CN102203281B - 复制条码筛选检测 - Google Patents

Abstract

RBS方案的设计目的是分离出那些对实验处理可能会有应答倾向的细胞，但实际上分离的细胞并未接受实验处理。它基于这样一个假设：如果一个细胞在实验处理下具有某种应答的趋势是由其固有的遗传或表观遗传特性所决定，则细胞分裂后，这种趋势有可能被其子细胞所遗传。RBS方案遵循如下步骤：首先，唯一的遗传标识（即“条码”）被插入到每个初始细胞群内。然后，这些细胞通过扩增使得每个具有唯一条码的细胞增殖成为多个具有相同条码的子细胞。细胞接着分为两组：处理组和预留组。处理组接受处理以识别那些表现为阳性应答的细胞。读取阳性细胞中的条码。最后，对每一个通过这种方式识别的条码，回收预留组中具有相同条码的细胞。这些细胞应当与处理组中的阳性细胞是姐妹细胞，因为它们具有相同的条码。通过这种方式回收的细胞可用于前瞻性研究，以确定它们是否具有应答处理的潜能，如果有，则其是基本遗传或表观遗传。

Description

复制条码筛选检测

技术领域

复制条码筛选RBS实验的设计目的是从某种未受实验处理的细胞中，分离出那些对该实验处理可能有应答倾向的细胞。

背景技术

在细胞生物学研究中，一种常规做法是对大量细胞进行实验处理，以筛选表现出某种特定反应的小部分细胞。不同研究之间的筛选机理区别可以很大。有时，筛选的机理是部分细胞在处理后能够存活。一个例子是作为化学抗性和肿瘤复发研究的一种方法，使用化疗药物处理培养的癌细胞以筛选抗性细胞。另一个例子是将肿瘤细胞移植到活体宿主，以由少数存活的移植细胞增殖获得次代肿瘤。有些研究中，筛选方案不是基于存活力，而是基于该细胞亚型是否能获得不同的表型。例如，最近的研究表明，将数个特定基因引入体细胞后可使部分细胞重编程成为与胚胎干细胞ESC极其相似的诱导型多能干细胞iPSC。另一个例子是，在系谱分化的研究中，通常会对干细胞进行某种条件处理，以诱导其中的部分细胞分化为特定谱系。

实际上，在所有情况下，弄清楚为什么只有一部分细胞对实验处理表现出期望的应答是非常有意义的。尤其是在要区分两种可能时非常重要。一种可能是所有细胞具有表现应答的相同内在潜能，但是由于随机原因，如处理时细胞处于不同的细胞周期或者药物暴露不均一，所以最后只有很少一部分细胞表现出应答。另一可能是，一开始，因为遗传或后天差异，处理的细胞在表现出应答的内在潜能是异质的，导致只有一部分细胞表现出应答。在后一种情况下，研究何种遗传/后天差异区分应答细胞和非应答细胞具有重要意义。

以成纤维细胞通过特定基因被重新编程为多能干细胞为例。事实上转染了基因的成纤维细胞只有极小部分可以重编程为多能干细胞，这可能完全由实验的随机性决定。如在基因转染时，细胞处于的细胞周期阶段、转入基因的拷贝数、转入基因的整合位点等。或者，可能是，至少部分是由于某些成纤维细胞本身比其它细胞更倾向于经历重编程。如果后者成立，了解这种易感倾向性的分子基础对进一步了解细胞重编程过程极其重要，并可能改进重编程的操作方案。

同样以通过移植肿瘤细胞获得次代肿瘤细胞为例。事实上，仅有极少数移植的细胞可以形成次代肿瘤细胞，这可能是由于实验过程的随机性造成，或者是原始细胞中的某些细胞具有更大的肿瘤发生遗传潜力（例如肿瘤干细胞假说）。如果后者正确，了解具有更强肿瘤发生遗传潜力的一部分细胞是如何与其余细胞相区分的具有重要作用。

为了区别随机性和趋向性，并深入了解任何可能存在的趋向性的机理，分离经实验处理后表现出所需应答的那部分细胞是非常有用的。然而，人们希望在细胞分离处理前将这些细胞分离出来，因为处理有可能会显著改变细胞的原始特性。

这样便存在一个两难困境：实验处理会对细胞存在未知的影响，因此这样做不理想，但是不经过实验处理又如何知道哪些细胞可能表现出应答？这有点像“种花生农夫的困境”——在中国有一个种花生的农民希望从收获到的花生中选取最美味的留到下一年进行播种，但正是品尝花生这一行为导致花生不适于作为种子了。RBS方案的设计旨在避免这一两难困境。

发明内容

RBS方案的设计目的是分离出那些对实验处理可能会有应答倾向的细胞，但实际上分离的细胞并未接受实验处理。它基于这样一个重要假设：如果一个细胞在实验处理下具有某种应答的趋势是由其固有的遗传或表观遗传特性所决定，那么，当该细胞分裂时，这种趋势有可能被其子细胞所遗传。尽管这未必在所有情况下都正确，但就我们已知的遗传和表观遗传对细胞表型影响的知识来看，这在很多情形行下仍是一个合理的假设。

RBS方案的大体步骤如图1所述。第一步，对细胞进行修饰，使得每个细胞具有一个唯一的基因标识，或称“条码”。第二步，培养这些细胞，以获得许多跟它们一样拥有唯一条码的姐妹细胞。第三步，将细胞分成两部分，一个作为实验组，一个作为预留组。第四步，对实验组细胞进行实验处理以识别阳性细胞——那些在实验处理下表现出某种预期应答的细胞。第五步，读取那些阳性细胞的条码。第六步，也是最后一步，在预留组内，用一种不会显著改变细胞特性的方法回收那些具有相同条码的细胞。这些细胞应该与处理组中的阳性细胞是姐妹细胞。即它们由同一个细胞增殖而来。

RBS方案的具体实施用到两种由慢病毒突变而来的两类载体：一类可称之为条码载体，另一类为敲除载体（这些载体的具体信息参见具体实施方式）。条码载体是作为一个库而存在的，这些库里面的载体序列除了条码区（一个随机的短序列，两个拷贝具有相同序列的几率是非常小的）不同外，其它部分都相同。含有条码的细胞通过引入条码载体而获得。条码区域镶嵌在选择报告基因之中。当载体导入细胞后，不同细胞之间可以通过它们所具有的不同条码而加以区分。这些细胞被分离到实验处理组和回收组，在实验处理组内的细胞将被进行处理。

在处理组内，应答表现为阳性的细胞可以通过PCR扩增条码区所得的产物进行鉴别。以这种方法识别的每个条码为基础，构建出表达小发卡RNA （shRNA）的敲除载体，并可将其导入到预留组内的细胞。含有该条码的细胞可被shRNA定位，用于筛选的报告基因（含有该条码）的表达则被抑制。因此可用来分离那些应答阳性细胞的姐妹细胞。例如，可筛选的报告因子可以是可见的，比如绿色荧光蛋白（GFP）。在这种情况下，可以利用流式细胞仪（FACS）筛选出荧光减弱的那些被抑制的细胞。可筛选的报告因子也可以是负向的药物筛选基因，例如胸苷激酶（TK），它可以将鸟嘌呤转变为具有细胞毒性的物质。在这种情况下，那些被敲出了TK表达的细胞可以通过鸟嘌呤的处理筛选出来。

附图说明

图1，复制条码筛选检测的示意图。检测的六个主要步骤将在正文中详细描述。每个灰色的椭圆代表一个细胞，里面的黑条代表细胞的基因组。黑条上有色的片段表示引入到该基因组内的条码序列，不同的颜色代表不同的条码。细胞或条码的数目仅作示意。

图2，用于快速构建慢病毒基因表达载体的三元质粒系统。三种类型的质粒，包括启动子质粒（pPromoter）、报告质粒（pReporter）和目标质粒（pDestination）。可以使用Gateway重组技术将他们重组为一个载体，即最终质粒（pFinal）（重组的发生通过十字交叉确认）。这里描述的重组发生于att位点。只有具有相同颜色的att位点才可以彼此重组。在此未对其进行详细描述。

图3，条码载体图谱及其shRNA的结合位点。(A)条码载体的主要特点，展示了载体上的两个潜在插入位点，它是shRNA的作用靶标。LTR：长末端重复序列，它是慢病毒基因组末端的标记，在此未作详述。(B) shRNA靶标序列。“N”表示随机序列，不同颜色标记的核苷酸序列具有不同特性。

图4，制备条码载体文库的步骤。详细描述了4个主要步骤。不同颜色标记的核苷酸序列具有不同特性。

图5，敲除载体的示意图。具体特点未作详述。(A)强力霉素缺失时，shRNA表达的抑制；(B)强力霉素存在时，shRNA表达抑制的解除。

图6， shRNA序列的设计。(A) shRNA正向和反向寡核苷酸。退火后它们互补，并被连接到空的敲除载体上。(B) 敲除载体表达的shRNA的小发卡结构。

具体实施方式

如发明内容所述，在RBS实验中使用有两种类型的载体。一种是对细胞进行条码标记的条码载体。另一种是敲除载体，表达shRNA与目的条码序列结合，以敲除包含于条码内的选择报告子。载体可以通过多种方法引入细胞。本文描述的一个例子是基于慢病毒载体的基因转移。

条码载体

条码载体图谱见图3A。它由图2所描述的pFinal慢病毒载体通过在选择报告基因（在下文详述）序列的5’-UTR 或3’-UTR，插入shRNA靶区域（含有条码序列）修饰得到。shRNA的靶序列通常设定为19个碱基，但其它长度的序列同样可行。

如图3B所示， 19-mer 长的shRNA靶区域内，条码序列为10个碱基长。一个10-mer的条码区在理论上具有编码4¹⁰，或大约一百万个不同的条码的能力。其它长度的条码序列亦可使用。靶区域真实序列的例子如图3B所示。

可筛选的报告基因可以是一种可见的标记（例如EmGFP，一个更亮的常规GFP变体）或者阴性药物筛选标记（一个例子是传统TK的改进版_ΔTK）。报告子可以由在研究中适用于细胞的启动子驱动（一个例子是广泛使用的强启动子：人EF1A启动子）。

pFinal质粒修饰后可以允许插入shRNA的靶区域（潜在的插入位点如图3A所示）。在选择性报告基因的5’-UTR 或 3’-UTR端引入了两个不同的酶切位点（例如BamHI 和 SalⅠ）。含有这些限制性酶切位点的质粒，称为空条码载体，可以使shRNA靶区序列连接到这两个限制性酶切位点之间。

构建含有随机条码序列的shRNA结合区，并按图4所述的步骤插入到空的条码载体内。第一步，合成三条寡核苷用于PCR反应。其中一条，称为条码寡核苷酸，在PCR反应中作为模板，其它两条寡核苷酸则作为引物。条码寡核苷酸包含了shRNA的结合区，在它两侧有前述的限制性酶切位点(BamHI 和 SalI)，在它更远的两侧有足够长的供PCR引物起始引发的额外序列。尤为关键的是，由整个随机序列构成的条码区在结合区的核心处。通过在合成这些碱基的每一条时，简单地提供所有的4种核苷酸，就可以在寡核苷酸合成过程中获得条码寡核苷酸的随机部分。第二步，通过PCR扩增将单链的条码寡核苷酸片段库转变成双链分子库。第三步，用BamHI和SalI对PCR扩增产物进行酶切，并使用磷酸酶处理，去除突出的（overhanging）磷酸基团（这是为了防止其在随后的连接操作中叠接（concatamerization））（黄色括号与黄色括号配对，绿色与绿色配对），使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分离纯化较大的目的片段。第四步，将含有随机条码的目的片段连接到同样被BamHI 和SalI酶切之后的空条码载体上。然后将连接产物转化到大肠杆菌以构建最终的条码载体文库，文库内的每一个克隆都具有唯一的条码。

敲除载体

可以通过改造可诱导的shRNA慢病毒载体构建敲除载体。如图5所示，该载体含有启动shRNA 表达的TRE/U6启动子。TRE/U6启动子通常被转录抑制子tTS所沉默，tTS由组成性CMV启动子启动的同一载体表达（图5A）。但是，在强力霉素存在时，tTS结合到强力霉素上，构象改变，使其不能阻遏TRE/U6启动子，从而引起shRNA的表达（图5B）。

空敲除载体（即没有插入shRNA序列）含有两个不同的限制性酶切位点（如XhoI和HindIII），shRNA序列可连接在两位点间。最终的敲除载体按如图6所示的步骤构建。首先，根据含有目标条码序列的shRNA结合区设计两条寡核苷酸链（在此称为“shRNA寡核苷酸链”），一条用于正向序列，另一条用于反向序列（图6A）。这两条寡核苷酸链彼此互补，并且与含有由9个碱基的发卡结构所隔离的19-mer结合区的正义和反义片段相一致。一旦退火，双链DNA的左右末端含有的单链化的悬臂（single-stranded overhangs）分别与XhoI和HindIII酶切产生的悬臂互补。当这两条shRNA寡核苷酸链退火后，被连接到同样用XhoI和HindIII酶切的空敲除载体上，然后将其转化入大肠杆菌内，并通过测序确认克隆。这样获得了如图5所示的最终敲除载体。源自该载体的shRNA序列的表达可产生预期的shRNA（图6B）。

 RBS实验步骤

RBS实验步骤通过示例描述如下。当哺乳动物细胞经6-硫鸟嘌呤（6-thioguanine）（6-TG）处理后，仅有极少部分细胞在X连锁的Hprt基因中发生功能丧失性突变而得以存活。利用RBS方案有望在不对细胞进行6-TG真实处理的情况下，回收那些有倾向的（predisposing）、Hprt缺陷的细胞。

使用条码慢病毒文库转染培养的小鼠成纤维细胞，并用潮霉素筛选这些转染的细胞（慢病毒载体上携带有潮霉素抗性基因）。调整病毒滴度使绝大部分感染的细胞只摄取一个病毒颗粒。这有两个重要的原因：首先，如果大多数细胞只携带有病毒载体的一个拷贝，细胞间慢病毒载体所携带的选择性报告子将更为均一的表达。这有助于在接下来的实验中提高找到敲除了报告子表达的细胞的能力。第二，如果一个细胞被多个病毒颗粒感染，细胞最后可能携带一个以上的条码，它可能会干扰接下来的分析。值得注意的是，虽然每一个慢病毒颗粒包裹了两个拷贝的基于RNA的病毒基因组，且两个拷贝可能带有不同的条码，但是两个拷贝中只有其中一个可以通过感染整合到宿主的基因组。

转染的细胞在分为处理组和预留组之前进一步扩增。处理组用6-TG处理以筛选抗性细胞。少数存活的克隆可以分别选出并扩增，每个克隆的条码可在PCR扩增条码区后对产物测序确定。

在通过这种方法识别的条码中，可建立一组相关的慢病毒敲除载体以结合这些条码。预留组的细胞可被扩增，并进一步分为数个亚组。每一个亚组的细胞被敲除病毒中的一种再次感染（superinfected），并用强力霉素处理细胞以启动shRNA的表达。这样，就可以筛选细胞以获得那些显示有报告子表达降低的细胞。这些细胞中应当包括了发生了报告子表达敲除的真正敲除细胞，以及“混杂”的非敲除细胞，这些细胞因为与shRNA敲除无关的原因，碰巧低水平表达报告子。强力霉素可诱导性启动和关闭shRNA表达的能力为去除那些混杂细胞提供了一个很方便的方法。当EmGFP作为选择报告子用于条码载体以时，再次感染后，并用强力霉素处理启动shRNA表达，具有低水平EmGFP的细胞使用流式细胞仪（FACS）分离，分离的细胞含有敲除细胞以及碰巧具有低EmGFP表达的未敲除细胞。然后从培养基中去除强力霉素，这将抑制shRNA的表达（见图5）。因此，敲除细胞的EmGFP表达就可以恢复到正常水平，导致其荧光增强，而那些低水平EmGFP表达的未敲除细胞仍然较低。去除强力霉素后，强EmGFP表达的细胞可被筛选出，以扩增真正敲除的细胞。

通过上述方案筛选的细胞以克隆密度（clonal density）培养。少数克隆被单独选出并扩增，并获得其条码。当RBS方案按设计进行，将会有足够的具有目标条码克隆的富集。由于具有目标条码，这些克隆将具有抗性，他们同样会具有引起抗性的突变，因为处理组中的抗性细胞中具有同样的条码。

Claims (5)

1.由“复制条码筛选”（RBS）检测实验构成的方法，其目的在于分离出那些对处理具有应答倾向的细胞，但实际上未使细胞接受所述处理，该方法包括：

(a) 通过使每个细胞带有唯一遗传标识，或“条码”的方式修饰初始细胞群；

(b) 扩增这些具有唯一条码的细胞，使其增殖为多个具有相同条码的子细胞；

(c) 将细胞分成两组：处理组和预留组；

(d) 对处理组内的细胞进行处理，以鉴别应答阳性细胞，即表现出预期应答的细胞；

(e) 读取阳性细胞的条码；

(f) 回收预留组内具有相同条码的细胞；

所述条码为随机核酸短序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，细胞的条码化是通过将源自条码载体文库的DNA引入细胞实现的，以使每个细胞具有唯一的条码区。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，条码载体以文库形式存在，在文库中，载体的各个拷贝具有相同的序列，随机条码区除外。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，读取处理组中阳性细胞的条码，通过PCR扩增条码区随后对PCR产物测序回收其条码。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，表达结合特定条码的小发卡RNA的敲除载体被引入预留组中，通过敲除存在于条码载体内含有shRNA结合区域的选择性报告基因的表达的方式回收具有所述条码的细胞。

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