CN102449153A - 表达方法 - Google Patents
表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102449153A CN102449153A CN2010800238005A CN201080023800A CN102449153A CN 102449153 A CN102449153 A CN 102449153A CN 2010800238005 A CN2010800238005 A CN 2010800238005A CN 201080023800 A CN201080023800 A CN 201080023800A CN 102449153 A CN102449153 A CN 102449153A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promotor
- dna
- expression
- target polypeptide
- nlmr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供用于制备靶多肽的表达系统。所述表达系统包括:包含与编码所述靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子的表达盒,和用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒,其包含与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子。所述表达盒处于正交启动子的调控之下。
Description
本发明涉及多肽表达的方法和表达系统。
学术目的或商业目的的许多多肽,特别是治疗用多肽是适宜地通过在重组宿主细胞中的表达来制备的。为了有效制备这样的异源多肽,特别是在生产环境中,优选应该调控所述多肽使得仅在生产的合适阶段制备出所述多肽。因此使多肽的表达置于诱导物的调控之下,使得需要时可通过施用合适的条件触发表达。例如诱导之前的异源多肽的表达(所谓“渗漏”表达),即基础表达的弱调控通常是不需要的,因为一些异源多肽对宿主细胞生长和质粒稳定性具有有害作用,该作用降低总产率。在某些情况下异源多肽的渗漏表达可导致克隆期间的载体稳定性问题,致使无法构建表达所需多肽的稳定表达载体。
存在大量具有不同调控和诱导模式的异源多肽表达系统,使得对用于制备目标多肽的表达系统/发酵工艺的选择和优化很大程度上是经验过程。这是耗费时间和不希望的。因此,需要提供改良的表达调控特别是改良的基础表达调控的系统。
诱导型基因表达是用于基因功能分析的重要工具。对这些系统的关键要求是紧密调控基础基因表达以既降低在未经诱导的细胞中基因表达的潜在有害作用,又允许明确地辨别由于诱导基因的表达而产生的生物学相关作用。
各种尝试降低或消除渗漏基础表达问题的补救办法均各有利弊。例如,降低在大肠杆菌中的基础表达的方法包括提高阻遏蛋白对操纵基因的比例、通过突变噬菌体感染的诱导、启动子强度的弱化、使用转录终止子与抗终止子的组合(由Makrides综述,MicrobiologicalReviews,1996年,第512-538页)。通过对抑制T7 RNA聚合酶的T7溶菌酶的共同过表达可减少pET载体(Novagen)的基础表达问题,该pET载体使用反式提供的T7 RNA聚合酶用于高水平蛋白表达。然而,用于降低或消除基础表达的最优表达成分的选择(Studier,Journal of Molecular Biology,1991年,第219卷第1期:第37-44页)是经验的,需要进行筛选以测定多种载体(pLysS、pLysL、pLysE和pLysH)对基础表达和诱导性的作用。在哺乳动物细胞中使用四环素调控的表达系统的基础表达是一个问题(Meyer-Ficca等人,Anal.Biochem,2004年,334:第9-19页)。Lai等人,Am.J.Physiol CellPhysiol,2003年,285:第711-719页描述了如何使用用四环素或蜕皮激素应答元件表达的报道基因(绿色荧光蛋白)产生具有高基础表达的哺乳动物细胞。可通过使用与报道基因系统组合的荧光激活细胞分选术来除去这些细胞。Becker等人,Nucleic Acids Research,2008,1-13公开了将真核HMGB蛋白用作大肠杆菌中的天然HU阻遏蛋白的替换。研究了对制备天然大肠杆菌LacZ/β-半乳糖苷酶基因的阻遏。
本发明一方面提供了制备靶多肽的表达系统,其包括:
a)包含与编码所述靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子的表达盒;和
b)用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒,其包含与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子;
其中所述表达盒处于正交启动子(orthogonal promoter)的调控之下。
认识到的是,当它们被不同条件激活时启动子是正交的。这些条件可为互斥的,或可为相容的。互斥的启动子是以下启动子,其中处于一种启动子调控之下的DNA表达所必需的条件防止处于另一种启动子的调控之下的DNA表达,包括例如四环素应答系统,其可配置为在四环素存在的情况下为“关闭的”(即防止表达),而在缺乏“四环素”的情况下为“开启的”(即启动表达)(“四环素关闭”),或者配置为在四环素存在的情况下为“开启的”(“四环素开启”),而在缺乏四环素的情况下为“关闭的”。在将编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地与四环素关闭的启动子连接,和将编码靶多肽的DNA可操作地与四环素开启的启动子连接时,添加四环素将诱导所述靶多肽的表达,但防止所述DNA结合转录调节蛋白的进一步表达。
在许多实施方案中,可操作地连接的DNA序列是相邻的。
本发明的表达系统中可使用的DNA结合转录调节蛋白包括来自原核和真核生物的蛋白。原核蛋白包括大肠杆菌DNA结合蛋白HU-α/DNA结合蛋白HU-β、整合宿主因子(IHF)-α、IHF-β和同源物。真核蛋白优选酵母(例如NHP6A、NHP6B)、或哺乳动物蛋白,包括高丰度序列非特异性高速泳动族(HMG)蛋白。HMG蛋白分为三大家族:HMGB家族(例如HMGB-1、HMGB-2、HMGB-3);HMGN家族(例如HMGN-1、HMGN-2、HMGN-3);和HMGA家族例如HMGA-1a、HMGA-1b、HMGA-1c、HMGA-2、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中的线粒体组蛋白(HM)蛋白和在人类和两栖动物线粒体中发现的同源物以及原核DNA结合转录调节蛋白的真核同源物,包括编码类似于细菌组蛋白样蛋白HU的蛋白的植物(蓝隐藻(Guillardiatheta))叶绿体hlpA。优选的DNA结合转录调节蛋白为大肠杆菌DNA结合蛋白HU-α/DNA结合蛋白HU-β和HMGB-1,特别地大鼠-HMGB-1。
本发明的表达盒可整合到宿主细胞基因组中或包含于染色体外元件(例如质粒)中。当包含于染色体外元件时所述表达盒可包含在相同的染色体外元件(例如质粒载体)中,或包含于被共转化到宿主细胞中的相容性单独染色体外元件。或者,所述表达系统可整合到噬菌体或病毒载体中,并将它们用于将所述表达系统递送到所述宿主细胞系统中。可通过本领域已知的方法装配质粒或其它表达载体。优选本发明表达盒两者均以独立质粒的形式使用。所述质粒可为自主复制质粒或整合质粒。典型地所述质粒也包含以下中的一种或多种:选择性标记,例如赋予抗生素抗性的序列;和cer稳定性序列。
在表达盒包含于单独的染色体外元件的实施方案中,优选使用不同的选择性标记以鉴定包含两种元件的转化宿主细胞。
用于所述表达盒中以过表达DNA结合转录调节蛋白的启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。本发明方面中可使用的组成型启动子实例包括T7A1、T7A2、T7A3、spc核糖体蛋白操纵子启动子、β-内酰胺酶基因启动子、噬菌体λ的PL启动子、复制调控启动子PRNAI和PRNAII、rrnB核糖体RNA操纵子的P1和P2启动子、Lac阻遏蛋白启动子pLacI、甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)和质膜H(+)-ATP酶(PMA1)启动子、交配因子(MF)-α启动子、KEX2、TEF-1、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人β-肌动蛋白启动子。更多的组成型启动子实例包括经修饰除去调控区的诱导型启动子,例如经修饰以除去lac或tac操纵基因的lac或tac启动子,这样的启动子在本发明的某些实施方案中有利,特别是当与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接时。
本发明方面中可使用的诱导型启动子实例包括依赖于噬菌体RNA聚合酶的启动子,特别是依赖于T7 RNA聚合酶的启动子系统,优选单一T7启动子,包括Studier和Moffat,J.Mol.Biol.第189卷:第113-130页(1986年)所公开的那些(通过引用结合于本文中),特别是T7基因10启动子。当使用依赖于T7RNA聚合酶的启动子系统时,据认为需要T7RNA聚合酶源,其通过本领域已知的方法提供并通常通过将表达所需的噬菌体聚合酶的λDE3原噬菌体插入大肠杆菌宿主菌株以制备溶原性宿主菌株来提供。也可通过用携带T7RNA聚合酶基因的特化λ转导噬菌体感染,将T7RNA聚合酶递送到细胞。更多可使用的诱导型启动子实例包括lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA、阿拉伯糖诱导型启动子、温度诱导型启动子(高温和低温两者)、铜诱导型启动子、uspA、uspB、malK、渗透压诱导型启动子、半乳糖诱导型启动子、信息素诱导型启动子、葡糖淀粉酶启动子、四环素应答型启动子(tetracycline responsive promoter)、人c-fos启动子、蜕皮激素诱导型启动子和糖皮质激素诱导型启动子。据认为启动子通常选自已知在宿主细胞中有效的启动子。例如,通常在大肠杆菌宿主细胞中使用大肠杆菌启动子,在哺乳动物细胞中使用哺乳动物启动子,在酵母细胞中使用酵母启动子。据认为在真核宿主中可使用很多来自原核宿主的启动子,反之亦然。优选使用至少一种诱导型启动子,特别优选与编码靶多肽的DNA可操作地连接。在一些实施方案中,特别优选将与编码靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子和与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的组成型启动子联合。
在表达盒中使用正交启动子以便可通过改变适合条件来转变所述盒的表达。过表达DNA结合转录调节蛋白具有降低或防止靶多肽的基础表达的作用,直至将条件调节至诱导靶蛋白的表达。
选择本发明方法中可使用的诱导物以对应于所使用的诱导型启动子,所述诱导物包括异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、IPTG的类似物例如异丙基-C-半乳糖苷(IBCG)、乳糖或蜜二糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、温度、pH、溶解氧水平、金属离子(例如铜)、吲哚丙烯酸、四环素、高丝氨酸内酯、蜕皮激素、水杨酸盐/酯、磷酸盐/酯。可使用其它诱导物以及在其它地方(例如,见The Operon,Miller和Renznikoff(1978年)编辑)有更全面的描述。诱导物可单独地或组合地使用。
当诱导靶多肽表达时,优选选择条件使得降低或防止DNA结合转录调节蛋白的表达。用于在靶蛋白的表达期间降低或防止DNA结合转录调节蛋白的表达的方法包括以下的一种或多种:
a)使用需要补充以维持效能的调控DNA结合转录调节蛋白表达的启动子和诱导物,例如其中诱导物被细胞代谢、修饰(因而其无效)或吸收,使得浓度下降到有效浓度之下;
b)将细胞与包含调控DNA结合转录调节蛋白表达的诱导物的培养基物理分离,然后将细胞重新引入到包含调控靶多肽表达所需要的诱导物的培养基中;
c)选择以下启动子,其调控DNA结合转录调节蛋白表达的强度比调控靶多肽表达的启动子低,使得产生充足的DNA结合转录调节蛋白以调控基础表达,而当诱导表达时,不会阻止或显著削弱靶多肽的表达;
d)选择拷贝数比编码靶多肽的载体少的编码DNA结合转录调节蛋白的载体,使得产生充足的DNA结合转录调节蛋白以调控基础表达,而当诱导所述表达时,不会阻止或显著削弱靶多肽的表达。
e)使用反义物或RNA干扰(例如微小RNA(miRNA))或小干扰RNA(siRNA)以削弱DNA结合转录调节蛋白的表达;
f)所选DNA结合转录调节蛋白的抑制剂的表达,例如使得当诱导靶多肽表达时表达所述抑制剂。在许多这类实施方案中,所述抑制剂可表达于与所述靶多肽相同的载体上;
g)靶向所选DNA结合转录调节蛋白的蛋白酶的表达,例如使得当诱导靶多肽表达时表达所述蛋白酶。在许多这样的实施方案中,所述蛋白酶可表达于与所述靶多肽相同的载体上;
h)所选DNA结合转录调节蛋白表达的抑制剂的表达,例如使得当诱导表达靶多肽时表达所述抑制剂。实例包括对DNA结合转录调节蛋白使用通常可诱导的启动子,例如不具有其关联阻遏物(例如cI阻遏蛋白)的组成型表达的λpL。如果使用诱导型启动子表达所述靶多肽和将相同的诱导型启动子用于表达所述抑制剂,那么在缺乏诱导物的情况下不存在抑制且所述DNA结合转录调节蛋白表达是组成型的。加入诱导物以诱导所述靶多肽的表达亦诱导所述抑制剂的表达,所述抑制剂阻止DNA结合转录调节蛋白的表达。在许多这样的实施方案中,所述抑制剂可于与所述靶多肽相同的载体上表达;
i)设计以下质粒载体,其具有呈不同方向的用于DNA结合转录调节蛋白和靶多肽的表达元件以及允许某种连读的用于靶多肽的转录终止子,其中所述DNA结合转录调节蛋白表达元件包括组成型启动子并跟随所述靶多肽的表达盒。当加入诱导物时,从所述靶多肽进行到所述DNA结合转录调节蛋白的表达盒的转录连读,将减少或停止所述DNA结合转录调节蛋白的转录;和
j)设计表达系统使得当加入诱导物时,DNA结合转录调节蛋白表达元件从其载体或宿主基因组中切除,从而不再可表达,但留下完整的靶多肽表达元件。
据认为DNA结合转录调节蛋白的过表达是指表达这样的蛋白到高于宿主细胞通常存在的水平。当所述DNA结合转录调节蛋白对所述宿主细胞为天然的时,过表达包括使这样的蛋白的表达强化至高于正常水平。当使用非天然的DNA结合转录调节蛋白时,通常在所述宿主细胞中存在的水平为0。将DNA结合转录调节蛋白过表达到减少或阻止靶多肽基础表达时的水平。
本发明的表达系统中可使用的操纵基因序列包括lac、gal、deo和gln。可使用一个或多个、优选两个操纵基因序列。在某些实施方案中,可使用两个或更多个完全回文操纵基因序列。在许多优选的实施方案中,使用两个完全回文操纵基因序列,最有利的是一个操纵基因序列位于启动子的下游,和一个操纵基因序列位于启动子的上游。当使用两种操纵基因系统时,优选将所述操纵基因序列间隔以最大限度调控所述启动子。据认为最常将两种操纵基因与诱导型启动子组合使用。在许多实施方案中,间隔是隔开85-150个碱基对,优选隔开90-126个碱基对,和最优选隔开91或92个碱基对。在某些实施方案中,操纵基因序列与转录起始点重叠。
据认为通常将所述操纵基因系统与合适的阻遏物序列一起使用。阻遏物序列产生阻遏蛋白,例如当使用lac操纵基因时的lacI基因序列。也可使用其它lac阻遏物序列,例如可使用lacIQ序列以提高lac阻遏蛋白的水平。也可通过宿主细胞基因组或通过使用额外的相容性质粒提供所述阻遏物序列。
本发明的表达系统提供对靶多肽的基础表达的调控,因此使所述靶多肽的制备更有效和可控。此外,本发明的表达系统能够通过阻遏对载体或宿主菌株稳定性具有毒性作用或别的不利影响的靶多肽的基础表达,使载体装配和/或克隆更有效。
当在载体装配或克隆中使用本发明的表达系统时,在某些实施方案中经常选择所述表达系统使得在所需载体装配或克隆之后,选择有利于与靶多肽可操作地连接的启动子的条件,使所述多肽能够表达。这样的实施方案特别适合于以下环境,其中例如靶多肽待表达于与载体装配中使用的那些相同的宿主细胞,最常用大肠杆菌。在其它的实施方案中,选择表达系统使得通过DNA结合转录调节蛋白对靶多肽表达的调控如此之强,以至于简单地选择用于所述靶多肽表达的条件产生很少或不产生靶多肽。在这样的实施方案中,可通过以下方式实现对所述靶多肽的表达,例如:
a)选择以下表达条件,其中表达DNA结合转录调节蛋白的细胞不再可选,但选择仅表达靶多肽的细胞,这类方法适合于在单独的载体上使用DNA结合转录调节蛋白和靶多肽的表达盒。
b)将载体转移到表达靶多肽但不表达DNA结合转录调节蛋白的宿主细胞,例如用于在真核生物(例如哺乳动物或酵母细胞)中表达靶多肽的载体在原核生物(特别是大肠杆菌)中的载体装配或克隆,所述靶多肽的表达宿主不能识别DNA结合转录调节蛋白的启动子。此方法特别适于其中DNA结合转录调节蛋白和靶多肽的表达盒位于单一载体上的表达系统,也可用于其中DNA结合转录调节蛋白和靶多肽位于不同的载体上的表达系统;
c)结构上修饰所述载体以切除编码DNA结合转录调节蛋白的表达盒,这类方法适于其中DNA结合转录调节蛋白和靶多肽的表达盒位于单一载体上的表达系统和其中DNA结合转录调节蛋白和靶多肽的表达盒位于不同的载体上的表达系统。
在许多优选的实施方案中,选择表达系统,使得与相应的但缺乏DNA结合转录调节蛋白表达元件的表达系统相比,当选择有利于靶多肽表达而不利于DNA结合转录调节蛋白表达的表达条件时不会阻止或损害所述靶多肽的表达。
某些特别优选的表达系统包含大肠杆菌DNA结合蛋白HU-α/DNA结合蛋白HU-β的表达盒,最优选与组成型lac启动子可操作地连接。这样的表达系统有利地包含用于大肠杆菌DNA结合蛋白HU-α/DNA结合蛋白HU-β和用于靶多肽的不同载体,所述靶多肽的载体包含与tac启动子可操作地连接的靶多肽的表达盒,这样的载体也优选地包含单一操纵基因,特别是天然的lac操纵基因或优选回文lac操纵基因。
进一步特别优选的表达系统包含大鼠-HMGB-1的表达盒,最优选与组成型lac启动子可操作地连接。这样的表达系统有利地包含用于大鼠-HMGB-1和靶多肽的不同载体,用于靶多肽的载体包含与tac启动子或与T7(特别是T7基因10)启动子可操作地连接的靶多肽表达盒。在许多这样的实施方案中,当所述靶多肽的载体包含tac启动子时,所述载体也包含单一操纵基因,特别是天然lac操纵基因或完全回文lac操纵基因。在更多这样的实施方案中,当所述靶多肽的载体包含T7(特别是T7基因10)启动子时,所述载体也包含两个完全回文操纵基因,特别是lac操纵基因,最优选一个操纵基因位于启动子上游,和一个操纵基因位于启动子下游。
可在宿主细胞(特别是在微生物)中使用本发明的表达系统来表达多肽。所述宿主细胞可为原核的或真核的。原核细胞的实例包括细菌细胞,例如革兰氏阴性细菌细胞包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marsescens)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)),和革兰氏阳性细菌细胞(包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))。真核细胞的实例包括酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))。可使用的哺乳动物宿主细胞包括人细胞系(例如人胎肾细胞和PERC.6细胞);鼠细胞系(例如NS0细胞);和特别是仓鼠细胞系(例如幼仓鼠肾细胞和尤其是中国仓鼠卵巢细胞)。也可使用其它真核宿主细胞例如丝状真菌、植物、昆虫、两栖动物细胞或卵巢种类(ovarian species)的那些。优选的宿主细胞为细菌,特别是肠杆菌科,优选大肠杆菌,特别是其B或K12菌株。
通过培养重组细胞,有利地将本发明的表达系统应用于制备多肽,特别是重组的多肽。
本发明的方法可表达的多肽包括治疗用蛋白和肽,包括细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、免疫球蛋白样多肽、酶、疫苗、肽类激素、趋化因子、受体、受体片段、激酶、磷酸酶、异构酶、水解酶、转录因子和融合多肽。
可表达的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体和具有生物活性的抗体片段,包括任何前述的多价形式和/或多特异性形式。
天然存在的抗体通常包括四条多肽链,即通过二硫键互联两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)。每条轻链包含可变区(VH)和恒定区(CH),CH区在其天然形式中包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含可变区(VL)和包含一个结构域的恒定区CL。
VH和VL区可进一步细分为超变区(称作互补决定区(CDR)),分散有更保守的称作构架区(FR)的区域。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
可表达的抗体片段包括完整抗体的部分,所述部分具有所需的生物活性。抗体片段通常包含至少一个抗原结合位点。抗体片段的实例包括:(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段;(ii)Fab衍生物,例如在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab’片段,其可通过两个Fab衍生物之间的二硫桥键形成二价片段;(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段;(iv)Fd衍生物,例如在CH1结构域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd衍生物;(v)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段;(vi)单链抗体分子(例如VL和VH结构域共价连接于其中的单链Fv(scFv)抗体;(vii)不含恒定区结构域的与另一个含或不含恒定区结构域的可变结构域(VH或VL结构域多肽)连接的VH或VL结构域多肽(例如VH-VH、VH-VL、或VL-VL);(viii)结构域抗体片段,例如由VH结构域或VL结构域组成的片段,和VH或VL结构域的抗原结合片段(例如分离的CDR区);(ix)包含两个抗原结合位点的所谓“双抗体”,例如在同一条多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH);和(x)包含与互补轻链多肽一起形成抗原结合区对的串联Fd区段对的所谓线性抗体。
可制备的优选的抗体片段为哺乳动物单可变结构域抗体,其为包含折叠多肽结构域的抗体片段,所述折叠多肽结构域包含以免疫球蛋白可变结构域为特点的序列并且与抗原特异性地结合(例如,少于或等于500nM的解离常数,例如少于或等于400nM,优选少于或等于250nM,和最优选少于或等于100nM),并且作为单可变结构域与抗原结合;换句话说,不具有任何互补可变结构域。单可变结构域抗体包括完全抗体可变结构域和修饰可变结构域,例如其中由不以抗体可变结构域为特点的序列代替了一个或多个环,或已截短或包含N-或C-末端突出端的抗体可变结构域,以及可变结构域的折叠片段。可制备的优选单可变结构域选自VH和VL(包括Vκ和Vλ)。最优选单可变结构域为人或骆驼(camelid)结构域(包括人源化骆驼结构域)。
因此,本发明也提供用于制备靶多肽的方法,其包括在宿主细胞中表达本发明第一方面的表达系统。
通过本领域中对所使用的细胞熟知的方法表达表达系统。优选的表达方法包括在生长培养基中培养重组细胞,特别是通过发酵,然后回收表达的蛋白。术语“生长培养基”是指用于使重组细胞生长的营养培养基。在许多实施方案中,使用营养液。对既定重组细胞合适的生长培养基为本领域所熟知。
通过选择适合于与编码DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子的条件,来调控基础表达。适当时,例如当所述细胞已生长至达到所需生长状态(例如通过监测细胞密度来确定),将条件调节为有利于与编码靶多肽的DNA可操作地连接的启动子。在许多实施方案中,在对数生长期进行此调节。
在不受下列实施例的限制的情况下阐述本发明。
实施例
质粒pAB013的构建
用于产生pAB013的初始载体为按照US 6,537,779所述制备的pZT7#2.0。pZT7#2.0具有pAT153载体骨架、cer稳定性序列、tet A/R、目的基因上游的单一天然lac操纵基因序列和上游T4转录终止子。通过Nco I、EcoR I和Xba I限制性内切酶位点用合成的寡核苷酸接头将T7A3启动子和二重完全回文lac操纵基因克隆到此质粒。
通过寡核苷酸1和2退火制备接头12:
寡核苷酸1(Seq ID No.1)
5′CATGTGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCAAGAACAATCCTGCACG
寡核苷酸2(Seq ID No.1)
5′AATTCGTGCAGGATTGTTCTTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCA
然后将所述接头连接到质粒pZT7#2.0并转化到克隆宿主菌株XL-1 Blue MR(Stratagene)作为Nco I/EcoR I片段。通过使用Nco I进行限制性消化来对转化体进行最初的筛选。通过测序确证序列。然后通过寡核苷酸3和4退火将T7A3启动子盒克隆到此载体:
寡核苷酸3(Seq ID No.3)
5′AATTCAAACAAAACGGTTGACAACATGAAGTAAACACGGTACGATGTACCGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA
寡核苷酸4(Seq ID No.4)
5′CTGGTGGGGGGTTGTGGGCGCTCGCGGTTCCGGTGCGTCGTGCCGT GTTTGCTTCGTGTTGTCGGCCGTTTTGTTTG
将退火寡核苷酸连接到所述载体和将所述载体转化到克隆宿主菌株XL-1 Blue MR(Stratagene)作为Xba I/EcoR I片段。通过限制性消化质粒DNA进行最初的筛选。然后通过测序确证所述序列。
将人肿瘤坏死因子(hTNF)-α.基因克隆到此质粒作为Nde I/Xho I片段以产生pAB013。此质粒在T7A3启动子/二重完全回文lac操纵基因序列/lac阻遏物系统的调控下表达hTNF-α。
质粒pAB044的构建
初始载体为按照US 6,537,779所述制备的pZT7#2.0。pZT7#2.0具有pAT153载体骨架、cer稳定性序列、tet A/R、目的基因上游的单一天然lac操纵基因序列和上游T4转录终止子。使用合成的寡核苷酸接头通过Nco I、EcoR I和Xba I限制性内切酶位点将T7A3启动子和二重完全回文lac操纵基因克隆到此质粒。
通过上述寡核苷酸1和2退火制备接头12
然后将所述接头连接到质粒pZT7#2.0并转化到克隆宿主菌株XL-1 Blue MR(Stratagene)作为Nco I/EcoR I片段。通过使用Nco I限制性消化最初筛选转化体。通过测序确证序列。通过寡核苷酸17和18退火将tac启动子盒克隆到此载体:
寡核苷酸17(Seq ID No.5)
5′AATTTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTG TGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA
寡核苷酸18(Seq ID No.6)
5′CTAGTGGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCG ATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA
将退火寡核苷酸连接并转化入克隆宿主菌株XL-1 BlueMR(Stratagene)作为Xba I/EcoR I片段。通过质粒DNA的限制性消化进行最初筛选。然后通过测序确证序列。将人TNFα基因克隆到此质粒作为Nde I/Xho I片段以制备pAB044。此质粒在tac启动子/二重完全回文lac操纵基因序列/lac阻遏物系统的调控下表达hTNF-α。
质粒pAB235的构建
pAB235的初始载体是pACYC-Duet(Novagen Cat.71147-3)。通过PCR自大肠杆菌菌株W3110(得自ATCC号ATCC27325)的基因组DNA扩增编码DNA结合蛋白HU(热不稳定)-β的HupB序列。使用的引物是引物1:GCCATATGCAGGAAGAAGGAGAATGAATAAATCTCAATTG(SeqID No.7)和引物2:GCCTCGAGTTAGTTTACCGCGTCTTTCAG(SeqID No.8)。将PCR产物克隆到载体pCR2.1 TOPO Blunt(得自InvitrogenCat K280020)。将插入物通过NcoI-XhoI消化(New England Biolabs)移出并克隆到pACYC-Duet以制备载体NBJ0585-6-1。
设计HupA基因(DNA结合蛋白HU-α)作为包含组成型lac启动子(除去lac操纵基因序列)和用于除去HupA基因的NdeI位点的MluI-NcoI片段。将其克隆到载体NBJ0585-6-1以制备质粒pAB235。图1提供了HupA基因序列(Seq ID No.9)。
质粒pAB249的构建
质粒pAB249的初始载体为pACYC-Duet。将设计为包含组成型lac启动子(除去lac操纵基因序列)和用于除去HupA基因的NdeI位点的MluI-NcoI片段的HupA基因(DNA结合蛋白HU-α),克隆到pACYC-Duet作为MluI-NcoI片段以制备载体NBJ0585-18-1。然后用NdeI-XhoI消化除去HupA基因。然后将大肠杆菌密码子最佳化的大鼠HMGB-1(高速泳动族B)基因克隆入以制备pAB249。图2中提供了大肠杆菌密码子最佳化的大鼠HMGB-1的基因序列(Seq ID No.10)。
pAB246的构建
pAB246的初始载体为pCI-Neo(PromegaCat E1841)。合成大鼠HMGB-1蛋白(针对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达优化的基因序列密码子)为NheI-NotI片段用于克隆。将其克隆到pCI-Neo以制备pAB246。
pAB193的构建
pAB193的初始载体为pOPRSV1/MCS(Stratagene)。将IgG Fc基因序列(图3,Seq ID No.11))作为NheI/NotI片段克隆到SpeI/NotI消化的pOPRSVI/MCS以制备pAB193。
实施例1
使用电穿孔将质粒pAB044转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素的Luria broth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD047)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
使用电穿孔将质粒pAB235和pAB044共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD283)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
使用电穿孔将质粒pAB235和pAB013共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补充有四环素和氯霉素的Luria broth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD271)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
使用电穿孔将质粒pAB249和pAB013共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD272)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
使用电穿孔将质粒pAB013转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素的Luria broth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD018)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
表1显示了重组大肠杆菌菌株的总结。
表1:重组大肠杆菌菌株
菌株命名号 | 大肠杆菌宿主菌株 | 质粒1/表达的蛋白 | 质粒2/表达的蛋白 |
CLD047 | W3110 | pAB044/hTNFα | 无 |
CLD283 | W3110 | pAB044/hTNFα | pAB235/HU-α/HU-β* |
CLD018 | W3110 | pAB013/hTNFα | 无 |
CLD271 | W3110 | pAB013/hTNFα | pAB235/HU-α/HU-β* |
CLD272 | W3110 | pAB013/hTNFα | pAB249/大鼠-HMGB-1 |
*DNA结合蛋白HU(热不稳定)-α/DNA结合蛋白HU(热不稳定)-β
实施例2
将CLD047和CLD283的小瓶从-80℃冰箱中取出并使之解冻。将10μl各种解冻的甘油储液分别接种到补加四环素(10μg/ml,CLD047)或氯霉素(34μg/ml)和四环素(10μg/ml)(对于CLD283)的5mlLuria Broth(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid)、10g/L胰蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化钠)中。将CLD047和CLD283的培养物在37℃下于定轨摇床中以200rpm孵育16h。然后将500μl各种这些培养物用于分别接种包含50ml Luria Broth(组成如上述)的250ml Erlenmeyer烧瓶。在定轨摇床中以200rpm于37℃下孵育所述烧瓶。继续在上述条件下孵育,在此期间取样(4h和22h)用于测量生长、在细菌细胞中hTNFα的积聚。通过对样品细菌的蛋白质印迹分析(使用抗hTNFα抗体)接着SDS-PAGE,来比较在CLD047和CLD28的未经诱导的培养物中hTNFα的基础累积水平。在缺乏诱导的情况下使用延长的孵育以提供最差情形条件,其扩增任何可观察的基础表达。
图4中显示了数据。出乎意料地,在有DNA结合蛋白HU(热不稳定)-α/DNA结合蛋白HU(热不稳定)-β(CLD283)存在的情况下hTNFα的基础表达甚至在延长孵育达22小时之后仍显著地减少。
实施例3
将CLD018、CLD271和CLD272的小瓶从-80℃冰箱中取出并使之解冻。将解冻的甘油储液各10μl分别接种到补加了四环素(10μg/ml,CLD018)或氯霉素(34μg/ml)和四环素(10μg/ml)(对于CLD271和CLD272)的5ml Luria Broth(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid)、10g/L胰蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化钠)中。在37℃下定轨摇床中以200rpm孵育培养物16小时。然后将各500μl这些培养物用于分别接种含有50ml Luria Broth(组成如上述)的250ml烧瓶中。在37℃下于定轨摇床中以200rpm下孵育所述烧瓶。监测生长直到OD600=0.5-0.7(约指数期中期)并取样。在上述条件下继续孵育另外的22小时,在此期间取样(在3h(指数期后期)和22h(稳定期))用于测量生长、在细菌细胞中hTNFα的积聚。通过对样品细菌的蛋白质印迹分析(使用抗hTNFα抗体)接着SDS-PAGE,来比较延长孵育后未经诱导的CLD018、CLD271和CLD272的培养物中hTNFα的基础积聚水平。
图5中显示了数据。所述数据确证:用与实施例2中使用的不同的启动子/表达系统,hTNFα的基础表达在存在DNA结合蛋白HU(热不稳定)-α/DNA结合蛋白HU(热不稳定)-β(CLD271)或真核大鼠-HMGB-1(CLD272)的情况下即使在延长孵育后依然显著降低。
实施例4
将中国仓鼠卵巢细胞细胞型CHO-PF(ECACC,cat no:00102307)的安瓿瓶从冷冻储液中复苏,并回复到含T175静置培养物的补加有10%胎牛血清(FCS)和4mM L-谷氨酰胺的50ml Iscove’s ModifiedDulbecco氏培养基(IMDM)细胞培养生长培养基中。将烧瓶常规地以1∶5的分传比传代直到转染的那天。通过除去所述培养基,用20ml磷酸缓冲盐溶液洗涤所述烧瓶的内容物,然后加入4ml胰蛋白酶和在37℃下孵育3分钟,将细胞从所述烧瓶中分离。当细胞分离后,加入新鲜的培养基到所述烧瓶以中和胰蛋白酶活性。在转染的那天,将所述细胞从所述烧瓶中分离,并对细胞取样以使用VicellTM自动化细胞计数仪测定有生活力的细胞浓度和生活力。将细胞浓度调节到7.5x105个细胞.ml-1并向6孔细胞培养微量滴定板中的每孔中转移1ml细胞悬浮液。将平板在37℃下在湿润的5%CO2培养箱(Sanyo)中孵育2小时并如下制备转染复合物:13.3μg pAB193和3.3μg pAB246(包括等量的pCMVlacI(Stratagene,表达Lac阻遏物)外加80μL Fugene6转染试剂(Roche,cat no:11814443001)和667μL IMDM。将DNA/Fugene6复合物在室温下孵育2小时,然后将200μL复合物加入细胞培养板的四个孔的每孔中。使用一半的除pAB246质粒DNA之外的上述量制备第二复合物。也将其孵化2小时,然后加入6孔细胞培养板中的2孔。将细胞培养板在37℃下在湿润的5%CO2培养箱中孵育24小时。通过加入IPTG(异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度5mM,来诱导包含pAB246的细胞培养板上的多个孔,以确证对所需蛋白质IgG-Fc的诱导。在37℃下湿润的5%CO2培养箱中对所述细胞培养板再孵育5天。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量IgG-Fc表达/分泌至细胞培养生长培养基中。
图6中显示数据。所述数据显示可使用HMGB-1共表达以减少哺乳动物表达系统中蛋白的基础表达。此外,当将诱导物IPTG加入到培养物中时,IgG-Fc蛋白质的诱导依然可行并且在诱导后产生蛋白质的水平增加。
实施例5
质粒pAB007和pAB031的构建
用于制备pAB031的初始载体为按照US 6,537,779描述所制备的pZT7#2.0。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制性内切酶位点将T7A3启动子和单一的完全回文lac操纵基因克隆到此质粒。
如上所述,包含T7A3启动子的接头由寡核苷酸3和4组成。
使寡核苷酸3和4退火,然后将形成的接头连接到质粒pZT7#2.0并转化到克隆的宿主菌株XL-1 Blue MR(Stratagene)作为Xba I/EcoRI片段。通过限制性消化质粒DNA进行最初筛选。然后通过测序确证序列。将人TNFα基因克隆到此质粒中作为Nde I/Xho I片段以制备pAB031。此质粒在T7A3启动子/单一的完全回文lac操纵基因序列/lac阻遏物系统的调控下表达hTNF-α。
质粒pAB040的构建
用于制备pAB040的初始载体为按照US 6,537,779描述所制备的pZT7#2.0。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制性内切酶位点将tac启动子和单一的完全回文lac操纵基因克隆到此质粒。
通过寡核苷酸13和14退火制备接头1314
寡核苷酸13(Seq ID No 12)
5′AATTTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGGATACTGT GTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCCA
寡核苷酸14(Seq ID No 13)
5′CTAGTGGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCACACAGTATCCGAGCCG ATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA
然后将所述接头连接到质粒pZT7#2.0并转化到克隆宿主菌株XL-1 Blue MR(Stratagene)作为Xba I/EcoR I片段。通过使用Nco I的限制性消化对转化体进行最初的筛选。通过测序确证序列。将人TNFα基因克隆到此质粒作为Nde I/Xho I片段以制备pAB40。此质粒在Tac启动子/单一的完全回文lac操纵基因序列/lac阻遏物系统的调控下表达hTNFα。
质粒pAB041的构建
用于制备pAB041的初始载体为按照US 6,537,779中描述所制备的pZT7#2.0。使用合成的寡核苷酸接头通过EcoR I和Xba I限制性内切酶位点将tac启动子和单一的天然lac操纵基因克隆到此质粒。
通过使寡核苷酸11和12退火制备接头1112
寡核苷酸11(Seq ID No.14)
5′AATTTTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGGATACTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCA
寡核苷酸12(Seq ID No.15)
5′CTAGTGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAGTATCCGAGCC GATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAA
然后将所述接头连接到质粒pZT7#2.0并转化到克隆宿主菌株XL-1 Blue MR(Stratagene)作为Xba I/EcoR I片段。通过使用Nco I限制性消化对转化体进行最初的筛选。通过测序确证序列。将人TNFα基因克隆到此质粒作为Nde I/Xho I片段以制备pAB041。此质粒在Tac启动子/单一天然lac操纵基因序列/lac阻遏物系统的调控下表达hTNFα。
质粒pAB350的构建
按照美国专利6,537,779的描述来制备pZT7#3.3的表达质粒。将人TNFα基因克隆到此质粒作为Nde I/Xho I片段以制备质粒pAB350。此质粒在T7基因10启动子/双重完全回文lac操纵基因序列/lac阻遏物系统的调控下表达hTNFα。
菌株构建
CLD032
使用电穿孔将质粒pAB031转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素的Luria broth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD032)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD408
使用电穿孔将质粒pAB235和pAB031共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD408)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD409
使用电穿孔将质粒pAB249和pAB031共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD409)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD042
使用电穿孔将质粒pAB041转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素的Luria broth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD042)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD410
使用电穿孔将质粒pAB235和pAB041共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD410)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD411
使用电穿孔将质粒pAB249和pAB041共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD411)纯化并在-80C下保存于甘油储液中。
CLD412
使用电穿孔将质粒pAB235和pAB040共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD412)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD413
使用电穿孔将质粒pAB249和pAB040共转化到大肠杆菌宿主菌株W3110。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD413)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD023
使用电穿孔将质粒pAB350转化到大肠杆菌宿主菌株BL21(λDE3)。选择菌落用于铺板到补加了四环素的Luria broth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD023)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD414
使用电穿孔将质粒pAB235和pAB350共转化到大肠杆菌宿主菌株BL21(λDE3)。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD414)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
CLD415
使用电穿孔将质粒pAB249和pAB350共转化到大肠杆菌宿主菌株BL21(λDE3)。选择菌落用于铺板到补加了四环素和氯霉素的Luriabroth(LB)琼脂上。将所得重组菌株(命名为CLD415)纯化并在-80℃下保存于甘油储液中。
表2中显示了实施例5中使用的重组大肠杆菌菌株的总结
表2
*DNA结合蛋白HU(热不稳定)-α/DNA结合蛋白HU(热不稳定)-β
将CLD032、CLD408、CLD409、CLD042、CLD410、CLD411、CLD0412、CLD0413、CLD023、CLD414和CLD415的小瓶从-80℃冰箱中取出并让其解冻。将解冻的甘油储液各10μl分别接种在补加了四环素(10μg/ml,CLD0032、CLD042、CLD043和CLD023)或氯霉素(34μg/ml)和四环素(10μg/ml)(对于CLD408、CLD409、CLD410、CLD411、CLD412、CLD413和CLD414)的5ml Luria Broth(LB,5g/L酵母提取物(Oxoid)、10g/L胰蛋白胨(Oxoid)和5g/L氯化钠)中。在37℃下在定轨摇床中以200rpm孵育培养物16小时。然后将500μl各种这些培养物用于分别接种含有50ml Luria Broth(组成如上述)的双重250ml烧瓶。在37℃下定轨摇床中以200rpm孵育所述烧瓶。监控生长直到OD600=0.5-0.7(约指数期中期)。取样,用0.5mM IPTG诱导每对烧瓶中的一个。在上述条件下继续孵育另外的22小时,在此期间取样(在3h(指数期后期)和22h(稳定期))用于测量生长、在细菌细胞中hTNFα的积聚。通过对样品细菌的SDS-PAGE,比较延长孵育后培养物中的hTNFα的积聚水平。通过对SimplyBlue染色的SDS-PAGE凝胶的激光密度计扫描来测量hTNFα的积聚水平(用%总细胞微生物蛋白(%TCP)表示),在下表3中显示对菌株CLD032、CLD408、CLD409、CLD042、CLD410、CLD411、CLD023、CLD414和CLD415所检测的水平。在下表4中显示对菌株CLD0412和CLD0413检测的水平。
表3中的数据显示包含本发明表达系统的例示菌株与缺乏DNA结合转录调节蛋白的表达盒的对应系统相比,hTNFα的基础表达显著减少。然而,通过加入IPTG诱导hTNFα表达时,由本发明的菌株产生的hTNFα水平与由缺乏DNA结合转录调节蛋白的表达盒的对应系统产生的水平可比较。
表4中的数据显示包含本发明表达系统的这些菌株的基础表达的优秀调控和hTNFα的良好诱导产生。
表3.hTNFα表达水平
菌株命名号 | 诱导 | %TCP hTNFα3小时 | %TCP hTNFα22小时 |
CLD032 | 无诱导 | 6.7 | 9.4 |
CLD032 | 0.5mM IPTG | 17.4 | 24.5 |
CLD408* | 无诱导 | 4.9 | 10.3 |
CLD408* | 0.5mM IPTG | 25.7 | 25.5 |
CLD409* | 无诱导 | 2.7 | 7.2 |
CLD409* | 0.5mM IPTG | 16.4 | 20.0 |
CLD042 | 无诱导 | 4.0 | 2.8 |
CLD042 | 0.5mM IPTG | 11.3 | 11.8 |
CLD410* | 无诱导 | 0 | 0 |
CLD410* | 0.5mM IPTG | 5.9 | 17.0 |
CLD411* | 无诱导 | 0 | 0 |
CLD411* | 0.5mM IPTG | 6.4 | 10.6 |
CLD023 | 无诱导 | 5.8 | 8.0 |
CLD023 | 0.5mM IPTG | 9.4 | 15.6 |
CLD414* | 无诱导 | 0 | 4.8 |
CLD414* | 0.5mM IPTG | 8.2 | 16.5 |
CLD415* | 无诱导 | 0 | 0 |
CLD415* | 0.5mM IPTG | 5.7 | 13.3 |
*=按照本发明的
表4.hTNFα表达水平
菌株命名号 | 诱导 | %TCP hTNFα3小时 | %TCP hTNFα22小时 |
CLD412 | 无诱导 | 0 | 0 |
CLD412 | 0.5mM IPTG | 7.1 | 17.1 |
CLD413 | 无诱导 | 0 | 0 |
CLD413 | 0.5mM IPTG | 6.5 | 11.0 |
Claims (17)
1.一种用于制备靶多肽的表达系统,其包括:
a)包含与编码所述靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子的表达盒;和
b)用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒,其包含与编码所述DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子;
其中所述表达盒处于正交启动子的调控之下。
2.权利要求1的表达系统,其中编码所述靶多肽的表达盒和用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒位于不同的载体上。
3.一种载体,其包含a)含有与编码靶多肽的DNA可操作地连接的诱导型启动子的表达盒;和
b)用于过表达DNA结合转录调节蛋白的表达盒,其包含与编码所述DNA结合转录调节蛋白的DNA可操作地连接的启动子;
其中所述表达盒处于正交启动子的调控之下。
4.一种宿主细胞,包含权利要求1或2的表达系统或者权利要求3的载体。
5.权利要求4的宿主细胞,其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
6.一种用于制备靶多肽的方法,其包括表达权利要求1或2的表达系统。
7.权利要求6的方法,其中使细胞在有利于DNA结合转录调节蛋白表达的条件下生长到所需生长状态,和当所述细胞达到所需生长状态时,将条件调节至有利于所述靶多肽的表达。
8.前述权利要求中任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法,其中所述DNA结合转录调节蛋白选自:DNA结合蛋白HU-α、DNA结合蛋白HU-β和HMGB家族。
9.前述权利要求中任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法,其中所述DNA结合转录调节蛋白与组成型启动子可操作地连接。
10.权利要求9的表达系统、载体、宿主细胞或方法,其中所述启动子选自:T7A1、T7A2、T7A3、spc核糖体蛋白操纵子启动子、β-内酰胺酶基因启动子、噬菌体λ的PL启动子、复制调控启动子PRNAI和PRNAII、rrnB核糖体RNA操纵子的P1和P2启动子、Lac阻遏蛋白启动子pLacI、甘油醛磷酸脱氢酶和质膜H(+)-ATP酶启动子、交配因子-α启动子、KEX2、TEF-1、猿猴病毒40早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、巨细胞病毒启动子和人β-肌动蛋白启动子。
11.前述权利要求中任一项的表达系统、载体、宿主细胞或方法,其中所述诱导型启动子选自:依赖于T7 RNA聚合酶的启动子、lac、lacUV5、trp、tac、trc、phoA、阿拉伯糖诱导型启动子、温度诱导型启动子、铜诱导型启动子、uspA、uspB、malK、渗透压诱导型启动子、半乳糖诱导型启动子、信息素诱导型启动子、葡糖淀粉酶启动子、四环素应答型启动子、人c-fos启动子、蜕皮激素诱导型启动子和糖皮质激素诱导型启动子。
12.权利要求2的表达系统,其中所述DNA结合转录调节蛋白的表达盒包括与组成型lac启动子可操作地连接的大肠杆菌DNA结合蛋白HU-α/DNA结合蛋白HU-β的表达盒,所述靶多肽的表达盒包括与tac启动子可操作地连接的靶多肽的表达盒并且还包括单一操纵基因。
13.权利要求12的表达系统,其中包括于所述靶多肽的表达盒中的操纵基因为天然的lac操纵基因或完全回文lac操纵基因。
14.权利要求2的表达系统,其中所述DNA结合转录调节蛋白的表达盒包括与组成型lac启动子可操作地连接的大鼠-HMGB-1的表达盒,所述靶多肽的表达盒包括:a)与tac启动子可操作地连接的靶多肽的表达盒,并且还包括单一操纵基因;或b)与T7启动子可操作地连接的靶多肽的表达盒,并且还包括两个完全回文的操纵基因,一个操纵基因位于所述启动子的上游,一个操纵基因位于所述启动子的下游。
15.一种用于制备靶多肽的方法,其包括表达权利要求12、13或14的表达系统。
16.权利要求15的方法,其中使细胞在有利于所述DNA结合转录调节蛋白表达的条件下生长到所需生长状态,和当所述细胞达到所需生长状态时,将条件调节至有利于表达所述靶多肽。
17.一种包含权利要求12、13或14的表达系统的宿主细胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0905331.5 | 2009-03-27 | ||
GBGB0905331.5A GB0905331D0 (en) | 2009-03-27 | 2009-03-27 | Expression process |
PCT/GB2010/000547 WO2010109187A1 (en) | 2009-03-27 | 2010-03-24 | Expression process |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102449153A true CN102449153A (zh) | 2012-05-09 |
Family
ID=40671852
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010800238005A Pending CN102449153A (zh) | 2009-03-27 | 2010-03-24 | 表达方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20120077227A1 (zh) |
EP (1) | EP2411523A1 (zh) |
JP (1) | JP2012521752A (zh) |
CN (1) | CN102449153A (zh) |
GB (1) | GB0905331D0 (zh) |
WO (1) | WO2010109187A1 (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111269926A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-06-12 | 江南大学 | 一种钴离子诱导型蛋白表达系统及应用 |
CN113811598A (zh) * | 2019-04-02 | 2021-12-17 | 丝芭博株式会社 | 重组蛋白的制备方法 |
CN114395584A (zh) * | 2013-05-03 | 2022-04-26 | 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 | 表达方法 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8828681B2 (en) | 2012-01-13 | 2014-09-09 | Bell Biosystems, Inc. | Host cells with artificial endosymbionts |
US8956873B2 (en) | 2012-01-13 | 2015-02-17 | Bell Biosystems, Inc. | Host cells with artificial endosymbionts |
US10076579B2 (en) | 2012-01-13 | 2018-09-18 | Bell Biosystems, Inc. | Host cells with artificial endosymbionts |
US9023612B2 (en) | 2012-01-13 | 2015-05-05 | Bell Biosystems, Inc. | Eukaryotic cells with artificial endosymbionts for multimodal detection |
CN106164268A (zh) | 2013-09-03 | 2016-11-23 | 贝尔生物系统公司 | 利用人工内共生体的宿主细胞修饰 |
WO2016054298A1 (en) * | 2014-10-01 | 2016-04-07 | Bell Biosystems, Inc. | Magnetogenetics |
GB201619876D0 (en) * | 2016-11-24 | 2017-01-11 | Cambridge Entpr Ltd | Controllable transcription |
EP4186366A1 (en) | 2016-12-08 | 2023-05-31 | Benchmark Animal Health Limited | Treatment for removing ectoparasites from fish |
CN107937328B (zh) * | 2017-11-30 | 2018-09-14 | 中央民族大学 | 基于细胞的比较器及应用与细胞计算机 |
CN110387381B (zh) * | 2018-04-16 | 2021-06-29 | 中国科学院微生物研究所 | 一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用 |
GB201809374D0 (en) | 2018-06-07 | 2018-07-25 | Fish Vet Group Norge As | Treatment for removing ectoparasites from fish |
JP2023516484A (ja) | 2020-03-11 | 2023-04-19 | ビット バイオ リミテッド | 肝細胞作製方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9715660D0 (en) * | 1997-07-25 | 1997-10-01 | Zeneca Ltd | Proteins |
WO2005084305A2 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Flavonoids |
GB0602173D0 (en) * | 2006-02-03 | 2006-03-15 | Avecia Ltd | Expression system |
GB0709061D0 (en) * | 2007-05-11 | 2007-06-20 | Avecia Biolog Ltd | Expression system |
ES2413482T3 (es) * | 2007-11-10 | 2013-07-16 | Joule Unlimited Technologies, Inc. | Organismos hiperfotosintéticos |
-
2009
- 2009-03-27 GB GBGB0905331.5A patent/GB0905331D0/en not_active Ceased
-
2010
- 2010-03-24 EP EP10722164A patent/EP2411523A1/en not_active Withdrawn
- 2010-03-24 CN CN2010800238005A patent/CN102449153A/zh active Pending
- 2010-03-24 US US13/258,283 patent/US20120077227A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-24 JP JP2012501373A patent/JP2012521752A/ja active Pending
- 2010-03-24 WO PCT/GB2010/000547 patent/WO2010109187A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NICOLE A. BECKER等: "Bacterial Repression Loops Require Enhanced DNA Flexibility", 《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114395584A (zh) * | 2013-05-03 | 2022-04-26 | 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 | 表达方法 |
CN113811598A (zh) * | 2019-04-02 | 2021-12-17 | 丝芭博株式会社 | 重组蛋白的制备方法 |
CN111269926A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-06-12 | 江南大学 | 一种钴离子诱导型蛋白表达系统及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2411523A1 (en) | 2012-02-01 |
GB0905331D0 (en) | 2009-05-13 |
WO2010109187A1 (en) | 2010-09-30 |
JP2012521752A (ja) | 2012-09-20 |
US20120077227A1 (en) | 2012-03-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102449153A (zh) | 表达方法 | |
Choi et al. | Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli | |
Rasala et al. | The microalga Chlamydomonas reinhardtii as a platform for the production of human protein therapeutics | |
US9683252B2 (en) | Method for producing a recombinant protein on a manufacturing scale | |
AU770119B2 (en) | Methods for making recombinant cells | |
Kasli et al. | Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions | |
US5665866A (en) | Process for obtaining antibodies utilizing heat treatment | |
EP1905839B2 (de) | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen | |
Sevastsyanovich et al. | Exploitation of GFP fusion proteins and stress avoidance as a generic strategy for the production of high-quality recombinant proteins | |
JP2023109812A (ja) | 生物製剤の製造のためのユニバーサル自己調節性哺乳動物細胞株プラットフォーム | |
CN107532178B (zh) | 用于自诱导蛋白表达的方法和系统 | |
US20180057823A1 (en) | Expression Vector | |
ZA200601177B (en) | Methods for producing recombinant proteins | |
Shen et al. | Identification of a novel promoter for driving antibiotic-resistant genes to reduce the metabolic burden during protein expression and effectively select multiple integrations in Pichia Pastoris | |
CN103797122A (zh) | 用于大肠杆菌中异源蛋白质生产的新的表达和分泌载体系统 | |
CA2404046C (en) | Improved methods and cells for expression of recombinant protein products | |
DE69310373T2 (de) | Expressionssystem für proteine | |
Tan et al. | The role of lac operon and lac repressor in the induction using lactose for the expression of periplasmic human interferon-α2b by Escherichia coli | |
Sommer et al. | Pseudomonas stutzeri as an alternative host for membrane proteins | |
Chen et al. | Auto-induction-based rapid evaluation of extracellular enzyme expression from lac operator-involved recombinant Escherichia coli | |
KR20210030949A (ko) | 내인성 단백질의 수준을 감소시켜 생물학적 생성물의 생산을 개선하는 방법 | |
Squires et al. | Vendor voice: A new paradigm for bacterial strain engineering | |
MASSIE et al. | Patent 2705077 Summary | |
CHOI et al. | Patent 2705077 Summary | |
WO2015001285A1 (en) | Expression process |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120509 |