JP2019507748A - 免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 - Google Patents
免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019507748A JP2019507748A JP2018542263A JP2018542263A JP2019507748A JP 2019507748 A JP2019507748 A JP 2019507748A JP 2018542263 A JP2018542263 A JP 2018542263A JP 2018542263 A JP2018542263 A JP 2018542263A JP 2019507748 A JP2019507748 A JP 2019507748A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- polypeptide
- single variable
- immunoglobulin single
- variable domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 334
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 334
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 175
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 300
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 282
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 280
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 277
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 213
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 223
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 210
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 200
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 196
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 158
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 158
- 101000664600 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 3 Proteins 0.000 claims description 123
- 102100038798 Tripartite motif-containing protein 3 Human genes 0.000 claims description 123
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 61
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 54
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 51
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 45
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 22
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 18
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 18
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 18
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 16
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 11
- -1 Kar2p Proteins 0.000 claims description 6
- 102100040881 60S acidic ribosomal protein P0 Human genes 0.000 claims description 5
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 101000673456 Homo sapiens 60S acidic ribosomal protein P0 Proteins 0.000 claims 4
- 101000609814 Dictyostelium discoideum Protein disulfide-isomerase 1 Proteins 0.000 claims 2
- 101001114059 Homo sapiens Protein-arginine deiminase type-1 Proteins 0.000 claims 2
- 102100023222 Protein-arginine deiminase type-1 Human genes 0.000 claims 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 21
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 68
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 37
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 29
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 29
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 28
- 108010034467 ribosomal protein P0 Proteins 0.000 description 28
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 9
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 7
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 101100203200 Danio rerio shha gene Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 6
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 5
- 101100070241 Mus musculus Hcn2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100314583 Mus musculus Trim3 gene Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 4
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 4
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- 102100032919 Chromobox protein homolog 1 Human genes 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 101000797584 Homo sapiens Chromobox protein homolog 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238154 Carcinus maenas Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 2
- 101000616562 Danio rerio Sonic hedgehog protein A Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710141833 Peroxisomal biogenesis factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000616493 Xenopus laevis Sonic hedgehog protein Proteins 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N chlorothalonil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(C#N)=C(Cl)C(C#N)=C1Cl CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-acetamido-3-methylbutanoyl]amino]-5-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[2-[[(2s)-1-amino-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H](CCCC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(N)=O)CC1=CC=CC=C1 BZSALXKCVOJCJJ-IPEMHBBOSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCQMOSJJIVCPJO-UHFFFAOYSA-N 2-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)ethoxymethylphosphonic acid Chemical compound CC1=CN(CCOCP(O)(O)=O)C(=O)NC1=O RCQMOSJJIVCPJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108050002744 60S acidic ribosomal protein P0 Proteins 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100407148 Arabidopsis thaliana PBL3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100083253 Caenorhabditis elegans pho-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000062995 Cassia occidentalis Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101100234413 Dictyostelium discoideum kif9 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 101000893906 Fowl adenovirus A serotype 1 (strain CELO / Phelps) Protein GAM-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000799554 Homo sapiens Protein AATF Proteins 0.000 description 1
- 108050008546 Hyperglycemic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000376403 Hyphopichia Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241001099157 Komagataella Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108700010674 N-acetylVal-Nle(7,8)- allatotropin (5-13) Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- 241000982698 Prorodonopsis coli Species 0.000 description 1
- 102100034180 Protein AATF Human genes 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 240000007591 Tilia tomentosa Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003144 genetic modification method Methods 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=CC(O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 102000028557 immunoglobulin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009323 immunoglobulin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- MVZXTUSAYBWAAM-UHFFFAOYSA-N iron;sulfuric acid Chemical compound [Fe].OS(O)(=O)=O MVZXTUSAYBWAAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150083025 kin-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- KNLQKHUBPCXPQD-UHFFFAOYSA-N manganese;sulfuric acid Chemical compound [Mn].OS(O)(=O)=O KNLQKHUBPCXPQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 108010067930 structure-specific endonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/35—Valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
収量の増加をもたらす、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドの製造法が提供される。該方法は、宿主内の１つ以上の補助タンパク質の同時増強に基づく。
Description
発明の分野
本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの製造法に関する。より具体的には、本発明は、増加した収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメインを生成する改善された方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法に使用するための核酸、遺伝子構築物及び宿主細胞、並びに、本発明の方法によって得ることのできる免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
本発明は、免疫グロブリン単一可変ドメインの製造法に関する。より具体的には、本発明は、増加した収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメインを生成する改善された方法を提供する。本発明はさらに、本発明の方法に使用するための核酸、遺伝子構築物及び宿主細胞、並びに、本発明の方法によって得ることのできる免疫グロブリン単一可変ドメインを提供する。
背景技術
治療的適用のために、抗体又は抗体断片の製品の品質は非常に高くなければならない。これにより、生物学的治療剤の生産プロセスに対して高い要求が課される。これらの治療用化合物の生産費用は、生産プロセス中に遭遇する困難によって強い影響を受ける。低収量又は均一性の欠如は、生産プロセスの経済に影響を及ぼし、したがって、全体的に治療薬の費用に影響を及ぼすだろう。
治療的適用のために、抗体又は抗体断片の製品の品質は非常に高くなければならない。これにより、生物学的治療剤の生産プロセスに対して高い要求が課される。これらの治療用化合物の生産費用は、生産プロセス中に遭遇する困難によって強い影響を受ける。低収量又は均一性の欠如は、生産プロセスの経済に影響を及ぼし、したがって、全体的に治療薬の費用に影響を及ぼすだろう。
機能的な製品の適切な収量を得る限界が、インビトロにおける翻訳、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、並びに昆虫細胞におけるバキュロウイルス系をはじめとする広範な発現系における慣用的な免疫グロブリン及びそれらの断片において報告されている。とりわけ、抗体発現における支障は、軽鎖の不十分な供給、小胞体（ＥＲ）における不適切なプロセシング及びフォールディング、並びに重鎖断片の細胞内蓄積であるようである（Lange et al. 2001, J. Immunol. Methods 255: 103; Gasser et al. 2006, Biotechnol Bioeng. 94: 353; Gach et al. 2007, J. Biotechnol. 128: 735; Jenkins et al. 2009, Biotechnol. Appl. Biochem. 53: 73）。
タンパク質のフォールディング及び分泌経路への介入が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）などの組換えタンパク質の発現及び品質を改善させるための様々な戦略の１つとして記載されている。しかしながら、ＥＲ分泌機構の１つ以上の成分の過剰発現により、生産性の向上に関して混合した結果がもたらされた。バイオ医薬品の生産において一貫して高い収量を達成するには多くの課題が依然として存在している（Jenkins et al. 2009, Biotechnol. Appl. Biochem. 53: 73）。
ピキア・パストリスは、異種タンパク質の生成のための宿主として開発された。この宿主は高度に効率的な発現系として知られているが、特に複雑なタンパク質の生成は、かなり低い成功率を示すことが判明した。Ｐ．パストリスでは、免疫グロブリン結合タンパク質（ＢｉＰ）の共過剰発現により、ｓｃＦｖ（Ａ３３ｓｃＦｖ）の分泌レベルは約３倍増加した。これに対し、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）の共過剰発現は、Ａ３３ｓｃＦｖの分泌に対して明らかな効果を全く及ぼさなかった。Ｐ．パストリスにおけるＢｉＰ及びＰＤＩ１の共過剰発現は、Ａ３３ｓｃＦｖの分泌を増加させず、タンパク質レベルは対照株と依然として同じであった（Damasceno et al. 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74: 381）。対照株と比較して、Ｐ．パストリスにおける２Ｆ５ Ｆａｂ断片の生産性は、ＢＦＲ２との共過剰発現の場合の１．２倍から、ＳＳＥ１又はＫＩＮ２を過剰発現させた場合の２．３倍まで改善させることができた（Gasser et al. 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499）。塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）転写因子ＨＡＣ１の過剰発現は、Ｐ．パストリスにおけるＭａｂ ２Ｆ５ Ｆａｂ断片の分泌に対して僅かな効果しか及ぼさなかったが（１．３倍）、ＰＤＩ１の過剰発現は、Ｆａｂレベルの１．９倍の増加を可能とした（Gasser et al. 2006, Biotechnol Bioeng. 94: 353）。著者は、十分な軽鎖の供給及び鎖間ジスルフィド結合の形成が、Ｆａｂの会合及びその後の分泌に対する主要な律速因子として認められ得ると結論する。
従来の４本鎖抗体又はその断片（Ｆａｂ及びｓｃＦｖを含む）で観察されるこれらの困難とは対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．パストリスのような宿主から十分な速度及びレベルで容易に発現及び分泌されることが知られている。免疫グロブリン単一可変ドメインは鎖間ジスルフィド架橋を有さず、単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合部位の形成によって特徴付けられ、これは抗原の認識のためにさらなるドメインとの相互作用（例えば、ＶＨ／ＶＬ相互作用の形態で）を必要としない。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物宿主における、免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの具体例としてのナノボディの生成が数多く記載されている（例えば、Ghahroudi et al. 1997, FEBS Letters 414: 521-526; Muyldermans 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302; Vranken et al. 2002, Biochemistry 41: 8570-8579を参照）。
Ｐ．パストリスなどの低級真核生物宿主におけるナノボディの生成は、Frenken et al. 2000（J. Biotechnol. 78: 11-21）、国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第２０１０／１２５１８７号、国際公開公報第２０１２／０５６０００号及び国際公開公報第２０１２／１５２８２３号に記載されている。
組換えラクダ単一可変ドメインは、条件を全く最適化することなく、振盪培養フラスコ中で増殖させたＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた場合に５〜１０mg/lのレベルで日常的に得られる（Ghahroudi et al. 1997）。他の発現系を用いても、より高い収量のＶＨＨ発現を得ることが可能でさえある。９．３mg/l/ＯＤ６６０又は振盪フラスコ中のサッカロマイセス酵母培養液１リットルあたり約２５０mgの分泌タンパク質という生成レベルがFrenken et al. 2000によって記載されている。より近年には、Ｐ．パストリスにおける発現時に１リットルあたり１ｇを超えるナノボディの収量が記載されている（国際公開公報第２０１０／１３９８０８号、国際公開公報第２０１２／１５２８２３号）。
国際公開公報第２０１０／１２５１８７号は、酵母（例えばＰ．パストリス）における単一可変ドメインを生成するための方法を記載している。国際公開公報第２０１０／１２５１８７号の方法は、単一可変ドメインにおけるジスルフィド架橋の形成を促進する条件を適用している。提案されている条件の１つは、チオールイソメラーゼ（例えばＰＤＩ１）の発現の増強である。
完全に機能的な免疫グロブリン単一可変ドメインは、例えばＥ．ｃｏｌｉ又は酵母において十分な速度及びレベルで容易に生成されるという事実は、従来の免疫グロブリンを上回る、この免疫グロブリンフォーマットの重要な利点を示す。
発明の要約
ＶＨＨ及びナノボディは、その発現のために当技術分野において記載されている発現系を使用して発現され得るが（国際公開公報第１９９４／２５５９１号; Ghahroudi et al. 1997, FEBS Letters 414: 521-526; Frenken et al. 2000, J. Biotechnol. 78: 11-21; Muyldermans 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302; Vranken et al. 2002, Biochemistry 41: 8570-8579; 国際公開公報第２０１０／１２５１８７号；国際公開公報第２０１２／０５６０００号；国際公開公報第２０１２／１５２８２３号及びAblynx N.V.による他の特許出願）、本発明者らは、場合によっては（例えば、多価ＶＨＨ及びナノボディ、並びに／又は、１つを超えるジスルフィド架橋を有するＶＨＨ及びナノボディ）、ＶＨＨ及びナノボディの発現はより難しく、予想されるよりはるかに低い発現レベル及び／又は収量がもたらされることを発見した。例えば、本発明者らは、いくつかの治療用ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの生成についての問題を意外にも観察した。Ｐ．パストリスにおけるこれらの免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時に、本発明者らは、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインを、ＶＨＨ２型及びＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメインで通常得られる収量と比較してはるかにより低い収量で得た。免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて確立されているものとは対照的に、Ｐ．パストリスにおける、例えばＶＨＨ１型の免疫グロブリン単一可変ドメインなどの特定の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現により、多量の機能的な産物は得られなかった。
ＶＨＨ及びナノボディは、その発現のために当技術分野において記載されている発現系を使用して発現され得るが（国際公開公報第１９９４／２５５９１号; Ghahroudi et al. 1997, FEBS Letters 414: 521-526; Frenken et al. 2000, J. Biotechnol. 78: 11-21; Muyldermans 2001, J. Biotechnol. 74: 277-302; Vranken et al. 2002, Biochemistry 41: 8570-8579; 国際公開公報第２０１０／１２５１８７号；国際公開公報第２０１２／０５６０００号；国際公開公報第２０１２／１５２８２３号及びAblynx N.V.による他の特許出願）、本発明者らは、場合によっては（例えば、多価ＶＨＨ及びナノボディ、並びに／又は、１つを超えるジスルフィド架橋を有するＶＨＨ及びナノボディ）、ＶＨＨ及びナノボディの発現はより難しく、予想されるよりはるかに低い発現レベル及び／又は収量がもたらされることを発見した。例えば、本発明者らは、いくつかの治療用ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの生成についての問題を意外にも観察した。Ｐ．パストリスにおけるこれらの免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時に、本発明者らは、これらの免疫グロブリン単一可変ドメインを、ＶＨＨ２型及びＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメインで通常得られる収量と比較してはるかにより低い収量で得た。免疫グロブリン単一可変ドメインにおいて確立されているものとは対照的に、Ｐ．パストリスにおける、例えばＶＨＨ１型の免疫グロブリン単一可変ドメインなどの特定の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現により、多量の機能的な産物は得られなかった。
本発明者らは、本明細書においてさらに示されているような、この問題に対する解決法を提供した。さらに、本発明者らは、免疫グロブリン単一可変ドメインの収量を改善するために提案された解決法は一般的に適用可能であり、すなわち、ＶＨＨ１型の免疫グロブリン単一可変ドメインの収量を改善させるためだけでなく、他の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ２型及びＶＨＨ３型の免疫グロブリン単一可変ドメインを改善させるためにも適用可能であることを観察した。
したがって、１つの態様では、本発明は、Ｐ．パストリスにおける特定の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時の低い収量の観察に関する。
本発明のさらなる態様では、得られる産物の収量が増加する、免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法が提供される。これらの方法は本明細書において「本発明の方法（群）」とも称される。したがって、本発明はまた、この意外な問題を克服する免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法を提供する。より特定すると、本発明者らは（補助タンパク質のライブラリーをスクリーニングすることによって）、ピキア宿主における特定の補助タンパク質（ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）、特にＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４））の発現の増強により、該ピキア宿主において発現させた場合に、免疫グロブリン単一可変ドメインの収量が増加したことを発見した。２倍超から１０倍超（またさらにそれ以上）の収量の増加が得られた。
１つの態様では、それ故、本発明は、ピキア（例えばＰ．パストリス）における免疫グロブリン単一可変ドメインの発現及び／又は生成収量を増加させるための方法に関する。本発明の方法では、免疫グロブリン単一可変ドメインが発現されるが、同時にＨＡＣ１スプライシング型の発現も増強される。
本発明の方法に使用される免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチド（「本発明のポリペプチド」とも称される）の一部を形成し得、これは、１つ以上（すなわち少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ場合により１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て場合により、１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）をさらに含み得る。
したがって、本発明は、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド（本明細書では「本発明のポリペプチド」と称される）を生成するための方法を提供し、該方法は、ピキア宿主において、本発明のポリペプチドを発現させる工程、及び該ピキア宿主においてＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現を増強させる工程を含む。本発明の方法はさらに、本発明のポリペプチドを単離及び／又は精製する工程を含み得る。
本発明の方法は、ピキア（例えばＰ．パストリス）において容易に発現可能ではないか又は標準的な条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させた場合に非常に低い収量で発現され、そのために、ピキア（例えばＰ．パストリス）において本発明のこれらの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを発現させると、十分な量の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを得ることができない、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドに特に適している。したがって、１つの態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において標準的なピキア発現条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させると、０．５ｇ/ｌ又はそれ以下、例えば０．４ｇ/Ｌ、０．３ｇ/Ｌ、０．２ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ、０．０５ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ、又はさらにはそれ以下の収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドから選択される。別の態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）においてピキア発現条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させた場合に得られる収量が、該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸のコピー数と逆相関（本明細書においてさらに定義されているような）を示す、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドから選択される。
本発明の具体的な態様では、本発明の方法は、Ｐ．パストリスなどのピキアにおいて容易に発現可能である本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドに特に適している。したがって、１つの態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ピキア宿主（例えばＰ．パストリス）においてピキア発現条件（本明細書においてさらに定義されているような）下で発現させると、０．５ｇ/ｌ又はそれ以上、例えば１ｇ/Ｌ、２ｇ/Ｌ、３ｇ/Ｌ、４ｇ/Ｌ、５ｇ/Ｌ、６ｇ/Ｌ、又はさらにはそれより高い収量が得られる、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドから選択される。
上記の方法では、本発明のポリペプチドは、２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得る。このようなポリペプチドはまた、多価ポリペプチドとも称される。したがって、具体的な態様では、本発明の方法によって発現しようとする本発明のポリペプチドは、多価ポリペプチドである。
あるいは、本発明の方法によって発現されるポリペプチドは、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得る。このようなポリペプチドは本明細書において、一価ポリペプチドとも称されるだろう。したがって、別の具体的な態様では、本発明の方法によって発現しようとする本発明のポリペプチドは、一価ポリペプチドである。
上記の方法では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）は、軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインである免疫グロブリン単一可変ドメイン、より具体的には従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン、特にドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又は、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むがこれに限定されない）、好ましくはナノボディであり得る（がこれらに限定されない）。
好ましい態様では、本発明の方法において発現されるナノボディは、ＶＨＨ配列（ＶＨＨ）、（部分的に）ヒト化されたＶＨＨ配列（ヒト化ＶＨＨ）、ラクダ化重鎖可変ドメイン（ラクダ化ＶＨ）、又は親和性成熟などの技術によって得られたナノボディである。
本発明の別の具体的な態様では、本発明の方法において発現される免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）は、少なくとも２つのジスルフィド架橋を含む。別の具体的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群に属する。
別の態様では、免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）は、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群に属さないが、別の群の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ２、ＶＨＨ３、又は任意の他の型の免疫グロブリン単一可変ドメインに属する。
さらに別の具体的な態様では、本発明の方法において発現される免疫グロブリン単一可変ドメイン（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）、例えば、国際公開公報第２０１２／０４２０２６号及び国際公開公報第２０１３／０４５７０７号に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する。したがって、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ここでの該免疫グロブリン単一可変ドメインは２つのジスルフィド架橋を含む）を含む本発明のポリペプチドは、本発明の具体的であるが非限定的な態様を形成する。本発明の方法に使用するための特定のナノボディは、配列番号４９である。
好ましい態様では、本発明の方法において発現される１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（群）（本発明のポリペプチドに存在する可能性がある）、例えば、Ablynx NVの米国仮出願ＵＳ６２／２５４，３７５号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７７５９５号も参照）に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＴＮＦに特異的に結合する。
したがって、ＴＮＦに特異的に結合する１つ以上の（少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含む本発明のポリペプチドは、本発明の具体的かつ非限定的な態様を形成する。
具体的な態様では、本発明の方法において発現される本発明のポリペプチドは、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなる。このようなポリペプチドは本明細書において、一価ポリペプチドとも称されるだろう。それ故、好ましい態様では、本発明の方法において、該ポリペプチドは一価ポリペプチドである。
１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるこのような一価ポリペプチドは、少なくとも２つのジスルフィド架橋を含み得る。したがって、ＴＮＦに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインに属する。
あるいは、免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つのジスルフィド架橋を含む。したがって、好ましい態様では、ＴＮＦに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群には属さないが、別の群の免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨ２、ＶＨＨ３、又は任意の他の型の免疫グロブリン単一可変ドメインに属する。
好ましい態様では、本発明の方法において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になり、ＣＤＲ１は配列番号５８であり、ＣＤＲ２は配列番号６０であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である。
本発明の方法に使用するための特定のナノボディは、配列番号５５及び５６からなる群より選択される。
１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなる本発明のポリペプチドはさらに、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された、１つ以上の他の残基又は結合単位を含み得る。
１つの態様では、前記の１つ以上の他の残基は、本発明のポリペプチド（本明細書においてさらに記載されているような）に対する血清中にすでに存在している抗体（いわゆる「既存抗体」）の結合を妨げるか又は減少させるのに有効であり得る。
別の態様では、前記の１つ以上の他の残基又は結合単位はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸配列、又はナノボディからなる群より選択され得る。２つ以上の結合単位を含むか又は実質的にからなるポリペプチドも、多価構築物と称される。
本発明の具体的な態様では、本発明の方法において発現される１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドは、多価構築物である。
別の具体的な態様では、本発明のポリペプチドは、二価、三価、又は四価ポリペプチドである。
本発明の特定の態様では、前記の１つ以上の他の結合単位は、前記の１つ以上の結合単位を含まないポリペプチドと比較して延長された半減期を有する本発明のポリペプチドを提供し得る。以下に限定されないが、延長された半減期を有するポリペプチドを提供する前記の１つ以上の他の結合単位は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合することのできる結合単位からなる群より選択され得る。
本発明の方法において、ＨＡＣ１スプライシング型の発現は、ピキア宿主への、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸（群）の導入によって増強され得る。別の態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現は、ピキア宿主への、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を制御している１つ以上の強力なプロモーター（群）の導入によって増強され得る。
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、同じ遺伝子構築物から発現されてもよい。本発明のこの特定の態様では、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写は、同じプロモーターによって又は異なるプロモーターによって制御され得る。ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の下流の遺伝子構築物上に位置し得る。代替的には、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の下流の遺伝子構築物上に位置し得る。
本発明の別の態様では、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、異なる遺伝子構築物から発現されてもよい。本発明のこの特定の態様では、異なる遺伝子構築物からの、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写は、同じでも異なっていてもよい２つの別々のプロモーターによって制御され得る。
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか若しくは実質的にからなるポリペプチド及び／又はＨＡＣ１スプライシング型タンパク質はまた、染色体から発現され得る。この特定の態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現は、ピキア宿主の染色体への強力なプロモーターの導入によって増強され得る。代替的には、強力なプロモーターによって制御されるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸（群）を、ピキア宿主の染色体に導入してもよい。また、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を、ピキア宿主の染色体に導入してもよい。
本発明の１つの態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）の数は１である。本発明の別の態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）の数は２以上である。
別の態様では、本発明はまた、本発明のポリペプチド（又はその適切な断片）をコードしかつＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸に関する。このような核酸は本明細書において「本発明の核酸」とも称され、例えば、本明細書にさらに記載のような遺伝子構築物の形態であり得る。
したがって、本発明はまた、遺伝子構築物の形態である本発明の核酸に関する。このような遺伝子構築物は本明細書において、「本発明の遺伝子構築物」とも称され、したがって、本発明のポリペプチドをコードしている核酸及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸を含む。具体的な態様では、本発明のこのような遺伝子構築物において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の下流に位置する。別の具体的な態様では、本発明のこのような遺伝子構築物において、本発明のポリペプチドをコードしている核酸は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の下流に位置する。本発明の遺伝子構築物において、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の発現及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現は、同じプロモーターによって又は異なるプロモーターによって制御され得る。該プロモーターは、構成性プロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。
本発明の１つの態様では、本発明のポリペプチドをコードしている核酸のコピー数は１である。本発明の別の態様では、本発明のポリペプチドをコードしている核酸のコピー数は２以上である。
本発明の１つの態様では、補助タンパク質の数は１であり、補助タンパク質はＨＡＣ１スプライシング型である。本発明の別の態様では、１つ以上の補助タンパク質の発現は増強されている。さらに別の本発明の態様では、追加の補助タンパク質（群）は、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、及びＲＰＰ０から選択される。さらに別の本発明の態様では、補助タンパク質の数は２である。さらに別の本発明の態様では、補助タンパク質の数は２つを超え、例えば３つ以上である。さらに別の態様では、２つ以上の補助タンパク質は、以下の補助タンパク質の組合せから選択される：
−ＰＤＩ１及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；並びに
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
−ＰＤＩ１及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；並びに
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
好ましい態様では、以下の補助タンパク質の発現が増強される：
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；又は
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；又は
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
本発明の好ましい態様では、補助タンパク質は、ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）である。
別の好ましい態様では、追加の補助タンパク質は、ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）、及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）から選択される。
別の好ましい態様では、２つ以上の補助タンパク質は、以下の補助タンパク質の組合せから選択される：
−ＰＤＩ１（配列番号５）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＰＤＩ１（配列番号５）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）。
−ＰＤＩ１（配列番号５）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−ＰＤＩ１（配列番号５）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨａｃ１スプライシング型（配列番号１４）。
別の態様では、本発明は、本明細書では「本発明のピキア宿主」とも称されるピキア宿主への、本発明の核酸及び遺伝子構築物の導入に関する。プラスミド又はベクターによるピキア宿主の形質転換に加えて、ピキア宿主の染色体の形質転換も、本発明によって包含される。強力な（誘導性）プロモーター（天然補助タンパク質の天然プロモーターの代わりに）を、ピキア宿主の染色体に導入しても；又は、別の（強力な）プロモーターの制御下にある別のコピーの補助タンパク質遺伝子配列を染色体に導入してもよい。
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを発現する（又は適切な環境下で発現することができる）（ここでＨＡＣ１スプライシング型の発現は増強されている）；並びに／あるいは、本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物を含有している、ピキア宿主に関する。
好ましい態様では、ピキア宿主はピキア・パストリスである。
別の好ましい態様では、ピキア・パストリス株は、ピキア・パストリスＸ３３及びピキア・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０から選択される。
本発明はさらに、本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、及び本発明のピキア宿主の調製法；並びに、免疫グロブリン単一可変ドメイン及びそれを含むポリペプチドの生成のための、前記の本発明の核酸、本発明の遺伝子構築物、及び本発明のピキア宿主の使用に関する。
本発明はさらに、本明細書に示されたいずれかの方法によって得ることのできるポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメイン、このようなポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインを含む医薬組成物及び他の組成物、並びに、該ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインの治療的使用、あるいは、該ポリペプチド及び／又は免疫グロブリン単一可変ドメインの使用を含む処置法に関する。
発明の詳細な説明
定義
特に示されない限り又は定義されない限り、使用される全ての用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al. 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Ausubel et al. 1987 (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York)、Lewin 1985 (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)、Old et al. 1981 (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Ed., University of California Press, Berkeley, CA)、Roitt et al. 2001 (Immunology, 6th Ed., Mosby/Elsevier, Edinburgh)、Roitt et al. 2001（Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed., Blackwell Publishing, UK）、及びJaneway et al. 2005 (Immunobiology, 6th Ed., Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York)、並びに、本明細書に引用されている一般的な背景技術を参照する。
定義
特に示されない限り又は定義されない限り、使用される全ての用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、これは当業者には明らかであろう。例えば、標準的なハンドブック、例えばSambrook et al. 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Ausubel et al. 1987 (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York)、Lewin 1985 (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)、Old et al. 1981 (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd Ed., University of California Press, Berkeley, CA)、Roitt et al. 2001 (Immunology, 6th Ed., Mosby/Elsevier, Edinburgh)、Roitt et al. 2001（Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed., Blackwell Publishing, UK）、及びJaneway et al. 2005 (Immunobiology, 6th Ed., Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York)、並びに、本明細書に引用されている一般的な背景技術を参照する。
特記されない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術、及び操作を、当業者には明らかであるようなそれ自体公知の方法で実施することができそして実施されている。例えば、ここでも、標準的なハンドブック及び本明細書に記載された一般的な背景技術、並びに、そこに引用されているさらなる文献；並びに、例えば、親和性成熟などのタンパク質工学のための技術、及び免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善させるための他の技術を記載した、以下のレビューPresta 2006 (Adv. Drug Deliv. Rev. 58: 640)、Levin and Weiss 2006 (Mol. Biosyst. 2: 49)、Irving et al. 2001 (J. Immunol. Methods 248: 31)、Schmitz et al. 2000 (Placenta 21 Suppl. A: S106)、Gonzales et al. 2005（Tumour Biol. 26: 31）を参照する。
ヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列が、別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列をそれぞれ「含む」と言われるか、又は、別のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列「から実質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列が、それぞれ最初に記載されたヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列に取り込まれていることを意味し得るが、通常、これは一般的に、最初に記載されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がその配列内に、最初に記載された配列がどのように実際に作製されたか又は得られたかに関係なく（これは例えば本明細書に記載の任意の適切な方法により得る）、後者の配列とそれぞれ同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有する、それぞれヌクレオチド残基鎖又はアミノ酸残基鎖を含むことを意味する。非限定的な例を用いて、本発明のポリペプチドが免疫グロブリン単一可変ドメインを含むと言われる場合、これは、免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が本発明のポリペプチド配列に取り込まれたことを意味し得るが、通常、これは一般的に、本発明のポリペプチドがその配列内に、前記の本発明のポリペプチドがどのように作製されたか又は得られたかに関係なく、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含有していることを意味する。また、核酸配列又はヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に記載された核酸配列又はヌクレオチド配列は好ましくは、それが発現産物（例えばポリペプチド）へと発現される場合、後者のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が、該発現産物の一部を形成する（換言すれば、後者のヌクレオチド配列が、最初に記載されたより大きな核酸配列又はヌクレオチド配列と同じ読み枠内にある）ようなものである。
「実質的にからなる」によって、本発明の方法に使用される免疫グロブリン単一可変ドメインが本発明のポリペプチドと正に同じであるか、又は、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ末端、カルボキシ末端、若しくはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加された、少数のアミノ酸残基、例えば１〜２０個のアミノ酸残基、例えば１〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜６個のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５、若しくは６個のアミノ酸残基を有する、本発明のポリペプチドに相当することを意味する。
核酸又はアミノ酸は、例えば、それが得られた反応培地又は培養培地と比較して、それが、通常、前記供給源又は培地中において伴う少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分若しくは巨大分子、又は少なくとも１つの混入物、不純物、若しくはマイナーな成分などから分離されている場合に、「（実質的に）単離された（形態）（に）」あると判断される。特に、核酸又はアミノ酸は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特定すると少なくとも１００倍、及び最大で１０００倍、又はそれ以上精製されている場合に「（実質的に）単離されている」と判断される。「（実質的に）単離された形態に」ある核酸又はアミノ酸は好ましくは、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して決定したところ、実質的に均一である。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／若しくはポリペプチド又は補助タンパク質などのポリペプチド「（の）発現」又は「を発現している」という用語は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物（すなわち、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／若しくはポリペプチド又は補助タンパク質）の合成に使用されるプロセスである。補助タンパク質又はポリペプチド、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドなどが、核酸、遺伝子構築物、又は染色体「から発現された」と言う場合、それは、核酸、遺伝子構築物、又は染色体からの情報が機能的遺伝子産物（すなわち、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／若しくはポリペプチド又は補助タンパク質）の合成に使用されるプロセスを通して合成される。タンパク質が「共発現」されたと言われる場合、該タンパク質は同時に発現されている。遺伝子の「発現を増強させること」は、遺伝子産物（例えば補助タンパク質）の産生が、遺伝子発現の増強を伴わない遺伝子産物の産生と比較して増加していることを意味する。さらに説明されているように、特定の遺伝子の発現は、例えば強力なプロモーターなどの適切な制御配列の使用、及び／又は例えばそれぞれの遺伝子のコピー数を増加させることによって遺伝子の量を増加させることを含む、様々な手段によって増強させることができる。
本発明において使用される「収量」という用語は、ピキア宿主において発現させた場合に機能的な形態で産生される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの量に関する。収量は、培地１Ｌ（リットル）あたりの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドのｇ（グラム）として表現される。
免疫グロブリン単一可変ドメイン
特記しない限り、「免疫グロブリン配列」という用語は、本明細書において重鎖抗体を指すために使用されるものであれ又は従来の４本鎖抗体を指すために使用されるものであれ、完全サイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、そのドメイン、又はその断片（抗原結合ドメイン又は断片、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインを含むがこれらに限定されない）の双方を含む一般的な用語として使用される。さらに、本明細書において（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語において）使用される「配列」という用語は、脈絡がさらに限定された解釈が必要としない限り、関連したアミノ酸配列、並びにそれをコードしている核酸配列又はヌクレオチド配列の双方を含むと一般的に理解されるべきである。
特記しない限り、「免疫グロブリン配列」という用語は、本明細書において重鎖抗体を指すために使用されるものであれ又は従来の４本鎖抗体を指すために使用されるものであれ、完全サイズの抗体、その個々の鎖、並びに、その全ての部分、そのドメイン、又はその断片（抗原結合ドメイン又は断片、例えばそれぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインを含むがこれらに限定されない）の双方を含む一般的な用語として使用される。さらに、本明細書において（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語において）使用される「配列」という用語は、脈絡がさらに限定された解釈が必要としない限り、関連したアミノ酸配列、並びにそれをコードしている核酸配列又はヌクレオチド配列の双方を含むと一般的に理解されるべきである。
「単一可変ドメイン」と互換的に使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在しかつそれによって形成されている、分子であると定義する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成している、「従来の」免疫グロブリン又はそれらの断片（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖなど）とは異なっている。典型的には、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成している。この場合、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与し、すなわち、合計で６つのＣＤＲが、抗原結合部位の形成に関与するだろう。
これに対し、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。
したがって、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」及び「単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位の形成のために少なくとも２つの可変ドメインの相互作用を必要とする従来の免疫グロブリン又はそれらの断片を含まない。しかしながら、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインによって形成されている、従来の免疫グロブリンの断片は含む。
一般的に、単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になるアミノ酸；又は、このようなアミノ酸の任意の適切な断片（よってこれは、通常、ＣＤＲの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基の少なくともいくつかを含有しているだろう）であろう。このような単一可変ドメイン及び断片は最も好ましくは、それらが免疫グロブリンフォールドを含むか又は適切な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができるようなものである。したがって、単一可変ドメインは例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその適切な断片；又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列又はＶＨＨ配列）若しくはその適切な断片を；それが単一の抗原結合単位（すなわち、機能的抗原結合ドメインを形成するために、例えばＶＨ／ＶＬの相互作用を通して、別の可変ドメインと相互作用する必要がある例えば従来の抗体及びｓｃＦｖ断片に存在する可変ドメインの場合のように、単一抗原結合ドメインが、機能的抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がないような、単一可変ドメインから実質的になる機能的抗原結合単位）を形成することができる限りにおいて含み得る。
本発明の１つの実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり；より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
例えば、単一可変ドメイン又は免疫グロブリン単一可変ドメイン（又は、免疫グロブリン単一可変ドメインとして使用するのに適したアミノ酸）は、（単一）ドメイン抗体（又は、（単一）ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又は、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸）、又はナノボディ（本明細書において定義されているようなものであり、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、又はそのいずれか１つの任意の適切な断片であり得る。（単一）ドメイン抗体の一般的な説明のために、本明細書に引用されている先行技術、並びに、欧州特許第０３６８６８４号も参照する。「ｄＡｂ」という用語については、例えば、Ward et al. 1989 (Nature 341: 544)、Holt et al. 2003（Trends Biotechnol. 21: 484）、並びに、例えば国際公開公報第０４／０６８８２０号、国際公開公報第０６／０３０２２０号、国際公開公報第０６／００３３８８号、及び、Domantis Ltdの他の公開された特許出願を参照する。また、それらは哺乳動物起源ではないので、本発明の脈絡においてあまり好ましくはないが、単一可変ドメインは、特定の種のサメに由来してもよいことが注記されるべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開公報第０５／１８６２９号を参照）。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ナノボディ（本明細書に定義されているような）又はその適切な断片であり得る。［注記：ナノボディ、ナノボディーズ及びナノクローンは、Ablynx N.V.の登録商標である］。ナノボディの一般的な説明については、本明細書に引用されている、例えば国際公開公報第０８／０２００７９号（１６頁）に記載されている先行技術を参照する。
免疫グロブリン配列、特にナノボディのアミノ酸配列及び構造は、しかしながらそれに限定されないが、当技術分野において及び本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」すなわち「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」すなわち「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」すなわち「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」すなわち「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」から構成されると考えられ得；該フレームワーク領域は、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」すなわち「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」すなわち「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」すなわち「ＣＤＲ３」と称される３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」によって中断されている。
ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０の領域内であり得、好ましくは１１２〜１１５であり、最も好ましくは１１３である。しかしながら、ナノボディの部分、断片、類似体、又は誘導体（本明細書にさらに記載されているような）は、このような部分、断片、類似体、又は誘導体が、本明細書に概略が示されているさらなる必要条件を満たし、かつまた好ましくは本明細書に記載の目的に適している限り、それらの長さ及び／又はサイズに関して特に限定されない。
ＶＨＨ及びナノボディのさらなる説明のために、Muyldermans 2001（Rev. Mol. Biotechnol. 74: 277）によるレビュー記事、並びに、一般的な背景技術として記載されている以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開公報第９４／０４６７８号、国際公開公報第９５／０４０７９号及び国際公開公報第９６／３４１０３号；ユニリーバ社の国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第９９／３７６８１号、国際公開公報第００／４０９６８号、国際公開公報第００／４３５０７号、国際公開公報第００／６５０５７号、国際公開公報第０１／４０３１０号、国際公開公報第０１/４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号、及び国際公開公報第０２／４８１９３号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)の国際公開公報第９７／４９８０５号、国際公開公報第０１／２１８１７号、国際公開公報第０３／０３５６９４号、国際公開公報第０３／０５４０１６号、及び国際公開公報第０３／０５５５２７号；Algonomics N.V.及びAblynx N.V.の国際公開公報第０３／０５０５３１号；カナダ国立研究機関による国際公開公報第０１／９０１９０号；the Institute of Antibodiesによる国際公開公報第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号）；並びに、Ablynx N.V.による国際公開公報第０４／０４１８６７号、国際公開公報第０４／０４１８６２号、国際公開公報第０４／０４１８６５号、国際公開公報第０４／０４１８６３号、国際公開公報第０４／０６２５５１号、国際公開公報第０５／０４４８５８号、国際公開公報第０６／４０１５３号、国際公開公報第０６／０７９３７２号、国際公開公報第０６／１２２７８６号、国際公開公報第０６／１２２７８７号及び国際公開公報第０６／１２２８２５号、並びにAblynx N.V.によるさらに他の公開された特許出願を参照する。また、これらの出願に記載のさらに他の先行技術、特に国際出願の国際公開公報第０６／０４０１５３号の４１〜４３頁に記載の文献のリストを参照し、このリスト及び文献は、参照により本明細書に組み入れられる。これらの文献に記載のように、ナノボディ（特にＶＨＨ及び部分的にヒト化されたナノボディ）は特に、１つ以上のフレームワーク配列内の１つ以上の「特徴的な残基」の存在によって特徴付けられ得る。ナノボディのヒト化及び／又はラクダ化、並びに、他の修飾、部分又は断片、誘導体、又は「ナノボディ融合体」、多価構築物（いくつかの非限定的なリンカー配列の例を含む）及びナノボディの半減期を延長させるための様々な修飾、並びにそれらの調製をはじめとする、ナノボディのさらなる説明が、例えば、国際公開公報第０８／１０１９８５号及び国際公開公報第０８／１４２１６４号に見い出され得る。
したがって、本発明の意味において、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」という用語は、ヒト以外の供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。それらは、以前に記載されているようにヒト化されていてもよい。さらに、該用語は、例えばDavies and Riechmann 1994 (FEBS 339: 285)、1995（Biotechonol. 13: 475）及び1996（Prot. Eng. 9: 531）並びにRiechmann and Muyldermans 1999（J. Immunol. Methods 231: 25）に記載のような、「ラクダ化」されている、ラクダ以外の供給源、例えばマウス又はヒトに由来するポリペプチドも含む。
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、及びラクダの免疫グロブリン配列を含む、様々な起源の免疫グロブリン配列を包含する。それはまた、完全なヒト免疫グロブリン配列、ヒト化免疫グロブリン配列、又はキメラ免疫グロブリン配列も含む。例えば、それは、ラクダ免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、又はラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばWard et al（例えば、国際公開公報第９４／０４６７８号並びにDavies and Riechmann 1994、1995及び1996を参照）によって記載のようなラクダ化ｄＡｂを含む。
本発明は、本明細書に記載のいずれかの免疫グロブリン単一可変ドメインの発現又は産生のために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリペプチド（すなわち、このような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド）の発現又は産生のために使用され得る。特定の態様では、本発明は、２つのジスルフィド架橋を含む免疫グロブリン単一可変ドメインの発現又は産生のために使用され得る。本発明はまた、２つのジスルフィド架橋を有する本発明のポリペプチド（すなわち、このような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド）の発現又は産生のために使用され得る。本発明はまた、本発明のポリペプチド（すなわち、２つのジスルフィド架橋を有するこのような免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド）の発現又は産生のために使用され得る。
全てのＶＨＨは、２２位のシステイン残基と、９２位のシステイン残基との間に少なくとも１つのジスルフィド架橋を含有していることが知られている（番号付けはＫａｂａｔによる、Ablynx N.V.の特許出願及びMuyldermans and Lauwereys 1999, J. Mol. Recognit. 12: 131を参照）。大半のＶＨＨはこの単一のジスルフィド架橋しか含有していないが、いくつかのＶＨＨは、合計で２つの（又は例外の場合には３つの）ジスルフィド架橋を含有していることが知られている。例えば、「ＶＨＨ−１型」、「ＶＨＨ−１クラス」又はその他（本明細書においてさらに定義されているような）と称されるＶＨＨ（及びナノボディ）のクラスは一般的に、ＣＤＲ２内の５０位のシステイン残基と、ＣＤＲ３内（又は例外的な場合には、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２内）に存在するシステイン残基との間に第二のジスルフィド架橋を有する。また、ラクダ又はヒトコブラクダ由来のいくつかのＶＨＨは、ＣＤＲ１内（又はＦＲ２内の４５位）に存在するシステイン残基と、ＣＤＲ３内に存在するシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有することが多い（Vu et al. 1997, Mol. Immunol. 34: 1121; Muyldermans and Lauwereys 1999）。ラマに由来するいくつかのＶＨＨは時に、ＣＤＲ１内（例えば３３位）に存在するシステイン残基と、ＣＤＲ３内に存在するシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有する（Vu et al., 1997）。
１つの具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク領域の１つにあるシステイン残基と、ＣＤＲ領域の１つにあるシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク領域の１つにあるシステイン残基と、ＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク２（ＦＲ２）内のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、フレームワーク２（ＦＲ２）内の４５位のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラクダ及びヒトコブラクダに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、１つのＣＤＲ内のシステイン残基と別のＣＤＲ内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ３内のシステイン残基と別のＣＤＲ内（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマに由来するいくつかのＶＨＨのように、特にＣＤＲ１内）のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ１内のシステイン残基と別のＣＤＲ内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ１内のシステイン残基とＣＤＲ１内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ１内のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、３３位のシステインとＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ２内のシステイン残基と別のＣＤＲ内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ２内のシステイン残基とＣＤＲ２内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、ＣＤＲ２内のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ラマに由来するいくつかのＶＨＨのように）。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、５０位のシステイン残基と別のＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ＶＨＨ１型のＶＨＨ及びナノボディのように）。
別の具体的であるが非限定的な態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、２２位のシステイン残基と９２位のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を含み、５０位のシステイン残基とＣＤＲ３内のシステイン残基との間に形成されたジスルフィド架橋をさらに含む（ＶＨＨ１型のＶＨＨ及びナノボディのように）。
好ましいが非限定的な実施態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」であり得る。例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドなどのアミノ酸は、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン又はＶＨＨ１型配列が、ＶＨＨ１共通配列（配列番号４６）：
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有しかつ必修的に５０位にシステインを、すなわちＣｙｓ５０（Ｋａｂａｔの番号付けを使用して）を有する場合に、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ１型配列」であると言われる。これらのＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインは一般的に、Ｃｙｓ５０と、ＣＤＲ３内（又は例外的な場合にはＣＤＲ１又はＣＤＲ２内）のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有する（又は形成することができる）。
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有しかつ必修的に５０位にシステインを、すなわちＣｙｓ５０（Ｋａｂａｔの番号付けを使用して）を有する場合に、「ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ１型配列」であると言われる。これらのＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインは一般的に、Ｃｙｓ５０と、ＣＤＲ３内（又は例外的な場合にはＣＤＲ１又はＣＤＲ２内）のシステイン残基との間にジスルフィド架橋を有する（又は形成することができる）。
アミノ酸配列、例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、ＶＨＨ２型免疫グロブリン単一可変ドメイン又はＶＨＨ２型配列が、ＶＨＨ２共通配列（配列番号４７）：
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有する場合に、「ＶＨＨ２型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ２型配列」であると言われる。
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有する場合に、「ＶＨＨ２型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ２型配列」であると言われる。
アミノ酸配列、例えば本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドは、ＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメイン又はＶＨＨ３型配列が、ＶＨＨ３共通配列（配列番号４８）：
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有する場合に、「ＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ３型配列」であると言われる。
に対して（標準的な設定、すなわちｂｌｏｓｏｍ６２スコアリングマトリックスを用いたｂｌａｓｔｐアルゴリズムを使用して）８５％の同一率を有する場合に、「ＶＨＨ３型免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「ＶＨＨ３型配列」であると言われる。
本発明は、ＶＨＨ１（ここでは２つのジスルフィド架橋の存在が非常に一般的である）の発現に特に適しているが、本発明はまたＶＨＨ２又はＶＨＨ３（これは２つのジスルフィド架橋を含んでいても含んでいなくてもよいが、これはあまり一般的ではない）の発現にも適用することができることが注記されるべきである。
一般的な説明について、及びｃ−Ｍｅｔに対して指向されかつ本明細書に記載の方法を使用して発現／産生され得るナノボディ（及びそれを含むポリペプチド）のいくつかの非限定的な例については、国際公開公報第２０１２／０４２０２６号及び国際公開公報第２０１３／０４５７０７号を参照する。
一般的な説明については、及びＴＮＦに対して指向されかつ本明細書に記載の方法を使用して発現／産生され得るナノボディ（及びそれを含むポリペプチド）のいくつかの非限定的な例については、Ablynx NVの米国仮出願のＵＳ６２／２５４，３７５号（ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７７５９５号も参照）を参照する。
本発明者らはまた、この教義が、ＶＨＨ−１などの２つ以上のジスルフィド架橋を有するＶＨＨ及びナノボディに特に適用可能であるだけでなく、２つ以上のジスルフィド架橋を含む他の免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、（単一）ドメイン抗体、ｄＡｂ、サメ由来のＩｇＮＡＲドメインなど）にも適用可能であると予期する。
本発明のポリペプチド
本発明の方法で調製された免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つ以上の（少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ、場合により１つ以上のさらなるアミノ酸配列をさらに含み得る（全てが場合により１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）、タンパク質又はポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド」と称される）の一部を形成し得る。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語はまた、このような本発明のポリペプチドも包含し得る。１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、このようなタンパク質又はポリペプチドにおいて結合単位として使用されてもよく、これは場合により、結合単位としての役目を果たし得る１つ以上のさらなるアミノ酸を含有していてもよく、これにより、それぞれ本発明の一価、多価、又は多重特異的なポリペプチドが提供される（１つ以上のＶＨＨドメインを含有している多価及び多重特異的なポリペプチド並びにそれらの調製については、Conrath et al. 2001（J. Biol. Chem. 276: 7346）並びに例えば国際公開公報第９６／３４１０３号、国際公開公報第９９／２３２２１号及び国際公開公報第２０１０／１１５９９８号も参照する）。
本発明の方法で調製された免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つ以上の（少なくとも１つの）免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得、かつ、場合により１つ以上のさらなるアミノ酸配列をさらに含み得る（全てが場合により１つ以上の適切なリンカーを介して連結されている）、タンパク質又はポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド」と称される）の一部を形成し得る。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語はまた、このような本発明のポリペプチドも包含し得る。１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、このようなタンパク質又はポリペプチドにおいて結合単位として使用されてもよく、これは場合により、結合単位としての役目を果たし得る１つ以上のさらなるアミノ酸を含有していてもよく、これにより、それぞれ本発明の一価、多価、又は多重特異的なポリペプチドが提供される（１つ以上のＶＨＨドメインを含有している多価及び多重特異的なポリペプチド並びにそれらの調製については、Conrath et al. 2001（J. Biol. Chem. 276: 7346）並びに例えば国際公開公報第９６／３４１０３号、国際公開公報第９９／２３２２１号及び国際公開公報第２０１０／１１５９９８号も参照する）。
本発明のポリペプチドは、上記に概略が示されているような、１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得るか又は実質的にからなり得る。このようなポリペプチドは本明細書において一価ポリペプチドとも称される。
本発明のポリペプチドは、上記に概略が示されているような、単一可変ドメインの形態の、２つ以上の抗原結合部位を含む構築物も包含し得る。例えば、同じ又は異なる抗原特異性を有する２つ（又はそれ以上）の免疫グロブリン単一可変ドメインを連結させることにより、例えば二価、三価、又は多価の構築物を形成することができる。２つ以上の特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを組み合わせることによって、二重特異的、三重特異的などの構築物を形成することができる。例えば、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメインは、同じ標的に対して指向される２つ若しくは３つの免疫グロブリン単一可変ドメイン、又は、標的Ａに対して指向される１つ若しくは２つの免疫グロブリン単一可変ドメインと標的Ｂに対して指向される１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み得る。当業者が容易に想像することのできるこのような構築物及びその改変は、本明細書に使用されるような本発明のポリペプチドという用語によって全て包含される。
さらに、本発明の方法で、タグ又は他の機能的な部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む、融合させた免疫グロブリン配列も調製される。
別の態様では、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（又はその適切な断片）を含むか又は実質的にからなる本発明のポリペプチドは、１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位をさらに含み得る。このようなさらなる基、残基、部分、結合単位、又はアミノ酸配列は、免疫グロブリン単一可変ドメインに（及び／又はそれが存在するポリペプチドに）さらなる機能を提供しても提供しなくてもよく、免疫グロブリン単一可変ドメインの特性を改変しても改変しなくてもよい。
例えば、このようなさらなる基、残基、部分、又は結合単位は、１つ以上の追加のアミノ酸であり得、よって該化合物、構築物、又はポリペプチドは、（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドである。好ましいが非限定的な態様では、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、免疫グロブリンである。さらにより好ましくは、前記の１つ以上の他の基、残基、部分、又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸、又はナノボディからなる群より選択される。
あるいは、このような基、残基、部分、又は結合単位は、例えば、それ自体が生物学的に及び／又は薬理学的に活性であってもなくてもよい、化学基、残基、部分であり得る。例えばであって限定するものではないが、このような基を１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインに連結させることにより、免疫グロブリン単一可変ドメインの「誘導体」を提供し得る。
好ましいが非限定的な態様では、前記のさらなる残基は、本発明のポリペプチドに対するいわゆる「既存抗体」の結合を妨げるか又は減少させるのに有効であり得る。この目的のために、本発明のポリペプチド及び構築物は、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（ここで、ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４、又は５（好ましくは１又は２、例えば１）であり；各Ｘは、独立して選択された、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）又はイソロイシン（Ｉ）からなる群より独立して選択された（好ましくは天然）アミノ酸残基である）を含有し得、これは、全て題名が「Improved immunoglobulin variable domains」である以下の同時係属中の米国仮出願：２０１４年５月１６日に出願された米国特許第６１／９９４５５２号、；２０１４年６月１８日に出願された米国特許第６１／０１４，０１５号；２０１４年８月２１日に出願された米国特許第６２／０４０，１６７号；及び２０１４年９月８日に出願された米国特許第６２／０４７，５６０号（全てAblynx N.V.に帰属する）並びにこれらの仮出願に基づきかつ２０１５年１１月１９日に公開された国際出願の国際公開公報第２０１５／１７３３２５号を参照する。
したがって、本発明の方法において、前記ポリペプチドはさらに、Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎ（ここで、ｎは１〜５、例えば１、２、３、４、又は５であり、Ｘは、天然アミノ酸であり、好ましくはシステインを全く含まない）を含み得る。
好ましい態様では、本発明の方法において発現される本発明のポリペプチドは、配列番号５５を含むか又は実質的にからなる。特定の態様では、このようなポリペプチドは配列番号５５からなる。
上記のポリペプチドにおいて、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び１つ以上の基、残基、部分、又は結合単位を、互いに直接及び／又は１つ以上の適切なリンカー若しくはスペーサーを介して連結させ得る。例えば、１つ以上の基、残基、部分、又は結合単位がアミノ酸である場合、リンカーもアミノ酸であってもよく、よって得られたポリペプチドは融合タンパク質又は融合ポリペプチドである。
本発明の１つの具体的な態様では、対応する免疫グロブリン単一可変ドメインと比較して延長された半減期を有する本発明のポリペプチドが調製される。例えばこのような半減期を延長させる部分を含む本発明のポリペプチドとしては、免疫グロブリン単一可変ドメインが１つ以上の血清タンパク質若しくはその断片（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその適切な断片）に、又は、血清タンパク質に結合することのできる１つ以上の結合単位に適切に連結されているポリペプチド（例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体として使用するのに適したアミノ酸、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとして使用するのに適したアミノ酸、又は血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）若しくはトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合することのできるナノボディ）；免疫グロブリン単一可変ドメインがＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）又はその適切な部分若しくは断片に連結されているポリペプチド；又は、１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメイン（群）が、血清タンパク質（例えば、国際公開公報第９１／０１７４３号、国際公開公報第０１／４５７４６号、又は国際公開公報第０２／０７６４８９号に記載のタンパク質及びペプチであるがこれらに限定されない）に結合することのできる１つ以上の小型タンパク質若しくはペプチドに適切に連結されているポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
一般的に、延長された半減期を有する本発明のポリペプチドは好ましくは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド単独での半減期の、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超である半減期を有する。
好ましいが非限定的な態様では、このような本発明のポリペプチドは、本発明の対応する免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチド単独と比較して、１時間以上、好ましくは２時間以上、より好ましくは６時間以上、例えば１２時間以上、又はさらには２４、４８、若しくは７２時間以上延長された血清中半減期を有する。
別の好ましいが非限定的な態様では、このような本発明のポリペプチドは、ヒトにおいて少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上の血清中半減期を示す。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも５日間（例えば約５〜１０日間）、好ましくは少なくとも９日間（例えば約９〜１４日間）、より好ましくは少なくとも約１０日間（例えば約１０〜１５日間）、又は少なくとも約１１日間（例えば約１１〜１６日間）、より好ましくは少なくとも約１２日間（例えば約１２〜１８日間又はそれ以上）、又は１４日間以上（例えば約１４〜１９日間）の半減期を有し得る。
本発明の方法は、Ｐ．パストリスなどのピキアにおいて容易に発現可能ではないか、又はこれらの宿主での使用に適用可能な発現条件下で発現させた場合に非常に低い収量であり、そのために、Ｐ．パストリスなどのピキアにおいて本発明のこれらの免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドを発現させると十分な量を得ることができない、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに特に適している。したがって、本発明の方法は、標準的なピキア発現条件下（本明細書において定義されているような）でピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において発現させると低い収量が得られる、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに特に適している。本発明に使用される「低い収量」は、得られる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量が、０．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、例えば０．４ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．３ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．２ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．１ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．０５ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、０．０１ｇ/Ｌ若しくはそれ以下、又はさらに低い［培地１Ｌ（リットル）あたりの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドのｇ（グラム）として表現される］ことを意味する。
本発明の方法はまた、標準的なピキア発現条件下（本明細書において定義されているような）でピキア宿主（例えばＰ．パストリス）において発現させた場合に得られる収量が、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸のコピー数とは逆相関（本明細書において定義されているような）を示す、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及びポリペプチドに特に適している。「逆相関」を示す収量とは、得られる該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量が、該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている１コピーを超える核酸を有するピキア宿主において該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを（本明細書に定義されているような標準的なピキア発現条件下で）発現させた場合に得られる該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量よりも、該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている１コピーの核酸を有するピキア宿主において該免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを（本明細書に定義されているような標準的なピキア発現条件下で）発現させた場合の方がより高いことを意味する。
本発明の方法に使用するのに好ましいポリペプチドとしては、配列番号４９〜５４が挙げられる。この配列はまた、本発明の別々の態様を形成する。したがって、本発明はまた、配列番号４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、又は５６を有するポリペプチドにも関する。
本発明の方法に使用するのに特に好ましい他のポリペプチドは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）（ここで、ＣＤＲ１は配列番号５８であり、ＣＤＲ２は配列番号６０であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である）から実質的になる免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば配列番号５５又は５６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなる。
補助タンパク質
本明細書において使用する「補助タンパク質」という用語は、他の分子構造及び／又はタンパク質が、それらの生物学的機能を遂行する際に支援するが、これらの他の分子構造及び／又はタンパク質がそれらの通常の生物学的機能を遂行する時に、それ自体はこれらの他の分子構造及び／又はタンパク質の構造には出現しない、タンパク質を指す。補助タンパク質は、例えば、他の分子構造及び／又はタンパク質の、生物物理学的特性、薬理学的特性、及び／又は発現特性を改変し得る。以下に限定されないが、補助タンパク質は、他の分子構造及び／又はタンパク質を安定化させ得（例えば複合体の形成を通して）、それらは、他の分子構造及び／又はタンパク質の活性を調節し得、それらは他の分子構造及び／又はタンパク質の（表面）発現を増加させ得、並びに／あるいは、それらはフォールディング及び／又は会合を支援し得る。
本明細書において使用する「補助タンパク質」という用語は、他の分子構造及び／又はタンパク質が、それらの生物学的機能を遂行する際に支援するが、これらの他の分子構造及び／又はタンパク質がそれらの通常の生物学的機能を遂行する時に、それ自体はこれらの他の分子構造及び／又はタンパク質の構造には出現しない、タンパク質を指す。補助タンパク質は、例えば、他の分子構造及び／又はタンパク質の、生物物理学的特性、薬理学的特性、及び／又は発現特性を改変し得る。以下に限定されないが、補助タンパク質は、他の分子構造及び／又はタンパク質を安定化させ得（例えば複合体の形成を通して）、それらは、他の分子構造及び／又はタンパク質の活性を調節し得、それらは他の分子構造及び／又はタンパク質の（表面）発現を増加させ得、並びに／あるいは、それらはフォールディング及び／又は会合を支援し得る。
その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質は、機能的ＨＡＣ１タンパク質である。ＨＡＣ１タンパク質は、任意の種を起源とし得るが、好ましくは酵母起源、最も好ましくはサッカロマイセス由来の酵母、例えばサッカロマイセス属、コマガタエラ属（Komagataella）又はピキア（ハンゼヌラ）属由来の酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリスである。具体的な態様では、機能的ＨＡＣ１タンパク質は「ＨＡＣ１スプライシング型」又は「ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質」である（両用語は本明細書において互換的に使用される）。ＨＡＣ１スプライシング型は、Guerfal et al. 2010（Microbial Cell Factories 9: 49）に記載のようなＨＡＣ１ ｍＲＮＡ上でのスプライシング事象（イントロンの除去）後に得られたＨＡＣ１タンパク質である。より具体的な態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、ピキア起源である。好ましい態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質は、Guerfal et al. 2010（Microbial Cell Factories 9: 49；配列番号１４）に記載のような配列を有する。
本発明の方法では、ＨＡＣ１タンパク質に加えて、場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１；ＥＣ５．３．４．１）、Ｋａｒ２ｐ及び保存リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）から選択された１つ以上の追加の補助タンパク質の発現が増強される。ピキア宿主におけるそれらの発現の増強が、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの増加した収量を与える限り、これらの補助タンパク質はどのような種を起源としていてもよい。好ましい態様では、補助タンパク質は、真菌、例えば酵母；好ましくはサッカロマイセス由来の酵母、例えばサッカロマイセス属、コマガタエラ属、又はピキア（ハンゼヌラ）属に由来する酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリスを起源とする。
好ましい態様では、補助タンパク質は、以下：
−Ｐ．パストリスのＨＡＣ１スプライシング型
及び場合により、以下の１つ以上：
−Ｐ．パストリスのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）：
−Ｐ．パストリスのＫａｒ２ｐ：
及び
−Ｐ．パストリスの６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）：
から選択される。
−Ｐ．パストリスのＨＡＣ１スプライシング型
及び場合により、以下の１つ以上：
−Ｐ．パストリスのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）：
−Ｐ．パストリスのＫａｒ２ｐ：
及び
−Ｐ．パストリスの６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）：
から選択される。
本発明の方法
本発明は、ピキア宿主において免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドを発現及び／又は産生するための方法に関する。本発明の方法では、ピキア宿主におけるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強される。本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸（群）の発現を増強させる工程；
場合により続いて；
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程。
本発明は、ピキア宿主において免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドを発現及び／又は産生するための方法に関する。本発明の方法では、ピキア宿主におけるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強される。本発明の方法は、以下の工程を含む：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸（群）の発現を増強させる工程；
場合により続いて；
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程。
したがって、本発明の方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現を産生するために／得るために、形質転換されたピキア宿主は一般的に、本発明の（所望の）免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドが発現されるような／産生されるような条件下で保持、維持、及び／又は培養され得る。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用されるピキア宿主株、並びに、本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節配列に依存するだろう。
一般的に、適切な条件としては、適切な培地の使用、適切な食物源及び／又は適切な栄養分の存在、適切な温度の使用、並びに場合により適切な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列（群）が誘導性プロモーターの制御下にある場合）が挙げられ得；これらは全て、当業者によって選択され得る。ここでも、このような条件下、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、構成的に発現されても、一過性に発現されても、又は適切に誘導された場合にのみ発現されてもよい。
ピキアにおける異種タンパク質の組換え産生のための培養条件は、例えば、Higgins and Cregg 1998（Eds, Methods in Molecular Biology, Pichia protocols, Volume 103, 2nd Ed., Humana Press）によって及びインビトロジェン（商標）（インビトロジェン（商標）ピキア発現キット；ピキア・パストリスにおける組換えタンパク質の発現用；カタログ番号Ｋ１７１０−０１）によって記載されている。Ｐ．パストリスにおける免疫グロブリン単一可変ドメインの産生は、国際公開公報第９４／２５５９１号、国際公開公報第２０１０／１２５１８７号、国際公開公報第２０１２／０５６０００号及び国際公開公報第２０１２／１５２８２３号に数多く記載されている。これらの文献の内容を、適切な培地及び条件をはじめとする一般的な培養技術及び方法に関連させてはっきりと言及する。これらの文書の内容は参照により組み込まれる。本発明はまた、当技術分野において記載されている具体的な条件、例えば国際公開公報第９４／２５５９１号、Gasser et al. 2006 (Biotechnol. Bioeng. 94: 535)；Gasser et al. 2007（Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499）、又はDamasceno et al. 2007（Microbiol. Biotechnol. 74: 381）に記載の一般的な培養法にも関する。
ピキア、特にＰ．パストリスは、典型的には、炭素源としてグリセロールを使用して３０℃の流加発酵で培養される。このような培地は一般的には、緩衝剤、グリセロール、微量元素及び水酸化アンモニウムを含む。緩衝剤の例としては、Ｈ３ＰＯ４、ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及びＫＯＨが挙げられる（がこれらに限定されない）。一般的な増殖培地（例えば基礎塩類培地）は、（１Ｌあたり）２６．７mLの８５％Ｈ３ＰＯ４、０．９３ｇのＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、１８．２ｇのＫ２ＳＯ４、１４．９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．１３ｇのＫＯＨ、４０ｇのグリセロール、２mLの微量元素［６g/Lの硫酸銅・５Ｈ２Ｏ；０．８ｇ/Ｌのヨウ化カリウム；３ｇ/Ｌの硫酸マンガン・Ｈ２Ｏ；０．２ｇ/Ｌのモリブデン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ；０．２ｇ/Ｌのホウ酸；０．５ｇ/Ｌの硫酸銅；２０ｇ/Ｌの塩化亜鉛；６５ｇ/Ｌの硫酸鉄・７Ｈ２Ｏ；０．２ｇ/Ｌのビオチン、及び５mLの濃硫酸から構成される］からなる。水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）は、ｐＨの調節のために（例えばｐＨ５）及び窒素源として使用される。流加培養期間中に、グリセロール（例えば５０％ｖ／ｖ）を数時間かけて例えば１５mL/Ｌ/ｈのフィード速度でフィードする。ＡＯＸ１プロモーターを使用して、本発明の所望の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている関心対象の遺伝子の発現を駆動する。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現は、４〜１０mL/Ｌ/ｈ（例えば４mL/Ｌ/ｈ）のメタノールフィード速度で３０℃で実施される。これらの条件は本明細書において「標準的なピキア発現条件」とも称される。
補助タンパク質の発現は、例えば強力なプロモーターなどの適切な制御配列の使用、及び／又は例えばそれぞれの遺伝子のコピー数を増加させることによって遺伝子の量を増加させることを含む、一般的に知られている手段によって増強させることができる。コピー数は、例えば、補助タンパク質の発現に適した遺伝子構築物（プラスミド又はベクター）を導入することによって増加させることができる。プラスミド又はベクターの追加の存在は、総コピー数を増加させるだろう。さらに、ピキア宿主ゲノムとは独立して増幅し得かつピキア宿主内に複数のコピーで存在する遺伝子構築物を使用してもよい。例えば、ピキア宿主細胞内に５〜５０のコピー数のマルチコピープラスミド又はベクターが存在し得る。
プラスミド又はベクターによるピキア宿主の形質転換に加えて、ピキア宿主の染色体の形質転換も本発明に包含される。強力な（誘導性）プロモーター（天然補助タンパク質の天然プロモーターの代わりに）を宿主の染色体に導入しても；又は、別の（強力な）プロモーターの制御下にある別のコピーの補助タンパク質遺伝子配列を染色体に導入してもよい。当業者は、補助タンパク質の発現を増強させる多くの可能性を知っており、それらは全て本発明によって包含される。
補助タンパク質（群）並びに本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、同じ又は異なる核酸から発現され得る。２つ以上のタンパク質の共発現は、同じ遺伝子構築物（プラスミド又はベクター又は宿主の染色体に組み込まれた）上の２つ以上のタンパク質の発現によって；又は、異なる遺伝子構築物（プラスミド又はベクター又は宿主の染色体に組み込まれた）上の２つ以上のタンパク質の発現によって達成され得る。
同じ遺伝子構築物上で発現される場合、前記の２つ以上のタンパク質をコードしている核酸は好ましくは互いに隣に位置する。前記の２つ以上のタンパク質をコードしている核酸の転写は、１つのプロモーター（両方の遺伝子の前に位置する）によって制御されても；又は、前記の２つ以上のうち１つのタンパク質をコードしているそれぞれの核酸は、同じ又は異なるプロモーターであり得る、別々のプロモーターによって制御されていてもよい。
異なる遺伝子構築物から発現される場合、本発明のポリペプチドをコードしている核酸の転写、及び１つ以上の補助タンパク質（群）をコードしている核酸の転写は、同じでも異なっていてもよい２つの別々のプロモーターによって制御されていてもよい。
前記プロモーターは構成性プロモーターでも誘導性プロモーターでもよい。好ましい態様では、該プロモーターは誘導性プロモーターである。
その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質の数は１（ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）であっても、又は、１つを超えていても、例えば２、３、４、５、若しくはそれ以上であってもよい。好ましい態様では、その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質の数は１（ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）である。
別の好ましい態様では、その発現が本発明の方法で増強される補助タンパク質の数は２、３、４、又はさらにはそれ以上である。この好ましい態様では、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現は増強され、さらに１つ以上の追加の補助タンパク質の発現が増強される。追加の補助タンパク質は、当技術分野において利用可能及び／又は公知である任意の補助タンパク質であり得る。好ましくは、追加の補助タンパク質は、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０のいずれかから選択される。
したがって、本発明の方法には、ピキア宿主における免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの発現及び／又は産生も包含され、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された１つ以上の追加の補助タンパク質の発現が増強される。したがって、本発明はまた、以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現させる工程；
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された補助タンパク質をコードしている１つ、２つ、３つ（又はそれ以上）の核酸の発現とを増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む方法にも関する。
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現させる工程；
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された補助タンパク質をコードしている１つ、２つ、３つ（又はそれ以上）の核酸の発現とを増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む方法にも関する。
具体的な態様では、本発明の方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された補助タンパク質をコードしている１つ、２つ、３つ（又はそれ以上）の核酸の発現とを増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現と、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＲＰＰ０から選択された補助タンパク質をコードしている１つ、２つ、３つ（又はそれ以上）の核酸の発現とを増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
したがって、本発明の方法のこの特定の態様では、以下の補助タンパク質（群）の組合せが増強され得る：
−ＰＤＩ１及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；並びに
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
−ＰＤＩ１及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型；
−ＰＤＩ１、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；
−Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型；並びに
−ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型。
補助タンパク質の数が２つ以上である場合、補助タンパク質は、１つのプラスミド若しくはベクター上での２つ以上の補助タンパク質の発現などの、同じ遺伝子構築物の作用によって；又は、異なるプラスミド若しくはベクター上での２つ以上の補助タンパク質の発現によって発現され得る。プラスミド又はベクターによるピキア宿主の形質転換に加えて、ピキア宿主の染色体の形質転換も本発明に包含される。強力な（誘導性）プロモーター（天然補助タンパク質の天然プロモーターの代わりに）を、ピキア宿主の染色体に導入しても；別の（強力な）プロモーターの制御下にある別のコピーの補助タンパク質遺伝子配列を染色体に導入してもよい。同じ遺伝子構築物上で発現される場合、２つ以上の補助タンパク質は、同じプロモーターによって制御されても異なるプロモーターによって制御されてもよい。異なる遺伝子構築物から発現される場合、２つ以上の補助タンパク質は、同じであっても異なっていてもよい２つの別々のプロモーターによって制御され得る。該プロモーターは構成性プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよい。
上記の方法の使用によって、本発明者らは、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドで時々観察される意外にも低い収量を増加させることができた。低い収量は、２つのジスルフィド架橋を含む免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインである免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）、及び／又は、標準的なピキア発現条件下でピキア宿主において発現させた場合に得られる収量が、該免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）をコードしている核酸のコピー数と逆相関を示す、免疫グロブリン単一可変ドメイン（及び／又はそれを含むポリペプチド）において特に観察された。
したがって、本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法も提供し、これは以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む。
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含む。
したがって、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含む。
好ましい態様では、本発明の方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
したがって、好ましい態様では、本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法も提供し、これは以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
したがって、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されていない方法で得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量の２倍以上（好ましくは３倍又は４倍又はそれ以上、より好ましくは５倍、７．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍又はさらにはそれ以上）である、本発明の同免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
別の好ましい態様では、本発明の方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
したがって、別の好ましい態様では、本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法も提供し、これは以下の工程：
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
ａ）ピキア宿主において、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている核酸を発現させる工程；及び
ｂ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｃ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
したがって、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの（発現及び／又は産生）収量を増加させるための方法は、
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
ａ）ピキア宿主が増殖するような条件下で該ピキア宿主を培養する工程；
ｂ）該ピキア宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で該ピキア宿主を維持する工程；及び
ｃ）該ピキア宿主において、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を増強させる工程；
場合により続いて：
ｄ）このようにして得られた本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を含み、該方法は、１ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、より好ましくは１．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、２ｇ/Ｌ若しくはそれ以上、又はさらには２．５ｇ/Ｌ若しくはそれ以上である、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの収量を提供する。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは細胞外で産生され、ピキア宿主細胞が培養された培地から単離される。
通常であって必ずしもではないが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを周辺質へと指向させる少なくとも１つの輸送シグナルを有するだろう。本発明において、ピキア宿主は、日常的な手段によって培養培地から除去され得る。例えば、ピキア宿主は、遠心分離又はろ過によって除去され得る。培養培地からのピキア宿主の除去によって得られた溶液は培養上清又は清澄化された培養上清とも称される。
また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、（まず）未成熟形（上記のような）で生成され得、次いで、使用されるピキア宿主に応じて翻訳後修飾にかけられ得ることが当業者には明らかであろう。また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、ここでもまた使用されるピキア宿主細胞に応じてグリコシル化されていてもよい。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、続いて、ピキア宿主から、及び／又は該ピキア宿主が培養された培地から、標準的な方法によって単離され得る。標準的な方法としては、クロマトグラフィー法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びアフィニティクロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法は、単独で、あるいは、他の精製法、例えば分別沈降技術、ゲル電気泳動、親和性技術（例えば本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに融合させた特異的で切断可能なアミノ酸配列を使用して）及び／又は免疫学的分取技術（すなわち、単離しようとする本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドに対する抗体を使用して）と組み合わせて実施され得る。当業者は、一般的な知識に基づいて免疫グロブリン単一可変ドメインについての適切な精製法の組合せを考案することができる。具体例については本明細書に引用された技術を参照する。
免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドは、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの組合せによって培養上清から精製され得る。あらゆる「精製工程」への言及は、これらの特定の方法を含むがこれらに限定されない。より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドは、清澄化された上清（遠心分離によって得られた）をプロテインＡ樹脂上に捕捉し；続いて、ＳＯＵＲＣＥ１５Ｓ（ＧＥヘルスケア社）陽イオン交換クロマトグラフィー工程及びスーパーデックス７５（ＧＥヘルスケア社）サイズ排除クロマトグラフィー工程にかけるプロセスを使用して、培養上清から精製され得る。
ピキア宿主の除去後、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを、多種多様な適切な緩衝液中に存在させ得る。例としては、ＰＢＳ、トリス−ＨＣｌ、ヒスチジン又はリン酸緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。また、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを生理食塩水中に存在させてもよい。
一般的には、薬学的使用のために、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤及び／又は補助剤と、場合により１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物とを含む、医薬調製物又は医薬組成物として製剤化され得る。非限定的な例を用いて、このような製剤は、経口投与、非経口投与（例えば静脈内注射、筋肉内注射、若しくは皮下注射、又は静脈内点滴による）、局所投与、吸入による、皮膚パッチによる、埋込剤による、坐剤による投与などに適した剤形であり得る。このような適した投与剤形（これは、投与法に応じて、固形、半固形、又は液体形であり得る）並びにその調製に使用するための方法及び担体は当業者には明らかであろう。
本発明の核酸及び遺伝子構築物
本発明はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型をコードしている核酸に関する。これらの核酸は本明細書において「本発明の核酸（群）」とも称される。
本発明はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型をコードしている核酸に関する。これらの核酸は本明細書において「本発明の核酸（群）」とも称される。
本発明の核酸は、当業者には明らかであろうように、遺伝子構築物の形態であり得、遺伝子構築物中に存在し得、及び／又は遺伝子構築物の一部であり得る。このような遺伝子構築物は一般的に、それ自体公知である遺伝子構築物の１つ以上の配列、例えば１つ以上の適切な制御配列（例えば適切なプロモーター（群）、エンハンサー（群）、終結因子（群）など）及び本明細書に言及されている遺伝子構築物のさらに他の配列などに場合により連結されている、少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は本明細書において、「本発明の遺伝子構築物（群）」とも称される。したがって、本発明の遺伝子構築物は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型を少なくともコードしている。
本発明の核酸（群）及び遺伝子構築物（群）によってコードされる補助タンパク質の数は１（すなわちＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）であっても、又は、１つを超えてもよく、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、若しくはそれ以上であってもよい。好ましい態様では、本発明の核酸及び遺伝子構築物によってコードされる補助タンパク質の数は１（すなわちＨＡＣ１スプライシング型タンパク質）である。別の好ましい態様では、本発明の核酸（群）及び遺伝子構築物（群）によってコードされる補助タンパク質の数は、２又はそれ以上である。
したがって、本発明はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドと、２つ以上の補助タンパク質（ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質を含む）とをコードしている核酸又は遺伝子構築物を包含する。
上記に考察されているように、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びに補助タンパク質（群）は、１つの単一の核酸及び／又は遺伝子構築物から共発現されても；あるいは、異なる（別々の）核酸及び／又は遺伝子構築物（おそらく、宿主の染色体からの発現も含む）から共発現されてもよい。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている、並びに／あるいは補助タンパク質（群）をコードしている（１つの構築物として又は別々の構築物として）、これら全ての核酸及び／又は遺伝子構築物は、「本発明の核酸（群）」及び「本発明の遺伝子構築物（群）」という用語に包含される。
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの形態であり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ（例えば、ピキア宿主細胞における発現に特に適応させたコドン使用頻度を有するＤＮＡなど）であり得る。
本発明の１つの実施態様によると、本発明の核酸は、本明細書において定義されているような実質的に単離された形態である。本発明の核酸はまた、例えばプラスミド、コスミド、若しくはＹＡＣなどのベクターの形態であり得るか、該ベクター内に存在し得るか、及び／又は該ベクターの一部であり得、これはここでも実質的に単離された形態であり得る。
本発明の核酸は、発現させようとする免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びに共発現のために使用される補助タンパク質（群）に関する情報に基づいて、それ自体公知である方法で調製することができるか又は得ることができる。また、当業者には明らかであろうように、本発明の核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列を、例えば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列を、補助タンパク質をコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列と、適切な方法で互いに連結させてもよい。
本発明の核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、例えば、これには自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然配列及び／又は合成配列（又は２つ以上のその部分）の組合せ、切断短縮された発現産物の発現をもたらす突然変異の導入、１つ以上の制限酵素部位の導入（例えば適切な制限酵素を使用して容易に消化及び／又は連結させ得るカセット及び／又は領域を作り出すために）、並びに／あるいは、１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応を用いての突然変異の導入、が挙げられるがこれらに限定されない。これらの技術及び他の技術は当業者には明らかであり、ここでも、標準的なハンドブック、例えば本明細書に記載されているSambrook et al. and Ausubel et al.及び以下の実施例を参照する。
本発明の遺伝子構築物はＤＮＡ又はＲＮＡであり得、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物はまた、ピキア宿主の形質転換に適した形態、ピキア宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みに適した形態、あるいはピキア宿主における独立的な複製、維持及び／又は遺伝に適した形態であり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクター、例えばプラスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンの形態であり得る。特に、該ベクターは、発現ベクター、すなわちピキア宿主において発現を与え得るベクターであり得る。
好ましいが非限定的な実施態様では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）以下のｂ）に作動可能に接続された少なくとも１つの本発明の核酸、
ｂ）１つ以上の制御配列、例えばプロモーター及び場合により適切な終結因子；
及び場合によりまた
ｃ）それ自体公知である遺伝子構築物の１つ以上のさらなる配列
を含み、「制御配列」、「プロモーター」、「終結因子」及び「作動可能に接続された」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し（本明細書にさらに記載されているように）；遺伝子構築物に存在する前記の「さらなる配列」は、例えば、３’−若しくは５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進若しくは増加させ得る配列であり得る。このような遺伝子構築物のためのこれらの配列及び他の適切な配列は当業者には明らかであり、これは例えば、使用される構築物の種類、ピキア宿主株、関心対象の本発明のヌクレオチド配列を発現させようとする様式（例えば、構成的発現、一過的発現、又は誘導的発現を介して）、及び／又は使用しようとする形質転換技術に依存する。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現及び産生のためのそれ自体公知である制御配列、プロモーター、及び終結因子は、実質的に同じような様式で使用され得る。
ａ）以下のｂ）に作動可能に接続された少なくとも１つの本発明の核酸、
ｂ）１つ以上の制御配列、例えばプロモーター及び場合により適切な終結因子；
及び場合によりまた
ｃ）それ自体公知である遺伝子構築物の１つ以上のさらなる配列
を含み、「制御配列」、「プロモーター」、「終結因子」及び「作動可能に接続された」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し（本明細書にさらに記載されているように）；遺伝子構築物に存在する前記の「さらなる配列」は、例えば、３’−若しくは５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進若しくは増加させ得る配列であり得る。このような遺伝子構築物のためのこれらの配列及び他の適切な配列は当業者には明らかであり、これは例えば、使用される構築物の種類、ピキア宿主株、関心対象の本発明のヌクレオチド配列を発現させようとする様式（例えば、構成的発現、一過的発現、又は誘導的発現を介して）、及び／又は使用しようとする形質転換技術に依存する。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現及び産生のためのそれ自体公知である制御配列、プロモーター、及び終結因子は、実質的に同じような様式で使用され得る。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、前記の少なくとも１つの本発明の核酸及び前記の制御配列、及び場合により前記の１つ以上のさらなる配列は、互いに「作動可能に連結」され、これにより、それらは互いに機能的な関係にあることを一般的に意味する。例えば、プロモーターは、該プロモーターがコード配列の転写及び／又は発現を開始又は別様に制御／調節することができる場合に（該コード配列は、該プロモーターの「制御下」にあると理解されるべきである）、コード配列に「作動可能に連結されている」と判断される。一般的に、２つのヌクレオチド配列が作動可能に連結されている場合、それらは同じ方向であり、通常、同じ読み枠内にある。それらはまた通常、実質的に連続的であるが、これもまた要求されるわけでなない。本発明の１つの態様では、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、補助タンパク質（群）をコードしているヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。それらは、同じプロモーターの制御下にあっても、又はそれらは各々、別々の（同じ又は異なる）プロモーターの制御下にあってもよい。
発現のための核酸配列を設計、作製、若しくは得る方法、適切なベクターを構築し、核酸配列を該ベクターに挿入し、適切なピキア宿主株を選択し、該ベクターを該ピキア宿主株に導入し、ポリペプチド若しくはタンパク質の発現を引き起こすか若しくは可能とし、該ピキア宿主株から核酸を単離するか、又は核酸配列及び対応するタンパク質配列を同定する方法は、当技術分野における通常の技能を有する当業者には誰にも周知である標準的な方法（Sambrook et al. 1989）である。当業者はまた、一般的な知識に基づいて、ピキア宿主において本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを発現させるのに適した遺伝子構築物を考案することができる。本発明はまた、当技術分野において記載されている遺伝子構築物、例えば、国際公開公報第９４／２５５９１号、Cereghino and Cregg 2000 (Curr. Opinion Biotechnol. 10: 422)、Gasser et al. 2006 (Biotechnol. Bioeng. 94: 535)、Gasser et al. 2007（Appl. Environ. Microbiol. 73: 6499）又はDamasceno et al. 2007（Microbiol. Biotechnol. 74: 381）に記載のプラスミド、プロモーター、及びリーダー配列にも言及する。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の制御配列及びさらなる配列は、それらが、ピキア宿主においてその目的とする生物学的機能を与えることができるようなものである。
例えば、プロモーター、エンハンサー、又は終結因子は、ピキア宿主において「作動可能」であるべきであり、これにより、（例えば）該プロモーターは、それが作動可能に連結されている（本明細書において定義されているように）ヌクレオチド配列、例えばコード配列の転写及び／又は発現を開始又は別様に制御／調節することができるはずであることを意味する。
適切なプロモーター、終結因子、及びさらなる配列のいくつかの好ましいが非限定的な例としては、ピキア宿主における発現に使用することができるもの；特に、本明細書に記載されているもの及び／又は以下の実施例に使用されているものが挙げられる。
いくつかの特に好ましいプロモーターとしては、ピキア宿主における発現のためにそれ自体公知であるプロモーター；特に、本明細書に記載されているもの及び／又は実施例に使用されているものが挙げられる。プロモーターの具体的な配列は、プロモーターの強度を決定する（「強力なプロモーター」は、高い転写開始率をもたらす）。補助タンパク質をコードしている核酸の発現が「強力なプロモーター」によって制御されていると言われる場合、それは、該補助タンパク質をコードしている核酸の発現が、天然補助タンパク質の転写開始を制御する天然プロモーターよりも高い転写開始率をもたらすプロモーターによって制御されていることを意味する。転写を「促進する」配列に加えて、プロモーターは、プロモーターの強度を制御するオペレーターとして知られる追加の配列を含み得る。例えば、プロモーターは、プロモーターへのＲＮＡの結合を誘引又は妨害するタンパク質の結合部位を含み得る。このタンパク質の有無は、プロモーターの強度に影響を及ぼすだろう。このようなプロモーターは、調節プロモーターとして知られている。
Ｐ．パストリスのアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターは、知られている中で最も強力で最も調節されているプロモーターの１つである。逆に、Ｐ．パストリスの第二のアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ２）は、はるかに弱いプロモーターによって制御されている。Ｐ．パストリスのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターは、グルコース培地、グリセロール培地、及びメタノール培地上で恒常的に高いレベルの発現を与える（Waterham et al. 1997, Gene 186: 37）。Ｐ．パストリスのホルミルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ１）プロモーターは、メタノール又はメチルアミンのいずれかによって誘導され得、その発現レベルはメタノール中でＡＯＸ１プロモーターを用いて得られたのと同等である（Shen et al. 1998, Gene 216: 93）。ペルオキシン８（ＰＥＸ８）プロモーターはグルコース上で低い発現を与え、細胞をメタノールに変更すると中程度に（約１０倍）誘導される（Johnson et al. 1999, Genetics 151: 1379）。
ハンゼヌラ・ポリモルファ（H.polymorpha）における強力なプロモーターは、メタノールオキシダーゼ遺伝子（ＭＯＸ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＭＤ）、及びジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子（ＤＨＡＳ）に由来する配列を含む（Song et al. 2006, Biotechnol. Lett. 25: 1999）。ハンゼヌラ・ポリモルファにおける、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ１）プロモーター（Sohn et al. 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 800）及びＰＭＡ１プロモーター（Cox et al. 2000, Yeast 16: 1191）は、構成的配列である。ＰＭＡ１プロモーターは、高い発現レベルのためにＭＯＸプロモーターと競合する。
ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）のアルコールオキシダーゼ（ＡＵＧ１）プロモーターであるＰ（ＭＯＤ１）及びＰ（ＭＯＤ２）は、メタノール（Ｐ（ＭＯＤ１）及びＰ（ＭＯＤ２））及びグリセロール（Ｐ（ＭＯＤ１）のみ）によって強力かつ堅固に調節される（Nakagawa et al. 2006, Yeast 23: 15）。
カンジダ・ボイディニイ（C.boidinii）由来の強力なプロモーターとしては、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ１）プロモーター及びジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）プロモーターが挙げられる（Yurimoto et al. 2000, Biochim. Biophys. Acta 1493: 56）。ＤＡＳ１プロモーター及びギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）プロモーターのどちらも、カンジダ・ボイディニイ（Sakai et al. 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 860; 1996, Biochim. Biophys. Acta 1308: 81）及びハンゼヌラ・ポリモルファ（Hollenberg and Gellissen 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 554）において利用可能である。
選択マーカーは、それが、すなわち適切な選択条件下で、本発明の核酸を用いて（成功裡に）形質転換されているピキア宿主細胞を、（成功裡に）形質転換されなかったピキア宿主細胞と区別することを可能とするようなものであるべきである。このようなマーカーのいくつかの好ましいが非限定的な例は、抗生物質（例えば、ゼオシン、ブラストサイジン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、フレオマイシン、カナマイシン、又はアンピシリンなど）に対する抵抗性を与える遺伝子、温度に対する抵抗性を与える遺伝子、あるいは、ピキア宿主が、形質転換されていない細胞の生存にとって必須である培地中の特定の因子、化合物及び／又は（食物）成分の非存在下で維持されることを可能とする遺伝子である。
リーダー配列は、ピキア宿主において、それが所望の翻訳後修飾及び／又は該細胞からの発現産物の分泌を可能とするようなものであるべきである。したがって、リーダー配列は、ピキア宿主において作動可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であり得る。しかしながら、通常であって必ずしもではないが、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はタンパク質を周辺質へと指向させる少なくとも１つの輸送シグナルを有するだろう。例えば、抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現及び産生のためのそれ自体公知であるリーダー配列は、実質的に同じような方法で使用され得る。
いくつかの好ましいが非限定的な分泌配列としては、サッカロマイセス・セレビシエ由来のα−接合因子シグナル配列、Ｐ．パストリス由来の酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列、Ｐ．パストリス由来のホスファターゼ（ｐｈｏ１）リーダー配列、酵母インベルターゼの分泌シグナル（Ｓｕｃ）、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド、シュワニオミセス・オクシデンタリス（S. occidentalis）由来のＧＡＭ１シグナル配列、及びヨーロッパミドリガニ（Carcinus maenas）由来の高血糖ホルモン（ＣＨＨ）配列などが挙げられる。
当業者はまた、ゲノムシークエンス実験から導かれた予測されたシグナルペプチドの使用を想定し得る。これらの予測されたシグナルペプチド配列は任意の種を起源とし得るが、好ましくは酵母起源であり、最も好ましくはサッカロマイセス由来の酵母、例えばサッカロマイセス属、コマガタエラ属、又はピキア属（ハンゼヌラ）由来の酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエ又はピキア・パストリスに由来する。Ｐ．パストリス由来のいくつかの好ましいが非限定的な予測されるシグナルペプチドは、De Schutter et al. 2009（Nature Biotech 27(6): 561-566）に記載されている。免疫グロブリン単一可変ドメインの生成のためのこのような予測されるシグナルペプチドの使用については、国際公開公報第２０１２／１５２８２３号をさらに参照する。
また、生成される本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの特性を改善するために、公知の又は予測される分泌配列を改変してもよい。このような改変は、例えば、プロセシング効率を改善することによって、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの純度を改善し得る。プロセシング効率の改善のためのα−接合因子シグナル配列の改変は、例えば国際公開公報第２０１２／１５２８２３号に記載されている。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、ピキア宿主において、それが遺伝子構築物（上に存在する遺伝子配列又はヌクレオチド配列）の発現の検出を可能とするようなものであるべきである。このようなレポーター遺伝子はまた、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドとのタンパク質融合体として発現されてもよい。いくつかの好ましいが非限定的な例としては、蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ及びルシフェラーゼＬＵＣ）が挙げられる。
本発明の遺伝子構築物は一般的に、例えば上記のSambrook et al.及びAusubel et al.などの一般的なハンドブックに記載された技術を使用して、上記の１つ以上のさらなる配列に、本発明の核酸及び／又はヌクレオチド配列（群）を適切に連結させることによって提供され得る。
しばしば、本発明の遺伝子構築物は、それ自体公知である適切な（発現）ベクターに本発明の核酸配列又はヌクレオチド配列を挿入することによって得られるだろう。適切な発現ベクターのいくつかの好ましいが非限定的な例は、以下の実施例に使用されたもの、並びに、本明細書に記載されているものである。
本発明の遺伝子構築物に使用するためのいくつかの好ましいが非限定的なベクターとしては、酵母又は他の真菌細胞における発現のためのベクター、例えばｐＹＥＳ２（インビトロジェン社）、ｐＵＲ３５１５及びｐＵＲ３５０１（Sierkstra et al. 1991, Curr. Genet. 19: 81）、並びにピキア発現ベクター、例えば（以下に限定されないが）Ｐ．パストリスにおける発現のためのｐＰＩＣＺベクター、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ６ａ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、インビトロジェン社によって提供されたＰ．メタノリカにおける発現のためのｐＭＥＴ、ｐＭＥＴαが挙げられる。ピキア発現ベクターの網羅的ではないリストについては、Daly and Hearn 2004 (J. Mol. Recognition 18: 119)、ピキアプロトコール2007（Ed. Cregg, 2nd Ed., Humana Press, NJ）及びGelissen 2000（Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741）も参照する。
また本発明には、補助タンパク質遺伝子（群）並びに／あるいは本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を、適切なベクターにクローニングする工程を含む、本発明の核酸及び遺伝子構築物の調製法が包含される。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物を使用して、すなわち本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現及び／又は産生のために、ピキア宿主を形質転換し得る。ピキア宿主を形質転換するのに適した技術は当業者には明らかであろう。ここでも、上記のハンドブック及び特許出願を参照する。形質転換手順に関するより詳しいことについては、インビトロジェン社のＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）ピキア発現マニュアル、Wu and Letchworth 2004（BioTechniques 36: 152）、ピキアプロトコール2007（Ed. Cregg, 2nd Ed., Humana Press, NJ）及びFaber 1994（Curr. Genet. 25: 305）を参照する。形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物を用いて成功裡に形質転換されたピキア宿主細胞を検出及び選択するための工程を実施し得る。これは例えば、本発明の遺伝子構築物に存在する選択マーカーに基づいた選択工程、又は、例えば特異的抗体を使用した本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であり得る。
したがって、本発明はさらに、本発明の遺伝子構築物又は核酸を含む、ピキア宿主細胞の調製に関する。当業者は、本発明の核酸又は遺伝子構築物をピキア宿主に日常的な措置によって、例えば形質転換によって導入することができる。次いで、当業者は、例えば補助タンパク質の発現を核酸レベル及び／又はタンパク質レベルでモニタリングすることによって、核酸又は遺伝子構築物を含む適切なピキア宿主細胞を選択することができる。満足できる発現レベルを有する株が選択されるだろう。高い発現の補助タンパク質が望ましいが、しかしながら、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの発現と競合するほど高いものであるべきではない。これは日常的な方法によって決定され得る。
形質転換されたピキア宿主細胞（これは、安定な細胞系の形態であり得る）は、本発明のさらなる態様を形成する。
ピキア宿主
したがって、本発明はまた、上記のようなこのような遺伝子構築物又は核酸を含むピキア宿主にも関する。「ピキア宿主」及び「ピキア宿主細胞」という用語は互換的に使用され、球状、楕円形、又は長方形の尖鋭形細胞を有するサッカロマイセス科ピキア属（ハンゼヌラ及びヒフォピキア（Hyphopichia）は廃れた同義語である）の酵母を指す。ピキアはテレオモルフであり、有性生殖中に帽子形状、半球状、又は円形の子嚢胞子を形成する。いくつかのピキア種の無性世代はカンジダ種である。無性生殖は多側方性出芽による。
したがって、本発明はまた、上記のようなこのような遺伝子構築物又は核酸を含むピキア宿主にも関する。「ピキア宿主」及び「ピキア宿主細胞」という用語は互換的に使用され、球状、楕円形、又は長方形の尖鋭形細胞を有するサッカロマイセス科ピキア属（ハンゼヌラ及びヒフォピキア（Hyphopichia）は廃れた同義語である）の酵母を指す。ピキアはテレオモルフであり、有性生殖中に帽子形状、半球状、又は円形の子嚢胞子を形成する。いくつかのピキア種の無性世代はカンジダ種である。無性生殖は多側方性出芽による。
本発明は、ピキア宿主に関するがこれに限定されず、ただしそれらは免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はそれを含むポリペプチドの産生に適したものである。本発明の目的のために、「ピキア宿主」という用語はまた、ハンゼヌラ種及びカンジダ種も含む。
本発明のピキア宿主は、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチド並びにＨＡＣ１スプライシング型タンパク質、並びに場合により１つ以上の追加の補助タンパク質（群）、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ１）、Ｋａｒ２ｐ又は保存リボソームタンパク質Ｐ０（ＲＰＰ０）を産生することができるだろう。それは典型的には、それが本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を含むように、かつＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が増強されるように、遺伝子的に改変されているだろう。遺伝子的改変の非限定的な例としては、例えばプラスミド若しくはベクターを用いての形質転換、又はウイルスベクターを用いての形質導入が挙げられる。いくつかの宿主は、融合技術によって遺伝子的に改変されてもよい。遺伝子的改変としては、宿主への別々の核酸分子、例えばプラスミド又はベクターの導入、並びに、例えば宿主の染色体への組み込みによる、例えば相同的組換えによる宿主の遺伝子材料の直接的改変が挙げられる。しばしば、両方の組合せが起こり、例えば宿主をプラスミドを用いて形質転換すると、このプラスミドは、相同的組換えにより（少なくとも部分的に）宿主の染色体に組み込まれるだろう。当業者は、宿主が本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを産生することを可能とする、宿主の適切な遺伝子的改変法を知っている。
適切なピキア宿主は当業者には明らかであり、これは、例えばピキア、ハンゼヌラ、又はカンジダ、例えばメタノトローフ酵母、例えばピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ハンゼヌラ・ポリモルファ（ピキア・アングスタ（Pichia angusta））及びカンジダ・ボイディニイが挙げられるがこれらに限定されない酵母であり得る。ピキア株の網羅的ではないリストについては、例えば、Gelissen 2000（Appl. Microbiol. Biotechno. 54: 741）を参照する。限定するものではないが、Ｐ．パストリス株は、Daly and Hearn 2004（J. Mol. Recognition, 18: 119）及びピキアプロトコール2007（Ed. Cregg, 2nd Ed., Humana Press, NJ）に列挙されている。Ｐ．パストリス株の例としては、インビトロジェン社によって提供され、Cereghino and Cregg 2004（FEMS Microbiol. Rev. 24: 45)）によって、Macauley-Patrick et al. 2005（Yeast 22: 249）及び／又はDamasceno et al. 2007 （Appl. Microbiol. Biotechno. 74: 381）によって記載された、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、ＳＭＤ１１６３、ＳＭＤ１１６５、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６８Ｈ、ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０、ＧＳ２００が挙げられる（がこれらに限定されない）。
ハンゼヌラ・ポリモルファ株の例としては、Ａ１６（Veale et al. 1992, Yeast 8: 361）、ＧＦ１６（Faber 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12985）、ＣＢＳ４７３２（ＣＣＹ３８−２２−２；ＡＴＣＣ３４４３８、ＮＲＲＬ−Ｙ−５４４５）、ＤＬ−１（ＮＲＲＬ−Ｙ−７５６０；ＡＴＣＣ２６０１２）、及びＮＣＹＣ４９５株（ＣＢＳ１９７６；ＡＴＡＡ１４７５４、ＮＲＬＬ−Ｙ−１７９８）が挙げられる（がこれらに限定されない）。
Ｐ．メタノリカ株の例としては、インビトロジェン社によって提供されたＰＭＡＤ１１及びＰＭＡＤ１６が挙げられる（がこれらに限定されない）。Ｐ．メタノリカ株（ＩＡＭ１２９０１及びＩＡＭ１２４８１）及びＣ．ボイディニイ株（ＩＡＭ１２８７５）が、Nakagawa et al. 1996（J. Fermentation Bioeng. 81: 498）によって記載されている。
また、本明細書において上記に引用された一般的な背景技術、並びに、例えば国際公開公報第９４／２９４５７号、Frenken et al. 1998（Res. Immunol. 149: 589）、van der Linden 2000（J. Biotechnol. 80: 261）、Joosten et al. 2003（Microb. Cell Fact. 2: 1）及び本明細書に引用されたさらなる文献も参照する。
工業的規模での生産について、免疫グロブリン単一可変ドメインを含有するタンパク質治療薬の（工業的）生産のために好ましい異種宿主としては、大規模な発現／生産／発酵、特に大規模な医薬品の発現／生産／発酵に適している、ピキア・パストリス株が挙げられる。このような株の適切な例は当業者には明らかであろう。このような株及び産生／発現系もまた、アビシア・バイオロジクス社（ビリンガム、ノース・イースト・イングランド、英国）、バイオミーバ有限会社（ハイデルベルク、ドイツ）、PharmedArtis有限会社（アーヘン、ドイツ）、Richter-Helm社（ハンブルク、ドイツ）、及びＣＭＣバイオロジクス社（コペンハーゲン、デンマーク）などの会社によって入手可能となっている。
本発明はまた、本発明のピキア宿主細胞のさらに他の世代、後代、及び／又は子孫も含み、これは例えば細胞分裂によって得ることができる。
医薬調製物
本発明はまた、本明細書に記載のような本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドにも関する。
本発明はまた、本明細書に記載のような本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドにも関する。
したがって、本発明はまた、本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドを含む、医薬調製物及び他の組成物にも関する。本発明はまた、本発明の方法によって得ることのできる本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの医療使用にも関する。
当業者は、一般的な知識に基づいて薬学的に適切な製剤を容易に製剤化することができる。さらに、本明細書に引用されている、免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はナノボディを特に扱う文献を明示的に参照する。限定するものではないが、鼻腔内、口腔内、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、膣内、直腸適用、局所適用、又は吸入による適用のための製剤を含む、標準的な適用経路用の製剤が調製され得る。
本発明に基づいて、当業者は、本発明の方法によって得ることのできる治療有効量の本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン及び／又はポリペプチドの使用によって特徴付けられる、適切な処置法を容易に考案することもできる。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明され、これは決してさらなる限定と捉えられるべきではない。本出願全体を通して引用された全ての文献（参考文献、交付済み特許、公開特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の全内容が、特に本明細書で上記に参照された教義について、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例
実験章は、ピキア・パストリスにおける一価及び多価の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時に、驚くべきことに低い収量が観察されたことを記載する。本発明者らはまた、１コピーを超える発現カセットがＰ．パストリスのゲノム内に存在する場合には収量はさらに減少することを観察した。また、ＨＡＣ１スプライシング型の発現を増強させることによって、該免疫グロブリン単一可変ドメインの発現収量を増加させるための方法も記載する。
実験章は、ピキア・パストリスにおける一価及び多価の免疫グロブリン単一可変ドメインの発現時に、驚くべきことに低い収量が観察されたことを記載する。本発明者らはまた、１コピーを超える発現カセットがＰ．パストリスのゲノム内に存在する場合には収量はさらに減少することを観察した。また、ＨＡＣ１スプライシング型の発現を増強させることによって、該免疫グロブリン単一可変ドメインの発現収量を増加させるための方法も記載する。
実施例１：ピキア・パストリスにおけるナノボディの発現を増加させる、補助タンパク質の同定
１．１ 発現ベクターの構築
国際公開公報第２０１３／０４５７０７号に配列番号７として以前に記載されたナノボディＡは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＡにおけるＮ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ｃ−Ｍｅｔへの結合に特異的であるが、Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは９Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＡの配列（配列番号４９）は表Ａ−１に示されている。ナノボディＡは、Ｐ．パストリスにおいて発酵させると非常に低い収量（０．２ｇ/Ｌ又はそれ以下）をもたらすことが以前に示された。
１．１ 発現ベクターの構築
国際公開公報第２０１３／０４５７０７号に配列番号７として以前に記載されたナノボディＡは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＡにおけるＮ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ｃ−Ｍｅｔへの結合に特異的であるが、Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは９Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＡの配列（配列番号４９）は表Ａ−１に示されている。ナノボディＡは、Ｐ．パストリスにおいて発酵させると非常に低い収量（０．２ｇ/Ｌ又はそれ以下）をもたらすことが以前に示された。
ナノボディＡのコード情報を含有しているＤＮＡ断片を、ブラストサイジン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有するピキア発現ベクター（ｐＰＩＣ６ａの誘導体、インビトロジェン社）のマルチクローニングサイトに、ナノボディ配列がａＭＦシグナルペプチド配列の下流かつ読み枠内となるようにクローニングした。ゲノム内に１コピー数を超える発現カセットを有するピキアクローンを生成するために、ピキア発現ベクター内の独特なＢｇｌＩＩ部位を使用して、ナノボディＡの第二の発現カセットを導入した。
表Ａ−２に示される補助タンパク質のコード配列を、ゼオシン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有しているピキア発現ベクター（ｐＰＩＣＺａの誘導体、インビトロジェン社）に（制限酵素のＢｓｔＢＩ及びＮｏｔＩを使用して）クローニングした。そのコード配列内にＢｓｔＢＩ部位を含有している補助タンパク質を、制限酵素のＡｆｅＩ及びＮｏｔＩを使用してクローニングした。ｐＰＩＣ６ａ及びｐＰＩＣＺａベクター内のナノボディ及び補助タンパク質は両方共に、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下にあった。
１．２ ナノボディコード配列の形質転換、並びにピキア宿主における該ナノボディの発現及び分泌
野生型ピキアＸ３３の形質転換及び発現研究を、標準的な技術によって及び「User manual for pPicZalphaA, B and C」（バージョンＤ、１１０８０１、マニュアル部分の番号２５−０１４８：インビトロジェン社）及びMethods in Molecular Biology 2007（Humana Press Inc.）に従って実施した。まず、Ｐ．パストリス株を、ナノボディＡの単一の又は２つの発現カセットを有する適切な発現ベクターを用いて形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。多くの個々のコロニーをｑＰＣＲによって特徴付けることにより、ゲノムに組み込まれた１コピーの発現ベクターを有するクローン、及びゲノムに組み込まれた１コピーを超えるの発現カセットを有するクローンを選択した。ナノボディの発現及び培地中への分泌を確認した（図１）。
野生型ピキアＸ３３の形質転換及び発現研究を、標準的な技術によって及び「User manual for pPicZalphaA, B and C」（バージョンＤ、１１０８０１、マニュアル部分の番号２５−０１４８：インビトロジェン社）及びMethods in Molecular Biology 2007（Humana Press Inc.）に従って実施した。まず、Ｐ．パストリス株を、ナノボディＡの単一の又は２つの発現カセットを有する適切な発現ベクターを用いて形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。多くの個々のコロニーをｑＰＣＲによって特徴付けることにより、ゲノムに組み込まれた１コピーの発現ベクターを有するクローン、及びゲノムに組み込まれた１コピーを超えるの発現カセットを有するクローンを選択した。ナノボディの発現及び培地中への分泌を確認した（図１）。
１．３ 補助タンパク質コード配列の形質転換、並びにピキア・パストリスにおけるナノボディの発現及び分泌
一旦、適切なナノボディを発現しているコロニーが同定されたら、その接種菌液をコンピテント細胞として増幅及び調製した。次いで、これらの細胞を、表Ａ−２で示された２２個の補助タンパク質を含有している発現ベクターライブラリーを用いて形質転換した。形質転換体を、様々な選択マーカー（ゼオシン（商標））を含有している選択培地上で増殖させ、このようにして、関心対象のナノボディ及び表Ａ−２の１つ以上の補助タンパク質の両方を含有している共形質転換体が得られた。振盪フラスコでの発現を、５mLのＢＭＣＭ培地の培養液中で実施し、ピキアプロトコール（例えば、Methods in molecular biology 2007, Humana Press Inc.を参照）に記載されているようなメタノールの添加によって誘導した。
一旦、適切なナノボディを発現しているコロニーが同定されたら、その接種菌液をコンピテント細胞として増幅及び調製した。次いで、これらの細胞を、表Ａ−２で示された２２個の補助タンパク質を含有している発現ベクターライブラリーを用いて形質転換した。形質転換体を、様々な選択マーカー（ゼオシン（商標））を含有している選択培地上で増殖させ、このようにして、関心対象のナノボディ及び表Ａ−２の１つ以上の補助タンパク質の両方を含有している共形質転換体が得られた。振盪フラスコでの発現を、５mLのＢＭＣＭ培地の培養液中で実施し、ピキアプロトコール（例えば、Methods in molecular biology 2007, Humana Press Inc.を参照）に記載されているようなメタノールの添加によって誘導した。
各々の設定において、１１２８個のクローンを、改善された発現についてスクリーニングし、ゲノムに組み込まれたたった１コピーの又は１コピーを超えるナノボディ発現カセットを含有しているが、１つ以上の補助タンパク質をコードしている発現ベクターは含まないそれらの対応する基準クローンと比較した。各々の設定において、本発明者らは、それらの基準クローンより有意により高い収量を有する２つのクローンを発見した。クローン６Ｈ１及び４Ｃ２は、ゲノムに組み込まれた１コピーのナノボディコード配列を有し（コピー数＝１）、クローン５Ａ６及び９Ｃ４は、ゲノムに組み込まれた１コピーを超えるナノボディコード配列を有していた（コピー数＞１）（図２）。
１．４ 発現収量に対してプラスの効果を及ぼす補助タンパク質の同定
Ｐ．パストリスにおけるナノボディの発現収量に対してプラスの効果を発揮する補助タンパク質の同定は、配列特異的ＰＣＲプライマーを使用したゲノムＤＮＡ ＰＣＲを用いて実施された。使用されたプライマーのリストを表Ａ−３に示す。同定された補助タンパク質を表１に示す。
Ｐ．パストリスにおけるナノボディの発現収量に対してプラスの効果を発揮する補助タンパク質の同定は、配列特異的ＰＣＲプライマーを使用したゲノムＤＮＡ ＰＣＲを用いて実施された。使用されたプライマーのリストを表Ａ−３に示す。同定された補助タンパク質を表１に示す。
１．５ 様々なクローンの発現収量の決定
ナノボディ／補助タンパク質（群）の共形質転換体の発現収量を、培地中に発現及び分泌されたナノボディの収量の定量によって、発現実験における対照（１つ以上の補助タンパク質（群）の発現の増強を伴わないナノボディ形質転換体）の発現収量と比較した。標準的な流加発酵条件を使用した。グリセロール流加培養を実施し、メタノールの添加によって誘導を開始した。生産を、２Ｌの規模でｐＨ６で３０℃で複合培地中で４ml/Ｌ/ｈのメタノールフィード速度で実施した。
ナノボディ／補助タンパク質（群）の共形質転換体の発現収量を、培地中に発現及び分泌されたナノボディの収量の定量によって、発現実験における対照（１つ以上の補助タンパク質（群）の発現の増強を伴わないナノボディ形質転換体）の発現収量と比較した。標準的な流加発酵条件を使用した。グリセロール流加培養を実施し、メタノールの添加によって誘導を開始した。生産を、２Ｌの規模でｐＨ６で３０℃で複合培地中で４ml/Ｌ/ｈのメタノールフィード速度で実施した。
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表２）。
クローン４Ｃ２及び６Ｈ１は、それらの基準クローン（ゲノムに組み込まれた１コピー数の発現カセット）と比較して、発現の顕著な増加を示した。この発現の増加は、両方のクローンに存在するＰＤＩ１の共発現の結果のようであった。同様に、クローン５Ａ６及び９Ｃ４は、それらの基準クローンと比較して、収量の巨大な増加を示した。クローン５Ａ６及び９Ｃ４の両方において発現されていた補助タンパク質は、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型である。そうした補助タンパク質が、ナノボディＡの改善された発現に関与している可能性が最も高い。興味深いことに、クローン４Ｃ２の発現レベルは、クローン６Ｈ１よりも顕著により高く、これは、Ｋａｒ２ｐ及びＨＡＣ１スプライシング型の共発現の結果のようであり、これらはまた、最も高い発現を示すクローンである５Ａ６及び９Ｃ４にも存在している。最も高い収量を示したクローンは全て、ＨＡＣ１スプライシング型を共発現していた（表１及び２）。
実施例２：個々の補助タンパク質の発現を増強させた場合のナノボディＡの収量の評価
個々の補助タンパク質ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型を、実施例１．３に記載のようなゲノム内に１コピーを超えるナノボディ発現カセットを有する基準クローンに形質転換した。形質転換体を、ゼオシン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。ナノボディＡと特定の補助タンパク質の両方を含有している共形質転換体が得られた。振盪フラスコでの発現を、５mLのＢＭＣＭ培地の培養液中で実施し、ピキアプロトコール（例えば、Methods in molecular biology 2007, Humana Press Inc.を参照）に記載されているようなメタノールの添加によって誘導した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（図３）。補助タンパク質の１つを共発現している全てのクローンが、ナノボディＡの収量の有意な増加を示した。ここでも、本発明者らは、ＨＡＣ１スプライシング型を含有しているクローンが、収量の最大の改善を示したことを観察した。
個々の補助タンパク質ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型を、実施例１．３に記載のようなゲノム内に１コピーを超えるナノボディ発現カセットを有する基準クローンに形質転換した。形質転換体を、ゼオシン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。ナノボディＡと特定の補助タンパク質の両方を含有している共形質転換体が得られた。振盪フラスコでの発現を、５mLのＢＭＣＭ培地の培養液中で実施し、ピキアプロトコール（例えば、Methods in molecular biology 2007, Humana Press Inc.を参照）に記載されているようなメタノールの添加によって誘導した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（図３）。補助タンパク質の１つを共発現している全てのクローンが、ナノボディＡの収量の有意な増加を示した。ここでも、本発明者らは、ＨＡＣ１スプライシング型を含有しているクローンが、収量の最大の改善を示したことを観察した。
実施例３：個々の補助タンパク質の発現を増強させた場合のナノボディＢの収量の評価
３．１ 発現ベクターの構築
ナノボディＢは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＢ内のサブユニットは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではなく、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しない。該サブユニットは、３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＢは、Ｐ．パストリスにおいて発酵させると非常に低い収量（０．２９ｇ/Ｌ又はそれ以下）を与えることが示された。
３．１ 発現ベクターの構築
ナノボディＢは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＢ内のサブユニットは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではなく、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しない。該サブユニットは、３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＢは、Ｐ．パストリスにおいて発酵させると非常に低い収量（０．２９ｇ/Ｌ又はそれ以下）を与えることが示された。
ナノボディＢのコード情報を含有しているＤＮＡ断片を、ゼオシン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有しているピキア発現ベクター（ｐＰｐＴ４＿Ａｌｐｈａ＿Ｓの誘導体：Naatsaari et al. 2012, PLoS One 7: e39720）のマルチクローニングサイトに、ナノボディ配列が、ａＭＦシグナルペプチド配列の下流かつ読み枠内となるようにクローニングした。補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型、Ｋａｒ２ｐ、ＰＤＩ１及びＲＰＰ０のコード配列を、ブラストサイジン（商標）耐性遺伝子マーカーを含有しているピキア発現ベクターにクローニングした。ナノボディと補助タンパク質の両方が、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下にあった。
３．２ 形質転換
個々の補助タンパク質のＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型を、ピキア・パストリス株のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０（ＡＴＣＣ番号７６２７３）に形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いて、ナノボディＢを用いて形質転換した。
個々の補助タンパク質のＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型を、ピキア・パストリス株のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０（ＡＴＣＣ番号７６２７３）に形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いて、ナノボディＢを用いて形質転換した。
３．３ 個々のクローンの発現収量の決定
発現分析を、実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表３）。ＨＡＣ１スプライシング型補助タンパク質を共発現しているクローンのみが、ナノボディＢの収量の大きな増加を示し、ここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現が、収量を最も効果的に改善することを示す。
発現分析を、実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表３）。ＨＡＣ１スプライシング型補助タンパク質を共発現しているクローンのみが、ナノボディＢの収量の大きな増加を示し、ここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現が、収量を最も効果的に改善することを示す。
実施例４：個々の補助タンパク質の発現を増強させた場合の良好な発現を示すナノボディＣの収量の評価
ナノボディＣは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＣ内のサブユニットは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではない。Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは、３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。個々の補助タンパク質のＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型は、実施例３に記載のようにクローニングされ、ピキア・パストリス株のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０に形質転換された。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いて、ナノボディＣを用いて形質転換した。発現分析を実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表４）。
ナノボディＣは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＣ内のサブユニットは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではない。Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは、３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。個々の補助タンパク質のＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、ＲＰＰ０及びＨＡＣ１スプライシング型は、実施例３に記載のようにクローニングされ、ピキア・パストリス株のＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０に形質転換された。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いて、ナノボディＣを用いて形質転換した。発現分析を実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表４）。
ＨＡＣ１スプライシング型と補助タンパク質とを共発現しているクローンのみが、ナノボディＣの収量の有意な増加を示した。このことはここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現が、ナノボディの収量の改善に最も効果的であることを示す。このことは、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の増強された発現がまた、良好な発現を示すナノボディの収量も増加させることができることを示す。
実施例５：補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の発現を増強させた場合の様々なナノボディ（ナノボディＤ、ナノボディＥ、ナノボディＦ、ナノボディＧ、及びナノボディＨ）の発現収量の評価
ナノボディＤは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＤ内のＮ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ｃ−Ｍｅｔへの結合に対して特異的であるが、Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは９Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＤの配列（配列番号５０）を表Ａ−１に示す。ナノボディＥは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＥ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであるが、中央のサブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットはＧ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＥの配列（配列番号５１）を表Ａ−１に示す。ナノボディＦは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＦ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインである。ナノボディＦ内のサブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しない。該サブユニットは３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＦの配列（配列番号５２）を表Ａ−１に示す。ナノボディＧ及びＨは、重鎖ラマ抗体の４つの配列の最適化された可変ドメインからなる四価ナノボディである。ナノボディＧ及びＨ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであるが、中央のサブユニットの１つはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＧ及びＨの配列（それぞれ配列番号５３及び配列番号５４）を表Ａ−１に示す。ナノボディＩはＴＮＦに特異的に結合する一価ナノボディである。ナノボディＩは、Ｃ末端伸長として１つのアラニン残基をさらに含む、１つの配列の最適化された可変ドメインから実質的になる。ナノボディＩは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではない。ナノボディＩの配列（配列番号５５）を表Ａ−１に示す。
ナノボディＤは、重鎖ラマ抗体の２つの配列の最適化された可変ドメインからなる二価ナノボディである。ナノボディＤ内のＮ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであり、ｃ−Ｍｅｔへの結合に対して特異的であるが、Ｃ末端サブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは９Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＤの配列（配列番号５０）を表Ａ−１に示す。ナノボディＥは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＥ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであるが、中央のサブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットはＧ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＥの配列（配列番号５１）を表Ａ−１に示す。ナノボディＦは、重鎖ラマ抗体の３つの配列の最適化された可変ドメインからなる三価ナノボディである。ナノボディＦ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインである。ナノボディＦ内のサブユニットはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合しない。該サブユニットは３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合し、Ｃ末端Ｆｌａｇ３−Ｈｉｓ６エピトープタグを含有している。ナノボディＦの配列（配列番号５２）を表Ａ−１に示す。ナノボディＧ及びＨは、重鎖ラマ抗体の４つの配列の最適化された可変ドメインからなる四価ナノボディである。ナノボディＧ及びＨ内のＣ末端サブユニットはＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインであるが、中央のサブユニットの１つはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。該サブユニットは３５Ｇ／Ｓリンカーを用いて頭部と尾部が融合している。ナノボディＧ及びＨの配列（それぞれ配列番号５３及び配列番号５４）を表Ａ−１に示す。ナノボディＩはＴＮＦに特異的に結合する一価ナノボディである。ナノボディＩは、Ｃ末端伸長として１つのアラニン残基をさらに含む、１つの配列の最適化された可変ドメインから実質的になる。ナノボディＩは、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインではない。ナノボディＩの配列（配列番号５５）を表Ａ−１に示す。
個々の補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型を３．１に記載のようにクローニングし、ピキア・パストリス株ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０に形質転換した。形質転換体を、ブラストサイジン（商標）を含有している選択培地上で増殖させた。単一のクローンを単離し、続いてナノボディＤ、Ｅ、Ｆ、Ｇ又はＨを用いて形質転換した。発現分析を、実施例１．５に記載のように実施した。タンパク質の相対的定量は、クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度スキャン測定を用いて実施された（表５）。ＨＡＣ１スプライシング型補助タンパク質の発現の増強は、全てのナノボディの収量を改善した。このことはここでも、補助タンパク質のＨＡＣ１スプライシング型の発現の増強が、ナノボディの収量を効果的に改善することを実証する。
Claims (55)
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドの生成方法であって、該方法は、ピキア宿主において該ポリペプチドを発現させる工程、及び該ピキア宿主において補助タンパク質ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）の発現を同時に増強させる工程を含む、前記方法。
- ポリペプチドを単離及び／又は精製する工程をさらに含む、請求項１の方法。
- 緩衝液中でポリペプチドを製剤化する工程をさらに含む、請求項１又は２のいずれかの方法。
- ポリペプチドを医薬組成物として製剤化する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれかの方法。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドを発現するか又は適切な環境下で発現することのできるピキア宿主であって、ここでは補助タンパク質ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）の発現が増強されている、前記宿主。
- ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が、ピキア宿主に、
−ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸（群）；及び／又は
−ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現を制御している１つ以上の強力なプロモーター（群）
の導入によって増強される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法又は請求項５記載のピキア宿主。 - 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドと、ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質が、同じ遺伝子構築物から発現される、請求項６記載の方法又はピキア宿主。
- ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸が、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の下流の遺伝子構築物上に位置する、請求項７記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、同じプロモーターによって制御される、請求項７又は８のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、異なるプロモーターによって制御される、請求項７又は８のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質が、異なる遺伝子構築物から発現される、請求項６記載の方法又はピキア宿主。
- 異なる遺伝子構築物からの、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、同じである別々のプロモーターによって制御される、請求項１１記載の方法又はピキア宿主。
- 異なる遺伝子構築物からの、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の転写、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の転写が、異なる別々のプロモーターによって制御される、請求項１１記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか若しくは実質的にからなるポリペプチド及び／又はＨＡＣ１スプライシング型タンパク質が、染色体から発現される、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
- ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質の発現が、ピキア宿主の染色体への強力なプロモーターの導入によって増強される、請求項１４記載の方法又はピキア宿主。
- 強力なプロモーターによって制御されるＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている１つ以上の核酸が、ピキア宿主の染色体に導入される、請求項１４記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸が、ピキア宿主の染色体に導入される、請求項１４記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）のコピー数が１である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸（群）のコピー数が２又はそれ以上である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
- ピキア宿主がピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法又はピキア宿主。
- ピキア・パストリス株が、Ｘ３３及びＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０から選択される、請求項２０記載の方法又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしかつＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）をコードしている核酸。
- 遺伝子構築物の形態である、請求項２２記載の核酸。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸と、ＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）をコードしている核酸とを含む、遺伝子構築物。
- ＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸が、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の下流に位置する、請求項２４記載の遺伝子構築物。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の発現、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現が、同じプロモーターによって制御される、請求項２４又は２５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチドをコードしている核酸の発現、及びＨＡＣ１スプライシング型タンパク質をコードしている核酸の発現が、異なるプロモーターによって制御される、請求項２４又は２５のいずれかに記載の遺伝子構築物。
- 請求項２４〜２７のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む、請求項５〜２１のいずれかに記載のピキア宿主。
- １つ以上の追加の補助的タンパク質の発現が増強されている、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 追加の補助的タンパク質が、ＰＤＩ１、Ｋａｒ２ｐ、及びＲＰＰ０から選択される、請求項２９記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 補助的タンパク質の数が２である、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ２つの補助的タンパク質が、以下の２つの補助的タンパク質の組合せ：
−ＰＤＩ１（配列番号５）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）
から選択される、請求項３１記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。 - 補助的タンパク質の数が３である、請求項２９又は３０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ３つの補助的タンパク質が、以下の３つの補助的タンパク質の組合せ：
−ＰＤＩ１（配列番号５）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；
−Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）；並びに
−ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）
から選択される、請求項３３記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。 - ＰＤＩ１（配列番号５）、Ｋａｒ２ｐ（配列番号４）、ＲＰＰ０（配列番号６）及びＨＡＣ１スプライシング型（配列番号１４）の発現が増強される、請求項２９記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが一価ポリペプチドである、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインが、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になり、ＣＤＲ１は配列番号５８であり、ＣＤＲ２は配列番号６０であり、ＣＤＲ３は配列番号６２である、請求項１〜３６に記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインが配列番号５６である、請求項１〜３７に記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが、場合により１つ以上のペプチドリンカーを介して連結された、１つ以上の他の残基又は結合単位をさらに含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 前記の１つ以上の他の残基又は結合単位が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項３９記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが多価構築物である、請求項３９又は４０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが、二価、三価、又は四価ポリペプチドである、請求項４１記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 前記の１つ以上の他の結合単位が、前記の１つ以上の結合単位を含まないポリペプチドと比較して、延長された半減期を有するポリペプチドを提供する、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 延長された半減期を有するポリペプチドを提供する前記の１つ以上の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に結合することのできる結合単位からなる群より選択される、請求項４３記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが、血清アルブミンに結合する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、請求項４４記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドがＣ末端伸長Ｘ（ｎ）をさらに含み、ｎは１〜５、例えば１、２、３、４又は５であり、Ｘは天然アミノ酸であり、好ましくはシステインを全く含まない、請求項１〜４５のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが配列番号５５を含むか又は実質的にからなる、請求項１〜４６のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディから選択される、請求項１〜４７のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインが、２つ以上のジスルフィド架橋を含む、請求項４８記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- １つ以上の結合単位が、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディから選択される、請求項３９〜４９のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ナノボディが、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、及びラクダ化重鎖可変ドメインから選択される、請求項４８又は５０のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ＶＨＨが、ＶＨＨ１型免疫グロブリン単一可変ドメインの群に属する、請求項５１記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- ポリペプチドが、標準的なピキア発現条件下でピキア宿主において発現させた場合に得られる収量が、ピキア宿主内の該ポリペプチドをコードしている核酸のコピー数と逆相関を示す、ポリペプチドの群から選択される、請求項１〜５２のいずれかに記載の方法、核酸、遺伝子構築物、又はピキア宿主。
- 請求項１〜４、６〜２１、又は２９〜５３の方法のいずれかによって得ることのできる、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含むか又は実質的にからなるポリペプチド。
- 請求項５４のポリペプチドを含む医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2024038103A JP2024073531A (ja) | 2016-02-12 | 2024-03-12 | 免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662294470P | 2016-02-12 | 2016-02-12 | |
| US62/294,470 | 2016-02-12 | ||
| PCT/EP2017/053034 WO2017137579A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-02-10 | Method for the production of immunoglobulin single variable domains |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2024038103A Division JP2024073531A (ja) | 2016-02-12 | 2024-03-12 | 免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019507748A true JP2019507748A (ja) | 2019-03-22 |
Family
ID=58018106
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018542263A Pending JP2019507748A (ja) | 2016-02-12 | 2017-02-10 | 免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 |
| JP2024038103A Pending JP2024073531A (ja) | 2016-02-12 | 2024-03-12 | 免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2024038103A Pending JP2024073531A (ja) | 2016-02-12 | 2024-03-12 | 免疫グロブリン単一可変ドメインの生成方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10975141B2 (ja) |
| EP (1) | EP3414268A1 (ja) |
| JP (2) | JP2019507748A (ja) |
| CN (1) | CN108699151B (ja) |
| AU (2) | AU2017216864B2 (ja) |
| CA (1) | CA3014443A1 (ja) |
| WO (1) | WO2017137579A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021187560A1 (ja) * | 2020-03-19 | 2021-09-23 | 国立大学法人神戸大学 | 内在性遺伝子の発現が増強された遺伝子組換え細胞の製造方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3014443A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-17 | Ablynx Nv | Method for the production of immunoglobulin single variable domains |
| WO2019187911A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2019-10-03 | 国立大学法人神戸大学 | 新規細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 |
| CN114981300A (zh) * | 2019-12-06 | 2022-08-30 | 艾伯霖克斯公司 | 包含靶向TNFα和IL-23的免疫球蛋白单个可变结构域的多肽 |
| CN110964113B (zh) * | 2019-12-24 | 2021-09-03 | 北京纽安博生物技术有限公司 | 介导结合免疫球蛋白的单域抗体、由其构建的双功能抗体及其应用 |
| WO2021198260A1 (en) | 2020-03-30 | 2021-10-07 | Ablynx Nv | Method for the production and purification of multivalent immunoglobulin single variable domains |
| FR3120877A1 (fr) | 2021-03-19 | 2022-09-23 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Cellule immunitaire comprenant un récepteur Fc à sa surface, et sur lequel est greffé une molécule hybride comprenant un fragment Fc d’anticorps et au moins un peptide citrulliné dérivé de la fibrine, et ses utilisations |
| FR3120865A1 (fr) | 2021-03-19 | 2022-09-23 | Arthritis Recherche & Developpement | Molécule hybride comprenant un fragment Fc d’anticorps et au moins un peptide citrulliné dérivé de la fibrine, et ses utilisations |
| FR3120866A1 (fr) | 2021-03-19 | 2022-09-23 | Universite Toulouse Iii - Paul Sabatier | Molécule hybride comprenant un peptide citrulliné dérivé de la fibrine et un anticorps ou fragment d’anticorps se liant à CD38 et/ou CD138, et ses utilisations |
| CN114920839B (zh) * | 2022-06-17 | 2023-03-10 | 天津大学 | 特异性结合il-23的纳米抗体及其用途 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007132949A1 (ja) * | 2006-05-16 | 2007-11-22 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | タンパク質の高分泌生産方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9212226B2 (en) | 2008-05-16 | 2015-12-15 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against CXCR4 and other GPCRs and compounds comprising the same |
| PT2424889E (pt) | 2009-04-30 | 2015-11-12 | Ablynx Nv | Método de produção de anticorpos de domínio |
| US8440456B2 (en) * | 2009-05-22 | 2013-05-14 | Vib, Vzw | Nucleic acids of Pichia pastoris and use thereof for recombinant production of proteins |
| WO2011161266A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Ablynx Nv | Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4 |
| CA2831415A1 (en) * | 2011-03-28 | 2012-10-04 | Ablynx Nv | Bispecific anti-cxcr7 immunoglobulin single variable domains |
| ES2815572T3 (es) | 2014-05-16 | 2021-03-30 | Ablynx Nv | Dominios variables de inmunoglobulina |
| CA3014443A1 (en) | 2016-02-12 | 2017-08-17 | Ablynx Nv | Method for the production of immunoglobulin single variable domains |
-
2017
- 2017-02-10 CA CA3014443A patent/CA3014443A1/en active Pending
- 2017-02-10 WO PCT/EP2017/053034 patent/WO2017137579A1/en active Application Filing
- 2017-02-10 EP EP17704752.9A patent/EP3414268A1/en active Pending
- 2017-02-10 US US16/076,314 patent/US10975141B2/en active Active
- 2017-02-10 CN CN201780010990.9A patent/CN108699151B/zh active Active
- 2017-02-10 JP JP2018542263A patent/JP2019507748A/ja active Pending
- 2017-02-10 AU AU2017216864A patent/AU2017216864B2/en active Active
-
2020
- 2020-07-30 US US16/943,022 patent/US11851480B2/en active Active
-
2023
- 2023-09-19 AU AU2023233070A patent/AU2023233070A1/en not_active Abandoned
-
2024
- 2024-03-12 JP JP2024038103A patent/JP2024073531A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007132949A1 (ja) * | 2006-05-16 | 2007-11-22 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | タンパク質の高分泌生産方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ACS SYNTH BIOL., 2016 MAY 13, VOL. 5, NO. 10, PP. 1070-1075, JPN6021010352, ISSN: 0004623242 * |
| BIOTECHNOL BIOENG. 2006 MAR 28, VOL. 94, NO. 2, PP. 353-361, JPN6021010346, ISSN: 0004935503 * |
| MICROB CELL FACT., 2010 JUN 30, VOL. 9, ARTICLE NO. 49 (PP. 1-12), JPN6021010350, ISSN: 0004935505 * |
| TRENDS BIOTECHNOL., 2003 NOV, VOL. 21, NO. 11, PP. 484-490, JPN6021010347, ISSN: 0004935504 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021187560A1 (ja) * | 2020-03-19 | 2021-09-23 | 国立大学法人神戸大学 | 内在性遺伝子の発現が増強された遺伝子組換え細胞の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2017216864A1 (en) | 2018-07-26 |
| US20210047392A1 (en) | 2021-02-18 |
| US11851480B2 (en) | 2023-12-26 |
| WO2017137579A1 (en) | 2017-08-17 |
| CN108699151A (zh) | 2018-10-23 |
| US10975141B2 (en) | 2021-04-13 |
| CN108699151B (zh) | 2022-08-12 |
| AU2017216864B2 (en) | 2023-06-22 |
| AU2023233070A1 (en) | 2023-10-05 |
| JP2024073531A (ja) | 2024-05-29 |
| US20190194302A1 (en) | 2019-06-27 |
| CA3014443A1 (en) | 2017-08-17 |
| EP3414268A1 (en) | 2018-12-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11851480B2 (en) | Method for the production of immunoglobulin single variable domains | |
| EP2707382B1 (en) | Method for the production of immunoglobulin single variable domains | |
| EP2632946B1 (en) | Method for the production of immunoglobulin single variable domains | |
| US11225667B2 (en) | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris | |
| JP2016516412A (ja) | 酵母及び他の形質転換細胞中のポリペプチドの高収率発現のための温度シフト | |
| CA2845579C (en) | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris | |
| EP2990485B1 (en) | Fd chain gene or l chain gene each capable of increasing secretion amount of fab-type antibody | |
| US20190390239A1 (en) | Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells | |
| JP2019104699A (ja) | 二重特異性抗体 | |
| CN111655296A (zh) | 编码肽接头的经改良核苷酸序列 | |
| WO2024133538A1 (en) | Host cells with pat1 knockout for increased specific protein productivity | |
| NZ621199B2 (en) | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris | |
| NZ721102B2 (en) | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200203 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210323 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210622 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211026 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220125 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220517 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220915 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220915 |
|
| C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20220927 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20221027 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20221101 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20221209 |
|
| C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20221213 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240312 |