CN110387381B - 一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用。本发明提供的谷氨酸棒杆菌表达系统包括一种表达载体和宿主菌：其中表达载体依次包括谷氨酸棒杆菌组成型启动子PglyA、半乳糖苷酶LacZ、乳糖通透酶LacY、T7RNA聚合酶启动子PT7；表达宿主菌含有来源于大肠杆菌Bl21(DE3)的T7RNA聚合酶。本发明的实验证明，本发明的乳糖诱导表达系统可以使谷氨酸棒杆菌利用乳糖作为诱导剂高效表达外源基因，避免了传统表达系统只能利用IPTG作为诱导剂的局限，在以糖质为原料的大规模发酵生产中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业生产菌株，是美国FDA认定的安全(generallyrecognized as safe，GRAS)菌株，广泛应用于生产氨基酸、泛酸、类胡萝卜素、有机酸等产品。同时，谷氨酸棒杆菌也是一种优良蛋白表达宿主。目前谷氨酸棒杆菌中重组蛋白表达中使用最为广泛的启动子元件为来源于大肠杆菌的Ptac启动子。但由于谷氨酸棒杆菌基因组中缺少负责编码乳糖转运的通透酶(LacY)和乳糖水解的半乳糖苷酶(LacZ)的基因，因此，目前在谷氨酸棒杆菌中，不能通过添加乳糖而只能通过添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导Ptac启动子的表达。IPTG虽然具有不被细胞代谢的优点，但由于其价格相对较高且对细胞有潜在的毒性，大大限制了其在工业化生产中的的大规模使用。
T7表达系统是一种被广泛应用在大肠杆菌中表达蛋白的强启动子调控的表达系统。虽然目前已有人将IPTG诱导的T7表达系统引入谷氨酸棒杆菌MB001中，其调控效果和表达水平与Ptac启动子相比均有较大提高，但该表达系统还是依赖IPTG诱导启动子的表达，仍没有解决诱导剂的问题(Microbial Biotechnology，2015，8，253-265)。所以开发一种能够利用乳糖进行诱导的高效、廉价、安全的谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达系统具有非常重要的实际应用价值。
目前，已有人在谷氨酸棒杆菌R163等菌株中探究了其利用乳糖的情况(ArchMicrobiol，1991，155，607-612；Applied and Environmental Microbiology，2004，70，2861-2866)，但并未见在谷氨酸棒杆菌中利用乳糖作为诱导剂诱导重组蛋白表达的报道。
因此，本专利尝试在谷氨酸棒杆菌13032中，引入lacZ和lacY基因，并利用T7启动子，构建一种可利用乳糖进行诱导的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统。
发明内容
本发明一个目的是提供一种利用乳糖诱导的谷氨酸棒杆菌表达目的蛋白试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括谷氨酸棒杆菌、乳糖诱导系统和驱动目的蛋白编码基因表达的T7表达系统；
所述T7表达系统包括T7RNA聚合酶基因、目的蛋白的编码基因和驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子；
所述乳糖诱导系统包括LacY基因和LacZ基因及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子。
上述试剂盒在制备表达目的蛋白的重组谷氨酸棒杆菌中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种表达目的蛋白的重组谷氨酸棒杆菌。
本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌，包括乳糖诱导系统和驱动目的蛋白编码基因表达的T7表达系统；
所述T7表达系统包括T7RNA聚合酶基因、目的蛋白的编码基因和驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子；
所述乳糖诱导系统包括LacY基因和LacZ基因及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子。
上述重组谷氨酸棒杆菌中，所述T7表达系统和/或所述乳糖诱导系统整合在谷氨酸棒杆菌的基因组上或以质粒的形式存在谷氨酸棒杆菌中。
上述重组谷氨酸棒杆菌中，所述T7RNA聚合酶基因整合在谷氨酸棒杆菌的基因组上，所述目的蛋白的编码基因、所述驱动目的蛋白编码基因表达的T7启动子、所述LacY基因、所述LacZ基因和所述驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子以质粒的形式存在所述谷氨酸棒杆菌中。
上述中，所述T7RNA聚合酶基因和所述T7启动子均来自大肠杆菌。
或，所述LacY基因、所述LacZ基因均来自大肠杆菌；
或，所述驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子为强启动子；
或，所述驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子为强启动子，具体为PglyA启动子；
或，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
本发明另一个目的是提供一种制备上述重组谷氨酸棒杆菌的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将T7RNA聚合酶基因整合在谷氨酸棒杆菌的基因组上，且将目的蛋白编码基因、驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子、LacY基因、LacZ基因以及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子以质粒的形式导入所述谷氨酸棒杆菌中，得到重组菌。
上述方法中，
所述将T7RNA聚合酶基因整合在谷氨酸棒杆菌的基因组上为将含有T7RNA聚合酶基因的同源片段通过重组载体导入所述谷氨酸棒杆菌中；
所述目的蛋白编码基因、驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子、LacY基因、LacZ基因以及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子通过质粒的形式导入所述谷氨酸棒杆菌中；
其中所述质粒为将T7启动子PT7片段同源重组到pXMJ19载体，且将由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段插入到载体中的EcoRI位点，且将超氧化物歧化酶基因替换表达载体中的HindIII和BamHI位点间的DNA片段，得到的质粒；
或，所述驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子为PglyA启动子；
或，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032；
或，所述目的蛋白为超氧化物歧化酶；
或，所述含有T7RNA聚合酶基因的同源片段的核苷酸序列为序列1；
或，所述含有T7启动子的PT7片段的核苷酸序列为序列2；
或，所述表达载体为pXMJ19；
或，所述由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段的核苷酸序列为序列3；
或，所述超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列为序列6。
由上述的方法制备的重组谷氨酸棒杆菌也是本发明保护的范围。
本发明第3个目的是提供一种乳糖诱导表达目的蛋白的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：在乳糖诱导下发酵上述的重组谷氨酸棒杆菌，实现乳糖诱导表达目的蛋白。
上述发酵的条件为2.5L的发酵罐，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在7.0左右、培养4小时左右OD到6-8时向重组菌培养体系加入终浓度为1％的乳糖，继续发酵20小时，发酵中后期通过流加补料培养基维持葡萄糖浓度在10g/L左右，整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％以上。
本发明的实验证明，本发明在构建的T7表达系统的基础上，将LacZ、LacY基因引入谷氨酸棒杆菌中，构建了能用乳糖诱导的T7启动子调控的表达系统，消除了IPTG对细胞的影响，同时可降低工业生产成本。
附图说明
图1为摇瓶培养重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD的蛋白表达量检测。
图2为发酵罐培养重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac的蛋白表达量检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、重组谷氨酸棒杆菌的制备
一、谷氨酸棒杆菌表达宿主菌CG-T7的构建
本实施例中所用的引物序列如下：
T7-PF:GCAACTCGTGAAAGGTAGGC
T7-PR:GCGTTACGCGAACGCGAAGT
U-T7-PF:GAGCTCGGTACCCGGGACAACTCTTTCACGTAAGTTC
U-T7-PR:CCTTTCACGAGTTGCGGAAGTAGGGGCCTTACGC
D-T7-PF:GCGTTCGCGTAACGCGGAAATAGGGGCCTTTTGTTG
D-T7-PR:GCAGGTCGACTCTAGACTTCCAAGATGGCATGGGGC
T7-PFv：ATGGTTCCGTTATCTCCGTA
T7-PRv：TTCAGCTTCCTCTCCGACT
1、大肠杆菌T7-Plac基因的扩增
根据已知T7RNA聚合酶的序列分别设计针对该序列片段的上游引物T7-PF和下游引物T7-PR，以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA为模板，扩增含有完整的乳糖操纵子调控下的T7polymerse片段，大小为4.5Kb，命名为T7-Plac序列的PCR产物。
2、T7-Plac重组同源臂的扩增
根据已知谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组的序列(GenBank登陆号：NC_003450)设计引物U-T7-PF、U-T7-PR，扩增同源重组上游同源臂T7up大小为498bp并进行PCR产物纯化；
根据已知谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组的序列(GenBank登陆号：NC_003450)设计引物D-T7-PF、D-T7-PR，扩增同源重组下游同源臂T7down大小为507bp并进行PCR产物纯化。
3、谷氨酸棒杆菌同源重组载体pK18-T7的构建：
将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Gene,145(1994)69-73)用限制性内切酶BamHI线性化，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将T7-Plac、T7up和T7down片段一步连接到pK18mobsacB上，获得的重组质粒命名为pK18-T7。
pK18-T7为将T7同源重组片段连接到pK18mobsacB载体上得到的质粒。
T7同源重组片段由T7-Plac、T7up和T7down组成，T7同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列1，其中，序列1第503-4951位为T7-Plac，序列1第16-502位为T7up，序列1第4952-5461位为T7down。
4、编码T7polymerse的谷氨酸棒杆菌表达宿主菌C.glutamicum T7的构建
利用电穿孔仪(BIO-RAD)将重组质粒pK18-T7通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，通过两次筛选获得重组菌：单交换重组菌在含25mg/L的卡那霉素BHI平板上进行第一次筛选，生长的菌株再在液体BHI培养基里过夜培养，之后在含有200g/L的蔗糖BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。
将同源重组双交换菌株用引物T7-PFv和T7-PRv进行PCR验证，能扩增出约5.6Kb的片段为正确的重组菌，将该重组菌命名为C.glutamicum T7(CG-T7)，该重组菌编码Lac启动子调控下的T7RNA聚合酶。
重组菌C.glutamicum T7为将序列1第503-4951位所示的T7-Plac通过T7同源重组片段插入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的Cgl0983基因上游得到的重组菌。
二、表达载体的构建
1、利用IPTG诱导的表达质粒pXMJ19-PT7的构建
根据已知T7启动子的序列设计引物PT7-PF、PT7-PR，以质粒pET28a(公司：Novagen；目录号：69864-3)为模板，扩增含有T7启动子的片段，回收大小约为200bp的产物，命名为PT7。
根据已知pXMJ19质粒的序列设计引物pXMJ19-PF1、pXMJ19-PR1，以质粒pXMJ19(公司：Biovector Co.,LTD,北京；目录号：Biovector6476432)为模板，扩增得到大小为6.4kb的pXMJ19片段并进行PCR产物纯化。
利用Gibson Assembly试剂盒将PT7片段以及pXMJ19片段相连接，获得的质粒命名为pXMJ19-PT7。
重组质粒pXMJ19-PT7为将T7启动子PT7片段(序列2)同源重组到pXMJ19载体得到的质粒。
引物：
PT7-PF：GCACCAATGCTTCTGGCGTCCGCTCATGAGCCCGAAGTGG
PT7-PR：ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGGAATTGTTATCCGCTCAC
pXMJ19-PF1：AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC
pXMJ19-PR1：GACGCCAGAAGCATTGGTGC
2、利用乳糖诱导的表达质粒pXMJ19-PT7-PglyA-lac的构建
根据已知谷氨酸棒杆菌glyA基因启动子的序列设计引物PglyA-PF1、PglyA-PR1，以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，扩增glyA基因的启动子，回收大小为176bp的产物，命名为PglyA。
根据已知大肠杆菌LacZ、LacY基因的序列设计引物lac-PF、lac-PR，以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用于扩增LacZ、LacY基因，扩增得到大小为4380bp的片段并进行产物纯化，命名为lac(含有LacZ、LacY基因)。
将上述1得到的pXMJ19-PT7质粒用EcoRI线性化，利用Gibson Assembly试剂盒将lac片段和PglyA片段连接到pXMJ19-PT7质粒上，构建的质粒命名为pXMJ19-PT7-PglyA-lac。
重组质粒pXMJ19-PT7-PglyA-lac为将T7启动子PT7片段(序列2)同源重组到pXMJ19载体得到的质粒，且将由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段(序列3)插入到pXMJ19载体中的EcoRI位点上得到的质粒。
由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段的核苷酸序列为序列3，其中序列3第21-196位为启动子PglyA，序列3第197-4606位为lac片段(其中，序列3第227-3301位为lacZ基因，序列3第3353-4606位为lacY基因)。
引物：
PglyA-PF1：GATCCCCGGGTACCGAGCTCAGCTACTCCACTAGTGTGATCG
PglyA-PR1：TCCTTAAGCGTAAACGTTATGCGTAAGACCTCACTCGCGG
lac-PF：ATAACGTTTACGCTTAAGGAGGTTCAACTAATGACCATGATTACGGATTC
lac-PR：TCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTAAGCGACTTCATTCACCTG
三、表达SOD的重组谷棒菌的构建
1、表达SOD重组谷棒菌CG-pXM-ApSOD的构建
以本实验室保存的来源于Aquifex Pyrophilus的超氧化物歧化酶SOD基因的大肠杆菌表达质粒pET28-ApSOD为模板，设计引物ApSOD-PF、ApSOD-PR，引物上加上RBS，PCR扩增得到含有RBS以及ApSOD基因的片段1(序列4)，ApSOD基因ORF大小为660bp。
引物：
ApSOD-PF:
CACAGGAAACAGAATTAATTGACGCATAACACACTAAACAAAGGAGGTTTCTAAAATGGGAGTTCACAAGCTGG
ApSOD-PR:GAGCTCGGTACCCGGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC
pXMJ19质粒采用HindIII、BamHI双酶切线性化，再利用Gibson Assembly试剂盒将含有RBS以及ApSOD基因的片段1连到谷氨酸棒杆菌表达质粒pXMJ19上，获得SOD表达质粒pXMJ19-ApSOD。
表达SOD重组质粒pXMJ19-ApSOD为将序列4所示的含有RBS以及ApSOD基因的片段1替换质粒pXMJ19的HindIII和BamHI酶切位点间得到的质粒。
将表达SOD重组质粒pXMJ19-ApSOD通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，用含12.5ug/ml氯霉素的BHI平板筛选阳性转化子并命名为CG-pXM-ApSOD。
重组菌CG-pXM-ApSOD为将表达SOD重组质粒pXMJ19-ApSOD导入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中得到的重组菌，其中，ApSOD基因通过pXMJ19载体上的tac启动子驱动表达。
2、表达SOD重组谷棒菌CG-pXM-PT7-ApSOD的构建
以上述1得到的质粒pXMJ19-ApSOD为模板，设计引物ApSOD-PF1、ApSOD-PR扩增得到含有RBS以及ApSOD基因的片段2(序列5)。
上述二得到的重组质粒pXMJ19-PT7质粒采用HindIII、BamHI双酶切线性化，再利用Gibson Assembly试剂盒将含有RBS以及ApSOD基因的片段2连到pXMJ19-PT7质粒上，获得表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD。
表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD为将T7启动子PT7片段(序列2)同源重组到pXMJ19载体，且将含有RBS以及ApSOD基因的片段2替换pXMJ19载体的的HindIII和BamHI位点间的DNA片段，得到的载体(质粒中含有RBS以及ApSOD基因)；且含有RBS以及ApSOD基因的片段2位于T7启动子PT7片段下游，且被其驱动表达。
将表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD通过电转化转入到已构建的重组菌CG-T7中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，用含12.5ug/ml氯霉素的BHI平板筛选阳性转化子并命名为CG-pXM-PT7-ApSOD。
重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD为将表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD导入上述一得到的重组菌C.glutamicum T7中，其中，ApSOD基因通过重组质粒pXM-PT7-ApSOD上的PT7启动子和重组菌C.glutamicum T7中的T7RNA聚合酶构成的T7表达系统驱动表达。
引物：
ApSOD-PF1：TGAGCGGATAACAATTCCCCGACGCATAACACACTAAACAAAGG
ApSOD-PR：GAGCTCGGTACCCGGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC
3、SOD表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac的构建
pXMJ19-PT7-PglyA-lac质粒采用HindIII、BamHI双酶切线性化，利用GibsonAssembly试剂盒将上述2中扩增得到的含有RBS以及ApSOD基因的片段2(序列5)连到上述二得到的pXMJ19-PT7-PglyA-lac质粒上，获得表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac。
表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac为将T7启动子PT7片段同源重组到pXMJ19载体，且将由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段插入到表达载体pXMJ19中的EcoRI位点上，且将含有RBS以及ApSOD基因的片段2替换表达载体pXMJ19中的HindIII和BamHI位点间的DNA片段，得到的质粒；且含有RBS以及ApSOD基因的片段2位于T7启动子PT7片段下游，且被其驱动表达。
将重组质粒pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum T7中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，用含12.5ug/ml氯霉素的BHI平板筛选阳性转化子并命名为CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac。
重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac为将表达SOD重组质粒pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac导入上述一得到的重组菌C.glutamicum T7中，其中，ApSOD基因通过重组质粒pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac上的PT7启动子和重组菌C.glutamicum T7中的T7RNA聚合酶构成的T7表达系统驱动表达，且通过启动子驱动lac实现乳糖诱导。
实施例2、重组谷氨酸棒杆菌的发酵
一、摇瓶种子液培养
将谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032以及重组菌株在BHI平板上过夜培养。从该新鲜平板上挑取单菌落接种到含有20ml种子培养基的100ml锥形瓶中，30℃，200rpm培养12小时。
种子培养基的配方：BHI，含脑心浸出液37g/L。
上述重组菌为CG-pXM-ApSOD和CG-pXM-PT7-ApSOD，且其培养基中额外添加终浓度为12.5ug/ml氯霉素。
2、摇瓶发酵培养
以2％接种量将种子液接种到装有50ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，控制初始OD600＝0.1，培养至OD600＝1的时候添加终浓度为0.5mM的IPTG，30℃，200rpm继续发酵20h。取20OD菌液12000rpm离心10min收集菌体重悬于1ml Tris-HCl缓冲液中(20mM,pH8.0)，菌悬液超声波破碎后12000rpm离心10min取上清，邻苯三酚法测定SOD酶活(参照“保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法”(GB/T5009.171-2003))，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
发酵培养基：CGXII，每升培养基含(NH4)2SO4 5g，尿素5g，MOPS 21g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，MgSO4 250mg，CaCl2 10mg，生物素0.2mg，1ml微量元素，葡萄糖40g。微量元素：每升含FeSO4·7H2O 16.4g，MnSO4·H2O 100mg，CuSO4 200mg，ZnSO4·7H2O 1g，NiCl2·6H2O20mg。抗生素终浓度为12.5ug/ml氯霉素。补料培养基：每升含葡萄糖400g,(NH4)2SO4 50g。
SOD酶活测量结果为：野生型菌株13032无SOD酶活，表达菌株CG-pXM-ApSOD的酶活为236U/ml，表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD的酶活为847U/ml。
SDS-PAGE检测结果如图1所示，泳道1为蛋白标准分子量，泳道2为野生型菌株13032的菌体破碎上清液，泳道3为经IPTG诱导的表达菌株CG-pXM-ApSOD的菌体破碎上清液，泳道4为经IPTG诱导的表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD的菌体破碎上清液。
依上结果可见，表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD的SOD蛋白表达量约为表达菌株CG-pXM-ApSOD的4倍。T7启动子调控下的表达系统较现有的tac启动子调控下的表达系统具有更强的蛋白表达能力。
二、发酵罐培养
以10％的接种量将重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD和重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac的种子液分别接种到1L发酵培养基当中，发酵采用2.5L的发酵罐，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在7.0左右。培养4小时左右OD到6-8时向重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD培养体系加入终浓度为0.5mM的IPTG；或培养4小时左右OD到6-8时向重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac)培养体系加入终浓度为1％的乳糖，继续发酵20小时。发酵中后期通过流加补料培养基维持葡萄糖浓度在10g/L左右。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％以上。
取20OD菌液12000rpm离心10min收集菌体重悬于1ml Tris-HCl缓冲液中(20mM,pH8.0)，菌悬液超声波破碎后12000rpm离心10min取上清，邻苯三酚法测定SOD酶活(参照“保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法”(GB/T 5009.171-2003))，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD和重组菌CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac在发酵罐上的菌体密度OD600均能达到80以上。
SOD酶活测量结果为：乳糖诱导的表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac的酶活为2936U/ml，IPTG诱导的表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD的酶活为3216U/ml。
SDS-PAGE检测结果如图2所示，泳道1为野生型菌株13032的菌体破碎上清液，泳道2为蛋白标准分子量，泳道3为经乳糖诱导的表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac的菌体破碎上清液，泳道4为经IPTG诱导的表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD的菌体破碎上清液。
依上结果可见，在所构建的T7表达系统的基础上，进一步构建的重组表达菌株CG-pXM-PT7-ApSOD-PglyA-lac在乳糖为诱导剂的条件下能高效地诱导SOD酶基因的表达。而且，由于发酵时所使用的诱导剂为乳糖，极大地降低了工业生产成本。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所 中国科学院大学
<120> 一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gagctcggta cccgggacaa ctctttcacg taagttcttc gtttctgcta ccacagccct 60
ggcggcagtc gcactggttg cgtgttcccc taatgagatt gattctgaac tgaaggtgcc 120
aacggcaact ggcgtttctt taccttcgaa gaacgtttcc gcgacctcaa ctgctactac 180
agatgaggat gcgcctggct acattgattg cgtagccgca ccaactcagc aacctgctga 240
aatctcacta aactgtgcaa tggatattga tcggctcacg gatatttctt ggagcgaatg 300
ggatactgat tccgcaactg gaaccggtac ccgcatcgta accgctgcaa atggtcaaga 360
gaccgaaacc gaagatattg aggtgaagct ttccttcccc accgagtctt cccaaggcct 420
agtgttcact caggtcaccg tcgatggaca ggttctcttc ctctaatcct ccataattag 480
agagcgtaag gcccctactt ccgcaactcg tgaaaggtag gcggatccag atcccggaca 540
ccatcgaatg gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat 600
tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct 660
cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 720
aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac 780
tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 840
cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 900
tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 960
cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 1020
tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 1080
tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 1140
cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc 1200
tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac 1260
gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 1320
gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 1380
ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata 1440
ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc 1500
tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca 1560
atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 1620
ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 1680
tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccc 1740
caggctttac actttatgct tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 1800
tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacggattca ctggccgtcg ttttacaacg 1860
tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 1920
cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 1980
cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg 2040
gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca 2100
cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt gacctatccc attacggtca atccgccgtt 2160
tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg 2220
gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtc gggatctgat ccggatttac 2280
taactggaag aggcactaaa tgaacacgat taacatcgct aagaacgact tctctgacat 2340
cgaactggct gctatcccgt tcaacactct ggctgaccat tacggtgagc gtttagctcg 2400
cgaacagttg gcccttgagc atgagtctta cgagatgggt gaagcacgct tccgcaagat 2460
gtttgagcgt caacttaaag ctggtgaggt tgcggataac gctgccgcca agcctctcat 2520
cactacccta ctccctaaga tgattgcacg catcaacgac tggtttgagg aagtgaaagc 2580
taagcgcggc aagcgcccga cagccttcca gttcctgcaa gaaatcaagc cggaagccgt 2640
agcgtacatc accattaaga ccactctggc ttgcctaacc agtgctgaca atacaaccgt 2700
tcaggctgta gcaagcgcaa tcggtcgggc cattgaggac gaggctcgct tcggtcgtat 2760
ccgtgacctt gaagctaagc acttcaagaa aaacgttgag gaacaactca acaagcgcgt 2820
agggcacgtc tacaagaaag catttatgca agttgtcgag gctgacatgc tctctaaggg 2880
tctactcggt ggcgaggcgt ggtcttcgtg gcataaggaa gactctattc atgtaggagt 2940
acgctgcatc gagatgctca ttgagtcaac cggaatggtt agcttacacc gccaaaatgc 3000
tggcgtagta ggtcaagact ctgagactat cgaactcgca cctgaatacg ctgaggctat 3060
cgcaacccgt gcaggtgcgc tggctggcat ctctccgatg ttccaacctt gcgtagttcc 3120
tcctaagccg tggactggca ttactggtgg tggctattgg gctaacggtc gtcgtcctct 3180
ggcgctggtg cgtactcaca gtaagaaagc actgatgcgc tacgaagacg tttacatgcc 3240
tgaggtgtac aaagcgatta acattgcgca aaacaccgca tggaaaatca acaagaaagt 3300
cctagcggtc gccaacgtaa tcaccaagtg gaagcattgt ccggtcgagg acatccctgc 3360
gattgagcgt gaagaactcc cgatgaaacc ggaagacatc gacatgaatc ctgaggctct 3420
caccgcgtgg aaacgtgctg ccgctgctgt gtaccgcaag gacaaggctc gcaagtctcg 3480
ccgtatcagc cttgagttca tgcttgagca agccaataag tttgctaacc ataaggccat 3540
ctggttccct tacaacatgg actggcgcgg tcgtgtttac gctgtgtcaa tgttcaaccc 3600
gcaaggtaac gatatgacca aaggactgct tacgctggcg aaaggtaaac caatcggtaa 3660
ggaaggttac tactggctga aaatccacgg tgcaaactgt gcgggtgtcg ataaggttcc 3720
gttccctgag cgcatcaagt tcattgagga aaaccacgag aacatcatgg cttgcgctaa 3780
gtctccactg gagaacactt ggtgggctga gcaagattct ccgttctgct tccttgcgtt 3840
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ggcgtttgac gggtcttgct ctggcatcca gcacttctcc gcgatgctcc gagatgaggt 3960
aggtggtcgc gcggttaact tgcttcctag tgaaaccgtt caggacatct acgggattgt 4020
tgctaagaaa gtcaacgaga ttctacaagc agacgcaatc aatgggaccg ataacgaagt 4080
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catgacgctg gcttacgggt ccaaagagtt cggcttccgt caacaagtgc tggaagatac 4260
cattcagcca gctattgatt ccggcaaggg tctgatgttc actcagccga atcaggctgc 4320
tggatacatg gctaagctga tttgggaatc tgtgagcgtg acggtggtag ctgcggttga 4380
agcaatgaac tggcttaagt ctgctgctaa gctgctggct gctgaggtca aagataagaa 4440
gactggagag attcttcgca agcgttgcgc tgtgcattgg gtaactcctg atggtttccc 4500
tgtgtggcag gaatacaaga agcctattca gacgcgcttg aacctgatgt tcctcggtca 4560
gttccgctta cagcctacca ttaacaccaa caaagatagc gagattgatg cacacaaaca 4620
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tgtagtgtgg gcacacgaga agtacggaat cgaatctttt gcactgattc acgactcctt 4740
cggtaccatt ccggctgacg ctgcgaacct gttcaaagca gtgcgcgaaa ctatggttga 4800
cacatatgag tcttgtgatg tactggctga tttctacgac cagttcgctg accagttgca 4860
cgagtctcaa ttggacaaaa tgccagcact tccggctaaa ggtaacttga acctccgtga 4920
catcttagag tcggacttcg cgttcgcgta acgcggaaat aggggccttt tgttgtcttc 4980
tcctggaggc tatttaagaa gtttaaattg tgtccatgag ttcgcgtatg gcaatgacag 5040
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gtgtagagcc agaccaaggt cactgcaaga ccaagcgcaa cgccccatgc catcttggaa 5460
gggaaatagg ggccttttgt tg 5482
<210> 2
<211> 229
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcaccaatgc ttctggcgtc cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 60
ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 120
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<210> 3
<211> 4626
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gatccccggg taccgagctc agctactcca ctagtgtgat cggggttatt ttttcacttc 60
aatgggtggc taaaagacgt gggcacgtga gtaaactcat gcgcgcgaaa cgatgggagt 120
gaacccatac ttttatatat gggtatcggc ggtctatgct tgtgggcgta cctgtcccgc 180
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cgtcgtcccc tcaaactggc agatgcacgg ttacgatgcg cccatctaca ccaacgtgac 540
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gctcacattt aatgttgatg aaagctggct acaggaaggc cagacgcgaa ttatttttga 660
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cagtcgtttg ccgtctgaat ttgacctgag cgcattttta cgcgccggag aaaaccgcct 780
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gatgagcggc attttccgtg acgtctcgtt gctgcataaa ccgactacac aaatcagcga 900
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tcgtctgacc gatgatccgc gctggctacc ggcgatgagc gaacgcgtaa cgcgaatggt 1560
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cggtctggtc tttgccgacc gcacgccgca tccagcgctg acggaagcaa aacaccagca 2100
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tcaggggaaa accttattta tcagccggaa aacctaccgg attgatggta gtggtcaaat 2820
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ataataaccg ggcaggccat gtctgcccgt atttcgcgta aggaaatcca ttatgtacta 3360
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tggtctgctt tctgacaaac tcgggctgcg caaatacctg ctgtggatta ttaccggcat 3600
gttagtgatg tttgcgccgt tctttatttt tatcttcggg ccactgttac aatacaacat 3660
tttagtagga tcgattgttg gtggtattta tctaggcttt tgttttaacg ccggtgcgcc 3720
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catcaataat cagtttgttt tctggctggg ctctggctgt gcactcatcc tcgccgtttt 3900
actctttttc gccaaaacgg atgcgccctc ttctgccacg gttgccaatg cggtaggtgc 3960
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
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gaaggcttat gaggccctta aagactttat caagcaccac caccaccacc actgaccggg 720
taccgagctc 730
Claims (3)
1.一种制备重组谷氨酸棒杆菌的方法，包括如下步骤：将T7RNA聚合酶基因整合在谷氨酸棒杆菌的基因组上，且将目的蛋白编码基因、驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子、LacY基因、LacZ基因以及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子以质粒的形式导入所述谷氨酸棒杆菌中，得到重组菌；
所述将T7RNA聚合酶基因整合在谷氨酸棒杆菌的基因组上为将含有T7RNA聚合酶基因的同源片段通过重组载体导入所述谷氨酸棒杆菌中；
所述目的蛋白的编码基因为超氧化物歧化酶基因；
所述质粒为将如下片段按照如下顺序插入表达载体得到：含有T7启动子的PT7片段、含有RBS以及超氧化物歧化酶基因的片段2、由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段；
所述lac片段包括所述LacY基因和所述LacZ基因；
所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032；
所述含有T7RNA聚合酶基因的同源片段的核苷酸序列为序列1；
所述含有T7启动子的PT7片段的核苷酸序列为序列2；
所述含有RBS以及超氧化物歧化酶基因的片段2的核苷酸序列为序列5；
所述由lac片段和驱动其表达的启动子PglyA组成的片段的核苷酸序列为序列3；
所述表达载体为pXMJ19。
2.由权利要求1所述的方法制备的重组谷氨酸棒杆菌。
3.一种乳糖诱导表达超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤：在乳糖诱导下发酵权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，实现乳糖诱导表达超氧化物歧化酶。
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| T7表达系统及自诱导蛋白产出策略;冯杉;《北京教育学院学报(自然科学版)》;20090920(第3期);第10-15页 * |
| 重组E.coli γ-ggt和gs原核表达载体的构建、蛋白诱导表达与应用和Hsp70、Hsp90及TAK1相关真核表达载体的构建及鉴定;胥俊峰;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20081115;摘要、第46-48页 * |
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Granted publication date: 20210629 |