CN114774419A - 一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用。本发明设计重构了一系列适用于B.subtilis的温敏型生物传感器；基于CRISPRi系统构建双向基因回路，并将双向基因回路与单输入多输出基因回路结合构建了高版本单输入多输出基因回路，实现多个代谢模块在不同发酵时间点的激活表达或/和下调表达。之后将获得的基因回路动态调控参与2’‑FL代谢合成的3个模块：2’‑FL合成模块，辅因子供给模块和竞争途径模块。利用基因回路进行动态调控能够将细胞生长阶段与2’‑FL合成阶段解耦连，缓解宿主细胞的代谢压力，合理分配代谢流，实现2’‑FL的高效合成。

Description

一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于合成生物学与代谢工程技术领域，尤其是指一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用。
背景技术
2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)，分子式C18H32O15，是一种由三个单糖分子组成的寡糖，其含量在总母乳寡糖中的占比约31％。2’-FL能够抑制肠道致病菌生长，从而增强肠道防护屏障功能，调节人体免疫系统。当前欧盟与FDA均批准2’-FL可以添加应用至婴幼儿配方奶粉中，市场前景广阔。
作为GRAS(Generally Regard as Safe)革兰氏阳性宿主，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)已被广泛用于L-天冬酰胺酶，透明质酸以及核黄素等高附加值化合物的生物合成。相比于大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母(S.cere)等宿主，2’-FL在B.subtilis胞内代谢合成后能够快速高效的转运至胞外，降低后续提取工艺成本，从而实现工业化制备。2’-FL的代谢合成途径较为复杂，其合成关键前体大部分会流向两条竞争途径：磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)与糖酵解途径(glycolysis)。然而磷酸戊糖与糖酵解途径均为微生物正常生长所必须途径，因此采用静态策略直接敲除这两条竞争途径会对细胞生长造成损害。因此如何调整B.subtilis胞内代谢流，平衡细胞生长与2’-FL代谢合成模块，提高2’-FL发酵产量是一个值得探讨的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过代谢工程技术，发明了一种动态调控策略以提高2’-FL发酵产量的方法。本发明首先设计重构了一系列适用于B.subtilis的温敏型生物传感器；其次，基于CRISPRi系统构建双向基因回路，并将双向基因回路与单输入多输出(SIMO)基因回路结合构建了高版本单输入多输出(ASIMO)基因回路，实现多个代谢模块在不同发酵时间点的激活表达或/和下调表达。之后将获得的ASIMO基因回路动态调控参与2’-FL代谢合成的3个主要模块：2’-FL合成模块，辅因子供给模块和竞争途径模块。首先利用ASIMO回路中的激活模块动态激活基因manB与futC的表达，实现2’-FL的从头合成；其次将辅因子模块与2’-FL合成模块偶联，即在激活2’-FL合成模块同时上调辅因子供给模块的关键基因ndk与gmk，提高2’-FL的发酵产量；最后利用ASIMO回路中的抑制回路顺序下调磷酸戊糖与糖酵解途径的关键基因pfkA与zwf，使得代谢流更多的流向于2’-FL合成模块，得到重组菌株MT17。MT17菌株在摇瓶内发酵60h后2’-FL发酵产量达到1.83g/L，是出发菌株MT1的5.16倍，且重组菌株MT17在5-L发酵罐内发酵60h，发酵产量可达5.8g/L。与静态调控相比，利用ASIMO基因回路进行动态调控能够将细胞生长阶段与2’-FL合成阶段解耦连，缓解宿主细胞的代谢压力，合理分配代谢流，进而实现2’-FL的高效合成。
本发明的第一个目的在于提供一种温敏型启动子，所述启动子为Pveg5、Pveg30、Pveg32、Pveg34或Pveg37；所述Pveg5的序列如SEQ ID NO.2所示、Pveg30的序列如SEQ ID NO.3所示、Pveg32的序列如SEQ ID NO.4所示、Pveg34的序列如SEQ ID NO.5所示、Pveg37的序列如SEQ IDNO.6所示。
本发明的第二个目的在于提供一种单输入多输出基因回路，所述单输入多输出基因回路包含至少2个所述的温敏型启动子，将不同激活温度的温敏型启动子分别与至少2个模块蛋白编码基因连接，实现至少2个模块蛋白的顺序表达。
本发明的第三个目的在于提供一种双向基因回路，所述双向回路包含至少1个所述的温敏型启动子、dCPf1和crRNA，实现基因的上调和下调；所述dCPf1连接温敏型启动子，crRNA连接组成型启动子，或dCPf1连接组成型启动子，crRNA连接温敏型启动子。
本发明的第四个目的在于提供一种高版本单输入多输出基因回路，所述高版本单输入多输出基因回路同时包含所述的单输入多输出基因回路和所述的双向基因回路。
本发明的第五个目的在于提供含所述温敏型启动子的细胞。
在本发明的一个实施例中，所述细胞还表达由组成型启动子连接的转录因子CI857。
本发明的第六个目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用所述的温敏型启动子控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用所述的温敏型启动子控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用所述的温敏型启动子在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。
在本发明的一个实施例中，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用温敏型启动子Pveg34控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用温敏型启动子Pveg37控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用温敏型启动子Pveg34在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。
在本发明的一个实施例中，利用组成型启动子或温敏型启动子表达所述dCpf1。
在本发明的一个实施例中，组成型启动子选自P43、Pveg或Psrfa。
在本发明的一个实施例中，所述温敏型启动子选自Pveg5或Pveg37。
在本发明的一个实施例中，所述基因manB Gene ID:946574；所述基因futC的序列来源于文章Engineering the Substrate Transport and Cofactor RegenerationSystems for Enhancing 2’-Fucosyllactose Synthesis in Bacillus subtilis DOI:10.1021/acssynbio.9b00314；所述基因zwf的序列来源于CRISPRi allows optimaltemporal control of N-acetylglucosamine bioproduction by a dynamiccoordination of glucose and xylose metabolism in Bacillus subtilis，所述基因pfkA的序列来源于CRISPRi allows optimal temporal control of N-acetylglucosamine bioproduction by a dynamic coordination of glucose andxylose metabolism in Bacillus subtilis；所述基因ndk的序列来源于文章Engineeringthe Substrate Transport and Cofactor Regeneration Systems for Enhancing 2’-Fucosyllactose Synthesis in Bacillus subtilis DOI:10.1021/acssynbio.9b00314；所述基因gmk的序列来源于文章Engineering the Substrate Transport and CofactorRegeneration Systems for Enhancing 2’-Fucosyllactose Synthesis in Bacillussubtilis DOI:10.1021/acssynbio.9b00314。
本发明的第七个目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌的构建方法，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用所述的温敏型启动子控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用所述的温敏型启动子控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用所述的温敏型启动子在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。
本发明的第八个目的在于提供所述的温敏型启动子或所述的基因回路或所述的重组枯草芽孢杆菌在合成化合物中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述应用为在发酵合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
在本发明的一个实施例中，发酵培养分三个时间段进行，时间段分别为0-12h、12-18h、18-60h；发酵培养的温度为30-37℃，搅拌速率200-900rpm。
在本发明的一个实施例中，发酵的培养基包括5-60g/L碳源，2-12g/L氮源，2-15g/L三水磷酸氢二钾，2-15g/L磷酸二氢钾。
在本发明的一个实施例中，所述碳源包括乳糖与其他碳源，所述其他碳源选自蔗糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种；所述氮源选自蛋白胨、酵母粉和硫酸铵中的一种或多种。
为解决2’-FL发酵产量较低的问题，本发明提供了一种提高2’-FL的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本方法首先在B.subtilis内利用组成型启动子P43表达来源于噬菌体λ的温敏型转录因子CI857，之后以枯草芽孢杆菌常见组成型启动子Pveg为改造模板，将CI857结合序列OR1和/或OR2放置于Pveg启动子内，重构适用于B.subtilis的温敏型启动子Pveg5，Pveg5的激活温度为37℃，且基本没有表达泄露；对Pveg5的OR2序列部分进行突变，通过流式细胞仪筛选获得了具有不同激活温度点(30℃，32℃，34℃与37℃)的温敏型启动子。之后利用具有不同激活温度的温敏型启动子构建了SIMO基因回路，基于CRISPRi系统构建了双向基因回路，结合SIMO与双向基因回路构建了ASIMO基因回路，该基因回路可以在不同发酵时间点通过改变环境温度，实现多个代谢模块的独立、顺序、动态的双向调控。最后利用温敏型启动子Pveg34介导2’-FL从头合成途径中关键基因manB与futC的表达，使得2’-FL合成模块在发酵温度为34℃时开始工作，摇瓶内发酵验证2’-FL的发酵产量达到755mg/L；利用组成型启动子P43表达dCpf1，利用温敏型启动子Pveg37控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA在37℃时的抑制表达，摇瓶发酵2’-FL的发酵产量进一步提升至1400mg/L；利用温敏型启动子Pveg34在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk，将GTP供给与2’-FL合成偶联，即在34℃时，增加GTP的合成供给，获得的重组菌株MT17在摇瓶内发酵60h后2’-FL发酵产量提高至1830mg/L，在5-L发酵罐内发酵60h后发酵产量可达5.8g/L。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明基于新型正交的温敏型传感器，设计构建了ASIMO基因回路，顺序调控涉及2’-FL代谢合成的3个模块，合理分配胞内资源，缓解代谢压力，最终2’-FL摇瓶发酵产量达到1830mg/L，5-L发酵罐内发酵产量可达5.8g/L。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例中所得重组菌株在不同温度下的荧光表达强度；
图2是本发明实施例2中梯度温度变化培养下WY9菌株荧光表达变化；
图3是本发明温敏型双向基因回路调控结果图；
图4是本发明实施例5菌株MT3发酵培养过程图；
图5是本发明实施例5菌株MT9发酵培养过程图；
图6是本发明实施例5菌株MT17发酵培养过程图；
图7是本发明实施例6菌株MT17在5-L发酵罐规模中发酵培养过程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1.温敏型启动子的设计与构建
(a)人工合成基因片段P43-CI857(序列见SEQ ID NO.1)，以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物amye-U-F、amye-U-R扩增得到基因amye-U，采用引物amye-D-F、amye-D-R扩增得到基因amye-D。以质粒p7s6为模板，采用引物S-amye-F、S-amye-R扩增得到基因amye-S。以P43-CI857为模板，采用P43-CI-F、P43-CI-R扩增得到片段P43-CI。(质粒p7s6与p7z6质粒均来源于Cre/lox System and PCR-Based Genome Engineering in Bacillussubtilis，DOI:10.1128/AEM.01156-08)。
(b)将步骤(a)中获得的四个片段amye-U、amye-D、amye-S和P43-CI基因片段按照等摩尔比配置进行一步融合pcr处理。将连接之后的片段转入枯草芽孢杆菌168感受态内，之后涂板于添加壮观霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，长出的单菌落即为重组菌株WY1。
(c)以质粒phta0为模板(序列来源文章：Design of a programmable biosensor-CRISPRi genetic circuits for dynamic and autonomous dual-control of metabolicflux in Bacillus subtilis doi:10.1093/nar/gkz1123)，分别采用6对引物引物Pveg-F、Pveg-R，Pveg1-F、Pveg1-R，Pveg2-F、Pveg2-R，Pveg3-F、Pveg3-R，Pveg4-F、Pveg4-R，Pveg5-F、Pveg5-R扩增得到片段Pveg、Pveg1、Pveg2、Pveg3、Pveg4和Pveg5。将得到的6个片段分别热击转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有氨苄抗性的2mLLB液体培养基内37℃培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到6种质粒phta1、phta2、phta3、phta4、phta5和phta6。
(d)在步骤(a)制备得到的枯草芽孢杆菌WY1中，分别导入质粒phta2、phta3、phta4、phta5和phta6，之后涂板于添加氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养18h，之后长出的单菌落即分别枯草芽孢杆菌WY2、WY3、WY4、WY5、WY6和WY7。
(e)将步骤(d)中构建的6株菌使用LB培养基培养，使用96孔板分别在28℃、30℃、32℃、34℃、37℃、39℃和42℃培养20h，利用酶标仪检测荧光值。GFP荧光蛋白激发波长：490nm，发射波长530nm，增益60。结果如图1所示，含有phta6质粒的WY7在低于37℃情况下泄露较低，且动态调控范围达到39.5倍。因此，质粒phta6内含有的启动子Pveg5为适用于枯草芽孢杆菌的温敏型启动子，激活温度为37℃。
(f)随后发现，以启动子Pveg5为出发启动子，改变部分序列调整Pveg5的激活温度，从而获得了一系列温敏型启动子Pveg30(激活温度30℃)，Pveg32(激活温度32℃)，Pveg34(激活温度34℃)和Pveg37(激活温度37℃)。
引物序列：
Amye-D-F：ggaagaaacatttggctaaccgcaactttagagtaaagggc
Amye-D-R：tgaacaggagcgttgattgatataac
Amye-U-F：ggttcatcctctgtctctatcaat
Amye-U-R：aattgttatccgctctaatcatccttccagggtatgtt
P43-CI-F：ctgggaaaacccttgataggtggtatgttttcgct
P43-CI-R：ttactctaaagttgcggttagccaaatgtttcttccggc
S-amye-F：ggaaggatgattagagcggataacaatttcacac
S-amye-R：cataccacctatcaagggttttcccagtcacg
Pveg-F：ttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagctgtcaccggatgtgcttPveg-R：acatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatg
Pveg1-F：ttattaacgttgatataatttaaattttatttgacataacaccgtgcgtgttgtacaataaatgtagctgtcaccggatgtgct
Pveg1-R：acatttattgtacaacacgcacggtgttatgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatgt
Pveg2-F：ttattaacgttgatattaacaccgtgcgtgttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagctgtcaccggatgtgct
Pveg2-R：acatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatg
Pveg3-F：ttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagtaacaccgtgcgtgttgagctgtcaccggatgtgctt
Pveg3-R：caacacgcacggtgttactacatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatgt
Pveg4-F：
ttattaacgttgatattaacaccgtgcgtgttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagtacctctggcggtgataaagctgtcaccggatgtgc
Pveg4-R：ttatcaccgccagaggtactacatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaa
Pveg5-F：ttattaacgttgatattaacaccgtgcgtgttgacatacctctggcggtgataatacaataaatgtagctgtcaccggatgtgctt
Pveg5-R：acatttattgtattatcaccgccagaggtatgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatgtgag
实施例2.构建SIMO基因回路
(a)人工合成以启动子Pveg32控制CFP表达的基因片段Pveg32-CFP(SEQ ID NO.7)，人工合成以启动子Pveg34控制GFP表达的基因片段Pveg34-GFP(SEQ ID NO.8)，人工合成以启动子Pveg37控制mcherry表达的基因片段Pveg37-mcherry(SEQ ID NO.9)。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物npre-U-F、npre-U-R扩增得到基因npre-U，采用引物npre-D-F、npre-D-R扩增得到基因npre-D，采用引物gana-U-F、gana-U-R扩增得到基因gana-U，采用引物gana-D-F、gana-D-R扩增得到基因gana-D。以质粒p7z6为模板，采用引物npre-Z-F、npre-Z-R扩增得到基因npre-Z。以质粒p7s6为模板，采用引物gana-C-F、gana-C-R扩增得到片段gana-S。
(b)将步骤(a)中获得的npre-U、npre-D、npre-Z和Pveg32-CFP基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段npre-CFP；将步骤(a)中获得的gana-U、gana-D、gana-S、Pveg34-GFP和Pveg37-mcherry基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段gana-GFP-mcherry。将融合PCR之后得到的基因片段npre-CFP和gana-GFP-mcherry导入枯草芽孢杆菌WY1的感受态内，之后涂板于添加博来霉素与壮观霉素的LB固体培养基平板上，30℃培养14h，长出的单菌落为枯草芽孢杆菌WY9。
(c)挑选步骤(b)中平板上长出的单菌落WY9培养至10mL LB液体培养基内，30℃培养10h取样1mL，之后将剩余的液体培养基放置在32℃培养4h，取样1mL；其次将剩余的液体培养基放置于34℃培养基4h，取1mL，最后剩余的液体培养基放置于37℃培养基4h，取1mL。
(d)将步骤(c)中分别在30、32、34和37℃培养条件下的的样品利用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光表达分析。荧光检测波长为：CFP激发波长为440nm，发射波长为465-480nm；GFP激发波长为488nm，发射波长为515-564nm；mcherry激发波长为580nm，发射波长为610-669nm。如图2所示，在30℃培养条件下，WY9菌株内的CFP、GFP与mcherry均不表达；当温度提升至32℃时，WY9菌株内的CFP开始表达，菌株显示出青色荧光；将温度继续升至34℃后，WY9菌株内的CFP继续表达，同时GFP开始表达，菌株显示出青色与绿色荧光；当温度最终升至37℃时，WY9菌株内的CFP、GFP与mcherry均表达，菌株显示出青色、绿色与红色荧光。因此，该结果证明了温敏型单输入多输出基因回路的成功构建。
引物序列：
Npre-D-Fgtcgtgactgggaaaaccctaattctgctacaggtcacg
Npre-D-Rggcagccatcttcacc
Npre-U-Fcacttattcacacgcacata
Npre-U-Racgcaataaatatcaacgttaataattcattcaagagttatgttt
Npre-Z-F ggcattacgcttggcatggacgaactctataaataatatgaccatgattacgaattcgag
Npre-Z-Rtgacctgtagcagaattagggttttcccagtcacgacgt
Gana-C-F ctaatgtgtgtttacgacaaagggttttcccagtcacgac
Gana-C-R cactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaagagcggataacaatttcacaca
Gana-D-F ctacccgtgttaatatcaacgttaataatgacatcacattctcctcct
Gana-D-Rtatctattcaatggcggaggtc
Gana-U-F agttgcctggccttgaaca
Gana-U-R ctgggaaaaccctttgtcgtaaacacacattaggc
实施例3.构建双向基因回路
(a)人工合成以启动子Pveg5控制dcpf1表达的基因片段Pveg5-dcpf1(SEQ IDNO.10)，人工合成以启动子Pveg控制抑制mcherry表达crrna的基因片段Pveg-crrnam(SEQ IDNO.11)。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物npre-U-F、npre-U-R2扩增得到基因npre-U2，采用引物npre-D-F、npre-D-R扩增得到基因npre-D，采用引物gana-U-F、gana-U-R扩增得到基因gana-U，采用引物gana-D-F2、gana-D-R扩增得到基因gana-D2。以质粒p7z6为模板，采用引物npre-Z-F2、npre-Z-R扩增得到基因npre-Z2，以质粒p7S6为模板，采用引物gana-C-F、gana-C-R2扩增得到片段gana-S2。
(b)将步骤(a)中获得的npre-U2、npre-D、npre-Z2和Pveg5-dcpf1基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段npre-dcpf1；将步骤(a)中获得的gana-U、gana-D2、gana-S2和Pveg-crrnam基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段gana-crrnam。将融合PCR之后得到的基因片段npre-dcpf1和gana-crrnam导入导入枯草芽孢杆菌WY7的感受态内，之后涂板于添加博来霉素与壮观霉素的LB固体培养基平板上，30℃培养14h，长出的单菌落为枯草芽孢杆菌WY10。
(c)人工合成以启动子P43控制mcherry表达的片段序列P43-mcherry(序列见SEQID NO.12)，以质粒pP43-egfp(序列来源Design ofaprogrammable biosensor-CRISPRigenetic circuits for dynamic and autonomous dual-control of metabolic fluxinBacillus subtilis doi:10.1093/nar/gkz1123)为模板，利用引物P43-F,P43-R扩增得到片段HP43，将得到的片段P43-mcherry与HP43按照等摩尔比体积进行吉布森连接，连接后的体系转入大肠杆菌JM109感受态内，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基，长出的单菌落接种于2mL的含有氨苄抗性的LB液体培养基内进行培养，利用生工质粒提取试剂盒进行提取得到质粒pP43-mcherry。将质粒pP43-mcherry导入枯草芽孢杆菌WY10感受态内，之后涂板于添加卡那霉素的LB固体培养基平板上，30℃培养14h，长出的单菌落分别为枯草芽孢杆菌WY11。
(d)挑选步骤(c)中平板上长出的单菌落WY11培养至2mL LB液体培养基内，分别在32℃、34℃、37℃、39℃与42℃条件下培养20h，将上述不同温度培养的样品利用酶标仪检测荧光值。GFP荧光蛋白激发波长：490nm，发射波长530nm，增益60；Cherry荧光蛋白激发波长：580nm，发射波长610nm，增益70。如图3所示，随着培养温度的升高，GFP相对表达水平呈现上升趋势，且mcherry相对表达水平呈现下降趋势。因此，该结果证明了温敏型双向调控基因回路的成功构建。
引物序列：
P43-FtggacgagctgtacaagtaaAGAGTCGACCTGTTAcgaa
P43-R cataccacctatcaggatccagttgctcaaaaaaatctcgg
Npre-D-F：gtcgtgactgggaaaaccctaattctgctacaggtcacg
Npre-D-R：ggcagccatcttcacc
Npre-U-F：cacttattcacacgcacata
Npre-U-R2：cagaggtatgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataattcattcaagagttatgtttttt
Npre-Z-F2：atgaagagtattttgagttcgtgcagaataggaataactaatatgaccatgattacgaattcgag
Npre-Z-R：tgacctgtagcagaattagggttttcccagtcacgacgt
Gana-C-F：ctaatgtgtgtttacgacaaagggttttcccagtcacgac
Gana-C-R2：gtacttgaaaacaggctgtgaggcctgtttttttattaatccgagcggataacaatttcacacag
Gana-D-F2：ttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatgacatcacattctcctccttgtt
Gana-D-R：tatctattcaatggcggaggtc
Gana-U-F：agttgcctggccttgaaca
Gana-U-R：ctgggaaaaccctttgtcgtaaacacacattaggc
实施例4.模块顺序动态调控2’-FL代谢合成
(a)，人工合成以启动子P43控制manc、gmd和wcag表达的基因片段P43-manc-gmd-wcag(SEQ ID NO.13)，人工合成以启动子Pveg34控制manb与futc表达的基因片段Pveg34-manb-futc(SEQ ID NO.14)。以枯草芽孢杆菌168作为模板，采用引物npre-U-F、npre-U-R3扩增得到基因npre-U3，采用引物npre-D-F、npre-D-R扩增得到基因npre-D，采用引物bpr-U-F、bpr-U-R扩增得到基因bpr-U，采用引物bpr-D-F、bpr-D-R扩增得到基因bpr-D。以质粒p7z6为模板，采用引物npre-Z-F3、npre-Z-R扩增得到基因npre-Z3，以质粒p7S6为模板，采用引物bpr-C-F、bpr-C-R扩增得到基因bpr-S。
(b)，将步骤(a)中获得的npre-U3、npre-D、npre-Z3和P43-manc-gmd-wcag基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段npre-mgw；将步骤(a)中获得的bpr-U、bpr-D、bpr-S和Pveg34-manb-futc(SEQ ID NO.14)基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段bpr-mf。将融合PCR之后得到的基因片段npre-mgw和bpr-mf导入枯草芽孢杆菌WY1的感受态内，之后涂板于添加博来霉素与壮观霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，长出的单菌落为枯草芽孢杆菌MT3。
(c)，人工合成以启动子Pveg37控制抑制pfka和zwf的crrna表达的基因片段Pveg37-crRNApz(SEQ ID NO.15)。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物ganA-U-F、ganA-U-R扩增得到基因ganA-U，采用引物ganA-D-F2、ganA-D-R扩增得到基因ganA-D2，采用引物epr-U-F、epr-U-R扩增得到基因epr-U，采用引物epr-D-F、epr-D-R扩增得到基因epr-D。以质粒p7z6为模板，采用引物ganA-C-F、ganA-C-R2扩增得到基因ganA-Z3，以质粒p7S6为模板，采用引物epr-C-F、epr-C-R扩增得到片段epr-S。
(d)，将步骤(c)中获得的ganA-U、ganA-D2、ganA-Z3和实施例3步骤(a)中的Pveg5-dcpf1基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段ganA-dcpf1；将步骤(c)中获得的epr-U、epr-D、epr-S和Pveg37-crrnapz基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段epr-crRNApz。将融合PCR之后得到的基因片段ganA-dcpf1和epr-crRNApz导入枯草芽孢杆菌MT3的感受态内，之后涂板于添加博来霉素与壮观霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，长出的单菌落为枯草芽孢杆菌MT9。
(e)，人工合成以启动子Pveg34控制ndk与gmk表达的基因片段Pveg34-ndk-gmk(SEQID NO.16)。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，采用引物ldh-U-F、ldh-U-R扩增得到基因ldh-U，采用引物ldh-D-F、ldh-D-R扩增得到基因ldh-D。以质粒p7S6为模板，采用引物ldh-C-F、ldh-C-R扩增得到片段ldh-S。
(f)，将步骤(e)中获得的ldh-U、ldh-D、ldh-S和Pveg34-ndk-gmk基因片段按照等摩尔比配置进行融合PCR连接得到基因片段ldh-GTP。将融合PCR之后得到的基因片段ldh-GTP导入枯草芽孢杆菌MT9的感受态内，之后涂板于添加壮观霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，长出的单菌落为枯草芽孢杆菌MT17。
引物序列：
Npre-D-F：gtcgtgactgggaaaaccctaattctgctacaggtcacg
Npre-D-R：ggcagccatcttcacc
Npre-U-F：cacttattcacacgcacata
Npre-U-R3：aagttcaagcgaaaacataccacctatcaggatcttcattcaagagttatgttttttacatat
Npre-Z-F3：agtggttccttgagaatcaagaccgctttcgggggtaatatgaccatgattacgaattcgag
Npre-Z-R：tgacctgtagcagaattagggttttcccagtcacgacgt
Bpr-C-F：aatgaggaaaaaaacgaaaaacagagagcggataacaatttcacacagg
Bpr-C-R：tatgtcaacactacccgtgttaatatcaacgttaataaagggttttcccagtcacga
Bpr-D-F：tggaagaaaagacaaaacttatccttgagttactgaacaagtaataagtggaaaaaaagctgcc
Bpr-D-R：cgaacattatgaaacgtgtttgac
Bpr-U-F：ttatcgcacaaatcgcgaaag
Bpr-U-R：tgaaattgttatccgctctctgtttttcgtttttttcctcat
ganA-C-F：ctaatgtgtgtttacgacaaagggttttcccagtcacgac
ganA-C-R2：gtacttgaaaacaggctgtgaggcctgtttttttattaatccgagcggataacaatttcacacag
ganA-D-F2：ttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatgacatcacattctcctccttgtt
ganA-D-R：tatctattcaatggcggaggtc
ganA-U-F：agttgcctggccttgaaca
ganA-U-R：ctgggaaaaccctttgtcgtaaacacacattaggc
epr-C-F：gtacttgaaaacaggctgtgaggcctgtttttttattaatcctatgaccatgattacgaattcgagctc
epr-C-R：aaatcttaaaggtttttggttaagggttttcccagtcacgacgt
epr-D-F：gtgactgggaaaacccttaaccaaaaacctttaagatttgcattc
epr-D-R：ggtccagcagatcaggatgc
epr-U-F：aagcagcatctgcacaaat
epr-U-R：tatgtcaacgagcacgccgccaatatcaacgttaataaatgagcgagagggcctatg
ldh-C-F：aagcgtgaacgcgttgcaccaagatataagaaaatgctggaggttgaataatatgaccatgattacgaattcgagctcg
ldh-C-R：acaatcagccctttactctaaagttgcggagggttttcccagtcacg
ldh-D-F：tgactgggaaaaccctccgcaactttagagtaaagggctg
ldh-D-R：ttgaaggcaggaaggct
ldh-U-F：ggttcatcctctgtctctatcaa
ldh-U-R：gtcaacactacccgtgttaatatcaacgttaataataatcatccttccagggtatgtttc
实施例5.枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵培养
在2mL LB培养基中接种固体LB平板上的枯草芽孢杆菌单菌落MT3、MT9、MT17，30℃，220rpm培养8-10h后，按接种量5％接入含有12.5g/L三水磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，12.0g/L酵母粉，6.0g/L蛋白胨，10.0g/L蔗糖和10.0g/L乳糖的液体培养基内。如图4所示，枯草芽孢杆菌MT3在0-12h时，培养温度30℃，12-60h时培养温度37℃。60h后发酵结束，取1mL菌液超声破碎离心，取上清液进行高效液相色谱检测，枯草芽孢杆菌MT3的2’-FL发酵产量达到755mg/L。如图5所示，枯草芽孢杆菌MT9在0-12h培养温度30℃，12-18h培养温度34℃，18-60h培养温度37℃，60h后发酵结束，取1mL菌液超声破碎离心，取上清液进行高效液相色谱检测，枯草芽孢杆菌MT9的2’-FL发酵产量达到1399mg/L。如图6所示，枯草芽孢杆菌MT17在0-12h培养温度30℃，12-18h培养温度34℃，18-60h培养温度37℃。60h后发酵结束，取1mL菌液超声破碎离心，取上清液进行高效液相色谱检测，枯草芽孢杆菌MT17的2’-FL发酵产量达到1830mg/L。
实施例6.枯草芽孢杆菌MT17的5-L发酵罐培养
在125mL的LB培养基中接种固体LB平板上的枯草芽孢杆菌MT17单菌落，30℃，220rpm培养8-10h后，按接种量5％接入含有12.5g/L三水磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，20.0g/L酵母粉，20.0g/L蛋白胨，30.0g/L蔗糖，8.0g/L尿素和5.0g/L乳糖的5-L发酵罐内。5-L发酵罐内初始体积为2.5L，发酵过程中利用氨水保持pH为7.0，溶氧控制范围20～40％。发酵罐培养条件为0-12h时培养温度30℃，12-18h时培养温度34℃，18-60h时培养温度37℃。在发酵时间20h与40h时，补料蔗糖使发酵罐内蔗糖浓度达到60g/L，在发酵时间36h时，补料乳糖使发酵罐内乳糖终浓度提高5g/L。如图7所示，枯草芽孢杆菌MT17的发酵产量可达5.8g/L。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用
<130> 16
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3181
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
gacgctcttc gcaagggtgt ctttttttgc ctttttttcg gtttttgcgc ggtacacata 60
gtcatgtaaa gattgtaaat tgcattcagc aataaaaaaa gattgaacgc agcagtttgg 120
tttaaaaatt tttatttttc tgtaaataat gtttagtgga aatgattgcg gcatcccgca 180
aaaaatattg ctgtaaataa actggaatct ttcggcatcc cgcatgaaac ttttcaccca 240
tttttcggtg ataaaaacat ttttttcatt taaactgaac ggtagaaaga taaaaaatat 300
gtaccgagct caaaggaggt gaaatgtaca catgcaaaag ttactgtctc tcccatctaa 360
cttagtccag agctttcatg aattagaaag agtaaatcgg actgactggt tttgcacatc 420
cgacccggtc ggaaaaaagc ttggcagtgg cggtggcaca tcatggctgc tcgaggaatg 480
ctataatgaa tactctgacg gcgcaacttt cggagagtgg ctcgaaaaag agaaaagaat 540
actgctccac gccggtgggc agtcccgccg tttgccgggt tacgctccta gtggtaagat 600
ccttacgccg gtcccagtat ttcgctggga aagaggacag cacctgggcc agaacctttt 660
gagtttacag cttccacttt atgagaaaat aatgagctta gctcctgaca agcttcatac 720
ccttatcgcc agcggagatg tctatatacg ctctgaaaaa ccgttgcagt ccatacctga 780
ggccgacgtt gtttgttacg ggctgtgggt cgacccttcc ttggcgacgc accatggggt 840
attcgccagt gaccgcaaac atccggagca gctcgacttc atgctccaga agccttcttt 900
ggcagaactt gaaagtctct ctaagactca tcttttcctg atggacatag ggatttggtt 960
attgtccgat cgcgcggtag agattttgat gaagcggtcc cataaggagt cctctgaaga 1020
attgaaatac tatgatcttt acagcgactt tgggcttgcc ctgggcaccc acccacggat 1080
agaagatgag gaagtgaata ctctctcagt tgcaattctg cctctcccgg gcggggagtt 1140
ttatcattac ggtactagca aagagctgat ttcctccacc ctgtcagtcc agaataaggt 1200
ttatgaccaa cgccggatca tgcatagaaa ggtcaaaccg aaccctgcca tgtttgtcca 1260
aaatgcggta gtacgtatcc cactgtgcgc tgagaacgca gacctctgga ttgaaaactc 1320
acatataggt ccgaagtgga agatagcgag ccggcatatt attactgggg tgccggagaa 1380
cgactggagt ttagcagtgc cagcaggggt atgtgtcgac gttgtcccga tgggtgataa 1440
aggttttgtg gcacggcctt acgggctgga cgatgtattt aaaggagacc tgagagattc 1500
aaaaaccact ttgaccggaa tcccattcgg tgaatggatg tccaaacggg gactctccta 1560
cactgatctg aaaggtcgga ctgacgacct tcaagccgtg agcgtgtttc cgatggtcaa 1620
ttccgttgag gaattgggcc tcgtactccg ctggatgctt tcagaacctg agttggaaga 1680
gggtaagaac atctggcttc gctccgagca cttctctgcg gatgaaataa gcgctggagc 1740
gaacctgaag cgcctctatg ctcaacggga agaattccgg aaggggaact ggaaagcatt 1800
agccgttaac catgagaagt ccgtatttta ccaactcgat ttggccgatg cggcggagga 1860
tttcgtacgg ttgggactcg acatgcctga attactccct gaggacgccc tgcagatgag 1920
tcgcatccat aatagaatgc ttcgcgctcg catcctcaag ctcgacggca aagattaccg 1980
gcctgaggaa caggcagcgt tcgatctgct gcgcgacggt ttgctcgatg gaatctctaa 2040
ccgtaaaagc acaccaaagc tggacgttta ttctgaccaa atagtgtggg gccggagccc 2100
agtacggatt gatatggccg gcggctggac cgacacccca ccttatagct tatattccgg 2160
aggcaatgtt gtgaaccttg cgattgaatt aaatggtcaa cctccattgc aggtatacgt 2220
taagccgtgt aaggacttcc atatcgtcct gcggtccatt gacatggggg ctatggagat 2280
agtctcaact tttgacgagc tgcaagacta caaaaagatc ggttccccgt tttccatacc 2340
aaaagccgct ctctctcttg ctggattcgc cccggcattt agcgctgtgt catatgcatc 2400
attggaggaa cagttgaaag attttggagc tggtattgag gttacgttat tagccgccat 2460
tccggctggt tctggtcttg gtacatcatc aatactggct tccacagtgc tcggggcaat 2520
taatgatttt tgtggactcg catgggacaa aaatgaaatt tgtcagagaa cattagtttt 2580
agagcaactg ctgactacgg gaggaggctg gcaggaccag tacggcgggg tcttgcaagg 2640
tgttaagctt ctgcagaccg aggccgggtt cgcgcaatcc ccattagtta gatggctgcc 2700
agaccacctc tttacgcacc ctgaatacaa ggactgccat ttgttatatt acacaggaat 2760
tacgcgtacg gcaaagggaa tactggcgga gatcgtctct agcatgtttc tcaatagtag 2820
cctgcacctg aatttactct cagaaatgaa agcgcatgcc ctcgacatga acgaggctat 2880
acagcgcggc tcctttgttg agttcggtcg ccttgtcgga aagacatggg agcaaaacaa 2940
ggcactcgac agtggtacca acccaccagc agtcgaagcc ataatcgact taattaagga 3000
ttatacatta gggtataaac tcccaggggc tggaggaggc gggtacctct acatggttgc 3060
taaagatccg caggcagcag tgcgcatccg caaaatttta acagagaacg cgccaaaccc 3120
tcgtgcccgg tttgtggaaa tgactctgtc cgacaaaggc tttcaagtaa gtcggtccta 3180
a 3181
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
ttattaacgt tgatattaac accgtgcgtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgt 66
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 3
ttattaacgt tgatattcgg tgcgtgcgag ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgt 66
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 4
ttattaacgt tgatatttat tgcgtgcatg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgt 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 5
ttattaacgt tgatattaac acgggtagtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgt 66
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 6
ttattaacgt tgatattggc ggcgtgctcg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgt 66
<210> 7
<211> 821
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 7
ttattaacgt tgatatttat tgcgtgcatg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtagat cttattattc acactttaaa ggaggtttcc tatggtttcc aaaggtgaag 120
aattattcac cggggttgta cctattctcg tggagctcga cggcgatgtc aatggacaca 180
agttcagcgt gtcaggtgag ggtgaaggcg atgccaccta tggcaaatta actctcaagt 240
tcatatgcac caccggcaaa ctgcctgtcc catggccaac tttagtaacg acacttacat 300
ggggcgtcca gtgtttctca cgctatccag accatatgaa gcagcacgac ttctttaaga 360
gcgctatgcc ggaagggtac gtgcaggaaa gaacgatctt ctttaaggat gatgggaact 420
ataagacccg tgccgaagta aaatttgagg gagacactct tgtaaaccgg attgagttga 480
agggaatcga cttcaaagag gacggtaaca tccttgggca taagttagag tataattaca 540
tttcccacaa tgtttacatc acggctgaca agcaaaaaaa tgggataaaa gctaatttca 600
agatacgtca taatatagag gacggaagcg tgcaactggc cgatcattac caacagaaca 660
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ccgcgggcat tacgcttggc atggacgaac tctataaata a 821
<210> 8
<211> 891
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 8
ttattaacgt tgatattaac acgggtagtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtagct gtcaccggat gtgctttccg gtctgatgag tccgtgagga cgaaacagcc 120
tctacaaata attttgttta atagagggta agtaaaagaa aggaggttta ttttatgggt 180
aagggagaag aacttttcac tggagttgtc ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt 240
aatgggcaca aattttctgt cagtggagag ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt 300
acccttaaat ttatttgcac tactggaaag ctgcctgttc cttggccaac acttgtcact 360
actcttactt atggtgttca atgcttttca agatacccag atcatatgaa gcggcacgac 420
ttcttcaaga gcgccatgcc tgagggatac gtgcaggaga ggaccatctt cttcaaggac 480
gacgggaact acaagacacg tgctgaagtc aagtttgagg gagacaccct cgtcaacaga 540
atcgagctta agggaatcga tttcaaggag gacggaaaca tcctcggcca caagttggaa 600
tacaactaca actcccacaa cgtatacatc atggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa 660
gttaacttca aaattagaca caacattgaa gatggaagcg ttcaactagc agaccattat 720
caacaaaata ctccaattgg cgatggccct gtccttttac cagacaacca ttacctgtcc 780
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tttgtaacag ctgctgggat tacacatggc atggatgaac tgtacaaata a 891
<210> 9
<211> 844
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 9
ttattaacgt tgatattggc ggcgtgctcg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtagtg atagcggtac cctcgagaaa aggaggaaaa aaaatgttta tgaaatctac 120
tggtattgta cgtatggtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca tcaaggagtt 180
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cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg tgaccaaggg 300
tggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg gctccaaggc 360
ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc ccgagggctt 420
caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga cccaggactc 480
ctccctgcag gacggcgaat tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca acttcccctc 540
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ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga aggacggcgg 660
ccactacgac gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc agctgcccgg 720
cgcctacaac gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt 780
ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg agctgtacaa 840
gtaa 844
<210> 10
<211> 4005
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 10
ttattaacgt tgatattaac accgtgcgtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtagtg atagcggtac cctcgaaaag gaggtgggat ccatgtcaat ttatcaagaa 120
tttgttaata aatatagttt aagtaaaact ctaagatttg agttaatccc acagggtaaa 180
acacttgaaa acataaaagc aagaggtttg attttagatg atgagaaaag agctaaagac 240
tacaaaaagg ctaaacaaat aattgataaa tatcatcagt tttttataga ggagatatta 300
agttcggttt gtattagcga agatttatta caaaactatt ctgatgttta ttttaaactt 360
aaaaagagtg atgatgataa tctacaaaaa gattttaaaa gtgcaaaaga tacgataaag 420
aaacaaatat ctgaatatat aaaggactca gagaaattta agaatttgtt taatcaaaac 480
cttatcgatg ctaaaaaagg gcaagagtca gatttaattc tatggctaaa gcaatctaag 540
gataatggta tagaactatt taaagccaat agtgatatca cagatataga tgaggcgtta 600
gaaataatca aatcttttaa aggttggaca acttatttta agggttttca tgaaaataga 660
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aatttgccta aatttctaga aaataaagct aagtatgaga gtttaaaaga caaagctcca 780
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caaattttaa gtgatacaga atctaaatct tttgtaattg ataagttaga agatgatagt 1140
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gatttgagta aaatttattt taaaaatgat aaatctctta ctgatctatc acaacaagtt 1320
tttgatgatt atagtgttat tggtacagcg gtactagaat atataactca acaaatagca 1380
cctaaaaatc ttgataaccc tagtaagaaa gagcaagaat taatagccaa aaaaactgaa 1440
aaagcaaaat acttatctct agaaactata aagcttgcct tagaagaatt taataagcat 1500
agagatatag ataaacagtg taggtttgaa gaaatacttg caaactttgc ggctattccg 1560
atgatatttg atgaaatagc tcaaaacaaa gacaatttgg cacagatatc tatcaaatat 1620
caaaatcaag gtaaaaaaga cctacttcaa gctagtgcgg aagatgatgt taaagctatc 1680
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cagtcagaag ataaggcaaa tattttagac aaggatgagc atttttatct agtatttgag 1800
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actcaaaagc catatagtga tgagaaattt aagctcaatt ttgagaactc gactttggct 1920
aatggttggg ataaaaataa agagcctgac aatacggcaa ttttatttat caaagatgat 1980
aaatattatc tgggtgtgat gaataagaaa aataacaaaa tatttgatga taaagctatc 2040
aaagaaaata aaggcgaggg ttataaaaaa attgtttata aacttttacc tggcgcaaat 2100
aaaatgttac ctaaggtttt cttttctgct aaatctataa aattttataa tcctagtgaa 2160
gatatactta gaataagaaa tcattccaca catacaaaaa atggtagtcc tcaaaaagga 2220
tatgaaaaat ttgagtttaa tattgaagat tgccgaaaat ttatagattt ttataaacag 2280
tctataagta agcatccgga gtggaaagat tttggattta gattttctga tactcaaaga 2340
tataattcta tagatgaatt ttatagagaa gttgaaaatc aaggctacaa actaactttt 2400
gaaaatatat cagagagcta tattgatagc gtagttaatc agggtaaatt gtacctattc 2460
caaatctata ataaagattt ttcagcttat agcaaagggc gaccaaatct acatacttta 2520
tattggaaag cgctgtttga tgagagaaat cttcaagatg tggtttataa gctaaatggt 2580
gaggcagagc ttttttatcg taaacaatca atacctaaaa aaatcactca cccagctaaa 2640
gaggcaatag ctaataaaaa caaagataat cctaaaaaag agagtgtttt tgaatatgat 2700
ttaatcaaag ataaacgctt tactgaagat aagtttttct ttcactgtcc tattacaatc 2760
aattttaaat ctagtggagc taataagttt aatgatgaaa tcaatttatt gctaaaagaa 2820
aaagcaaatg atgttcatat attaagtata gctagaggtg aaagacattt agcttactat 2880
actttggtag atggtaaagg caatatcatc aaacaagata ctttcaacat cattggtaat 2940
gatagaatga aaacaaacta ccatgataag cttgctgcaa tagagaaaga tagggattca 3000
gctaggaaag actggaaaaa gataaataac atcaaagaga tgaaagaggg ctatctatct 3060
caggtagttc atgaaatagc taagctagtt atagagtata atgctattgt ggtttttgag 3120
gatttaaatt ttggatttaa aagagggcgt ttcaaggtag agaagcaggt ctatcaaaag 3180
ttagaaaaaa tgctaattga gaaactaaac tatctagttt tcaaagataa tgagtttgat 3240
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atgggtaaac aaacaggtat tatctactat gtaccagctg gttttacttc aaaaatttgt 3360
cctgtaactg gttttgtaaa tcagttatat cctaagtatg aaagtgtcag caaatctcaa 3420
gagttcttta gtaagtttga caagatttgt tataaccttg ataagggcta ttttgagttt 3480
agttttgatt ataaaaactt tggtgacaag gctgccaaag gcaagtggac tatagctagc 3540
tttgggagta gattgattaa ctttagaaat tcagataaaa atcataattg ggatactcga 3600
gaagtttatc caactaaaga gttggagaaa ttgctaaaag attattctat cgaatatggg 3660
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ctaactagtg tcctaaatac tatcttacaa atgcgtaact caaaaacagg tactgagtta 3780
gattatctaa tttcaccagt agcagatgta aatggcaatt tctttgattc gcgacaggcg 3840
ccaaaaaata tgcctcaaga tgctgatgcc aatggtgctt atcatattgg gctaaaaggt 3900
ctgatgctac taggtaggat caaaaataat caagagggca aaaaactcaa tttggttatc 3960
aaaaatgaag agtattttga gttcgtgcag aataggaata actaa 4005
<210> 11
<211> 258
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 11
ttattaacgt tgatataatt taaattttat ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata 60
aatgtagaaa gataaaaaat atagaggtag agacgcgagg tctaagaact ttaaataatt 120
tctactgttg tagatatgta cggctccaag gcctacgtaa tttctactgt tgtagatcgt 180
ctctgaactg atttaaagag gcttcaaagc cttgctgtac ttgaaaacag gctgtgaggc 240
ctgttttttt attaatcc 258
<210> 12
<211> 1042
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 12
gatcctgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat acagccattg aacatacggt 60
tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg gccaaggacg ctgccgccgg 120
ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt ttacttattt ttttgccaaa 180
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agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtaccc tcgagaaaag gaggaaaaaa 300
aatgtttatg aaatctactg gtattgtacg tatggtgagc aagggcgagg aggataacat 360
ggccatcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca 420
cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa 480
gctgaaggtg accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg gacatcctgt cccctcagtt 540
catgtacggc tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac atccccgact acttgaagct 600
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gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggcgaattc atctacaagg tgaagctgcg 720
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catggacgag ctgtacaagt aa 1042
<210> 13
<211> 3858
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 13
gatcctgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat acagccattg aacatacggt 60
tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg gccaaggacg ctgccgccgg 120
ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt ttacttattt ttttgccaaa 180
gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt tagaaatggg cgtgaaaaaa 240
agcgcgcgat tatgtaaaat ataagtaccg agctcaaagg aggttttttt tatgagctca 300
cctcttattc cggttatatt aagtggtggt aatggtacta ggttatggcc actatctaga 360
gaggaatatc ctaagcagtt tttaaaacta accgactcaa tatcaatgct gcaatcaaca 420
atatctcggt tagactcatt aaatacttcc tctccagttg taatatgcaa tgaattacac 480
agatttattg ttgcagaaca actcaggcac ttaaataaat tagataataa tattatttta 540
gaaccatctg gtcgcaatac tgcacctgct atttgtattg ctgctttaat tttaaaaatg 600
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gtcaaaactt tttgtaatac aataaaaagt gctattccct tcgctgaagc tggtaatttg 720
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tttatgtcaa aagtcgctct catcaccggt gtaaccggac aagacggttc ttacctggca 1800
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cagccgatgg cagaaagcga gttgttgcag ggcacgctgg agccgactaa cgagccttat 3300
gctattgcca aaatcgccgg gatcaaactg tgcgaatcat acaaccgcca gtacggacgc 3360
gattaccgct cagtcatgcc gaccaacctg tacgggccac acgacaactt ccacccgagt 3420
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ccggacgtgg tggtatgggg cagcggtaca ccgatgcgcg aatttctgca cgtcgatgat 3540
atggcggcgg cgagcattca tgtcatggag ctggcgcatg aagtctggct ggagaacacc 3600
cagccgatgt tgtcgcacat taacgtcggc acgggcgttg actgcactat ccgcgagctg 3660
gcgcaaacca tcgccaaagt ggtgggttac aaaggccggg tggtttttga tgccagcaaa 3720
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gaccgctttc gggggtaa 3858
<210> 14
<211> 2524
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 14
ttattaacgt tgatattaac acgggtagtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtagtg atagcggtac caaaggaggt gggatccatg gcatttaagg ttgttcagat 120
ttgcgggggg ttagggaatc agatgtttca atatgcgttt gcgaaaagcc tgcaaaaaca 180
ctcaaatacg ccggttctgc tggatattac gtcgtttgat tggtcagata gaaaaatgca 240
actggaactg tttccgatcg atctgccata tgcaagcgaa aaagaaattg caatcgcaaa 300
aatgcaacat ctgcctaaac tggtgagaga tgcgctgaaa tgcatgggat tcgaccgcgt 360
ttcaaaagaa attgtttttg aatacgagcc ggaactgctg aaaccgtcaa gactgacata 420
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ggaatatatg gcaaaaagag ttccgaatat ggaactgttt gttttttgcg aagatctgac 720
atttacacaa aatctggatc tgggctatcc gtttatggat atgacaacaa gagataaaga 780
agaagaagca tattgggata tgctgctgat gcaatcatgc caacatggca ttattgcaaa 840
ttcaacatat tcatggtggg cagcatatct gattaataat ccggaaaaaa ttattattgg 900
cccgaaacat tggctgtttg gccatgaaaa tattctgtgc aaagaatggg ttaaaattga 960
atcacatttt gaagttaaat cacaaaaata taatgcataa ctgcaggtcg acgtccccgg 1020
ggcagcccgc ctaatgagcg ggcttttttc acgtcacgcg tcttattaac gttgatatta 1080
acacgggtag tgttgacata cctctggcgg tgataataca ataaatgtag tgatagcggt 1140
accaaaggag gtgggatcca tgctaacttg ctttaaagct tatgatattc gcgggaaact 1200
aggcgaagaa ctgaatgaag atatcgcctg gcgcattggg cgtgcctatg gcgaatttct 1260
caaaccgaaa accattgtgt taggcggtga tgtccgcctc accagcgaaa ccttaaaact 1320
ggcgctggcg aaaggtttac aggatgcggg cgtcgatgtg ctggatatcg gtatgtccgg 1380
caccgaagag atctatttcg ccacgttcca tctcggcgtg gatggcggca ttgaagttac 1440
cgccagccat aatccgatgg attataacgg catgaaactc gtgcgcgagg gggctcgccc 1500
gatcagcggg gataccggac tgcgcgatgt ccagcgtctg gcagaagcca acgacttccc 1560
tcccgttgat gaaaccaaac gcggtcgtta tcagcaaatc aatctgcgtg acgcttacgt 1620
tgatcacctg ttcggttata tcaacgtcaa aaacctcacg ccgctcaagc tggtgattaa 1680
ctccgggaat ggcgcggcgg ggccggtggt ggacgccatt gaagcccgct ttaaagccct 1740
cggcgcaccg gtggaattaa tcaaagtaca caacacgccg gacggcaatt tccccaacgg 1800
tattcctaac ccgttgctgc cggaatgccg cgacgacacc cgtaatgcgg tcatcaaaca 1860
cggcgcggat atgggcattg cctttgatgg cgattttgac cgctgtttcc tgtttgacga 1920
aaaagggcag tttatcgagg gctactacat tgtcggcctg ctggcagaag cattcctcga 1980
aaaaaatccc ggcgcgaaga tcatccacga tccgcgtctc tcctggaaca ccgttgatgt 2040
ggtgaccgcc gcgggcggca ctccggtgat gtcgaaaacc ggacacgcct ttattaaaga 2100
acgtatgcgc aaggaagacg ccatctacgg tggcgaaatg agcgcccacc actatttccg 2160
tgatttcgct tactgcgaca gcggcatgat cccgtggctg ctggtcgccg aactggtgtg 2220
tctgaaagga aaaacgctgg gcgaactggt gcgcgaccgg atggcggcgt ttccggcaag 2280
cggtgagatc aacagcaaac tggcgcaccc cgttgaggcg attaatcgcg tcgaacagca 2340
ttttagccgc gaggcgctgg cggtggatcg caccgatggc atcagcatga cctttgccga 2400
ctggcgcttt aacctgcgct cctccaacac cgaaccggtg gtgcggttga atgtggaatc 2460
gcgcggtgat gtaccgctga tggaagaaaa gacaaaactt atccttgagt tactgaacaa 2520
gtaa 2524
<210> 15
<211> 288
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 15
ttattaacgt tgatattggc ggcgtgctcg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtagag gtagagacgc gaggtctaag aactttaaat aatttctact gttgtagatc 120
agtggtagga gttggaagaa gaaggtaatt tctactgttg tagatcatgt gtaggtgtac 180
cgggtacaaa tttctactgt tgtagatcgt ctctgaactg atttaaagag gcttcaaagc 240
cttgctgtac ttgaaaacag gctgtgaggc ctgttttttt attaatcc 288
<210> 16
<211> 1204
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 16
ttattaacgt tgatattaac acgggtagtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60
aaatgtgtac cgagctcgtc cgtcaaaagg aggtttcttt tatgatggaa aagactttta 120
tcatggtgaa accagacggt gtccaacgtc agctcattgg ggacatttta tctagattcg 180
aacgtaaggg cttacaatta gctggcgcca agttaatgag agtgactgaa caaatggctg 240
agaaacacta cgccgaacat caaggtaagc ctttcttcgg agagctcgtt gagtttatta 300
cttcaggacc tgtattcgca atggtgtggg aaggcgaaaa tgtcattgaa gtgacgagac 360
agctgatcgg gaaaacaaac cctaaagaag ctttacctgg tacgattcgt ggggattatg 420
gcatgtttgt cggaaaaaac atcatccacg gctctgattc tctcgaaagt gcagaacgcg 480
agattaacat tttctttaag aatgaagaat tagtatcata tcagcagctt atggcaggct 540
ggatctatta atgatgaaag cttggcgtaa tcaaaaggag gtttttttta tgaaagaaag 600
agggttatta atcgttctct caggtccctc aggagttggt aaaggaacgg ttcgacaagc 660
gatcttttcg caggaagaca caaaatttga atattcgatt tcagtaacca caagaagtcc 720
aagagagggc gaagtgaacg gagtcgatta ttttttcaaa acaagagacg aattcgagca 780
aatgattgcg gacaacaagc tgcttgaatg ggcagagtat gtcggcaatt attacggcac 840
gccagtcgat tatgttgaac agacgcttca agatggaaaa gacgtctttt tagaaattga 900
agttcaaggg gctcttcaag tgagaaatgc tttcccggaa ggcctgttta ttttccttgc 960
gcctccaagc ctttctgaac tgaaaaacag aatcgtgaca cgaggaacag aaacagacgc 1020
tctgattgaa aatcgaatga aagccgcaaa agctgagatc gaaatgatgg atgcttatga 1080
ctatgtcgtt gaaaacgata atgtcgaaac ggcttgcgat aaaatcaaag caatcgttct 1140
tgctgaacat ttgaagcgtg aacgcgttgc accaagatat aagaaaatgc tggaggttga 1200
ataa 1204

Claims (16)

1.一种温敏型启动子，其特征在于，所述启动子为Pveg5、Pveg30、Pveg32、veg34或Pveg37；所述Pveg5的序列如SEQ ID NO.2所示、Pveg30的序列如SEQ ID NO.3所示、Pveg32的序列如SEQ IDNO.4所示、Pveg34的序列如SEQ ID NO.5所示、Pveg37的序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种单输入多输出基因回路，其特征在于，所述单输入多输出基因回路包含至少2个权利要求1所述的温敏型启动子，将不同激活温度的温敏型启动子分别与至少2个模块蛋白编码基因连接，实现至少2个模块蛋白的顺序表达。
3.一种双向基因回路，其特征在于，所述双向基因回路包含至少1个权利要求1所述的温敏型启动子、dCPf1和crRNA，实现基因的上调和下调；所述dCPf1连接温敏型启动子，crRNA连接组成型启动子，或dCPf1连接组成型启动子，crRNA连接温敏型启动子。
4.一种高版本单输入多输出基因回路，其特征在于，所述高版本单输入多输出基因回路同时包含权利要求2所述的单输入多输出基因回路和权利要求3所述的双向基因回路。
5.含权利要求1所述温敏型启动子的细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞，所述细胞还表达由组成型启动子连接的转录因子CI857。
7.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用权利要求1所述的温敏型启动子控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用权利要求1所述的温敏型启动子控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用权利要求1所述的温敏型启动子在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。
8.根据权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用温敏型启动子Pveg34控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用温敏型启动子Pveg37控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用温敏型启动子Pveg34在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。
9.根据权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，利用组成型启动子或温敏型启动子表达所述dCpf1。
10.根据权利要求9所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述温敏型启动子选自Pveg5或Pveg37。
11.一种重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用权利要求1所述的温敏型启动子控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用权利要求1所述的温敏型启动子控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用权利要求1所述的温敏型启动子在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。
12.权利要求1所述的温敏型启动子、权利要求2-4任一项所述的基因回路或权利要求7-10任一项所述的重组枯草芽孢杆菌在合成化合物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用为在发酵合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，发酵培养分三个时间段进行，时间段分别为0-12h、12-18h、18-60h；发酵培养的温度为30-37℃，搅拌速率200-900rpm。
15.根据权利要求13或14所述的应用，其特征在于，发酵的培养基包括5-60g/L碳源，2-12g/L氮源，2-15g/L三水磷酸氢二钾，2-15g/L磷酸二氢钾。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述碳源包括乳糖与其他碳源，所述其他碳源选自蔗糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种；所述氮源选自蛋白胨、酵母粉和硫酸铵中的一种或多种。
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