JP2001512560A

JP2001512560A - 標的に対し特異的な親和性を有するペプチドおよびタンパク質の選択のための方法および手段

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Publication number: JP2001512560A
Application number: JP51741298A
Authority: JP
Inventors: ロフテンベルヒ、トン; クライフ、コルネリスアドリアーンデ
Original assignee: ユー―ビスイスベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1996-10-08
Filing date: 1997-10-07
Publication date: 2001-08-21
Also published as: ATE230850T1; AU4474497A; ES2190543T3; DE69718341D1; CA2267139A1; DE69718341T2; EP0934526B1; DK0934526T3; WO1998015833A1; EP0934526A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的に対し特異的結合親和性を有するペプチドおよびその他のタンパク質性の分子を選抜する新規な方法および手段を提供する。結合するペプチド／タンパク質はレプリカブルディスプレイパッケージ、好ましくはファージ上にディスプレイされる。結合するペプチドは標的に対するこの結合親和性で選抜される。ある態様では、標的は固体層上に付着したペプチドの形で提供され、他の態様では、標的は組織切片に存在する。

Description

【発明の詳細な説明】標的に対し特異的な親和性を有するペプチドおよびタンパク質の選択のための方法および手段この発明は、標的に対し特異的な親和性を有するタンパク質性の生体分子の分野に関する。より明確には、本発明は、抗体、特にモノクローナル抗体、あるいは、特異的に結合するその誘導体または断片といったタンパク質のような、特異的に結合するペプチドに由来する分子に関する。典型的態様では、本発明は、レプリカブルジェネティックパッケージ(replicable genetic package)の表面で発現される異なった分子の大きなコレクション（ライブラリー）として多かれ少なかれ無作為に産生されるペプチドおよび抗体に関する。これらのライブラリーから、ペプチドあるいは抗体が標的分子への結合について親和性選抜される。生体分子間あるいはその誘導体間の特異的結合親和性が、多くの異なった目的で長期にわたり、応用生命工学、分子生物学、医学生物学などを通じ利用されてきた。特異的結合親和性を有する最も一般的な応用生体分子の例に抗体がある。抗体は複合タンパク質であり、通常、不変領域と可変領域からなる２本の軽鎖と２本の重鎖からなっており、可変領域はさらに抗体の結合特異性を決定する超可変ドメイン（相補性決定部位(CDR)）からなっている。抗体は、高等脊椎動物の標準防御システムの一部である。それらは、免疫系の細胞により合成される。 1975年まで、抗体は抗原物質を動物（通例、げっ歯類）に投与し、そして動物の免疫反応で合成された抗体を回収することにより得られた。この方法では、抗原物質上の異なった結合部位に多くの異なった特異性を有する抗体の混合物が得られる結果となった。これらの混合物は、ポリクローナル抗血清と呼ばれる。モノクローナル抗体の出現（コフラー（KOHLER）およびミルスタイン(MILSTEIN)、ネイチャー(Nature)256巻、495頁(1975)）は、科学的にも商業的にも重要な結果をもたらす、たいへん重要な技術革新の象徴となった。慣例的に、モノクローナル抗体は、抗体を分泌する形質細胞を不死化させるために、免疫された動物に由来する形質細胞と腫瘍細胞系を融合することにより作られる。目的とする特異性を有する抗体を産生させるため、不死化したハイブリドーマをスクリーニングする。選抜されたハイブリドーマを増殖し、培地に分泌されたモノクローナル抗体を回収、そして用途に応じて精製する。ハイブリドーマ技術の達成以来、妊娠検査からエイズ試験に至るまで、多くの抗原を検査しまた同定する方法において、モノクローナル抗体の幅広い用途が発見されている。それらはまた、広範な種類の分子を研究、同定するため、また、免疫組織化学、たとえば組織におけるある種の細胞を同定するために、研究所で広く適用されている。たとえば、細胞の特定生物型群で発現された特定の抗原と反応するモノクローナル抗体は、免疫組織化学法あるいは免疫蛍光法により組織切片におけるこれら細胞の検出に利用することができる。モノクローナル抗体の本質的な利点をポリクローナル抗体と比較すると、１つの特定のエピトープとのみ反応する点、および、バッチ間で、また研究所間で標準化されている点を挙げることができる。モノクローナル抗体の利用により得られる全ての利点にもかかわらず、ハイブリドーマ技術には多くの制限があり、そしてそれゆえ、得られるモノクローナル抗体にも多くの制限が存在する。たとえば、ある抗体を特異的に分泌させるために確立できる、またスクリーニングできるハイブリドーマの数は限られている。免疫のプロトコルおよび動物免疫系が抗原に対処する様式では、免疫的に優勢なエピトープに対する抗体を分泌するハイブリドーマを選択することが好都合であり、一方、免疫を付与する抗原あるいはそのエピトープのあるものは動物免疫系で認識されないので、他の特異性は得られないのである。加えて、動物から得られたモノクローナル抗体はヒトにおける治療用途にほとんど適さない。というのは、それらは免疫反応を喚起するためである。これらの欠点のいくつかは、可変領域が動物由来で、不変領域がヒト由来である(不変領域が免疫反応の大部分を担っている)キメラ抗体の創生を目的とする抗体工学を使って回避することが可能であるかもしれない。しかしながら、これらキメラはなお免疫反応を喚起する。免疫反応を回避する別の可能性は、CDR−グラフティング(CDR-grafting)と呼ばれる技術である。それにより、動物由来のCDRがヒト抗体骨格に挿入され、CDR のみが動物由来となる。これらの人体に適応させた抗体は、その創生がかなり困難であり、また、しばしばそれらの結合親和性がある程度欠失することになる。抗体を修飾する別の方法は、特異的な親和性によりなお特異的に抗原（より正確には、エピトープ）に結合する最小の断片を得られるようにすることである。断片が小さければ小さいほど免疫原性が小さいと予想される。これは、哺乳類の抗体の重鎖および軽鎖各々に存在する３つのCDRの内の１つのみ、たとえば、重鎖のCDR3のみからなるペプチド様分子であるFab'2およびFabフラグメントとなった。遺伝子工学的な抗体創生方法においてはまた、１つの抗体を得るのに少なくとも２つの異なったサブユニット（重鎖および軽鎖）を発現させなければならないことの回避法が発見された。これは、重鎖および軽鎖のサブユニット間をペプチドリンカーにより融合することで達成された。これはいわゆる単一鎖抗体と呼ばれるものであり、後ほどより詳しく論ずる。モノクローナル抗体の免疫原性に関する欠点とは別に、モノクローナル抗体で得られる特異性にも制限が存在する。自然界は、抗体のCDRを形成する際、CDRをコードする遺伝子フラグメントにおける超変異、再配列、挿入の複雑な工程を経る特異的な工程を必要とし、またそれに続き、一次および二次リンパ器官において抗体産生細胞の選抜が行われる。これらの工程の結果、動物で産生される様々な結合特異性が制限されることになる。その１つの結果として、モノクローナル抗体は、それらの使用が意図される用途、たとえば免疫組織化学のような用途において必ずしも有効とならない。組織切片を必要とする免疫組織化学法および免疫蛍光法は一般に、包埋剤中で組織を包埋し、その前または後で組織の固定あるいは凍結を行いまたは行わず、包埋組織を切断して薄切片とし、モノクローナル抗体と組織切片をインキュベートし、酵素反応および基質の沈殿によりまたは蛍光ラベルにより、抗体が結合した細胞のシグナルおよび視覚化の増幅を行う工程からなる。従来のモノクローナル抗体の欠点は、固定された組織切片において標的であるエピトープにしばしば結合しないことであり、恐らくこれは固定化工程による標的エピトープの崩壊の結果と思われる。パラフィン包埋やホルマリン固定のような固定および包埋の方法、それは、組織の解剖学的構造の保存に適しており、また医学的診断に日常的に使用されているが、過度なタンパク質の変性を招き、それにより、通常天然のエピトープに結合するモノクローナル抗体の適用が妨げられることになる。特異的結合技術における別の技術革新にはレプリカブルジェネティックディスプレイパッケージの使用が含まれている。レプリカブルジェネティックディスプレイパッケージあるいはディスプレイパッケージの語は生体粒子を指しており、それは、その粒子に複製する能力を与える遺伝情報を有している。パッケージは、抗体、抗体断片、タンパク質あるいはペプチドを含む融合タンパク質をディスプレイ(display)することができる。融合タンパク質は、抗体がディスプレイパッケージと接触している標的構造に結合できる状態でディスプレイパッケージに存在する。たとえば、ディスプレイパッケージは細菌細胞、細菌芽胞または細菌性ウイルスに由来することができる。ファージディスプレイ技術においては、目的とするペプチドをコードする配列とファージの外側でディスプレイされるタンパク質をコードする配列との間で遺伝子融合が行われる（実際は、ペプチド配列がタンパク質をコードする配列中に挿入される）。全種類の異なったペプチドを含んでいる非常に多数のディスプレイパッケージからなるライブラリーにおいて、他の分子あるいは細胞などとの結合親和性に基づき、それら表面タンパク質の１つを容易に産生させ、選抜し、そして試験することができる。ヒト抗体遺伝子の一部および単一可変領域をコードする配列をそのようなファージ遺伝子に挿入し、そして、抗体断片ファージディスプレイライブラリーを得た。抗体可変領域のディスプレイライブラリーは、様々な方法により構築されてよい。一般に、抗体あるいは抗体断片の大きなコレクションが複製可能なジェネティックディスプレイパッケージの表面で発現される。本現発明の典型的態様では、ディスプレイパッケージとは、抗体−コートタンパク質融合体からなるファージ粒子である。抗体の構築に使用されるヌクレオチド配列はヒト由来のものである。表面で発現された抗体分子のライブラリーは、抗原に結合する抗体の親和性選抜のため、標的抗原と接触するように形成されている。この方法は、ディスプレイされた抗体分子からなる非常に大きなコレクションの迅速なスクリーニングを可能とし、ヒト抗体を産生し、また、動物の免疫を必要としない。新規な特異性がそのようなライブラリーから得られるかもしれない。目的とする抗体特異性を発現するファージが４つの工程を経てライブラリーから選抜される；１)ファージの標的抗原への親和性結合、２)洗浄による非結合ファージの除去、３)結合したファージの溶出、４)大腸菌(E．Coli)への溶出したファージの感染およびその増殖。親和性選抜によりライブラリーからファージ抗体を首尾よく得るためには、様々な標的が必要とされる。ファージ抗体親和性選抜は、固体層にコートされた精製抗原で、サスペンジョンまたは単層のインタクト(intact)な真核細胞で、また、原核細胞で行われる。親和性結合および親和性選抜、特異な結合という言葉は、ペプチドまたは抗体ディスプレイライブラリーからの選抜を指し、それは、標的構造に結合するライブラリーの各ディスプレイパッケージ表面上のこれら分子の異なった親和性に基づいている。親和性選抜の例としてはアフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、蛍光発光細胞選別、凝集およびプラークリフト(plaque lifts)がある。すべてのファージ抗体親和性選抜の方法において、選抜の第一段階では結合ファージ、好ましくは標的の多様な領域に結合するファージの大きなコレクションを得ることは避けられない。選抜の次の段階で、このコレクションからの特定の必要条件を満たすこれら抗体の選抜が達成されてよい。本現発明はさらなる選抜法を提供するものであり、それにより、新規な特異性が容易に得られ、および／または、有効な抗体断片およびエピトープ（または、互いに結合親和性を有する二つのペプチドまたはタンパク質性の物質のいずれの組み合わせでさえ）が同定され、得られることになる。ある態様では、本発明はタンパク質性の標的に特異的に結合することができるペプチドまたは抗体を同定する方法を提供し、その方法は、レプリカブルディスプレイパッケージ表面上にペプチドまたは抗体をディスプレイすること、固体層状にタンパク質性標的由来のオリゴペプチドを合成すること、および結合させるため特異的な結合をするペプチドを固体層に結合したオリゴペプチドと接触させることからなる。レプリカブルディスプレイパッケージ上に発現したペプチドは直鎖でよく、または、たとえばジスルフィド架橋でつながった円形のペプチドまたは一つ以上のジスルフィド架橋を含むペプチドのような他の立体配座を有してもよく、また予測できない立体配座を有してもよい。加えて標的オリゴペプチドは直鎖であってよく、または他の立体配置からなってよい。このように本現発明は標的分子の領域（部分）を示す限定されたオリゴペプチドの明確な組(sets)に対するファージ抗体（または、他の結合ペプチド）の直接的な前選抜を行う方法を提供する。本現発明の目的のため、さまざまな文法的な形において抗体の語は当業者に理解され、そしてイムノグロブリン分子および免疫学的に活性な部分および／またはその誘導体、たとえば抗原結合部位を有する分子を含むものである。本ペプチドは膜またはビーズのようなポリスチレンロッドまたは他の固体層上で重複するまたは重複しない多重結合体の組として合成される。好ましい態様では、ペプスキャンテクノロジー(pepscan technology)で使用されるポリスチレンロッドが使用される。固体層結合ロッド上での選抜後、抗オリゴペプチドファージ抗体が増加したファージのコレクションは、別の立体配置をとる標的分子にも結合する抗オリゴペプチドファージを選別するため、または標的とするタンパク質性物質のさまざまな形態間で区別できる抗体を選抜するため、次の段階で使用される。オリゴペプチドが由来する標的タンパク質と結合する抗オリゴペプチド抗体の多くの例が科学文献に記載されている。その中でオリゴペプチドは６から30アミノ酸残基、好ましくは８から20アミノ酸残基からなると定義されている。それらはまた単にペプチドと称されている。ペプスキャンの語は数百のペプチドの固体支持体上での迅速な同時合成法に関するものであり、本質的には（ゲイセンエイチ(GEYSEN,H. )ら、プロク．ナトゥル．アカド．サイユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA )81巻、3998頁(1984)）に記載されている。原手法ではペプチドは固体支持体としてのポリエチレンロッド上で合成されている。膜様のフィルターまたはビーズのような他の固体支持体もまた使用できる。様々な形態のペプチドが合成でき、直鎖状のペプチドおよびジスルフィド架橋された円形のペプチドが含まれている。このようにある態様において、本現発明は、ペプスキャンテクノロジーで使用されるポリエチレンロッドのような固体層上で合成されるペプチドに特異的な抗体を創生する方法を提供する。本方法は一般に、標的分子またはその一部の領域に相当するペプチドの組の固体層での合成、抗体またはペプチドのディスプレイライブラリーの構築、親和性選抜および親和性吸着技術による固体層に結合したペプチドに結合するディスプレイされたペプチドまたは抗体の選抜、という工程からなる。典型的な態様では、ペプチドまたは抗体のディスプレイライブラリーはファージディスプレイライブラリー、または、細菌または酵母細胞表面で作られたディスプレイライブラリーとすることができる。一段階あるいは多数段階の選抜の後、ディスプレイされた結合抗体またはペプチドは、ペプチド上でまたは天然または変性した立体配置の標的タンパク質上で付加的な選抜段階がとられてよい。典型的な態様では本方法は天然の立体配置である標的タンパク質、たとえば普通のまたは悪性の真核細胞上で発現されたマーカー、または固定された組織切片中の細胞で発現されたマーカーのように変性した立体配置である標的タンパク質とも結合する抗ペプチド抗体を単離するために使用できる。同様に本方法は、差し引き法を用いて、あるタンパク質とその他の関連する形態のタンパク質間で区別することができる抗体を作るために使用することができる。その関連する形態のタンパク質は標的タンパク質と一つまたはそれ以上のアミノ酸が異なってよく、または糖鎖付加のような翻訳後修飾の結果として異なってもよい。本方法の実例となる態様では、人造の抗体ファージディスプレイライブラリーを使って特異的な抗体を親和性選抜により作ることができる。ファージライブラリーは貫膜タンパク質の外側の領域に相当するペプチドで覆われたロッドを含むペプスキャンブロックとともにインキュベートされ、そして、ファージが個々のロッドに結合することになる。洗浄により非結合ファージを除去した後、結合ファージをロッドから溶出し、そして、細菌細胞中で増殖させる。選抜のための多様な以後の段階は同じ方法で行われてよい。一方、細胞上で発現されたような別の立体配置を示すタンパク質または組み換えタンパク質との結合について、固体層に結合したペプチド上での最初の選抜段階を経た結合ファージを選抜してよい。差し引き法では、最初のおよび／またはその後の選抜段階でペプチドから溶出されたファージを、関連する分子と交差反応するファージを吸着するため、最初の選抜で使われたペプチドと一つあるいはそれ以上のアミノ酸が異なるペプチドのような他のペプチドで覆われたロッドとともにインキュベートしてよい。本発明は、単一の抗原の同一分子上にある二つの重複しないエピトープと結合する二重特異性抗体を得るために適用できることが意図されている。そのような抗体はキレート効果により、親和性を高めたということが示されている（チョンエイチエス(CHEONG,H.S.)ら、バイオケム．バイオフィズ．レス．コム(Biochem.Biop hys.Res.Comm)173巻、795頁(1990)）。一組の重複するペプチドと結合する親和性選抜されたファージ抗体のプール(pool)をコードするDNAを、さまざまな形態の二重特異性抗体のディスプレイを可能とするベクターに再クローン化してよい。高い親和性で結合するファージを得るために、ディスプレイされた二重特異性抗体を標的タンパク質との結合についての親和性で選抜してよい。同じ戦略を使って異なった分子で発現される二つのエピトープと結合する二重特異性抗体を得てよい。個々の抗体またはペプチド、およびこれらの抗体またはペプチドをコードする遺伝子またはオリゴヌクレオチドを、親和性の増強の後、ファージディスプレイライブラリーから単離することも本現発明で可能である。これらの遺伝子およびオリゴヌクレオチドは抗体産生のため発現ベクターにサブクローニングするため使うことができ、またオリゴヌクレオチドの誘導体はヌクレオチド配列決定および化学的に合成されたペプチド、または、原核細胞または真核細胞における産生といった組み換えDNA法により作られるペプチドを合成するために使われる情報として使用できる。別の態様では本現発明は固定された生体標的に対し特異的に結合することができるペプチドの同定法を提供するものであり、それは、レプリカブルディスプレイパッケージの表面上にペプチドをディスプレイすること、および結合させるためその特異的に結合するペプチドを固定された標的と接触させることからなる。このように本現発明は、さまざまな方法で包埋および固定された組織切片を使う免疫組織化学法および免疫蛍光法に適する抗体の選抜を容易にする方法を提供するものである。加えて本方法は、組織切片、たとえば除去による方法および／または個々の細胞または細胞の小集団の顕微解剖により得た腫瘍細胞が浸潤した領域といった、特定の解剖学的領域に結合する抗体特異性の単離を容易にする。本方法は、レプリカブルディスプレイパッケージの表面上で発現される抗体またはペプチドの大きなライブラリーを必要とする。ディスプレイライブラリーは、様々な方法で構築されてよい。典型的な態様では、ディスプレイパッケージは抗体−コートタンパク質融合体からなるファージ粒子である。抗体の構築に使われるヌクレオチド配列は部分的にin vitroで合成され組立てられる。これらのライブラリーは、自己の抗原に対する抗体を含む、多くの新規な特異性を含んでいる。基本的な方法では、目的の抗体特異性を発現するファージを、再記する１)包埋および固定された組織切片へのファージの結合、２)洗浄による非結合ファージの除去、３)結合ファージの溶出、４)大腸菌(E．Coli)への溶出したファージの感染およびその増殖、からなる４つの工程でこのライブラリーから選抜する。特定の組織あるいは細胞の型に結合する特定のファージ抗体を得るため、本方法は、意図されない特異性を排除するため溶出したファージ抗体を吸着することにより拡充してよい。これは溶出したファージ抗体と他の組織の切片等を、あるいは目的とする標的細胞を含まない同一組織の切片等をインキュベートし、そして続く非結合ファージの増殖により達成してよい。加えて、特定の細胞の型、たとえば解剖学的位置決定により定義されたようなものに特異的なファージ抗体を得るために、個々のまたは集団の細胞あるいは組織片および吸着したファージを顕微解剖により組織切片からこすり取ってよい。本現発明は、固体層依存ペプチド合成と合わせて、抗体またはペプチドディスプレイ技術により特異的な抗体またはペプチドを単離する強力で直接的な方法を利用できるようにするものである。本現発明は、さらに、組織切片または全組織についての選抜方法と合わせて、抗体またはペプチドディスプレイ技術により特異的な抗体またはペプチドを単離する強力で直接的な方法を利用できるようにするものである。本現発明の典型的な態様では、ディスプレイパッケージは抗体可変領域のアミノ酸配列を含む抗体融合コートタンパク質からなるファージ粒子である。レプリカブルファージベクターのライブラリー、特に抗体融合コートタンパク質のライブラリーをコードするファージミドを形成し、適する宿主細胞に感染させて使用する。ファージライブラリーの構築に使われる抗体可変遺伝子は完全に個々のリンパ球に由来してよく、または部分的に、半人造ファージ抗体ディスプレイライブラリーにおけるようにin vitroで組み立てられてよい。これらのin vitro免疫系の構成および多様性の重要な決定因子は、ライブラリーを構築するための構成単位として使われる抗体遺伝子の供給源である。ライブラリーは、感染源に対する免疫または暴露の結果として特定の免疫応答を示すことが知られる個々のＢリンパ球により発現されるＶ領域から組み立てられてよい。これら個々のリンパ器官におけるＢ細胞群は、抗原特異的Ｂ細胞、およびクローンの増大および抗原親和性の成熟を受けた形質細胞で増強され、その結果、免疫されたファージライブラリーから高親和性抗体断片を選抜できる可能性が高まる。普通の免疫系によって生ずるすべての多様性を取り込むことを意図する際には、ライブラリーを免疫されていない個々のＢ細胞によって発現されたＶ領域から構築してよい。重要なことは、未感作の(naive)、免疫された、または感染した個々のＢリンパ球は、積極的かつ消極的な選抜力を経て一次および二次リンパ器官に存在することに注意すべきである。これらの過程の全体としての影響により、イムノグロブリン遺伝子セグメントの再配列、Ｎ領域の挿入および体細胞超変異に基づく、潜在的に到達できる多様性よりも低い多様性を示すＢ細胞群(B cell repertoire)となる。このin vivo抗体群選抜は、結果生ずる未感作ファージライブラリーに反映される。多様なライブラリーを作る別の方法では、PCRにより無作為なCDR3およびJ H領域がin vitroで融合された、クローン化Ｖ遺伝子の大きなコレクションの利用が可能となる。これら半人造ライブラリーの多様性は、通常の免疫系で働く選抜力により抑制されない。そのようなライブラリーはヒトの実際の抗体能力にない特異性を含むと期待してよい。典型的な態様では、選抜されるべき新規な抗ペプチド特異性を有すると期待されるため、人造ライブラリーが使用される。キメラタンパク質から形成されたファージ粒子は、ペプスキャンブロックのロッド上で合成された標的ペプチドに結合するファージ結合抗体の能力に基づく親和性選抜により分離することができる。ペプスキャンブロック上のロッドは個々のペプチドで修飾されており、それらペプチドのアミノ酸配列は標的タンパク質のアミノ酸配列により決定される。ペプスキャンブロック上で合成されたペプチドの一つあるいは複数の選抜段階の後、天然のまたは変性した立体配置の標的タンパク質に結合するファージが選抜される。たとえば、標的タンパク質は、真核または原核細胞で発現された精製組み換えタンパク質、または、原核または真核細胞の細胞表面で発現された組み換えタンパク質であってよい。標的タンパク質に結合するファージを溶出し増殖させ、そして最終的に結合を分析する。ペプチドの一つあるいは複数の親和性選抜の工程の後、差し引きまたは吸着工程が、二つの近似するペプチド間で区別できるファージを得るのに必要であるかも知れない。たとえば、アミノ酸配列DLVYKDPARPKIおよびDLVYKDPYRPKIで示される近似するペプチド間で区別できるファージは、アミノ酸配列DLVYKDPARPKIに基づく親和性選抜、それに続くアミノ酸配列DLVYKDPYRPKIに結合するファージの吸着によって得られるかも知れない。後半の工程では両ペプチドを認識する識別力のないファージが除かれ、そして増殖に使用されない。この方法により作られた抗体は、たとえば、あるタンパク質の天然に生ずるさまざまなイソ型を区別するのに使用でき、または、がん遺伝子または抗がん遺伝子の変異により生ずる細胞形質転換を検出するための免疫化学的測定法に使用できる。吸着および差し引きの語は、親和性選抜の後または前における得られたファージのコレクションから意図しない特異性を有するファージ抗体を除去することをいう。吸着工程それ自身は、目的とするエピトープを有しないと期待される標的についての親和性選抜工程である。吸着／差し引きに使われる標的は組織切片、細胞系組み換えタンパク質、ペプチドなどでよい。実施例本発明を一般的に記述するが、以下の実施例を参照することにより容易に理解される。これらは、本現発明のある態様および具体例を例証するために単に示されるものであり、また本発明を限定するものではない１．原料および方法別の方法が示されない限り、組み換えDNA法および微生物学的技術は、たとえばサンブルックジェイ（SAMBROOK，J.）ら、モレキュラークローニング(Molec ular Cloning)：アラボラトリーマニュアル(A Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバー研究所出版(Cold Spring harbor Laboratry Press)、コールドスプリングハーバー(Col d Spring harbor)、エヌワイ(NY)(1989)およびオースベルエフエム(AUSUBEL ,F.M.)ら、カレントプロトコルズインモレキュラーバイオロジー(Current P rotocols in Molecular Biology)、ジョンウイリーアンドサンズインコーポレイティド(John Wiley and Sons,Inc.)(1995)により記載されるような標準法を使って行った。ファージ抗体の増殖および選抜のための特定のプロトコルはジクライフジェイ(de，KRUIF，J.)ら、メソッヅインモレキュラーバイオロジー(Methods in Molecular Biology)(1996？)に記載されている。人造ファージ抗体ディスプレイライブラリーの構築人造抗体ライブラリーは本質的に（ジクライフ(de，KRUIF)ら、ジェイモルバイオル(J．Mol．Biol.)２４８巻、97頁(1995)）に記載されるようにして構築した。すなわち、人造CDR3領域を49個の以前クローン化した生殖系VH遺伝子のコレクションに加えるため、縮重オリゴヌクレオチドを使用した。続いて、これらin vitroで再配列したＶＨ遺伝子を、ファージの微量カプシドタンパク質ge neIIIをコードする遺伝子のフレームに融合させた７つの異なる軽鎖Ｖ領域を含むファージミド由来ベクターpHEN1のコレクションにクローン化した。細菌へのこれら構造物(constructs)の導入により、ヘルパーファージの存在のもと、バクテリオファージの表面上でgeneIII融合タンパク質としてscFv抗体断片の発現が生じた。組織切片の調製組織の固定、凍結、包埋および切片化は、たとえば、ツェラーアール(ZELLER，R)、カレントプロトコルズインモレキュラーバイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)、14.1.1−14.1.8頁、オースベルエフエム(AUSUBEL，F.M.)ら編集、グリーンパブリッシングアンドウィリーインターサイエンス(Green Publishing and Wiley Interscience)、ニューヨーク(New York)に記載されるような標準法を使って行った。免疫組織化学法および免疫蛍光法は、たとえば、カレントプロトコルズインイムノロジー(Current Protocols in Immunology)、5.8.1−5.8.8頁、コリガンジェイイー(COLIGAN,J.E.)ら編集、ウィリーインターサイエンス(Wiley Interscience) 、ニューヨーク(New York)に記載されるような標準プロトコルを使って行った。実施例１ペプスキャンを使った選抜 CD64ペプチドのペプスキャン合成ペプスキャン合成は本質的に（ゲイセンエイチエム(GEYSEN，H.M.)ら、プロク．ナトゥル．アカド．サイ．ユースエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81巻、39 98頁(1984)）に記載されるようにして行った。典型的な態様では、CD64分子の細胞外ドメインを、表１の計画に従い25個のポリエチレンロッド上で近接する重複しない12merのペプチドの組として合成した。ペプチド特異的ファージをCD64ペプチドで覆ったロッドとの親和性結合により単離した。ロッドは、１穴当たり30 0μlのlxブロッキングバッファー(2xブロッキングバッファー：ＰＢＳ中、10％オボアルブミン、10％牛血清、１％Tween80)を含む96穴マイクロタイタープレート(microtiterplate)のウエル(well)に室温で２時間ペプスキャンブロックを置くことにより、室温で２時間インキュベートしてブロックした。ファージを2xブロッキングバッファーと１：１(v／v)で混合し、そして室温で30分間インキュベートした。およそ10¹²個のファージを含む250μlのブロックされたファージの溶液を、96穴プレートの１ウエル当たりに添加し、そして25ロッドのペプスキャンブロックを個々のウエルに沈め室温で３時間インキュベートした。ロッドをPBS／0.5％Tween80で10回、また最後の１回をＰＢＳで洗浄し、非特異的なファージ抗体を除去した。ロッドに結合したファージ抗体をマイクロタイタープレートの各ウエルに300μlの0.1Ｍジエチルアミンバッファーを加えて溶出し、そして室温で５分間インキュベートした。その300μlを回収後、溶出工程を繰り返した。600μlの溶出したファージに対し300μlの１ＭトリスバッファーpH7.4を加えて中和した。900μlの溶出ファージサスペンジョンを、５％グルコースおよび10μg／mlのテトラサイクリンを含む4mlの2TYに加えた。最後に5mlのXL−1ブルーセル(Blue cells)(OD600が0.5)を加え、そしてその混合物を37℃で30分間インキュベートした。細胞を3000rpmで30分間遠心分離し、吸引により上清を除去し、そして細胞を、５％グルコース、100μg／mlのアンピシリンおよび10μg／m lのテトラサイクリンを含む２つのTYEプレート上で500μlの残りの培地に再けん濁し、細菌を37℃で一夜培養した。コロニーを細菌プレートからかきとり、そして（ジクライフジェイ(de,KRUIF,J.)ら、ジェイモルバイオル(J.Mol.Bi ol.)248巻、97頁(1995)）に記載されるようにしてファージ抗体粒子を回収するために用いた。結果としてペプチド結合ファージ抗体が増加したライブラリーからの10¹²個のファージ抗体をブロッキングバッファー中で同じペプチドで覆われたロッドとともにインキュベートし、そして同じ方法を使って選抜の次の工程にかけた。ペプスキャンブロックの洗浄酵素結合免疫測定法（以下、ELISAという）またはファージ選抜で使われるブロックを、ディスラプトバッファー（リン酸バッファー／１％SDS／0.1％ベータメルカプトエタノール、pH7.2）にそのペプスキャンブロックを沈め、また超音波水槽に70℃で１時間おくことにより洗浄した。選抜ファージのELISAによる分析選抜後、調製モノクローナルまたはポリクローナルscFv抗体を、選抜に使った同じペプスキャンブロックを使ってELISAでペプチドとの結合の存在について分析した。調製scFvを調製ファージのかわりに使用した。というのは、後者はELIS Aで高いバックグラウンドを生じたためである。すべてのインキュベーションは9 6穴マイクロタイタープレート中で行われた。洗浄したロッドを300μlのPBSに室温で30分間浸し、そして150μlのブロッキングバッファー（5％オボアルブミン／5％牛血清／1％Tween80、ワットマン41ろ紙で濾過したもの）とともに各ピン( each pin)を室温で３時間インキュベートすることで事前にコートした。ロッドをPBS／0.05％Tween80で２回リンスし、そして150μlのブロッキングバッファーと混合したscFvを含有するジクライフ(de,KRUIF)ら、ジェイバイオルケム (J.Biol.Chem.)271巻、7630頁(1996)に記載されるようにして調製した調製ペリプラズム150μlとともに室温で１時間インキュベートした。ロッドをPBS／0.05％Tween 80で２回洗浄し、抗Myc付加(tag)抗体9E10を分泌するハイブリドーマの培養液上清300μlとともに１時間インキュベートした。ロッドをPBS／0.05％Tween80で２回リンスし、PBS／0.05％Tween80／1％BSAで1:500に希釈したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスイムノグロブリン300μlとともに１時間インキュベートした。最後にロッドをPBS／0.05％Tween80で３回洗浄し、ABTS基質とともにインキュベートした。CD64ブロック上でペプチド＃21に結合する３段階の親和性選抜で得た抗ペプチドscFv抗体の代表的な結果を図２に示す。このscFv抗体は選抜の標的として使ったペプチド＃21に特異的に結合するが、CD64ペプスキャンブロックの他のペプチドで覆われたロッドには結合しなかった。細胞選別によるペプスキャン事前選抜ファージ抗体の選抜と分析ペプスキャンブロック上でペプチドに結合する豊富なファージ群を２回またはそれ以後の工程で、フローサイトメトリーおよび細胞選別により標的タンパク質を発現する原核または真核細胞に結合するものについて選抜してよい。この方法を使ったインタクトな細胞上でのファージ選抜の方法は詳細に（ジクライフジェィ(de,KRUIF，J.)ら、プロクナトゥルアカドサイユーエスエイ(Pro c.Natl.Acad.Sci.USA)92巻、3938頁）に記載されている。およそ10¹³個のファージ抗体粒子を、４％のミルクパウダーを含むPBS(MPBS)4mlで15分間ブロックした。5x10⁶個の標的細胞をブロックしたファージに加え、そしてその混合物を４℃で１夜ゆっくりと振とうした。次の日、細胞を氷冷PBS／1％BSA50mlで２回洗浄した。細胞選別または細胞の特定生物型群の選別のため、蛍光色素ラベルされたモノクローナル抗体で染色するために、細胞ペレットを氷冷PBS／1％BSA2mlに再けん濁した。そのため、25μlの蛍光色素ラベルした抗体を細胞ペレットに加え、そして氷上で20分間インキュベーションした後、細胞を1％BSA／PBSで一度洗浄し、そして氷冷PBS／1％BSA2mlに再けん濁した。細胞選別はエフエイシイエスバンテイジ(FACSvantage)で行った。選抜したファージ抗体のフローサイトメトリー分析の方法は詳細に（ジクライフジェイ(de,KRUIF,J.)ら、プロクナトゥルアカドサイユーエスエイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92巻、3938頁）に記載されている。細胞の染色のため、およそ10¹¹個の粒子を含む100μlのモノクローナルファージ抗体を室温で15 分間50μlの4％MPBSを加えてブロックした。50μlのPBS／1％BSA中の5x10⁵個の白血球を加え、そして１時間氷上でインキュベートした。細胞を氷冷PBS／1％BS Aで２度洗浄した。細胞に結合したファージを検出するため、細胞を1／200に希釈したヒツジ抗Ｍ13ポリクローナル抗体（ファルマシア(Pharmacia)、ウプサラ( Uppsala)、スウェーデン(Sweden)）10μl中でインキュベートし、２度洗浄し、そして20μg／mlのPEラベルしたロバ抗ヒツジポリクローナル抗体10μl中でインキュベートした。各工程は氷上で20分間行った。全組織または組織切片におけるペプスキャン事前選抜ファージ抗体の選抜標的器官由来の組織切片を標準法により調製し、固定した。たとえば、組織を OCT包埋剤に沈め、１分間液体窒素中につけ、穏やかに凍結させてよい。クライオスタットを使って10μmの凍結切片を調製し、顕微鏡のスライドグラス上にのせた。その切片を室温で10分間乾燥し、５秒間100％アセトンで固定し、その後室温で乾燥した。ファージライブラリーとインキュベーションする前に、組織切片を液体の拡散を防ぐためワックスでシールし、そして室温で30分間MPBSとともにインキュベーションしてブロックした。ブロッキング工程の後、ペプチドに結合する事前選抜されたファージ抗体ライブラリー由来の、合計で10¹²個のファージを100μlのMPBSでブロックし、スライドグラス上でMPBSの小滴に加えた。ファージ抗体の結合を容易にするため、組織切片を恒湿槽(moist chamber)内で40℃ １夜インキュベートした。その切片を、200mlのPBS／0.5％Tween20を10回交換し合計で21のPBS／0.5％Tw een20により室温で２時間リンスした。リンスの後、スライドグラス上に300μl の76mMクエン酸バッファー(pH2.5)をのせ、そして室温で５分間インキュベーションすることにより、ファージ抗体を溶出した。150μlの１Ｍトリス塩酸バッファーをスライドガラスに添加して中和し、そして、そのサスペンジョンを15ml試験管中で3mlの2TY培地に移した。3mlのXL―1ブルーバクテリア(blue bacteria) を試験管に加え、そしてファージの感染と合成を標準プロトコルに記載されるように進めた。２から３段階の選抜の後、モノクローナルファージ抗体を分析のため調製した。免疫組織化学法による選抜ファージ抗体の分析モノクローナルファージ抗体の組織への結合を免疫組織化学スクリーニングで確認した。そのために、５μｍの凍結組織切片をゼラチンでコートした顕微鏡のスライドグラスにのせた。切片を恒湿槽で30分間、10¹⁰個のファージ粒子を含む 50μlのファージ溶液とともにインキュベートした。結合していないファージを、MPBS―Twでスライドグラスを充分にリンスし除去した。結合したモノクローナルファージ抗体を1:50に希釈されたぺルオキシダーゼ結合ヒツジ抗Ｍ13とともに切片をインキュベートし、その後基質であるジアミノベンジデン(diaminobenzid ene)とともにインキュベーションすることにより視覚化した。ペプスキャンブロック上で親和性選抜されたファージ抗体のコレクションからの二重特異性抗体の構築および選抜 CD64ペプチドに結合する選抜されたモノクローナルファージ抗体をプールし、そして、たとえばダイアボディーズ(diabodics)（ホリガーピイ(HOLLIGER,P.) ら、プロクナトゥルアカドサイユーエスエイ(Proc.Natlc.Acad.Sci.USA )90巻、6444頁(1993)）またはロイシンジッパー化された二重特異性抗体（ジクライフジェイ(de,KRUIF,J.)ら、ジェイバイオルケム(J.Biol.Chem.)271巻、7630頁(1996)）のためのベクターのような、二重特異性抗体のディスプレイを可能とするディスプレイベクターに再クローン化した。典型的な態様では、バクテリオファージの表面上に分泌された分子またはg3p融合タンパク質として二重特異性(scFv)2断片のin vivo細菌発現および組立てを容易にできるように、ファージミドベクターを構築した。我々が報告したFosおよびJun scFvロイシンジッパー構造物（ジクライフジェイ(de,KRUIF,J.)ら、ジェイバイオルケム(J. Biol.Chem.)271巻、7630頁(1996)；図３、１および２）を、プライマーＭ13RおよびPDIM3(5'−TTT GCA TTC AAG CTT TTA TTA GCC CGC ATA GTC AGG AAC ATC GTA TGG GTA TGC GGC AGC GCA ACCACC)を使ってＰＣＲで増幅した。プライマーPDIM3で、Myc付加をヘマグルチニン(HA)付加におきかえ、そしてストップコドンおよびHindIIIサイトをこれらの断片に加えた。PCR生成物を HindIIIで消化し、相補的ロイシンジッパーおよびMyc付加に融合されたscFv遺伝子を含むベクターpHEN1（フーゲンブームエイチアール(HOOGENBOOM,H.R.)ら、ヌクレイックアシッドレス(Nuelcic Acid Res.)19巻、4133頁(1991)）にクローン化した。結果生じた構造物において、両scFvジッパー断片は単一の転写配列によりコードされた。二つのリボソーム結合サイトにより個々にタンパク質が翻訳される。最初のscFv断片はFosジッパードメインおよびHA付加と融合しており、２番目のscFvはJunジッパーおよびMyc付加に融合している（図３、３）。 g3pタンパク質に関するscFvジッパーの位置の影響を決定するため、scFvジッパー断片が逆になった追加の構造体を形成した（図３、４）。サプレッサーE．col i種においてMyc付加とgene3とのあいだに挿入されたアンバーコドンにより、ジッパー領域を介してgene3に融合しているscFv断片をディスプレイするファージ粒子の産生が可能となる。２番目のscFvはFosおよびJunロイシンジッパーのヘテロ２量体化によりペリプラズム領域でファージと会合し、その結果表面上に二重特異性抗体を発現するファージを形成することになる。非サプレッサー種では、Fos Ju nロイシンジッパーが結合する二重特異性(scFv)2断片がペリプラズム領域で組み立てられることになる。非サプレッサー細菌種SF110-FAにおける(scFv)2断片の発現を、SDS―PAGE、その後に続くニトロセルロースへのブロッティングおよびMyc付加およびHA付加特異的モノクローナル抗体(MoAbs)を用いて検出することによりモニターした（図４、下パネル）。還元SDS―PAGEにおいて、構造物３および４は予想されるサイズのHAおよびMyc付加タンパク質の発現を示した。構造物３および４で得られたM yc付加scFv断片の発現レベルは、構造物１および２で得られたものと比較して低かった。おそらく前者の構造物を保持する細菌における、２番目のscFvの同時発現の結果であると思われる。非還元SDS―PAGEではscFvジッパーのおよそ２倍のサイズのタンパク質のみがすべてのレーンで見られた（図４、上パネル）。抗HA モノクローナル抗体で多数のバンドが検出され、一方、抗Mycモノクローナル抗体では一つのみ検出された。抗HAモノクローナル抗体で視覚化された断片の一つは、抗Mycモノクローナル抗体で視覚化された断片と同じ位置に移動した。我々はこのバンドが二重結合特異性抗体を示しており、またその他のHA付加タンパク質は、これらの構造物における最初のscFvジッパーのより高い発現レベルから生ずるホモダイマーであると仮定する。(scFv)2断片の機能をELISAで分析した（図５）。検出のためMyc付加およびHA付加特異的モノクローナル抗体の両者を使って、(scFv)2断片の両標的抗原への特異的結合を証明することができた。サンドイッチ(sandwich)ELISAで、我々は(scFv)2断片が実際に二つの異なった抗原に結合する二重特異性であることを示した。組み換えファージ抗体粒子を構造物１から４を使って合成し、そしてELISAで分析した（図５）。直接gene3に融合したJunジッパーを含む構造物２および３からなるファージでは、不適切な抗体との非特異的な結合を示すものがあった。gene3に融合したFosジッパーを含む構造物１および４を使って合成したファージは、それらの標的抗原のみを認識した。ファージ群から二重特異性ファージ抗体を選抜できる可能性を試験するため、構造物４由来の二重特異性ファージ粒子を抗体ファージディスプレイライブラリーに1:1000の割合で注入し、IgGまたはDNPのいずれかでコートされたイムノチューブ(immunotubes)中で一段階の選抜を行った。選抜後の二重特異性ファージの頻度をプライマーＭ13RおよびFOSCON(5'―CGC CAG GAT GAA CTC C、Fosジッパーに位置する)を使って個々のコロニーに関し、PCRで予測した。選抜後の二重特異性ファージの頻度は0／32(注入したライブラリー)、9／32(IgGで選抜)および6／32（DNPで選抜）であった。算出した濃縮ファクター（±250x）は、単一特異性ファージ抗体を使って得たそれらに匹敵する。このベクターはFosおよびJunロイシンジッパーを使って機能的にファージ上で発現されうる二重特異性抗体の発現を可能とする。それ故、２つの異なったscFv 断片を発現するファージのライブラリーを構築すること、およびこれらから目的とする組み合わせを選択することが可能である。さらに選抜された二重特異性(scFv)2断片を非サプレッサー種で合成でき、また抗Myc、その後に続く抗HAアフィニティーカラムで精製することができる。ペプスキャンブロック上のペプチドと結合する事前選抜されたファージ抗体コレクションから二重特異性抗体を選抜するためには、結合対象の量を保証するためではなく、過度な選抜による多様性の消失を防ぐためロッドに結合したペプチドでの選抜回数（通常２から３回）を制限することに注意すべきである。ペプチドとの結合が増強されたファージ抗体をコードするＶ遺伝子群をロイシンジッパー構造物に再クローン化し、そして標的タンパク質に結合する二重特異性ファージ抗体を前記の方法のいずれかにより選抜する。加えて、より高い親和性の二重特異性抗体がサーフェイスパルスマンレゾナンス（surface palsmon resona nce）（ジョンソンユウ(JONSSON,U.)ら、バイオテクニクス(Biotechniques)11 巻、620頁(1991))の助けでファージ選抜を行うことにより直接単離されると予想されてよい。実施例２：切片上での選抜組織切片の調製標準法により、標的器官から組織切片を調製し固定した。たとえば、組織をOC Tのような包埋剤で包埋し、１分間液体窒素につけることで穏やかに凍結してよい。クライオスタットを使って、10μmの凍結切片を調製し顕微鏡のスライドグラスにのせた。その切片を室温で10分間乾燥し、そして５秒間100％アセトンで固定し、それに続いて室温で乾燥させた。また、組織を４％の用時調製したパラフォルム溶液中で数時間インキュベーションし、濃度を増加させたエタノール中を連続的に通過させて脱水し、そしてパラフィンワックスで包埋して固定してよい。パラフィンブロックを６から８μm の切片に切断した。組織切片のかわりに、用時単離した、または培養した細胞を使用し、同じ方法で処理してよい。組織切片上でのファージの親和性選抜凍結組織切片を直ちに室温で乾燥した。パラフィン包埋した組織切片を１時間 60℃に保持し、そして４分ごとにキシレンを３度交換し、その後２分ごとに100 ％エタノールを２度交換して、それに浸すことによりパラフィン除去した。組織切片をエタノールの濃度を徐々に低下させた溶液で、また最終的に水により再水和させ、そしてPBSで洗浄した。ファージライブラリーとインキュベーションする前に、対象となるスライドグラスの上で液体が拡散するのを防ぐため組織切片をワックスでシールし、そして室温で30分間１％の脱脂ミルクパウダーを含むPBS(MPBS)とともにインキュベーションし、ブロックした。ブロッキング工程のうち、人造ファージ抗体ディスプレイライブラリー由来の合計で10¹³個のファージを300μlのMPBSでブロックし、そしてスライドグラス上のMPBSの小滴に加えた。ファージ抗体の結合を容易にするため、組織切片を恒湿槽中で40℃１夜インキュベートした。その切片を、200mlのPBS／0.5％Tween20を10回交換し合計で21のPBS／0.5％Tw een20により室温で２時間リンスした。リンスの後、スライドグラス上に300μl の 76mMクエン酸バッファー(pH2.5)をのせ、そして室温で５分間インキュベーションすることにより、ファージ抗体を溶出した。150μlの１Ｍトリス塩酸バッファーをスライドグラスに添加して中和し、そして、そのサスペンジョンを15ml試験管中で3mlの2TY培地に移した。3mlのXL―1ブルーバクテリアを試験管に加え、そしてファージの感染と合成を標準プロトコルに記載されるように進めた。２から３段階の選抜の後、モノクローナルファージ抗体を免疫組織化学法による分析のため調製した。免疫組織化学法による選抜ファージ抗体の分析モノクローナルファージ抗体の組織への結合を免疫組織化学スクリーニングで確認した。そのために、5μmの凍結組織切片をゼラチンでコートした顕微鏡のスライドグラスにのせた。切片を恒湿槽で30分間およそ10１０個のファージ粒子を含む50μlのファージ溶液とともにインキュベートした。結合していないファージを、MPBS―Twでスライドグラスを充分にリンスし除去した。結合したファージ抗体を1:50に希釈されたペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗Ｍ13とともに切片をインキュベートし、その後基質であるジアミノベンジデンとともにインキュベーションすることにより視覚化した。意図されない特異性を有する選抜されたファージ抗体の吸着組織切片に結合する選抜されたファージ抗体のコレクションを、意図されない特異性のファージ抗体のために吸着させてよい。結合したファージ抗体の溶出および中和の後、4％(w／v)MPBS溶液を脱脂ミルクの濃度が１％ととなるように溶出物に加えた。ファージ溶液は続いて、たとえば、他の組織または同一組織の解剖学的に異なった領域の組織切片とインキュベートした。非結合ファージを除去し、そして直接増殖させるか、または別の吸着工程のために、他の組織切片とともにインキュベートした。この吸着方法は結果として生ずる非結合ファージをバクテリア中で増殖させる前に、多数回繰り返してよい。顕微解剖器を使った組織切片からの特異的ファージ抗体の単離個々の細胞または組織の一部および結合ファージを本質的には(クーパーアール(KUPPER,R.)ら、エンボジェイ(EMBO-J)12巻、4955頁(1993)）に記載されるようにして、顕微解剖器または類似の装置を使って組織切片からかきとってよい。この方法により、ある組織切片中で特定の解剖学的構造または個々の細胞に結合するファージの単離を行うことができる。たとえば、この方法により、腫瘍の塊を貫く血管の内皮の単離または個々の腫瘍細胞の単離を可能とする。組織切片からかきとった後、結合ファージを溶出し、基本的なプロトコルに記載されているようにして増殖させた。図の説明図１ペプスキャンブロックのロッド上で合成されたペプチドに結合することによるジェネティックディスプレイパッケージの親和性選抜の一般的原理。図２ CD64ペプスキャンブロック上でのペプチド＃21に結合する親和性選抜されたファージ抗体のELISA結果。ブロック上で、他のペプチドとバックグラウンド以上の結合は観察されなかった。図３初発原料（１および２）および二重特異性構造物（３および４）、LacZプロモーター（三角形）、リボソーム結合サイト（丸）、pelBリーダー(P)、Fosジッパー(F)、Junジッパー(J)、Myc付加(M)、HA付加(H)、およびストップコドン（矢印）を示す。黒塗り部および斜線部は異なったscFv特異性を示す。図４ SDS―PAGE／ウエスタンブロッティング分析。発現された構造物１から４由来の調製ペリプラズムを非還元(上パネル)および還元（下パネル）条件で泳動した。タンパク質をHA付加(tag)特異的モノクローナル抗体(左レーン)およびMyc付加 (tag)特異的モノクローナル抗体(右レーン)を使い、その後ペルオキシダーゼ結合抗体を使うことにより視覚化した。図５構造物１から４由来の抗体断片を使ったELISA分析。標準ELISA法では(scFv)2 断片を抗原でコートしたウエルに結合させ、そして抗Mycおよび抗HAモノクローナル抗体を使い、その後ペルオキシダーゼ結合抗体を使って検出した。二重特異性(scFv)2断片を使って（ジクライフジェイ(de,KRUIF,J.)ら、ジェイバイオルケム(J.Biol.Chem.)2 71巻、7630頁）に記載されるようにして、サンドイッチELISA法を行った。ファージＥＬＩＳＡでは、ファージ抗体を抗原をコートしたウエルに結合させ、そしてペルオキシダーゼ結合抗Ｍ13抗体を使って検出した。数字は吸光度を示す。ミルク(milk)でブロックしたウエルに結合するバックグラウンドより３倍高い値をポジティブと考えた（灰色部）。表１ＣＤ６４の細胞外ドメインに相当するオリゴペプチドの組

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. タンパク質性の標的に特異的に結合することができるペプチドを同定する方法であって、レプリカブルディスプレイパッケージの表面上にペプチドをディスプレイすること、固体層上にタンパク質性の標的に由来するオリゴペプチドを合成すること、および結合させるため特異的に結合するペプチドをオリゴペプチドと接触させることからなる方法。 2. 固定した生体標的に特異的に結合することができるペプチドを同定する方法であって、レプリカブルディスプレイパッケージの表面上にペプチドをディスプレイすること、および結合させるため前記の特異的に結合するペプチドと固定した標的とを接触させることからなる方法。 3. タンパク質性の抗原と特異的に結合することができるペプチドとその能力を有さないペプチドとを区別する方法であって、レプリカブルディスプレイパッケージの表面上に候補となるペプチドをディスプレイすること、固体層上でタンパク質性の抗原に由来するオリゴペプチドを合成すること、および結合させるため候補となるペプチドをオリゴペプチドと接触させること、また非特異的に結合するディスプレイパッケージを除去するため固体層を洗浄することからなる方法。 4. 固定した生体標的と特異的に結合することができるペプチドとその能力を有さないペプチドとを区別する方法であって、レプリカブルディスプレイパッケージの表面上に候補となるペプチドをディスプレイすること、結合させるため前記の特異的に結合するペプチドと固定した標的とを接触させること、また非特異的に結合するディスプレイパッケージを除去するため固定した生体標的を洗浄することからなる方法。 5. レプリカブルディスプレイパッケージがファージ粒子である請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の方法。 6. レプリカブルディスプレイパッケージが細菌、酵母、または微生物の芽胞である請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項または第５項記載の方法。 7. 特異的に結合するペプチドが、前記ファージの表面タンパク質をコードする遺伝子の中にそれをコードする配列を挿入することにより、ファージの表面上にディスプレイされる請求の範囲第５項記載の方法。 8. ディスプレイされるペプチドが、イムノグロブリン重鎖、イムノグロブリン軽鎖、重鎖と軽鎖の組、VH、VL、Fab、Fv、scFvまたはジスルフィド架橋されたF vである請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項または第７項記載の方法。 9. 特異的に結合するペプチドが、単一鎖抗体断片、好ましくはScFvである請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項または第８項記載の方法。 10．ディスプレイされたペプチドが目的とする標的を含まない試料と接触させられるさらなる工程からなる請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項または第９項記載の方法。 11．タンパク質性の標的または固定した生体標的と特異的に結合することができるペプチドのための、レプリカブルディスプレイパッケージのライブラリーをスクリーニングする方法であって、ライブラリー中のペプチドについて請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７項、第８項、第９項または第10項記載の方法により行う方法。 12．前記ライブラリーがファージディスプレイライブラリーである請求の範囲第 11項記載の方法。