够的营养物。
到第21天时，两个生产生物反应器均已达到下一个靶小稀释速率(0.30和0.33反应器体积/天)。生产生物反应器保持在靶稀释速率下共另外5天，直到大多数培养参数已达到几乎恒定的值。由于此时正在测试的稀释速率较低，并且对于实验的剩余部分，等待直到培养物已达到对于每一个参数完全不变的值是不切实际的。
从第26天到第28天，通过减少盐水稀释剂与直接加入生产生物反应器中的浓缩进料的体积比，再次减少生产生物反应器的稀释速率。为了实现从第28-31天保持恒定的降低的稀释速率(如图例如15中所示的0.21和0.25反应器体积/天)，必须完全消除盐水稀释剂的使用。从第28天开始，对生产生物反应器的进料仅由来自相关N-1灌注反应器的细胞流出物、浓缩营养物进料、浓缩葡萄糖进料和痕量的消泡剂组成。因为细胞已转换成其中不产生净乳酸的代谢状态，所以对于实验的剩余部分需要可忽略不计的碱滴定剂量。再次，大多数代谢参数到第31天时稳定至接近恒定的值。
在第31天时，待加入其相关的生产生物反应器(CSTR)中的来自N-1灌注生物反应器的细胞流出物的体积降低一半，以便模拟体积为N-1反应器那种的十倍的生产生物反应器。为了重申这一点，不改变从N-1灌注生物反应器中取出的细胞流出物的体积，但现在将该细胞流出物的更大部分送到废物而不是加入相关的生产生物反应器中。模拟体积比中的这种变化对于尝试研究低于已经测试那种的生产生物反应器的稀释速率而不限制营养物对培养物的可用性是必要的。在模拟体积中的变化后，接受来自靶80x106个细胞/mLN-1灌注生物反应器的细胞流出物的生产生物反应器的活细胞密度减少至正好超过50x106个细胞/mL。当这发生时，关于浓缩营养物进料的需求略微减少，直到培养物的有效稀释速率在第34天时达到大约0.15反应器体积/天的值。该稀释速率保持恒定直到第41天时，在此时实验对于接收来自靶80x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器的细胞流出物的生产生物反应器完成。以类似的方式，接收来自靶40x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器的细胞流出物的生产生物反应器的有效稀释速率在第34天时减少至约0.14反应器体积/天，并且保持在那里直到第43天时，此时大多数参数达到稳态值。
在第43天时，N-1灌注生物反应器与生产生物反应器的模拟体积比再次改变，这次是1:20。这允许对于接受来自靶40x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器的细胞流出物的生产生物反应器，探索从第46天到第50天的0.09反应器体积/天的稀释速率(图15)。同样在第43天时，稍微改变加入靶40x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器中的灌注培养基的制剂。在第43天之前灌注培养基中的L-乳酸钠水平为2.1克/L。在第43天时，进行转换以使用含有DL-乳酸钠的灌注培养基，这是纯L-乳酸钠化学品的更商购可得和经济的替代物。假定所获得的DL-乳酸钠浓缩溶液含有相等比率的乳酸盐的D和L-异构体，并且培养中的细胞可能仅摄取L-异构体形式。DL-乳酸钠加入至4.2克/L的水平，使得灌注培养基中L-乳酸盐的摩尔浓度仍为大约18.8毫摩尔。尝试在改变为具有相同渗透强度的DL-乳酸盐之前和之后制备灌注培养基。这通过降低加入灌注培养基中的氯化钠的量来补偿添加的D-乳酸钠的另外渗透贡献来实现。作为在培养基制备过程期间的无菌过滤之前的最后步骤，通过冰点渗透压计测量渗透强度。通常将氯化钠加入培养基制剂中，以将溶液的同渗容摩浓度调整至接近所需值，在这种情况下为大约319mOsm/kg。尽管尝试匹配灌注培养基的渗透强度，但在转换为含有DL-乳酸盐的灌注培养基后不久，约第43天存在N-1生物反应器的稳态渗透强度中的略微增加(图18)。
在纯形式的D-乳酸钠的分开烧瓶测试中，确定在正常使用范围内(0-5克/l)，D-乳酸盐形式无法使用标准分析方法用分析设备记录。出于这个原因，在改变为含有DL-乳酸盐的灌注培养基(第43天)后，如在靶40x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器中测量的乳酸盐水平没有明显变化就不令人惊讶了(图11)。
图19中显示了作为灌注生物反应器独立操作的N-1灌注生物反应器的体积生产率。该图假定灌注生物反应器作为生产生物反应器操作，并且从离开生物反应器的所有流(细胞流出物和离开细胞保留系统的无细胞渗透物)中回收蛋白质产物。体积生产率还考虑了生物反应器中产物浓度的微小变化，所述微小变化在生物反应器中发生产物的少量选择性浓缩时发生。这主要仅在具有靶80x106个细胞/mL密度的N-1灌注生物反应器中显而易见(图20，第15-25天)。
即使灌注生物反应器的操作条件在约第10天后没有显著改变，并且对于两个灌注生物反应器，细胞密度、细胞活力和其他培养参数从实验的第10天到结束几乎没有改变，体积生产率仍对于靶40x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器(从第12天到第48天)缓慢下降约29％，并且对于靶80x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器(从第12天到第40天)缓慢下降约36％。生产率中的这种损失可能是生产者CHO细胞系B的适度遗传不稳定性的结果。
图21中显示了与生产生物反应器(CSTR)系统连接的组合N-1灌注的稳态体积生产率。体积生产率相对于生产生物反应器中使用的稀释速率进行绘制。连接的N-1灌注和CSTR生产生物反应器的稳态体积生产率以下述方式进行计算。进行材料平衡以确定生产生物反应器中产物蛋白的生产速率。材料平衡考虑了从N-1生物反应器进入生产生物反应器的产物浓度和液体体积、生产生物反应器中产物浓度增加的速率、以及生产生物反应器中在任何时间点的产物浓度及其去除速率(稀释速率)。该计算得到CSTR中产生的产物的总质量，其随后针对时间进行作图。线性回归随后用于更准确地确定质量的产生/时间/反应器体积值，仅考虑当稀释速率保持恒定并且细胞密度已达到相对恒定值时的时间点。然后将该估计值加入N-1生物反应器的生产速率(再次假定N-1与生产生物反应器的正确模拟体积比，并且仅考虑进入生产生物反应器的流体体积)，用于对于任何特定稀释速率，连接的N-1灌注生物反应器与生产CSTR系统的最终体积生产率估计。
将对于任何特定稳态在最后时间点的CSTR生产生物反应器中的产物浓度乘以稀释速率(以倒数时间)也将得到连接的生物反应器系统的总体积生产率的估计值。然而，除非产物浓度在所使用的时间点不变，否则这种计算将给出系统的实际稳态体积生产率的略微低估。
如图21中可以看出的，对于许多稳态条件，组合的N-1灌注和生产生物反应器的体积生产率显著高于独立操作的N-1灌注生物反应器的体积生产率。这种概括的一个例外可能是在图19上的最早时间点，靶80x106个细胞/mL N-1灌注生物反应器的体积生产率。该灌注生物反应器以3.6反应器体积/天的灌注速率和非常高的细胞密度操作。由于制备和贮存所需的培养基体积，以及设计可以以非常大的体积起作用的细胞保留系统的困难，此类生物反应器在非常大的规模下的实际操作可能带来重大挑战。另外，因为递送足够的氧且去除足够的二氧化碳在大规模下变得更成问题，所以非常高的活细胞密度(80x106个细胞/mL)可能造成大量工程复杂化。
与CSTR生产生物反应器连接的N-1灌注通过急剧降低灌注生物反应器的大小，并且急剧降低所需培养基的总体积来缓解这些问题中的许多。连接的生物反应器系统维持体积生产率与连续灌注生物反应器大约相同，所述连续灌注生物反应器以高密度和维持高细胞密度所需的高灌注速率操作。图21显示了用于操作CSTR生产生物反应器的最佳稀释速率在每天约0.1至大约0.35反应器体积的相当宽的范围内发生。由于如图19中所示的细胞系生产率的缓慢损失，以及在实验期间首先调查高稀释速率条件的事实，可能关于低稀释速率如图21中呈现的稳态体积生产率可能略微低估可实现的实际生产率。
表7列出了如图21上指出的，关于两个与CSTR系统连接的N-1灌注的最高体积生产率条件相关的一些另外细节。
表7.与关于连接的N-1灌注和CSTR生产生物反应器系统的两个最高稳态体积生产率相关的各种工艺参数。作为生产生物反应器独立操作和作为连接的生物反应器系统的部分的灌注生物反应器的比较。
Figure BDA0004142268040000251
当与独立操作的灌注生物反应器比较时，培养基或进料使用的效率在连接的生物反应器系统中显著更高。即使当与以补料分批模式操作的哺乳动物细胞培养生物反应器比较时，具有培养基使用的最高效率的条件也是相当高的，对于连接系统作为整体在系统中使用的每升培养基或进料产生3.83克产物蛋白质。
虽然在当前的实验中，每天手动调整细胞流出速率，以确保两个N-1灌注培养物均维持接近其靶值的细胞密度，但在使用充分理解的方法的工业环境中，细胞密度用任何数目的可消毒探针进行监测，所述可消毒探针利用电容测量(或其他技术)来估计操作生物反应器中的活细胞质量。然后可以编写计算机控制算法，以连续地改变从N-1灌注生物反应器中取出的细胞流出物量。据推测，在与CSTR生产生物反应器系统连接的N-1灌注中，所有细胞流出物将立即转移至生产生物反应器。
因为CSTR生产生物反应器的有效稀释速率在很大程度上取决于从连续N-1灌注生物反应器进入容器的液体体积，所以在一个实施方案中，进一步浓缩来自N-1灌注生物反应器的细胞流出物(通过从细胞流出物中去除另外的液体)，然后将其转移到CSTR生产生物反应器内。当N-1灌注生物反应器在低细胞密度下操作时，和/或当在实验中确定CSTR生产生物反应器中的低稀释速率对于作为整体的系统得到更高的体积生产率时，细胞流出物的这种浓缩是特别有价值的。细胞流出物的进一步浓缩(如果需要的话)通过任何实际的细胞保留方法(连续微过滤、声波沉降、水力旋流器等)进行。
因为来自N-1灌注反应器的细胞流出物将流体总体积的相当大部分带入生产反应器内(取决于条件)，所以在一个实施方案中，为了最小化对生产生物反应器的进料培养基添加，非常高营养物含量的培养基用于灌注N-1生物反应器。因为N-1灌注反应器中的细胞不能消耗来自灌注培养基的所有营养物，所以大量营养物随后将在生产生物反应器中流动。然而，这种能力存在有限，因为在非常高水平的一些氨基酸的存在下，细胞的生长速率可能是相当有限的。另外，因为进入N-1生物反应器的大多数灌注培养基在无细胞渗透物中损失至废物，所以必须考虑弃去大体积的高营养素含量的灌注培养基的另外成本。
以与在转移前潜在地浓缩细胞流出物的理由相似的方式，将直接对CSTR生产生物反应器的营养物进料高度浓缩对于连接系统有效起作用且实现高体积生产率是重要的。非常稀释的进料培养基可以通过增加生物反应器的有效稀释速率来稀释CSTR生产生物反应器中的生物量。对于通常具有接近或超过一天的最大倍增时间的哺乳动物细胞，任何接近或高于1.0反应器体积/天(或1/天)的有效稀释速率都可以导致CSTR生产生物反应器中非常低的细胞密度，并且因此导致连接的生物反应器系统中的低生产率。
在我们已上文描述的实施例中，在其中稀释速率高于0.20反应器体积/天(1/天)的条件过程中，如表3中所述的盐水稀释剂用于稀释对CSTR生产生物反应器的浓缩进料。图21显示了使用连接的生物反应器系统，在甚至高达0.64反应器体积/天的稀释速率下，可以实现合理的体积生产率。高稀释速率稀释CSTR中的活细胞质量并且倾向于驱动生产率降低，但是高稀释速率也同时将细胞生成的抑制性化合物冲洗出生物反应器系统，并且因此增加细胞的生长速率。这些竞争因素部分地相互平衡，这允许在高稀释速率下的细胞密度仍维持相当高，并且因此仍可以实现相当高的体积生产率。因此，在一个实施方案中，生产生物反应器的稀释速率为约0.1体积/天至约1.25体积/天。在另一个实施方案中，主题技术的生产生物反应器的稀释速率为约0.2体积/天至约1.0体积/天；或约0.2至约0.75体积/天；或约0.2体积/天或约0.65体积/天。在另一个实施方案中，主题技术的生产生物反应器的稀释速率为约0.1体积/天；或为约0.2体积/天；或为约0.25体积/天；或为约0.3体积/天；或为约0.35体积/天；或为约0.4体积/天；或为约0.45体积/天；或为约0.5体积/天；或为约0.6体积/天；或为约0.7体积/天；或为约0.8体积/天；或为约1.0体积/天；或为约1.25体积/天。
在0.64反应器体积/天时，在生物反应器中生成的产物的平均停留时间为大约1.56天。该停留时间远远小于在补料分批生物反应器中制备的产物的平均停留时间。出于这个原因，在不稳定蛋白质的情况下，与CSTR生产生物反应器系统连接的N-1灌注可能具有超过生物反应器操作的补料分批模式的显著优点。另外，通过使用加入生产生物反应器中的增加体积的盐水稀释剂，可以操纵连接的生物反应器系统的稀释速率，以降低产物蛋白质的停留时间，而不过度降低作为整体的系统的体积生产率。当然可以通过简单地操纵直接流入生产生物反应器内的进料培养基的浓度来实现相同的结果。因此，在一个实施方案中，主题技术的生产生物反应器中的产物停留时间为约1天至约10天。在另一个实施方案中，主题技术的生产生物反应器中的产物停留时间为约1天、或约2.0天；或约2.5天；或约3.0天；或约3.5天；或约4天、或约5天、或约6天、或约7天、或约8天、或约9天、或约10天。在另一个实施方案中，主题技术的生产生物反应器中细胞的停留时间小于约10天。
如本文较早提及的，在实验开始时使用限制CSTR生产生物反应器中葡萄糖可用性的策略(HIPDOG技术)。这限制了生物反应器中乳酸盐的累积。因为关于CSTR的低稀释速率被证明是最具生产力的，所以在工业应用中，立即或非常快速地移动到低稀释速率的条件可能是有价值的。据推测，当第一细胞从N-1灌注生物反应器流入生产生物反应器CSTR内时，CSTR生物反应器将至少部分地充满新鲜的基础培养基。在可自由获得的葡萄糖的存在下的高度增殖状态中，这些细胞可能开始产生大量的乳酸，并且使用pH控制，这也意味着当乳酸被中和时的高渗透强度。在生物反应器充满时在培养早期在CSTR中累积、或在非常低的稀释速率下其后立即生产的任何乳酸盐(及其相关的高渗透强度)将非常缓慢地从培养系统中稀释出来。出于这个原因，在CSTR生产生物反应器的初始启动阶段，利用葡萄糖限制技术例如葡萄糖的高端pH控制递送(HIPDOG)具有重大价值。如果没有控制初始乳酸盐产生的一些方法，高水平的乳酸盐可以在生产生物反应器中累积，使得在仅几天的操作之后，在生产生物反应器中可实现很少的生长或无生长。当培养物中的CHO细胞暴露于高乳酸盐浓度时，有时发生正反馈条件，其中来自葡萄糖的乳酸盐产生显著上调。此类条件可能显著延迟甚至无法达到在低稀释速率下具有高体积生产率的稳态条件。尽管HIPDOG葡萄糖限制策略在当前实验中运行良好，但是也可以或可替代地使用对低pH控制设定点或低于36.5℃的温度的转换，以最小化当它第一次启动时一段时间CSTR生产生物反应器中的乳酸盐形成。较低的pH和较低的温度两者均可以减缓生长并且减少细胞生产率，因此这些设定点控制变化的使用必须针对控制乳酸盐形成的需要相平衡。为此目的，最佳pH设定点可能低于7.0，可能在6.7和7.0之间。最佳温度可能在30-35℃之间
对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所述实施例进行各种修改和变化，而不背离所请求保护的方法的精神和范围。因此，预期本文请求保护的方法涵盖本文所述实施例的修改和变化，条件是它们落入所附权利要求及其等价物的范围内。
工业适用性
本文公开的装置和方法可用于连接-灌注至CSTR细胞培养生物制造，并且因此用于改善用于制造重组和/或治疗性蛋白质的工业方法。

Claims (6)

1.一种产生目的蛋白质的方法，其包括：
(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞；
(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；和
(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在所述生产生物反应器中培养所述细胞；
其中所述方法进一步包括步骤(d)从所述生产生物反应器中收获所述目的蛋白质，其中收获步骤(d)是连续的。
2.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养生物反应器是连续灌注培养生物反应器，并且所述生产生物反应器是连续搅拌釜反应器(CSTR)生产生物反应器。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述生产生物反应器不具有细胞保留装置。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述培养生物反应器与所述生产生物反应器的体积比为约1:1至约1:20、或约1:1至约1:5、或约1:5。
5.一种连接的培养方法，其包括：
(a)在培养生物反应器(N-1生物反应器)中，培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞；
(b)用从步骤(a)获得的细胞接种生产生物反应器(N生物反应器)；和
(c)在允许目的蛋白质产生的条件下，在所述生产生物反应器中培养细胞；
其中所述连接的培养方法进一步包括步骤(d)从所述生产生物反应器中收获目的蛋白质；其中收获步骤(d)是连续的。
6.一种连接的培养系统，其包括：
用于培养包含编码目的蛋白质的基因的细胞的培养生物反应器(N-1生物反应器)；和
生产生物反应器(N生物反应器)，其与所述培养生物反应器连接并且从所述培养生物反应器接收细胞作为接种物，其中所述生产生物反应器在允许目的蛋白质产生的条件下操作。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111344558A (zh) 2017-10-06 2020-06-26 龙沙有限公司 使用拉曼光谱法自动控制细胞培养
WO2019079188A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. PERFUSION BIOREACTOR AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019094333A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-16 Amgen Inc. Methods for producing protein products
CN113661233A (zh) * 2019-04-01 2021-11-16 勃林格殷格翰国际公司 集成且连续的重组蛋白质制造
CN113924355B (zh) * 2019-05-28 2024-04-02 上海药明生物技术有限公司 用于监测和自动控制灌流细胞培养的拉曼光谱集成灌流细胞培养系统
KR20220092948A (ko) * 2019-11-07 2022-07-04 메르크 파텐트 게엠베하 관류 세포 배양을 수행하기 위한 방법 및 시스템
US20240002772A1 (en) 2020-10-13 2024-01-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Systems and methods for producing a biologic molecule with hydrocyclone cell retention device
WO2024054414A1 (en) * 2022-09-06 2024-03-14 Amgen Inc. Lean perfusion cell culture methods

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4176472B2 (ja) 2000-12-20 2008-11-05 バイエル・フアーマシユーチカルズ・コーポレーシヨン 哺乳動物細胞の種連続増殖（ｓｅｅｄ−ｔｒａｉｎｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のための装置及び方法
KR100834110B1 (ko) 2007-01-25 2008-06-02 한국과학기술원 상류 충전탑 세포재순환 장치가 장착된 다단계 ｃｓｔｒ생물반응기 시스템
CN101085978B (zh) * 2007-06-27 2011-01-05 广州铭康生物工程有限公司 一种用于动物细胞灌流培养的过滤-沉降双结合灌流系统
US8580554B2 (en) * 2009-07-31 2013-11-12 Baxter International Inc. Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
CN102071137B (zh) * 2009-11-19 2014-10-22 上海坤巨科技发展有限公司 连续灌注生物反应器/罐袋系统制备干细胞装置和方法
CN103285385B (zh) * 2012-12-27 2015-02-11 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法
US10214718B2 (en) * 2013-07-01 2019-02-26 University Of Massachusetts Distributed perfusion bioreactor system for continuous culture of biological cells
US20160289633A1 (en) 2013-12-20 2016-10-06 Biogen Ma Inc. Use of Perfusion Seed Cultures to Improve Biopharmaceutical Fed-Batch Production Capacity and Product Quality
CN104195187B (zh) * 2014-08-01 2018-02-16 润科生物工程（福建）有限公司 沉降‑逆灌流‑放流偶联制备富含dha油脂的方法及其专用细胞沉降槽
EP3303558B1 (en) 2015-05-29 2022-05-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Cell-controlled perfusion in continuous culture

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