KR20230085925A - 하이드로사이클론 세포 보유 장치를 사용한 생물학적 분자를 생산하기 위한 시스템 및 방법 - Google Patents
하이드로사이클론 세포 보유 장치를 사용한 생물학적 분자를 생산하기 위한 시스템 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자의 연속 생산을 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 보다 구체적으로, 상기 시스템은 (i) 적어도 하나의 배양 생물반응기; (ii) 적어도 하나의 하이드로사이클론; 및 (iii) 적어도 하나의 생산 생물반응기를 포함하고; 여기서 상기 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기는 하이드로사이클론에 의해 연결된다. 상기 방법은 (i) 적어도 하나의 배양 생물반응기에서 관심있는 생물학적 분자를 생산할 수 있는 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계; (ii) 적어도 하나의 생산 생물반응기에 단계 (i)로부터 수득된 세포를 접종하는 단계; 및 (iii) 세포를 생산 생물반응기에서 배양하는 단계를 포함한다.
Description
본원에는 관심있는 생물학적 분자를 생산하기 위한 시스템 및 방법이 개시되며, 이러한 시스템 및 방법은 세포 보유 장치로서 기능하는 적어도 하나의 하이드로사이클론을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 시스템 및 방법은 단백질, 예를 들어 항체를 생산하기 위한 2-스테이지, 연결된 관류 생물반응기 시스템을 제공한다.
지난 10년 동안 생물학적 약물은 인간 질환 치료에서 중요성이 커져왔다. 그러나, 생물제제의 제조 공정은 기존의 소분자 약물의 제조 공정과는 크게 다르며, 즉, 생물제제는 전형적으로 화학 반응을 통해 합성되는 것과 대조적으로 조작된 세포 또는 미생물에 의해 생산된다. 따라서 생물제제의 생산은 전형적으로 소분자의 생산보다 더 복잡하고 비용이 많이 든다.
연속 바이오프로세싱(continuous bioprocessing)은 생물제제 제조의 품질을 개선하고 비용을 절감할 수 있는 한 가지 방법을 제공한다. 바이오프로세싱은 종단 간 연속적이거나 특정 공정, 예를 들어 세포 배양에 대해 연속적일 수 있다. 연속 바이오프로세싱은 업스트림 작업과 관련되기 때문에 일반적으로 관류 기술을 지칭한다. 관류 세포 배양 공정은 많은 수의 생존 가능한 세포를 보유하면서 신선한 배지의 일정한 또는 반-일정한 공급 및 사용한 배지 및 생성물의 일정한 또는 반-일정한 제거를 수반한다.
배양물에서 세포를 유지하면서 사용한 배지를 제거하는 것은 여과, 침강 또는 원심분리를 기반으로 하는 기술을 포함한 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 당업계에 공지된 세포 보유 장치는 스핀 필터, 경사 침강기, 연속 원심분리, 막 여과 장치, 또는 초음파 분리기를 포함한다. 그러나, 이들 각각은 특정 제한 및/또는 복잡성을 겪는 것으로 알려져 있다.
예를 들어, 막을 사용하는 거의 모든 세포 보유 장치(현재 대규모로 사용되고 있는 많은 장치와 마찬가지로)는 결국 세포 파편으로 막힐 것이다. 종종 매우 생산적인 관류 공정과 관련된 높은 세포 밀도 및 낮은 생존력은 막 오염을 더욱 가속화한다. 또한, 막이 세포 파편으로 막힘에 따라, 이들이 한외여과(ultrafiltration) 장치로도 효과적으로 기능하기 시작하여 쉽게 예측하거나 재현할 수 없는 방식으로 생물반응기 내에 고 분자량 생성물 단백질을 보유한다. 이는 연속 관류 생물반응기 시스템에서는 관심있는 생성물이 무세포 수확물에서 생물반응기로부터 연속적으로 제거되고 일관된 방식으로 다운스트림 작업으로 전달되도록 하는 것이 유리하기 때문에 단점이다. 당업계에 공지된 세포 보유 장치가 갖는 다른 문제는 장치에서의 과열, 낮은 분리 효율 및 긴 체류 시간을 포함한다.
결과적으로, 종래의 연속 관류 세포 배양 시스템은 통상적으로 2,000L 미만의 작업 용적을 가지며, 생산성이 가장 높은 조건(예를 들어 높은 생존 세포 밀도 및 높은 관류 속도)에서 작동되는 경우, 막힘 및 생성물 정체로 인해 막-기반 세포 보유 장치를 자주 교체해야 한다. 또한, 매우 많은 양의 무세포 배양 수확물을 처리할 수 있는 세포 보유 장치는 매우 복잡하고(예를 들어 다수의 움직이는 부품), 비용이 많이 들고, 과도한 전단력을 통해 세포를 손상시키고, 고장나기 쉽다. 세포 보유 장치는 전형적으로 생물반응기 외부에 있기 때문에, 효과적인 세척 및 멸균도 대규모로 어려울 수 있다. 또한, 배치 및 공급-배치는 규모에 관계없이 가장 일반적인 포유동물 세포 배양 유형으로 남아 있다.
약 5배 내지 약 20배 더 큰 연속-유동 교반-탱크 반응기(CSTR 또는 케모스태트)에 연결된 막 기반 세포 보유 장치를 사용하는 관류 N-1 (시드) 생물반응기는 생산성을 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, Boehringer Ingelheim International GmbH의 미국 특허 공개 제2019/0031997호 참조).
특히 대규모 바이오프로세싱에 대해 현재의 종래의 관류 배양 시스템과 관련된 한계를 극복하는 대체 세포 배양 방법 또는 시스템에 대한 필요성이 남아 있다.
본원에는 바이오프로세싱 시스템 및 방법, 보다 특히 세포 보유 장치로서 기능하는 적어도 하나의 하이드로사이클론을 포함하는 관심있는 생물학적 분자(예를 들어, 항체)를 생산하기 위한 시스템 및 방법이 개시되어 있다.
제1 측면에서, 본원에는 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자의 연속 생산을 위한 시스템이 개시되어 있으며, 상기 시스템은 (i) 적어도 하나의 배양 생물반응기(예를 들어, N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기); (ii) 적어도 하나의 하이드로사이클론; 및 (iii) 적어도 하나의 생산 생물반응기(예를 들어, N 생물반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기)를 포함하고; 여기서 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기는 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론에 의해 연결되고, 상기 하이드로사이클론은 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림 및 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 생성하고, 여기서 상기 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고, 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 생산 생물반응기로 향한다.
하나의 양태에서, 시스템은 6주 이상, 8주 이상, 3개월 이상, 6개월 이상 또는 1년 이상 동안 고도로 생산적인 정상 상태로 작동할 수 있다. "고도로 생산적인" 정상 상태는 적어도 약 0.80g/L/일 또는 약 0.84g/L/일의 계산된 정상-상태 용적 생산성(calculated steady-state volumetric productivity)으로 간주된다.
특정 양태에서, 시스템은 더 낮은 세대 수의 세포로 배양 생물반응기를 재시작함으로써 고도로 생산적인 정상 상태에서 무기한 작동할 수 있다.
제2 측면에서, 본원에는 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자의 연속 생산을 위한 시스템이 개시되어 있으며, 상기 시스템은 (i) 적어도 하나의 연속 (예를 들어, 관류) 배양 생물반응기(예를 들어, N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기); (ii) 적어도 하나의 하이드로사이클론; (iii) 적어도 하나의 생산 생물반응기(예를 들어, N 생물반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기); 및 (iv) 적어도 하나의 다운스트림 구성요소(예를 들어, 포획 또는 정제 구성요소)를 포함하고; 여기서 상기 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기는 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론에 의해 연결되고, 상기 하이드로사이클론은 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림 및 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 생성하고, 상기 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고, 상기 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 상기 생산 생물반응기로 향한다.
제3 측면에서, 본원에는 관심있는 생물학적 분자(예를 들어, 항체)를 연속적으로 생산하는 방법이 개시되어 있으며, 상기 방법은 (i) 관심있는 생물학적 분자(예를 들어, 항체)를 생산할 수 있는 복수의 숙주 세포를 적어도 하나의 배양 생물반응기(예를 들어, N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기)에서 배양하는 단계; (ii) 하나 이상의 생산 생물반응기(예를 들어, N 생물반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기)에 단계 (i)로부터 수득된 세포를 접종하는 단계; 및 (iii) 관심있는 생물학적 분자(예를 들어, 항체)의 생산을 허용하는 조건하에 적어도 하나의 생산 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기는 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론에 의해 연결되고, 배양 생물반응기는 하이드로사이클론으로부터 언더플로우를 수용하는 반면, 생산 생물반응기는 오버플로우를 수용하여, 생산 생물반응기에 접종한다.
한 양태에서, 상기 방법은 (v) 생산 생물반응기로부터 배양된 숙주 세포의 일부를 수확하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기로부터 배양된 숙주 세포의 일부를 수확하는 단계는 연속적으로 일어난다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기로부터 배양된 숙주 세포의 일부를 수확하는 단계는 주기적으로, 예를 들어 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 또는 2일에 1회 일어난다. 임의로, 하나 이상의 추가 단계가 관심있는 생물학적 분자를 추가로 처리하기 위해 수행될 수 있다. 한 양태에서, 하나 이상의 단계는 정화, 포획, 정제, 연마, 제형화, 패키징 단계 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 이러한 하나 이상의 추가 단계는 본질적으로 연속적이거나 비연속적일 수 있으며, 이에 따라 하이브리드 또는 연속 종단 간 공정을 제공한다.
배양 생물반응기와 생산 생물반응기 사이의 연결을 제공하기 위해 하이드로사이클론보다는 막-함유 숙주 세포 보유 장치를 이용하는 시스템 및/또는 방법과 비교하여, 본원에 개시된 시스템 및/또는 방법은 특히 대규모 시스템에 적용될 때 하나 이상의 개선된 특성을 제공한다. 예를 들어, 생산 생물반응기의 작업 용적이 1000L를 초과하는 시스템에서, 배양 생물반응기와 생산 생물반응기 사이의 연결을 제공하기 위해 하이드로사이클론을 이용하는 본원에 기재된 시스템 및/또는 방법은 총 분리 효율 증가, 배지 사용량 감소 및/또는 적어도 하나의 관심있는 생물학적 분자의 생산 증가를 포함하는 특정 개선을 제공할 수 있다. 특정 양태에서, 개선된 특성은 높은 생존 세포 밀도(viable cell density, VCD) 및 또는 높은 관류 속도(perfusion rate, PF)로 나타난다. 시스템이 매우 큰 규모인 특정 양태에서, 배양 생물반응기와 생산 생물반응기 사이의 연결을 제공하기 위해 하이드로사이클론보다는 막-함유 숙주 세포 보유 장치를 이용하는 시스템은 불충분한 막 면적에 의해 방해를 받을 수 있으며, 이는 하이드로사이클론 연결된 생물반응기 시스템과 비교할 때 더 낮은 전체 생산성을 초래할 것이다.
본 발명의 기술의 추가적인 이점은 다음의 도면 및 상세한 설명으로부터 당업계의 숙련가들에게 용이하게 명백해질 것이다. 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 제한적인 것이 아니다.
도 1은 예시적인 하이드로사이클론에서의 유체 역학의 다이어그램이다. 배양물은 장치 상단에 있는 두 개의 접선 입구(tangential inlet)를 통해 하이드로사이클론 소용돌이 챔버로 들어간다. 원심 필드(centrifugal field)는 세포를 소용돌이 챔버의 벽으로 밀어내는 1차 와류(vortex)를 생성하는 반면 원뿔형 테이퍼(conical taper)는 세포가 장치 바닥의 언더플로우 스트림에서 빠져나올 때까지 세포를 아래쪽으로 안내한다. 동시에, 부분적으로 무세포 재료는 방향을 반대로 하고 위쪽으로 이동하는 2차 와류로 들어가서 장치 상단의 오버플로우 스트림을 통해 빠져나간다.
도 2는 예시적인 생물반응기 구성을 예시하는 개략도이다. 이러한 구성에서, 세포 보유 장치로서 하이드로사이클론을 사용하는 N-1 관류 생물반응기는 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 N 단계 생산 생물반응기로서 작동하는 제2 연속-유동 교반 탱크 반응기(CSTR)에 연속적으로 공급한다. N-1 관류 생물반응기는 일정한 용적으로 유지되었고, 관류 배지가 공급되었다. 600 시리즈 Watson Marlow 연동 펌프는 N-1 배양물을 3L/min로 하이드로사이클론에 공급하여 2.4bar의 작동 압력에 도달한다. 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 N-1 생물반응기로 다시 재순환되는 반면 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 370mL/min의 유속으로 제2 연동 펌프(500 시리즈 Watson Marlow)를 사용하여 생산 CSTR에 첨가되었다. 농축된 영양소 공급물도 생산 CSTR에 직접 첨가되었다. 생산 CSTR은 세포 보유 장치를 사용하지 않았고 전체 세포 수확물은 생산 CSTR을 일정한 용적으로 유지하기 위해 생물반응기로부터 제거되었다.
도 3은 예시적인 N-1 관류 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 사용되는 예시적인 하이드로사이클론의 도면이다. 다이어그램에 표시된 치수는 본원에 기재되어 있다.
도 4a는 세포 보유 장치로서 하이드로사이클론을 사용하는 예시적인 N-1 관류 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 측정된 생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 다이아몬드로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 다이아몬드로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 4b는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 실험에서 1:5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 사각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 사각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 4c는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 실험에서 1:10 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 삼각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 삼각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 4d는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 실험에서 1:20 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 원으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 원으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 5a는 실시예 1에서 사용된 N-1 관류 생물반응기에서의 잔류 글루코스(닫힌 다이아몬드) 및 락테이트(열린 다이아몬드) 농도를 보여주는 그래프이다.
도 5b는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 시스템에서 1:5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 사각형) 및 락테이트(열린 사각형) 농도를 보여주는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(High-End pH Delivery of Glucose, HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 5c는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 시스템에서 1:10 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 삼각형) 및 락테이트(열린 삼각형) 농도를 보여주는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 5d는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 시스템에서 1:20 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 원) 및 락테이트(열린 원) 농도를 보여주는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 6은 N-1 관류 생물반응기에서 세포 보유 장치로서 사용된 예시적인 하이드로사이클론에 의해 달성된 총 분리 효율(닫힌 다이아몬드) 및 감소된 분리 효율(열린 다이아몬드)을 보여주는 플롯이다. 계산은 이 텍스트의 실험 섹션에 기재되어 있다.
도 7은 N-1 관류 생물반응기에서의 관류 속도(닫힌 다이아몬드) 및 예시적인 하이드로사이클론 오버플로우 스트림으로부터의 계산된 유효 세포 블리드(열린 다이아몬드)를 보여주는 그래프이다. 관류 속도는 1일당 반응기 용적(RV/일)으로 열거되며 이는 1일당 N-1 생물반응기에 첨가되는 관류 배지의 용적을 N-1 생물반응기의 작업 용적으로 나누어 계산된다. 계산된 세포 블리드 또한 RV/일로 열거되며 이는 관류 속도에 오버플로우 스트림 생존 세포 밀도 대 생물반응기 생존 세포 밀도의 비율을 곱하여 계산된다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 8은 1:5 생산 CSTR(닫힌 사각형), 1:10 생산 CSTR(닫힌 삼각형) 및 1:20 생산 CSTR(닫힌 원)에서의 희석 속도를 보여주는 그래프이다. 희석 속도는 RV/일로 열거되며 이는 매일 생물반응기로부터 제거된 전체 세포 수확물의 용적을 생물반응기의 작업 용적으로 나누어 계산된다. 수직 점선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 9는 하이드로사이클론을 사용하는 예시적인 연결된 생물반응기 시스템에서 정상 상태 조건에서 시간에 대해 플롯팅된 용적당 생산된 항체 생성물의 총 질량을 보여주는 그래프이다. 독립형 단위 작업으로서의 N-1 관류는 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:5 생산 CSTR은 열린 사각형으로 표시되며, 1:10 생산 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:20 생산 CSTR은 열린 원으로 표시된다. 이러한 재료 균형 계산의 세부사항은 본 출원의 실험 섹션에 기재되어 있다. 생물반응기가 관류 속도 또는 희석 속도, 생존 세포 밀도 및 대사산물과 관련하여 거의 정상 상태 조건에 있을 때, 시간에 대해 플롯팅된 리터당 그램(g/L) 단위의 생산된 총 생성물에 대해 선형 회귀를 수행하였다. 생성된 선의 기울기는 1일당 리터당 그램(g/L/일)의 정상 상태 용적 생산성이다. 두 개의 정상 상태는 파선으로 원으로 표시된다.
도 10은 생물반응기에서의 항체 생성물 농도 또는 역가의 그래프이다. N-1 관류는 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:5 생산 CSTR은 열린 사각형으로 표시되고, 1:10 생산 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:20 생산 CSTR은 열린 원으로 표시된다.
도 11은 예시적인 캐스케이딩 CSTR 생물반응기 구성을 예시한 다이아그램이다. 이러한 구성에서, N-1 생물반응기는 CSTR로서 일정한 용적으로 작동되었다. 전체 세포 블리드가 생물반응기로부터 반연속적으로 제거되고 N-1 CSTR보다 2.5 내지 10배 더 큰 N 스테이지 생산 CSTR에 공급됨에 따라 관류 배지가 N-1 CSTR에 첨가되었다. 이러한 생산 CSTR에는 또한 농축된 공급물이 직접 공급되면서 전체 세포 수확물은 생물반응기로부터 연속적으로 제거되어 생산 CSTR을 일정한 용적으로 유지하였다. N-1 CSTR이나 생산 CSTR은 이 구성에서 세포 보유 장치를 사용하지 않았다.
도 12a는 예시적인 N-1 CSTR에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 다이아몬드로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 다이아몬드로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 12b는 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1:2.5 용적비를 시뮬레이션하는 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 사각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 사각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계 및 생산 CSTR이 N-1 CSTR로부터 분리되고 독립형 생산 CSTR로 작동하는 시점을 나타낸다.
도 12c는 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1:5 용적비를 시뮬레이션하는 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 삼각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 삼각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계 및 생산 CSTR이 N-1 CSTR로부터 분리되고 독립형 생산 CSTR로 작동하는 시점을 나타낸다.
도 12d는 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1:10 용적비를 시뮬레이션하는 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 원으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 원으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 13은 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1일당 반응기 용적(RV/일)의 희석 속도를 보여준다. 그래프는 N-1 CSTR(닫힌 다이아몬드), 1:2.5 생산 CSTR(열린 사각형), 1:5 생산 CSTR(열린 삼각형) 및 1:10 생산 CSTR(열린 원)을 보여준다. 희석 속도는 1일당 CSTR로부터 제거된 전체 세포 수확물의 용적을 생물반응기의 작업 용적으로 나누어 계산된다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 14a는 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험에서 N-1 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 다이아몬드) 및 락테이트(열린 다이아몬드) 농도를 나타내는 그래프 이다.
도 14b는 캐스케이딩 CSTR 공정에서 1:2.5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 사각형) 및 락테이트(열린 사각형) 농도를 나타내는 그래프이다. 수직 파선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 14c는 캐스케이딩 CSTR 공정에서 1:5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 삼각형) 및 락테이트(열린 삼각형) 농도를 나타내는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 14d는 캐스케이딩 CSTR 공정에서 1:10 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 원) 및 락테이트(열린 원) 농도를 나타내는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 15는 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험에서 정상 상태 조건에서 시간에 대해 플롯팅된 용적당 생산된 항체 생성물의 총 질량을 나타내는 그래프이다. 독립형 단위 작업으로서의 N-1 CSTR은 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:2.5 생산 CSTR은 열린 사각형으로 표시되며, 1:5 생산 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:10 생산 CSTR은 열린 원으로 표시된다. 이 재료 균형의 세부사항은 본 출원의 실험 섹션에 기재되어 있다. 생물반응기가 희석 속도, 생존 세포 밀도 및 대사산물과 관련하여 거의 정상 상태 조건에 있을 때, 시간에 대해 플롯팅된 리터당 그램(g/L) 단위의 생산된 총 생성물에 대해 선형 회귀가 수행되었다. 생성된 직선의 기울기는 1일당 리터당 그램(g/L/일) 단위의 정상 상태 용적 생산성이다.
도 16은 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험을 위한 생물반응기에서의 항체 생성물 농도 또는 역가를 나타내는 그래프이다. N-1 CSTR은 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:2.5 CSTR은 열린 사각형으로 표시되며, 1:5 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:10 CSTR은 열린 원으로 표시된다.
도 2는 예시적인 생물반응기 구성을 예시하는 개략도이다. 이러한 구성에서, 세포 보유 장치로서 하이드로사이클론을 사용하는 N-1 관류 생물반응기는 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 N 단계 생산 생물반응기로서 작동하는 제2 연속-유동 교반 탱크 반응기(CSTR)에 연속적으로 공급한다. N-1 관류 생물반응기는 일정한 용적으로 유지되었고, 관류 배지가 공급되었다. 600 시리즈 Watson Marlow 연동 펌프는 N-1 배양물을 3L/min로 하이드로사이클론에 공급하여 2.4bar의 작동 압력에 도달한다. 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 N-1 생물반응기로 다시 재순환되는 반면 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 370mL/min의 유속으로 제2 연동 펌프(500 시리즈 Watson Marlow)를 사용하여 생산 CSTR에 첨가되었다. 농축된 영양소 공급물도 생산 CSTR에 직접 첨가되었다. 생산 CSTR은 세포 보유 장치를 사용하지 않았고 전체 세포 수확물은 생산 CSTR을 일정한 용적으로 유지하기 위해 생물반응기로부터 제거되었다.
도 3은 예시적인 N-1 관류 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 사용되는 예시적인 하이드로사이클론의 도면이다. 다이어그램에 표시된 치수는 본원에 기재되어 있다.
도 4a는 세포 보유 장치로서 하이드로사이클론을 사용하는 예시적인 N-1 관류 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 측정된 생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 다이아몬드로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 다이아몬드로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 4b는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 실험에서 1:5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 사각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 사각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 4c는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 실험에서 1:10 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 삼각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 삼각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 4d는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 실험에서 1:20 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 원으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 원으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 5a는 실시예 1에서 사용된 N-1 관류 생물반응기에서의 잔류 글루코스(닫힌 다이아몬드) 및 락테이트(열린 다이아몬드) 농도를 보여주는 그래프이다.
도 5b는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 시스템에서 1:5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 사각형) 및 락테이트(열린 사각형) 농도를 보여주는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(High-End pH Delivery of Glucose, HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 5c는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 시스템에서 1:10 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 삼각형) 및 락테이트(열린 삼각형) 농도를 보여주는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 5d는 하이드로사이클론을 사용한 연결된 생물반응기 시스템에서 1:20 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 원) 및 락테이트(열린 원) 농도를 보여주는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 6은 N-1 관류 생물반응기에서 세포 보유 장치로서 사용된 예시적인 하이드로사이클론에 의해 달성된 총 분리 효율(닫힌 다이아몬드) 및 감소된 분리 효율(열린 다이아몬드)을 보여주는 플롯이다. 계산은 이 텍스트의 실험 섹션에 기재되어 있다.
도 7은 N-1 관류 생물반응기에서의 관류 속도(닫힌 다이아몬드) 및 예시적인 하이드로사이클론 오버플로우 스트림으로부터의 계산된 유효 세포 블리드(열린 다이아몬드)를 보여주는 그래프이다. 관류 속도는 1일당 반응기 용적(RV/일)으로 열거되며 이는 1일당 N-1 생물반응기에 첨가되는 관류 배지의 용적을 N-1 생물반응기의 작업 용적으로 나누어 계산된다. 계산된 세포 블리드 또한 RV/일로 열거되며 이는 관류 속도에 오버플로우 스트림 생존 세포 밀도 대 생물반응기 생존 세포 밀도의 비율을 곱하여 계산된다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 8은 1:5 생산 CSTR(닫힌 사각형), 1:10 생산 CSTR(닫힌 삼각형) 및 1:20 생산 CSTR(닫힌 원)에서의 희석 속도를 보여주는 그래프이다. 희석 속도는 RV/일로 열거되며 이는 매일 생물반응기로부터 제거된 전체 세포 수확물의 용적을 생물반응기의 작업 용적으로 나누어 계산된다. 수직 점선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 9는 하이드로사이클론을 사용하는 예시적인 연결된 생물반응기 시스템에서 정상 상태 조건에서 시간에 대해 플롯팅된 용적당 생산된 항체 생성물의 총 질량을 보여주는 그래프이다. 독립형 단위 작업으로서의 N-1 관류는 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:5 생산 CSTR은 열린 사각형으로 표시되며, 1:10 생산 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:20 생산 CSTR은 열린 원으로 표시된다. 이러한 재료 균형 계산의 세부사항은 본 출원의 실험 섹션에 기재되어 있다. 생물반응기가 관류 속도 또는 희석 속도, 생존 세포 밀도 및 대사산물과 관련하여 거의 정상 상태 조건에 있을 때, 시간에 대해 플롯팅된 리터당 그램(g/L) 단위의 생산된 총 생성물에 대해 선형 회귀를 수행하였다. 생성된 선의 기울기는 1일당 리터당 그램(g/L/일)의 정상 상태 용적 생산성이다. 두 개의 정상 상태는 파선으로 원으로 표시된다.
도 10은 생물반응기에서의 항체 생성물 농도 또는 역가의 그래프이다. N-1 관류는 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:5 생산 CSTR은 열린 사각형으로 표시되고, 1:10 생산 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:20 생산 CSTR은 열린 원으로 표시된다.
도 11은 예시적인 캐스케이딩 CSTR 생물반응기 구성을 예시한 다이아그램이다. 이러한 구성에서, N-1 생물반응기는 CSTR로서 일정한 용적으로 작동되었다. 전체 세포 블리드가 생물반응기로부터 반연속적으로 제거되고 N-1 CSTR보다 2.5 내지 10배 더 큰 N 스테이지 생산 CSTR에 공급됨에 따라 관류 배지가 N-1 CSTR에 첨가되었다. 이러한 생산 CSTR에는 또한 농축된 공급물이 직접 공급되면서 전체 세포 수확물은 생물반응기로부터 연속적으로 제거되어 생산 CSTR을 일정한 용적으로 유지하였다. N-1 CSTR이나 생산 CSTR은 이 구성에서 세포 보유 장치를 사용하지 않았다.
도 12a는 예시적인 N-1 CSTR에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 다이아몬드로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 다이아몬드로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 12b는 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1:2.5 용적비를 시뮬레이션하는 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 사각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 사각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계 및 생산 CSTR이 N-1 CSTR로부터 분리되고 독립형 생산 CSTR로 작동하는 시점을 나타낸다.
도 12c는 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1:5 용적비를 시뮬레이션하는 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 삼각형으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 삼각형으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계 및 생산 CSTR이 N-1 CSTR로부터 분리되고 독립형 생산 CSTR로 작동하는 시점을 나타낸다.
도 12d는 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1:10 용적비를 시뮬레이션하는 예시적인 생산 CSTR 생물반응기에 대해 트리판 블루 배제에 의해 측정된 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 생존 세포 밀도는 닫힌 원으로 표시되며 왼쪽 y축에 해당한다. 세포 생존율은 열린 원으로 표시되며 오른쪽 y축에 해당한다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 13은 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험에서 1일당 반응기 용적(RV/일)의 희석 속도를 보여준다. 그래프는 N-1 CSTR(닫힌 다이아몬드), 1:2.5 생산 CSTR(열린 사각형), 1:5 생산 CSTR(열린 삼각형) 및 1:10 생산 CSTR(열린 원)을 보여준다. 희석 속도는 1일당 CSTR로부터 제거된 전체 세포 수확물의 용적을 생물반응기의 작업 용적으로 나누어 계산된다. 수직 파선은 정상 상태의 경계를 나타낸다.
도 14a는 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험에서 N-1 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 다이아몬드) 및 락테이트(열린 다이아몬드) 농도를 나타내는 그래프 이다.
도 14b는 캐스케이딩 CSTR 공정에서 1:2.5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 사각형) 및 락테이트(열린 사각형) 농도를 나타내는 그래프이다. 수직 파선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 14c는 캐스케이딩 CSTR 공정에서 1:5 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 삼각형) 및 락테이트(열린 삼각형) 농도를 나타내는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 14d는 캐스케이딩 CSTR 공정에서 1:10 용적비를 시뮬레이션한 예시적인 생산 CSTR에서의 잔류 글루코스(닫힌 원) 및 락테이트(열린 원) 농도를 나타내는 그래프이다. 수직 점선은 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG) 제어가 중단된 시점을 나타낸다.
도 15는 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험에서 정상 상태 조건에서 시간에 대해 플롯팅된 용적당 생산된 항체 생성물의 총 질량을 나타내는 그래프이다. 독립형 단위 작업으로서의 N-1 CSTR은 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:2.5 생산 CSTR은 열린 사각형으로 표시되며, 1:5 생산 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:10 생산 CSTR은 열린 원으로 표시된다. 이 재료 균형의 세부사항은 본 출원의 실험 섹션에 기재되어 있다. 생물반응기가 희석 속도, 생존 세포 밀도 및 대사산물과 관련하여 거의 정상 상태 조건에 있을 때, 시간에 대해 플롯팅된 리터당 그램(g/L) 단위의 생산된 총 생성물에 대해 선형 회귀가 수행되었다. 생성된 직선의 기울기는 1일당 리터당 그램(g/L/일) 단위의 정상 상태 용적 생산성이다.
도 16은 실시예 1의 캐스케이딩 CSTR 실험을 위한 생물반응기에서의 항체 생성물 농도 또는 역가를 나타내는 그래프이다. N-1 CSTR은 닫힌 다이아몬드로 표시되고, 1:2.5 CSTR은 열린 사각형으로 표시되며, 1:5 CSTR은 열린 삼각형으로 표시되고, 1:10 CSTR은 열린 원으로 표시된다.
하기 상세한 설명에서, 본 발명의 기술에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나, 당업계의 통상의 숙련가에게는 본 발명의 기술이 이러한 특정 세부사항 중 일부 없이 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 다른 예에서, 잘 알려진 구조 및 기술은 본 발명의 기술을 모호하게 하지 않도록 상세하게 나타내지 않았다.
본 발명의 기술에 대한 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 아래에 정의되어 있다:
정의:
본원에 사용된 문법적 관사["one", "a", "an" 및 "the"]는 달리 지시되지 않는 한 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 관사는 본원에서 관사의 문법적 대상들 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "구성요소(a component)"는 하나 또는 그 이상의 구성요소를 의미하며, 따라서, 가능하게는, 하나 이상의 구성요소가 고려되고, 기재된 양태들의 구현에 채용되거나 사용될 수 있다.
용어 "약"은 일반적으로 측정에서의 약간의 오차를 나타내며, 종종 특정 신뢰 수준(일반적으로 68% C.I.의 경우 ±1σ) 내의 참값(true value)을 포함하는 값의 범위로 명시된다. 용어 "약"은 또한 정수 및 정수의 ±20%의 값으로서 기재될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 특정 항원을 인식하고 결합할 수 있는 단백질을 광범위하게 지칭한다. 상기 용어는 구체적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 이량체, 다량체, 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 항체 단편(예를 들어, Fab 단편, F(ab')2, 절단된 항체로부터의 Fv 단편 또는 Fc 단편, scFv-Fc 단편, 미니바디, 디아바디 또는 scFv) 및 이중 및 단일 쇄 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체 및 암 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또한, 상기 용어는 항체의 유전자 조작 유도체를 포함한다. 항체, 항체의 단편 및 유전자 조작된 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다.
용어 "생체중합체"는 단편, 다량체, 응집체, 접합체, 융합 산물 등을 포함하여, 천연 또는 생물학적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있는 핵산 중합체(예를 들어, DNA, RNA), 폴리펩티드, 단백질 또는 바이러스 입자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 생성물"은 본원에 사용되는 바와 같이 생산되어 세포 배양물로부터 단리될 수 있는 분자를 지칭한다. 생물학적 생성물은 생체중합체, 예를 들어, 핵산, 폴리펩티드(예를 들어, 단백질), 항체, 탄수화물 또는 지질일 수 있다. 본원에 개시된 시스템 및 방법을 사용하여 생산된 생물학적 생성물은 주어진 생성물에 대해 당업계에 공지된 방법에 의해 정제되고, 관심있는 최종 상업적으로 관련된 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)로 제형화되고, 적합한 용기에 포장될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생물반응기"는 예를 들어, 세포 또는 무세포 효소를 함유하여 원료를 생물학적 생성물(및 일부 경우 덜 바람직한 불순물)로 변형시키는 생물학적 활성 환경을 제공하는 제조되거나 조작된 장치를 지칭한다. 생물반응기 내에서, 조건(예를 들어, 가스, 유속, 온도, pH 및 교반 속도/순환 속도)은 일반적으로 균일하며 세포로의 영양소의 공급 및 불순물의 제거를 조작함으로써 정밀하게 제어될 수 있다. 생물반응기는 작동 모드에 따라 배치식, 공급-배치식 또는 연속식(예를 들어, 연속 배양 또는 연속 교반-탱크 반응기(CSTR))으로 분류할 수 있다. 일반적으로 생물반응기는 밀리리터에서 입방 미터까지 크기가 다양한 원통형 또는 입방체이며, 종종 스테인리스 강 또는 플라스틱으로 만들어진다. 특정 양태에서, 생물반응기는 일회용이거나 사용후 버릴 수 있다. "케모스태트"는 배양 용적을 일정하게 유지하기 위해 배양액을 지속적으로 제거하면서 신선한 배지를 지속적으로 첨가하는 생물반응기이다.
본원에 사용된 용어 "세포 밀도"는 주어진 용적의 배지에 존재하는 세포의 수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포 보유 시스템" 또는 "세포 보유 장치"는 생물반응기를 떠나는 유체 내의 세포의 밀도가 생물반응기 내의 유체 중의 세포의 밀도보다 낮도록 생물반응기 내에서 생존 세포를 선택적으로 보유하는 수단을 지칭한다. 이러한 의미에서, 세포 보유 장치는 세포 분리 장치와는 상이하다.
본원에 사용된 용어 "세포 생존율"은 배양물 중의 세포가 주어진 일련의 배양 조건 또는 실험적 변형하에서 생존하는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 용어는 또한 그 때의 배양물 중의 세포, 살아 있는 세포 및 죽은 세포의 총 수와 비교하여 특정 시간에 살아 있는 세포의 그 부분을 지칭한다.
단위(예를 들어, 개별 생물반응기)의 맥락에서 본원에 사용된 용어 "연속"은 일정 기간, 예를 들어, 일, 주, 월 또는 년의 기간에 걸쳐 작동하는 단위를 지칭한다.
공정의 맥락에서 용어 "연속"은 그 사이에 0 또는 최소 보유 용적을 갖는 둘 이상의 통합된 (물리적으로 연결된) 연속 단위 작업을 지칭한다. 모든 단위 작업이 연속적이고 통합된 경우, 이러한 공정을 완전 연속 또는 종단 간 연속이라고도 한다. 공정이 배치 및 연속 단위 작업 둘 다, 예를 들어 연속 업스트림 공정(세포 배양 및 표적 단백질의 합성) 및 배치 다운스트림(단백질을 약물 성분 또는 의약품으로 정제 및 제형화)으로 구성된 경우 공정은 하이브리드이다. 본원에 기재된 연결된 생물반응기의 특정 맥락에서, 용어 "연속"은 일정하거나 비주기적인 액체 전달을 지칭한다.
일반적으로, 시스템의 개시시, 연속 또는 반연속 모드로 배양 생물반응기에서 생산 생물반응기로의 세포 블리드/전달 속도는 세포 성장 속도보다 낮을 것이므로 세포 밀도가 관류 반응기에서 증가하여 정상-상태 조건에 도달할 수 있다. 일단 정상 상태에서 세포 블리드 속도는 동일하거나, 성장 속도보다 매우 약간 낮다. 관류 생물반응기에서 발생하는 세포 사멸의 수준은 항상 낮을 것이다. 정상 상태에서, 관류 생물반응기로부터의 세포의 블리드 속도는 정상 상태 성장 속도보다 약간 낮을 것이며, 즉 성장 속도에서 사망 속도를 뺀 값이 블리드 속도와 동일할 것이다.
본원에 사용된 용어 "배양물" 및 "세포 배양물" 및 "포유동물 세포 배양물"은 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건하에 배지에서 유지되거나 성장하는 표면-부착된 또는 현탁액 중의 세포 집단을 지칭한다. 이 용어는 또한 세포 집단 및 집단이 현탁된 배지를 지칭할 수 있다.
용어 "배양 생물반응기"(예를 들어, N-1 생물반응기, N-1 관류 생물반응기)는 세포(예를 들어 포유동물 세포)를 배양하여 생산 반응기에 대한 접종물의 공급원으로서 기능하며, 즉, 시드 생물반응기로서 기능하는, 생산 반응기의 상류에 있는 생물반응기를 지칭한다. 접종물은 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론으로부터의 오버플로우로서 생산 생물반응기로 블리딩/이동된다.
바이오프로세싱 또는 바이오제조와 관련하여 용어 "다운스트림 구성요소"는 생산 생물반응기의 다운스트림에 있는 임의의 및 모든 구성요소를 포함한다. 이들은, 예를 들어, 정화, 포획, 정제, 연마, 제형화 및/또는 포장을 허용하는 구성요소를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 구성요소는 크로마토그래피 컬럼이다. 용어 "다운스트림 단계"는 생산 생물반응기에서 관심있는 생체분자의 생산과 관련하여 유사한 의미를 갖는다.
이러한 맥락에서 용어 "하이드로사이클론"은 유체 저항에 대한 구심력의 비율에 기초하여 액체 현탁액에서 입자를 분리하거나 분류하는 장치를 지칭한다. 하이드로사이클론은 일반적으로 액체가 접선 방향으로 공급되는 상단에 원통형 섹션, 및 원뿔형 바닥을 가질 것이다. 하이드로사이클론의 다양한 치수, 예를 들어 원뿔형 섹션의 각도 및 길이 뿐만 아니라 하이드로사이클론의 내부 형상의 다른 치수는 장치의 작동 특성에 영향을 줄 수 있다. 하이드로사이클론은 유체가 높은 유속으로 장치를 순환함에 따라 내부 원심력을 생성하여 대량 배양 유체로부터 세포를 분리한다. 유체는 장치 상단 근처의 하나 또는 두 개의 작은 포트를 통해 들어가서 유입물을 내부 원뿔 형상에 접선 방향으로 향하게 한다. 챔버를 통한 유동은 세포를 벽으로 밀어내는 1차 와류를 생성하는 반면 원뿔형 테이퍼는 농축된 세포를 아래쪽으로 안내하여 하단 포트를 통해 떠난다(언더플로우). 동시에, 부분적으로 세포-고갈된 유체는 위쪽으로 이동하여, 상단의 포트를 통해 장치를 빠져나갈 때까지 2차 와류를 생성한다(오버플로우)(도 1).
공정과 관련하여 본원에 사용된 용어 "하이브리드"는 연속 및 배치 서브공정 둘 다를 포함하는 공정을 지칭한다. 하이브리드 공정은, 예를 들어, 연속 업스트림 공정과 배치 다운스트림 공정 또는 배치 업스트림 공정과 연속 다운스트림 공정을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "불순물"은 배양 공정 동안 생성된 바람직하지 않은 화학적 또는 생물학적 화합물을 지칭한다. 불순물은 예를 들어 에틸 알콜, 부틸 알콜, 락트산, 아세톤 에탄올, 가스상 화합물, 펩티드, 지질, 암모니아, 방향족 화합물, 및 DNA 및 RNA 단편 뿐만 아니라 생물학적 생성물의 배지 성분 또는 분해 생성물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접종물"은 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로 블리딩/이동되어 그 안에서 배양을 위한 숙주 세포의 과정으로서 기능하는 부분적으로 세포-고갈된 유체를 지칭한다. 접종물은 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하여 접종물로서 생산 생물반응기에 오버플로우를 제공하는 하이드로사이클론의 중간 생성물이다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분획화를 거치고 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 생물학적 분자 또는 유사한 분자의 그룹을 지칭한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 명칭은 조성물 중 영양소의 활성 형태가 조성물 중의 총 분자의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.
본원에 사용된 용어 "배지(media)" 또는 "배지(medium)" 또는 "세포 배양 배지"는 배양된 세포에 영양을 공급하는 영양소를 함유하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질 및 미량 원소를 제공한다. 용액은 또한 호르몬 및 성장 인자를 포함하여 최소 속도 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분을 함유할 수 있다. 용액은 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다.
본원에 사용된 용어 "연결된 생물반응기"는 직접 또는 간접적인 연결을 갖는 2개 이상의 생물반응기를 지칭한다(예를 들어, 하이드로사이클론은 간접 연결을 제공한다). 본원에 기재된 양태에서, 연결된 생물반응기는 2-스테이지 연결된-생물반응기 시스템일 수 있으며, 여기서 제1 스테이지는 배양 또는 "시드" 스테이지(생물반응기)이고 제2 스테이지는 생산 스테이지(생물반응기)이다.
본원에 사용된 용어 "관류 생물반응기" 또는 "배양 생물반응기"는 세포가 생물반응기의 반응기 챔버 내에 보유되지만 세포 배양 배지의 적어도 일부가 연속적으로 제거(및 보충)되도록 연속적으로 작동되는(예를 들어, 입력 스트림 및 출력 스트림은 지정된 기간에 걸쳐 0이 아닌 유속을 가짐) 생물반응기를 지칭한다. 본원에 개시된 특정 양태에서, 배양 및 생산 생물반응기 둘 다는 관류 생물반응기이다.
본원에 사용된 용어 "관류 배양"은 신선한 배지가 시간이 지남에 따라 배양물에 연속적으로 또는 반연속적으로 제공되고 이전에 도입된 배지(불순물 포함)는 제거되는 세포 배양 방법을 지칭한다. 매일 제거 및 교체되는 배지의 분획은 배양되는 특정 세포, 초기 시딩 밀도 및 특정 시간의 세포 밀도에 따라 달라질 수 있다. "RV 또는 "반응기 용적"은 배양 공정의 시작시에 존재하는 배양 배지의 용적(예를 들어, 시딩 후에 존재하는 배양 배지의 총 용적)을 의미한다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기의 시동 동안, 작업 용적은 최종 작업 용적의 약 70%, 또는 약 60 내지 약 80%이다. 전형적으로, 시동 후 처음 며칠(예를 들어 약 2 내지 약 4일)에 걸쳐, 용적은 최종 작업 용적에 도달할 때까지 생물반응기에 축적(또는 증가)된다. RV/일 단위의 희석 속도는 배양 시작시(즉, 시동시)에 시작하는 작업 용적이 아닌 최종 작업 용적을 기준으로 계산된다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "생산 생물반응기" 또는 "N 생물반응기" 또는 "CSTR 생물반응기" 또는 "CSTR 생산 생물반응기"는 세포 보유 시스템 또는 장치를 이용하지 않는 생물반응기를 지칭한다. 생산 생물반응기는 하나 이상의 업스트림 배양 생물반응기(들)에 연결되고 배양 생물반응기(들)로부터 접종물을 수용한다. 생산 생물반응기는 균일하게 혼합되고, 유체 유출과 동등한 유체 유입을 가지며, 따라서, 거의 일정한 용적을 유지한다. 이러한 생산 생물반응기는 충분히 오랜 기간 동안 작동할 때 반드시 그런 것은 아니지만 종종 '화학적으로 정적' 또는 '정상 상태' 환경을 달성할 것이며, 이는 세포 밀도 및 배양물의 다른 측면(예를 들어, 영양소의 농도 등)이 안정한(즉, 정상 또는 정적) 상태에 도달할 것임을 의미하며, 따라서 일반적으로 '케모스태트'라고도 지칭된다. 생산 생물반응기로의 유체 유입 및/또는 유출은 독립적으로 연속적이거나 반연속적일 수 있다. 이러한 생산 생물반응기는 3주, 4주, 5주 또는 6주 이상의 기간 동안 연속적으로 작동한다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물반응기로의 및/또는 생물반응기로부터의 액체 전달의 맥락에서 용어 "반연속"은 '주기적'을 의미하거나, 액체(예를 들어, 배지 단독 및/또는 세포를 가짐, 세포 블리드)가 장기간에 한 번씩 생물반응기에 첨가 및/또는 생물반응기로부터 제거되는 시나리오를 지칭한다. 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 45 또는 60분마다 한 번, 또는 매시간 한 번, 또는 2 내지 3시간마다 한 번, 또는 1분 내지 24시간의 장기간마다 한 번씩, 액체의 버스트가 수 초(예를 들어, 1초, 2초, 5초 10초, 20초 또는 60초) 내지 수 분(예를 들어, 2분, 5분, 10분, 25분, 50분, 120분 또는 240분)으로 연장되는 기간 동안 생물반응기로부터 및/또는 생물반응기로 전달된다.
용어 "작업 용적"은 생물반응기의 전체 용적의 일부를 지칭한다. 일부 양태에서, 작업 용적은 공급 및/또는 샘플링이 발생한 후에도 실질적으로 일정하다.
하이드로사이클론
본원에는 본원에 기재된 시스템 및 방법에 사용하기 위한 하이드로사이클론이 개시되어 있다. 일반적으로, 하이드로사이클론은 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기와 유체 연통하는 세포 보유 장치로서 기능하며, 여기서 하이드로사이클론은 배양 생물반응기를 떠나는 유체 내의 세포의 밀도가 배양 생물반응기 내의 유체 내의 세포의 밀도보다 낮도록 배양 생물반응기 내의 생존 세포의 보유를 용이하게 한다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 세포 보유 장치로서 기능하거나 이를 대체한다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 표적 생물학적 분자(예를 들어, 단백질과 같은 생체중합체)의 생산을 위한 시스템 및 방법에서 세포 보유 장치로서 기능하거나 이를 대체한다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 대규모(>1,000L) 생산 시스템에서 표적 생물학적 분자의 생산을 위한 시스템 및 방법에서 세포 보유 장치로서 기능하거나 이를 대체한다.
전형적으로, 오늘날 사용되는 종래의 막-기반 세포 보유 시스템은 100% 세포 보유 시스템이다. 막-기반 세포 보유 시스템을 사용하는 경우, 세포의 별도의 블리드를 N-1 생물반응기로부터 직접 취하고, 생산 생물반응기로 옮긴다. 대규모에서, 막-기반 세포 보유 시스템은, 지속적인 장기 배양 공정 동안 교체해야 할 수 있기 때문에, 비용이 많이 들고, 막히기 쉬워 시스템 고장이 발생하고, 세척 및 재사용이 어렵고, 멸균이 어렵고, 공정에 추가적인 오염 위험이 발생할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 막-기반 세포 보유 장치를 하이드로사이클론으로 대체하는 것은 표적 생물학적 분자의 생산을 위한 이러한 시스템이 막-기반 세포 보유 장치에 의존하는 시스템에 대해 실현 가능한 것 이상으로 확장(scale up)될 수 있게 한다.
한 양태에서, 하이드로사이클론은 필적하는 종래의 막 세포 보유 장치에 비해 하나 이상의 개선된 특성을 나타내며, 여기서 하나 이상의 개선된 특성은 높은 생존 세포 밀도(VCD) 및/또는 높은 관류 속도(PR)로 나타난다. 높은 생존 세포 밀도는 약 20x106개 세포/mL 내지 약 250x106개 세포/mL의 범위이다. 높은 관류 속도는 적어도 약 1 VVD(1일당 생물반응기 용적당 배지의 용적)이다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론에 들어가는 세포의 약 85 내지 약 95%, 보다 특히 약 90 내지 약 95%, 보다 특히 약 85%, 약 87%, 약 90%, 약 92%, 약 94% 또는 약 95%는 보유되고 언더플로우 (또는 언더플로우 스트림)를 통해 배양 생물반응기로 되돌아간다.
하이드로사이클론은 당업계에 공지되어 있다. 한 양태에서, 하이드로사이클론은 액체가 들어가는 상부에 원통형 섹션, 및 원뿔형 바닥을 갖는다. 전형적으로, 하이드로사이클론은 반대 방향으로 축에 출구를 갖는다: 언더플로우 (또는 수용)에서 더 크고 오버플로우 (또는 거부)에서 더 작다. 언더플로우 스트림은 일반적으로 밀도가 높거나 두꺼운 부분인 반면 오버플로우 스트림은 더 가볍거나 더 많은 유체 분획이다. 오버플로우 스트림은 부분적으로 세포-고갈된 접종물을 생산 반응기에 제공한다.
하이드로사이클론의 기하학적 구조는 다를 수 있다. 한 양태에서, 하이드로사이클론은 도 3 및/또는 표 1에 나타낸 기하학적 구조를 갖는다.
하이드로사이클론의 치수는 다를 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 하이드로사이클론의 치수는 예를 들어, 오버플로우 직경(Do), 언더플로우 직경(Du), 챔버 직경(Dc), 원뿔형 섹션 길이(Ls), 원통형 섹션 길이(Lc), 와류 탐지기 길이(Lv), 및 언더플로우 출구 길이(Lu), 입구 초기 직경(Dii), 입구 최종 직경(Dii), 와류 탐지기 내부 직경(Dvi), 와류 탐지기 벽 두께(W), 오버플로우 출구 길이(Lo) 및 입구 길이(Li)를 포함한다. 일반적으로, 와류 탐지기 내부 직경은 오버플로우 직경과 같다.
한 양태에서, 오버플로우 직경은 약 1 내지 약 3mm의 범위이다. 한 양태에서, 언더플로우 직경은 약 1 내지 약 4mm 범위이다. 한 양태에서, 챔버 직경은 약 5 내지 약 15mm, 또는 약 8 내지 약 12mm의 범위이다. 한 양태에서, 원뿔형 섹션 길이는 약 50 내지 약 170mm, 또는 약 60 내지 약 80mm의 범위이다. 한 양태에서, 원통형 섹션 길이는 약 2 내지 약 20mm, 또는 약 2 내지 약 6mm의 범위이다. 한 양태에서, 와류 탐지기 길이는 약 1 내지 약 4mm의 범위이다. 한 양태에서, 언더플로우 출구 길이의 길이는 약 0 내지 약 40mm, 또는 약 1 내지 약 40mm의 범위이다.
한 양태에서, 입구 초기 직경은 약 3 내지 약 13mm, 또는 약 6 내지 약 11mm의 범위이다. 한 양태에서, 입구 최종 직경은 약 1 내지 약 3mm의 범위이다. 한 양태에서, 와류 탐지기 내부 직경(Dvi)은 약 1 내지 약 3mm의 범위이다. 한 양태에서, 와류 탐지기 벽 두께(W)는 약 0.3 내지 약 2mm, 또는 약 0.3 내지 약 1mm의 범위이다. 한 양태에서, 오버플로우 출구 길이(Lo)는 약 0 내지 약 40mm, 또는 약 1 내지 약 40mm의 범위이다. 한 양태에서, 입구 길이(Li)는 약 10 내지 50mm의 범위이다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론의 각 부분의 치수는 비례한다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 도 1에 나타낸 구성을 갖는다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 도 3에 나타낸 구성을 갖는다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 표 1에 나타낸 치수를 갖는다.
한 양태에서, 하이드로사이클론은 본원에 개시된 시스템 및 방법에 사용하기에 적합하다. 또 다른 양태에서, 하이드로사이클론은 본원에 개시된 시스템 및 방법의 구성요소이다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 업스트림 배양 생물반응기에 연결된다. 한 양태에서, 하이드로사이클론은 연동 펌프에 의해 배양 생물반응기에 연결된다. 농축된 세포의 스트림은 무제한 언더플로우 스트림으로 하이드로사이클론에서 배양 반응기로 되돌아간다. 일반적으로, 연동 펌프(예를 들어, 600 시리즈, Watson Marlow, Wilmington, MA)는 배양 생물반응기로부터 튜빙(예를 들어, 9.5-mm 내부 직경(ID) 튜빙)을 통해 하이드로사이클론으로의 유동을 공급하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 배양 반응기로부터 하이드로사이클론으로의 유동은 장치 내에서 원하는 압력 강하(예를 들어 약 2.4-2.6bar의 압력 강하)를 생성하기 위해 약 2 내지 약 4L/분, 또는 약 3L/분의 속도로 이루어진다. 특정 양태에서, 농축된 세포의 스트림은 무제한 언더플로우 스트림으로 배양 생물반응기로 되돌아간다. 특정 양태에서, 언더플로우 스트림은 하이드로사이클론의 하부에 걸쳐 끼워맞춰진 원하는 길이(예를 들어, 약 15cm)의 튜빙(예를 들어, 25.4mm의 내부 직경을 갖는 튜빙)을 통해 배양 반응기로 되돌아갔다. 하이드로사이클론의 하부로부터의 튜빙은 배양 생물반응기에 연결되는 튜빙의 더 좁은 부분에 연결될 수 있다. 예를 들어, 25.4mm ID 튜빙은 3D 인쇄 이중 호스 미늘 감속기(hose barb reducer)를 사용하여 4cm에 걸쳐 9.5mm ID 튜빙으로 축소될 수 있다. 9.5mm ID 튜빙은 감속기에 부착되고 생물반응기에 용접될 수 있다.
전형적으로, 제2 연동 펌프(예를 들어, 500 시리즈, Watson Marlow, Wilmington, MA)는 튜빙(예를 들어, 9.5mm 내부 직경(ID) 튜빙)을 통해 생산 반응기로 배양 생물반응기/하이드로사이클론 시스템을 떠나는 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림의 유동을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론으로부터 생산 반응기로의 유동은 원하는 최대 일일 관류 용적(예를 들어 약 532L의 용적)을 달성하기 위해 약 320 내지 약 420mL/분, 또는 약 370mL/분의 유속으로 이루어진다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 다운스트림 생산 생물반응기에 연결된다. 한 양태에서, 하이드로사이클론은 연동 펌프에 의해 다운스트림 생산 생물반응기에 연결된다.
하이드로사이클론은 각각의 경우에 숙주 세포의 배양 및 특히, 본원에 개시된 시스템 및 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이러한 숙주 세포로부터 적어도 하나의 생물학적 분자의 생산을 위해 벤치-크기 시스템 또는 방법, 파일럿-크기 시스템 또는 방법, 또는 제조-크기 시스템 또는 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다. 한 양태에서, 하이드로사이클론은 벤치-크기 시스템, 파일럿-크기 시스템 또는 제조-크기 시스템에 대한 크기 및 다른 적절한 치수를 갖는다.
일반적으로, 본원에 기재된 시스템 및 방법에 대해, 시스템의 크기 또는 용량이 증가함에 따라 시스템에 사용되는 하이드로사이클론의 수가 증가하여 시스템 또는 방법의 증가된 생산을 제공할 수 있다. 예를 들어, 시스템의 용량 또는 유체 용적이 증가되거나 확장되는 경우, 시스템 내의 하이드로사이클론의 수는 용량 또는 유체 용적의 증가를 수용하기 위해 증가될 수 있다. 특정 양태에서, 2개 이상의 하이드로사이클론이 시스템에 포함될 때, 상기 하이드로사이클론은 병렬로 작동된다.
하이드로사이클론은 임의의 적절한 재료로 만들어질 수 있다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 금속(예를 들어, 강철) 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리프로필렌 또는 폴리우레탄)으로 만들어진다. 상기 하이드로사이클론은 통상적인 제조 방법 또는 적층 제조(즉, 3D 인쇄)에 의해 제조될 수 있다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 금속으로 만들어진다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 스테인리스 강으로 구성되며, 이는 산업용 생물반응기 상에서 제자리에서 세척 및 멸균될 수 있다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 통상적인 제조 또는 적층 제조(즉, 3D 인쇄)에 의해 플라스틱(예를 들어, 생체적합성 플라스틱)으로부터 제조된다. 이들은 감마선 조사 또는 열에 의해 멸균될 수 있으며 일회용 구성요소로서 제공될 수 있다.
특정 양태에서, 하이드로사이클론은 3D 인쇄된 생체적합성 플라스틱으로 제조된다. 재료 압출, 바트(vat) 중합(예를 들어 광조형(SLA)), 분말 베드 융합 및 분말 베드 분사의 방법을 포함하는 3D 인쇄의 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다. 한 양태에서, 하이드로사이클론은 오토클레이브성 및 생체적합성 수지를 사용하는 반전된 광조형 프린터를 사용하여 3D 인쇄된다.
한 양태에서, 하이드로사이클론 구성은 낮은 에너지 소비를 특징으로 한다.
본원에 기재된 하이드로사이클론은 오버플로우 스트림으로부터 CSTR로 유동할 수 있는 1일당 약 200 내지 약 550 리터의 세포 배양 유체로부터 세포를 분리하거나 적어도 세포의 농도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론의 내부 유동 챔버의 용적은 약 14mL 미만, 약 10mL 미만, 또는 약 5mL 미만이다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론의 내부 유동 챔버의 용적은 약 0.4 내지 약 14mL, 또는 약 2mL 내지 약 5mL의 범위이다.
시스템
본원에 개시된 하이드로사이클론은 세포를 배양하고, 특정 양태에서, 또한 하나 이상의 관심있는 생물학적 분자를 생산하는데 사용하기에 적합한 시스템의 구성요소로서 사용될 수 있다.
전통적으로, 생물학적 생성물을 생산하기 위한 시스템은 배치식 또는 공급-배치식 작동 모드로 작동되었다. 본원에 개시된 특정 양태에서, 시스템은 독성 대사 폐기물을 함유하는 폐배지는 제거되고 영양소를 함유하는 신선한 배지는 첨가됨에 따라 가장 높은 세포 밀도가 달성될 수 있도록 하는 하나 이상의 생물학적 분자 또는 생성물의 연속적 (관류) 생산을 허용하도록 연속적인 방식으로 작동한다.
한 양태에서, 적어도 하나의 배양 생물반응기, 적어도 하나의 생산 생물반응기 및 적어도 하나의 하이드로사이클론(예를 들어, 본원에 개시된 하이드로사이클론)을 포함하는 시스템이 개시되고, 여기서 하이드로사이클론은 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자 또는 생물학적 생성물의 연속 생산을 허용하도록 배양 생물반응기와 생산 생물반응기를 연결하고, 하이드로사이클론은 배양 생물반응기로부터 유체를 수용하고 이를 위한 세포 보유 장치로서 기능한 다음 언더플로우를 배양 생물반응기로 되돌려 보내고 오버플로우(부분적으로 세포-고갈된 유체)를 생산 생물반응기에 제공한다.
한 양태에서, 시스템은 단일 하이드로사이클론을 포함한다.
특정 양태에서, 시스템은 2개 이상의 하이드로사이클론, 예를 들어 단일 대형 펌프로부터 생성된 유체 유동과 병렬로 작동하는 2개 이상의 하이드로사이클론을 포함한다. 한 양태에서, 시스템은 병렬로 작동될 수 있는 2개 이상의 하이드로사이클론을 포함한다. 특정 양태에서, 시스템은 동일한 기하학적 구조의 2개 이상의 하이드로사이클론을 포함한다. 전체 하이드로사이클론 오버플로우 스트림은 배양 반응기보다 약 5 내지 약 20배, 및 보다 특히 배양 반응기보다 약 5 내지 약 18배, 약 5 내지 약 14배, 약 5 내지 약 10배, 또는 약 5배, 약 10배, 약 15배 또는 약 20배 용적이 더 큰 생산 생물반응기에 신선한 세포를 제공하는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 시스템은 (숙주 세포를 배양하고, 특정 양태에서, 생산 반응기에서 생물학적 생성물을 생산하기 위한) 독립형 시스템 또는 하나 이상의 추가(예를 들어, 다운스트림) 구성요소를 함유하는 더 큰 시스템의 일부일 수 있다. 독립형 시스템의 생성물은 생산 생물반응기에서 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자이거나, 또는 임의로, 전체 세포 수확물을 생산하기 위해 하나 이상의 구성요소를 이용한다.
특정 양태에서, 시스템은 하나 이상의 다운스트림 구성요소, 예를 들어 더 큰 시스템을 추가로 포함한다. 이러한 다운스트림 구성요소는 생산 생물반응기(들)의 생성물을 정화, 포획, 정제, 연마 및/또는 포장하기 위한 구성요소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
시스템의 예시적인 생성물은 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자를 함유하는 정화된 생성물, 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자를 함유하는 정제된 생성물, 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자를 함유하는 연마된 생성물, 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자를 함유하는 제형화된 생성물 또는 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자를 함유하는 포장된 생성물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 더 큰 시스템의 생성물은 관심있는 하나 이상의 생물학적 분자를 함유하는 정화되고, 정제되고, 연마되고, 제형화된 생성물이다.
일반적으로, 생산 동안, 본원에 기재된 생물반응기는 숙주 세포(즉, 복수의 숙주 세포) 및 배지를 포함한다. 세포 배양물은 숙주 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 특정 양태에서, 복수의 숙주 세포는 배양된 숙주 세포이다. 숙주 세포는 세포의 배양이 요구되는, 예를 들어 세포의 확장 및/또는 증식을 위한 임의의 세포 공급원으로부터 일 수 있다. 한 양태에서, 세포는 동물, 곤충, 및 식물 세포로부터 선택된다. 세포는 유전자 조작될 수 있으며, 즉 이의 유전자 산물(들)이 세포에 의해 생산되는 하나 이상의 유전자 서열을 함유한다.
한 양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 본원에 사용된 포유동물 세포는 분비된 재조합 치료 단백질의 생산에 적합한 포유동물 세포주이며, 따라서 또한 "숙주 세포"로 지칭될 수 있다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 설치류 세포, 예를 들어 햄스터 세포이다. 포유동물 세포는 단리된 세포 또는 세포주이다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 형질전환 및/또는 불멸화된 세포주이다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 세포 배양물에서 연속 계대에 적합하고, 1차 비형질전환 세포 또는 기관 구조의 일부인 세포를 포함하지 않는다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 BHK21, BHK TK-, Jurkat 세포, 293 세포, HeLa 세포, CV-1 세포, 3T3 세포, CHO, CHO-K1, CHO-DXB11(또한 CHO-DUKX 또는 DuxB11로 지칭됨), CHO-S 세포 및 CHO-DG44 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21이고, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 더욱 더 바람직하다. 특정 양태에서, 포유동물 세포는 CHO-DG44 세포이다. 포유동물 세포, 특히 CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 합성효소(GS)-결핍 유도체가 또한 포함된다. 한 양태에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍 세포 또는 이의 유도체이다.
특정 양태에서, 포유동물 세포는 치료 단백질, 예를 들어 재조합 분비 치료 단백질과 같은 이종 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포는 또한 뮤린 세포, 예를 들어 뮤린 골수종 세포, 예를 들어 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손일 수 있다. 본 발명의 의미에서 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적인 예가 또한 표 1에 요약되어 있다. 그러나, 이들 세포, 인간, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 포유동물 세포의 유도체/자손도 본 발명에서, 특히 바이오의약품 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.
포유동물 생산 세포주의 예는 표 A에 제공된다.
표 A: 포유동물 생산 세포주
1CAP (CEVEC's Amniocyte Production) 세포는 일차 인간 양수 세포를 기반으로하는 불멸화된 세포주이다.
본원에 기재된 시스템 및 방법에 사용될 수 있는 포유동물 세포의 예는 하기 세포주로부터의 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: NSO, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2 (BHK-21 유도체), CHO, CHO 야생형, CHO-DUKX, CHO-DUKX B11, CHO-DG44, CHO Pro-5, CHO-S, Lec13, V79, HEK 293, COS-7, HuNS1, Per. C6, CHO-K1, CHO-K1/SF, CHO-K1 GS, CHOZN GS. 한 양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포 또는 COS 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 양태에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
특정 양태에서, 포유동물 세포는 무혈청 조건하에서 및 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩티드가 없는 배지 중에서 확립되고, 적응되고, 완전히 배양된다. Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640(Sigma), 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(MEM; Sigma), Iscove의 변형된 둘베코 배지(IMDM; Sigma), CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invitrogen), 무혈청 CHO 배지(Sigma) 및 무단백질 CHO 배지(Sigma)와 같은 상업적으로 이용 가능한 배지가 예시적인 적절한 영양 용액이다. 임의의 배지는 필요에 따라 다양한 화합물로 보충될 수 있으며, 이의 비제한적인 예는 재조합 호르몬 및/또는 다른 재조합 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충액(예를 들어, HEPES), 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 기타 등가 에너지원, 항생제 및 미량 원소이다. 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택 가능한 유전자를 발현하는 유전자 변형 세포의 성장 및 선택을 위해 적절한 선택제가 배양 배지에 첨가된다.
특정 양태에서, 세포는 세포가 증식하도록 허용하는 조건하에서, 또는 관심있는 생물학적 분자의 발현에 유리한 조건하에서 배양된다. 그후 관심있는 생물학적 분자는 세포 및/또는 세포 배양 상청액으로부터 단리된다. 특정 양태에서, 관심있는 생물학적 분자는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되거나, 또는 분비 신호 없이 발현되는 경우 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
한 양태에서, 숙주 세포는 하이드로사이클론이 합리적인 분리 효율을 달성하기 위해 요구되는 조건하에서 작동할 때 발생하는 높은 압력 강하를 견딜 수 있는 세포, 예를 들어 고-생존성 세포 또는 유체역학적 전단에 의한 손상에 일반적으로 더 내성이 있는 세포이다.
개시된 연속 생물반응기 시스템에서, 배양 생물반응기(예를 들어, N-1 배양물) 내의 세포는 전형적으로 다소 높은 관류 속도 및 세포 블리드 속도를 갖는 고도로 증식성이고 고도로 생존 가능한 상태로 유지된다. 일반적으로, 임의의 특정 하이드로사이클론이 처리할 수 있는 유량은 이의 설계에 따라 좌우된다. 세포 블리드 속도는 또한 다양하며 세포 성장 속도에 의해 제한된다. 세포 블리드는 세포 밀도가 결국 0(세척)으로 떨어지지 않도록 세포 성장 속도보다 덜해야 한다. 특정 양태에서, 정상 상태 관류 속도는 1일당 약 1.05 및 1.4 RV의 범위이고, 상응하는 유효 세포 블리드 속도는 1일당 약 0.54 내지 약 0.70 RV의 범위이다. 더 낮은 관류 속도는 정상 상태에 도달하기 전에 또는 고장수리(troubleshooting)시 생물반응기의 시동(개시)에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 배양 생물반응기의 평균 생존 세포 밀도(VCD)는 약 10 x 106 내지 약 40 x 106, 약 10 x 106 내지 약 25 x 106, 약 10 x 106 내지 약 15 x 106, 약 13 x 106 내지 약 18 x 106, 약 15 x 106 내지 약 20 x 106 또는 약 20 x 106 내지 약 25 x 106개 세포/mL의 범위이다.
한 양태에서, 평균 관류 속도는 약 0.1 내지 약 1.8, 약 0.5 내지 약 1.5, 또는 약 0.8 내지 약 1.3 RV/일의 범위이다.
임의의 적합한 배지가 생물반응기에 사용될 수 있다. 배지는 예를 들어 염, 아미노산, 비타민, 지질, 세제, 완충액, 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 미량 원소 및 탄수화물을 함유할 수 있다.
액체는 임의의 적절한 경로, 예를 들어, 액체 유입구를 통해 생물반응기(들)에 첨가되고/되거나 생물반응기(들)로부터 제거될 수 있다.
시스템은 임의의 원하는 크기, 예를 들어 벤치-크기, 파일럿-크기 또는 제조-크기일 수 있다. 한 양태에서, 본원에 개시된 시스템은 벤치-크기, 파일럿-크기 또는 제조-크기 시스템이다. 생물반응기는 임의의 원하는 크기, 예를 들어 벤치-크기, 파일럿-크기 또는 제조-크기일 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, "작업 용적"은 생물반응기가 세포를 배양하는 동안 실질적으로 보유할 수 있는 액체의 실제 용적을 지칭한다. 예를 들어 기포가 부서지거나 벤트 포트 등을 위해 상부에 공간이 있어야 하기 때문에 작업 용적은 생물반응기의 총 용적보다 작다. 특정 양태에서, 작업 용적은 생물반응기의 총 용적의 약 50 내지 약 95%, 약 50 내지 약 90%, 약 60 내지 약 95%, 약 60 내지 약 90%, 약 70 내지 약 95%, 또는 약 70 내지 약 90%이다. 본원에 정의된 바와 같이, 시스템의 "작업 용적"은 생산 생물반응기가 배양 공정 동안 실질적으로 보유할 수 있는 작업 용적을 지칭한다.
시스템은 약 0.5 내지 약 25,000L의 작업 용적을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 시스템은 약 0.5 내지 약 20L의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 시스템은 약 20 내지 약 500L의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 시스템은 약 500 내지 약 25,000L의 작업 용적을 갖는다. 한 양태에서, 시스템은 약 0.5 내지 약 20L의 작업 용적을 갖는 벤치-크기 시스템이다. 한 양태에서, 시스템은 약 20 내지 약 500L의 작업 용적을 갖는 파일럿-규모 시스템이다. 한 양태에서, 시스템은 약 500 내지 약 25,000L의 작업 용적을 갖는 제조- 또는 생산-규모 시스템이다.
특정 양태에서, 시스템은 약 0.5L 이상, 약 1L 이상, 약 5L 이상, 약 10L 이상, 또는 약 15L 이상의 작업 용적을 갖는 벤치-크기 시스템이다. 특정 양태에서, 시스템은 20L 미만의 작업 용적을 갖는 벤치-크기 시스템이다.
특정 양태에서, 시스템은 약 100L 이상, 약 200L 이상, 약 300L 이상, 또는 약 400L 이상의 작업 용적을 갖는 파일럿-규모 시스템이다. 특정 양태에서, 시스템은 500L 미만의 작업 용적을 갖는 파일럿-규모 시스템이다.
특정 양태에서, 시스템은 약 500L 이상, 약 1000L 이상, 약 2000L 이상, 약 3000L 이상, 약 4000L 이상, 약 5000L 이상, 약 6000L 이상, 약 7000L 이상, 약 8000L 이상, 약 9000L 이상, 약 10,000L 이상, 약 15,000L 이상, 또는 약 20,000L 이상의 작업 용적을 갖는 제조-규모 시스템이다. 특정 양태에서, 시스템은 25,000L 미만의 작업 용적을 갖는 제조-규모 시스템이다.
생산 반응기는 약 0.5 내지 약 25,000L의 작업 용적을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 약 0.5 내지 약 20L의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 약 20 내지 약 500L의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 약 500 내지 약 25,000L의 작업 용적을 갖는다.
특정 양태에서, 생산 반응기는 약 0.5L 이상, 약 1L 이상, 약 5L 이상, 약 10L 이상, 또는 약 15L 이상의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 20L 미만의 작업 용적을 갖는다.
특정 양태에서, 생산 반응기는 약 100L 이상, 약 200L 이상, 약 300L 이상, 또는 약 400L 이상의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 500L 미만의 작업 용적을 갖는다.
특정 양태에서, 생산 반응기는 약 500L 이상, 약 1000L 이상, 약 2000L 이상, 약 3000L 이상, 약 4000L 이상, 약 5000L 이상, 약 6000L 이상, 약 7000L 이상, 약 8000L 이상, 약 9000L 이상, 약 10,000L 이상, 약 15,000L 이상, 또는 약 20,000L 이상의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 25,000L 미만의 작업 용적을 갖는다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기(예를 들어 N 생물반응기)의 작업 용적에 대한 배양 생물반응기(예를 들어 N-1 생물반응기)의 작업 용적의 비는 약 1:5 내지 약 1:20, 약 1:5 내지 약 1:10, 또는 약 1:10 내지 약 1:20의 범위이다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기(예를 들어 N 생물반응기)의 작업 용적에 대한 배양 생물반응기(예를 들어 N-1 생물반응기)의 작업 용적의 비는 약 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20이다. 예를 들어, 배양 생물반응기가 약 500L의 작업 용적을 갖고 생산 생물반응기가 약 2,500L의 작업 용적을 갖는 경우, 생산 생물반응기의 작업 용적에 대한 배양 생물반응기의 작업 용적의 비는 약 1:5이다.
특정 양태에서, 배양 생물반응기는 약 0.02L 내지 약 5,000L, 0.02L 내지 약 4,000L, 약 0.02 내지 약 4L, 약 4 내지 약 100L, 약 100L 내지 약 4,000L, 또는 약 100L 내지 약 5,000L의 범위의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 약 0.02L 이상, 약 0.04L 이상, 약 1L 이상, 약 2L 이상, 또는 약 3L 이상의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 4L 미만의 작업 용적을 갖는다.
특정 양태에서, 배양 생물반응기는 약 4L 이상, 약 20L 이상, 약 40L 이상, 약 60L 이상, 또는 약 80L 이상의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 100L 미만의 작업 용적을 갖는다.
특정 양태에서, 배양 생물반응기는 약 100L 이상, 약 200L 이상, 약 400L 이상, 약 600L 이상, 약 800L 이상, 약 1000L 이상, 약 1200L 이상, 약 2,000L 이상, 약 3,000L 이상, 또는 약 4000L 이상의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 4,000L 미만의 작업 용적을 갖는다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 5,000L 미만의 작업 용적을 갖는다.
배양의 종료시(통상적으로 10 내지 18일 후) 단일 대량 수확물을 생성하는 공급-배치식 생물반응기 작동과는 달리, 정상 상태에서 작동하는 본원에 개시된 연속 생물반응기 시스템은 생물반응기로부터 생성물의 연속적인 유동을 생성한다. 특정 양태에서, 생물반응기로부터의 생성물의 연속적인 유동은 일관된 역가 및 생성물 품질을 갖는다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기는 1일당 약 0.85 내지 약 0.96g/L 이상의 정상 상태 용적 생산성을 나타낸다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 1일당 약 0.96, 약 0.97, 약 0.98, 약 0.99, 약 1.00, 약 1.01, 약 1.02, 약 1.03, 약 1.04, 또는 약 1.05g/L 이상의 정상 상태 용적 생산성을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 시스템은 하나 이상의 하이드로사이클론 대신에 막 세포 보유 장치를 이용하는 필적하는 연속 배양 시스템에 비해 감소된 배지 사용을 나타낸다.
특정 양태에서, 시스템은 약 0.05 내지 약 0.8, 또는 약 0.1 내지 약 0.8 RV/일 이하, 및 보다 특히 약 0.05, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.4, 약 0.6 또는 약 0.8 RV/일 (생산 반응기의 용적 기준)의 배지 또는 농축 공급물을 사용한다.
특정 양태에서, 시스템은 독립형 단위 작동으로서 N-1 관류 생물반응기가 요구하는 1.05 내지 1.40 RV/일에 비해 약 2 내지 3배 적은 배지 및 농축 공급물을 사용한다.
특정 양태에서, 시스템은 약 0.9g/l/일 내지 약 3g/l/일, 또는 약 1g/L/일 내지 약 3g/L/일의 용적 생산성을 달성한다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기를 떠나는 항체의 농도는 약 4g/L/일 내지 약 6g/L/일의 범위이다.
필적하는 종래의 시스템 내의 막 세포 보유 장치를 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 하이드로사이클론으로 대체하는 것의 추가적인 이점은 오염 또는 막힘의 위험이 상당히 감소하고, 대형 막 시스템에 비해 작고 간단한 장치를 작동시키는 용이성을 포함한다. 막 세포 보유 장치를 갖는 종래의 시스템에서, 막은 주기적인 세척이 필요할 수 있다. 시스템의 위생 및/또는 멸균은 필적하는 종래의 시스템 내의 막 세포 보유 장치를 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 하이드로사이클론으로 대체함으로써 단순화된다. 막 세포 보유 장치를 사용하는 시스템과 비교하여, 오염은 하이드로사이클론을 포함하는 본원에 기재된 시스템에서 최소화되거나 제거될 것이다.
한 양태에서, 막 세포 보유와 비교하여, 더 낮은 분리 효율 및 전단 손상은 개시된 관류 시스템 및 방법에서 하이드로사이클론을 통한 다중 통과로부터 초래된다. 관류 속도가 증가함에 따라, 더 많은 세포가 오버플로우 스트림으로 손실되어 생산 생물반응기 접종에 필요한 큰 세포 수를 신속하게 생성하거나(N-1 관류의 경우) 연속 관류 생산 생물반응기에서 바람직한 높은 세포 밀도를 달성하기에 너무 높은 세포 블리드 속도가 초래된다. 또한, 연속 관류 생산 생물반응기에서 높은 용적 생산성을 달성하기 위해, 세포-특이적 생산성이 최대화되어야 하며, 이는 통상적으로 더 낮은 세포 성장 속도에서 달성된다. 연속 관류 생물반응기에서, 낮은 세포 회전율로 낮은 성장 속도를 유도하는 조건은 종종 더 낮은 세포 생존력을 초래하며, 이는 이러한 배양물로부터의 세포가 장치에서 발생하는 전단력으로 인해 하이드로사이클론을 사용하는 관류에 부적합하게 만들 수 있다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 약 6주 이상의 기간 동안 연속적으로 작동할 수 있다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기는 약 3개월 초과, 약 6개월 초과 또는 약 1년 초과 동안 연속적으로 작동할 수 있다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기는 무기한으로 연속적으로 작동할 수 있다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 최대 약 3개월 동안 연속적으로 작동할 수 있다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기는 세포 생산성을 증가시키기 위해 필요에 따라(예를 들어, 3개월마다) 재가동될 수 있다.
배양 생물반응기로부터의 배양물은 배양 생물반응기의 세포 블리드 속도와 동등한 연속적이고 고정된 유속으로 생산 생물반응기로 들어갈 것이다. 또한, 생산 생물반응기는 해당 생물반응기의 세포가 계속 대사하고, 생성물을 생산하고, 잠재적으로 일부 제한된 세포 분열을 겪음에 따라 영양 배지의 지속적인 공급을 갖게 될 것이다. 생물반응기 둘 다의 작업 용적은 일정하게 유지될 가능성이 높으므로 생산 생물반응기의 유효 희석 속도는 배양 연속 세포 블리드의 유동 및 생산 반응기에 직접 첨가된 영양 배지 및 pH-제어 적정제의 연속 공급에 의해 결정될 것이다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 연속적으로 작동한다. 특정 양태에서, 하이드로사이클론은 배양 생물반응기로부터 배양물을 연속적으로 수용받는다.
세포주가 장기간 작동하기에 유전적으로 충분히 안정하지 않은 상황에서, 냉동 바이알로부터 확장된 신선한 세포의 접종물로 주기적으로 시작하는 제2 배양 생물반응기가 사용될 수 있으며, 일단 그 생물반응기가 적절한 세포 밀도에 도달하면 제2 배양 생물반응기가 제1 배양 생물반응기를 대신할 수 있으며 제1 배양 생물반응기는 세척 및 재살균을 위해 분해된다. 배양 생물반응기(들) 내의 세포 밀도는 이것이 연결된 생산 생물반응기의 크기에 따라 달라질 수 있다. 일부 양태에서, 배양 생물반응기 내의 세포 밀도는 약 10Х106개 세포/mL 이상, 또는 약 20Х106개 세포/mL 이상이거나, 또는 약 40Х106개 세포/mL 이상이거나, 또는 10Х106 내지 200Х106개 세포/mL이거나, 또는 40Х106 내지 120Х106개 세포/mL이거나, 또는 이러한 범위 내의 특정 밀도에 있다.
한 양태에서, 시스템은 세포가 하나 이상의 하이드로사이클론을 통해 생산 생물반응기로 옮겨지기 전에 세포가 배양되는 배양 생물반응기(N-1 생물반응기)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 시스템은 하나 이상의 하이드로사이클론을 통해 생산 생물반응기로 전달하기 위해 배양된 세포를 생산하기 위해 교호적으로 작동하는 두 개의 배양 생물반응기를 포함한다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 가장 높은 세포 생산성을 촉진하는 조건하에서 작동한다. 높은 생산성 조건을 달성하기 위해, 세포 생산성을 개선시키지만 성장을 늦추거나 멈추는 공지된 화학물질이 생산 생물반응기에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 생물반응기는 예를 들어, 세포가 특정 품질 특성을 갖는 단백질을 생산하도록 하는데 유익한 낮은 또는 높은 pH 또는 저온(Cu, 저 Ca의 첨가, 갈락토스의 첨가 등) 하에서 작동하도록 만들어질 수 있지만, 이러한 동일한 조건은 높은 세포 성장 속도를 허용하지 않는다.
높은 희석 속도로 작동하는 생산 생물반응기는 억제성 대사산물이 생물반응기로부터 더 효과적으로 플러싱됨에 따라 더 높은 성장 속도를 초래할 수 있다. 생산 생물반응기의 희석 속도는 N-1 생물반응기로부터의 세포 블리드 속도, 및 생산 생물반응기로 직접 유입되는 pH 제어에 사용되는 임의의 적정제 및 공급물의 속도에 따라 좌우될 것이다. 생산 생물반응기로의 공급 배지의 농도를 조작하면 최적의 성장, 영양소 가용성 및 시스템으로부터의 억제제 대사산물 플러싱의 균형을 유지할 수 있다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기의 희석 속도는 단일 농축 공급 배지를 사용하고, 필요에 따라 이 배지를 물로 희석하거나, 또는 포화 염수 용액과 혼합된 물로 희석함으로써 조정된다. 가변 농도 공급 배지를 사용한 희석 속도의 제어는 또한 시스템으로부터 생산된 재조합 단백질의 체류 시간에 대한 제어를 허용할 수 있다. 높은 희석 속도는 생성물 체류 시간을 낮추고 매우 불안정한 단백질에 유리할 수 있다.
본 발명의 기술은 상기한 바와 같은 방법에 의해 생산되는, 관심 생물학적 분자, 또는 관심 단백질에 관한 것이다. 이러한 관심 생물학적 분자 또는 단백질은 생체중합체; 항체, 예를 들어 단클론 항체; 융합 단백질, 예를 들어 Fc-융합 단백질; 효소, 사이토카인, 예를 들어 인터루킨(IL); 림포카인; 접착 분자; 인슐린; 인슐린-유사 성장 인자; hGH; tPA; 바이러스; 바이러스-유사 입자; 아데노-관련 바이러스; 수용체 및 이의 유도체 또는 단편; 및 효능제 또는 길항제로서 기능할 수 있고/있거나 치료적 또는 진단적 용도를 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드 및 스캐폴드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 양태에서, 관심있는 생물학적 분자는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체이다. 본원에 기재된 시스템 및 방법은 단클론 항체, 다중특이 항체, 또는 이의 단편, 바람직하게는 단클론 항체, 이중특이 항체, 또는 이의 단편과 같은 항체의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 항체 단편은 예를 들어 "Fab 단편"(항원 결합 단편(Fragment antigen-binding)=Fab)을 포함한다. Fab 단편은 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 두 개의 사슬 모두의 가변 영역으로 구성된다. 이들은 통상적인 항체로부터 프로테아제 소화, 예를 들어 파파인에 의해 형성될 수 있지만, 유사한 Fab 단편은 또한 유전공학에 의해 생산될 수 있다. 추가의 항체 단편은 F(ab')2 단편을 포함하며, 이는 펩신을 사용한 단백질 분해 절단에 의해 제조될 수 있다.
유전공학적 방법을 사용하여, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로만 구성되는 단축된 항체 단편을 생산할 수 있다. 이를 Fv 단편(가변 단편=가변 부분의 단편)이라고 한다. 이러한 Fv-단편은 불변 사슬의 시스테인에 의한 두 사슬의 공유 결합이 부족하기 때문에 Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 짧은 펩티드 단편, 예를 들어 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산에 의해 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 구성된 단일 펩티드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일쇄-Fv(scFv)로 알려져 있다. scFv-항체 단백질의 예는 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 바람직한 분비된 재조합 치료 항체는 이중특이 항체이다. 이중특이 항체는 전형적으로 하나의 분자에 표적 세포(예를 들어, 악성 B 세포) 및 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 대식세포)에 대한 항원-결합 특이성을 구비한다. 예시적인 이중특이 항체는 이에 제한되는 것이 아니지만 디아바디, BiTE(이중특이 T 세포 관여자) 포맷 및 DART(이중-친화성 리-타겟팅) 포맷이다. 또한, 본 발명의 맥락에서 예상되는 것은 미니바디이다. 미니바디란, 숙련가들은 2가의 동종 이량체 scFv 유도체를 의미한다.
특정 양태에서, 관심있는 생물학적 분자는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되거나 단리된다. 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 관심있는 생물학적 분자를 단리하여 관심있는 생물학적 분자의 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해, 세포 및/또는 미립자 세포 파편을 배양 배지 또는 용해물로부터 제거한다. 다음으로, 관심있는 생물학적 분자를 오염 가용성 단백질, 폴리펩티드 및 핵산으로부터, 예를 들어 면역친화성 또는 이온 교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스 크로마토그래피, 및 실리카 상의 크로마토그래피 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피에 의해 정제한다. 숙주 세포에 의해 발현되는 이종 단백질을 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
한 양태에서, 시스템은 하나 이상의 다운스트림 구성요소를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 다운스트림 구성요소는 침전 구성요소, 정제 구성요소, 마감 구성요소, 포장 구성요소 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 양태에서, 침전 및/또는 정제 구성요소는 크로마토그래피 컬럼이다.
특정 양태에서, 적어도 하나의 다운스트림 구성요소는 시스템에 연결되지 않으며, 즉, 하이브리드 시스템이다. 한 양태에서, 하나 이상의 다운스트림 요소들은 연속 시스템의 다른 요소들에 연결되지 않으며, 즉 하이브리드 시스템이다.
특정 양태에서, 모든 다운스트림 구성요소는 시스템에 연결되며, 즉 연속 종단 간 시스템이다.
한 양태에서, 하나 이상의 다운스트림 요소들은 연속 시스템의 다른 요소들에 연결되고, 즉 연속 종단 간 시스템이다.
특정 양태에서, 시스템은 약 2,000 내지 약 10,000L 이상의 작업 용적을 갖는 생산 생물반응기에 세포를 공급하는 고도의 증식성 배양 생물반응기로 이루어진다. 특정 양태에서, 시스템은 0.96g/L/일의 높은 정상 상태 용적 생산성에서 작동하고, 단지 0.17RV/일의 배지를 필요로 하며, 5.7g/L의 항체 생성물의 연속 스트림을 전달한다.
배양 생물반응기
특정 양태에서, 본원에 개시된 시스템은 생산 생물반응기에 접종하는데 사용될 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 숙주 세포)를 배양하기 위한 적어도 하나의 배양 생물반응기를 포함한다. 배양 생물반응기는 예를 들어 도 2에 도시된 바와 같이 하이드로사이클론과 (즉, 유체 연통으로) 연결된다.
한 양태에서, 배양 생물반응기는 N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기이다.
배양 생물반응기의 용적은 다양할 수 있다. 한 양태에서, 배양 생물반응기의 용적은 생산 생물반응기보다 상당히 적다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기의 용적은 500L이다.
한 단위로서, 배양 생물반응기는 연속적일 수 있다. 한 양태에서, 배양 생물반응기는 관류 배양 생물반응기 또는 관류 생물반응기일 수 있고, 배양 생물반응기로의 및/또는 배양 생물반응기로부터의 액체 전달에 대하여 연속 또는 반연속적일 수 있다. 특정 양태에서, 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 세포 블리드 또는 전달은 간접적으로 하이드로사이클론으로부터의 오버플로우에 의해 연속적 또는 반연속적일 수 있다.
특정 양태에서, 배양 (예를 들어, 관류) 생물반응기는 숙주 세포 배양물을 생산하고 유지하도록 구성된다. 특정 양태에서, 배양 (예를 들어, 관류) 생물반응기는 반응 챔버 및 액체의 유입 또는 유출을 허용하는 하나 이상의 포트 또는 연결부를 포함한다.
한 양태에서, 배양 (예를 들어 관류) 생물반응기는 복수의 숙주 세포(예를 들어, 배양된 숙주 세포, 예를 들어 배양된 포유동물 숙주 세포) 및 세포 배지를 함유한다.
배양 생물반응기에서 숙주 세포의 생존력은 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 세포 생존율은 약 50 내지 약 100%, 약 60 내지 약 100%, 약 70 내지 100%, 약 80 내지 100%, 약 90 내지 100%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 100%이다.
특정 양태에서, 생존 세포 밀도는 약 20x106 내지 약 30x106개 세포/mL이다.
배양 반응기 조건은 세포 유형(예를 들어, 용존 가스 농도, 온도, pH)에 따라 좌우될 것이고, 필요에 따라 세포의 최적 성장 및 생산성을 위해 조정될 것이며, 이는 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다. 특정 양태에서, pH는 약 6.5 내지 약 7.5의 범위이다. 특정 양태에서, 온도는 약 27 내지 약 38℃, 또는 약 31 내지 약 37℃의 범위이다. 특정 양태에서, 용존 산소는 공기 포화도의 약 10 내지 약 80%의 범위이다.
배양 후, 배양된 숙주 세포의 품질은 생산 생물반응기로 옮겨지고(블리딩), 이는 임의로 배양 생물반응기와 (즉, 유체 연통으로) 연결된다. 특정 양태에서, 배양된 숙주 세포는 배양 생물반응기를 생산 생물반응기에 연결하고 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론으로부터의 오버플로우 형태로 부분적으로 세포-고갈된 유체로서 생산 생물반응기로 옮겨진다(블리딩).
한 양태에서, 생산 CSTR로의 구상된 세포 전달(블리드)은 관류가 시작되자마자 시작된다.
특정 양태에서, 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 세포 블리드/전달의 속도는 1일당 약 0.1 반응기 용적(RV/일) 내지 약 1.3 RV/일, 약 0.1 내지 약 1.4 RV/일, 약 0.1 내지 약 1.5 RV/일, 또는 약 0.1 내지 약 2.0 RV/일이다. 또 다른 양태에서, 연속 또는 반연속 모드에서 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로의 세포 블리드/전달의 속도는 2.0 RV/일 미만, 1.5 RV/일 미만, 1.4 RV/일 미만, 1.3 RV/일 미만, 1.0 RV/일 미만, 0.8 RV/일 미만, 0.6 RV/일 미만, 0.4 RV/일 미만, 0.2 RV/일 미만이다.
한 양태에서, 접종 밀도는 약 1.5x106개 세포/mL이다. 한 양태에서, 접종 밀도는 약 1x106 내지 약 2x106개 세포/mL의 범위이다.
A.
생산 생물반응기
본원에 개시된 시스템은 또한 배양 생물반응기로부터 배양된 숙주 세포의 접종물을 수용하고, 전달된 숙주 세포를 배양하고, 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자를 생산하기 위한 생산 생물반응기를 포함한다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 시스템의 중간 구성요소로서 배양 반응기 및 생산 반응기를 직접 연결하여 오버플로우가 부분적으로 세포-고갈된 유체가 되도록 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론으로부터 오버플로우 형태로 배양된 숙주 세포의 접종물을 생산 생물반응기에 제공하는 배양 생물반응기와 (즉, 유체 연통으로) 간접적으로 연결된다.
생산 생물반응기는 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자를 발현시키기에 (본질적으로 또는 유전자 조작에 의해) 적합한 적어도 제1 유형의 숙주 세포의 성장 및 유지를 촉진하도록 구성된다. 특정 양태에서, 예를 들어, 생산 생물반응기는 세포 배양 배지(예를 들어, 제1 유형의 숙주 세포의 성장을 촉진하도록 구성된 성장 세포 배양 배지, 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자의 발현을 촉진하도록 구성된 생산 세포 배양 배지) 및 제1 유형의 숙주 세포를 포함하는 현탁액을 유지하도록 구성된 반응 챔버를 포함한다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기는 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자를 발현시키기에 적합한 한 가지 유형의 숙주 세포의 성장 및 유지를 촉진하도록 구성된다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기는 관심있는 2가지 이상의 유형의 생물학적 분자를 발현시키기에 적합한 2가지 이상의 유형의 숙주 세포의 성장 및 유지를 촉진하도록 구성된다. 생산 생물반응기가 2가지 이상의 유형의 숙주 세포의 성장 및 유지를 촉진하도록 구성된 양태에서, 시스템은 2개 이상의 배양 반응기를 포함하고, 여기서 각각의 배양 반응기는 한 가지 유형의 숙주 세포를 배양하도록 구성되고(즉, 각각의 배양 반응기는 상이한 유형의 숙주 세포를 배양함) 모든 배양 반응기는 동일한 생산 반응기 내로 공급된다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 복수의 숙주 세포(예를 들어, 배양된 숙주 세포, 예를 들어 배양된 포유동물 숙주 세포) 및 세포 배지를 함유한다.
생산 생물반응기 내의 숙주 세포의 밀도는 다양할 수 있다. 특정 양태에서, 숙주 세포의 밀도는 약 5x106 내지 약 200x106개 세포/mL, 또는 약 30x106 내지 약 80x106개 세포/mL의 범위이다.
생산 반응기 조건은 세포 유형(예를 들어, 용존 가스 조성, 온도, pH)에 따라 좌우될 것이고, 필요에 따라 세포의 최적 성장 및 생산성을 위해 조정될 것이며, 이는 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다. 특정 양태에서, pH는 약 6.5 내지 약 7.5의 범위이다. 특정 양태에서, 온도는 약 27 내지 약 38℃, 또는 약 31 내지 약 37℃의 범위이다. 특정 양태에서, 용존 산소는 공기 포화도의 약 10 내지 약 80%의 범위이다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 3주 초과; 4주 초과; 5주 초과; 또는 6주 초과의 기간 동안 연속적으로 작동한다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 종래의 막 숙주 세포 보유 장치를 이용하는 필적하는 시스템에 비해 증가된 정상 상태 용적 생산성을 나타낸다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기는 1일당 약 0.5 내지 약 6g/L, 1일당 약 1 내지 약 6g/L, 또는 1일당 약 0.5 내지 약 3g/L의 정상 상태 용적 생산성을 나타낸다. 특정 양태에서, 생산 생물반응기는 1일당 약 0.5, 약 0.6 또는 약 1g/L 이상의 정상 상태 용적 생산성을 나타낸다.
한 양태에서, 생산 생물반응기는 적어도 14일의 기간 동안 1일당 리터당 적어도 0.6 그램의 용적 생산성을 갖고; 생산 생물반응기는 적어도 20일의 기간 동안 1일당 리터당 적어도 0.6 그램의 용적 생산성을 갖고; 생산 생물반응기는 적어도 30일의 기간 동안 1일당 리터당 적어도 0.6 그램의 용적 생산성을 갖고; 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 가지며; 생산 생물반응기는 1일당 약 1 내지 약 0.1 용적의 희석 속도를 갖고; 생산 생물반응기에는 희석제 용액이 공급되며; 희석제 용액은 물 또는 염수이다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖고; 생산 생물반응기는 1일당 약 1 내지 약 0.1 용적의 희석 속도를 갖는다. 특정 양태에서, 추가 희석제(예를 들어, 물 또는 염수)는 사용되지 않는다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기는 약 1 내지 약 10일의 생성물 체류 시간을 갖고; 생산 생물반응기는 1일당 약 1 내지 약 0.1 용적의 희석 속도를 가지며; 생산 생물반응기에는 희석제 용액이 공급되고; 희석제 용액은 물 또는 염수이다.
특정 양태에서, 생산 생물반응기는 생물반응기 중량의 증가에 반응하여 생물반응기로부터 제거된 전체 세포 수확물의 제거를 허용하는 유출구(예를 들어, 연동 펌프)를 포함한다.
추가 시스템 구성요소
한 양태에서, 시스템은 하나 이상의 추가 구성요소를 포함한다.
특정 양태에서, 배양 생물반응기, 생산 생물반응기 및 하이드로사이클론을 포함하는 생물반응기 시스템은 하나 이상의 다운스트림 구성요소를 포함하는 더 큰 시스템의 일부이다.
다운스트림 구성요소는, 예를 들어, 생산 반응기에서 생산된, 관심있는 생물학적 분자를 정화, 포획, 정제, 연마 및/또는 포장하기 위한 구성요소일 수 있다. 각 유형의 2개 이상의 구성요소, 예를 들어, 2개 이상의 정제 구성요소, 예를 들어, 2개 이상의 정제 크로마토그래피 컬럼이 존재할 수 있다.
한 양태에서, 시스템은 하나 이상의 다운스트림 구성요소를 포함하는 더 큰 시스템의 일부이며, 여기서 다운스트림 구성요소 중 적어도 하나는 시스템에 연결되지 않으며, 즉, 하이브리드 시스템이다.
다른 특정 양태에서, 시스템은 하나 이상의 다운스트림 구성요소를 포함하는 더 큰 시스템의 일부이며, 여기서 적어도 하나의 다운스트림 구성요소 모두는 시스템에 연결되며, 즉, 연속적인 종단 간 시스템이다.
임의로, 하나 이상의 성분, 예를 들어, 불순물, 배지 또는 숙주 세포는 이의 작동 동안 적어도 하나의 배양 반응기 및/또는 적어도 하나의 생산 생물반응기로부터 제거될 수 있다.
방법
본원에는 본원에 개시된 시스템 및 방법(또는 임의의 적합한 시스템에서의 하이드로사이클론)을 사용하여 숙주 세포를 배양하는 방법 및 이러한 배양된 숙주 세포로부터 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자를 생산하는 방법이 개시된다.
한 양태에서, 관심있는 생물학적 분자를 생산하는 방법이 개시되고, 상기 방법은 (i) 적어도 하나의 배양 생물반응기(예를 들어, N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기)에서 (예를 들어, 관심있는 단백질, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는) 관심있는 생물학적 분자를 생산할 수 있는 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계, (ii) 적어도 하나의 생산 생물반응기(예를 들어, N 생물반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기)에 단계 (i)로부터 수득된 세포를 접종하는 단계; 및 (iii) 생산 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기는 적어도 하나의 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 적어도 하나의 하이드로사이클론에 의해 연결된다.
또 다른 양태에서, 관심있는 생물학적 분자를 생산하는 방법이 개시되고, 상기 방법은 (i) 적어도 하나의 배양 생물반응기(예를 들어, N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기)에서 복수의 숙주 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 배양하는 단계; (ii) 적어도 하나의 생산 생물반응기(예를 들어, N 생물반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기)에 단계 (i)로부터 수득된 세포를 접종하는 단계; 및 (iii) 관심있는 생물학적 분자의 생산을 허용하는 조건하에 생산 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고; 여기서 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기는 적어도 하나의 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 적어도 하나의 하이드로사이클론에 의해 연결되고, 하이드로사이클론은 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림 및 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 생성하고, 여기서 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고, 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 생산 생물반응기로 향한다. 오버플로우는 그 안에서 배양될 다량의 숙주 세포의 형태로 생산 반응기를 위한 접종물로서 기능한다.
예시적인 방법이 도 2에 나타내어져 있다.
한 양태에서, 단계 (ii)에서의 접종은 세포를 배양 생물반응기로부터 생산 생물반응기로 전달함으로써 이루어진다. 특정 양태에서, 세포 전달은 연속 또는 반연속 모드로 세포 블리드에 의해 이루어진다. 한 양태에서, 세포 전달은 2분 내지 24시간마다 한 번 또는 그 사이의 임의의 간격으로 세포 전달을 수반하는 반연속 모드로 이루어진다.
일반적으로, 상기 방법에 사용하기 위한 시스템은 막 세포 보유 장치와 같은 종래의 세포 보유 장치를 포함하지 않는다. 하나 이상의 양태에서, 하나 이상의 하이드로사이클론이 종래의 세포 보유 장치, 예를 들어 스크린 또는 막 분리 장치 대신에 상기 방법에 사용된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 하이드로사이클론은 배양 생물반응기로부터, 예를 들어, 하나 이상의 하이드로사이클론의 상부에 있는 입구를 통해, 세포 배양 스트림을 수용하는 반면 농축된 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 생산 생물반응기로 향한다.
특정 양태에서, 하나 이상의 하이드로사이클론은 배양 생물반응기로부터 숙주 세포 전달을 2분 내지 24시간마다 한 번 또는 그 사이의 임의의 간격으로 수용한다. 특정 양태에서, 생산 반응기는 하이드로사이클론 오버플로우에 의해 2분 내지 24시간마다 한 번 또는 그 사이의 임의의 간격으로 배양 생물반응기로부터 숙주 세포 전달을 수용한다.
한 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가 단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 방법은 생산 생물반응기로부터 관심있는 단백질을 수확하는 단계 (iv)를 추가로 포함한다. 다른 추가 단계는 예를 들어 정화 단계, 포획 단계, 정제 단계, 연마 단계, 제형화 단계, 포장 단계 또는 이들의 조합을 포함하는 다운스트림 단계를 포함한다. 이러한 하나 이상의 추가 단계는 연속적인 종단 간 방법을 제공하기 위해 세포 배양 방법에 연결될 수 있거나 하나 이상의 추가 단계가 연결 해제되어 하이브리드 방법을 제공할 수 있다.
한 양태에서, 생산 생물반응기에 대한 배양 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:20이고; 생산 생물반응기에 대한 배양 생물반응기의 용적비는 약 1:1 내지 약 1:5이고; 생산 생물반응기에 대한 배양 생물반응기의 용적비는 약 1:5이다.
다음 실시예는 예시 목적으로만 제공되며 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예
1 - 생산 생물반응기로 작동하는 연속-유동
교반
탱크 생물반응기(CSTR)에 연결된 N-1 관류 생물반응기를 위한 세포 보유 장치로서의
하이드로사이클론의
사용.
도 2는 당해 실험에 사용된 2단계 연결된-생물반응기 시스템의 다이아그램을 보여준다. N-1 관류 생물반응기는 8-L 작업 용적으로 작동하는 15-L 유리 용기(Applikon, Schiedam, Netherlands)였다. 관류를 위한 세포 보유 장치는 반전된 광조형 프린터(Form 2, Formlabs, Somerville, MA)를 사용하여 3D 프린팅된 하이드로사이클론이었다. 다양한 언더플로우 직경(2 내지 4mm)과 오버플로우 직경(1 내지 3mm)을 갖는 하이드로사이클론을 단기간의 비멸균 벤치탑 실험으로 시험하였다.
표 1 및 도 3의 기하학적 구조는 이러한 시험에서 세포 생존력에 미치는 영향을 최소화하면서 가장 큰 분리 효율을 제공했기 때문에 선택되었다. 하이드로사이클론은 오토클레이브성 및 생체적합성 수지(Dental SG V1, Formlabs, Somerville, MA)를 사용하여 3D 프린팅하고 자외선(FormCure, Formlabs, Somerville, MA)으로 경화시켰다.
표 1. 하이드로사이클론 치수
연동 펌프(600 시리즈, Watson Marlow, Wilmington, MA)는 N-1 생물반응기로부터 9.5mm 내경(ID) 튜빙을 통해 분당 대략 3리터(L/min)로 하이드로사이클론으로 유동을 공급하여 장치 내에 2.4 내지 2.6bar의 압력 강하를 생성하였다. 농축된 세포의 스트림은 무제한 언더플로우 스트림으로 N-1 생물반응기로 되돌아갔다. 언더플로우 리턴 루프는 하이드로사이클론의 하부에 맞는 대략 15 센티미터(cm)의 25.4mm ID 튜빙으로 구성되었다. 이러한 25.4mm ID 튜빙은 이전에 기재된 재료 및 방법을 사용하여 3D 인쇄된 3D 인쇄 이중 호스 미늘 감속기를 사용하여 4cm에 걸쳐 9.5mm ID 튜빙으로 축소되었다. 9.5mm ID 튜빙을 감속기에 부착하고 생물반응기에 용접하였다. 두 번째 연동 펌프(500 시리즈, Watson Marlow, Wilmington, MA)는 532L의 최대 일일 관류 용적을 위해 분당 370 밀리리터(mL/min)의 유속으로 9.5mm ID 튜빙을 통해 N-1 생물반응기/하이드로사이클론 시스템을 떠나는 부분적 무세포 오버플로우 스트림을 제어하였다.
오버플로우 스트림은 정확한 제어의 목적을 위해 연동 펌프로 제한되었지만, 이전 실험에서는 제한되지 않은 오버플로우 스트림의 유속이 거의 동일하다는 것을 보여주었다.
최대 관류 용량의 일부만을 사용하기 위해, 관류 속도는 하이드로사이클론이 작동되는 시간을 제한함으로써 제어되었다. 당해 실험에서 8-L N-1 관류의 경우, 하이드로사이클론을 1일당 30분 이하로 작동시켰다. 전력 콘센트 타이머를 사용하여 입구 및 오버플로우 펌프를 몇 분 동안 켠 다음 3시간마다 한 번씩 다시 끈다. 따라서 일일 하이드로사이클론 작동 시간은 8회에 고르게 분배되었다. 펌프가 켜지면, 하이드로사이클론 시스템은 몇 초 내에 유체역학적 평형에 도달하였으며 이러한 시동 시간은 이 실험의 목적을 위해 무시할 수 있는 것으로 간주되었다. 전력 사이클 사이의 3시간에 재순환 루프에 남아 있는 세포가 있는 세포 배양 유체의 양을 줄이기 위해, 신선한 관류 배지를 하이드로사이클론 유입 펌프 직전 및 언더플로우 스트림의 하이드로사이클론 직후 연결을 통해 반연속적으로 첨가하였다(15분마다 등가 용량으로 전달). 이러한 설정은 재순환 루프의 배양물의 대부분을 전력 사이클 사이에 신선한 배지를 사용하여 생물반응기로 다시 세척할 수 있게 하였다.
생산 CSTR은 초기에 최종 작업 용적의 70%의 기본 배지만 함유하였다. CSTR의 시동시, 오버플로우 스트림의 일부는 연동 펌프(300 시리즈, Watson Marlow, Wilmington, MA)를 사용하여 각 CSTR에 세포를 점진적으로 공급하였다. 이러한 공급 펌프는 입구 및 오버플로우 펌프와 유사한 간헐적 작동 일정을 따랐다. 생산 CSTR에 공급되는 세포가 신선하다는 것을 보장하기 위해, CSTR에 세포를 공급하는 펌프는 하이드로사이클론이 작동하기 시작한지 1분 후에 시작되도록 시간을 정했다. 이러한 1분의 시동 시간 동안, 전체 오버플로우 스트림이 낭비되었다. 각 CSTR의 작업 용적이 1.4리터로 축적되면, 생물반응기 작업 용적은 생물반응기 중량의 증가에 반응하여 생물반응기로부터 전체 세포 수확물을 제거하는 ChemTec 펌프(Parker Domnik Hunter, Oxnard, CA)에 의해 일정하게 유지되었다.
표 2는 이 실험에 사용된 배지 및 공급물의 일부 세부사항을 보여주고 표 3은 다양한 생물반응기 작동 매개변수를 보여준다.
표 2. N-1 관류 및 생산 CSTR 생물반응기에서 배지 및 공급물의 조성
표 3. N-1 관류 및 생산 CSTR 생물반응기에 대한 작동 매개변수
N-1 및 생산 생물반응기는 용존 산소 및 용존 이산화탄소(CO2)를 제어하기 위해 이중 살포(dual sparging) 전략을 사용하였다. 15-L N-1 관류 생물반응기에는 용존 산소를 제어하기 위해 배양물에 순수 산소를 공급하는 100μm 소결 강철 스파저(sparger)가 장착되었다. 15-L N-1 관류 생물반응기는 주로 CO2 제거를 위해 7x1mm 드릴 구멍 스파저를 통해 공기를 살포하였다. 3-L 생산 CSTR은 초기에 7x1mm 드릴 구멍 스파저를 사용하여 배양물에 산소를 전달하였다. 생산 CSTR에서 산소 요구량이 높은 수준으로 증가하면, 15μm 소결 강철 스파저를 사용하여 배양물에 순수 산소를 공급하였으며 순수 산소는 CO2 제거 및 산소 전달 둘 다를 위해 7x1mm 드릴 구멍 스파저를 통해 계속 살포하였다. 가스 및 pH는 혈액 가스 분석기(Siemens Diagnostics, Deerfield, IL)를 사용하여 오프라인으로 측정하였다. 드릴 구멍 스파저를 통한 가스 유량은 때때로 표 3에 열거된 범위 내에서 용존 CO2를 유지하기 위해 수동으로 조정되었다.
N-1 관류 생물반응기에 1.5x106개 세포/mL를 접종하였으며, 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 경향은 도 4a에 나타내어져 있다. 생존 세포 밀도, 세포 생존율 및 대사산물은 NovaFLEX 분석기(Nova Biomedical, Waltham, MA)를 사용하여 측정하였다. 생물반응기에서 락테이트 축적을 제어하기 위해, 글루코스의 하이-엔드 pH 전달(HIPDOG)로 알려진 글루코스 전달 기술을 사용하여 2일째부터 시작하여 pH에 기반하여 글루코스를 공급하고 실험 기간 동안 계속하였다. 이러한 제어 방식에서, 세포 배양은 먼저 기본 배지에서 글루코스를 고갈시키고 락트산을 생성하였다. 세포에 글루코스가 제한되었을 때, 세포는 락트산을 소비하기 시작하여 pH 상승을 초래하였다. pH가 하이-엔드 pH 설정값 이상으로 증가하면, 글루코스 펌프가 작동되고 500g/L 글루코스가 생물반응기에 첨가되었다. 배양이 글루코스를 락트산으로 전환함에 따라, pH가 하이-엔드 설정값 아래로 밀려나고 글루코스 펌프가 꺼지도록 유도하였다. 관류 시스템에서, 락테이트는 관류 공정 자체의 결과로서 생물반응기로부터 플러싱된다. 결과적으로, 일부 잔류 락테이트 없이는 글루코스 고갈을 알리는 pH 반응이 없기 때문에 락테이트 고갈은 아마도 HIPDOG 제어가 실패하게 할 수 있다. HIPDOG 실패를 방지하기 위해, 1M 나트륨/칼륨 탄산염 용액(몰 비 0.94M 나트륨: 0.06M 칼륨)을 생물반응기에 첨가하여 pH에 상향 구동력을 생성하여 락테이트가 완전히 고갈되지 않도록 하였다. 1M 나트륨/칼륨 탄산염 용액을 관류 용적의 1% 미만의 속도로 반연속적으로(앞서 기재한 바와 같이) 첨가하였으며 생물반응기의 잔류 락테이트 농도를 0.5 내지 2g/L로 유지하도록 조정하였다. 1.2 RV/일보다 높은 관류 속도에서, 관류 배지는 HIPDOG 제어에 의한 추가적인 글루코스 보충 없이 배양물에 충분한 글루코스를 공급한다는 것을 주지해야 한다. N-1 관류에 대한 잔류 글루코스 및 락테이트 프로파일은 도 5a에 나타내어져 있다. 정상 상태 시점 동안, 암모늄은 6mM 미만으로 유지되었고, 삼투압 농도는 280 내지 315 mOsm/kg 사이에서 유지되었다.
관류는 3 내지 24일에 1일당 세포당 50 피코리터(pL/세포/일)의 세포 특이적 관류 속도(CSPR)로 3일째에 개시되었다. 관류 속도는 세포 밀도의 변화를 반영하기 위해 매일 조정되었다. 이전의 관류 실험에서, 이러한 CSPR은 이 세포주의 기하급수적인 성장을 유지하기에 충분한 속도로 성장 억제제(락테이트 제외)를 플러싱하는 것으로 결정되었다. 하이드로사이클론 작동 압력은 초기에 2.6bar로 설정되었으며, 이는 이 조건이 단기간 시험에서 세포 생존율의 무시할 수 있는 저하로 가장 높은 분리 효율을 산출했기 때문이다. 그러나 관류의 처음 3일 동안, 성장 속도가 유의하게 떨어졌고 세포 생존율은 하향 추세를 보이기 시작하여 85%만큼 낮은 상태에 도달하였다. 6일째에는, 전단 손상을 줄이고 배양물을 회수하기 위한 시도로 작동 압력을 2.4bar로 낮췄다. 분리 효율은 약간 감소했지만, 배양물은 빠르게 거의 기하급수적인 성장으로 돌아왔고 생존력은 88-94%에서 안정화되었다. 2.4bar에서 작동하면, 하이드로사이클론에 들어간 세포의 92-96%가 도 6에 나타낸 바와 같이 생물반응기로 돌아가는 언더플로우 스트림에서 회수되었다. 이 값은 다음 방정식을 이용하여 총 분리 효율(Et)을 계산함으로써 결정되었다:
여기서, XO 및 Xbrx는 각각 오버플로우 스트림 및 생물반응기의 생존 세포 밀도를 나타내고, QO 및 Q는 각각 오버플로우 스트림 및 유입 스트림의 유속을 나타낸다. 감소된 또는 원심 분리 효율(E')은 또한 아래 방정식을 사용하여 계산할 수 있다:
당해 실험에서, 54%의 평균 감소된 분리 효율이 관찰되었다. 하이드로사이클론은 완벽한 분리를 제공하지 않기 때문에, 관류 속도가 증가함에 따라, 오버플로우 스트림으로부터의 유효 세포 블리드도 도 7에 나타낸 바와 같이 증가하였다. 본원에 정의된 바와 같이, 유효 블리드 속도는 세포 블리드가 연속적으로 생물반응기로부터 직접 제거되는 경우에 발생할 세포 블리드의 속도이다. 이러한 세포 블리드 속도는 세포 보유 시스템이 100% 효과적이고(막 세포 보유 시스템처럼) 정상 상태(바이오매스 상수) 조건을 달성하기 위해 배양물로부터 직접 세포를 제거해야 할 때 관류 생물반응기 작동에서 전형적으로 정의되는 것과 동일하다. 그 결과, N-1 생존 세포 밀도는 오버플로우 스트림으로부터의 유효 세포 블리드가 성장 속도와 동일할 때 20.4x106개 생존 세포/mL에서 정체되었다. N-1 생물반응기는 20.4x106개 생존 세포/mL의 평균 생존 세포 밀도, 23분/일의 하이드로사이클론 작동 시간, 1일당 1.05 반응기 용적(RV/일)의 관류 속도, 및 18 내지 23일에 0.5 RV/일의 근사값 유효 세포 블리드에서 정상 상태 조건에 도달하였다. 첫 번째 정상 상태 이후, 관류 속도가 증가하고, N-1 생물반응기에서 16.5x106개 생존 세포/mL의 평균 생존 세포 밀도, 30분/일의 하이드로사이클론 작동 시간, 1.4 RV/일의 관류 속도, 80pL/세포/일의 CSPR 및 27 내지 33일에 0.7 RV/일의 근사값 유효 세포 블리드에서 두 번째 정상 상태가 달성되었다.
4일째에, 오버플로우 스트림은 1:5, 1:10 및 1:20의 N-1 대 N 용적비를 시뮬레이션하기 위해 3개의 상이한 N 단계 생산 CSTR에 세포를 공급하기 시작하였다. 생산 CSTR에 대한 생존 세포 밀도 및 생존율 프로파일은 도 4b, 4c 및 4d에서 찾을 수 있다.
이 경우, 자동화된 작업을 면밀히 모니터링할 수 있도록 관류 후 대략 16시간 후에 세포 추가가 시작되었다. 전체 세포 수확물 수집은 각각 1:5, 1:10 및 1:20 용적비를 시뮬레이션하는 CSTR에 대해 7일, 10일 및 11일에 생물반응기 작업 용적이 1.4L로 축적되면 시작되었다. CSTR 배양물은 초기에 높은 수준의 락트산을 생성하는 상응하는 경향을 갖는 매우 영양소가 풍부한 상태(highly prolific state)에 있었으며; 따라서, HIPDOG 제어는, 앞서 기재된 바와 같이, 1:5 용적비 CSTR의 경우 10 내지 18일, 1:10 용적비 CSTR의 경우 11 내지 18일, 및 1:20 용적비 CSTR의 경우 13 내지 18일째에 비억제 수준으로 락트산 농도를 유지하도록 구현되었다. 생산 CSTR에 대한 잔류 글루코스 및 락테이트 프로파일은 도 5b, 5c 및 5d에 나타내어져 있다. CSTR에 대한 희석 속도가 낮았기 때문에(도 8에 나타낸 바와 같이 0.3 RV/일 미만) 락테이트의 잔류 수준을 유지하기 위해 나트륨/칼륨 탄산염 첨가가 필요하지 않았다. 성장 속도가 느려지고 락트산 생산 속도가 떨어질 것으로 예상됨에 따라, HIPDOG 제어가 중단되고 글루코스 공급 속도가 과거 글루코스 소비율을 사용하여 계산되었다. HIPDOG 제어 후, pH는 1M 나트륨/칼륨 탄산염(앞서 기재된 바와 같은 몰 비)을 첨가하고 하이 엔드에서 CO2를 살포함으로써 로우 엔드에서 제어되었다. 영양소는 총 잔류 아미노산 수준을 대략 40mM 이상으로 유지하기 위해 고도로 농축된 공급물 배지를 사용하여 CSTR에 직접 반연속적으로 공급되었다. 간헐적인 오프라인 UPLC 아미노산 분석은 생산 CSTR이 임의의 아미노산에 대해 제한되지 않는다는 것을 확인시켜 주었다. 암모늄 수준은 정상 상태 시점에서 1:5 생산 CSTR에서 6mM 미만으로 유지되었다. 1:10 및 1:20 생산 CSTR(낮은 희석 속도에서 작동)은 각각 7.5mM 및 9.6mM에서 정상 상태 2 동안 약간 더 높은 암모늄 수준에 도달하였다. 삼투압 농도는 320 내지 380 mOsm/kg 사이에서 유지되었다. 정상 상태 시점에서, 생산 CSTR은 93-99%의 세포 생존율을 유지한 반면(도 4b, 4c 및 4d) N-1 관류는 91-94%의 세포 생존율을 유지하였다(도 4a). N-1 생물반응기의 낮은 생존력은 하이드로사이클론에 의해 생성된 높은 전단 환경 때문일 가능성이 높다.
연결된 생물반응기 시스템은 생존 세포 밀도, 생물반응기 용적 유량, 대사산물 농도, 및 용적 생산성을 포함한 대부분의 매개변수에 대해 정상 상태 또는 거의 정상 상태 조건에 도달하였다. 정상 상태의 요약은 표 4에 나타내어져 있다.
표 4. 연결된 생물반응기 정상 상태의 요약
연결된 생물반응기 시스템은 첫 번째 정상 상태의 경우 0.84 내지 0.96g/L/일, 두 번째 정상 상태의 경우 0.54 내지 0.55g/L/일의 계산된 정상 상태 용적 생산성을 가졌다. 이러한 CHO 세포주의 보통의 유전적 불안정성으로 인해, 두 번째 정상 상태 생산성은 약간 과소평가될 가능성이 있다. 최소한의 공정 개발만으로, 정상 상태 1에서 이러한 연속 연결된 생물반응기 시스템은 0.48g/L/일의 누적 용적 생산성을 갖는 최적화된 12일 공급-배치 공정보다 1.8 내지 2배 더 생산적이며, 또한 독립적으로 작동하는 N-1 관류 생물반응기보다 유의하게 더 생산적이다(0.54g/L/일). 마지막으로, 하이드로사이클론을 사용한 연결된 시스템의 결과는 세포 보유 장치로서 막을 사용하지만 동일한 세포주, 배지 및 환경 매개변수에 대해 이전에 수득된 생산성과 매우 유리하게 비교된다. 정상 상태 1 작동 조건에서, 여기에 제시된 실험에 사용된 설계의 단일 하이드로사이클론은 오염 우려 없이 2,500 내지 10,000 리터의 매우 생산적인 생산 생물반응기를 공급하는 오버플로우 스트림을 갖는 500-L N-1 관류 생물반응기의 세포 보유 장치로서 작동할 수 있다. 이러한 연결된 생물반응기 공정은 때때로 (세포주의 유전적 안정성에 따라) 더 낮은 세대 수의 세포로 N-1 생물반응기를 재시작함으로써 잠재적으로 매우 생산적인 정상 상태에서 무기한으로 작동할 수 있다.
정상 상태 용적 생산성은 두 가지 방법을 사용하여 계산되었다. 첫 번째이자 가장 정확한 방법에서는, 연결된 생물반응기 시스템에서 항체 생성물 생산의 속도를 결정하기 위해 재료 균형이 수행되었다. 재료 균형은 N-1 생물반응기에서 생산 CSTR로 들어가는 생성물 농도 및 용적, 생산 생물반응기의 생성물 농도 및 이의 제거 속도(희석 속도), 및 생물반응기에서 생성물의 축적 속도를 고려하였다. 이러한 계산은 도 9에 나타낸 바와 같이 시간에 대해 플롯팅된 연결된 생물반응기 시스템에서 생산된 생성물의 총 질량을 산출하였다. 희석 속도, 세포 밀도 및 대사산물이 합리적으로 일정한 시점에서, 선형 회귀를 사용하여 시간당 용적당 생성물의 질량의 단위로 용적 생산성을 결정하였다. 두 번째 방법에서는 생물반응기의 생성물 농도 또는 역가(도 10)에 희석 속도를 곱하여 시스템의 정상 상태 용적 생산성을 산출한다. 그러나, 이 방법은 생성물 농도가 일정하고 생산 CSTR의 낮은 희석 속도가 이 반응을 유의하게 지연시키는 경우에만 정확하다.
이러한 연결된 생물반응기 시스템에서 배지 및 농축된 공급물의 사용은 매우 효율적이며 필요한 용적은 표 5에 나타낸 바와 같이 제조 규모에서 합리적이다. CSTR 생산 생물반응기에 연결될 때, N-1 관류 생물반응기는 전체 오버플로우 스트림이 CSTR 생산 생물반응기에 세포를 제공하는 데 사용되기 때문에 어떠한 폐기물 스트림도 생성하지 않는다. 연결된 생물반응기 시스템은 N-1 관류 생물반응기가 독립형 단위 작동으로서 요구하는 1.05 내지 1.40 RV/일과 비교하여 총 0.10 내지 0.32 RV/일 (생산 반응기의 용적 기준)의 관류 배지 및 농축된 공급물을 필요로 한다. 또한, 이러한 연결된 생물반응기 시스템은 독립적으로 작동하는 N-1 관류의 경우 0.26 내지 0.54g/L, 최적화된 공급 배치 공정의 경우 5.76g/L에 비해 배지 리터당 생산된 생성물이 1.72 내지 8.40g으로 배지 사용에서도 매우 효율적이다. 본 발명자들은 이러한 실험으로부터 연결된 생물반응기 시스템과 독립형 관류 생물반응기의 비교가 유용하다고 믿지만, 관류 생물반응기 조건은 독립형 작동에 최적화되지 않은 것으로 이해된다. 이들 실험으로부터 관류 생물반응기에 사용되는 성장 속도 및 따라서 요구되는 세포 블리드 속도는 독립형 관류 생물반응기에서 통상적으로 사용되는 조건보다 유의하게 더 높다. 이는 연결된 생물반응기 시스템의 경우, 관류 생물반응기의 기능이 높은 성장 속도 상태의 상당수의 생존 세포를 생산 생물반응기(CSTR)에 연속적으로 전달하는 것이라는 사실 때문이다.
표 5. 배지 요건의 요약
1농축된 영양소 공급물 외에도 소량의 1M 나트륨/칼륨 탄산염 및 1% 시메티콘을 생물반응기에 첨가하여 각각 pH 및 발포를 제어하였다.
34일째에, 아마도 배지 펌프의 오작동으로 인해 생물반응기 용적이 용적 설정값의 대략 75%로 떨어졌을 때(용적 25% 감소), N-1 관류 정상 상태 조건에서 섭동이 있었다. 이러한 낮은 용적 기간 동안, 상단 임펠러가 부분적으로 노출되어 잠재적으로 액체/공기 계면에서 과도한 전단이 발생할 수 있다. 배양물을 회수하기 위한 초기 시도에서, 추가 관류 배지를 전달함으로써 작업 용적을 복원하고, 관류 속도를 38일까지 1.40 RV/일로 유지하였다. 그러나, 락테이트는 3.2g/L의 높은 억제 수준으로 급증한 반면 생존 세포 밀도 및 생존율은 각각 4.3x106개 생존 세포/mL 및 86%로 낮은 상태에 도달하였다. 38일째에, 배양을 회복하기 위해 다른 접근 방식이 취해졌다; 관류 속도를 0.4 RV/일로 떨어뜨려 배양물이 락트산의 일부를 소비하고 하이드로사이클론 오버플로우 스트림으로부터 세포 블리드를 감소시켰다. 성장 속도 및 생존율이 개선되었을 때, 50pL/세포/일의 CSPR을 유지하면서 전체 관류 속도는 천천히 증가하였다. 49일째에, 배양물은 제1 정상 상태에서 달성된 조건으로 완전히 회복되었고, 조건은 56일째에 실험이 끝날 때까지 합리적으로 안정하게 유지되었다. 돌이켜보면, 글루코스 농도가 낮은 관류 배지를 사용하면 락테이트 조절을 제공하고 배양 회복을 촉진할 수 있는 더 많은 유연성을 제공할 것이다.
하이드로사이클론을 사용하는 생산 CSTR 연결된 생물반응기 시스템에 대한 N-1 관류의 가치를 입증하기 위해, 관류를 필요로 하지 않는 보다 간단한 대안이 또한 평가되었다. 하이드로사이클론을 사용한 실험에서 첫 번째이자 가장 생산적인 정상 상태에서, N-1 관류는 20.4x106개 생존 세포/mL의 보통의 평균 생존 세포 밀도를 유지하였고, 생산 CSTR에 세포를 공급한 하이드로사이클론 오버플로우 스트림은 10.5x106개 세포/mL의 평균 생존 세포 밀도를 가졌다. 이러한 정상 상태 조건은 1.05 RV/일의 관류 속도, 0.54 RV/일의 유효 세포 블리드 및 50pL/세포/일의 CSPR을 가졌다. N-1 생물반응기의 용적이 두 배로 증가하고 높은 성장 속도를 유지하는 배양 조건이 사용되는 경우 N-1 생물반응기는 생산 CSTR에 동일한 용적 및 양의 세포를 추가하기 위해 CSTR로서 작동할 수 있다고 고려되었다. 캐스케이딩 CSTR 공정의 다이어그램은 도 11에 나타내어져 있다.
이러한 캐스케이딩 CSTR을 하이드로사이클론을 사용하는 연결된 생물반응기로 달성한 결과와 비교하기 위한 실험이 수행되었다. N-1 CSTR이 하이드로사이클론을 사용하는 N-1 관류 생물반응기만큼 높은 세포 밀도를 달성하지 못할 것으로 예측되었기 때문에, 당해 실험에서는 생산 CSTR에 대한 N-1 생물반응기의 시뮬레이션된 용적비를 절반으로 줄였다. 따라서, N-1 CSTR과 N-단계 생산 CSTR 간의 시뮬레이션된 용적비는 1:2.5, 1:5 및 1:10이었다. 작동 매개변수의 요약은 표 6에 나타내어져 있다.
표 6. N-1 CSTR 및 생산 CSTR에 대한 작동 매개변수
N-1 CSTR은 1.4L 작업 용적으로 작동하는 3L 유리 용기(Applikon, Scheidam, Netherlands)였다. 생물반응기는 생물반응기 중량의 증가에 반응하여 N-1 생물반응기로부터 전체 세포 배양물을 제거하는 ChemTec 펌프(Parker Domnik Hunter, Oxnard, CA)에 의해 일정한 용적으로 유지되었다. N-1 CSTR은 초기에 배양물에 산소를 공급하기 위해 7x1mm 드릴-구멍 스파저를 사용하였다. 일단 산소 요구량이 높은 수준에 도달하면, 15μm 소결 강철 스파저를 사용하여 배양물에 산소를 공급하였으며, 산소는 7x1mm 드릴-구멍 스파저를 통해 살포되어 배양물에 산소를 공급하고 CO2를 스트리핑하였다. 표 6에 열거된 용존 CO2 조건을 유지하기 위해, 오프라인 CO2 측정에 기초하여 드릴-구멍 스파저를 통한 산소 유량에 대한 수시 수동 조정이 이루어졌다. N-1 CSTR에 하이드로사이클론을 갖는 연결된 생물반응기 실험에 사용된 것과 동일한 CHO 세포주 및 기본 배지(표 2)를 0.8x106개 세포/mL로 접종하였다. 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 프로파일은 도 12a에서 찾을 수 있다. N-1 공정의 처음 이틀 동안, 온도 프로브에 상당한 오프셋이 있어 생물반응기가 온도 설정값보다 대략 3℃ 낮게 제어되어 성장 지연이 야기되었다. 온도는 2일째에 수정되었고 배양물은 빠르게 기하급수적 성장으로 돌아왔다. 희석은 표 2의 하이드로사이클론 실험에 사용된 것과 동일한 배지를 첨가함으로써 0.25 RV/일의 희석 속도로 3일째에 시작되었다. 희석 속도는 도 13에 나타낸 바와 같이 4일째에 0.54 RV/일로 증가하였고 나머지 실험 동안 일정하게 유지되었다. 희석 배지를 15분마다 등가 용량으로 N-1 생물반응기에 반연속적으로 첨가하였다.
생산 CSTR은 1.4L 작업 용적으로 작동하는 3L 유리 용기(Applikon, Scheidam, Netherlands)였다. 생산 CSTR은 N-1 CSTR에 대해 기재된 바와 동일한 이중 살포 전략을 사용하였다. 하이드로사이클론을 갖는 CSTR 생물반응기 시스템에 연결된 N-1 관류와 마찬가지로, 제조 환경에서 N-1 CSTR로부터의 전체 세포 블리드는 용적 기준으로 2.5 내지 10배 더 큰 생산 CSTR을 공급하도록 의도되었다. 그러나, 이 실험 설정에서는, 적절한 용적의 세포 블리드를 생산 CSTR에 추가하고 초과 세포 블리드 용적은 폐기물로 보냄으로서 용적비를 시뮬레이션하였다. N-1 세포 블리드를 15분마다 등가 용량으로 생산 생물반응기에 반연속적으로(이전에 기재된 바와 같이) 첨가하였다. 생산 CSTR은 초기에 최종 작업 용적의 70%의 기본 배지만 함유하였다. 일단 생산 CSTR의 용적이 1.4L의 최종 작업 용적으로 축적되면, 용적은 생물반응기로부터 전체 세포 수확물을 제거하는 ChemTec 펌프 (Parker Domnik Hunter, Oxnard, CA)에 의해 일정하게 유지되었다. 생산 CSTR에 대한 생존 세포 밀도 및 세포 생존율 데이터는 도 12b, 12c, 및 12d에 나타내어져 있다.
락테이트 축적은 앞서 기재된 바와 같이 HIPDOG 제어를 사용하여 조절하였다. N-1 CSTR은 상대적으로 높은 희석 속도로 작동하여 높은 세포 성장 속도에 도움이 되는 조건을 유지하였다. 이러한 매우 증식적인 상태에서, N-1 배양은 높은 수준의 락트산을 생성하는 경향이 있었고 HIPDOG 제어는 실험 기간 동안 7 일째부터 락테이트를 비억제 수준으로 유지하기 위해 사용되었다. 생산 CSTR은 초기에 락트산을 생성하는 상응하는 경향으로 높은 성장 속도를 보였다. HIPDOG 제어는 1:2.5 시뮬레이션된 용적비의 경우 5 내지 17일, 1:5 시뮬레이션된 용적비의 경우 6 내지 17일, 시뮬레이션된 1:10 용적비의 경우 11 내지 20일에 생산 CSTR에서의 락테이트 축적을 제어하는 데 사용되었다. HIPDOG 후, 글루코스 공급 속도는 과거 글루코스 소비율을 사용하여 계산되었고, 생물반응기는 일반적으로 글루코스 이용 가능성과 관련하여 제한되지 않았다. N-1 CSTR 및 생산 CSTR에 대한 잔류 글루코스 및 락테이트 농도는 도 14a, 14b, 14c, 및 14d에 나타내어져 있다. HIPDOG 제어가 중단된 후, pH는 1M 나트륨/칼륨(앞서 기재된 몰 비) 용액을 첨가함으로써 로우-엔드에서 제어되었고 CO2를 살포함으로써 하이-엔드에서 제어되었다. 고농축 공급물 배지는 생산 CSTR에 직접 추가 영양소를 반연속적으로 공급하였다. 영양소 공급 속도는 잔류 아미노산 농도를 40mM 이상으로 유지하도록 조정하였다. 간헐적인 오프라인 UPLC 분석은 N-1 및 생산 CSTR이 임의의 아미노산에 대해 제한되지 않음을 확인시켜 주었다. 락테이트 축적은 잘 조절된 반면(도 14a, 14b, 14c, 및 14d), 암모늄은 각각 N-1, 1:2.5, 1:5 및 1:10 용적비 CSTR에 대한 정상 상태 조건 동안 최대 7.5, 5.5, 8.9 및 15.5 mM까지 축적되었다. 삼투압 농도는 280 내지 370 mOsm/kg 사이에서 잘 유지되었다.
N-1 CSTR은 10.0x106개 생존 세포/mL의 생존 세포 밀도, 0.53 RV/일의 희석 속도 및 50pL/세포/일의 세포 특이적 희석 속도에서 14일째에 정상 상태에 도달하였다. 생산 CSTR은 도 12b, 12c 및 12d에 나타낸 바와 같이 다양한 시점에서 생존 세포 밀도, 희석 속도, 대사산물 농도 및 용적 생성성을 포함한 대부분의 매개변수에 대해 정상 상태 조건에 도달하였다. 추가적으로, 정상 상태 조건의 요약이 표 7에 나타내어져 있다. 정상 상태 시점에서, N-1 CSTR 및 1:2.5 및 1:5 용적비를 시뮬레이션하는 생산 CSTR은 97%를 초과하는 세포 생존율을 지속하였다(도 12a, 12b 및 12c). 1:10 용적비를 시뮬레이션하는 생산 CSTR에서의 생존율은 83 내지 87%의 더 낮은 정상 상태 생존율을 가졌으며(도 12d), 이는 잠재적으로 이러한 세포주에 대해 이전에 볼 수 있었던 이러한 낮은 희석 속도에서 특정 억제 대사 산물의 축적 때문이다. 캐스케이딩 CSTR에 대한 정상 상태 용적 생산성은 하이드로사이클론을 사용하는 생산 CSTR에 연결된 N-1 관류에 대해 기재된 바와 동일한 방법을 사용하여 계산되었다(도 15).
표 7. 캐스케이딩 CSTR 정상 상태의 요약
하이드로사이클론을 갖는 생산 CSTR에 연결된 N-1 관류는 더 복잡한 장비 설정을 필요로 하지만, 캐스케이딩 CSTR 시스템보다 1.8배 내지 3.1배 더 생산적이다.
1:2.5 용적비 및 1:5 용적비 캐스케이딩 CSTR 시스템이 며칠 동안 정상 상태 조건을 유지한 후, 이러한 두 생산 CSTR을 독립형 모드로 작동시켜 캐스케이딩 작업의 가치를 결정하였다. 35 내지 43일에, N-1 CSTR로부터 생산 CSTR로의 세포 블리드 첨가가 중단되었다. 등가의 희석 속도를 유지하기 위해, 신선한 관류 배지를 N-1 세포 블리드 대신에 생산 CSTR에 첨가하였다. 일단 N-1 CSTR로부터의 신선한 세포의 첨가가 중단되면, VCD 강하가 관찰되었다. 이에 따라, 생물반응기 역가(도 16)가 떨어졌으며, 이는 용적 생산성의 저하를 나타낸다.
이러한 결과는 세포 보유 장치로서 하이드로사이클론을 사용하는 예시적인 연속 연결된 생물반응기 시스템이 매우 생산적이고 배지-효율적이라는 것을 입증한다. 본원에 기재된 예시적인 시스템 및 방법은 제조 비용을 절감하고 기존 제조 시설에서 용적 생산성을 높이는 동시에 막 오염에 대한 우려를 제거할 수 있는 잠재력을 갖는다.
제조 환경에서, 본원에 개시된 설계의 단일 하이드로사이클론은 2,500 내지 10,000-L 생산 CSTR에 세포를 공급하면서 매우 증식적인 500-L N-1 관류에서 세포 보유 장치로서 작동할 수 있다. 이 시스템은 0.96 g/L/일 만큼 높은 정상 상태 용적 생산성에서 작동하고, 0.17 RV/일의 배지만을 필요로 하며, 5.7g/L의 항체 생성물의 연속 스트림을 전달한다. 이러한 용적 생산성은 막 세포 보유 장치를 사용하는 연결된 생물반응기 시스템에 필적하며 최적화된 공급-배치 공정보다 최대 2배 더 생산적이다. 하이드로사이클론을 이용한 관류는 종래의 막 관류 방법이 비실용적일 수 있는 대규모 생물반응기에 적용될 경우 상당한 이점을 가질 것이다. 본 발명자들은 하이드로사이클론이 다른 관류 모드에 대한 작동상의 제한을 갖는다는 것을 발견하였지만, 특별한 시설 수정 없이 레거시 제조 시설에 적용할 수 있는 매우 생산적인 연결된 생물반응기 시스템에 성공적으로 사용되어, 연속 또는 반연속 다운스트림 정제 공정의 경제적 이점을 가능하게 하였다.
상기 명세서에서, 다양한 양태들이 실시예들을 참조하여 기재되었다. 그러나, 이에 대한 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있고, 하기 청구항에 제시된 보다 넓은 범위의 예시적인 양태를 벗어나지 않으면서 추가적인 양태들이 구현될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 본 명세서 및 도면은 제한적인 의미보다는 예시적인 의미로 간주되어야 한다.
Claims (26)
- 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자의 연속 생산을 위한 시스템으로서,
(i) 적어도 하나의 배양 생물반응기;
(ii) 적어도 하나의 하이드로사이클론; 및
(iii) 적어도 하나의 생산 생물반응기를 포함하고,
여기서 상기 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기가 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론에 의해 연결되고, 상기 하이드로사이클론이 농축된 포유동물 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림 및 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 생성하고, 상기 농축된 포유동물 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고, 상기 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 생산 생물반응기로 향하는, 시스템. - 관심있는 적어도 하나의 생물학적 분자의 연속 생산을 위한 시스템으로서,
(i) 적어도 하나의 배양 생물반응기;
(ii) 적어도 하나의 하이드로사이클론;
(iii) 적어도 하나의 생산 생물반응기; 및
(iv) 적어도 하나의 다운스트림 구성요소를 포함하고,
여기서 상기 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기가 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 하이드로사이클론에 의해 연결되고, 상기 하이드로사이클론이 농축된 포유동물 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림 및 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 생성하고, 상기 농축된 포유동물 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고, 상기 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 생산 생물반응기로 향하는, 시스템. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 배양 생물반응기가 N-1 생물반응기 또는 N-1 관류 생물반응기인, 시스템.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 생산 생물반응기가 N 생물반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 생산 생물반응기인, 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 6주 이상 동안 고도로 생산적인 정상 상태에서 작동할 수 있는, 시스템.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로사이클론에 들어가는 세포의 약 85 내지 약 95%가 보유되고 언더플로우 스트림을 통해 배양 생물반응기로 되돌아가는, 시스템.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로사이클론이 다음의 치수를 갖는, 시스템: 약 1 내지 약 3mm 범위의 오버플로우 직경, 약 1 내지 약 4mm 범위의 언더플로우 직경, 약 5 내지 약 15mm 범위의 챔버 직경, 약 50 내지 약 170mm 범위의 원뿔형 섹션 길이, 약 2 내지 약 20mm 범위의 원통형 섹션 길이, 약 1 내지 약 4mm 범위의 와류 탐지기 길이, 및 약 0 내지 약 40mm 범위의 언더플로우 출구 길이.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.5 내지 약 25,000L의 작업 용적을 갖는, 시스템.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 약 500 내지 약 25,000L의 작업 용적을 갖는 제조- 또는 생산-규모 시스템인, 시스템.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 생물반응기가 약 0.02L 내지 약 5,000L 범위의 작업 용적을 갖는, 시스템.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기가 약 0.4 내지 약 25,000L 범위의 작업 용적을 갖는, 시스템.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산 생물반응기의 작업 용적에 대한 배양 생물반응기의 작업 용적의 비가 약 1:5 내지 약 1:20 범위인, 시스템.
- 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다운스트림 구성요소가 침전 구성요소, 정제 구성요소, 마감 구성요소, 포장 구성요소 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 시스템.
- 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다운스트림 구성요소가 시스템에 연결되지 않는, 시스템.
- 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 다운스트림 구성요소가 시스템에 연결되거나 연속 시스템의 다른 요소에 연결되는, 시스템.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양물이 NSO, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2 (BHK-21 유도체), CHO, CHO 야생형, CHO-DUKX, CHO-DUKX B11, CHO-DG44, CHO Pro-5, CHO-S, Lec13, V79, HEK 293, COS-7, HuNS1, Per. C6, CHO-K1, CHO-K1/SF, CHO-K1 GS, CHOZN GS로부터 선택된 포유동물 세포를 포함하고, 한 양태에서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, 및 COS 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 시스템.
- 관심있는 생물학적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 적어도 하나의 배양 생물반응기에서 관심있는 생물학적 분자를 생산할 수 있는 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계;
(ii) 적어도 하나의 생산 생물반응기에 단계 (i)로부터 수득된 세포를 접종하는 단계; 및
(iii) 생산 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고;
여기서 상기 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기가 적어도 하나의 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 적어도 하나의 하이드로사이클론에 의해 연결되고;
여기서 상기 숙주 세포가 포유동물 세포를 포함하는, 방법. - 관심있는 생물학적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 적어도 하나의 배양 생물반응기에서 복수의 숙주 세포를 배양하는 단계;
(ii) 적어도 하나의 생산 생물반응기에 단계 (i)로부터 수득된 세포를 접종하는 단계; 및
(iii) 관심있는 생물학적 분자의 생산을 허용하는 조건하에 생산 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하고;
여기서 상기 배양 생물반응기 및 생산 생물반응기가 배양 생물반응기에 대한 세포 보유 장치로서 기능하는 적어도 하나의 하이드로사이클론에 의해 연결되고;
여기서 상기 숙주 세포가 포유동물 세포를 포함하며,
여기서 상기 하이드로사이클론이 농축된 포유동물 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림 및 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림을 생성하고, 상기 농축된 포유동물 세포 배양물을 함유하는 언더플로우 스트림은 배양 생물반응기로 되돌아가고, 상기 부분적으로 무세포 오버플로우 스트림은 생산 생물반응기로 향하는, 방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서, 단계 (ii)에서의 접종이 세포를 배양 생물반응기에서 생산 생물반응기로 옮김으로써 이루어지는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 배양 생물반응기에서 생산 생물반응기로 세포를 옮기는 것이 연속 또는 반연속 모드에서 세포 블리드(cell bleed)에 의해 이루어지는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 세포 블리드가 반연속 모드인, 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 사용하기 위한 시스템이 막 세포 보유 장치를 포함하지 않는 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 생산 생물반응기가 2분 내지 24시간마다 한 번 또는 그 사이의 임의의 간격으로 하이드로사이클론 오버플로우에 의해 배양 생물반응기로부터 숙주 세포 전달을 수용하는, 방법.
- 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로사이클론이 연속적으로 작동하는, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드로사이클론이 배양 생물반응기로부터 연속적으로 배양물을 수용하는, 방법.
- 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양물이 NSO, Sp2/0-Ag14, BHK21, BHK TK-, HaK, 2254-62.2 (BHK-21 유도체), CHO, CHO 야생형, CHO-DUKX, CHO-DUKX B11, CHO-DG44, CHO Pro-5, CHO-S, Lec13, V79, HEK 293, COS-7, HuNS1, Per. C6, CHO-K1, CHO-K1/SF, CHO-K1 GS, CHOZN GS로부터 선택된 포유동물 세포를 포함하고, 한 양태에서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포, HEK-293 세포, VERO 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, 및 COS 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
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