CN101984063A - 一种大肠杆菌胞内表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌胞内表达载体及其应用，属于基因工程领域。所述表达载体包含以下元件：(1)p15A复制子，(2)卡那霉素抗性标记基因，(3)两个多克隆位点MCS1和MCS2(4)温敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857，(5)λ噬菌体PL、PR双启动子。应用该质粒表达修饰后色氨酸合成代谢中的关键酶基因aroF^Fbr和trp操纵子trpE^FbrDCBA生产色氨酸，发酵液中色氨酸的浓度最高可积累至11g/L，与野生菌相比，产量提高了50倍。载体pSV-T在色氨酸及其它重要代谢产物的基因工程菌构建中具有广泛的应用前景。

Description

一种大肠杆菌胞内表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌胞内表达的表达载体，属于基因工程领域。本发明还涉及该新型表达载体在色氨酸生产中的应用，属于发酵工程领域。

背景技术

近年来，随着氨基酸等重要代谢产物的市场需求迅猛增长，促进这些重要代谢产物积累的胞内表达载体受到了越来越多的重视，并成功地表达了多种重要代谢产物的关键酶基因。大肠杆菌胞内表达的原理是：将目标终端产物代谢途径中的一个或几个关键酶基因，插入至胞内表达载体的启动子序列之后，由于表达产物是终端代谢产物的重要前体物，从而促进终端代谢产物的积累。此外，由于胞内表达酶在胞内已经空间折叠成具有天然构象的活性蛋白，因此无需考虑酶的跨膜运输过程，表达稳定高效。

为了促进代谢终端产物的积累，就需要选择合适的胞内表达载体，表达终端产物的一个或几个关键前体物基因。虽然已经有了许多胞内表达载体可供选择，但是这些载体大多或多或少地具有如下特点：(1)多拷贝数，强启动子；这就造成外源基因表达量过高，在胞内形成大量包涵体，从而抑制了细胞本身的活力。同时相应关键酶的过量表达使得终端产物的合成代谢通道在关键酶所在位置形成拥堵，影响菌株本身活力的同时，终端产物的积累也受到了影响。(2)IPTG诱导；在工业化应用中一方面由于IPTG本身价格昂贵，使得终端产物生产成本大幅增加；另一方面，IPTG在后续的产品提取中很难完全去除，因此很难在食品和医药类产品的生产过程中使用，这就大大限制了载体的应用范围。(3)单启动子表达；菌体内某一重要代谢产物的积累，往往是其合成途径中多个关键基因共同表达的结果，而单个启动子在表达多个基因时，基因的表达量会受到影响。

Zhou，H.Y.，et al.公布了一种载体(Enhanced 1-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA(fbr)and aroF(wt).Bioresour Technol.2010，101(11)：4151-6.)，其携带有野生型aroF基因(aroFwt)和pheAFbr，用于生产L-苯丙氨酸，3L发酵后，携带有此载体的菌株L-苯丙氨酸产量仅提高2.81倍，表达效率还是有待提高。

本发明构建了一种通用性好的新型胞内表达载体，引入修饰的外源基因aroF^Fbr及抗色氨酸反馈调控的trp操纵子基因(trpE^FbrDCBA)，应用于色氨酸生产，表达产量提高达50倍。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌胞内表达载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述表达载体的物理图谱如图1所示。

所述表达载体复制子，抗性标记基因，阻遏蛋白基因及双启动子。

所述抗性标记基因为卡那霉素抗性基因。

所述复制子为p15A。

所述两个多克隆位点为MCS1和MCS2。

所述阻遏蛋白基因为λcItS857。

所述双启动子为λ噬菌体PL、PR双启动子。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述表达载体的应用。

为解决上述技术问题，采用的技术方案为：

使用上述表达载体，构建衍生表达载体pSV03，用于色氨酸生产。

所述色氨酸生产包括如下步骤：将质粒pSV03转化至大肠杆菌W3110的衍生菌JW3686(E.coli Genetic Stock Center，Yale University)。挑选卡那霉素抗性单克隆菌落，选用通用的LB培养基35～37℃培养，当OD值达到3以上时，按照5～10％的接种量，转接至装液量为1.2～1.5L的3L发酵罐中，30～33℃培养至对数生长前期，升温至37～39度开始诱导产色氨酸；发酵一般是24～48h，更佳地为30～36h，pH值控制在6.8～7.2。

所述表达载体pSV03的物理图谱如附图2所示。

所述表达载体pSV03含有修饰的外源基因aroF、抗色氨酸反馈调控的trp操纵子基因(trpE^FbrDCBA)。

所述修饰的基因aroF通过定点突变技术，缺失突变了由aroF编码的DAHP合成酶氨基酸序列中的第十一个氨基酸Lie，从而获得了抗色氨酸反馈调节的aroF^Fbr基因。

可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞，最佳的为大肠杆菌。

对于用于代谢工程的胞内表达载体而言，通常启动子序列、复制子序列等元件的选择至关重要。本发明的发明人经过多年研究，选择了λ噬菌体的温控型PL、PR双启动子和拷贝数为15的p15A复制子。在此基础上，构建了本大肠杆菌胞内表达载体pSV-T。以λ噬菌体转录启动子PL、PR构建的载体已经为大家所熟悉。这两个强启动子受控于λ噬菌体cl基因产物。cl基因的温度敏感突变体λcItS857，常常被用于调控PL、PR启动子的转录，30℃时阻遏启动子转录，42℃时解除抑制开始转录。

本发明提供的表达载体可以控制外源基因的表达，应用该质粒表达色氨酸合成代谢中的关键酶基因aroF^Fbr和trp操纵子trpE^FbrDCBA生产色氨酸，发酵液中色氨酸的浓度最高可积累至11g/L，产量提高达50倍，在工业上有几大的应用前景。

附图说明

图1表达载体pSV-T的物理图谱

图2表达载体pSV03的物理图谱

图3表达载体pSV03构建方法

图4表达载体pSV03的酶切鉴定

1：Markeλ-EcoT 14 I digest；2：Marker DL2000；3，4：BamHI和bglII双酶后的DNA片段

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

实施例1温敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857核酸序列，λ噬菌体PL启动子核酸序列、多克隆位点MCS1核酸序列的克隆

提供温敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857，λ噬菌体PR启动子序列是载体pDN707(C.A.Love et al.，1996，Stable high-copy number λpromoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli，gene，176，49-53)。而多克隆位点MCS1核酸序列为人工合成，且在引物设计中引入多克隆位点MCS1。设计引物PCR扩增得到pDN707载体上2631至3737的核苷酸序列A1。所用的上游引物为：

P1：5’-CTGCAGGTGATGATTATCAGCCAGCAG-3’(下划线Pst1酶切位点)。

下游引物为：

P2：5’-CAGCTGAGTACTCATATGGATATCAGATCTTTAGCTGTCTTGGTTTGCCCAAAGC-3’(下划线为MCS1核酸序列，包含的酶切位点有PvuII、ScaI、NdeI、EcoRV、BglII)

PCR产物经胶回收、PstI/PvuII双酶切后，低融点胶回收备用。

实施例2PL启动子核酸序列和多克隆位点MCS2核酸序列的的克隆

提供PR启动子核酸序列是载体仍然是pDN707(C.A.Love et al.，1996，Stable high-copy numberλpromoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli，gene，176，49-53)。而多克隆位点MCS2核酸序列为人工合成，且在引物设计中引入多克隆位点MCS2。设计引物PCR扩增得到pDN707载体上3738至3984的核苷酸序列A2。所用的上游引物为：

P3：5’-AGATCTGATATCCATATGAGTACTCAGCTGTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTG-3’(下划线为MCS1核酸序列)

下游引物为：

P4：5’-GGATCCTCTAGAGTTAACGAGCTCCCATGGCAATGCTTCGTTTCGTATCAC-3’(下划线为MCS2核酸序列，包含的酶切位点有BamHI、XbaI、HpaI SacI、NcoI)

PCR产物经胶回收、BglII/NcoI双酶切后，低融点胶回收备用。

实施例3温敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857核酸序列和λ噬菌体PR启动子、多克隆位点MCS1、λ噬菌体PL启动子、多克隆位点MCS2核酸序列的克隆

以实例1和实例2所得到的PCR片段A1，A2为模板，通过重叠PCR技术，利用引物P1和P4，PCR扩增得到含有温敏型λ阻遏蛋白基因λcItS857核酸序列和λ噬菌体PR启动子、多克隆位点MCS1、λ噬菌体PL启动子、多克隆位点MCS2核酸序列的核酸片段A3

PCR产物经胶回收、PstI/BamHI双酶切后，低融点胶回收备用。

实施例4表达载体pSV-T的构建

p15A复制子核酸序列，卡那霉素抗性基因序列来自于载体pACYC17(Chang AC，Cohen SN.，1978，Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the p15A cryptic miniplasmid，J.Bacteriol.，134(3)，1141-1156；)。用PstI/BamHI双酶切载体pACYC17，然后分离出3026bp的DNA片段B1，低熔点胶回收备用；将实例3中得到的DNA片段A3与DNA片段A2混合在一起，用连接酶连接过夜，经测序验证连接正确和核苷酸序列正确，从而构建成载体pSV-T。载体pSV-T的物理图谱如附图1所示，其酶切图谱如图4所示。

实例5表达载体pSV03.的构建

克隆表达E.coli来源的抗aroF^Fbr和色氨酸操纵子trpE^FbrDCBA

1.抗反馈调节作用基因aroF^Fbr的获得

基因aroF和trpEDCBA均是E.coli色氨酸合成途径中的关键酶基因，其中由aroF和trpED分别编码的DAHP合成酶和邻氨基苯甲酸合成酶均受到终端产物色氨酸的反馈抑制作用。因此本实例中首先涉及aroF和trpED抗反馈调节突变基因aroF^Fbr和trpE^FbrD的获得。

aroF基因由实验室保藏的质粒pMD18-T/aroF提供，以载体pMD18-T/aroF为模板，由PCR反应得到突变后，由aroF编码的DAHP合成酶氨基酸序列缺失了第十一个氨基酸Lie，从而获得了抗色氨酸反馈调节的pMD18-T/aroF^Fbr序列。定点突变所用的上游引物为：

P3：5’-GCTGAATAACGTACATACCGACGAACAGG-3’

下游引物为：

P4：5’-CCTGTTCGTCGGTATGTACGTTATTCAGC-3’。

2.质粒pSV03.的构建

TrpE^FbrDCBA基因由实验室保藏质粒pMD18-T/TrpE^FbrDCBA提供。分别酶切质粒pMD18-T/aroF^Fbr和pMD18-T/TrpE^FbrDCBA，将获得的aroF^Fbr和TrpE^FbrDCBA基因序列分别克隆入质粒pSV-T的BglII/ScaI和BamHI/Ncol位点，形成质粒pSV03。

实施例6发酵生产色氨酸

1.工程菌的构建

将表达载体pSV03电转E.coli模式菌BW25113的衍生菌JW3686(E.coli Genetic Stock Center，Yale University)，涂布于含有50μg/ml 卡那霉素的平板，挑选阳性菌种，进行PCR鉴定，建立产色氨酸的基因工程菌JW3686/pSV-T3。

2.种子培养

将基因工程菌JW3686/pSV-T3，接入含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，50ml培养基放入250ml的培养瓶中，37℃，转速为200rpm，培养时间为10～12小时，培养后OD600吸光值在4～5之间。

3.发酵罐培养：

发酵培养基组份浓度：0.3％(W/V)MgSO₄·7H₂O，0.0015％(W/V)CaCl₂·H₂O，0.3％(W/V)KH₂PO₄，0.1％(W/V)NaCl，0.5％(W/V)，(NH₄)₂SO₄，0.0075％(W/V)FeSO₄·7H₂O，0.01％(W/V，Na-Citrate，0.4％(W/V)Tryptone，0.2％(W/V)Yeast Extract，1.5％(W/V)glucose。

1.5ml/L微量元素液：

0.2％(W/V)Al₂(SO₄)₃·18H₂O，0.075％(W/V)

CoSO₄·7H₂O，0.25％(W/V)CuSO₄·5H₂O，0.05％(W/V)

H₃BO₃，2.4％(W/V)MnSO₄·H₂O，0.3％(W/V)

Na₂MoO₄·2H₂O，0.25％(W/V)NiSO₄·6H₂O，1.5％(W/V)

ZnSO₄·7H₂O。

发酵过程补料：

葡萄糖500～600g/L

上述培养基在发酵罐中高压灭菌，用前无菌加入卡那霉素终浓度为50μg/ml。

发酵参数为：发酵前期培养温度为30℃，菌体对数生长中期时开始升温诱导，温度控制在38℃；pH值使用氨水控制在7.0；通气量为每升培养基1L/min；溶解氧控制在20％以上；搅拌速率与溶氧偶联。

发酵时以5％的比例在发酵罐中加入种子培养基，发酵3～4h，葡萄糖基本耗尽时，开始流加葡萄糖，保持发酵培养基中葡萄糖的浓度在0.5～2g/L。

发酵48h时，停止发酵，取菌液离心，取上清液测定色氨酸的产量，发现发酵液中最高可积累色氨酸11g/L。与不添加质粒pSV03的菌株JW3686发酵情况相比，色氨酸产量提高10倍以上。可见载体pSV-T在代谢工程中的应用具有广泛的前景。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌胞内表达载体，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的表达载体，其特征在于含有：复制子，抗性标记基因，两个多克隆位点，阻遏蛋白基因及双启动于。

3.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述抗性标记基因为卡那霉素抗性基因。

4.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述复制子为p15A。

5.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述两个多克隆位点分别为CAGCTGAGTACTCATATGGATATCAGATCT和GGATCCTCTAGAGTTAACGAGCTCCCATGG。

6.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述阻遏蛋白基因为λcItS857。

7.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于所述双启动子λ噬菌体PL、PR双启动子。

8.如权利要求1所述表达载体的应用，其特征在于构建衍生表达载体pSV03，用于色氨酸生产。

9.如权利要求8所述表达载体的应用，其特征在于所述表达载体pSV03含有修饰的外源基因aroF、抗色氨酸反馈调控的trp操纵子基因(trpE^FbrDCBA)；所述trpE^FbrDCBA核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

10.如权利要求9所述表达载体的应用，其特征在于所述基因aroF通过定点突变技术，缺失突变了由aroF编码的DAHP合成酶氨基酸序列中的第十一个氨基酸Lie，从而获得了抗色氨酸反馈调节的aroF^Fbr基因，序列如SEQ ID NO：3所示。

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