CN110402253B - 用于生产多特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于生产多特异性抗体的方法，其包括步骤：提供表达所述抗体的哺乳动物细胞，用包含编码具有结构域交换的抗体多肽的表达盒的表达载体转染所述哺乳动物细胞，培养转染的细胞以及从细胞或培养基回收抗体，由此产生多特异性抗体。

Description

用于生产多特异性抗体的方法
发明领域
本发明涉及多特异性抗体的生产，尤其涉及在其一条链中包含结构域交换(crossover)的多特异性抗体。在本文报道的方法中，通过在已经转染或转导的细胞中引入用于结构域交换链的另外表达盒，提高分泌多特异性抗体的重组哺乳动物细胞的表达产量。
背景技术
US 5,958,727描述了一种生产多肽的方法，包括在有利于产生多肽的条件下培养突变细胞，其中突变细胞通过在如下的基因座将核酸构建体引入亲本细胞的基因组中而与亲本细胞相关，所述亲本细胞包含编码所述多肽的第一DNA序列，其中所述的基因座不在第一DNA序列内，不在编码负向调节所述多肽的转录、翻译或分泌的蛋白质的第二DNA序列内，且不在编码在这些条件下水解所述多肽的蛋白酶的第三DNA序列内；将两种细胞在这些条件下培养时，突变细胞比亲本细胞产生更多的多肽；收集所述多肽。
Genzel，Y.等描述了用丙酮酸取代谷氨酰胺降低氨形成和哺乳动物细胞的生长抑制(Biotechnol.Prog.21(2005)58-69)。De la cruz Edmonds，M.C.等报道了CHOK1 SV细胞系统的转染和高生产者筛选方案的研发(Mol.Biotechnol.34(2006)179-190)。在WO 2007/036291中，报道了改良的细胞培养基。在EP 1 482 031中，报道了无血清哺乳动物细胞培养基及其用途。Link，T.等描述了在无蛋白培养基中生产由CHO-K1细胞表达的重组MUC1融合蛋白的生物工艺研发(J.Biotechnol.110(2004)51-62)。EP 0 481 791描述了用于CHO细胞和适应细胞的培养基。US 2007/161079描述了具有增加的稳定性的重组细胞克隆及其制备和使用方法。EP 0 659 880描述了用于培养动物细胞或抗体产生细胞的方法。Butler，M.等描述了哺乳动物细胞对非产氨(non-ammoniagenic)培养基的适应化(Cytotechnol.15(1994)87-94)。Altamirano，C.等描述了CHO细胞培养基配方的改良：同时取代葡萄糖和谷氨酰胺(Biotechnol.PROG.16(2000)69-75)。
EP 0 569 678描述了MHC基因的双转染子作为细胞疫苗用于免疫预防肿瘤转移。WO 97/08342描述了一种使用报告基因测量哺乳动物细胞中启动子序列活性的改进方法。WO 2005/113770中描述了使用抗RhoA和抗RhoC siRNA以特异性地抑制RhoA或RhoC合成。US7,202,072中描述了在酵母细胞中重组产生或表达真核碱性磷酸酶突变体的方法。WO2001/038557报道了使用双顺反子表达荧光蛋白来筛选多重转化的细胞的方法。WO 1999/47647中描述了用于产生表达多种目的蛋白或RNA的重组真核细胞系的方法。WO 2003/076588中描述了使用编码的载体用转染材料转染细胞的系统，包括方法、组合物和试剂盒。US 5,089,397描述了用于重组产生所需蛋白质的表达系统，包括用DNA序列转化CHO细胞，所述DNA序列具有在人金属硫蛋白-II启动子控制下的所需蛋白质编码序列。US 2003/0040047中描述了用于产生重组蛋白的方法。Lamango等(Lamango，N.S.等，Arch.Biochem.Biophys.330(1996)238-250)描述了激素原转化酶2的产生对神经内分泌多肽7B2的存在的依赖性。Waldenstroem，M.等，Gene 120(1992)175-181描述了将基于BPV-1的表达载体转染至具有未整合的复制性BPV-1基因组的细胞中。US 4,912,038描述了用于获得犬和人32K肺泡表面活性剂蛋白的方法和载体。
WO 89/10959描述了重组DNA技术和哺乳动物多肽在基因工程化真核细胞中的表达。DD 287531描述了用于人生长激素的表达载体和用于选择标记基因的表达载体的重复共转移。WO 93/01296描述了在痘苗病毒感染细胞中生产抗体。WO 95/17513描述了丝状真菌的再转化。WO 89/00999描述了抗体基因的模块组装，由此制备的抗体和用途。US 2003/096341描述了碱性磷酸酶在酵母中的表达。
EP 1 453 966描述了用于生产重组多肽的方法。WO 03/046187描述了用于生产重组多肽的方法。US 5,550,036描述了用于在人细胞中共扩增人蛋白C基因的方法。EP 0 921194描述了TNF配体家族基因。EP 0 319 206描述了基因扩增。Li，F.K等描述了人促红细胞生成素基因的克隆和表达(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)7580-7584)。WO 00/28066描述了表达重组人促红细胞生成素的宿主细胞。Chen，S.等描述了在哺乳动物细胞中生产重组蛋白(Curr.Prot.Prot.Sci.(1998)5.10.1-5.10.41)。
WO 89/00605描述了含有在相反方向上定向的基因的载体的转染细胞及其获取方法。US 5,420,019描述了稳定的杀菌/渗透性增强蛋白质产品和含有它们的药物组合物。US5,639,275描述了生物相容性免疫隔离(immunoisolatory)胶囊，其含有用于递送生物活性分子的遗传上改变的细胞。Kemball-Cook，G.等描述了使用新的哺乳动物表达载体高水平地生产人凝血因子VII和XI(Gene 139(1994)275-279)。EP 1 010 758描述了用于生产重组人促红细胞生成素的表达系统，用于纯化分泌的人促红细胞生成素的方法及其用途。
Mulligan，R.C.和Berg P.描述了表达编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌基因的动物细胞的选择(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981)2072-2076)。Colosimo，A.等描述了外源基因在哺乳动物细胞中的转移和表达(BioTechniques 29(2000)314-331)。Maruyama，K.等描述了通过哺乳动物表达载体转染培养的哺乳动物细胞(Meth.Nucleic Acids Res.(1991)283-305)。Wang，D.Z.等描述了用静脉内tPA治疗急性中风患者(Stroke 31(2000)77-81)。Sakamoto，T.等描述了用活化蛋白C溶栓后预防动脉再闭塞(Circulation 90(1994)427-432)。Lee，G.M.等描述了使用统计学设计来研发用于在重组中国仓鼠卵巢细胞的悬浮培养中生产促红细胞生成素的无血清培养基(J.Biotechnol.69(1999)85-93)。Lusky，M.和Botchan，M.R.描述了牛乳头瘤病毒载体维持序列的表征(Cell36(1984)391-401)。
US 2014/0242079描述了用于在HEK细胞中瞬时表达的1:2:1:1的单表达盒载体的载体比例。
WO 2015/052230公开了多特异性结构域交换的共同可变轻链抗体。
WO 2012/023053公开了用于产生多特异性和多价抗体的方法。
WO 2005/072112公开了用于产生和鉴定多特异性抗体的方法。
WO 02/079255公开了与GnTIII共表达的重组抗体。
US 2002/06210公开了用于制备具有杂多聚的和共同的组分的多特异性抗体的方法。
US 2013/045888公开了用于在转化的微生物(如毕赤酵母)中高滴定度和高纯度地生产多亚基蛋白(如抗体)的多拷贝策略。
Frenzel等在Front.Immunol.4(2013)Article 217中报道了重组抗体的表达。
Wurm等报道了在培养的哺乳动物细胞中生产重组蛋白治疗剂(Nat.Biotechnol.22(2004)1393-1398)。
发明概述
已经发现，为了产生用于生产异二聚体(即多特异性)抗体的细胞系，有利的是使用如下表达载体用于转染，所述表达载体包含轻链表达盒作为唯一的抗体链表达盒。该载体可以在共转染中或者分开在第二个后续转染步骤中与其他表达载体组合使用。利用这种方法，可以获得生产细胞系，其产生具有改进的产物特征(即，具有增加的产物和减少的产物相关杂质)的异二聚体抗体。
本文公开的一个方面是一种用于产生多特异性抗体的方法，所述抗体包含至少三个不同的多肽/由至少三个不同的多肽组成/含有至少三个不同的多肽，所述方法包括以下步骤：
-在培养基中培养哺乳动物细胞(在适于多特异性抗体表达的条件下)，其中所述哺乳动物细胞通过以下方法产生
a)用第一表达载体和一个、两个或三个其他表达载体转染哺乳动物细胞(不表达抗体)，
其中所述第一表达载体包含确切地一个编码多特异性抗体的多肽的核酸序列，并且所述一个、两个或三个其他表达载体包含分别编码多特异性抗体的不同多肽链的至少两个核酸序列，
其中所述第一表达载体的确切地一个核酸序列是编码多特异性抗体的轻链多肽的核酸序列，
其中所述第一表达载体的转染在所述一个、两个或三个其他表达载体的转染的同时、之前或之后进行，
b)选择在选择培养条件下生长的步骤a)中(稳定)转染的细胞，
-从细胞或培养基收集多特异性抗体，
和由此产生多特异性抗体。
本文中公开的一个方面是一种用于产生/生产/获得(能够(稳定地))表达多特异性抗体的哺乳动物细胞的方法，所述抗体包含至少三个不同的多肽/由至少三个不同的多肽组成，所述方法包括以下步骤：
a)用第一表达载体和一个、两个或三个其他表达载体转染哺乳动物细胞(不表达抗体)，
其中所述第一表达载体包含确切地一个编码多特异性抗体的多肽的核酸序列，并且所述一个、两个或三个其他表达载体包含分别编码多特异性抗体的不同多肽链的至少两个核酸序列，
其中所述第一表达载体的确切地一个核酸序列是编码多特异性抗体的轻链多肽的核酸序列，
其中所述第一表达载体的转染在所述一个、两个或三个其他表达载体的转染的同时、之前或之后进行，
b)选择在选择培养条件下生长的步骤a)中转染的细胞，
和由此产生/生产/获得(稳定)表达多特异性抗体的哺乳动物细胞。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体的多肽中的两个包含/具有(关联(cognate))结构域交换。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，所述第一表达载体的确切地一个核酸编码具有多特异性抗体的结构域交换的轻链多肽。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，步骤a)包括：用第一表达载体和一个、两个或三个其他表达载体共同转染哺乳动物细胞(不表达抗体)。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，步骤a)包括以下步骤：i)用一个、两个或三个其他表达载体(同时或按序)转染哺乳动物细胞，任选ii)选择(稳定)转染的细胞，iii)用第一表达载体转染i)或ii)的细胞，和任选iv)选择(稳定)转染的细胞。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，所述选择是基于表达产率和/或产物相关副产物/杂质的量进行的。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，选择产生最少量(分数)的产物相关副产物/杂质的(稳定)转染的细胞。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，选择产生最少量(分数)的产物相关副产物/杂质并具有最高产率的(稳定)转染的细胞。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞稳定地表达多特异性抗体。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，结构域交换是CH1-CL交换或VH-VL交换。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是三价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，
b)与第一轻链配对时特异性地结合第一抗原的全长抗体的第二重链，和
c)Fab片段，其特异性地结合第二抗原，并通过肽衔接物与a)或b)的重链之一的C-末端融合，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
本文公开的一个方面是用本文记载的方法获得的(稳定转染的)哺乳动物细胞。
本文公开的一个方面是一种用于生产多特异性抗体的方法，其包括以下步骤：
-(在适于多特异性抗体表达的条件下)在培养基中培养本文公开的(稳定转染的)细胞，
-从细胞或培养基回收多特异性抗体，
-任选用一个或多个色谱步骤纯化回收的抗体，
和由此产生多特异性抗体。
本文公开的一个方面是一种用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物的方法，其包括以下步骤：
-用本文公开的方法获得/生产/产生(稳定转染的)(稳定)表达多特异性抗体的哺乳动物细胞，
-在培养基中培养获得的/生产的/产生的哺乳动物细胞，
-从细胞或培养基回收抗体制备物，
-任选用一个或多个色谱步骤纯化回收的抗体，
和由此产生具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物。
本文公开的一个方面是本文记载的方法用于降低多特异性抗体制备物中的产物相关杂质的用途。
本文记载了一种用于在重组哺乳动物细胞中生产多特异性抗体的方法，所述抗体包含至少一条具有结构域交换的链。该方法形成了一种改进的方法，其中改进特别在于产物相关副产物的减少和正确折叠/正确装配的多特异性抗体的量的增加。
本文公开的一个方面是一种用于生产多特异性抗体(包含至少一条具有结构域交换的多肽链)的方法，其包括以下步骤：
a)提供(稳定转染)的(稳定)表达多特异性抗体的哺乳动物细胞，
b)用编码具有结构域交换的多特异性抗体的多肽链的表达盒转染步骤a)的哺乳动物细胞，
c)培养步骤b)的细胞并从细胞或培养基回收抗体，并由此产生多特异性抗体，
d)任选用一个或多个色谱步骤纯化回收的抗体。
在所有方面的一个实施方案中，表达多特异性抗体的哺乳动物细胞稳定地表达多特异性抗体。
在一个实施方案中，步骤b)的表达盒是在表达载体中。
在所有方面的一个实施方案中，具有结构域交换的多特异性抗体的多肽链是抗体轻链。
在所有方面的一个实施方案中，结构域交换是CH1-CL交换或VH-VL交换。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，或三价双特异性抗体或四价双特异性抗体。
在所有方面的一个实施方案中，通过用一个或多个编码多特异性抗体的核酸分子转染哺乳动物细胞并且选择稳定转染的细胞来获得表达多特异性抗体的哺乳动物细胞。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是三特异性或四特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰)轻链和第二(修饰)重链，其中可变结构域VL和VH互换，和/或其中恒定结构域CL和CH1互换，和
c)其中特异性地结合一个或两个其他抗原(即，第三和/或第四抗原)的一个至两个抗原结合肽通过肽衔接物与a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-末端融合。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性、四价抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)特异性地结合第二抗原的抗体的两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段两者通过肽衔接物与a)的重链的C-或N-末端融合，
和
其中在所述Fab片段中，进行了以下修饰
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和/或恒定结构域CL和CH1互换，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，且恒定结构域CL和CH1互换，
和
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，或恒定结构域CL和CH1互换，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，或恒定结构域CL和CH1互换，
和
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，且恒定结构域CL和CH1互换，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1互换，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1互换，和在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行了以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，
和/或
恒定结构域CL和CH1互换。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性、四价抗体，其包含：
a)特异性地结合第一抗原并包含第一VH-CH1结构域对的第一抗体的(修饰)重链，其中所述重链的C-末端通过肽衔接物与所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N-末端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
c)特异性地结合第二抗原并包含第一VH-CL结构域对的第二抗体的(修饰)重链，其中所述重链的C-末端通过肽衔接物与所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-末端融合，和
d)c)的所述第二抗体的两条(修饰)轻链，其各自包含CL-CH1结构域对。
在本文记载的所有方面中，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在所有方面的一个实施方案中，本文记载的方法中产生的抗体是多特异性抗体，其需要至少两个重链多肽的杂二聚化。
在一个实施方案中，全长抗体是
a)人亚类IgG1的全长抗体，
b)人亚类IgG4的全长抗体，
c)具有突变L234A、L235A和P329G的人亚类IgG1的全长抗体，
d)具有突变S228P、L235E和P329G的人亚类IgG4的全长抗体，
e)在两条重链中都具有突变L234A、L235A和P329G、以及在一条重链中具有突变T366W和S354C或Y349C和在相对的另一条重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C或S354C的人亚类IgG1的全长抗体，
f)在两条重链中都具有突变S228P和P329G、以及在一条重链中具有突变T366W和S354C和在相对的另一条重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人亚类IgG4的全长抗体，
g)在两条重链中都具有突变L234A、L235A、P329G、I253A、H310A和H435A、以及在一条重链中具有突变T366W和S354C和在相对的另一条重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人亚类IgG1的全长抗体，或
h)在两条重链中都具有突变L234A、L235A、P329G、M252Y、S254T和T256E、以及在一条重链中具有突变T366W和S354C和在相对的另一条重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和Y349C的人亚类IgG1的全长抗体。
本文公开的一个方面是包含编码用本文公开的方法获得的双特异性抗体的核酸的细胞。
本文公开的一个方面是一种生产本文公开的多特异性抗体的方法，其包括以下步骤：
a)培养本文公开的产生/表达多特异性抗体的细胞，和
b)从细胞或培养基回收多特异性抗体，
和由此产生本文记载的多特异性抗体。
本文公开的一个方面是用本文记载的方法产生的抗体。
本文公开的一个方面是包含用本文公开的方法产生的抗体和药物学上可接受载体的药物制剂。
本文公开的一个方面是本文公开的方法产生的抗体用作药物。
本文公开的一个方面是用本文公开的方法产生的双特异性抗体在制造药物中的用途。
在所有方面的一个实施方案中，双特异性抗体选自由抗-Aβ/转铁蛋白受体抗体、抗-CD20/转铁蛋白受体抗体、抗-PD1/Tim3抗体和抗-FAP/DR5抗体组成的双特异性抗体组。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性、四价抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)特异性地结合第二抗原的抗体的两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段两者分别通过肽衔接物与a)的重链之一的C-末端融合，
和
其中在另外的Fab片段中，进行了以下修饰
在b)的两个另外的Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和/或恒定结构域CL和CH1互换，
其中i)第一抗原是DR5，而第二抗原是FAP，或ii)第一抗原是FAP，而第二抗原是DR5，
其中特异性地结合第一抗原的抗体的两条重链是具有突变L234A、L235A和P239G的人亚类IgG1的。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换，
其中i)第一抗原是PD1，而第二抗原是Tim3，或ii)第一抗原是Tim3，而第二抗原是PD1，
其中第一重链和第二重链是人亚类IgG1的，两者均具有突变L234A、L235A和P239G、以及在一条重链中具有突变T366W和任选的S354C或Y349C和在相对的另一条重链中具有突变T366S、L368A、Y407V和任选的Y349C或S354C，其中末端甘氨酸或甘氨酸-赖氨酸二肽可以不存在，
其中第一轻链在恒定轻链结构域(CL)的位置123包含氨基酸残基精氨酸(替代野生型谷氨酸残基；E123R突变)以及在位置124包含氨基酸残基赖氨酸(替代野生型谷氨酰胺残基；Q124K突变)(编号根据Kabat)，
其中第一重链在第一恒定重链结构域(CH1)中的位置147包含谷氨酸残基(替代野生型赖氨酸残基；K147E突变)以及在位置213包含谷氨酸残基(替代野生型赖氨酸氨基酸残基；K213E突变)(编号根据Kabat)。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是三价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)特异性地结合第二抗原的抗体的一个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链之一的C-末端融合，
和
其中在另外的Fab片段中，进行了以下修饰
可变结构域VL和VH互换，和/或恒定结构域CL和CH1互换，
其中i)第一抗原是Aβ，而第二抗原是转铁蛋白受体，或ii)第一抗原是CD20，而第二抗原是转铁蛋白受体。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含
a)一条全长抗体，其包含两对的全长抗体轻链和全长抗体重链，其中由每对全长重链和全长轻链形成的结合位点特异性地结合第一抗原，和
b)一个另外的Fab片段，其中该另外的Fab片段与所述全长抗体的一条重链的C-末端融合，其中所述另外的Fab片段的结合位点特异性地结合第二抗原，
其中每条全长抗体轻链在恒定轻链结构域(CL)的位置123包含氨基酸残基丙氨酸(替代野生型谷氨酸残基；E123R突变)以及在位置124包含氨基酸残基赖氨酸(替代野生型谷氨酰胺残基；Q124K突变)(编号根据Kabat)，
其中每条全长抗体重链在第一恒定重链结构域(CH1)的位置147包含谷氨酸残基(替代野生型赖氨酸残基；K147E突变)以及在位置213包含谷氨酸残基(替代野生型赖氨酸氨基酸残基；K213E突变)(编号根据Kabat EU索引)，
其中特异性地结合第二抗原的所述另外的Fab片段包含结构域交换，使得恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)互换，和其中第一抗原是人A-β蛋白，而第二抗原是人转铁蛋白受体。
在所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含
a)一条全长抗体，其包含两对的全长抗体轻链和全长抗体重链，其中由每对全长重链和全长轻链形成的结合位点特异性地结合第一抗原，和
b)一个另外的Fab片段，其中该另外的Fab片段与全长抗体的一条重链的C-末端融合，其中所述另外的Fab片段的结合位点特异性地结合第二抗原，
其中每条全长抗体轻链在恒定轻链结构域(CL)的位置123包含氨基酸残基丙氨酸(替代野生型谷氨酸残基；E123R突变)以及在位置124包含氨基酸残基赖氨酸(替代野生型谷氨酰胺残基；Q124K突变)(编号根据Kabat)，
其中每条全长抗体重链在第一恒定重链结构域(CH1)的位置147包含谷氨酸残基(替代野生型赖氨酸残基；K147E突变)以及在位置213包含谷氨酸残基(替代野生型赖氨酸氨基酸残基；K213E突变)(编号根据Kabat EU索引)，
其中特异性地结合第二抗原的所述另外的Fab片段包含结构域交换，使得恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)互换，和其中第一抗原是人CD20，而第二抗原是人转铁蛋白受体。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，每个多肽在表达盒内，每个表达盒以5’-至3’-方向包含启动子、编码多肽的结构基因、多腺苷酸化序列和任选的终止子序列。在一个实施方案中，所有表达盒具有相同的启动子、相同的多腺苷酸化位点和任选地相同的终止子序列。在一个实施方案中，启动子是人CMV(巨细胞病毒)启动子。在一个实施方案中，CMV启动子包含内含子A。在一个实施方案中，多腺苷酸化位点是BGH(牛生长激素)多腺苷酸化位点。在一个实施方案中，存在终止子并且是HGT(人生长激素终止子)。在一个实施方案中，启动子是任选包含内含子A的CMV启动子，并且多腺苷酸化位点是BGH多腺苷酸化位点。在一个实施方案中，启动子是任选包含内含子A的CMV启动子，多腺苷酸化位点是BGH多腺苷酸化位点，终止子是HGT。
在一个实施方案中，所述其他表达载体包含，或所述其他表达载体中的每个都包含，至少两个核酸序列，所述至少两个核酸序列分别编码多特异性抗体的不同多肽链，其中每个编码核酸在各自的载体上仅存在/被包含一次。
发明详述
杵进臼(knobs into holes)二聚化模块及其在抗体工程化中的用途描述于Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.:Immunotechnology，卷2，Number1，1996年2月，pp.73-73(1)。
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)给出。
如本文中使用的，根据Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号系统，将重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置编号，并且在本文中将其称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，在这种情况中，本文中通过称为“根据Kabat EU索引编号”来进一步澄清)。
用于实施本发明的有用的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.(编辑)，CurrentProtocols in Molecular Biology，卷I至III(1997)；Glover,N.D.和Hames,B.D.编辑，DNACloning:A Practical Approach，卷I和II(1985)，Oxford University Press；Freshney,R.I.(编辑)，Animal Cell Culture–apractical approach，IRL Press Limited(1986)；Watson,J.D.编辑，Recombinant DNA，第二版，CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.，FromGenes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.编辑，Cell Biology,SecondEdition,Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique，第二版，Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
使用重组DNA技术能够产生核酸衍生物。例如，衍生物可以是通过置换、改变、交换、缺失或插入，在单核苷酸位置或几个核苷酸位置，进行修饰的。例如，可以通过定点诱变进行修饰或衍化。这样的修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见，例如，Sambrook,J.等，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，USA；Hames,B.D.和Higgins，S.G.，Nucleic acid hybridization-apractical approach(1985)IRL Press，Oxford，England)。
定义
“多特异性抗体”表示对同一抗原或两个不同抗原上的至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。可以将多特异性抗体制成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab’)2双特异性抗体)或其组合(例如，全长抗体加另外的scFv或Fab片段)。具有两个、三个或更多个(例如，四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体也已经有报道(参见，例如，US 2002/0004587A1)。
如本文使用的术语“正确折叠/正确装配”表示抗体具有正确的化学计算，即，包含匹配数量和拷贝的独立/相应的轻链和重链。例如，对于“天然人IgG抗体”，当分离的分子包含了两个轻链多肽和两个重链多肽时，其是正确折叠/正确装配的。例如，对于多特异性抗体，如果该多特异性抗体是二价、双特异性天然人IgG抗体，则在如下情况下该多特异性抗体是正确折叠/正确装配的，即，分离的分子由结合第一抗原的第一对的关联第一轻链和关联第一重链以及结合第二抗原的第二对的关联第二轻链和关联第二重链(即，四个不同的多肽)组成时。没有正确折叠/正确装配的所有抗体，即，包含少于或多于所需数量的链、和/或包含错误结合的链，即，没有形成重链和轻链的关联对的抗体，称为“产物相关副产物”。
如本文使用的术语“结构域交换”表示，在抗体重链VH-CH1片段及其相应关联抗体轻链的对中，即，在抗体结合臂中(即，在Fab片段中)，结构域序列偏离天然序列，其中至少一个重链结构域被其相应的轻链结构域取代，且反之亦然。存在三种一般类型的结构域交换，(i)CH1和CL结构域的交换，这导致具有VL-CH1结构域序列的结构域交换轻链和具有VH-CL结构域序列的结构域交换重链片段(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)，(ii)VH和VL结构域的结构域交换，这导致具有VH-CL结构域序列的结构域交换轻链和具有VL-CH1结构域序列的结构域交换重链片段，和(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域交换(“Fab交换”)，这导致具有VH-CH1结构域序列的结构域交换轻链和具有VL-CL结构域序列的结构域交换重链片段(所有上述结构域序列以N-末端到C-末端方向表示)。
如本文中使用的，关于相应的重链和轻链结构域的术语“互换”是指上述的结构域交换。因此，当CH1和CL结构域“互换”时，是指在项(i)下提及的结构域交换以及所得到的重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“互换”时，是指在项(ii)下提及的结构域交换；以及当CH1和CL结构域“互换”且VH1和VL结构域“互换”时，是指在项(iii)下提及的结构域交换。包括结构域交换的双特异性抗体记载于例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192中。
使用本文记载的方法产生的多特异性抗体实质上包含如下Fab片段，所述Fab片段包括以上项(i)下提及的CH1和CL结构域的结构域交换，或以上项(ii)下提及的VH和VL结构域的结构域交换。可以将特异性地结合相同抗原(一个或多个)的Fab片段构造成具有相同的结构域序列。因此，在多特异性抗体中包含一个以上具有结构域交换的Fab片段时，所述Fab片段可以特异性地结合相同抗原。
本文中使用的术语“抗体”以最宽的含义来使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们呈现期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指，并非完整抗体的分子，其包括完整抗体的部分，所述部分结合该完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双功能抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，同时重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文中使用的术语“Fc受体”是指激活受体，特征在于存在与该受体相关的胞质ITAM序列(参见，例如，Ravetch,J.V.和Bolland,S.，Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。这样的受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”表示，在10μg/ml的抗体浓度下，在本文记载的方法中产生的抗体与NK细胞的结合是针对WO 2006/029879中记载的抗OX40L抗体LC.001发现的结合的10％或更少。
尽管IgG4显示出降低的FcR结合，但其他IgG亚类的抗体显示出强结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc碳水化合物)、Pro329、和234、235、236和237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是，如果改变，也可以提供降低的FcR结合的残基(Shields，R.L.等，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等，FASEBJ.9(1995)115-119；Morgan,A.等，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434)。在一个实施方案中，本文中所述的抗体是IgG1或IgG2亚类的，并且包含突变PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A。在一个实施方案中，本文中所述的抗体是IgG4亚类的，并且包含突变L235E。在一个实施方案中，所述抗体进一步包含突变S228P。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分的恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区域。该术语包括天然序列Fc-区和变体Fc-区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc-区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc-区的C-端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外指出，Fc-区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat,E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIHPublication 91-3242中所述的。
本文中记载的方法中产生的抗体可以包含Fc-区，在一个实施方案中，源自人来源的Fc-区。在一个实施方案中，所述Fc-区包含人恒定区的所有部分。抗体的Fc区直接参与补体激活、C1q结合、C3激活和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于特定条件，但C1q结合是由Fc-区中的确定结合位点引起的。这样的结合位点是现有技术中已知的并且描述于例如Lukas,T.J.等，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等，Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307434。这样的结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(编号根据Kabat的EU索引)。除非本文另外指出，Fc-区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat,E.A.等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述的。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常显示出补体激活、C1q结合和C3激活，而IgG4不激活补体系统，不结合C1q和不激活C3。“抗体的Fc-区”是本领域技术人员公知的术语，并且是基于抗体的木瓜蛋白酶裂解来限定的。在一个实施方案中，Fc-区是人Fc-区。在一个实施方案中，Fc区是包含突变S228P和/或L235E(编号根据Kabat的EU索引)的人IgG4亚类。在一个实施方案中，Fc-区是包含突变L234A和L235A(编号根据Kabat的EU索引)的人IgG1亚类。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上类似的结构或具有含有本文中定义的Fc-区的重链的抗体。“全长抗体”是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。更详细地，全长抗体包含两条抗体轻链(各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域)和两条抗体重链(各自包含重链可变结构域、铰链区和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3)。C-末端氨基酸残基K或GK可以彼此独立地存在或不存在于全长抗体的两条抗体重链中。
术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且是指其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其衍生的后代，不考虑传代数。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。针对在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性而言，具有相同的功能或生物活性的突变体后代被包括在本文中。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个和通常两个可变结构域的基本上全部，其中HVR(例如，CDR)的所有或基本上所有对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”是指已经经历人源化的抗体。
“分离的”抗体是已经与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来测定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生的变体抗体)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”表示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、以及利用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-端至C-端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中铰链区位于所述第一和第二个恒定结构域之间。类似地，从N-端至C-端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，接着是轻链恒定(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。“天然样”抗体具有与“天然抗体”相同的结构，但具有不同的结合特异性。
本文中使用的术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。
术语“表达盒”表示含有用于至少所含的核酸在细胞中表达所必需的调控元件(如启动子和多腺苷酸化位点)的构建体。
术语“表达载体”表示提供包含的结构基因(一或多个)在细胞中表达所需的全部元件的核酸。通常，表达载体包含原核质粒增殖单位，例如，对于大肠杆菌，包含复制起点，和选择标记，真核选择标记和一个或多个用于目标结构基因表达的表达盒，所述表达盒各自包含启动子核酸、结构基因和转录终止子，包括多腺苷酸化信号。通常将基因表达置于启动子核酸的控制下，并且将这样的结构基因称为“可操作地连接”启动子核酸。相似地，如果调控元件调节核心启动子核酸的活性，则调控元件和核心启动子核酸可操作地连接。
术语“可操作地连接”表示两种或更多种组分的并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子和/或增强子以顺式起作用来控制或调节所连接的编码序列的转录，则它们与编码序列可操作地连接。通常但非必需地，“可操作地连接”的DNA序列是连续的，并且在必需连接两个蛋白质编码区域，如分泌前导序列和多肽时，是连续的且在(阅读)框架中。然而，尽管可操作连接的启动子通常位于编码序列的上游，但它不必与其连续。增强子不必是连续的。如果增强子增加编码序列的转录，则增强子与编码序列可操作地连接。可操作连接的增强子可以位于编码序列的上游，内部或下游，并且可以距启动子具有相当距离。如果多腺苷酸化位点位于编码序列的下游末端，使得转录可以进行通过编码序列进入多腺苷酸化序列，则该多腺苷酸化位点与编码序列可操作地连接。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游末端(3'末端)，则翻译终止密码子与外显子核酸序列可操作地连接，使得翻译可以进行通过编码序列到达终止密码子并在此终止。连接可以通过本领域已知的重组方法完成，例如，使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点连接。如果不存在方便的限制性位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
术语“多肽”表示由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生还是合成产生的。小于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由两个或多个多肽组成或包含一个多于100个氨基酸残基的多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽还可包含非氨基酸组分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由在其中表达多肽的细胞添加，并且可以随细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸骨架结构或编码其的核酸定义。通常不具体限定添加物如碳水化合物基团，但是其可以存在。
术语“生产”表示插入表达盒中的结构基因在细胞中的表达。该术语包括核酸的转录和翻译过程。生产在适当的原核或真核细胞中进行，并且可以在裂解细胞后从细胞中或从培养上清液中回收表达的(即生产的)多肽。
术语“启动子核酸”表示控制与其可操作连接的基因/结构基因或核酸序列的转录的多核苷酸序列。启动子核酸包括用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。使用的启动子核酸在细胞中是有功能的，其中考虑了所选结构基因的表达。大量启动子核酸，包括来自各种不同来源的组成型、诱导型和阻遏型启动子，是本领域公知的(并且标识在诸如GenBank的数据库中)，可作为克隆多核苷酸或在克隆多核苷酸内获得(来自例如保藏库，如ATCC以及其他商业或个人来源)。
通常，启动子核酸位于基因的5'非编码区或非翻译区，靠近结构基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子核酸内的序列元件常可以通过共有核苷酸序列表征。这些元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE)、环AMP反应元件(CRE)、血清反应元件(SRE)，糖皮质激素反应元件(GRE)、和其他转录因子的结合位点，如CRE/ATF、AP2、SP1、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和octamer因子。如果启动子核酸是诱导型启动子核酸，则转录速率响应于诱导剂而增加，如后随两个tet-操纵子位点的CMV启动子核酸、金属硫蛋白和热激启动子核酸。如果启动子核酸是组成型活性启动子核酸，则转录速率不受诱导剂调节。在已被鉴定为用于表达的强启动子核酸的真核启动子核酸中，有SV40早期启动子核酸、腺病毒主要晚期启动子核酸、小鼠金属硫蛋白-I启动子核酸、劳氏肉瘤病毒长末端重复、中国仓鼠延伸因子1α(CHEF-1)、人EF-1α、泛素和人巨细胞病毒主要立即早期启动子核酸(hCMV MIE)。
术语“选择标记”表示，在相应的选择剂存在下(在选择性培养条件下培养)，允许携带它的细胞被特异性选择出来或选择除去的核酸。通常，选择标记将赋予对药物的抗性或补偿其所引入的细胞中的代谢或分解代谢缺陷。选择标记可以是阳性、阴性或双功能的。有用的阳性选择标记是抗生素抗性基因，其允许在相应的选择剂例如，抗生素存在下选择用其转化的细胞。非转化细胞不能在选择条件下(即在选择剂存在下)生长或存活。阴性选择标记允许选择性地消除携带标记的细胞。与真核细胞一起使用的选择标记包括，例如，编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH)的结构基因，例如，编码潮霉素(hyg)、新霉素(neo)和G418选择标记，二氢叶酸还原酶(DHFR)，胸苷激酶(tk)，谷氨酰胺合成酶(GS)，天冬酰胺合成酶，色氨酸合成酶(选择剂吲哚)，组氨醇脱氢酶(选择剂组氨醇D)的结构基因，以及赋予嘌呤霉素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素，Zeocin和霉酚酸抗性的核酸。
方法
本发明至少部分基于以下发现：对于产生用于生产杂二聚抗体的细胞系，有利的是在转染中使用包含轻链多肽编码核酸作为唯一(抗体)多肽编码核酸的表达载体，即该载体包含轻链表达盒作为唯一抗体多肽表达盒。该载体在共转染中或者分开在第二个后续转染步骤中与其他表达载体一起使用。通过这种方法，可以获得产生杂二聚抗体的生产细胞系，其具有改善的产物特征，即具有增加的产物和减少的产物相关杂质。
设计多特异性抗体的一种方法称为“CrossMab技术”。该方法基于重链和轻链之间的域交叉，从而产生不同的结构域排列用于不同特异性的重链和轻链(参见例如WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、Schaefer，W.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)11187-11192，涉及具有域交换的二价双特异性IgG抗体；WO2010/145792和WO2010/145792，涉及具有域交换的四价抗原结合蛋白)。
在一个结合位点具有VH/VL置换/交换以防止轻链错配的多特异性抗体(CrossMabVH-VL)，描述于WO2009/080252中，(还参见Schaefer，W.等，PNAS，108(2011)11187-1191)，该抗体明显减少由于相对第一抗原的轻链与相对第二抗原的错误重链的错配引起的副产物(与没有这种结构域交换的方法相比)。但是，它们的制备并不是完全没有副产物。主要的副产物基于错误的轻链与结构域交换的重链的Bence-Jones型相互作用(参见Schaefer，W.等，PNAS，108(2011)11187-1191；补充的图S1I)。
WO2015/101588A1涉及血脑屏障穿梭模块。WO2015/101588A1提到了二价双特异性抗体，其在一个结合臂中具有VH/VL结构域交换，且在CH1/CL界面具有突变。WO2015/101588A1没有提及所述突变的技术效果。
用于产生四链同型二聚二价抗体(即天然样抗体)的细胞系的各种生产方法是已知的。为了提高这些细胞系的生产力，这些方法中的一些依赖于所谓的“超转染”方法。其中将细胞转染至少两次，并进行中间细胞系选择。在该超级转染方法中使用的载体通常包含待表达抗体的完整编码信息，即轻链和重链。一些特殊的超级转染方法使用非常相似或甚至相同的载体，这些载体仅在选择标记中不同，以便在已知的生产性区域中实现近端整合到基因组中。与使用DHFR的基因扩增方法一样，超转染方法旨在通过增加细胞中功能性表达盒的数量来增加表达产量。
对于包含杂二聚Fc区和所谓的结构域交换的新型复合三价双特异性抗体形式(其中所述杂二聚Fc区和结构域交换两者被引入以限制或甚至排除链错配和从而增加所获得的正确折叠和装配的多特异性抗体的产量)，已经报道了以不同载体比例共转染三到四个载体的复杂程序，其中每个载体包含单个表达盒(参见例如WO2013/026833)。
本发明至少部分基于以下发现：如果用表达所述多特异性抗体的轻链的表达盒重复转染细胞，则可以提高重组细胞的多特异性抗体的表达产量。如果多特异性抗体包含具有结构域交换的变体重链和轻链，则这尤为有用。
本文公开的一个方面是一种用于生产多特异性抗体(包含至少一个具有结构域交换的多肽)的方法，其包括以下步骤：
a)提供表达抗体的哺乳动物细胞，
b)用表达载体转染a)的哺乳动物细胞，所述表达载体包含编码具有结构域交换的抗体多肽的表达盒，
c)培养b)的细胞并从细胞或培养基回收抗体，并由此产生多特异性抗体。
用本文报道的方法获得的修饰细胞“分泌”更多正确折叠和装配形式的多特异性抗体，并且在本文中定义为释放到胞外培养基中的正确折叠和正确装配的多特异性抗体的量相对于亲本细胞增加的细胞。免疫印迹分析、生物活性测定和物理-化学分离方法可用于量化由修饰细胞相对亲本细胞释放的正确折叠和装配的多特异性抗体的绝对量。
本文公开的一个方面是一种生产多特异性抗体的方法，其包括以下步骤：
a)在适用于/有助于多特异性抗体产生的条件下培养修饰细胞，其中
i)通过在基因座将核酸引入亲本细胞的基因组中，修饰细胞与亲本细胞相关，其中亲本细胞包含编码多特异性抗体的第一DNA序列，且所述基因座不在第一DNA序列内；和
ii)将两种细胞在相同条件下培养时，修饰细胞比亲本细胞产生更多的多特异性抗体；和
b)回收多肽。
具有结构域交换的抗体格式
本文报道的方法通常适用于生产任何包含分开编码的重链和轻链的多特异性抗体。
在一个实施方案中，多特异性抗体是二价双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换。
a)中的抗体不含b)中记载的修饰，并且a)中的重链和轻链是分离的链。
在b)的抗体中
在轻链内
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替代，
且
在重链内
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替代。
在一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换，和其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
a)的抗体不含b)记载的修饰，并且a)的重链和轻链是分离的链。
在b)的抗体中
在轻链内
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替代，且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替代；
和
在重链内
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域CL替代，且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替代。
在一个实施方案中，多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
a)的抗体不含b)记载的修饰，并且a)的重链和轻链是分离的链。
在b)的抗体中
在轻链内
恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替代；
和在重链内
恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替代。
在一个实施方案中，多特异性抗体是三特异性或四特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰)轻链和第二(修饰)重链，其中可变结构域VL和VH互换，和/或其中恒定结构域CL和CH1互换，和
c)其中特异性地结合一个或两个其他抗原(即，第三和/或第四抗原)的一个至四个抗原结合肽通过肽衔接物与a)和/或b)的轻链或重链的C-或N-末端融合。
a)的抗体不含b)记载的修饰，并且a)的重链和轻链是分离的链。
在一个实施方案中，所述三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性地结合一个或两个其他抗原的一个或两个抗原结合肽。
在一个实施方案中，抗原结合肽选自scFv片段和scFab片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽是scFv片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽是scFab片段。
在一个实施方案中，抗原结合肽与a)和/或b)的重链的C-末端融合。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性地结合一个其他抗原的一个或两个抗原结合肽。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性地结合第三抗原的两个相同的抗原结合肽。在一个优选实施方案中，这样的两个相同的抗原结合肽通过相同的肽衔接物分别与a)和b)的重链的C-末端融合。在一个优选实施方案中，两个相同的抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
在一个实施方案中，三特异性或四特异性抗体在c)中包含特异性地结合第三和第四抗原的两个抗原结合肽。在一个实施方案中，所述两个抗原结合肽通过相同的肽接头分别与a)和b)的重链的C-末端融合。在一个优选的实施方案中，所述两个抗原结合肽是scFv片段或scFab片段。
在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性、四价抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)特异性地结合第二抗原的抗体的两个另外的Fab片段，其中所述两个另外的Fab片段通过肽衔接物分别与a)的重链的C-或N-末端融合，
和
其中在Fab片段中，进行了以下修饰
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和/或恒定结构域CL和CH1互换，
或
ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和恒定结构域CL和CH1互换，
和
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，或恒定结构域CL和CH1互换，
或
iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，或恒定结构域CL和CH1互换，
和
在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和恒定结构域CL和CH1互换，
或
iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，和在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1互换，
或
v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1互换，和在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-末端，或与a)的重链的N-末端融合。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽衔接物与a)的重链的C-末端融合。
在一个实施方案中，所述另外的Fab片段通过肽接头与a)的重链的N-末端融合。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行了以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，
和/或
恒定结构域CL和CH1互换。
在一个实施方案中，在Fab片段，进行了以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，
和/或
恒定结构域CL和CH1互换。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行了以下修饰：
i)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1互换。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行了以下修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH互换，
和/或
恒定结构域CL和CH1互换。
在一个实施方案中，在Fab片段中，进行了以下修饰：
i)在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1互换。
在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性、四价抗体，其包含：
a)特异性地结合第一抗原并且包含第一VH-CH1结构域对的第一抗体的(修饰)重链，其中所述重链的C-末端通过肽衔接物与所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N-末端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
c)特异性地结合第二抗原并且包含第一VH-CL结构域对的第二抗体的(修饰)重链，其中所述重链的C-末端通过肽衔接物与所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N-末端融合，和
d)c)的所述第二抗体的两条(修饰)轻链，其各自包含CL-CH1结构域对。
在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，和
b)特异性地结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中重链的N-末端通过肽衔接物连接到轻链的C-末端。
a)的抗体不含b)记载的修饰，并且重链和轻链是分离的链。
在本文记载的所有方面中，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，并且第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在一个实施方案中，本文记载的方法中产生的抗体是多特异性抗体，其需要至少两条重链多肽的杂二聚化。
为了支持杂二聚化而用于CH3修饰的几种方法已经描述于例如WO 96/27011、WO98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中，将其按引用并入本文中。通常，在本领域已知的方法中，以互补的方式对第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域进行工程化，使得包含一个工程化的CH3结构域的重链不再与相同结构的另一条重链同型二聚化(例如，CH3工程化的第一重链不再与另一条CH3工程化的第一重链同型二聚化；和CH3工程化的第二重链不再与另一条CH3工程化的第二重链同型二聚化)。由此，迫使包含一个工程化的CH3结构域的重链与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一条重链杂二聚化。对于本发明的这个实施方案，通过氨基酸置换以互补方式将第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域工程化，从而迫使第一重链和第二重链杂二聚化，而第一重链和第二重链不再同型二聚化(例如，出于空间原因)。
上文引用和包括的本领域已知的支持重链杂二聚化的不同方法被考虑作为不同替代方案用于根据本发明的多特异性抗体中，其包含源自特异性地结合第一抗原的第一抗体的“非交换Fab区”、和源自特异性地结合第二抗原的第二抗体的“交换Fab区”，结合以上针对本发明描述的特定氨基酸置换。
如本文记载的方法中产生的多特异性抗体的CH3结构域可以通过“杵进臼”技术改变，该技术在例如几个实例中有详细描述，例如，WO 96/027011，Ridgway，J.B.等，ProteinEng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.等，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的杂二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之任一可以是“杵”，而另一个是“臼”。二硫键桥的引入可以进一步稳定杂二聚体(Merchant，A.M等，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26 -35)并提高产量。
在一个优选的实施方案中，如本文中记载的方法产生的多特异性抗体包含在“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和在“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A，Y407V突变(编号根据Kabat EU索引)。还可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫键桥(Merchant，A.M.等，Nature Biotech.16(1998)677-681)，例如，将Y349C突变引入“杵链”的CH3结构域中并将E356C突变或S354C突变引入“臼链”的CH3结构域中。因此，在另一个优选的实施方案中，如本文中记载的方法产生的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变以及在两个CH3结构域之另一个中的E356C、T366S、L368A和Y407V突变，或如本文中记载的方法产生的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变以及在两个CH3结构域之另一个中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中另外的Y349C突变和另一个CH3结构域中另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键桥)(编号根据KabatEU索引)。
但是也可以替代地或另外地使用如EP 1 870 459A1中所述的其他杵进臼技术。在一个实施方案中，如本文记载的方法中产生的多特异性抗体包含在“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变以及在“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(编号根据KabatEU索引)。
在一个实施方案中，如本文中记载的方法中产生的多特异性抗体包含在“杵链”的CH3结构域中的T366W突变以及在“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A和Y407V突变以及额外地在“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变以及在“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(编号根据Kabat EU索引)。
在一个实施方案中，如本文中记载的方法中产生的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一个中的Y349C和T366W突变以及在两个CH3结构域之另一个中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或如本文中记载的方法中产生的多特异性抗体包含在两个CH3结构域之一个中的Y349C和T366W以及在两个CH3结构域之另一个中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变以及额外地在“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变以及在“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(编号根据Kabat EU索引)。
除了“杵进臼技术”，用于修饰多特异性抗体的重链的CH3结构域以实施杂二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术，尤其是WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768，WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被考虑为“杵进臼技术”的替代方案，用于在本文记载的方法中产生的多特异性抗体。
在本文记载的所有方面和实施方案的一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。在本发明的一个优选实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，抗体是二价或三价抗体。在一个实施方案中，抗体是二价抗体。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，多特异性抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类的，或具有突变L234A和L235的人IgG1亚类的。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG2亚类的。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG3亚类的。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG4亚类的，或具有另外的突变S228P的人IgG4亚类的。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是人IgG1亚类或人IgG4亚类的。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的(编号根据Kabat EU索引)。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1亚类的(编号根据Kabat EU索引)。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P和L235E的人IgG4亚类的(编号根据Kabat EU索引)。在本文记载的所有方面的再一个实施方案中，多特异性抗体的特征在于所述多特异性抗体是具有突变S228P、L235E和P329G的人IgG4亚类的(编号根据Kabat EU索引)。
在本文记载的所有方面的一个实施方案中，包含包括本文详述的CH3结构域的重链的抗体，还包含另外的C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，编号根据Kabat EU索引)。在本文记载的所有方面的一个实施方案中，包含包括本文详述的CH3结构域的重链的抗体，还包含另外的C-末端甘氨酸残基(G446，编号根据Kabat EU索引)。
双特异性、三价抗人A-β/人转铁蛋白受体抗体
这种抗体是由全长核心抗体和融合的Fab片段组成的双特异性抗体，其中某些结构域是交叉交换的。因此，所得到的双特异性抗体是不对称的。因此，可以使用具有称为杵突变的第一重链(HC杵)和具有称为臼突变的第二重链(HC臼)，使用称为杵进臼的杂二聚化技术，产生该双特异性抗体。
在这个实例中，已经使用共转染。
抗体0012、抗体0015、抗体0020和抗体0024记载于WO 2017/055540 A1中(分别为WO 2017/055540 A1的SEQ ID NO:06至09，SEQ ID NO:01至03和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11至13和SEQ ID NO:14至17)。
抗体0012是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中具有杵突变的重链的C-末端通过衔接物与Fab的VL融合，其中在该Fab中，VH和VL结构域交换(VH-VL结构域交换)。该全长抗体的无结构域交换的两个Fab已经进行修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
抗体0015是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中具有杵突变的重链的C-末端通过衔接物与Fab的VH融合，其中在该Fab中，CH1和CL结构域交换(CH-CL结构域交换)。该全长抗体的无结构域交换的两个Fab已经进行修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
抗体0020是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中具有杵突变的重链的C-末端通过衔接物与单链Fab的VL融合(无结构域交换)。没有结构域交换的两个Fab已经进行修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
抗体0024是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中具有杵突变的重链的C-末端通过衔接物与Fab的VH融合，其中在该Fab中，CH1和CL结构域交换(CH-CL结构域交换)。
相应多肽在不同表达载体上的不同分配/组合、所得载体的不同比例和不同转染顺序，已用于双特异性抗体的重组生产。
LC+HC臼：包含用于具有臼突变的重链和轻链的一个表达盒的表达载体。
LC交换+HC杵：包含用于具有杵突变的重链和具有结构域交换的轻链的一个表达盒的表达载体。
LC：包含用于轻链的一个表达盒的表达载体。
LC交换：包含用于具有结构域交换的轻链的一个表达盒的表达载体。
HC杵：包含用于具有杵突变的重链和融合的scFab的一个表达盒的表达载体。
在CHO-K1细胞中的结果呈现于下表中。
已经在CHO-S细胞中小规模地产生了这些双特异性抗体，并且在使用蛋白A亲和性色谱的第一个纯化步骤后以及在使用制备性大小排阻色谱的第二个纯化步骤后，分析了副产物分布。结果呈现于下表中。
/>
使用这种方法，可以获得具有改善的产物特征(即，具有提高的产物和降低的产物相关杂质)的产生杂二聚抗体的生产细胞系。
通过与包含用于轻链的唯一抗体链表达盒的表达质粒共转染，产生稳定的生产细胞系。
在1(LC):1(LC+HC臼):3(LC交换+HC杵)的质粒比例下转染了CHO-K1细胞。用氨甲蝶呤选择已经将外源DNA稳定整合至其基因组中的细胞。分离稳定的细胞系并且关于产品质量在四天分批培养中评价。使用蛋白A亲和性色谱分离产物并用CE-SDS分析。
双特异性、三价抗人CD20/人转铁蛋白受体抗体
这种抗体是由全长核心抗体和融合的Fab片段组成的双特异性抗体，其中某些结构域是交叉交换的。因此，所得到的双特异性抗体是不对称的。因此，可以使用具有称为杵突变的第一重链(HC杵)和具有称为臼突变的第二重链(HC臼)，使用称为杵进臼的杂二聚化技术，产生该双特异性抗体。
在这个实例中，已经使用共转染。
抗体0039、抗体0041、抗体0040和抗体0042记载于WO 2017/055542 A1中(分别为WO 2017/055542 A1的SEQ ID NO:06至09，SEQ ID NO:01至03和SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11至13和SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:14至17)。
抗体0038是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中scFab的VL通过衔接物与具有杵突变的重链的C-末端融合。已经将两条正常的Fab臂进行修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
抗体0039是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中Fab的VL通过衔接物与具有杵突变的重链的C-末端融合，其中在该Fab中，VH和VL结构域交换(VH-VL结构域交换)。两个具有未改变的结构域的Fab已经进行修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
抗体0041是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中Fab的VH通过衔接物与具有杵突变的重链的C-末端融合，其中在Fab中，CH1和CL结构域交换(CH-CL结构域交换)。全长抗体的两对重链和轻链已经修饰来包含电荷以促进正确的装配以及Fab。两个具有未改变的结构域的Fab已经修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
抗体0040是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中Fab的VH通过衔接物与具有杵突变的重链的C-末端融合，其中在Fab中，CH1和CL结构域交换(CH-CL结构域交换)。
抗体0042是包含具有臼突变的一条重链和具有杵突变的一条重链的全长抗体，其中Fab的CH1通过衔接物与具有杵突变的重链的N-末端融合，其中在融合重链的Fab中，VH和VL结构域交换(VH-VL结构域交换)。两个具有未改变结构域的Fab已经修饰来包含电荷，以促进正确的装配。
相应多肽在不同表达载体上的不同分配/组合、所得载体的不同比例和不同转染顺序，已用于双特异性抗体的重组产生。
LC+HC臼：包含用于具有臼突变的重链和轻链的一个表达盒的表达载体。
LC交换+HC杵：包含用于具有杵突变的重链和具有结构域交换的轻链的一个表达盒的表达载体。
LC：包含用于轻链的一个表达盒的表达载体。
LC交换：包含用于具有结构域交换的轻链的一个表达盒的表达载体。
HC杵：包含用于具有杵突变的重链和融合的scFab的一个表达盒的表达载体。
相应多肽在不同表达载体上的不同分配/组合和所得载体的不同比例已用于HEK细胞中这些双特异性抗体的重组产生。结果呈现于下表中。
相应多肽在不同表达载体上的不同分配/组合和所得载体的不同比例已用于CHO-K1细胞中双特异性抗体的重组产生。结果呈现于下表中。
已经在CHO-S细胞中小规模地生产这些双特异性抗体，并且在使用蛋白A亲和性色谱的第一个纯化步骤后以及在使用制备性大小排阻色谱的第二个纯化步骤后分析了副产物分布。结果呈现于下表中。
/>
已经在不同的细胞系中生产了这些双特异性抗体。结果显示于下表中。
使用这种方法，可以获得具有改善的产物特征(即，具有提高的产物和降低的产物相关杂质)的产生杂二聚抗体的生产细胞系。
双特异性、二价抗人PD1/人Tim3抗体
该抗体是由在Fc-区中具有杵进臼突变和在CH3结构域之间具有人工二硫桥的全长抗体组成的双特异性抗体，其中在形成PD1结合位点的重链和轻链对中，VH和VL结构域互换。因此，所得到的双特异性抗体是不对称的。因此，使用具有称为杵突变的第一重链(HC杵)和具有称为臼突变的第二重链(HC臼)，使用称为杵进臼的杂二聚化技术，产生该双特异性抗体。对于序列，参见WO 2017/055404 A1。
在这个实例中，已经使用共转染。
在此，几个不同形式的表达质粒被组合，以产生表达上述抗体的细胞系。这些方法的区别在于质粒的组合，而不在于抗体。
对于0516转染，以1:1比例共转染包含用于第一轻链(LC-1)和IgG1亚类的具有臼突变的第一重链(HC-1-臼)的表达盒的载体1、以及包含用于结构域交换的第二轻链(交换LC-2)和IgG1亚类的具有杵突变的结构域交换的第二重链(交换HC-2-杵)的表达盒的载体2。
对于0517转染，以1:1:1比例共转染包含用于第一轻链(LC-1)和IgG1亚类的具有臼突变的第一重链(HC-1-臼)的表达盒的载体1、包含用于结构域交换的第二轻链(交换LC-2)和IgG1亚类的具有杵突变的结构域交换的第二重链(交换HC-2-杵)的表达盒的载体2、以及包含用于结构域交换的第二轻链(交换LC-2)的表达盒的载体3。
对于0518转染，以1:1比例共转染包含用于结构域交换的第二轻链(交换LC-2)和IgG1亚类的具有臼突变的第一重链(HC-1-臼)的表达盒的载体1、以及包含用于第一轻链(LC-1)和IgG1亚类的具有杵突变的结构域交换的第二重链(交换HC-2-杵)的表达盒的载体2。
对于0519转染，以1:1:1比例共转染包含用于结构域交换的第二轻链(交换LC-2)和IgG1亚类的具有臼突变的第一重链(HC-1-臼)的表达盒的载体1、包含用于第一轻链(LC-1)和IgG1亚类的具有杵突变的结构域交换的第二重链(交换HC-2-杵)的表达盒的载体2、以及包含用于结构域交换的第二轻链(交换LC-2)的表达盒的载体3。结果呈现于下表中。
正确装配的抗体具有ABCD的化学计量，A＝IgG1亚类的具有杵突变的第二重链(交换HC-2-杵)，B＝IgG1亚类的具有臼突变的第一重链(HC-1-臼)，C＝结构域交换的第二轻链(交换LC-2)和D＝第一轻链(LC-1)。
形成的主要的化合物相关副产物是错误装配的抗体。两种主要的副产物都是四链抗体。第一种是杂臼杵HC二聚体，其中交换的轻链被非交换的轻链替代(ABD2)。第二种是同型臼杵半抗体二聚体(B2D2)。
可以看出，对于使用包含唯一一个域交换轻链表达盒的额外质粒进行的转染，可以获得改善的结果，即存在较少的产物相关副产物(参见图1A至1D)。
从图1中可以看出，可以减少产物相关的副产物，尤其是ABD2副产物。这伴随着在随后的纯化步骤中产物损失的减少。例如，可以减少所需纯化步骤的数量，或者可以减少由于重叠峰和分级分离而导致的产物损失(峰更加分离，从而可以以减少的产物损失来切除峰)或两者。由此可以增加可获得的产量。
使用这种方法，可以获得产生具有改善的产物特征(即，具有提高的产物和减少的产物相关杂质)的杂二聚抗体的生产细胞系。
双特异性、四价抗人FAP/DR5抗体
通过在C-末端经由(G4S)4衔接物将FAP结合结构域与DR5 IgG重链融合，产生了双特异性FAP-DR5抗体。DR5部分由drozitumab的可变轻链(VL)和可变重链(VH)组成(参见US2007/003141401)或由噬菌体展示产生的新DR5抗体组成。为了最小化轻链错配副产物，使用了具有结构域交换的CrossMab技术。将FAP-结合单元工程化成交换的Fab，其中VH与恒定轻链(CL)融合，而VL与CH1(恒定重链1)结构域融合。对于序列，参见WO 2016/055432。
在这个实例中，使用了顺序转染。
相应多肽表达盒分布在不同的表达载体上。
LC+HC臼：包含用于具有臼突变的重链和轻链的一个表达盒的表达载体。
LC交换+HC杵：包含用于具有杵突变的重链和具有结构域交换的轻链的一个表达盒的表达载体。
LC：包含用于轻链的一个表达盒的表达载体。
LC交换：包含用于具有结构域交换的轻链的一个表达盒的表达载体。
通过标准双质粒转染获得了克隆131，所述质粒各自包含两个表达盒用于表达双特异性抗体(全长抗体，具有一个CH1/CL交换-Fab连接分别至两条重链的C-末端)。
这个克隆产生了以下的组合物。
此克隆已经用作基础克隆用于第二转染，第二转染使用仅包含FAP结合位点的交换轻链的质粒。
一些示例性的所得克隆的特征显示于下表中。
CE-SDS结果呈现于下表(231＝5/6抗体；242＝单体)和图2中。
使用这种方法，可以获得产生具有改善的产物特征(即，具有提高的产物和减少的产物相关杂质)的杂二聚抗体的生产细胞系。
用于产生抗体的一般重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如US 4,816,567中所述的。对于这些方法，提供一个或多个编码抗体的分离核酸。
在天然抗体或天然抗体片段的情况中，需要两个核酸，一个用于轻链或其片段，而一个用于重链或其片段。此类核酸编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上。
在具有杂二聚重链的双特异性抗体的情况中，需要四个核酸，一个用于第一轻链，一个用于包含第一杂单体Fc-区多肽的第二轻链，一个用于第二轻链，和一个用于包含第二杂单体Fc-区多肽的第二重链。例如，杂二聚重链之一包含所谓的“杵突变”(T366W和任选S354C或Y349C中的一个)，而另一个包含所谓的“臼突变”(T366S、L368A和Y407V和任选Y349C或S354C)(参见，例如，Carter，P.等，Immunotechnol.2(1996)73)。这样的核酸编码抗体的包含第一VL的氨基酸序列和/或包含第一VH(包括第一杂单体Fc-区)的氨基酸序列和/或包含第二VL的氨基酸序列和/或包含第二VH(包括第二杂单体Fc-区)的氨基酸序列(例如，抗体的第一和/或第二轻链和/或第一和/或第二重链)。这些核酸可以在相同的表达载体上或在不同的表达载体上，通常这些核酸位于两个或三个表达载体上，即，一个载体可以包含这些核酸中的一个以上。这些双特异性抗体的实例是CrossMabs和T细胞双特异性抗体。
在一个实施方案中，提供了本文记载的方法中使用的编码抗体的分离核酸。
在再一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)。
在再一个实施方案中，提供了包含这样的核酸的宿主细胞。
在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经转化了)：
-在天然抗体或天然抗体片段的情况中：
(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或
(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。
-在具有杂二聚重链的双特异性抗体的情况中：
(1)包含第一对核酸(其编码氨基酸序列，所述氨基酸序列之一包含抗体的第一VL而另一个包含抗体的第一VH)的第一载体和包含第二对核酸(其编码氨基酸序列，所述氨基酸序列之一包含抗体的第二VL而另一个包含抗体的第二VH)的第二载体，或
(2)包含第一核酸(其编码包含可变结构域之一(优选轻链可变结构域)的氨基酸序列)的第一载体、包含一对核酸(其编码氨基酸序列，所述氨基酸序列之一包含轻链可变结构域而另一个包含第一重链可变结构域)的第二载体、和包含一对核酸(其编码氨基酸序列，所述氨基酸序列之一包含相应于第二载体中的另一轻链可变结构域，而另一个包含第二重链可变结构域)的第三载体，或
(3)包含核酸(其编码包含抗体的第一VL的氨基酸序列)的第一载体、包含核酸(其编码包含抗体的第一VH的氨基酸序列)的第二载体、包含核酸(其编码包含抗体的第二VL的氨基酸序列)的第三载体、和包含核酸(其编码包含抗体的第二VH的氨基酸序列)的第四载体。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗[[PRO]]抗体的方法，其中该方法包括在适于抗体表达的条件下培养以上提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
为了重组产生抗[[PRO]]抗体，分离例如如上所述的编码抗体的核酸，并将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这些核酸可以使用常规程序容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)或通过重组方法产生或通过化学合成获得。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。为了在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还可以参见Charlton，KA，见：Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，BKC(编辑)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254，描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可以从细菌细胞糊分离在可溶性级分中的抗体，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，真核微生物，如丝状真菌或酵母，是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech 22(2004)1409-1414；和Li，H.等，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，它们可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适应在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(例如，293或如Graham，F.L.等，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(例如，如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如，如Mather，J.P.等，Annals NYAcad.Sci.383(1982)44-68中所述的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，如Y0，NS0和Sp2/0。对于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的概述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(编辑)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，pp.255-268。
附图描述
图1针对以下的去糖基化的ESI-MS总离子色谱图
(A)转染0516；
(B)转染0517；
(C)转染0518；
(D)转染0519：
A：具有杵突变的IgG1亚类的第二重链(交换HC-2-杵)；B：具有臼突变的IgG1亚类的第一重链(HC-1-臼)；C：结构域交换的第二轻链(交换LC-2)；D：第一轻链(LC-1)。
图2通过CE-SDS测定了参考克隆0131和通过本文所述方法获得的克隆的相对单体含量(A)和5/6抗体副产物(B)。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实施各种其他实施方案。
材料&一般方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下文献中给出：Kabat，EA等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。将抗体链的氨基酸编号并根据Kabat的编号来提及(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991))。
重组DNA技术
如Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中所述的，将标准方法用于操纵DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
基因合成
从化学合成制得的寡核苷酸制备所需的基因区段。通过退火和连接寡核苷酸(包括PCR扩增)并随后通过指定的限制性位点克隆，装配两侧为单一限制性内切核酸酶切割位点的长基因区段。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。根据Geneart(Regensburg，德国)给出的说明书，对基因合成片段进行排序。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，德国)或SequiServe GmbH(Vaterstetten，德国)进行双链测序来确定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析以及序列数据管理
GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2版和Infomax的Vector NT1 Advance套件8.0版用于序列创建、绘图、分析、注释和说明。
表达载体
为了表达所述双特异性抗体，可以应用用于瞬时表达(例如，在HEK293细胞中)的表达载体，所述表达载体可以基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA组织或可以基于具有CMV启动子的基因组组织。
除了抗体表达盒，载体含有：
-复制起点，其允许这种载体在大肠杆菌中复制，和
-β-内酰胺酶基因，其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
抗体基因的转录单元由以下元件组成：
-5’端的独特限制位点
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA组织情况中，内含子A序列，
-源自人抗体基因的5’-未翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-编码相应抗体链的核酸，作为cDNA或具有基因组外显子-内含子组织，
-具有多腺苷酸化信号序列的3’未翻译区，和
-3’端的独特限制位点。
编码抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生，并通过已知的重组方法和技术通过连接相应的核酸区段(例如，使用相应载体中的独特限制位点)来装配。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。对于瞬时转染，通过从转化的大肠杆菌培养物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)制备载体，来制得较大量的载体。
对于所有构建体，使用杵进臼杂二聚化技术，在第一CH3结构域中具有典型的杵(T366W)取代，且在第二个CH3结构域中具有相应的臼取代(T366S、L368A和Y407V)(以及另外两个引入的半胱氨酸残基S354C/Y349'C)(包含在上述各自相应的重链(HC)序列中)。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术，如Current Protocols in Cell Biology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编辑)，John Wiley&Sons，Inc。
HEK293-F系统中的瞬时转染
通过瞬时表达产生双特异性抗体。因此，根据制造商的说明，使用HEK293-F系统(Invitrogen)，用相应载体进行转染。简而言之，将HEK293-F细胞(Invitrogen)在无血清FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen)中在摇瓶或搅拌发酵罐中悬浮生长，用相应表达载体和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以1.0*106个细胞/mL的密度接种在600mL中，并以120rpm，8％CO2温育。第二天，细胞以约1.5*106细胞/mL的细胞密度转染，使用大约42mL A)20mL包含600μg总载体DNA(1μg/mL)的Opti-MEM培养基(Invitrogen)和B)20ml补充了1.2mL 293fectin或fectin(2μl/毫升)的Opti-MEM培养基的混合物。根据葡萄糖消耗，在发酵过程中添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌抗体的上清液，从上清液中直接纯化抗体，或将上清液冷冻保存。
蛋白质测定
根据Pace等，Protein Science 4(1995)2411-1423，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定280nm处的光密度(OD)来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。
上清液中的抗体浓度测定
通过用蛋白A琼脂糖珠(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)免疫沉淀来估算细胞培养物上清液中的抗体和衍生物的浓度。因此，将60μL蛋白A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris缓冲液，pH 7.5，补充了150mM NaCl和1％Nonidet-P40)中洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清液应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠。在室温下孵育1小时后，将珠子在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤一次，用0.5mL 2×磷酸盐缓冲盐水(2×PBS，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)洗涤两次，并用0.5mL100mM柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)简短地洗涤四次。通过添加35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。将一半样品分别与/>样品还原剂混合或保持未还原，并在70℃下加热10分钟。随后，将5-30μl应用于4-12％/>Bis-TrisSDS-PAGE凝胶(Invitrogen)(对于非还原SDS-PAGE，使用MOPS缓冲液；以及对于还原的SDS-PAGE，使用含有/>抗氧化剂运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液)并用考马斯蓝染色。
通过亲和性HPLC色谱法定量测量了细胞培养物上清液中的抗体浓度。简而言之，在Agilent HPLC 1100系统上，在200mM KH2PO4，100mM柠檬酸钠，pH 7.4中将含有与蛋白A结合的抗体的细胞培养物上清液应用于Applied Biosystems Poros A/20柱上，用200mMNaCl，100mM柠檬酸，pH 2.5洗脱。通过UV吸光度和峰面积的积分来定量洗脱的抗体。将纯化的标准IgG1抗体用作标准。
或者，通过Sandwich-IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简而言之，用100μL/孔生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab')2<h-Fcγ>BI(Dianova)以0.1μg/mL包被StreptaWell高结合链霉亲和素A-96孔微量滴定板(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)，在室温下处理1小时，或替换地在4℃下处理过夜，并随后用200μL/孔PBS，0.05％Tween(PBST，Sigma)洗涤三次。此后，将100μL/孔的含有相应抗体的细胞培养物上清液在PBS(Sigma)中的稀释系列加入到孔中，并在室温下在振荡器上孵育1-2小时。将孔用200μL/孔PBST洗涤三次，并用100μlF(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)以0.1μg/mL作为检测抗体通过在室温下在振荡器上孵育1-2小时来检测结合的抗体。通过用200μL/孔PBST洗涤三次除去未结合的检测抗体。通过加入100μLABTS/孔然后孵育来检测结合的检测抗体。吸光度的测定在Tecan Fluor光谱仪上进行，测量波长为405nm(参考波长492nm)。
制备性抗体纯化
参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化抗体。简而言之，将抗体应用于蛋白A Sepharose柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，然后立即中和。通过大小排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在包含150mM NaCl(pH 6.0)的20mM组氨酸缓冲液中将聚集的蛋白质与单体抗体分离。合并单体抗体级分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(如果需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白质分析和分析性表征，例如，通过SDS-PAGE、大小排阻色谱(SEC)或质谱法。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。特别地，使用了10％或4-12％/>Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和/>MES(还原凝胶，含/>抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
CE-SDS
使用微流体Labchip技术(PerkinElmer，USA)通过CE-SDS分析了纯度和抗体完整性。因此，根据制造商的说明使用HT Protein Express Reagent试剂盒制备了用于CE-SDS分析的5μl抗体溶液，并使用HT Protein Express Chip在LabChip GXII系统上进行分析。使用LabChip GX软件分析了数据。
分析性大小排阻色谱
通过HPLC色谱法进行了用于测定抗体的聚集和寡聚状态的大小排阻色谱(SEC)。简而言之，在Ultimate系统(Thermo Fischer Scientific)上，将蛋白A纯化的抗体应用于30mM NaCl，50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH 7.5)中的Tosion TSKgel G3000SW柱，或在Dionex HPLC系统上应用于2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积的积分来定量洗脱的抗体。BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准。
质谱
本节描述了双特异性抗体的表征，重点在于它们的正确装配。通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)去糖基化完整抗体以及在特定情况下去糖基化/限制性LysC消化的抗体，分析了预期的一级结构。
用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F将抗体在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度进行去糖基化至多17小时。限制性LysC(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)消化在Tris缓冲液(pH8)中用100μg去糖基化的抗体进行，分别在室温下进行120小时，或在37℃下进行40分钟。在质谱分析之前，将样品在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上通过HPLC脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(BrukerDaltonik)上通过ESI-MS测定了总质量。
实施例1
表达和纯化
按照以上一般材料和方法部分中所述，产生了双特异性抗体。
通过蛋白A亲和性色谱和大小排阻色谱的组合，从上清液纯化了双特异性抗体。通过质谱表征所获产物的身份，并表征所获产物的分析特性，如通过CE-SDS表征纯度、单体含量和稳定性。
如一般方法部分中所述，通过去糖基化的完整抗体和去糖基化/纤溶酶消化的或替换地去糖基化/限制性LysC消化的抗体的电喷雾电离质谱(ESI-MS)，分析了预期的一级结构。
其他分析方法(例如热稳定性、质谱和功能评估)仅在蛋白A和SEC纯化后应用。
实施例2
通过ELISA体外测定与Aβ1-40纤维的结合
通过ELISA测定法测量了双特异性抗体与纤维状Aβ的结合。简而言之，以PBS中7μg/mL的Aβ(1-40)包被在Maxisorb平板上，在37℃下3天，以产生纤维状Aβ，然后在室温下干燥3小时。将板用PBS中的1％CroteinC和0.1％RSA(封闭缓冲液)在室温下封闭1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤一次。在封闭缓冲液中以高达100nM的浓度添加双特异性抗体或对照，并在4℃下孵育过夜。4个洗涤步骤后，通过在封闭缓冲液(1RT)中以1:10,000稀释添加抗人IgG-HRP(Jackson Immunoresearch)，然后进行6次洗涤并在TMB(Sigma)中孵育来检测构建体。在用1N HCl停止显色后，在450nm处读出吸光度。
实施例3
体外结合转铁蛋白受体的测定
通过对小鼠X63.AG8-563骨髓瘤细胞的FACS分析，测试双特异性抗体与鼠转铁蛋白受体的结合。如果Aβ抗体显示出与Ag8细胞非特异性结合的某种趋势，则可以通过与20倍过量的抗小鼠-TfR抗体共孵育来定量特异性结合。通过离心回收细胞，用PBS洗涤一次，并用1.5μM至10nM稀释系列的多肽融合物在冰上孵育5×104个细胞1.5小时，其中在100μLRPMI/10％FCS中加入或不加入200nM抗小鼠TfR抗体。用RPMI/10％FCS洗涤2次后，用RPMI/19％FCS中1:600稀释的偶联了藻红蛋白的山羊抗人IgG(Jackson Immunoresearch)在冰上孵育细胞1.5小时。再次洗涤细胞，重悬于RPMI/10％FCS中，并在FACS-Array仪器(Becton-Dickinson)上测量藻红蛋白荧光。
实施例4
针对人TfR-抗体相互作用的基于表面等离子体共振的结合测定
根据供应商的手册，使用标准胺偶联化学程序，在配备有用抗人Fab抗体(GEHealthcare，目录号28-9583-25)预处理的C1传感器芯片(GE Healthcare，目录号BR1005-35)的BIAcore B 4000(GE Healthcare)上进行了结合实验。
对于动力学测量，在25℃下在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水，0.05％吐温20中施加60秒的接触时间和10μL/min的流速来固定样品抗体。以递增的浓度应用重组His6标记的人转铁蛋白受体(R&D systems，目录号2474-TR-050)，并随时监测信号。记录了在30μL/min流速下150秒的结合时间和600秒的解离时间的平均时间跨度。使用1:1结合模型(Langmuir等温线)来拟合数据。
实施例5
使用如本文报道的方法产生的双特异性抗体通过间接免疫荧光从阿尔茨海默病患者的脑切片染色天然人β-淀粉样蛋白斑块
可以使用间接免疫荧光通过免疫组织化学分析，测试双特异性抗体染色天然人β-淀粉样斑块的能力。可以证明真正的人β-淀粉样斑块的特异性和敏感性染色。通过间接免疫荧光，标记从阿尔茨海默病阳性诊断的患者死后获得的颞叶皮质的未固定组织的低温恒温切片。使用两步孵育来检测结合的双特异性抗体，其通过与Alexa 555染料(MolecularProbes)缀合的亲和性纯化的山羊抗人(GAH555)IgG(H+L)来显示。对照可以包括不相关的人IgG1抗体(Sigma)和单独的二抗，所有这些都应该给出阴性结果。
实施例6
如本文报道的方法中产生的双特异性抗体在阿尔茨海默病小鼠模型中对体内β-淀粉样蛋白斑块的修饰
可以在APP/PS2双转基因小鼠(AD相关淀粉样变性的小鼠模型(Richards，J.Neuroscience，23(2003)8989-9003)中，针对体内免疫修饰β-淀粉样蛋白斑块的能力，测试双特异性抗体。这使得能够评估脑渗透程度以及与淀粉样蛋白β斑块的结合。与裸抗-Aβ单克隆抗体相比，融合多肽可以以不同剂量施用，并且在6天后，用磷酸盐缓冲盐水灌注动物，并将脑在干冰上冷冻并准备冷冻切片。
可以使用未固定的低温恒温切片评估结合β-淀粉样斑块的抗体的存在，其中采用单标记的间接免疫荧光，以15μg/ml浓度使用缀合Alexa555染料(GAH555)的山羊抗人IgG(H+L)(Molecular Probes)，在室温下1小时。淀粉样斑块的复染可以通过与浓度为0.5μg/ml的BAP-2(一种与Alexa 488缀合的针对Aβ的小鼠单克隆抗体)在室温下孵育1小时来完成。用荧光封片剂(S3023 Dako)封载玻片，并通过共聚焦激光显微镜进行成像。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。
实施例7
用包含用于域交换轻链的表达盒的表达载体转染表达双特异性抗DR5/FAP抗体的稳定细胞系
用CrossLC表达载体转染克隆0131细胞，所述载体包含一个用于具有结构域交换的轻链的表达盒。使用核转染(Amaxa)和0.6/1.2/2.4pM(总)质粒在化学成分确定的培养基中使用线性化DNA进行转染，得到2×3个细胞库，进行不同选择。
在化学成分确定的培养基中选择转染的克隆库，所述培养基补充了10mmol/L谷氨酰胺和250nM MTX(用于DHFR)加500nM和700nM潮霉素B。三周后，针对侧峰的减少和主峰的增加，通过CE-SDS和HIC分析了库。
基于这些结果，选择通过250nM MTX和700NM HygB选出的三个库(0314，0316，0318)进行有限稀释(LD)，分别接种3×384w平板，平板具有化学成分确定的培养基(补充了10mmol/L谷氨酰胺和250nmol/L浓度的MTX和700nM HygB)。
一周后，针对与DR5和FAP的结合，通过ELISA和DR5-FAP桥接ELISA测试了3×384w平板的上清液。挑选158个具有良好滴定度以及对两种抗原的高反应性的克隆，并通过24孔板扩增至6个孔，在4天的分批实验('种子培养物滴定度')中进行评估，其中评估对靶标的结合(通过ELISA和桥接ELISA)，评估生长、生产力和副产物特征(通过CE-SDS)。具有高达830μg/ml滴定度和可接受的产品质量的46个克隆进一步在Ambr15系统中在14天补料分批培养中表征，并分析了靶标结合、生长特性和副产物特征(通过CE-SDS和HIC)。选择20个克隆并通过质谱(MS)进一步测试。在摇瓶中的化学成分确定的培养基中培养选择的10个克隆并保藏为PSB。

Claims (12)

1.一种用于生产多特异性抗体的方法，所述抗体包含至少三个不同的多肽，所述方法包括以下步骤：
-在培养基中培养哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞已经通过以下方法产生：
用第一表达载体和两个或三个其他表达载体转染哺乳动物细胞，
其中首先用所述两个或三个其他表达载体转染哺乳动物细胞以提供表达所述抗体的哺乳动物细胞，随后表达所述抗体的该哺乳动物细胞用所述第一表达载体转染，
其中所述第一表达载体包含确切地一个编码多特异性抗体的多肽的核酸序列，并且其中所述两个或三个其他表达载体各自包含至少两个分别编码多特异性抗体的不同多肽链的核酸序列，
其中所述第一表达载体的确切地一个核酸序列是编码多特异性抗体的轻链多肽的核酸序列，
-从细胞或培养基回收多特异性抗体，
和由此产生多特异性抗体，
其中：
(i)所述多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含：
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换；
或
(ii)所述多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换；
或
(iii)所述多特异性抗体是三价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，
b)与第一轻链配对时特异性地结合第一抗原的全长抗体的第二重链，和
c)Fab片段，其特异性地结合第二抗原，通过肽衔接物与a)或b)的重链之一的C-末端融合，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
2.根据权利要求1的方法，其中多特异性抗体的多肽链中的两条包含结构域交换。
3.根据权利要求2的方法，其中所述第一表达载体的确切地一个核酸编码多特异性抗体的结构域交换的轻链多肽。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
5.根据权利要求2的方法，其中结构域交换是CH1-CL交换或VH-VL交换。
6.根据权利要求3的方法，其中结构域交换是CH1-CL交换或VH-VL交换。
7.根据权利要求1的方法，其中所述方法用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物。
8.根据权利要求3的方法，其中所述方法用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物。
9.根据权利要求4的方法，其中所述方法用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物。
10.根据权利要求1的方法，其中所述方法用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物，
其中多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含：
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH互换。
11.根据权利要求1的方法，其中所述方法用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物，
其中多特异性抗体是二价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，和
b)特异性地结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
12.根据权利要求1的方法，其中所述方法用于生产具有低的/降低的产物相关杂质的多特异性抗体制备物，
其中多特异性抗体是三价、双特异性抗体，其包含
a)特异性地结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，
b)与第一轻链配对时特异性地结合第一抗原的全长抗体的第二重链，和
c)Fab片段，其特异性地结合第二抗原，通过肽衔接物与a)或b)的重链之一的C-末端融合，其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1互换。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114014936A (zh) * 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
AU2020253023B2 (en) 2019-03-29 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of an FcRn expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
SG11202109642SA (en) * 2019-05-07 2021-10-28 Amgen Inc Vectors and expression systems for producing recombinant proteins
AU2020294880A1 (en) 2019-06-19 2021-12-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a protein expressing cell by targeted integration using Cre mRNA
JP7446342B2 (ja) 2019-06-19 2024-03-08 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって三価の抗体を発現する細胞を生成するための方法
MX2021015648A (es) 2019-06-19 2022-02-03 Hoffmann La Roche Metodo para la generacion de una celula que expresa un anticuerpo multiespecifico multivalente mediante integracion dirigida de multiples casetes de expresion en una organizacion definida.
CA3140318A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 Johannes Auer Method for the generation of a bivalent, bispecific antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
AU2020297940A1 (en) 2019-06-19 2021-12-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a multivalent, bispecific antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002079255A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
WO2015052230A1 (en) * 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
CN104619715A (zh) * 2012-09-14 2015-05-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同实体的分子的生产和选择方法及其用途
WO2017055540A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human a-beta/human transferrin receptor antibodies and methods of use

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4912038A (en) 1984-12-11 1990-03-27 California Biotechnology Inc. Recombinant DNA sequence encoding alveolar surfactant protein
DE3688418T2 (de) 1985-02-13 1993-08-26 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US5550036A (en) 1986-04-09 1996-08-27 Eli Lilly And Company Method for co-amplification of human protein C genes in human cells
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
AU2263288A (en) 1987-07-16 1989-02-13 Codon Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of obtaining the same
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0319206A3 (en) 1987-11-30 1990-04-18 Berlex Laboratories, Inc. Gene amplification
WO1989010959A1 (en) 1988-05-06 1989-11-16 Codon Supertransformants for high expression rates in eukaryotic cells
DD287531A5 (de) 1988-06-16 1991-02-28 Akademie Der Wissenschaften,De Verfahren zur herstellung von humanem wachstumshormon (sth) in tierischen zellen
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
GB9114468D0 (en) 1991-07-04 1991-08-21 Wellcome Found Antibody production
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
EP0569678A3 (en) 1992-03-13 1994-10-26 Yeda Res & Dev Double transfectants of MHC genes as cellular vaccines for immunoprevention of tumor metastasis.
US6482919B2 (en) * 1993-02-01 2002-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5420019A (en) 1993-02-02 1995-05-30 Xoma Corporation Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
AU7568094A (en) 1993-08-12 1995-03-14 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
WO1995017513A1 (en) 1993-12-23 1995-06-29 Novo Nordisk A/S Retransformation of filamentous fungi
US5719050A (en) 1993-12-24 1998-02-17 Eiken Chemical Co., Ltd. Animal cell culturing media containing N-acetyl-L-glutamic acid
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5726041A (en) 1995-08-30 1998-03-10 Gentest Corporation Method for detecting a receptor-ligand complex using a cytochrome P450 reporter gene
EP1482031B1 (en) 1996-08-30 2015-10-28 Life Technologies Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
AU4424597A (en) 1996-09-13 1998-04-02 Novo Nordisk Biotech, Inc. Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
CA2310987A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Eli Lilly And Company Tnf ligand family gene
WO1999047647A1 (en) 1998-03-18 1999-09-23 Pharmacopeia, Inc. Eukaryotic cells stably expressing genes from multiple transfected episomes
BR9905867A (pt) 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
TW570977B (en) 1998-12-07 2004-01-11 Li-Wei Hsu An expression system for producing recombinant human erythropoietin, method for purifying secreted human erythropoietin and uses thereof
DE19920712A1 (de) 1999-05-05 2000-11-09 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Proteines
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
AUPQ422399A0 (en) 1999-11-24 1999-12-16 University Of New South Wales, The Method of screening transformed or transfected cells
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
JP2002027581A (ja) 2000-07-13 2002-01-25 Npl:Kk スピーカ
DE10036491A1 (de) 2000-07-25 2002-02-07 Roche Diagnostics Gmbh Expression von Alkalischer Phosphatase in Hefe
US20030157641A1 (en) * 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
JP4723185B2 (ja) 2001-11-28 2011-07-13 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト 組換えポリペプチドの生産方法
AU2003213791A1 (en) 2002-03-05 2003-09-22 Vitra Bioscience, Inc. Multiplexed cell transfection using coded carriers
DE10213201A1 (de) 2002-03-25 2003-10-16 Roche Diagnostics Gmbh Erzeugung von schwach aktiven oder inaktiven Mutanten von Alkalischer Phosphatase und deren Expression in Hefe
US20050266425A1 (en) * 2003-12-31 2005-12-01 Vaccinex, Inc. Methods for producing and identifying multispecific antibodies
WO2005113770A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Institut Gustave Roussy Anti-rhoa and -rhoc sirnas and therapeutic compositions comprising them.
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
DE102005046225B4 (de) 2005-09-28 2012-01-05 Cellca Gmbh Verbessertes Zellkulturmedium
AR060070A1 (es) 2006-03-24 2008-05-21 Merck Patent Gmbh Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN103124743A (zh) 2009-12-29 2013-05-29 新兴产品开发西雅图有限公司 Ron结合构建物及其使用方法
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
US9834615B2 (en) 2010-08-16 2017-12-05 Novimmune Sa Methods for the generation of multispecific and multivalent antibodies
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
US10150968B2 (en) * 2011-08-19 2018-12-11 Alderbio Holdings Llc Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
EP3321286B1 (en) 2011-08-23 2021-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6541974B2 (ja) 2011-12-20 2019-07-10 メディミューン，エルエルシー 二重特異的抗体足場用改変ポリペプチド
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
EP2961771B1 (en) 2013-02-26 2020-01-01 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules specific to cd3 and cea
BR112015021921A2 (pt) 2013-03-15 2017-08-29 Merck Patent Gmbh Anticorpos biespecíficos tetravalente
JP6557664B2 (ja) 2014-01-06 2019-08-07 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価の血液脳関門シャトルモジュール
JP6744292B2 (ja) 2014-07-29 2020-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
RU2017116020A (ru) 2014-10-08 2018-11-12 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Комбинированная терапия биспецифичными антителами, специфичными к fap и dr5, и химиотерапевтические агенты
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
CN114014936A (zh) 2015-10-02 2022-02-08 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗人cd20/人转铁蛋白受体抗体及使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002079255A1 (en) * 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
CN104619715A (zh) * 2012-09-14 2015-05-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同实体的分子的生产和选择方法及其用途
WO2015052230A1 (en) * 2013-10-11 2015-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
WO2017055540A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human a-beta/human transferrin receptor antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells";Florian M Wurm;《Nature Biotechnology》;20041104;第22卷(第11期);第1393-1398页 *
"The use of CrossMAb technology for the generation of bi- and multispecific antibodies";Christian Klein 等;《mAbs》;20160711;第8卷(第6期);第1010-1020页 *
"双特异性抗体的结构设计及其装配工艺研究进展";黎晓维 等;《中国新药杂志》;20141031(第20期);第2430-2436页 *
"基因工程双特异性抗体构建模式研究进展";解志刚 等;《军事医学科学院院刊》;20040831(第4期);第375-378页 *

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