CN113981027A - 制备治疗性蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备治疗性蛋白质的方法。具体地，本申请涉及一种制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括：培养胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞；用以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；(ii)编码能够使所述细胞中的谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质的核酸；以及(iii)编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

Description

制备治疗性蛋白质的方法

本申请是申请日为2016年4月27日，申请号为201680037233.6， 发明名称为“制备治疗性蛋白质的方法”的申请的分案申 请

发明背景

使用哺乳动物细胞表达系统生产治疗性蛋白质在生物技术产业 中越来越重要。已经描述了多种培养和转染系统，但每一种都具有显 着的局限性。

发明内容

本文描述的发明部分地基于以下发现：胆固醇营养缺陷型细胞与 一种或多种额外的选择性标志物的组合可用于制备治疗性蛋白质的 方法，以避免与胆固醇营养缺陷型细胞相关的意外的制备问题(例如， 低生产率)。在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的 方法，该方法包括：培养具胆固醇营养缺陷型和谷氨酰胺营养缺陷型 的细胞；用以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆 固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；(ii)编码能够使所述细胞中的 谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质的核酸；以及(iii)编码所述治疗性 蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞； 以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码谷氨酰胺 合成酶。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在 外源引入的谷氨酰胺的情况下(例如，在核酸(ii)转染之后)培养 所述细胞。在一些实施方案中，在存在谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如， 甲硫氨酸亚砜亚胺)的情况下(例如，在核酸(ii)转染期间和/或之 后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶 抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/或之后)培养所述 细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且不存在外源 引入的谷氨酰胺的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存 在外源引入的胆固醇、不存在外源引入的谷氨酰胺并且存在谷氨酰胺 合成酶抑制剂(例如，甲硫氨酸亚砜亚胺)的情况下培养所述细胞。 在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如，在 核酸(i)转染之后)培养所述细胞，并且在不存在外源引入的谷氨酰 胺的情况下(例如，在核酸(ii)转染之后)培养所述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞： (i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸； (ii)编码表达一种或多种选择性标志物的蛋白质的核酸；以及(iii) 编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件 下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。

在一些实施方案中，核酸(i)编码3-酮基类固醇还原酶。

在一些实施方案中，核酸(ii)编码谷氨酰胺合成酶、二氢叶酸 还原酶(DHFR)或一种或多种抗生素(例如，新霉素、杀稻瘟素、 潮霉素、嘌呤霉素、Zeocin、霉酚酸)抗性基因。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在 3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和 /或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆 固醇的情况下培养所述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养不表达功能性二氢叶酸还原酶(DHFR)的胆固醇营 养缺陷型细胞；用以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞 中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；(ii)编码DHFR的核酸； 以及(iii)编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质 表达的条件下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在 DHFR抑制剂(例如，甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX))的情况下(例如， 在核酸(ii)转染期间和/或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中， 在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转 染期间和/或之后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在 DHFR抑制剂(例如，甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX))的情况下培养所 述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对新霉素敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸 转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的 蛋白质的核酸；(ii)编码新霉素抗性基因的核酸；以及(iii)编码 所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培 养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码来自编码 氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH 3‘II)的Tn5的新霉素抗性基因。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，第一表达载体和第二表达载体均含有HC和 LC，一种载体含有KSR并且另一种载体含有GS或另一种抗生素抗 性基因。在一些实施方案中，存在三种单独的载体(例如，用于三重 选择)，其中全部三种载体都含有HC和LC；第一载体含有KSR， 第二载体含有GS，而第三载体含有任意的抗生素抗性基因，例如NEO。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在氨 基糖苷类抗生素(例如，G418)的情况下(例如，在核酸(ii)转染 期间和/或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/或之 后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在氨 基糖苷类抗生素(例如，G418)的情况下培养所述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对杀稻瘟素敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核 酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复 的蛋白质的核酸；(ii)编码杀稻瘟素抗性基因的核酸；以及(iii) 编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件 下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码来自蜡状 芽胞杆菌(Bacillus cereus)的杀稻瘟素抗性基因(其编码杀稻瘟素-S 脱氨酶)。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在肽 基核苷抗生素(例如，杀稻瘟素)的情况下(例如，在核酸(ii)转 染期间和/或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/或 之后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在肽 基核苷抗生素氨基糖苷类抗生素(例如，杀稻瘟素)的情况下培养所 述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对潮霉素B敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核 酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复 的蛋白质的核酸；(ii)编码潮霉素B抗性基因的核酸；以及(iii) 编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件 下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码潮霉素B 磷酸转移酶。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在氨 基糖苷类抗生素(例如，潮霉素B)的情况下(例如，在核酸(ii) 转染期间和/或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/ 或之后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在肽 基核苷抗生素氨基糖苷类抗生素(例如，潮霉素B)的情况下培养所 述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对嘌呤霉素敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核 酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复 的蛋白质的核酸；(ii)编码嘌呤霉素抗性基因的核酸；以及(iii) 编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件 下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码嘌呤霉素 N-乙酰转移酶。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在氨 基核苷抗生素(例如，嘌呤霉素)的情况下(例如，在核酸(ii)转 染期间和/或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/或 之后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在肽 基核苷抗生素氨基核苷抗生素(例如，嘌呤霉素)的情况下培养所述 细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对Zeocin敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用以下核酸 转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的 蛋白质的核酸；(ii)编码Zeocin抗性基因的核酸；以及(iii)编码 所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培 养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码Sh ble基 因产物。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在铜 螯合的糖肽抗生素(例如，Zeocin)的情况下(例如，在核酸(ii) 转染期间和/或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/ 或之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆 固醇的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入 的胆固醇并且存在铜螯合的糖肽抗生素(例如，Zeocin)的情况下培养所述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对霉酚酸(MPA)敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用 以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合 成恢复的蛋白质的核酸；(ii)编码MPA抗性基因的核酸；以及(iii) 编码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件 下培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在 MPA的情况下(例如，在核酸(ii)转染期间和/或之后)培养所述细 胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下 (例如，在核酸(i)转染期间和/或之后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在MPA的情况下培养所述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养对霉酚酸(MPA)敏感的胆固醇营养缺陷型细胞；用 以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使细胞中的胆固醇生物合成恢 复的蛋白质的核酸；(ii)编码MPA抗性基因的核酸；以及(iii)编 码所述治疗性蛋白质的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下 培养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iii)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在 MPA的情况下(例如，在核酸(ii)转染期间和/或之后)培养所述细 胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶抑制剂的情况下 (例如，在核酸(i)转染期间和/或之后)培养所述细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下培养所 述细胞。在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且存在 MPA的情况下培养所述细胞。

在一方面，本公开内容的特征在于制备治疗性蛋白质的方法，该 方法包括：培养胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞；用 以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合 成恢复的蛋白质(例如，KSR)的核酸；(ii)编码能够使所述细胞 中的谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质(例如，谷胱甘肽合成酶)的核 酸；(iii)编码能够提供对G418的抗性的蛋白质的核酸(例如，新 霉素抗性基因)；以及(iv)编码所述治疗性蛋白质(例如，抗体， 例如重链和轻链)的核酸；在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培 养所述细胞；以及分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

在一些实施方案中，首先将核酸(iii)转染，并在转染期间和/ 或转染后将G418添加至细胞培养基。在一些实施方案中，首先将核 酸(iii)转染，并在转染期间和/或转染后将G418添加至细胞培养基； 并且第二步将核酸(ii)转染，并在转染期间和/或转染后，细胞培养 基中不存在胆固醇。在一些实施方案中，首先将核酸(iii)转染，并 在转染期间和/或转染后将G418添加至细胞培养基；并且第二步将核 酸(ii)转染，并在转染期间和/或转染后，细胞培养基中不存在胆固 醇(例如，外源添加的胆固醇)；并且第三步将核酸(i)转染，并在 转染期间/转染后，细胞培养基中不存在谷氨酰胺(例如，外源添加的 谷氨酰胺)(任选地将甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)添加至细胞培养基)。

在一些实施方案中，将核酸(ii)和(i)同时转染，其中将G418 添加至细胞培养基，并且该细胞培养基不含胆固醇(例如，外源添加 的胆固醇)。在一些实施方案中，将核酸(i)、(ii)、(iii)和(iv) 同时转染，其中将G418添加至细胞培养基，并且该细胞培养基不含胆固醇(例如，外源添加的胆固醇)并且不含谷氨酰胺(例如，外源 添加的谷氨酰胺)(任选地将甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)添加至细胞 培养基)。在一些实施方案中，将核酸(iv)掺入与(i)、(ii)和 (iii)中的每一个均相同的核酸序列(例如，载体)中。在一些实施 方案中，将核酸(iv)掺入与(i)和(ii)；(i)和(iii)；或(ii) 和(iii)中的每一个均相同的核酸序列(例如，载体)中。在一些实 施方案中，核酸(iv)编码治疗性抗体的重链和轻链。在一些实施方 案中，将所述轻链掺入与(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)； 或(i)、(ii)和(iii)中的每一个均相同的核酸序列(例如，载体) 中。在一些实施方案中，将所述重链掺入与(i)和(ii)；(i)和(iii)； (ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)中的每一个均相同的核酸序 列(例如，载体)中。在一些实施方案中，将所述轻链和重链掺入与 (i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii) 中的每一个均相同的核酸序列(例如，载体)中。

在一些实施方案中，将核酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的 任一种掺入单个核酸(例如，单个载体)中。例如，在一些实施方案 中，将核酸(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)、 (ii)和(iii)；(i)、(ii)、(iii)和(iv)；(ii)和(iii)； 或(ii)和(iv)；(iii)和(iv)掺入单个核酸上。在一些实施方案 中，核酸(iv)包含两种单独的核酸，一种编码治疗性抗体的重链， 而一种编码治疗性抗体的轻链。在一些实施方案中，将所述重链掺入 另一核酸例如(i)、(ii)或(iii)上。在一些实施方案中，将所述 轻链掺入另一核酸例如(i)、(ii)或(iii)上。

在一个实施方案中，所述细胞为NS0细胞。

在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质为抗体。在一些实施方案 中，所述治疗性蛋白质为融合蛋白。在一些实施方案中，所述治疗性 蛋白质为含Fc的融合蛋白。

在一些实施方案中，在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体 重链的核酸(iv)转染所述细胞。在一些实施方案中，核酸(i)编码 3-酮基类固醇还原酶。在一些实施方案中，核酸(ii)编码谷氨酰胺 合成酶。在一些实施方案中，核酸(iii)编码新霉素抗性基因。

在一些实施方案中，第一表达载体包含核酸(i)和(iv)，并且 第二表达载体包含核酸(ii)。在一些实施方案中，第一表达载体包 含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iv)。在一些实 施方案中，第一表达载体的转染在第二表达载体的转染之前进行。在 一些实施方案中，第一表达载体的转染与第二表达载体的转染同时进 行。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如， 在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存在 外源引入的谷氨酰胺的情况下(例如，在核酸(ii)转染之后)培养 所述细胞。在一些实施方案中，在存在谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如， 甲硫氨酸亚砜亚胺)的情况下(例如，在核酸(ii)转染期间和/或之 后)培养所述细胞。在一些实施方案中，在存在3-酮基类固醇还原酶 抑制剂的情况下(例如，在核酸(i)转染期间和/或之后)培养所述 细胞。

在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇并且不存在外源 引入的谷氨酰胺的情况下培养所述细胞。在一些实施方案中，在不存 在外源引入的胆固醇、不存在外源引入的谷氨酰胺并且存在谷氨酰胺 合成酶抑制剂(例如，甲硫氨酸亚砜亚胺)的情况下培养所述细胞。 在一些实施方案中，在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如，在 核酸(i)转染之后)培养所述细胞，并且在不存在外源引入的谷氨酰 胺的情况下(例如，在核酸(ii)转染之后)培养所述细胞。

附图说明

图1示出了本文所述方法的示例性方案。

图2示出了3-酮基类固醇还原酶的NCBI参考氨基酸序列 (NP_057455)(SEQ IDNo.1)。

图3示出了HSD17β7的NCBI参考mRNA序列(NM_016371.3) (SEQ ID No.2)。

图4示出了谷氨酰胺合成酶的NCBI参考氨基酸序列 (NP_002056.2)(SEQ IDNo.3)。

图5A至5E示出了谷氨酰胺合成酶的NCBI参考mRNA序列 (NM_002065.6)(SEQ IDNo.4)。

图6示出了二氢叶酸还原酶(DHFR)的NCBI参考氨基酸序列(NP_000782.1)(SEQ IDNo.5)。

图7A-7B示出了DHFR的NCBI参考mRNA序列(NM_000791.3) (SEQ ID No.6)。

图8示出了使用3-KSR细胞培养系统产生的蛋白质的稳定性。图 8列出了对于10种不同的3-KSR细胞克隆，3-KSR细胞上清液中的 最终蛋白质效价。四种克隆(3-261、3-330、3-351、3-997)表现出 高蛋白质效价。然而，如图8进一步所示，3-KSR克隆3-351表现出 细胞单位生产率的下降。

图9为示出使用Neo(100μg/ml或200μg/ml G418)进行的细胞 选择的线图。该图示出了细胞活力与回收后天数的关系。

图10为示出使用谷胱甘肽合成酶(GS)(分别将谷氨酰胺浓度 从2mM降低至0mM或从0.5mM降至0mM)进行的细胞选择的线 图。该图示出了细胞活力与回收后天数的关系。

图11为示出使用3-KSR、neo和GS作为三重选择而进行的细胞 选择的线图。该图示出了细胞活力与回收后天数的关系。neo基因可 以赋予对G418的抗性。NS0中G418的浓度为100ug/ml和200ug/ml； 将谷氨酰胺浓度从2mM降低至0mM或从0.5mM至0mM。还可使 用MSX抑制剂来抑制GS活性。

具体实施方式

在某些重组蛋白质生产系统如NS0宿主细胞系统中，通过将3- 酮基类固醇还原酶(3-KSR)基因引入编码治疗性蛋白质的载体中来 开发胆固醇营养缺陷体，并且通过从培养基中除去胆固醇而选择重组 细胞(US20100028940)。然而，本公开的发明人出人意料地发现， 由于在该细胞系中难以扩增，该系统可能具有低生产率(例如，每个 细胞每天的蛋白质产物)和低蛋白质效价(参见例如图8)。在其他 NS0宿主细胞系统中，通过将谷氨酰胺合成酶(GS)基因引入编码治 疗性蛋白质的载体中来开发谷氨酰胺营养缺陷体，并且通过从培养基 中除去谷氨酰胺来选择转染的细胞。另外，可将GS抑制剂添加至培 养基中以驱动针对GS基因的多个拷贝引入(因此针对编码感兴趣蛋 白质的基因)的选择(Barnes等人,Cytotechnology.2000.Advances in animal cell recombinant protein production:GS-NS0 expression system Feb；32(2):109-23)。每个系统均具有不同的局限性。本文描述了在 例如NS0宿主细胞系统中制备治疗性产物的替代方法。

如本文所用的，“谷氨酰胺营养缺陷型”细胞被定义为不合成任何 谷氨酰胺或不合成足以能够在无谷氨酰胺的细胞培养基中存活和生 长的谷氨酰胺的细胞。

如本文所用的，“胆固醇营养缺陷型”细胞被定义为不合成任何胆 固醇或不合成足以能够在无胆固醇的细胞培养基中存活和生长的胆 固醇的细胞。

如本文所用的，“使谷氨酰胺生物合成恢复”是指将细胞中的谷氨 酰胺生物合成水平(从谷氨酰胺营养缺陷型细胞中的水平)提高到至 少使细胞能够在无谷氨酰胺细胞培养基中存活和生长的水平。

如本文所用的，“使胆固醇生物合成恢复”是指将细胞中的胆固醇 生物合成水平(从胆固醇营养缺陷型细胞中的水平)提高到至少使细 胞能够在无胆固醇细胞培养基中存活和生长的水平。

如本文所用的，“存活和生长”是指如通过台盼蓝排除法测量的， 细胞或细胞培养物在对数期生长期间维持大于60％的细胞活力的能 力。

3-酮基类固醇还原酶(KSR)

3-酮基类固醇还原酶由HSD17β7基因编码，并在胆固醇的生物 合成中起3-酮基类固醇还原酶的作用(Marijanovic等人,Mol Endocrinol.2003年9月；17(9):1715-25)。NCBI参考氨基酸序列 (NP_057455)和mRNA序列(NM_016371.3)分别参见图2(SEQ ID No.1)和图3(SEQ ID No.2)。

谷氨酰胺合成酶(GS)

由谷氨酰胺合成酶基因编码的谷氨酰胺合成酶催化由谷氨酸和 氨合成谷氨酰胺(Eisenberg等人,Biochimica et Biophysica Acta,2000, Vol 1477,122–145)。已经发现了该基因的几种可变剪接转录物变体。 NCBI参考氨基酸序列NP_002056.2和mRNA序列NP_002056.2分 别参见图4(SEQ ID No.3)和图5(SEQ ID No.4)。

二氢叶酸还原酶(DHFR)

DHFR酶由DHFR基因编码，并将二氢叶酸转化为四氢叶酸—— 一种从头合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸所需的甲基穿梭体(methyl group shuttle)。已经发现了该基因的几种可变剪接转录物变体。NCBI 参考氨基酸序列(NP_000782.1)和mRNA序列(NM_000791.3)分 别参见图6(SEQ ID No.5)和图7(SEQ ID No.6)。

抗生素抗性基因选择性标志物

抗生素抗性基因是哺乳动物细胞培养中常用的阳性选择性标志 物(参见例如Antibody Expression and Production，Mohamed Al-Rubeai 编,Springer Netherlands,Springer Science Business Media B.V.,ISBN 978-94-007-1256-0；Cell LineDevelopment,Mohamed Al-Rubeai,2009 年8月11日,Springer Science&BusinessMedia)。示例性抗生素抗 性基因包括但不限于赋予对新霉素抗性基因、杀稻瘟素、潮霉素、嘌 呤霉素、Zeocin、霉酚酸的抗性的基因。用于细胞选择的合适的抗生 素抗性基因和相应的抑制剂会是本领域技术人员已知的。

表1.示例性抗生素选择性标志物

载体、宿主细胞和治疗性蛋白质的产生

本发明的治疗性蛋白质可由宿主细胞产生。宿主细胞是指包含将 本文所述的多肽和构建体从其相应的核酸表达所需的必需细胞组分 (例如，细胞器)的媒介。核酸可包含在核酸载体中，该核酸载体可 通过本领域已知的常规技术(例如，转化、转染、电穿孔、磷酸钙沉 淀、直接显微注射、感染等)引入到宿主细胞中。核酸载体的选择部 分地取决于待使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞来源于原核生 物(例如，细菌)或真核生物(例如，哺乳动物)。

核酸载体构建与宿主细胞

编码本发明治疗性蛋白质的氨基酸序列的核酸序列可通过本领 域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于寡核苷酸介导的 (或位点定向的)诱变和PCR诱变。编码本发明的治疗性蛋白质的 核酸分子可使用标准技术例如基因合成来获得。或者，可使用本领域 的标准技术，例如QuikChange^TM诱变，使编码野生型治疗性蛋白质 的核酸分子突变，以含有特定的氨基酸置换。可使用核苷酸合成仪或 PCR技术来合成核酸分子。

可将编码本发明的治疗性蛋白质的核酸序列插入能够在原核或 真核宿主细胞中复制并表达核酸分子的载体中。本领域中有许多可用 的载体，并且其可用于本发明的目的。每种载体均可包含可针对与特 定宿主细胞的相容性进行调整和优化的各种组分。例如，载体组分可 包括但不限于复制起点、选择性标志物基因、启动子、核糖体结合位 点、信号序列、编码感兴趣蛋白质的核酸序列和转录终止序列。

在一个实例中，本发明的载体包括：包含用于选择性基因(例如， 3-酮基类固醇还原酶和谷氨酰胺合成酶)的弱启动子和用于编码感兴 趣蛋白质(例如，抗体，例如抗体的重链和轻链)的基因的强启动子 的载体。可对载体进行线性化或超螺旋化，从而表现出提高的转染效 率。在一些实施方案中，采用载体的密码子优化来使编码序列中罕见 密码子的使用减至最少并且提高蛋白质生产产率。Wurm(2004) Nature Biotechnology,Vol 22；Issue 11:1393-1398中描述了本发明的 示例性载体。

在一些实施方案中，使用哺乳动物细胞作为本发明的宿主细胞。 谷氨酰胺营养缺陷型且胆固醇营养缺陷型表型可通过对非谷氨酰胺 营养缺陷型且非胆固醇型营养缺陷型的细胞进行遗传操作来诱导，该 遗传操作包括例如内源性谷氨酰胺生物合成所必需的基因(如谷氨酰 胺合成酶)的突变或缺失。遗传工程化的常用方法是本领域技术人员 公知的，例如，位点定向诱变、锌指核酸酶、shRNA、转座子，参见 例如Cytotechnology.2007年4月；53(1-3):65-73。被称为NS0的鼠骨 髓瘤细胞是已知的谷氨酰胺营养缺陷型且胆固醇营养缺陷型的细胞 (参见例如Barnes等人,Cytotechnology.2000.Advances in animalcell recombinant protein production:GS-NS0 expression system Feb；32(2):109-23；以及US 20100028940)。

可被操作以用作宿主细胞的哺乳动物细胞类型的其他实例包括 但不限于人胚肾(HEK)(例如HEK293，HEK 293F)、中国仓鼠卵 巢(CHO)、HeLa、COS、PC3、Vero、MC3T3、NS0、VERY、BHK、 MDCK、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D)、CRL7030 和HsS78Bst细胞。在其他实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发 明的宿主细胞。大肠杆菌菌株的实例包括但不限于大肠杆菌294 (

31,446)、大肠杆菌λ1776(

31,537)、大肠杆菌BL21(DE3)(

BAA-1025)和大肠杆菌RV308(

31,608)。 不同的宿主细胞具有用于蛋白质产物翻译后加工和修饰的特征性和 特异性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统来确保所表达的治疗性 蛋白质的正确修饰和加工。可使用本领域的常规技术，例如，转化、 转染、电穿孔、磷酸钙沉淀和直接显微注射，将上述表达载体导入合 适的宿主细胞中。一旦将载体导入宿主细胞中用于蛋白质生产，就将 宿主细胞在适当改良的常规营养培养基中培养，以用于诱导启动子、 选择转化体或扩增编码所需序列的基因。用于表达治疗性蛋白质的方 法是本领域已知的，参见例如Paulina Balbas,Argelia Lorence(编)Recombinant Gene Expression:Reviews and Protocols(Methods in MolecularBiology),Humana Press；2004年第二版(2004年7月20日) 以及Vladimir Voynov和JustinA.Caravella(编)Therapeutic Proteins: Methods and Protocols(Methods inMolecular Biology)Humana Press； 2012年第二版(2012年6月28日)。

蛋白质生产、回收和纯化

用于产生本发明的治疗性蛋白质的宿主细胞可在本领域已知的 并且适用于培养选定的宿主细胞的培养基中生长。用于哺乳动物宿主 细胞的合适培养基的实例包括最小必需培养基(MEM)、Dulbecco 改良Eagle培养基(DMEM)、Expi293^TM表达培养基、补充有胎牛血清(FBS)的DMEM，和RPMI-1640。用于细菌宿主细胞的合适培 养基的实例包括加有必需补充剂如选择剂例如氨苄青霉素的Luria肉 汤(LB)。在合适的温度(如约20℃至约39℃，例如25℃至约37 ℃，优选37℃)和CO₂水平如5至10％(优选8％)下培养宿主细胞。 培养基的pH通常为约6.8至7.4，例如7.0，主要取决于宿主生物体。 如果在本发明的表达载体中使用诱导型启动子，则在适合激活该启动 子的条件下诱导蛋白质表达。用于产生治疗性蛋白质的常规细胞培养 条件是本领域已知的，例如参见Butler,Cell Culture and UpstreamProcessing,Taylor&Francis；第一版(2007年5月25日)。

蛋白质回收通常涉及破坏宿主细胞，该破坏通常通过诸如渗透压 休克、声处理或裂解等手段进行。一旦将细胞破坏，就可通过离心或 过滤去除细胞碎片。可进一步纯化蛋白质。可通过蛋白质纯化领域已 知的任何方法来纯化本发明的抗体，例如，通过蛋白A亲和层析、其 他层析(例如，离子交换层析、亲和层析和大小排阻柱层析)、离心、 溶解度差异或通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。(参见 Process Scale Purification ofAntibodies,Uwe Gottschalk(编)John Wiley&Sons,Inc.,2009)。在一些情况下，可将治疗性蛋白质与标志 物序列如肽相缀合，以促进纯化。标记氨基酸序列的一个实例为以微 摩尔亲和力结合镍官能化琼脂糖亲和柱的六组氨酸肽(His-标签)。 对纯化有用的其他肽标签包括但不限于血凝素“HA”标签，其对应于 来源于流感血凝素蛋白质的表位。

药物组合物和制剂

本发明的特征在于包含一种或多种本文所述的治疗性蛋白质的 药物组合物。除治疗有效量的治疗性蛋白质外，该药物组合物还可含 有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，其可通过本领域技术人 员已知的方法配制。

药物组合物中可接受的载体和赋形剂在所用剂量和浓度下对接 受者是无毒的。可接受的载体和赋形剂可包括缓冲液、抗氧化剂、防 腐剂、聚合物、氨基酸和碳水化合物。本发明的药物组合物可以以可 注射制剂的形式肠胃外施用。可使用无菌溶液或任何药学上可接受的 液体作为媒介物来配制用于注射(即，静脉内注射)的药物组合物。 药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水和细胞培养基 (例如，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、α-改良Eagles培养 基(α-MEM)、F-12培养基)。配制方法是本领域已知的，参见例 如Banga(编)Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation, Processing andDelivery Systems(第二版)Taylor&Francis Group,CRC Press(2006)。

可根据需要以单位剂量形式形成药物组合物。包含在药物制剂中 的活性成分(例如，一种或多种本发明的治疗性蛋白质)的量使得提 供在指定范围内的合适剂量(例如，在0.01-500mg/kg体重范围内的 剂量)。

治疗性蛋白质

可通过本文所述的方法制备的治疗性蛋白质包括任何感兴趣的 重组治疗性蛋白质或其生物相似物，包括但不限于抗体(例如，单克 隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体)、融合蛋白(例如，Fc融合 体)、抗凝血剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白质支架、 酶、生长因子、激素、激素释放因子、干扰素、白细胞介素和溶栓剂。 治疗性蛋白质包括糖基化蛋白质(例如，具有至少一个寡糖链的蛋白 质)和非糖基化蛋白质。

示例性的单克隆抗体包括但不限于阿达木单抗、英夫利昔单抗、 帕利珠单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、依库珠单抗、乌司奴单抗、 戈利木单抗、ofatumab、卡那奴单抗、贝利木单抗、阿利库单抗、美 泊利单抗、奈昔木单抗、纳武单抗、地努图希单抗、苏金单抗、依伏 库单抗、兰妥莫单抗、派姆单抗、雷莫芦单抗、维多珠单抗、司妥昔 单抗、阿托珠单抗、曲妥珠单抗、雷昔库单抗、培妥珠单抗、本妥昔 单抗、伊匹木单抗、地舒单抗、托珠单抗、奥法木单抗、卡那奴单抗、 赛妥珠单抗、卡妥索单抗、雷珠单抗、帕木单抗、贝伐珠单抗、西妥 昔单抗、依法珠单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、替伊莫单抗、阿仑 珠单抗、吉妥珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗和阿昔 单抗(adalimumab,infiliximab,palivizumab,cetuximab,natalizumab, eculizumab,ustekinumab,golimumab,ofatumab,canakinumab,belimumab,alirocumab,mepolizumab,necitumumab,nivolumab, dinutuximab,secukinumab,evolocumab,blinatumomab,pembrolizumab, ramucirumab,vedolizumab,siltuximab,obinutuzumab,trastuzumab, raxibacumab,pertuzumab,brentuximab,ipilimumab,denosumab, tocilizumab,ofatumumab,canakinumab,certolizumab,catumaxomab, ranibizumab,panitumumab,bevacizumab,cetuximab,efalizumab,omalizumab,tositumomab,ibritumomab,alemtuzumab,gemtuzumab, basiliximab,daclizumab,rituximab,and abciximab)。

示例性的融合蛋白包括但不限于阿来西普、依那西普、阿巴西普、 贝拉西普、阿柏西普、ziv-阿柏西普、利纳西普、罗米司亭、apocept、 trebananib、blisibimod和杜拉鲁肽(alefacept,entanercept,abatacept, belatacept,aflibercept,ziv-aflibercept,rilonacept,romiplostim,apocept, trebananib,blisibimod,and dulaglutide)。

其他实施方案

下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为限制 性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容 均通过引用并入本文。

实施例

实施例1.利用双重营养缺陷型细胞制备治疗性抗体

以下实施例描述了制备治疗性蛋白质如抗体的方法，其包括在胆 固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞中表达感兴趣的治疗 性蛋白质。该方法符合预期地允许感兴趣基因的扩增和拷贝数增加， 以及在不存在胆固醇的情况下的生产(胆固醇在水溶液中高度不溶并 且其使用非常具有挑战性)。该示例性方法在图1中进一步概述。

用包含编码3-酮基类固醇还原酶(3-KSR)的核酸的第一载体来 转染谷氨酰胺营养缺陷型且胆固醇营养缺陷型的细胞，如NS0细胞。 在该第一次转染期间和之后，将细胞维持在不含胆固醇的培养基中以 选择表达第一载体的细胞，由此产生表达3-KSR的谷氨酰胺营养缺陷 型细胞培养物。同时或随后，用包含编码谷氨酰胺合成酶(GS)和感 兴趣蛋白质(例如，治疗性抗体的重链和轻链)的核酸的第二载体转 染这些细胞。在该第二次转染期间和之后，将细胞维持在无谷氨酰胺 的细胞培养基中以选择表达第二载体的细胞。为了进一步选择已经引 入多个拷贝的第二载体的细胞，在第二次转染期间和/或之后，为细胞 培养基补充谷氨酰胺合成酶抑制剂，如甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)。 最终的产生3-KSR-GS抗体的细胞可保持在无胆固醇的培养基中，从 而避免与胆固醇相关的制备问题，并且其显示出来源于MSX选择的 高水平生产率。

实施例2：细胞活力测定：

以下实施例描述了用于确定细胞活力的台盼蓝测定法，细胞活力 作为表现出充分存活和生长的细胞的指标。

在pH 7.2至7.3的缓冲等渗盐溶液(即，磷酸盐缓冲盐水)中制 备台盼蓝的0.4％溶液。将0.1mL的台盼蓝储备液添加至1mL的细 胞。加载血细胞计数器并且在低放大倍数的显微镜下立即检查。对蓝 色染色的细胞数目和细胞总数进行计数。细胞活力以血细胞计数器上 网格内的活细胞数目除以细胞总数来计算。如果细胞吸收台盼蓝，则 其被认为是非存活的。对于健康的对数期培养物，细胞活力至少为 90％。

％活细胞＝[1.00-(蓝色细胞数目÷细胞总数)]×100

细胞系悬浮液的细胞密度可使用血细胞计数器来测定。

为了计算每mL培养物中的活细胞数目，使用以下公式来校正稀释因 数：活细胞数目×10E4×1.1＝细胞/mL培养物。

实施例3.利用三重选择方法制备治疗性抗体

以下实施例描述了制备治疗性蛋白质如抗体的方法，其包括在具 有另外的第三选择机制例如新霉素抗性基因(例如，使用G418来选 择)的具胆固醇营养缺陷型和谷氨酰胺营养缺陷型的细胞中表达感兴 趣的治疗性蛋白质。该方法符合预期地允许感兴趣基因的扩增和拷贝 数增加，以及在不存在胆固醇的情况下的生产(胆固醇在水溶液中高 度不溶且其使用非常具有挑战性)，同时克服与3-KSR细胞培养选择 系统相关的意外的制备挑战，包括例如低生产率。

首先使用单一新霉素选择(图9)和单一GS选择(图10)来优 化NSO细胞选择。对于新霉素优化，根据标准惯例，用编码新霉素 抗性基因的核酸载体转染细胞。然后以(100μg/ml或200μg/ml)将 新霉素添加至细胞培养基中以供选择。在回收后的指定天数时测量细胞活力。对于基于GS的选择，用编码GS的核酸载体转染细胞，并 将细胞维持在无谷氨酰胺细胞培养基中。在回收后的指示天数时测量 细胞活力。使用新霉素、3-KSR和GS选择来优化基于3-KSR的三重 选择方法，以克服与3-KSR选择相关的意外的低生产率(图8)。根 据标准惯例，用一种或多种编码3-KSR、GS和新霉素抗性基因的核 酸载体转染细胞。对于选择，将细胞维持在不存在谷氨酰胺和胆固醇 并存在新霉素的情况下。如图11所示，三重选择在回收后维持充足 的细胞活力。

序列表

<110> 动量制药公司

拜奥法克图拉公司

<120> 制备治疗性蛋白质的方法

<130> M2050-7090WO

<140> PCT/US2016/029472

<141> 2016-04-27

<150> 62/153,178

<151> 2015-04-27

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 341

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Lys Val Val Leu Ile Thr Gly Ala Ser Ser Gly Ile Gly Leu

1 5 10 15

Ala Leu Cys Lys Arg Leu Leu Ala Glu Asp Asp Glu Leu His Leu Cys

20 25 30

Leu Ala Cys Arg Asn Met Ser Lys Ala Glu Ala Val Cys Ala Ala Leu

35 40 45

Leu Ala Ser His Pro Thr Ala Glu Val Thr Ile Val Gln Val Asp Val

50 55 60

Ser Asn Leu Gln Ser Val Phe Arg Ala Ser Lys Glu Leu Lys Gln Arg

65 70 75 80

Phe Gln Arg Leu Asp Cys Ile Tyr Leu Asn Ala Gly Ile Met Pro Asn

85 90 95

Pro Gln Leu Asn Ile Lys Ala Leu Phe Phe Gly Leu Phe Ser Arg Lys

100 105 110

Val Ile His Met Phe Ser Thr Ala Glu Gly Leu Leu Thr Gln Gly Asp

115 120 125

Lys Ile Thr Ala Asp Gly Leu Gln Glu Val Phe Glu Thr Asn Val Phe

130 135 140

Gly His Phe Ile Leu Ile Arg Glu Leu Glu Pro Leu Leu Cys His Ser

145 150 155 160

Asp Asn Pro Ser Gln Leu Ile Trp Thr Ser Ser Arg Ser Ala Arg Lys

165 170 175

Ser Asn Phe Ser Leu Glu Asp Phe Gln His Ser Lys Gly Lys Glu Pro

180 185 190

Tyr Ser Ser Ser Lys Tyr Ala Thr Asp Leu Leu Ser Val Ala Leu Asn

195 200 205

Arg Asn Phe Asn Gln Gln Gly Leu Tyr Ser Asn Val Ala Cys Pro Gly

210 215 220

Thr Ala Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Gly Ile Leu Pro Pro Phe Ile Trp

225 230 235 240

Thr Leu Leu Met Pro Ala Ile Leu Leu Leu Arg Phe Phe Ala Asn Ala

245 250 255

Phe Thr Leu Thr Pro Tyr Asn Gly Thr Glu Ala Leu Val Trp Leu Phe

260 265 270

His Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asn Pro Leu Ile Lys Tyr Leu Ser Ala

275 280 285

Thr Thr Gly Phe Gly Arg Asn Tyr Ile Met Thr Gln Lys Met Asp Leu

290 295 300

Asp Glu Asp Thr Ala Glu Lys Phe Tyr Gln Lys Leu Leu Glu Leu Glu

305 310 315 320

Lys His Ile Arg Val Thr Ile Gln Lys Thr Asp Asn Gln Ala Arg Leu

325 330 335

Ser Gly Ser Cys Leu

340

<210> 2

<211> 1537

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

gtactctgat tggtgacggg tgaggcggcc cgaaatcgta ggacttccga aagcagcggc 60

ggcgtttgct tcactgcttg gaagtgtgag tgcgcgaaga tgcgaaaggt ggttttgatc 120

accggggcta gcagtggcat tggcctggcc ctctgcaagc ggctgctggc ggaagatgat 180

gagcttcatc tgtgtttggc gtgcaggaac atgagcaagg cagaagctgt ctgtgctgct 240

ctgctggcct ctcaccccac tgctgaggtc accattgtcc aggtggatgt cagcaacctg 300

cagtcggtct tccgggcctc caaggaactt aagcaaaggt ttcagagatt agactgtata 360

tatctaaatg ctgggatcat gcctaatcca caactaaata tcaaagcact tttctttggc 420

ctcttttcaa gaaaagtgat tcatatgttc tccacagctg aaggcctgct gacccagggt 480

gataagatca ctgctgatgg acttcaggag gtgtttgaga ccaatgtctt tggccatttt 540

atcctgattc gggaactgga gcctctcctc tgtcacagtg acaatccatc tcagctcatc 600

tggacatcat ctcgcagtgc aaggaaatct aatttcagcc tcgaggactt ccagcacagc 660

aaaggcaagg aaccctacag ctcttccaaa tatgccactg accttttgag tgtggctttg 720

aacaggaact tcaaccagca gggtctctat tccaatgtgg cctgtccagg tacagcattg 780

accaatttga catatggaat tctgcctccg tttatatgga cgctgttgat gccggcaata 840

ttgctacttc gcttttttgc aaatgcattc actttgacac catataatgg aacagaagct 900

ctggtatggc ttttccacca aaagcctgaa tctctcaatc ctctgatcaa atatctgagt 960

gccaccactg gctttggaag aaattacatt atgacccaga agatggacct agatgaagac 1020

actgctgaaa aattttatca aaagttactg gaactggaaa agcacattag ggtcactatt 1080

caaaaaacag ataatcaggc caggctcagt ggctcatgcc tataattcca gcactttggg 1140

aggccaaggc agaaggatca cttgagacca ggagttcaag accagcctga gaaacatagt 1200

gagcccttgt ctctacaaaa agaaataaaa ataatagctg ggtgtggtgg catgcgcatg 1260

tagtcccagc tactcagaag gatgaggtgg gaggatctct tgaggctggg aggcagaggt 1320

tgcagtgagc tgagattgtg ccactgcact ccagcctggg tgacagcgag accctgtctc 1380

aaaatatgta tatatttaat atatatataa aaccagagct gacaatgaca ctctggaaca 1440

ttgcatacct tctgtacatt ctggggtaca tggatttcta ctgagttgga taatatgcat 1500

ttgtaataaa ctatgaacta tgaaaaaaaa aaaaaaa 1537

<210> 3

<211> 373

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Thr Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Val

1 5 10 15

Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp

20 25 30

Ile Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp

35 40 45

Ser Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Thr Leu Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Val

65 70 75 80

Pro Ala Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu

85 90 95

Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Arg Pro Ala Glu Thr Asn

100 105 110

Leu Arg His Thr Cys Lys Arg Ile Met Asp Met Val Ser Asn Gln His

115 120 125

Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly

130 135 140

His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro

145 150 155 160

Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Ala Asp Arg Ala Tyr Gly Arg Asp Ile Val

165 170 175

Glu Ala His Tyr Arg Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Val Lys Ile Ala Gly

180 185 190

Thr Asn Ala Glu Val Met Pro Ala Gln Trp Glu Phe Gln Ile Gly Pro

195 200 205

Cys Glu Gly Ile Ser Met Gly Asp His Leu Trp Val Ala Arg Phe Ile

210 215 220

Leu His Arg Val Cys Glu Asp Phe Gly Val Ile Ala Thr Phe Asp Pro

225 230 235 240

Lys Pro Ile Pro Gly Asn Trp Asn Gly Ala Gly Cys His Thr Asn Phe

245 250 255

Ser Thr Lys Ala Met Arg Glu Glu Asn Gly Leu Lys Tyr Ile Glu Glu

260 265 270

Ala Ile Glu Lys Leu Ser Lys Arg His Gln Tyr His Ile Arg Ala Tyr

275 280 285

Asp Pro Lys Gly Gly Leu Asp Asn Ala Arg Arg Leu Thr Gly Phe His

290 295 300

Glu Thr Ser Asn Ile Asn Asp Phe Ser Ala Gly Val Ala Asn Arg Ser

305 310 315 320

Ala Ser Ile Arg Ile Pro Arg Thr Val Gly Gln Glu Lys Lys Gly Tyr

325 330 335

Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ser Ala Asn Cys Asp Pro Phe Ser Val Thr

340 345 350

Glu Ala Leu Ile Arg Thr Cys Leu Leu Asn Glu Thr Gly Asp Glu Pro

355 360 365

Phe Gln Tyr Lys Asn

370

<210> 4

<211> 8337

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

gtaaaactat tccccgtgaa ggcggcaggg cagaggtcca gggcgggctt tgctgggagc 60

ctcgggaccc cgggttgggg gccgtggggc ggcacctggc gagctggcgg gtgggcggcg 120

agccgaggct tcccggcctg gcggcaactc gcccctctgc cctcagccct cccggctccg 180

ctcccttccc ccacgccgcc ctgcccctcc cccacgcccc tttctctttc tttctttctt 240

tcccagttcg cttgccccca ccccagcggc gcccgccggg ctcctcgccc aatggccgcg 300

gggcccggga ccgcatcagc tgatcggccc gggctcctgg ccgctgggag ccaatcaggg 360

caccgggggc ggccccgggc cgcggataaa gggtgcgggg ctgctggcgg ctctgcagag 420

tcgagagtgg gagaagagcg gagcgtgtga gcagtactgc ggcctcctct cctctcctaa 480

cctcgctctc gcggcctagc tttacccgcc cgcctgctcg gcgaccagcg gggatcctcc 540

cccagccgca agtccacgaa gaaagcaacg aatgaaaatt atgaagacaa cgagaagtca 600

gactcctccg ggtcgcgctc cagctgcttc ggcttcgtcg cctactctgt gaactccggg 660

gagagatctc gagtcaagat taagacctta acccaccaac ctgcctgttc ggacaccccc 720

cgggccggcc gctgtctgtc cccttctcca tcgccctctc ccagaaagct ccggtgcttg 780

gaccagctag agtctgagaa agaggagagg cgcgaacgcc actccaaaaa gagaagggtt 840

aaagagggca accctaacga tacgcttgac tttctgtggc tgggaacacc ttccaccatg 900

accacctcag caagttccca cttaaataaa ggcatcaagc aggtgtacat gtccctgcct 960

cagggtgaga aagtccaggc catgtatatc tggatcgatg gtactggaga aggactgcgc 1020

tgcaagaccc ggaccctgga cagtgagccc aagtgtgtgg aagagttgcc tgagtggaat 1080

ttcgatggct ctagtacttt acagtctgag ggttccaaca gtgacatgta tctcgtgcct 1140

gctgccatgt ttcgggaccc cttccgtaag gaccctaaca agctggtgtt atgtgaagtt 1200

ttcaagtaca atcgaaggcc tgcagagacc aatttgaggc acacctgtaa acggataatg 1260

gacatggtga gcaaccagca cccctggttt ggcatggagc aggagtatac cctcatgggg 1320

acagatgggc acccctttgg ttggccttcc aacggcttcc cagggcccca gggtccatat 1380

tactgtggtg tgggagcaga cagagcctat ggcagggaca tcgtggaggc ccattaccgg 1440

gcctgcttgt atgctggagt caagattgcg gggactaatg ccgaggtcat gcctgcccag 1500

tgggaatttc agattggacc ttgtgaagga atcagcatgg gagatcatct ctgggtggcc 1560

cgtttcatct tgcatcgtgt gtgtgaagac tttggagtga tagcaacctt tgatcctaag 1620

cccattcctg ggaactggaa tggtgcaggc tgccatacca acttcagcac caaggccatg 1680

cgggaggaga atggtctgaa gtacatcgag gaggccattg agaaactaag caagcggcac 1740

cagtaccaca tccgtgccta tgatcccaag ggaggcctgg acaatgcccg acgtctaact 1800

ggattccatg aaacctccaa catcaacgac ttttctgctg gtgtagccaa tcgtagcgcc 1860

agcatacgca ttccccggac tgttggccag gagaagaagg gttactttga agatcgtcgc 1920

ccctctgcca actgcgaccc cttttcggtg acagaagccc tcatccgcac gtgtcttctc 1980

aatgaaaccg gcgatgagcc cttccagtac aaaaattaag tggactagac ctccagctgt 2040

tgagcccctc ctagttcttc atcccactcc aactcttccc cctctcccag ttgtcccgat 2100

tgtaactcaa agggtggaat atcaaggtcg tttttttcat tccatgtgcc cagttaatct 2160

tgctttcttt gtttggctgg gatagagggg tcaagttatt aatttcttca cacctaccct 2220

cctttttttc cctatcactg aagcttttta gtgcattagt ggggaggagg gtggggagac 2280

ataaccactg cttccattta atggggtgca cctgtccaat aggcgtagct atccggacag 2340

agcacgtttg cagaaggggg tctcttcttc caggtagctg aaaggggaag acctgacgta 2400

ctctggttag gttaggactt gccctcgtgg tggaaacttt tcttaaaaag ttataaccaa 2460

cttttctatt aaaagtggga attaggagag aaggtagggg ttgggaatca gagagaatgg 2520

ctttggtctc ttgcttgtgg gactagcctg gcttgggact aaatgccctg ctctgaacac 2580

gaagcttagt ataaactgat ggatatccct accttgaaag aagaaaaggt tcttactgct 2640

tggtccttga tttatcacac aaagcagaat agtattttta tatttaaatg taaagacaaa 2700

aaactatatg tatggttttg tggattatgt gtgttttgct aaaggaaaaa accatccagg 2760

tcacggggca ccaaatttga gacaaatagt cggattagaa ataaagcatc tcattttgag 2820

tagagagcaa gggaagtggt tcttagatgg tgatctggga ttaggccctc aagacccttt 2880

tgggtttctg ccctgcccac cctctggaga aggtgggcac tggattagtt aacagacaac 2940

acgttactag cagtcacttg atctccgtgg ctttggttta aaagacacac ttgtccacat 3000

aggtttagag ataagagttg gctggtcaac ttgagcatgt tactgacaga gggggtattg 3060

gggttatttt ctggtaggaa tagcatgtca ctaaagcagg ccttttgata ttaaattttt 3120

taaaaagcaa aattatagaa gtttagattt taatcaaatt tgtagggttt ctaggtaatt 3180

tttacagaat tgcttgtttg cttcaactgt ctcctacctc tgctcttgga ggagatgggg 3240

acagggctgg agtcaaaaca cttgtaattt tgtatcttga tgtctttgtt aagactgctg 3300

aagaattatt ttttttcttt tataataagg aataaacccc acctttattc cttcatttca 3360

tctaccattt tctggttctt gtgttggctg tggcaggcca gctgtggttt tcttttgcca 3420

tgacaacttc taattgccat gtacagtatg ttcaaagtca aataactcct cattgtaaac 3480

aaactgtgta actgcccaaa gcagcactta taaatcagcc taacataaga tctctctgat 3540

gtgtttgtga ttctttcaaa tccctatgtg ccattatatt tctttatttc ctaaaacagg 3600

caaaataagc tcaagtttat gtactctgag tttttaaaac actggagtga tgttgctgac 3660

cagccgtttc ctgtacctct ctaagttggg tatttgggac ttaagggatt aagtttttca 3720

cctagactta gttacacaca atcttggcat ttcctagcct agaggtttgt agcagggtac 3780

aagccccact cctccccctt cctttgctcc cctgagtttg gttttggctt accataacat 3840

tgttttgacc attcctagcc taatacaata gcctaacata atgtaagatt aactggcttt 3900

acgatttcta ttctctgctc tcagtgataa gaaacaaata ttagctaccc tgctaccctg 3960

gttgaagcct tccaaggctg gctatgccct aggcatgggc tcatccttgg gtgtatcttg 4020

ccttgcagga agaccagtgg accgattgtg attctcaaaa gctctgtgtt gtcacctgtg 4080

cccttgcccc ttgctcttat cttggtccgt gtatctggga gttcttccac cttatcttgg 4140

ccaattccta ccttcgttca ttcctcatga ggttgggtaa aagctccctc cggctcccat 4200

gatgctgtgc atatacctag caaaaagcaa ttattggaca cattggagtg caatattatt 4260

aatagcatta atactactaa taatgtgggc aatagtgatt gtttttaaaa ggcagtatac 4320

tcttaccagt gcgaggtagc tggggcctgt gatagttttt agagataagt tcttcaggca 4380

actgtgtatt ttacactagt caagtaatcc tagatatccg tggtttttct taagaaagtt 4440

ggctcgtaat atgatttaat attcaaagta gagtcatcta cctattagct tgctggcgtg 4500

gtcctagttt atgcctgttt cagcatgatt gttgagtacc ctgtttcatc cttagcattt 4560

tcttgatttt gttgttaaat gatgtatacc cttatttcca ttgaatctgt gcttccaccc 4620

ccccaactga agttgtcttc cctttgcttg gccaccctta cagcctcttg gatggtgtat 4680

cctacagtgt aagcactaaa ctgaagaggc agtgacctga gcactttgga ttttgttcat 4740

tgtaatcaat tccatgacaa aatgattgca tgagaaggaa ttttaaattc ataggatcag 4800

aatttaggtg aaaacaacca gcatatttgt ttcttcaccc tctcacctag aattagcttt 4860

gacctacagg tcacagtgca atccccttgt atttctaagg tgttttttat agttcatttg 4920

cagacaatgg gttatgtgat aacttttatc agtgatagat taaacagaat aatgaccaag 4980

ctttcaacct taaggagtca ggccagtatt tacaaaagga ggtctccatg aactccttaa 5040

atatgagttc ccctaatatc atcttgccag gtactaaata acaactgata gcacaagcta 5100

tagggaattt gaaagaattc catggatggg tgttgtctag ggccttttgt tgtttttgag 5160

acggggtctg actctcaccc aggctggagt atagtgtggc gcaatcttgg ctcactgcaa 5220

cttctgcctc ccagattcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccaagtag ctgagactac 5280

aggtgtgcac caccatgctc agctaatttt tgtattttta gtacagatgg ggtttcacca 5340

tgttggccag gctggtcttg aactcctgat ctcccaaagt gaggtcttga actggtcttg 5400

aactcctcca cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccactgcac ccggcctagg 5460

gccatgtaaa aagccagatc tgtgctgctg tctgtgtaga agggtagaca agtggatgag 5520

aagttcctga actattcttg gcccttttac cactaagtga aagtaacttg ctgccccaaa 5580

gaaagatgtc tcatcattcg acaggacttt ctagttgaac ttcatgaaag caagagatcc 5640

tgtttttctt gctcaccact gtatcttgag acctgttgta gtgcctgcaa tacttattta 5700

ataagttatt tttaagtatc agttttgtga gctttaactc tatgaggtct ttgttgtttg 5760

actgtatttt aactctggcc atgacagcaa gacaaagttc catttttatt gagcttaaaa 5820

agaatcaagg ccaggtgaag tggcttacgc ctgtgatccc aacactttgt gaggctgcag 5880

caggaggatc tcttgagccc aggagtttga gaccgttcta ggcaatgtag tgaggtccag 5940

actccacaaa ataatttttt tttaaattgc acgcctgtag tctcagctat caggaggctg 6000

agatgggagg atgacttgag cccaggaaat tgaagctgca gtgaattgtg attgcaccac 6060

tgcactccag cctgggtgac agatcaagac cttgcctaaa caaaacaaaa caaacaaaac 6120

cccaaaaaac aaattgaaaa tgttgattct ttttactaca aacattatgg cagcactaaa 6180

aacttcgtgg gagtgtactg tggaaaatag tgtacttaat taattctcat tgtaatcagg 6240

ctaccaagag ccttgtgttg ctttaagagt tataactgcc aggcacagtg gctcatgcct 6300

ataatcccag caccttgaga ggccgaggca ggtggatcac ctgagatcgg gagtttgaga 6360

ccagccgggc caatatggtg aaacaagctg tgtctctact aaatacaaaa aattagccgg 6420

gcgtggtggc acatgcctgt aatcccagct gcttgggaga ctgagacagg agaattgctt 6480

gaacctggaa ggcggaggtt gcagtgagct gagattgcaa cattgtactc cagcctgggc 6540

aacaagaggg aaactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaagtt gtaactgagg ctgggcatgg 6600

tggctcatac ctgtaatccc agcactttga aaagccgagg caggtagatc acttgagctc 6660

agaagttcga gactagcctg ggcaacatga caaaacccca tctctacaaa aaatacgaaa 6720

aattagctgg gcgtggtggc atgcacctgt agtcctagct acctgggagg ctgaggtggg 6780

aagattactt gaagctgcag tgagccatgg ttgtgccact gccctccagt ctgggcaaca 6840

aagtgagacc ctgtctcaaa aaaacaaaaa aaaattataa ctgatgtaaa ctggcagttt 6900

aggctgggtg tggtggctca agcctgtaat cctagcactt tgggaggcca aggcaggtgg 6960

atcacctgag ttcaggagtt cgagaccagc gtggccaaca tggtgaaacc ttgtctctat 7020

taaaaatacc aaaattagca agatgtggtg gtgggtgcct ataattccag ctactcagga 7080

ggctgaggca ggaggatcgc tggagccagg gaggcagagg ttacagtaag caaagatcac 7140

tccacttcac tccagcctgg gcaaaagagt gagacatatc aaaaaataaa caaataaata 7200

aataaataag tggcagttca tcatttaact ccaaagactt tgcgtacatt tctactgaaa 7260

acaatctgag ctgattagaa ccctgccatt ttatagcctt tagctcgatc tccgaccgtt 7320

catttaaaaa aattctactt caggccgggc atggtggctc aagcctgtaa tcccatcact 7380

gtaggaggcc aaagtgggca gatcacttaa ggtcaggagt ttgagaccag cctggccacc 7440

atggtgaaac cccatctcta ctaaaaatac aaaaattagc cgggcttggt ggtgagcacc 7500

tgtaatccca ccctgccgag tggcaggctg aggcaggaga atcgcttgag cccaagagcc 7560

ggaggttgca gtgagccaag cttgcaccat tgcactccag cctaggcaac agagtgtgac 7620

tccatctcaa gaaaaaaaaa attctatttc attttacaat atgcagatat atgtccatac 7680

acatgcataa tataaatgta taccatattt gtgagaatat gcatatatgt acacattaga 7740

tacacaatac aagcacaata catatgtctt ttgcccaaga tacagcattt tgtaaaggag 7800

acaggaattt agtaatatat gttccagaaa cagtacacaa gagaattcgc cgagatgaga 7860

aagttgtcac taggaatggg gagtggtaag atgtagaagg tataattgtt cttaaagttc 7920

tactgccaac tctttccaat taattaccca ctctgccatg ctttatggac aggaggttgt 7980

cggacactgt caattaataa atatttgagc atgatacact gcttggagct cctctaatat 8040

aggagagtga tatcctagtg catgttacag agggagtgtc cacacagttc ctattgtcat 8100

ttgatgagtt acttttcagg ggccttgtac ctgagcaagt tgtcctcttt ttgatggatt 8160

tcagattgag ttacctgcat tgtcttgaga ttgcagcgtg tttcctccac tgtacggcgt 8220

agtcagcaga tctattagtt aaactccagt gggccctcag tcactaaatc tatcctctgt 8280

gttgaaggct ttctgcattt gcctttcaat aaaggtttag aataactcct taaaaaa 8337

<210> 5

<211> 187

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Val Gly Ser Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly

1 5 10 15

Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe

20 25 30

Arg Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln

35 40 45

Asn Leu Val Ile Met Gly Lys Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys

50 55 60

Asn Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ile Asn Leu Val Leu Ser Arg Glu Leu

65 70 75 80

Lys Glu Pro Pro Gln Gly Ala His Phe Leu Ser Arg Ser Leu Asp Asp

85 90 95

Ala Leu Lys Leu Thr Glu Gln Pro Glu Leu Ala Asn Lys Val Asp Met

100 105 110

Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Lys Glu Ala Met Asn His

115 120 125

Pro Gly His Leu Lys Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Asp Phe Glu

130 135 140

Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Glu Lys Tyr Lys Leu Leu

145 150 155 160

Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Asp Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile

165 170 175

Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Asn Asp

180 185

<210> 6

<211> 3932

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

tcccagacag aacctactat gtgcggcggc agctggggcg ggaaggcggg agctgggggc 60

gctgggggcg ctgcggccgc tgcggccgct gcagccgctg cagcgccagg gtccacctgg 120

tcggctgcac ctgtggagga ggaggtggat ttcaggcttc ccgtagactg gaagaatcgg 180

ctcaaaaccg cttgcctcgc aggggctgag ctggaggcag cgaggccgcc cgacgcaggc 240

ttccggcgag acatggcagg gcaaggatgg cagcccggcg gcagggcctg gcgaggagcg 300

cgagcccgcg gccgcagttc ccaggcgtct gcgggcgcga gcacgccgcg accctgcgtg 360

cgccggggcg ggggggcggg gcctcgcctg cacaaatggg gacgaggggg gcggggcggc 420

cacaatttcg cgccaaactt gaccgcgcgt tctgctgtaa cgagcgggct cggaggtcct 480

cccgctgctg tcatggttgg ttcgctaaac tgcatcgtcg ctgtgtccca gaacatgggc 540

atcggcaaga acggggacct gccctggcca ccgctcagga atgaattcag atatttccag 600

agaatgacca caacctcttc agtagaaggt aaacagaatc tggtgattat gggtaagaag 660

acctggttct ccattcctga gaagaatcga cctttaaagg gtagaattaa tttagttctc 720

agcagagaac tcaaggaacc tccacaagga gctcattttc tttccagaag tctagatgat 780

gccttaaaac ttactgaaca accagaatta gcaaataaag tagacatggt ctggatagtt 840

ggtggcagtt ctgtttataa ggaagccatg aatcacccag gccatcttaa actatttgtg 900

acaaggatca tgcaagactt tgaaagtgac acgttttttc cagaaattga tttggagaaa 960

tataaacttc tgccagaata cccaggtgtt ctctctgatg tccaggagga gaaaggcatt 1020

aagtacaaat ttgaagtata tgagaagaat gattaatatg aaggtgtttt ctagtttaag 1080

ttgttccccc tccctctgaa aaaagtatgt atttttacat tagaaaaggt tttttgttga 1140

ctttagatct ataattattt ctaagcaact agtttttatt ccccactact cttgtctcta 1200

tcagatacca tttatgagac attcttgcta taactaagtg cttctccaag accccaactg 1260

agtccccagc acctgctaca gtgagctgcc attccacacc catcacatgt ggcactcttg 1320

ccagtccttg acattgtcgg gcttttcaca tgttggtaat atttattaaa gatgaagatc 1380

cacataccct tcaactgagc agtttcacta gtggaaatac caaaagcttc ctacgtgtat 1440

atccagaggt ttgtagataa atgttgccac cttgtttgta acagtgaaaa attgaaaaca 1500

acctggaagt ccagtgatgg gaaaatgagt atgtttctgt cttagattgg ggaacccaaa 1560

gcagattgca agactgaaat ttcagtgaaa gcagtgtatt tgctaggtca taccagaaat 1620

catcaattga ggtacggaga aactgaactg agaaggtaag aaaagcaatt taaagtcagc 1680

gagcaggttc tcattgataa caagctccat actgctgaga tacagggaaa tggagggggg 1740

aaagctggag tattgatccc gcccccctcc ttggttgtca gctccctgtc ctgtgtgtgg 1800

gcggaacata gtccagctgc tctatagcaa gtctcaggtg tttgcagtaa gaagctgctg 1860

gcatgcacgg gaacagtgaa tgccaaacac ttaaagcaat tcgatgttta agtatgtaag 1920

ttcttttttt tttagacagc gtttcgctct tgttgcccag gctagcatgc aatggtgtga 1980

cctcggctta ctgcaacctc cgccttccca gattcaagcg attctcctgc ctcaggctcc 2040

caagtagcta ggaccaggtg cgcgccacca cgcccggcta atttttgtat tttgtatttt 2100

tagtagagat ggggtttcac catgttggtc aggctagtct cgaactcgtg accgcaagcg 2160

attcacccac ctcagcctcc caaagtgctg ggattaccgg cttgagccac cacacccggc 2220

acatcttcat tctttttatg tagtaaaaag tataaggcca cacatggttt atttgaagta 2280

ttttataatt taaaaaaata cagaagcagg aaaaccaatt ataagttcaa gtgagggatg 2340

atggttgctt gaaccaaagg gttgcatgta gtaagaaatt gtgatttaag atatatttta 2400

aagttataag tagcaggata ttctgatgga gtttgacttt ggttttgggc ccagggagtt 2460

tcagatgcct ttgagaaatg aatgaagtag agagaaaata aaagaaaaac cagccaggca 2520

cagtggctca cacctgtaat cccagcgctt tgggaggcta aggcaggcag atcacttgag 2580

accagcttgg gcaacatggc aaagccccat ctctacaaaa aacacaaaaa ttagctgggc 2640

attgtggcgc acacctgtat tcccatctag tcaggaagct gagatggaag aattaattga 2700

gcccacgagt tcaaggctgc agtgagtcgt gattgtgcca ctgcactcca gccggggtga 2760

cagaagagac cttgtctcga aaaggaatct gaaaacaatg gaaccatgcc ttcataattc 2820

tagaaagtta ttttcaactg ataaatctat attcacccaa ataatcaagg gtgaaggtaa 2880

aataatacat ttttagacaa gcaaagactc aggggttacc tccatgtgcc ctttttaggg 2940

aagctgttgg agaaaatact ccagcaaaat gaaggagtac acaaaccaga gaatgacatg 3000

aatccagcaa ataggatcca acacaggcaa tattccagct atggagctag ctttaaaaag 3060

gaacagtaaa aatattaatc ggttagctgg gtggaatggc ccatgcctgt agtcccagct 3120

actcaggagg ctcagcagca ggacgacttg agcccaagag ttccagacca gcctggccac 3180

cttagtgaga tcccttctct taaaaataat aacttattgc cagatttggg gcatttggaa 3240

agaagttcat tgaagataaa gcaaaagtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaca aggggaaagg 3300

gttggttagg caatcattct agggcagaaa gaagtacagg ataggaagag cataatacac 3360

tgtttttctc aacaaggagc agtatgtaca cagtcataat gatgtgactg cttagcccct 3420

aaatatggta actactctgg gacaatatgg gaggaaaagt gaagattgtg atggtgtaag 3480

agctaaatcc tcatctgtca tatccagaaa tcactatata atatataata atgaaatgac 3540

taagttatgt gaggaaaaaa acagaagaca ttgctaaaag agttaaaagt cattgctctg 3600

gagaattagg agggatgggg caggggactg ttaggatgca ttataaactg aaaagccttt 3660

ttaaaatttt atgtattaat atatgcattc acttgaaaaa ctaaaaaaaa acaataattt 3720

ggaaaaaccc atgaaggtaa ctaacggaag gaaaaactaa gagaatgaaa agtatttgcc 3780

tctggaaaga acaactggca ggactgttgt tttcattgta agacttttgg agccatttaa 3840

ttgtacttaa ccattttcat ctatttcttt aataagaaca attccatctt aataaagagt 3900

tacacttgtt aataagtaaa aaaaaaaaaa aa 3932

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签

<400> 7

His His His His His His

1 5

Claims (10)

1.一种制备治疗性蛋白质的方法，该方法包括：

培养胆固醇营养缺陷型且谷氨酰胺营养缺陷型的细胞；

用以下核酸转染所述细胞：(i)编码能够使所述细胞中的胆固醇生物合成恢复的蛋白质的核酸；(ii)编码能够使所述细胞中的谷氨酰胺生物合成恢复的蛋白质的核酸；以及(iii)编码所述治疗性蛋白质的核酸；

在适合所述治疗性蛋白质表达的条件下培养所述细胞；以及

分离和/或纯化所述治疗性蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述治疗性蛋白质为抗体。

3.如权利要求1所述的方法，其中在所述转染步骤中，用编码抗体轻链和抗体重链的核酸(iii)转染所述细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其中核酸(i)编码3-酮基类固醇还原酶。

5.如权利要求1所述的方法，其中核酸(ii)编码谷氨酰胺合成酶。

6.如权利要求1所述的方法，其中第一表达载体包含核酸(i)和(iii)，并且第二表达载体包含核酸(ii)。

7.如权利要求1所述的方法，其中第一表达载体包含核酸(i)，并且第二表达载体包含核酸(ii)和(iii)。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一表达载体的转染在所述第二表达载体的转染之前进行。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述第一表达载体的转染与所述第二表达载体的转染同时进行。

10.如任一前述权利要求所述的方法，其中在不存在外源引入的胆固醇的情况下(例如，在核酸(i)转染之后)培养所述细胞。

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