JP2003505025A - （ポリ）ペプチド／タンパク質を、ジスルフィド結合を介してバクテリオファージ粒子に表示させる新規方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質を、ジスルフィド結合を介して結合させることによって、該（ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒子の表面に表示させる方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質をジスルフィド結合を介して結合さ
せることによって、この（ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒
子の表面に表示させる方法に関する。

【０００２】 本出願は、引用によりその全体が本明細書中に包含される欧州特許出願ＥＰ
９９ １１ ４０７２．４およびＥＰ ００ １０ ３５５１．８を基礎とし、これ
らに対して優先権を主張する。本明細書中を通して、多数の文献が引用されてい
る。これらの文献の開示内容は引用によりその全体が本明細書中に包含される。

【０００３】 Smithは、１９８５年に、繊維状ファージが、その遺伝子ＩＩＩタンパク質（
ｐＩＩＩ）内に挿入された外来のタンパク質断片を寛容することを最初に示し、
そのタンパク質断片がファージ表面に表されることを示すことができた(Smith,
1985)。Landerは、その概念をファージ表面に表示された（ポリ）ペプチドおよ
び／またはタンパク質のレパートリーのスクリーニングに拡大し、それ以後、フ
ァージディスプレーは劇的な進歩を経験し、実質的に達成された。

【０００４】 （ポリ）ペプチド／タンパク質ファージディスプレーライブラリーを構築し、
スクリーニングする種々の形式が開発され、多数の総括論文および研究論文がこ
れらの発達を報告し、要約している（例えば、Kay et al., 1996; Dunn, 1996;
McGregor, 1996）。

【０００５】 最もよく用いられてきたのは、繊維状ファージに基づく系である。

【０００６】 この方法は、最初は、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の表示を計画され(WO 88/0
6630; さらにWO 92/01047を参照)、その後Ｆａｂ断片のような多量体タンパク質
のディスプレー(WO 91/17271; WO 92/01047)を含む、ウシ膵臓トリプシン阻害剤
（ＢＰＴＩ）(WO 90/02809)、ペプチドライブラリー(WO 91/19818)、ヒト成長ホ
ルモン(WO 92/09690)および種々の他のタンパク質のディスプレーに急速に拡大
された。

【０００７】 ペプチドまたはタンパク質を繊維状バクテリオファージ表面にアンカーするた
めには、ほとんどの場合、ファージコートタンパク質に対する遺伝的融合物が用
いられる。好ましいのは、遺伝子ＩＩＩタンパク質(Parmley & Smith, 1988)ま
たはその断片(Bass et al., 1990)および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質(Greenwood
et al., 1991)に対する融合物である。１つの例では遺伝子ＶＩが用いられ(Jesp
ers et al., 1995)、また最近では遺伝子ＶＩＩと遺伝子ＩＸの組み合わせがＦ
ｖ断片の表示用に用いられた(Gao et al., 1999)。

【０００８】 さらに、ファージラムダに対するファージディスプレーも達成された。この場
合、遺伝子Ｖタンパク質(Maruyama et al., 1994)、遺伝子Ｊタンパク質および
遺伝子Ｄタンパク質(Sternberg & Hoess, 1995; Mikawa et al., 1996)が用いら
れた。

【０００９】 遺伝的融合物を用いる以外に、外来ペプチドまたはタンパク質が結合ドメイン
を介してファージ表面に結合された。WO 91/17271では、ファージ表面に表示さ
れたタグおよび、表示されるべきペプチド／タンパク質に融合されたタグ結合リ
ガンドを用いて非共有的表示を達成することが示された。

【００１０】 ｃＤＮＡライブラリーの表示ために同様の概念が追求された(Crameri & Suter
, 1993)。ここでは、ｊｕｎ／ｆｏｓ相互作用を用いて、ｃＤＮＡ断片の表示が
媒介された。その構築体中、ｊｕｎならびにｆｏｓの両端に隣接するさらなるシ
ステイン残基が、２つのジスルフィド結合の形成によってその相互作用をさらに
安定化した。

【００１１】 バイオパニング（biopanning）においてファージディスプレーライブラリーを
スクリーニングする場合、所望の標的と結合したファージをどのように最良に回
収するかという問題が残っている。通常、これは、ｐＨ勾配または塩濃度勾配の
使用または、可溶性標的を用いる特異的溶出による、適当なバッファーでの溶出
によって達成される。しかし、標的に高い親和性（アフィニティー）で結合する
最も関心ある結合物がこのアプローチによって失われることもある。この問題を
克服するために、表示される（ポリ）ペプチド／タンパク質とその融合パートナ
ー間、または目的の標的と固形表面に標的をアンカーするその担体間の開裂シグ
ナルを提供することによる、いくつかの別の方法が工夫された。

【００１２】 さらに、本明細書中に示すすべてのアプローチは、少なくともファージコート
タンパク質の部分と外来（ポリ）ペプチド／タンパク質を含む融合タンパク質の
使用を必要とする。特に、表示されるべきペプチド／タンパク質に対するパート
ナーとして遺伝子ＩＩＩを用いる場合、このことはいくつかの問題を生じさせる
。第一に、遺伝子ＩＩＩの発現産物は宿主細胞に対して有毒であり、遺伝子ＩＩ
Ｉ融合タンパク質の厳重な調節が必要とされる。第二に、遺伝子ＩＩＩ産物の発
現は、子孫のファージ粒子の生産に必要とされるヘルパーファージの感染に対し
て宿主細胞を耐性にし得る。そして最後に、遺伝子ＩＩＩ融合構築体と遺伝子Ｉ
ＩＩの野生型コピー間の組換えイベントは望ましくない人工産物を生じさせる。
さらに、融合タンパク質をファージコート内へ包含させるために、少なくとも、
約１９０アミノ酸を含む遺伝子ＩＩＩタンパク質のＣ末端ドメインを用いなけれ
ばならないので、この核酸配列を含むベクターのサイズは大きくなり、形質転換
効率の減少を生じさせる。しかし、形質転換効率は非常に大きなライブラリーの
生産に決定的な要因である。さらに、ファージディスプレーライブラリーからの
選択後に得られた（ポリ）ペプチド／タンパク質の特徴付けに関して、ファージ
コートタンパク質融合パートナーを除去するためか、あるいは、例えば検出用酵
素または多量体化ドメイン（multimerisation domains）との融合によって新た
な融合タンパク質を作成するために、その（ポリ）ペプチド／タンパク質を通常
、発現ベクターに再クローニングする。再クローニングなしに直接発現し、（ポ
リ）ペプチド／タンパク質を他の部分と直接カップリングさせることを可能にす
る系が有益である。

【００１３】 さらに、これらのアプローチのほとんど（Jespers et al. (1995), WO 91/172
71および本明細書中、上に記載されるCrameri & Suter (1993)の実験を除く）は
、（ポリ）ペプチド／タンパク質のＣ末端をファージコートタンパク質と融合さ
せなければならないため、遊離のＮ末端を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質
の提示に限定される。特に、ｃＤＮＡライブラリーの場合、または機能的である
ために遊離のＣ末端が必要とされるタンパク質の場合、Ｃ末端融合物の作成を必
要としない単純な方法が非常に望ましい。

【００１４】 したがって、本発明の基礎となる技術的な課題は、ファージコートタンパク質
との融合タンパク質を用いる必要なしに、（ポリ）ペプチド／タンパク質をファ
ージ粒子上に提示することを可能にする単純な信頼できる系を開発することであ
る。さらに、より信頼できる様式で、厳重に結合した（ポリ）ペプチド／タンパ
ク質を回収することを可能にする方法が必要とされる。

【００１５】 この技術的課題は、請求の範囲に特徴付けられる態様を提供することによって
解決される。したがって、本発明は、バクテリオファージ粒子表面に表示された
（ポリ）ペプチド／タンパク質の大きなライブラリーを容易に作成し、スクリー
ニングすることを可能にする。（ポリ）ペプチド／タンパク質をジスルフィド結
合によってファージ粒子表面に連結する、本発明の技術的アプローチは先行技術
によって開示も示唆もされていない。

【００１６】 したがって、本発明は（ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒
子表面に表示させる方法であって： 該（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とタンパク質
コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基との間にジスルフィド結合を
形成させることにより、発現後の該（ポリ）ペプチド／タンパク質と該バクテリ
オファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結合させるか、あるいはその
結合を可能にすることを含む方法に関する。

【００１７】 本発明の記載では、用語「バクテリオファージ」とは、ファージの複製に必要
とされる核酸を含むタンパク質コートからなるパッケージを形成する細菌のウイ
ルスに関する。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本鎖または一本鎖、直鎖状
または環状であり得る。ファージラムダまたは繊維状ファージ（例えばＭ１３、
ｆｄまたはｆ１）のようなバクテリオファージは当業者に周知である。本発明の
記載では、用語「バクテリオファージ粒子」は本発明に記載の粒子、すなわちジ
スルフィド結合を介して（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する粒子を表す。
バクテリオファージの組み立て中、コートタンパク質は、パッケージングシグナ
ルを含んでいる種々の核酸配列をパッケージングすることができる。本発明の記
載中、バクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子に含まれる「核酸配列
」という用語は、バクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子の組み立て
時に、バクテリオファージコートタンパク質によってパッケージングされる核酸
配列またはベクターに関する。好ましくは、該核酸配列またはベクターは天然に
存在するバクテリオファージゲノムから誘導され、例えば繊維状ファージの場合
、ファージおよびファージミドベクターを含む。後者は、プラスミドの特徴に加
えてパッケージングシグナルおよびファージの複製起点を含むプラスミドである
。

【００１８】 用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数、すなわ
ち２つまたはそれ以上のアミノ酸の１つまたはそれ以上の鎖からなる分子に関す
る。

【００１９】 用語「タンパク質」は、少なくとも（ポリ）ペプチドの一部が、その（ポリ）
ペプチド鎖（群）内および／または間の、二次、三次または四次構造の形成によ
って規定の三次元配置を獲得しているか、あるいはその獲得能を有する（ポリ）
ペプチドを表す。この定義には、天然に存在するか、あるいは少なくとも部分的
に人工的なタンパク質、ならびに、上に記載される規定の三次元配置を獲得可能
である完全長タンパク質の断片またはドメインが含まれる。

【００２０】 一本鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例には、単一鎖Ｆｖ抗体断片
があり、複数の鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例には、Ｆａｂ抗体
断片がある。

【００２１】 第一のシステイン残基が、（ポリ）ペプチド／タンパク質のＣ末端に位置する
場合、表示形式は、Ｃ末端がファージコートタンパク質のメンバーに遺伝子融合
されている慣用の表示機構に対応する。しかし、（ポリ）ペプチド／タンパク質
のＮ末端を用いることによって、表示形式は上記のCrameri & SuterのｐＪｕＦ
Ｏ系におけるように逆転させることができる。

【００２２】 用語「バクテリオファージ粒子の表面」とは、バクテリオファージ粒子の部分
であって、この粒子が含有される媒体と接触し、接近可能な部分を意味する。こ
の表面は、適当な宿主細胞内でのファージ生産時に組み立てられるファージコー
トの部分であるタンパク質（粒子のタンパク質コートのメンバー）によって決定
される。

【００２３】 用語「発現後」とは、バクテリオファージコートタンパク質との融合タンパク
質をコードしている核酸が発現されるアプローチとは対照的に、該（ポリ）ペプ
チド／タンパク質をコードする核酸が、該コートとの結合前に宿主細胞内で発現
される状況を表す。該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードしている核酸の発
現および、結合を生じさせるか、あるいは可能にする工程を、分離された工程お
よび／または環境において行うことができる。しかし、発現および、結合を生じ
させるか、あるいは可能にする工程は、適当な宿主細胞内で順に行われるのが好
ましい。用語「（該結合が）ジスルフィド結合の形成によって生じる（ジスルフ
ィド結合を形成させることにより）」とは、例えばｐＪｕＦｏ系の場合(Crameri
& Suter, 1993)のように、ジスルフィド結合が結合に寄与し、また（ポリ）ペ
プチド／タンパク質に存在する第二のドメインと相互作用するための相互作用ド
メインが、タンパク質コートの該メンバーと組換え的に融合されていない状況を
表す。

【００２４】 好ましい態様では、（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示するバクテリオファ
ージ粒子は（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む。

【００２５】 本発明に記載の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子の構築方
法、該核酸分子を含むベクターの構築方法、該ベクターを適当に選択された宿主
細胞へ導入する方法、該（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現させるか、あるい
はその発現を可能にする方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999; Ge et al, 1995を参照）。さらに、適当な宿主
細胞内での子孫のバクテリオファージまたはバクテリオファージ粒子の生産に必
要とされる遺伝物質の導入方法、および該子孫のバクテリオファージまたはバク
テリオファージ粒子を生産させるか、あるいはその生産を可能にする方法は周知
である（例えば、Kay et al., 1996を参照）。

【００２６】 さらに好ましい態様では、本発明は、該第二のシステイン残基がバクテリオフ
ァージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在する方法に関す
る。

【００２７】 さらに好ましい態様では、本発明は、タンパク質コートの該メンバーがバクテ
リオファージの野生型コートタンパク質である方法に関する。

【００２８】 用語「野生型コートタンパク質」とは、天然に存在するバクテリオファージの
ファージコートを形成するタンパク質を表す。繊維状バクテリオファージの場合
、該野生型タンパク質は遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｐＩＩＩ）、遺伝子ＶＩタン
パク質（ｐＶＩ）、遺伝子ＶＩＩタンパク質（ｐＶＩＩ）、遺伝子ＶＩＩＩタン
パク質（ｐＶＩＩＩ）および遺伝子ＩＸタンパク質（ｐＩＸ）である。繊維状バ
クテリオファージの密接に関係するメンバー、例えばｆ１、ｆｄおよびＭ１３間
の相違を含むこれらの配列は当業者に周知である（例えば、Kay et al., 1996を
参照）。

【００２９】 さらに好ましい態様では、タンパク質の該メンバーは、バクテリオファージ野
生型コートタンパク質の断頭された変異体であり、該断頭された変異体は少なく
とも、該コートタンパク質をバクテリオ粒子タンパク質コート内へ包含させる、
該野生型コートタンパク質の部分を含む。

【００３０】 用語「断頭された変異体」とは、野生型配列の少なくとも部分の欠失させるこ
とによって修飾された上記野生型タンパク質由来のタンパク質を表す。これには
、バクテリオファージ突然変異体において発見された断頭された遺伝子ＩＩＩタ
ンパク質変異体のような変異体(Crissman & Smith, 1984)または標準的ファージ
ディスプレー法の工程で生産された変異体（例えば、Bass et al., 1990; Krebb
er, 1996）が含まれる。例えば、断頭された変異体は、遺伝子ＩＩＩタンパク質
のＣ末端ドメインからなるか、あるいはこれを含み得る。本発明に記載の断頭さ
れた変異体を同定するために、この変異体に検出タグを融合させることができ、
この変異体が、変異体の存在下で形成されたバクテリオファージ粒子のファージ
コート内に包含されているか否かを測定するアッセイを構成することができる。
野生型タンパク質の部分を欠失させることによって野生型タンパク質を断頭させ
る方法により、野生型タンパク質中で、欠失された部分に含まれる第二のシステ
インとジスルフィド結合を形成するシステイン残基を利用可能にすることができ
る。

【００３１】 さらに好ましい態様では、タンパク質コートの該メンバーは、バクテリオファ
ージ粒子のタンパク質コート内に包含され得る、バクテリオファージの野生型コ
ートタンパク質の修飾された変異体である。

【００３２】 本発明に記載の野生型タンパク質を修飾する方法は当業者に周知であり、これ
には標準的クローニングおよび／または突然変異誘発技術が含まれる。本発明に
記載の方法において用いられる野生型タンパク質の修飾された変異体をコードす
る核酸分子の構築方法、ファージおよび／またはファージミドベクターの構築を
含む、該核酸分子を含むベクターの構築方法、該ベクターを適当に選択された宿
主細胞へ導入する方法、該修飾されたタンパク質を発現させるか、あるいはその
発現を可能にする方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989;
Ausubel et al., 1999; Kay et al., 1996を参照）。本発明に記載の修飾され
た変異体を同定するために、変異体に検出タグを融合させることができ、この変
異体を、変異体の存在下で形成されたバクテリオファージ粒子のファージコート
内へ包含させることができるか否か、あるいは包含されているか否かを測定する
ためにアッセイを構成することができる。

【００３３】 最も好ましい態様では、該第二のシステイン残基はバクテリオファージの野生
型コートタンパク質内の対応するアミノ酸位置に存在しない。

【００３４】 好ましい態様では、該第二のシステインはバクテリオファージの野生型コート
タンパク質内へ人工的に導入されたものである。本明細書の記載では、用語「人
工的に導入された」とは、野生型コートタンパク質が例えば組換え法によって修
飾された状況を表す。例えば、野生型コートタンパク質をコードする核酸を標準
的手法によって操作し、システインコドンを導入して、修飾されたコートタンパ
ク質をコードする核酸配列を作成する。ここにシステイン残基は、該野生型また
は修飾されたコートタンパク質の少なくとも部分に挿入、あるいは該システイン
残基を付加することによって、あるいは該野生型または修飾されたタンパク質の
少なくとも部分に含まれるアミノ酸残基を該システイン残基で置換することによ
って、あるいは野生型または修飾されたコートタンパク質の少なくとも部分を、
該第二のシステイン残基を含む（ポリ）ペプチド／タンパク質と融合することに
よって、あるいはこれらの挿入、付加、置換または融合の任意の組み合わせによ
って人工的に導入される。このような組換え的に導入されたシステインコドンを
含む核酸を発現すると、システイン残基を含む野生型タンパク質の変異体が形成
される。

【００３５】 さらに最も好ましい態様では、該第二のシステインは、バクテリオファージ野
生型コートタンパク質の断頭された変異体に人工的に導入されたものである。

【００３６】 さらに好ましい態様では、該第二のシステインは、バクテリオファージ野生型
コートタンパク質の修飾された変異体に人工的に導入されたものである。

【００３７】 本発明に記載の人工的導入の達成方法は当業者に周知であり、これには標準的
クローニングおよび／または突然変異誘発技術が含まれる。本発明に記載の方法
において用いられる野生型タンパク質の修飾された変異体をコードする核酸分子
の構築方法、該核酸分子を含むベクターの構築方法、該ベクターを適当に選択さ
れた宿主細胞へ導入する方法、該融合タンパク質を発現させるか、あるいはその
発現を達成する方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; A
usubel et al., 1999を参照）。

【００３８】 別の態様では、本発明は、該第二のシステインが、該バクテリオファージ粒子
のファージコートの該メンバーのＣ末端またはＮ末端か、あるいはその近くに存
在する方法に関する。

【００３９】 用語「の近く」とは、バクテリオファージの外側に位置する、該（ポリ）ペプ
チド／タンパク質のＮまたはＣ末端どちらかから数えて、１５アミノ酸まで、よ
り好ましくは１０アミノ酸までの範囲を表す。

【００４０】 さらに好ましいのは、該バクテリオファージが繊維状バクテリオファージであ
る方法である。繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆｄまたはｆ１は当
業者に周知である。

【００４１】 繊維状バクテリオファージの場合では、バクテリオファージ粒子のタンパク質
コートの該メンバーが野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか、あるいはそれ
から誘導されたものである方法が特に好ましい。

【００４２】 さらに好ましいのは、バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバ
ーが野生型コートタンパク質ｐＩＸであるか、あるいはそれから誘導されたもの
である方法である。本明細書の記載では、用語「誘導された」とは、修飾された
タンパク質がバクテリオファージ粒子のタンパク質コートに包含され得るもので
ある修飾を表す。修飾されたタンパク質の野生型タンパク質に対応する部分は、
対応する野生型配列と比較して約７０％、好ましくは約８０％、最も好ましくは
約９０％を超えるアミノ酸同一性を示すのが好ましい。

【００４３】 本発明のさらに好ましい態様では、 （ａ）該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列を
含有する宿主細胞を入手し； （ｂ）該核酸配列を発現させるか、あるいはその発現を可能にし； （ｃ）該宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生（生産）させるか、あるい
はその産生を可能にすることを含む方法に関する。

【００４４】 本発明の記載中、用語「発現させるか、あるいはその発現を可能にする」とは
、核酸配列を発現させる条件下で宿主細胞を培養することを表す。本発明に記載
の（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸分子を構築する方法、該核酸
分子を含むベクターを構築する方法、該ベクターを適当に選択された宿主細胞に
導入する方法、（ポリ）ペプチド／タンパク質を発現させるか、あるいはその発
現を可能にする方法は当分野に周知である（例えば、Sambrook et al., 1989; A
usubel et al., 1999を参照）。さらに、適当な宿主細胞内における子孫のバク
テリオファージまたはバクテリオファージ粒子の生産に必要とされる遺伝物質を
導入する方法、および該子孫のバクテリオファージまたはバクテリオファージ粒
子を生産させるか、あるいはその生産を可能にする方法は周知である（例えば、
Kay et al., 1996を参照）。バクテリオファージ粒子を生産させるか、あるいは
その生産を可能にする工程は、例えばファージミドを用いる操作の場合、適当な
ヘルパーファージの使用を必要とすることもある。工程（ｂ）と（ｃ）はいずれ
かの順序で行ってもよいし、あるいは同時に行ってよい。

【００４５】 さらなる態様では、該（ポリ）ペプチド／タンパク質は免疫グロブリンまたは
その機能的断片を含む。

【００４６】 本明細書の記載では、「免疫グロブリン」は「抗体」の類義語として用いられ
る。用語「機能的断片」とは、免疫グロブリンの抗原結合部分を保持している免
疫グロブリンの断片を表す。本発明に記載の機能的免疫グロブリン断片とは、Fv
(Skerra & Plueckthun, 1988), scFv (Bird et al., 1988; Huston et al., 19
88), ジスルフィド連結された Fv (Glockshuber et al., 1992; Brinkmann et a
l., 1993), Fab, F(ab')₂ 断片または当業者に周知の他の断片であって、免疫グ
ロブリンまたは免疫グロブリン断片の可変ドメインを含むものであってよい。特
に好ましいのは、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片である。

【００４７】 好ましい態様では、本発明は、 （ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の、１個またはそれ以上の
部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパク質をファージコー
ト内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を含むもの；および、
（ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に
存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシス
テイン残基であるもの； からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコ
ードする核酸配列に関する。

【００４８】 本発明の記載では、野生型コートタンパク質配列内のアミノ酸残基をシステイ
ン残基で置換することによって得られる修飾された変異体は、追加のシステイン
残基によって連結された該野生型タンパク質の２つの部分から構成される変異体
とみなすことができる。これに対応して、野生型配列と比較していくつかの突然
変異を含む野生型コートタンパク質の変異体はいくつかの野生型部分から構成さ
れ、個々の部分は突然変異残基によって連結されているとみなすことができる。
しかし、該変異体は、システイン残基を含む６個までの残基を野生型コートタン
パク質のＣ末端またはＮ末端に追加することによって得られたものであってもよ
い。

【００４９】 さらに好ましいのは、 （ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の１個またはそれ以上の部
分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパク質をファージコート
内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を含むもの； （ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に
存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシス
テイン残基であるもの；および、 （ｃ）精製および／または検出目的の１個またはそれ以上のペプチド配列； からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコ
ードする核酸配列である。

【００５０】 特に好ましいのは、金属イオンと結合でき、したがって、それらが融合される
タンパク質の精製に用いることができる(Lindner et al., 1992)、少なくとも５
個のヒスチジン残基を含むペプチド（Hochuli et al., 1988）である。また本発
明によって、一般に用いられるｃ−ｍｙｃおよびＦＬＡＧタグ(Hopp et al., 19
88; Knappik & Plueckthun, 1994)またはＳｔｒｅｐタグ(Schmidt & Skerra, 19
94; Schmidt et al., 1996)のような追加の部分が提供される。

【００５１】 この修飾された変異体はさらに、クローニング、発現またはタンパク質輸送に
必要とされるアミノ酸残基を含む。クローニングに必要とされるアミノ酸残基に
は、核酸配列の適当なベクター内へのクローニングを可能にするために包含され
る制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含む核酸配列によってコードされる残基
が含まれる。発現に必要とされるアミノ酸残基には、（ポリ）ペプチド／タンパ
ク質の可溶性または安定性を増加させる残基が含まれる。タンパク質輸送に必要
とされるアミノ酸残基には、修飾された変異体の大腸菌周辺質への輸送を担うシ
グナル配列および／または該シグナル配列の効率的開裂を促進するアミノ酸残基
が含まれる。上記のクローニング、発現、タンパク質輸送、精製および／または
検出目的で必要とされるさらなるアミノ酸残基は、当業者に周知の多数のもので
ある。

【００５２】 別の態様では、本発明は、本発明に記載の核酸配列を含むベクターに関する。

【００５３】 好ましい態様では、このベクターは、第二のシステイン残基を含む（ポリ）ペ
プチド／タンパク質をコードする１個またはそれ以上の核酸配列をさらに含む。

【００５４】 最も好ましい態様では、該（ポリ）ペプチド／タンパク質は免疫グロブリンま
たはその機能的断片を含む。

【００５５】 本明細書中、上に記載される単一鎖Ｆｖ抗体断片の場合には、このベクターは
、ポリペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードす
る１個の核酸配列を含み、Ｆａｂ抗体断片の場合には、このベクターはＶＨ−Ｃ
ＨおよびＶＬ−ＣＬ鎖をコードする２個の核酸配列を含む。

【００５６】 さらなる態様では、本発明は、本発明に記載の核酸配列または本発明に記載の
ベクターを含む宿主細胞に関する。

【００５７】 本発明の記載では、用語「宿主細胞」は、例えば大腸菌(Ge et al., 1995)ま
たは枯草菌（Bacillus subtilis, Wu et al., 1993）のような細菌、酵母(Horwi
tz et al., 1988; Ridder et al., 1995)または糸状菌(Nyyssoenen et al., 199
3)のような真菌、植物細胞(Hiatt & Ma, 1993; Whitelam et al., 1994)、昆虫
細胞(Potter et al., 1993; Ward et al., 1995)または哺乳類細胞(Trill et al
., 1995)を含むがこれらに限定されない、異種タンパク質の生産に一般に用いら
れる多数のもののうちのいずれかであってよい。

【００５８】 さらに好ましい態様では、本発明は、本発明に記載の核酸配列、本発明に記載
のベクターによってコードされるか、あるいは本発明に記載の宿主細胞によって
生産される野生型バクテリオファージのコートタンパク質の修飾された変異体に
関する。

【００５９】 別の態様では、本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシ
ステイン残基とタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基と
の間にジスルフィド結合を形成させることにより、発現後の該（ポリ）ペプチド
／タンパク質とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結合
させるか、あるいはその結合を可能にすることを含む方法によって得られる（ポ
リ）ペプチド／タンパク質をその表面に表示するバクテリオファージ粒子に関す
る。

【００６０】 別の態様では、本発明は、（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシ
ステイン残基とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーに含まれ
る第二のシステイン残基のジスルフィド結合の形成によって生じる結合により、
その表面に結合された（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示するバクテリオファ
ージ粒子に関する。

【００６１】 好ましい態様では、バクテリオファージ粒子はさらに、該（ポリ）ペプチド／
タンパク質をコードする１個またはそれ以上の核酸配列を含むベクターを含む。

【００６２】 本発明の最も好ましい態様では、バクテリオファージ粒子は、修飾された野生
型バクテリオファージコートタンパク質をコードする核酸配列およびさらに、（
ポリ）ペプチド／タンパク質をコードし、そして最も好ましくは、少なくとも免
疫グロブリンの機能的ドメインを含むものをコードする、１個またはそれ以上の
核酸配列を含む本発明に記載のベクターを含む。

【００６３】 本明細書中、上に記載される本発明の方法の好ましい態様は、必要な変更を加
えて本発明のバクテリオファージに適用される。

【００６４】 さらなる態様では、本発明は、各バクテリオファージ粒子が（ポリ）ペプチド
／タンパク質の種々の集団由来の（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する本発
明に記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団に関する。「バクテリオファー
ジ粒子の種々の集団」はまた、「ライブラリー」または「多数のバクテリオファ
ージ粒子」として表すことができる。このようなライブラリーのメンバーはそれ
ぞれ、ライブラリーの別のメンバーを表示する。

【００６５】 本発明の記載中、用語「種々の集団（diverse collection）」とは、その組成
、性質および／または配列が少なくとも部分的に異なっている少なくとも２個の
粒子または分子の集団を表す。例えば、（ポリ）ペプチド／タンパク質の種々の
集団とは、その配列の少なくとも１個のアミノ酸位置が異なっている一組の（ポ
リ）ペプチド／タンパク質である。このような（ポリ）ペプチド／タンパク質の
種々の集団は種々の方法、例えば出発（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードす
る核酸配列の少なくとも１個のコドンをランダムに突然変異誘発させることによ
って、誤りがちなＰＣＲを用いて出発（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードす
る核酸配列を増幅することによって、あるいは本発明の方法において変異誘発株
を宿主細胞として用いることによって得られる。（ポリ）ペプチド／タンパク質
の種々の集団を作成するための、これらの方法、さらなる方法または別の方法は
当業者に周知である。「バクテリオファージ粒子の種々の集団」はまた、ライブ
ラリーまたは多数のバクテリオファージ粒子として表されることもある。このよ
うなライブラリーのメンバーはそれぞれ、ライブラリーの別のメンバーを表示す
る。

【００６６】 別の態様では、本発明は、 （ａ）本発明に記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団を提供し； （ｂ）所望の性質を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する少なくとも
１個のバクテリオファージ粒子を得るために該種々の集団をスクリーニングし、
ならびに／あるいは該種々の集団から選択することを含む、所望の性質を有する
（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法に関する。

【００６７】 本発明の記載中、用語「所望の性質」とは、（ポリ）ペプチド／タンパク質の
種々の集団由来の１個の（ポリ）ペプチド／タンパク質が有するべきであり、こ
の種々の集団のスクリーニングおよび／または選択の基礎を形成する、あらかじ
め決められた性質を意味する。このような性質は、標的に対する結合、標的のブ
ロック、標的が媒介する反応の活性化、酵素活性および、当業者に既知のさらな
る性質のような性質を含む。当業者であれば、所望の性質のタイプに依存してス
クリーニングおよび／または選択を行う形式および必要な工程を同定できるであ
ろう。

【００６８】 最も好ましいのは、該所望の性質が目的の標的に対する結合である方法である
。

【００６９】 該目的の標的は、例えば固相バイオパニング用の表面にコーティングし、溶液
中のバイオパニング用に磁気ビーズのような粒子に連結し、あるいは全細胞バイ
オパニングまたは組織セクションバイオパニング用の細胞表面に表示させるよう
な当業者に周知の種々の方法でバクテリオファージ粒子の該種々の集団に対して
提示することができる。該標的と結合したバクテリオファージ粒子は、例えば適
当なバッファーで溶出させること、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を用いること、ま
たは可溶性標的を用いる特異的溶出のような当業者に既知の種々の方法によって
回収できる。

【００７０】 好ましい態様では、（ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法はさらに： （ｂａ）バクテリオファージ粒子の該種々の集団を目的の標的と接触させ； （ｂｂ）目的の標的と結合しないバクテリオファージ粒子を溶出させ； （ｂｃ）工程（ｂａ）で形成された目的の標的および該目的の標的と結合したバ
クテリオファージの複合体を還元条件下で処理することによって、目的の標的と
結合したバクテリオファージ粒子を溶出させることを含む。

【００７１】 例えばＤＴＴとインキュベートすることによる、還元条件下では、ジスルフィ
ド結合は開裂し、これにより、バイオパニングのさらなるラウンドおよび／また
は該標的と特異的に結合する（ポリ）ペプチド／タンパク質の同定用の、特異的
バクテリオファージ粒子を回収することが可能になる。

【００７２】 実施例は、本発明を説明するものである。 実施例１：ジスルフィド結合の形成による、非操作繊維状バクテリオファージ粒
子表面における（ポリ）ペプチド／タンパク質のディスプレイ 以下の実施例において、すべての分子バイオプシー実験は、標準的プロトコル
（Ausubel et al., 1999）にしたがって行なった。

【００７３】 ｓｃＦｖを発現するベクターの構築 使用したベクターはすべて、高コピーファージミドpMorphX7-LHの誘導体（図1
a+b）、pCALベクターシリーズの誘導体（WO97／08320；Knappik et al., 2000）
である。発現カセットには、phoA シグナル配列、モノクローナル抗体（mab）抗
−FLAG M1（Sigma ＃F-3040）（Knappik and Plueckthun, 1994）に対する最小
結合部位、一本鎖断片（ｓｃＦｖ）、短いリンカー（PGGSG）および6ｘヒスチジ
ンタグ（6His; Hochuli et al., 1988）（図1a）を含んでいる。pMorphX7-LCHお
よびpMorphX7-LHCは、Cys-6Hisおよび6His-Cysをコードするオリゴヌクレオチド
カセットをそれぞれ、pMorphX7-LHの固有のAscIおよびHindIII 部位の間に挿入
することによって作製されている（図１ａ, 表１）。すべてのベクターは、いず
れのファージコートタンパク質とも遺伝子的に融合していない可溶性ｓｃＦｖを
発現する。WO97／08320に記載されたpCAL4ベクターに基づいておりファージタン
パク質pＩＩＩのＣ末端部分へのｓｃＦｖの融合物を発現する、慣用的なファー
ジディスプレイベクターpMorph13を、ポシティブコントロールとして使用した。
ｓｃＦｖは、固有のXbaIおよびEcoRI部位（c.f. 図1a）によって、それぞれのベ
クター間で交換されている。

【００７４】 ｓｃＦｖの説明−抗原相互作用 すべてのｓｃＦｖは、ヒトのコンビナトリアル抗体ライブラリー（HuCAL; WO9
7／08320; Knappik et al., 2000）から得られる。HuCAL VHおよびVLコンセンサ
ス遺伝子（WO97／08320に記載）およびｓｃＦｖのCDR３配列を表２に示す。クロ
ーンhag2をインフルエンザウイルス赤血球凝集素由来のペプチド（赤血球凝集素
由来のアミノ酸９９〜１１０＋更なるフランキングアミノ酸（イタリックで示す
（訳者注：本明細書翻訳文では下線で示す）、CAGPYDVPDYASLRSHH）に対して選
択し、クローンMacI-5をヒトCR-3α鎖の断片（MacI）（SWISS-PROT entry P1121
5、６×ヒスチジンタグを含むC末端配列に融合したヒトCR-3αのアミノ酸１４９
〜３５３）に対して選択した。ELISAおよびドープ化ライブラリー実験のための
対応する抗原を以下のようにして得た。hag2特異的抗原N1-hagを、ベクターpTFT
74の誘導体である、発現ベクターpTFT74-N1-hag-HIPM（Freund et al., 1993）
（図2）を用いて調製した。N1-hagは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素由
来のアミノ酸９９〜１１０および６×ヒスチジンタグ（（イタリック（訳者注：
本明細書翻訳文では下線で示す））を含んでなるアミノ酸配列PYDVPDYASLRSHHHH HH （hag）に融合したN末端（N1）に更なるメチオニン残基を含んでいるファージ
M13の成熟遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ酸１〜８２を含んでなる。Ｎ１−hag
の発現、精製および再折り畳みは、記載されている通りに行なった（Krebber, 1
996; Krebber et al., 1997）。MacI-5の抗原として、Ｃ末端６×ヒスチジンタ
グに融合したヒトＣＲ−３α鎖の精製断片（MacI）（SWISS-PROT entry P11215
）を使用した。詳細には、発現カセットは、Ｎ末端のメチオニン、ヒトＣＲ−３
α鎖のアミノ酸１４９〜３５３およびアミノ酸IEGRHHHHHHをコードする。このカ
セットを固有の制限部位BspHIおよびHindIIIによってつなぎ、例えば、pQE-60（
QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）の固有NcoIおよびHindIII部位ヘ導入して、発
現ベクター pQE60-MacIを得ることができる（図３）。発現および精製は、標準
的な方法を用いて行なった（The QIAexpressionist^TM 3rd edition：A handbook
for high-level expression and purification of 6xHis-tagged protein（Jul
y 1998）. QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）。ウシ血清アルブミン（BSA, Sigma
＃A7906）をネガティブコントロール抗原として使用した。

【００７５】 非操作ファージ上にディスプレイされたｓｃＦｖの機能性 ディスプレイされたｓｃＦｖが特異的抗原の認識に関して機能的であることを
示すため、ファージＥＬＩＳＡを行なった。HuCAL ｓｃＦｖ hag2およびMacI-5
の２つについて分析を行なった。ｓｃＦｖのＣ末端に融合したモジュールが異な
る３つの発現系、pMorphX7-LH、pMorphX7-LHCおよびpMorphX7-LCHを分析した。

【００７６】 ファージは、ヘルパーファージVCSM13を用いる標準的手法（Kay et al., 1996
）にしたがって調製した。特異的抗原または対照抗原（BSA, Sigma ＃A7906）を
、ＰＢＳ中５μｇ／ウェルの濃度で、４℃にて、Nunc Maxisorp マイクロタイタ
ープレート（＃442404）に１２時間コーティングする。ファージをPBSTM（5％脱
脂粉乳および0.1％ツイーン20を含むPBS）中、5 mM DTT有りまたはなしで、室温
にて２時間プレインキュベーションした後、それを、抗原でコーテイングしたEL
ISAウェルに、１×１０^１０ファージ／ウェルの濃度で加える（pMorph13につい
ては３×１０^７ファージ／ウェルの濃度で用いる）。室温で１時間結合させた後
、非特異的に結合したファージを0.05％ツイーン２０を含むPBSで洗い流し、結
合したファージを抗-M13-HRPコンジュゲート（Amersham Pharmacia Biotech ＃2
7-9421-01）およびBM blue soluble（Boehringer Mannheim ＃1484281）を用い
るELISAで検出した。３７０nmでの吸光度を測定した。特異的抗原により得られ
たELISAシグナルを対照抗原のものと比較した。ｓｃＦｖをディスプレイしてい
るファージの抗原に対する特異的結合を示すことができた。ｓｃＦｖs hag2およ
びMacI-5のこのような２つのＥＬＩＳＡの例を、図４および図５にそれぞれ示し
た。pMorphX7-LCHおよびpMorphX7-LHC由来のファージは、シグナルがバックグラ
ウンドの１．９〜５．８倍に達した。プレインキュベーション工程中、抗原結合
の前に５ｍＭＤＤＴを加えた場合、ＥＬＩＳＡシグナルはバックグラウンドレベ
ルまでほぼ減少したが、慣用のディスプレイファージ（pMorph13）については、
DTTの影響はあまりなかった。

【００７７】 ｓｃＦｖをディスプレイする非操作ファージの富化 ｓｃＦｖをディスプレイする非操作ファージを特異的抗原に対して富化できる
ことを証明するため、いわゆるドープ化ライブラリー（doped library）実験を
行なった。特異的ファージを大過剰の非特異的ファージと混合し、特異的抗原に
対する３ラウンドのパニングを行なった。各ラウンド後に特異的ファージの富化
を測定した。pMorphX7-LHCベクターにおいてHuCAL ｓｃＦｖs hag2およびMacI-5
に関して分析を行なった。

【００７８】 pMorphX7-hag2-LHCおよびpMorphX7-MacI-5-LHC誘導化ファージを１：１０^５（
pMorphX7-hag2-LHCパニング）および１０^５：１（pMorphX7-MacI-5-LHCパニング
）の割合で混合した。それぞれhag2およびMacI-5特異的抗原に対して３ラウンド
のパニングを行なった。標準的手順によってファージを調製し、ＰＢＳＴＭ（Ｐ
ＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイーン２０）と１：１混合することによってプ
レブロックし、室温で２時間インキュベーションした。Nunc Maxisorp マイクロ
タイタープレート（＃442404）のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中５μｇ／ウェ
ルの濃度の特異的抗原Ｎ１-hag（およびＢＳＡ）でコーティングし、次いでＰＢ
ＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬで室温にて２時間ブロックした。最初
のラウンドでは、ウェル当たり１０^１１のプレブロックされたファージをウェル
に加え、マイクロタイタープレートシェーカー上で、室温にて１時間インキュベ
ーションした。ファージ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％
ツイーン２０）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを標準的なプ
ロトコルにしたがって１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、ＴＧ１細胞の感
染に用いた。さらに、ウェルに加えたＴＧ１の直接感染によって、残りのファー
ジを溶出させた。特異的抗原に対するパニングの各ラウンド後、少なくとも４６
個の独立した感染細胞をＰＣＲによって分析することにより、非特異的ファージ
に対する特異的ファージの割合を測定した。標準的なプロトコルにしたがい、鋳
型のソースとして単一のコロニーを用い、プライマーとして各ｓｃＦｖのＶＨ
ＣＤＲ３およびＶＬ ＣＤＲ３に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＰ
ＣＲを行った。３ラウンドのパニング後、特異的クローンは、pMorphX7-hag2-LH
Cパニングに関しては約４％（分析された９３クローンのうち４個）に富化され
、pMorphX7-MacI-5-LHCパニングに関しては約９０％（分析された９１クローン
のうち８２個）に富化された。

【００７９】 実施例２：ジスルフィド結合の形成による操作された繊維状バクテリオファージ
粒子の表面上における（ポリ）ペプチド／タンパク質の表示 実施例２．１：ｓｃＦｖのディスプレー 上記実施例１は、機能的ｓｃＦｖがジスルフィド結合により非操作ファージ上
にディスプレーされ得ることを示す。この系を、例えばファージコートタンパク
質上の露出したシステインを操作することにより、さらに改良することができる
。１つの候補となるファージコートタンパク質は、プロテインＩＩＩ（ｐＩＩＩ
）であり、これはＮ１、Ｎ２およびｐＩＩＩＣＴの３つのドメインからなる。不
対のシステイン残基が位置する可能性のある部位は、ドメイン間のリンカー領域
か、そのドメインまたは先端欠失型のｐＩＩＩであるｐＩＩＩＣＴの暴露したＮ
末端である。更なる例は、システインが例えば全長タンパク質のＮ末端に連結し
得るファージコートタンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）である。原則として、そのような
操作されたタンパク質の発現のためのカセットを、ｓｃＦｖを生じるベクター上
（１−ベクター系）か、または別のベクター上（２−ベクター系）に配置するこ
とができる。

【００８０】 以下に、我々が全長型および先端欠失型ｐＩＩＩの両方およびｐＩＸを操作し
た実験を記載する。これらのタンパク質を同じ細菌細胞において、ファージミド
（pMorph18-C-gIII-scFv-LHC誘導体；１−ベクター系）または別のプラスミド（
pBR322-C-gIIIまたはpUC19-C-gIIIおよび誘導体；２−ベクター系）から、ｓｃ
Ｆｖとともに同時発現させた。

【００８１】 ｓｃＦｖおよび操作されたファージコートタンパク質を発現するベクターの構
築 ２−ベクター系のためのファージコートタンパク質発現カセットを以下のとお
り構築した：末端に固有ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりつないだ
２つの異なる発現カセットを作製し、完全長の成熟ｐＩＩＩ（Ｃ−ｇＩＩＩ）の
Ｎ１ドメインの暴露したＮ末端または先端欠失型タンパク質のｐＩＩＩＣＴドメ
インのＮ末端（タンパク質ｐＩＩＩのアミノ酸２１６〜４０６；Ｃ−ｇＩＩＩＣ
Ｔ）（図６ｂ＋ｃ））で不対のシステイン残基を位置させた。両方の発現カセッ
トをｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下にあり、シグナル配列ｏｍ
ｐＡ、アミノ酸ＤＹＣＤＩＥＦおよびｐＩＩＩまたはｐＩＩＩＣＴ ＯＲＦ（表
３に示された完全アミノ酸配列を含む）を含んでなる。修飾されたｐＩＩＩタン
パク質を発現するプラスミドは、これらＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩカセットをプ
ラスミドｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９へ、それぞれ固有ＮｄｅＩおよびＨｉｎ ｄ ＩＩＩまたはＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位により挿入することによって
得た。一例として、ｐＢＲ−Ｃ−ｇＩＩＩのベクターマップを図６ａに示す。得
られたプラスミド、ｐＢＲ−Ｃ−ｇＩＩＩ、ｐＢＲ−Ｃ−ｇＩＩＩＣＴ、ｐＵＣ
−Ｃ−ｇＩＩＩおよびｐＵＣ−Ｃ−ｇＩＩＩＣＴを、修飾されたｓｃＦｖを発現
するpMorphX7-LHCファージミド（実施例１）によりE. coli TG1へ同時トランス
フェクションし、両抗生物質マーカーについて選択した。

【００８２】 １−ベクター系において、両方の修飾されたファージコートタンパク質並びに
修飾されたscFvを、ｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御下でジシスト
ロン（dicistronic）ファージミドから発現させた。第１の発現カセットは、シ
グナル配列ｏｍｐＡ、アミノ酸ＤＹＣＤＩＥＦおよび各ファージコートタンパク
質のＯＲＦまたはその一部を含んでなる。不対のシステイン残基を完全長の成熟
ｐＩＩＩ（Ｃ−ｇＩＩＩ）のＮ１ドメインの露出したＮ末端、先端欠失型のプロ
テインＩＩＩ（タンパク質ｐＩＩＩのアミノ酸２１６〜４０６；Ｃ−ｇＩＩＩＣ
Ｔ）のＮ末端およびタンパク質ＩＸのＮ末端（Ｃ−ｇＩＸ）のそれぞれに連結し
た（アミン酸配列を表４に示す）。第２の発現カセットは、ｐｈｏＡシグナル配
列、各ｓｃＦｖのＯＲＦ、短いリンカー（ＰＧＧＳＧ）、６×ヒスチジンタグ（
６His; Hochuli et al., 1988）および１個のシステイン残基（pMorphX7-LHC、
表１参照）を含む。修飾された完全長のｐＩＩＩ並びに修飾されたｓｃＦｖｈａ
ｇ２をコードするpMorph18-C-gIII-hag2-LHCの完全なベクター配列並びに各ベク
ターマップを図７ａ＋ｂに示す。異なるファージコートタンパク質は、、ｓｃＦ
ｖの３’末端に存在する第２のＥｃｏＲＩ部位のために、３フラグメント法にお
いてＥｃｏＲＩおよびＳｔｕＩにより交換することができる。異なる操作された
ｓｃＦｖを固有ＭｆｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位によりクローニングすること
ができる。このベクターの誘導体pMorph20-C-gIII-hag2-LHCは、固有EcoRI 部位
をscFvの３’末端に含んでいるが、第２の部位（ompA シグナル配列とgIII ORF
の間）がサイレントなPCR突然変異誘発により削除されている。この構築物は、
固有SphIおよびEcoRI部位によりｓｃＦｖまたはｓｃＦｖプールのクローニング
を可能にする。

【００８３】 ジスルフィド結合によるｓｃＦｖのファージコートタンパク質への結合 バイオパニング法に利用するファージは、ヘルパーファージVCSM13を用いて標
準的なプロトコル（Kay et al., 1996）にしたがって調製することができる。ヘ
ルパーファージタンパク質に加え、操作したファージコートタンパク質および可
溶性の修飾されたｓｃＦｖを、上記の１−ベクター系または２−ベクター系から
同時発現させた。ジスルフィド結合によりscFvsが操作したファージコートタン
パク質に結合し、ファージ粒子に取りこまれることを実証するために、scFvをデ
ィスプレイしているファージを、非還元的および還元的条件下でSDS PAGEに付し
た。ウェスタンブロット分析を抗-pIIIおよび抗-Flag M1抗血清に対して行なっ
た。

【００８４】 ファージを標準的な手法にしたがって、ヘルパーファージVCSM13（Kay et al.
, 1996）を用いて調製した。５mM DTT添加またはDTT無添加のPBS中（それぞれ還
元的および非還元的条件）でファージを室温にて３０分間プレインキュベーショ
ンした後、DTTまたはβ−メルカプトエタノールのような還元剤を含まないSDS添
加緩衝液を加えた。レーンあたり、１〜５×１０^１０のファージ４〜１５％ SDS
PAGE（BioRad）に付し、PVDFメンブランにブロットした。抗-pIIIウェスタンブ
ロットについては、メンブランをMPBST（PBS buffer containing 5％ milk powd
erおよび0.05％ Tween20）中でブロックし、１次抗体としてマウス抗-pIII（１
：２５０希釈；Mobitec）、２次抗体として抗マウス-IgG-APコンジュゲート（１
：１００００希釈；SIGMA）および基質としてBCIP／NPT タブレット（SIGMA）を
用いて発色させた。抗-Flag M1ウェスタンブロットについては、メンブランをMT
BST-CaCl₂（５％ミルク粉末、０.０５％ツイーン２０および１mM CaCl₂を含むTB
S緩衝液）中でブロックし、１次抗体としてマウス抗-Flag M1（１：５０００希
釈；Sigma）、２次抗体として抗マウス-IgG-APコンジュゲート（１：１００００
希釈；SIGMA）および基質としてBCIP／NPT タブレット（SIGMA）を用いて発色さ
せた。

【００８５】 完全長のｐＩＩＩに連結したｓｃＦｖについて予想された高さに移動した特異
的バンドを、１−ベクター系および２−ベクター系の両方について示すことがで
きた。このシグナルは、非還元的条件下でのみ認められ、ＤＴＴ下では現れず、
ｐＩＩＩおよびｓｃＦｖがジスルフィド結合（ｓｃＦｖ−Ｓ−Ｓ−ｐＩＩＩ）に
よって結合していることを示すものである。２−ベクター系の一例として、scFv
MacI−5についての抗-Flag M1および抗-pIII ウェスタンブロットを図８に示す
。更なるシステインを有しないｓｃＦｖ（pMorph7x-MacI-5-LH）を発現するとき
、ファージを通過する遊離のscFvのみを抗-Flag M1ウェスタンブロットにおいて
検出することができる（レーン８、図８A）。更なるシステインがscFvに付加さ
れているとき（pMorphX7-MacI-5-LHC）、それらのバンドはほとんど認めること
ができず、scFvダイマー（scFv-S-S-scFvおよび／または（scFv-SH）₂）（およ
び未知のさらなるバンド（scFv-S-SX））の高さに移動するバンドが現れる（レ
ーン７、図８A）。操作したｓｃＦｖが操作したさらなるシステインをＮ末端に
含むpIII（pMorphX7-MacI-5-LHCおよびpBR-C-gIII）とともに同時発現するとき
、シグナルはｓｃＦｖ−ｐＩＩＩヘテロ二量体（scFv-S-S-pIII）に対応する分
子量へシフトする（レーン６、図８A）。予想通り、同様の数のファージ粒子を
各レーンに加えたにもかかわらず、非操作のscFvが操作されたpIIIとともに同時
発現したとき（pMorphX7-MacI-5-LHおよびpBR-C-gIII）、このscFv-S-S-pIIIシ
グナルは認められなかった（レーン５、図８A）。還元剤の存在下では、支配的
なシグナルは、すべての発現系について、遊離のｓｃＦｖからのものであった（
レーン１〜４、図８Ａ）。抗-pIII ウェスタンブロットでは、還元的および非還
元的条件下の両方で、すべての発現系について、遊離のプロテインＩＩＩ（pIII
-SH および／またはpIII）が認められた（レーン１〜８、図８Ｂ）。ジスルフィ
ド結合したプロテインＩＩＩ二量体（pIII-S-S-pIII）について予想された高さ
に移動する特異的なバンドは、操作したプロテインＩＩＩが発現したとき、非還
元的条件下でのみ検出できた（図８Ｂのレーン５および６）。操作されたｓｃＦ
ｖおよび操作されたプロテインＩＩＩが同時発現したときのみ、ジスルフィド結
合したプロテインＩＩＩ二量体に加え、ジスルフィド結合したｓｃＦｖおよびプ
ロテインＩＩＩ（scFv-S-S-pIII）の高さに移動した更なるバンドが現れた（レ
ーン６、図８Ｂ）。このバンドは、抗-Flag M1ウェスタンで検出され（レーン６
、図８Ａ参照）、DTT感受性である（レーン２、図８Ａ参照）scFv-S-S-pIIIシグ
ナルのサイズに対応する。ジスルフィド結合したｓｃＦｖおよびプロテインＩＩ
Ｉの高さに移動し、抗-Flag M1および抗-pIII抗血清の両方により検出されたＤ
ＴＴ感受性のバンドも、操作されたｓｃＦｖおよび操作されたｐＩＩＩが同じフ
ァージミド（pMorph18-C-pIII-scFv-LHC）から同時発現したときに観察された。
この１−ベクター系の一例として、scFv hag2については抗-Flag M1および抗-pI
IIウェスタンブロットを、およびscFvs AB1.1およびMacI−5については抗-pIII
ウェスタンブロットを、図９Ａおよび９Ｂにそれぞれ示す。

【００８６】 操作されたファージ（engineered phages）に表示されたｓｃＦｖの機能性 表示されたｓｃＦｖが特異的抗原の認識に関して機能的であることを示すため
、ファージＥＬＩＳＡを行った。HuCAL scFv MacI-5 および hag2 に関して分析
を行った。２ベクター系では、pMorphX7-LHC をそれぞれ pBR-C-gIII, pBR-C-gI
IICT, pUC-C-gIII および pUC-C-gIIICT とともに同時トランスフォームした。
３個の異なる１ベクター構築体、すなわち pMorph18-C-gIII-scFv-LHC, pMorph1
8-C-gIIICT-scFv-LHC および pMorph18-C-gIX-scFv-LHC を分析した。ｓｃＦｖ
がジスルフィド結合によって、操作されたファージコートタンパク質に結合する
ことを示すため、非還元条件および還元条件下の両方でファージＥＬＩＳＡを行
った。

【００８７】 ヘルパーファージ VCSM13 を用いる標準的手法にしたがってファージを生産し
、ファージ力価を測定した(Kay et al., 1996)。ＰＢＳ中５μｇ／ウェル量の特
異的抗原またはコントロール抗原(BSA, Sigma #A7906)を、４℃で１２時間、Nun
c Maxisorp ミクロタイタープレート (# 442404) にコーティングし、５％脱脂
粉乳を含むＰＢＳで２時間ブロックした。可能であれば、ファージを２．５％脱
脂粉乳、０．０５％ツイーン２０および５ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳ中、室温で
２時間プレインキュベートし、その後、抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡウ
ェルにウェル当たり６．４×１０^６〜１×１０^１１ファージの濃度範囲で適用し
た。室温（ＲＴ）で１時間結合させた後、非特異的に結合したファージを、０．
０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄して除き、結合したファージを抗−Ｍ１
３−ＨＲＰコンジュゲート(Amersham Pharmacia Biotech #27-9421-01)とＢＭブ
ルー可溶性物質(BM blue soluble、Boehringer Mannheim #1484281)を用いるＥ
ＬＩＳＡにおいて検出した。３７０ｎｍでの吸光度を測定した。特異的抗原を用
いて得られたＥＬＩＳＡシグナルをコントロール抗原を用いて得られたシグナル
と比較した。ｓｃＦｖを表示しているファージの抗原への特異的結合は１ベクタ
ー形式における C-gIII, C-gIIICT および C-gIX 構築体に関して示された。ま
た、C-gIII および C-gIIICT を試験し、両２ベクター系において働くことが示
された。このようなｓｃＦｖに関する４つのＥＬＩＳＡの例としてＭａｃＩ−５
を図１０〜１３に示す。ファージコートタンパク質がシステイン残基の追加によ
って操作されているすべての場合で、ＥＬＩＳＡシグナルは、ｓｃＦｖのみが追
加のシステインを保持している pMorphX7-LHC シグナルと比べて有意に増加して
いる。プレインキュベーション時、抗原結合前に５ｍＭ ＤＴＴをファージに加
えると、全３個の操作されたファージコート構築体および未操作（non-engineer
ed）pMorphX7-LHC ファージに関してＥＬＩＳＡシグナルはほとんどバックグラ
ウンドレベルにまで減少したが、ＤＴＴは慣用的ディスプレーファージ（pMorph
13；図１３）に対しては重大な影響を与えなかった。このことは、未操作および
操作されたファージの両方に関して、ジスルフィド結合は、ファージに対するｓ
ｃＦｖの機能的表示に本質的であり、したがってｓｃＦｖを表示しているファー
ジが抗原と特異的に結合するのに本質的であることを示す。

【００８８】 「ドープ化ライブラリー（doped library）」実験におけるｓｃＦｖを表示する
操作されたファージの富化(enrichment) ｓｃＦｖを表示する操作されたファージを特異的抗原に対して富化できること
を証明するため、「ドープ化ライブラリー」実験を行った：特異的ファージを大
過剰の非特異的ファージと混合し、特異的抗原に対する３ラウンドのパニングを
行った。各ラウンド後に特異的ファージの富化を測定した。pMorph18-C-gIII-sc
Fv-LHC １ベクター系において２個の HuCAL scFv hag2 および MacI-5 に関して
分析を行った。

【００８９】 pMorph18-C-gIII-hag2-LHC および pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC 誘導化ファ
ージを１：１０^５(pMorph18-C-gIII-hag2-LHC パニング)および１０^５：１(pMor
ph18-C-gIII-MacI-5-LHC パニング)の割合で混合した。それぞれｈａｇ２および
ＭａｃＩ−５特異的抗原に対して３ラウンドのパニングを行った。標準的手順に
よってファージを製造し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイー
ン２０）と１：１混合することによってプレブロックし、室温で２時間インキュ
ベートした。Nunc Maxisorp プレート (#442404)のウェルを、４℃で一晩、ＰＢ
Ｓ中５μｇ／ウェルの濃度の特異的抗原（およびＢＳＡ）でコーティングし、次
いで室温で２時間、ＰＢＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬでブロックし
た。第一ラウンドでは、ウェル当たり１０^１０のプレブロックされたファージを
適用し、ミクロタイタープレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートし
た。ファージ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２
０）で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージを標準的プロトコルにし
たがって１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、ＴＧ１細胞の感染に用いた。
さらに、ウェルに加えられたＴＧ１細胞の直接感染によって、残りのファージを
溶出させた。特異的抗原に対するパニングの各ラウンド後、少なくとも９１個の
独立した感染細胞をＰＣＲによって分析し、非特異的ファージに対する特異的フ
ァージの割合を測定した。標準的プロトコルにしたがい、鋳型のソースとして単
一のコロニーを用い、プライマーとして各ｓｃＦｖのＶＨ ＣＤＲ３およびＶＬ
ＣＤＲ３に対して特異的なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った。２ラウ
ンドのパニング後、pMorph18-C-gIII-hag2-LHC パニングに関しては約０％（分
析された９３クローンのうち０個）の陽性クローンが得られ、pMorph18-C-gIII-
MacI-5-LHC パニングに関しては約３％（分析された９１クローンのうち３個）
の陽性クローンが得られた。３ラウンドのパニング後、特異的クローンは、pMor
ph18-C-gIII-hag2-LHC パニングに関しては約７９％（分析された１１７クロー
ンのうち９２個）に富化され、pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC パニングに関して
は約１００％（分析された２２９クローンのうち２２９個）に富化された。

【００９０】 プレ選択されたプールのパニングにおけるｓｃＦｖを表示する操作されたファー
ジの富化 ｓｃＦｖを表示する操作されたファージを種々のプール（diverse pool）から
選択できることを証明するため、プレ選択されたライブラリーのパニングを行っ
た。１ラウンドの慣用的パニング後のプールを操作された１ベクター形式へサブ
クローニングし、さらに３ラウンドまでパニングを継続した（ｃｙｓ−ディスプ
レーパニング）。

【００９１】 以下の抗原に対してパニングを行った：（ｉ）成熟ＩＣＡＭ１の細胞外部分（
アミノ酸１〜４５４）＋Ｍ２−Ｆｌａｇおよび６×ヒスチジンタグを含むアミノ
酸 CGRDYKDDDKHHHHHHを含むＩＣＡＭ１、（ｉｉ）Ｎ末端に追加のメチオニン残
基＋Ｃ末端に短いリンカー（Ｎ１）を有するファージＭ１３の成熟遺伝子ＩＩＩ
タンパク質のａａ１〜８２を含み、ヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエ
ントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３を含むポリペプチド＋６×ヒ
スチジンタグを含むＣ末端配列 IEGRHHHHHH と融合されたＮ１−ＭａｃＩ、（ｉ
ｉｉ）ヒトＮＦκＢ ｐ５０のアミノ酸２〜３６６＋６×ヒスチジンタグを含む
アミノ酸 EFSHHHHHH と融合された、Ｎ１を含むＮ１−Ｎｐ５０。Ｎ１−Ｍａｃ
ＩおよびＮ１−Ｎｐ５０用の発現ベクターはベクターｐＴＦＴ７４(Freund et a
l., 1993) に基づくものである(pTFT74-N1-hag-HIPM の完全ベクター配列を図２
に示す)。発現、精製および再フォールディングは Krebber, 1996; Krebber ら,
1997 に記載されるように行った。

【００９２】 最初に、標準的プロトコルにしたがって、１ラウンドの、抗体ライブラリー H
uCAL-scFv (WO 97/08320; Knappik et al., 2000)の慣用的パニングを行った。
簡単には、Maxisorp ミクロタイタープレート(Nunc; #442404)のウェルを、ＰＢ
Ｓに溶解したそれぞれの抗原でコーティングし、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロ
ックした。１〜５×１０^１２ HuCAL-scFv ファージを２０℃で１時間加えた。Ｐ
ＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）およびＰＢＳで数回洗浄する工程後
、結合したファージを１００ｍＭ トリエチルアミンまたは１００ｍＭグリシン
ｐＨ２．２で溶出させ、すぐに１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．０で中和し、ＴＧ
１細胞の感染に用いた。さらに、残りのファージを、ウェルに加えられたＴＧ１
細胞の直接感染によって溶出させた。Ｎ１−Ｎｐ５０に対するパニングは完全 H
uCAL-scFv ライブラリー（組み合わせられたκおよびλプール）を用い、Ｎ１−
ＭａｃＩに対するパニングでは、κおよびλ軽鎖プールは分離されたままであっ
た。ＩＣＡＭ１に対して、HuCAL-scFv のλ軽鎖部分の１ラウンドの慣用的パニ
ングを行い、次いで選択された重鎖をλ軽鎖の完全ライブラリーと再び組み合わ
せた。得られた軽鎖の最適化ライブラリーは１．４×１０^７の多様性（diversit
y）を有していた。

【００９３】 それぞれのプールのｓｃＦｖを、唯一のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩ部位を介してベ
クター pMorph20-C-gIII-scFv-LHC（１ベクター形式）にサブクローニングした
。次いで、３ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニングを行った。ファージを標
準的手法によって調製し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％ツイー
ン２０）と１：１混合してプレブロックし、室温で２時間インキュベートした。
Nunc Maxisorp プレート (#442404) のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中５μｇ
／ウェルの濃度の特異的抗原でコーティングし、次いで室温で２時間、ＰＢＳＭ
（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬでブロックした。ｃｙｓ−ディスプレーパ
ニングの各ラウンドでは、ウェル当たり１×１０^１０〜４．５×１０^１１の範囲
の、プレブロックされたファージを適用し、ミクロタイタープレートシェーカー
上、室温で１時間インキュベートした。ファージ溶液を除去し、ウェルを高スト
リンジェンシーのＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０）およびＰＢＳで
洗浄した。第一ラウンドは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでそれぞれ、３×すばやく、
２×５分間洗浄し、第二ラウンドは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでそれぞれ、１×す
ばやく、４×５分間洗浄し、第三ラウンドは、ＰＢＳＴおよびＰＢＳでそれぞれ
、１０×すばやく、５×５分間洗浄した。標準的プロトコルにしたがって、結合
したファージを１００ｍＭトリエチルアミンで溶出させ、ＴＧ１細胞の感染に用
いた。さらに、残りのファージを、ウェルに加えられたＴＧ１細胞の直接感染に
よって溶出（eluted）させた。

【００９４】 パニングの各ラウンド後に、抗原特異的ファージの数をＥＬＩＳＡによって測
定した。Ｎ１−ＭａｃＩ、Ｎ１−Ｎｐ５０およびＩＣＡＭ−Ｓｔｒｅｐ（成熟Ｉ
ＣＡＭ１のアミノ酸１〜４５５＋ＳｔｒｅｐタグＩＩを含有する SAWSHPQFEK を
含む）をそれぞれ抗原として用いた。大量（高速）発現を確実にするために、選
択されたｓｃＦｖを発現ベクター pMorphX7-FS（表１）にサブクローニングした
。サブクローニングは二工程で行った。第一に、pMorph20-C-gIII-scFv-LHC か
らＡｆｌＩＩとＥｃｏＲＩを介してｓｃＦｖ断片を単離し、次いでこの断片をＳ
ｐｈＩで再消化し、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩで消化された pMorphX7-FS ベクター
にクローニングした。この手法により、ベクター pMorph20-C-gIII-scFv-LHC 由
来のｓｃＦｖのみがサブクローニングされ、慣用のディスプレーまたは発現ベク
ター由来のｓｃＦｖの混入が確実に排除される。標準的手法にしたがい、ｓｃＦ
ｖの発現およびその、それぞれの抗原に対するＥＬＩＳＡにおける試験を行った
。ＥＬＩＳＡにおいてバックグラウンドに対し、少なくとも３倍高いシグナルを
示したクローンを陽性であると考えた。この結果を表５にまとめる。選択された
ｓｃＦｖがその抗原に強く、特異的に結合することを証明するために、２ラウン
ドのｃｙｓ−ディスプレーパニング後のいくつかの陽性クローンを選択し、６個
の種々の抗原に対する特異性ＥＬＩＳＡにおいて４回再試験した（図１４および
１５）。抗原特異的結合物の富化が明らかに示された。Ｎ１−ＭａｃＩ、Ｎ１−
Ｎｐ５０およびＩＣＡＭ１に対する、プレ選択されたプールの２ラウンドのｃｙ
ｓ−ディスプレーパニング後には、試験されたクローンの８０％〜９７％がＥＬ
ＩＳＡにおいて陽性であった。いくつかの選択されたｓｃＦｖの親和性をＢｉａ
ｃｏｒｅにおいて測定し、１ｎＭ〜２．２μＭの範囲のＫｄ値が測定された。こ
れらの結果は、並行して行われたそれぞれのプールの慣用的パニングにおいて得
られた富化率および親和性と同様であった。いくつかのｓｃＦｖはｃｙｓ−ディ
スプレーおよび慣用のパニングを介して独立して選択された。

【００９５】 還元剤を用いる、ｓｃＦｖを表示する操作されたファージの溶出 バイオパニングにおいてファージディスプレーライブラリーをスクリーニング
する場合、所望の標的と結合したファージをどのように最良に回収するかという
課題が残っている。通常、これは、ｐＨ勾配または塩濃度勾配を用いるか、ある
いは可溶性標的を用いて特異的に溶出させることによる、適当なバッファーでの
溶出によって達成される。しかし、標的に対して高い親和性で結合する最も興味
深い結合物はこのアプローチによって失われるかもしれない。操作されたｃｙｓ
−ディスプレーファージを用いる場合、標的と特異的バクテリオファージの複合
体を還元剤で処理、例えばＤＴＴとインキュベートし、ｓｃＦｖとファージコー
トタンパク質のジスルフィド結合を開裂させ、特異的バクテリオファージ粒子を
回収できる。

【００９６】 上記プロトコルにしたがって、Ｎ１−ＭａｃＩに対して、プレ選択されたプー
ルのパニングを行った。１００ｍＭ トリエチルアミンを用いる標準的プロトコ
ルにしたがい、そして残りのファージによってＴＧ１細胞を直接感染させるか、
あるいはウェルをｐＨ８．０のトリスバッファー中、２０ｍＭ ＤＴＴと１０分
間インキュベートすることによってファージを溶出させた。パニングの各ラウン
ド後に、上記の二工程手法にしたがって、選択されたｓｃＦｖのプールを発現ベ
クター pMorphX7-FS にサブクローニングし、Ｎ１−ＭａｃＩ特異的ｓｃＦｖの
数をＥＬＩＳＡにおいて測定した。選択されたｓｃＦｖがその抗原に強く、特異
的に結合することを証明するために、いくつかの陽性クローンを選択し、特異性
ＥＬＩＳＡにおいて３回再試験した。両溶出手法に関して、抗原特異的結合物の
富化が明らかに示された。ＭａｃＩκ−プールおよびＭａｃＩλ−プールの２ラ
ウンドのパニング後、慣用の溶出と比べて、それぞれ２倍および５倍多くのＥＬ
ＩＳＡ陽性クローンが還元剤での溶出時に得られた。

【００９７】 実施例２．２：Ｆａｂの表示（ディスプレー） 実施例２．１は、機能的単一鎖断片が、ジスルフィド結合を介して、操作され
たファージに表示され得ることを示す。以下では、Ｆａｂに関しても同じこと真
実であることを示す実験を記載する。システインをＦａｂ抗体断片の種々の位置
において操作した。これらのＦａｂは、２ベクター系に基づく、操作された完全
長ｐＩＩＩとともに同一細菌細胞内で発現された。

【００９８】 Ｆａｂおよび操作されたｐＩＩＩを発現するベクターの構築 Ｆａｂ断片の重鎖および軽鎖をｌａｃプロモーター／オペレーター領域の制御
下、ジシストロンファージミド（dicistronic phagemid）から発現した。第一の
発現カセットはシグナル配列ｏｍｐＡおよび軽鎖の可変および不変ドメインを含
み、第二の発現カセットはシグナル配列ｐｈｏＡおよび重鎖の可変および不変ド
メインを含む。重鎖および軽鎖はジスルフィド結合によって連結されていない。
操作されたシステインを含むモジュールは軽鎖または重鎖のＣ末端に位置してい
た。モジュールのアミノ酸組成が異なるいくつかの構築体を比較し、これを表６
にまとめる。例として、修飾されたＦａｂ ＭａｃＩ−５をコードする pMorphX1
0-Fab-VL-LHC-VH-FS の完全ベクター配列およびそのベクターマップを図１６ａ
＋ｂに示す。

【００９９】 ２個の異なるプラスミドを完全長ｐＩＩＩの発現に用いた。プラスミド pBR-C
-gIII はすでに上に記載した。その発現カセットは、ラクトースプロモーター／
オペレーター領域の制御下にシグナル配列ｏｍｐＡ、アミノ酸 DYCDIEF および
ｐＩＩＩ ＯＲＦを含む（表３、図６）。別法では、プラスミド pBAD-SS-C-gIII
を用いた。ここにその発現カセットは、アラビノースプロモーター／オペレー
ター領域の制御下にｐＩＩＩのシグナル配列、アミノ酸 TMACDIEF およびｐＩＩ
Ｉ ＯＲＦを含んでいる（表３）。pBAD-SS-C-gIII 構築時に、操作されたシステ
イン＋ｐＩＩＩをコードする断片を pUC-C-gIII からＰＣＲによって増幅し、制
限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを導入し、市販のベクター pBAD/gIII A (
Invitrogen) にクローニングした。プラスミド pBR-C-gIII または pBAD-SS-C-g
III を、修飾されたＦａｂを発現するそれぞれの pMorphX10-Fab ファージミド
とともに、両抗生物質マーカーに関して選択された大腸菌ＴＧ１内へトランスフ
ォームした。

【０１００】 Ｆａｂの説明−抗原相互作用 ヒト組み合わせ抗体ライブラリー(HuCAL; WO 97/08320; Knappik et al., 200
0)由来の３個の異なるＦａｂすべてを用いて、操作されたファージへのＦａｂの
表示を評価した。ＨｕＣＡＬ ＶＨおよびＶＬ共通（コンセンサス）遺伝子（WO
97/08320に記載されている）およびＦａｂのＣＤＲ３配列を表２に示す。Ｆａｂ
ＭａｃＩ−５は、上記のｓｃＦｖ ＭａｃＩ−５から誘導され、Ｆａｂ形式に変
換された（pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS の完全ベクターマップは図１６
ａに示す）。Ｆａｂ ＭａｃＩ−Ａ８およびＩＣＡＭ１−Ｃ８は HuCAL-Fab ライ
ブラリーの１つから直接単離した。Ｎ末端メチオニン、ヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷ
ＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３および、
ＳｔｒｅｐタグＩＩを含むアミノ酸 SAWSHPQFEK (Schmidt et al., 1996) を含
む抗原ＭａｃＩ−Ｓｔｒｅｐに対してクローンＭａｃＩ−Ａ８を選択した。発現
および精製は Schmidt & Skerra (1994) にしたがって行った。ＥＬＩＳＡ用の
対応する抗原としてＮ１−ＭａｃＩを用いた。Ｎ１−ＭａｃＩは上に記載され、
Ｎ−末端メチオニン、ファージＭ１３の成熟遺伝子ＩＩＩタンパク質のアミノ酸
１〜８２＋短いリンカー（Ｎ１）、ヒトＣＲ−３α鎖（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエ
ントリーＰ１１２１５）のアミノ酸１４９〜３５３および、６×ヒスチジンタグ
を含むアミノ酸 IEGRHHHHHH を含む。成熟ＩＣＡＭ１の細胞外部分（アミノ酸１
〜４５４）＋Ｍ２−Ｆｌａｇおよび６×ヒスチジンタグを含有するアミノ酸 CGR DYKDDDK HHHHHH を含む上記抗原ＩＣＡＭ１に対してクローンＩＣＡＭ１−Ｃ８を
選択した。同一の抗原をＥＬＩＳＡアッセイおよびドープ化ライブラリーの実験
に用いた。

【０１０１】 ジスルフィド結合を介するＦａｂのファージコートタンパク質への結合 Ｆａｂがジスルフィド架橋を介してｐＩＩＩと結合し、ファージ粒子に包含さ
れることを証明するために、それぞれのファージを、非還元および還元条件下、
ＳＤＳ ＰＡＧＥで電気泳動した。それぞれｐＩＩＩ、重鎖、λ軽鎖およびκ軽
鎖を検出する抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。表６に記載される
すべての構築体を分析し、例として pMorphX10-ICAM1C8-VL-LHC-VH-FS ＋ pBAD-
SS-C-gIII および pMorphX10-MacIA8-VL-LHC-VH-MS ＋ pBAD-SS-C-gIII に関す
る結果を図１７および１８に示す。

【０１０２】 標準的プロトコル(Kay et al., 1996)にしたがい、ヘルパーファージＶＣＳＭ
１３を用いてファージを生産した。ヘルパーファージタンパク質に加えて、操作
されたファージコートタンパク質および可溶性修飾Ｆａｂを２ベクター系から同
時に発現した。ファージを２０ｍＭ ＤＴＴを含むか、あるいは含まないＰＢＳ
（それぞれ還元および非還元条件）中、室温で１時間プレインキュベートし、次
いで還元剤、例えばＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールを欠いているＳＤＳ
添加バッファーを加えた。レーン当たり１×１０^１０ファージを１２％ ＳＤＳ
ＰＡＧＥ（BioRad）で電気泳動し、ニトロセルロース膜にブロットした(Schleic
her & Schuell)。抗−ｐＩＩＩウエスタンブロットでは、この膜をＭＴＢＳＴ（
５％粉乳および０．０５％ツイーン２０を含む５０ｍＭトリスバッファーｐＨ７
．４）中でブロックし、一次抗体としてマウス抗−ｐＩＩＩ（１：２５０希釈；
Mobitec）、二次抗体として抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（１：
５０００希釈；SIGMA）および基質としてＢＭブルーＰＯＤ沈殿(Roche #1442066
)を用いて展開した。重鎖、κ軽鎖およびλ軽鎖の検出では、一次抗体、抗−Ｆ
ｄ（１：５０００希釈；The binding site PC075）、抗−ヒトκ（１：５０００
希釈；Sigma K-4377）および抗−ヒトλ（１：５００希釈、Sigma L-6522）をそ
れぞれ用いた。

【０１０３】 抗−ｐＩＩＩウエスタンブロットでは、還元および非還元の両条件下のすべて
の発現系に対して遊離のタンパク質ＩＩＩ（ＳＨ−ｐＩＩＩおよび／またはｐＩ
ＩＩ）を検出できる（図１７および１８）。操作されたＦａｂおよび操作された
タンパク質ＩＩＩの両方を同時発現させる場合、軽鎖とタンパク質ＩＩＩのヘテ
ロ二量体(VL-CL-SS-pIII)のレベルでのシグナル移動は非還元条件下で出現した
。さらに、ジスルフィド結合されたタンパク質ＩＩＩ二量体（ｐＩＩＩ−ＳＳ−
ｐＩＩＩ）に関して予測されるレベルでのバンドの移動が見られる（レーン１１
および１２、図１７、１８）。サンプルをＤＴＴで処理した場合（レーン５およ
び６、図１７および１８）、または修飾されたＦａｂを未操作ＰＩＩＩと同時発
現した場合（レーン３、４、９および１０、図１７および１８）、ヘテロおよび
ホモ二量体は両方とも消失した。軽鎖が完全長ｐＩＩＩと連結されている場合の
ヘテロ二量体は、非還元ゲル中、抗−軽鎖抗体を用いて検出できたが、還元条件
下では不存在であった。さらに軽鎖のホモ二量体(VL-CL-SS-VL-CL)に関して予測
されるレベルでのバンドの移動は検出可能であった（データは示していない）。
表６に記載されるすべての構築体に関して同様の結果が得られ、操作されたｐＩ
ＩＩを供給するベクター pBR-C-gIII と pBAD-SS-C-gIII 間の有意な相違点は検
出できなかった（データは示していない）。

【０１０４】 操作されたファージに表示されたＦａｂの機能性 表示されたＦａｂが特異的抗原の認識に関して機能的であることを示すために
、ファージＥＬＩＳＡを行った。分析は HuCAL Fab MacI-5, MacI-A8 および I
CAM1-C8 に関して行った。Ｆａｂでのシステインの位置が異なっているすべての
形式を比較した（表６）。Ｆａｂがジスルフィド結合を介して操作されたファー
ジコートタンパク質に結合していることを示すために、非還元および還元の両条
件下でファージＥＬＩＳＡを行った。

【０１０５】 修飾されたＦａｂを発現するそれぞれのファージミドを pBR-C-gIII とともに
同時トランスフォーミングし、標準的条件(Kay et al., 1996)下でファージ生産
を行った。慣用的Ｆａｂディスプレーファージ (pMorph18-Fab) を陽性コントロ
ールとして用い、未操作Ｆａｂ発現用のファージミド発現ベクター(pMorphX9-Fa
b-FS)を陰性コントロールとして用いた。特異的抗原またはコントロール抗原(BS
A, Sigma #A7906)を、４℃で１２時間、ＰＢＳ中５μｇ／ウェル量で Nunc Maxi
sorp ミクロタイタープレート (# 442404) にコーティングし、５％脱脂粉乳、
０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで１時間ブロックした。可能であれば、フ
ァージを、室温で１時間、５％脱脂粉乳、０．０５％ツイーン２０および１０ｍ
Ｍ ＤＴＴを含むＰＢＳ中でプレインキュベートし、その後、抗原でコーティン
グされたＥＬＩＳＡウェルに、ウェル当たり１×１０^８〜１×１０^１０ファージ
の濃度範囲で適用した。室温で１時間結合した後、非特異的に結合したファージ
を０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳおよびＰＢＳで洗浄して除いた。抗−Ｍ
１３−ＨＲＰコンジュゲート(Amersham Pharmacia Biotech #27-9421-01)および
ＢＭブルー可溶性物質(Roche #1484281)を用いるＥＬＩＳＡによって結合したフ
ァージを検出した。３７０ｎｍでの吸光度を測定した。特異的抗原を用いて得ら
れたＥＬＩＳＡシグナルをコントロールを用いて得られたシグナルと比較した。
３個までの独立したファージ調製物を分析し、平均値を図１９〜２２に示す。

【０１０６】 すべての種々の２ベクター形式に関して、抗原に対するＦａｂ表示ファージの
特異的結合を示すことができた（図１９〜２１、レーン１〜４）。Ｆａｂ Ｍａ
ｃＩ−５に関しては、４個の形式間に有意な相違は検出できず（図１９）、構築
体 pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS は Fab MacI-A8 および ICAM1-C8 に対して最
良の結果を再現的に示した（図２０および２１）。プレインキュベーション工程
時、抗原結合前に１０ｍＭ ＤＴＴをファージに加えると、すべてのｃｙｓ−デ
ィスプレーファージに関してＥＬＩＳＡシグナルはほとんどバックグラウンドレ
ベルにまで減少したが、ＤＴＴは慣用的ディスプレーファージ(pMorph18-Fab)に
対しては重大な影響を示さなかった（Fab MacI-5 に関して図２２に示す）。こ
れはジスルフィド結合がファージへのＦａｂの機能的表示、つまりＦａｂを表示
しているファージが抗原と特異的に結合するために本質的であることを示す。

【０１０７】 ドープ化ライブラリー実験におけるＦａｂを表示する操作されたファージの富化 Ｆａｂを表示する操作されたファージが特異的抗原に対して富化できることを
示すために、「ドープ化ライブラリー」実験を行った：特異的ファージを大過剰
の非特異的ファージと混合し、特異的抗原に対する３ラウンドのパニングを行っ
た。特異的ファージに関する富化は各ラウンド後に測定した。分析は２ベクター
系 pMorphX10-Fab-VL-LHC-VH-FS ＋ pBAD-SS-C-gIII において HuCAL Fab ICAM1
-C8 に関して行った。

【０１０８】 ICAM1-C8 および MacI-A8 を表示する、操作されたファージを１：１０^５の割
合で混合した。ＩＣＡＭ１抗原に対して３ラウンドのパニングを行った。ファー
ジを標準的手法によって製造し、ＰＢＳＴＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳、０．１％
ツイーン２０）と１：１混合してプレブロックし、室温で２時間インキュベート
した。Nunc Maxisorp プレート (#442404) のウェルを、４℃で一晩、ＰＢＳ中
５μｇ／ウェルの濃度の特異的抗原でコーティングし、次いで室温で２時間、Ｐ
ＢＳＭ（ＰＢＳ、５％脱脂粉乳）４００μＬでブロックした。第一ラウンドでは
、ウェル当たり、プレブロックされた１０^１１ファージを適用し、ミクロタイタ
ープレートシェーカー上、室温で１時間インキュベートした。ファージ溶液を除
去し、ウェルをＰＢＳＴで３回（ＰＢＳ、０．０５％ツイーン２０；１×すばや
く、２× ５分間）、ＰＢＳで３回（１×すばやく、２× ５分間）洗浄した。標
準的プロトコルにしたがい、結合したファージを１００ｍＭトリエチルアミンで
溶出させた。さらに、残りのファージを、ウェルに加えられた細胞の直接感染に
よって溶出させた。pBAD-SS-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の直接感染は十分に効率
的ではなかったので、溶出されたファージをＴＧ１細胞の感染に用い、増幅し、
次いで pBAD-SS-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の感染に用いた。したがって、２ベク
ター系を復帰（restore）させ、次のラウンドのパニングを行った。ファージＥ
ＬＩＳＡおよびＷＢに関して、操作されたｐＩＩＩの発現用の２つのプラスミド
(pBR-C-gIII および pBAD-SS-C-gIII)間の相違は観察されず、pBR-C-gIII を宿
すＴＧ１細胞の感染は pBAD-SS-C-gIII を宿すＴＧ１細胞の感染ほど効率的では
なかった。パニングの各ラウンド後、少なくとも９２個の独立した感染細胞をＰ
ＣＲによって分析し、非特異的ファージに対する特異的ファージの割合を測定し
た。標準的プロトコルにしたがい、単一のコロニーを鋳型のソースとして用い、
λ軽鎖（フレームワーク４のプライム化）、κ軽鎖（フレームワーク３のプライ
ム化）およびＦａｂ断片の上流のベクター配列（市販のＭ１３−ｒｅｖプライマ
ー、ＮＥＢ）に対する特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣ
Ｒを行った。λＦａｂ（ＩＣＡＭ１−Ｃ８）に対しては約４２０ｂｐ長の断片が
予測され、κＦａｂ（ＭａｃＩ−Ａ８）に対しては２９０ｂｐが予測された。２
ラウンドのパニング後には、６１％の陽性クローン（分析された９３クローンの
うち５７）が得られ、第三ラウンド後には、これは１００％（分析された９２ク
ローン中９２）に富化できた。

【０１０９】 参考文献 Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G.,
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【０１１０】 表１：ベクター pMorphX7-hag2-FS, pMorphX7-hag2-LH, pMorphX7-hag2-LCH お
よび pMorphX7-hag2-LHC のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位間のＯＲＦモ
ジュールのアミノ酸配列

【表１】

【０１１１】 表２：ＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖおよびＨｕＣＡＬ Ｆａｂのアミノ酸配列*

【表２】 *詳細は実施例に記載する。

【０１１２】 表３：ベクター pBR-C-gIII および誘導体の操作されたファージコートタンパク
質のアミノ酸配列

【表３】 操作されたＣｙｓ（訳者注：左から三列目の欄中のＣｙｓ）は太字（訳者注：本
翻訳文中では下線）で示す。 野生型ファージコートタンパク質の配列は下線で示す。

【０１１３】 表４：ベクター pMorph18-C-gIII-scFv-LHC およびその誘導体の操作されたファ
ージコートタンパク質のアミノ酸配列

【表４】 操作されたＣｙｓ（訳者注：左から三列目の欄中のＣｙｓ）は太字（訳者注：本
翻訳文中では下線）で示す。 野生型ファージコートタンパク質の配列は下線で示す。

【０１１４】 表５：プレ選択されたプールのＣｙｓ−ディスプレーパニング

【表５】 nd: 測定せず。^ａ N1-MacI, N1-Np50：１ラウンドの慣用的パニング後のクローン数； ICAM1：軽鎖の最適化されたプールの多様性。^ｂ それぞれのプレ選択されたプールのＥＬＩＳＡ陽性の数。

【０１１５】 表６：操作されたＦａｂ断片のモジュールのアミノ酸配列

【表６】 操作されたシステインは太字（訳者注：本翻訳文中では下線）で示す。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】 構築体 pMorphX7-hag2-LH のベクターマップ。

【図１ｂ】 pMorphX7-hag2-LH のベクター配列。

【図２】 pTFT74-N1-hag-HIPM のベクター配列。

【図３】 pQE60-MacI のベクター配列。

【図４】 未操作ファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合。 標準的手法によって構築体 pMorphX7-MacI5-LCH, pMorphX7-MacI5-LHC および
pMorphX7-MacI5-LH 由来のファージを生産し、５ｍＭ ＤＴＴを含む（＋ＤＴＴ
）か、あるいはＤＴＴを含まないＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μ
ｇ／ウェルの特異的抗原(MacI, 暗カラム)および非特異的コントロール抗原（Ｂ
ＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティ
ングし、それぞれ１×１０^１０ファージ／ウェルとインキュベートした。結合し
たファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質に
よって検出した。慣用のファージディスプレーベクター pMorph13-MacI5 由来の
ファージをコントロールとして用いた（３×１０^７ファージ／ウェル）。実験の
詳細は実施例１に記載する。

【図５】 未操作ファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合。 標準的手法により、構築体 pMorphX7-hag2-LCH, pMorphX7-hag2-LHC および p
MorphX7-hag2-LH 由来のファージを生産し、５ｍＭ ＤＴＴを含む（＋ＤＴＴ）
か、あるいはＤＴＴを含まないＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μｇ
／ウェルの特異的抗原(Ｎ１−ｈａｇ、 暗カラム)および非特異的コントロール
抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレートに
コーティングし、それぞれ１×１０^１０ファージ／ウェルとインキュベートした
。結合したファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶
性基質によって検出した。慣用のファージディスプレーベクター pMorph13-hag2
由来のファージをコントロールとして用いた（３×１０^７ファージ／ウェル）
。実験の詳細は実施例１に記載する。

【図６ａ】 構築体 pBR-C-gIII のベクターマップ。

【図６ｂ】 Ｎ末端にシステイン残基を有する完全長ｐＩＩＩの発現カセッ
トの配列（Ｃ−ｇＩＩＩ）。

【図６ｃ】 Ｎ末端にシステイン残基を有する断頭されたｐＩＩＩの発現カ
セットの配列（Ｃ−ｇＩＩＩＣＴ）。

【図７ａ】 構築体 pMorph18-C-gIII- hag2-LHC のベクターマップ。

【図７ｂ】 pMorph18-C-gIII-hag2-LHC のベクター配列。

【図８】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖ ＭａｃＩ−５の検出
−２ベクター系。 標準的手法により、構築体 pMorphX7-MacI-5-LH / pBR-C-gIII (レーン 1 お
よび 5), pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIII (レーン 2 および 6), pMorphX7-
MacI-5-LHC (レーン 3 および 7) および pMorphX7-MacI-5-LH (レーン 4 およ
び 8) 由来のファージを生産した。１〜５×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む
（レーン１〜４）か、あるいはＤＴＴを含まない（レーン５〜８）ＰＢＳ中でプ
レインキュベートした。還元剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファ
ージを４〜１５％ ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロット
で分析した。ファージと結合したｓｃＦｖの検出は、抗−ＦＬＡＧ Ｍ１抗体、
抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートおよびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基
質（６Ａ）および抗−ｐＩＩＩ抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲート
およびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（６Ｂ）によって行った。低域マーカー(
low range marker, Amersham #RPN756)はＭと記す。実験の詳細は実施例２．１
に示す。

【図９】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの検出−１ベクター系
。 標準的手法により、構築体 pMorph18-C-gIII-hag2-LHC (レーン 1 〜 8; 7A),
pMorph18-C-gIII-AB1.1-LHC (レーン 1, 2, 5 および 6; 7B) および pMorph18
-C-gIII-MacI-5-LHC (レーン 3, 4, 7 および 8; 7B) 由来のファージを生産し
た。１〜５×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１、２、５および６；
７Ａおよびレーン１〜４；７Ｂ）か、あるいはＤＴＴを含まない（レーン３、４
、７および８；７Ａおよびレーン５〜８；７Ｂ）ＰＢＳ中でプレインキュベート
した。還元剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを４〜１５％
ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。ファ
ージと結合したｓｃＦｖの検出は、抗−ＦＬＡＧ Ｍ１抗体、抗−マウス−Ｉｇ
Ｇ−ＡＰコンジュゲートおよびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（レーン１〜４
；７Ａ）および抗−ｐＩＩＩ抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートお
よびＦａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（レーン５〜８；７Ａおよびレーン１〜８
；７Ｂ）によって行った。低域マーカー(Amersham #RPN756)はＭと記す。実験の
詳細は実施例２．１に示す。

【図１０】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−種々
の２ベクター系の比較。 標準的手法により、構築体 pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIII (1), pMorphX
7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIIICT (2), pMorphX7-MacI-5-LHC / pUC-C-gIII (3), p
MorphX7-MacI-5-LHC / pUC-C-gIIICT (4), pMorphX7-MacI-5-LHC (5), pMorphX7
-MacI-5-LH (6) および慣用のファージディスプレーベクター pMorph13-MacI-5
(7) 由来のファージを生産した。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ）および非特異
的コントロール抗原（ＢＳＡ、データは示していない）を Maxisorp Nunc-Immun
o ミクロタイタープレートにコーティングし、ウェル当たり６．４×１０^６〜１
×１０^１１の範囲のファージとインキュベートした。結合したファージを、抗−
Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の
詳細は実施例２．１に記載する。

【図１１】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−１ベ
クター系と２ベクター系の比較。 標準的手法により、構築体 pMorphX7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIII (1), pMorphX
7-MacI-5-LHC / pBR-C-gIIICT (2), pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (3), pMorph1
8-C-gIIICT-MacI-5-LHC (4) および pMorphX7-MacI-5-LHC (5) 由来のファージ
を生産した。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ、暗カラム）および非特異的コント
ロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレ
ートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０と１×１０^９ファージとインキュ
ベートした。結合したファージを抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭ
ブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２．１に示す。

【図１２】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−１ベ
クター系における操作された遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＩＸタンパク質の比較。 標準的手法により、構築体 pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (1), pMorph18-C-gI
IICT-MacI-5-LHC (2), pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC (3), pMorphX7-MacI-5-LHC
(4) および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph13-MacI-5 (5) 由来の
ファージを生産した。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ、暗カラム）および非特異
的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイ
タープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^１０、１×１０^９および１×
１０^８ファージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰ
コンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２
．１に示す。

【図１３】 操作されたファージに表示されたｓｃＦｖの特異的結合−ＤＴ
Ｔの影響。 標準的手法により、構築体 pMorph18-C-gIII-MacI-5-LHC (1), pMorph18-C-gI
IICT-MacI-5-LHC (2), pMorph18-C-gIX-MacI-5-LHC (3), pMorphX7-MacI-5-LHC
(4) および慣用的ファージディスプレーベクター pMorph13-MacI-5 (5) 由来の
ファージを生産し、５ｍＭ ＤＴＴを含む（＋）か、あるいはＤＴＴを含まない
（−）ＰＢＳＴＭ中でプレインキュベートした。５μｇの特異的抗原（ＭａｃＩ
、暗カラム）および非特異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisor
p Nunc-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^{１ ０} ファージとインキュベートした。結合したファージは、抗−Ｍ１３−ＨＲＰコ
ンジュゲートおよびＢＭブルー基質によって検出した。実験の詳細は実施例２．
１に示す。

【図１４】 選択されたｓｃＦｖの特異性−プレ選択されたプールのＮ１−
ＭａｃＩに対するパニング。 κ鎖（１〜５）およびλ鎖プール（６〜８）から、抗原Ｎ１−ＭａｃＩに対す
る２ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパニング後に選択されたｓｃＦｖを標準的
手法にしたがって発現させた。０．１μｇ／ウェルの粉乳（Ａ）、ＢＳＡ（Ｂ）
，ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（Ｃ、ＢＳＡとカップリングさせたＦＩＴＣ）、Ｎ１−ｈａ
ｇ（Ｄ）、Ｎ１−Ｎｐ５０（Ｅ）およびＮ１−ＭａｃＩ（Ｎ１−ＭａｃＩ）を３
８４ウェルプレート(Maxisorp; Nunc)にコーティングし、ぞれぞれｓｃＦｖ溶液
１０μＬとインキュベートした。結合したｓｃＦｖを抗−Ｆｌａｇ Ｍ１、抗−
Ｆｌａｇ Ｍ２および抗−マウスＩｇＧ−ＡＰコンジュゲートの混合物ならびに
AttoPhos 蛍光基質(Roche #1484281)によって検出した。各ｓｃＦｖを４回試験
し、平均値を示す。

【図１５】 選択されたｓｃＦｖの特異性−プレ選択されたプールのＮ１−
Ｎｐ５０に対するパニング。 抗原Ｎ１−Ｎｐ５０（１〜８）に対する２ラウンドのｃｙｓ−ディスプレーパ
ニング後に選択されたｓｃＦｖを標準的手法にしたがって発現させた。０．１μ
ｇ／ウェルの粉乳（Ａ）、ＢＳＡ（Ｂ），ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（Ｃ、ＢＳＡとカッ
プリングさせたＦＩＴＣ）、Ｎ１−ｈａｇ（Ｄ）、Ｎ１−ＭａｃＩ（Ｅ）および
Ｎ１−Ｎｐ５０（Ｎ１−Ｎｐ５０）を３８４ウェルプレート(Maxisorp; Nunc)に
コーティングし、ぞれぞれｓｃＦｖ溶液１０μＬとインキュベートした。結合し
たｓｃＦｖを抗−Ｆｌａｇ Ｍ１、抗−Ｆｌａｇ Ｍ２および抗−マウスＩｇＧ−
ＡＰコンジュゲートの混合物ならびに AttoPhos 蛍光基質(Roche #1484281)によ
って検出した。各ｓｃＦｖを４回試験し、平均値を示す。

【図１６ａ】 構築体 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS のベクターマッ
プ。

【図１６ｂ】 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS の完全ベクター配列。

【図１７】 操作されたファージに表示されたＦａｂ ＩＣＡＭ１−Ｃ８の
検出。 標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS / pBAD-SS-
C-gIII (レーン 5,6,11,12), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS (レーン 3,
4,9,10) および pMorph18-Fab-ICAM1C8 (レーン 1,2,7,8) 由来のファージを生
産した。１×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１〜６）か、あるいは
ＤＴＴを含まない（レーン７〜１２）ＰＢＳ中でプレインキュベートした。還元
剤を欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを１２％ ＳＤＳ ＰＡＡ
Ｒｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。検出は抗−ｐＩＩＩ
抗体、抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルーＰＯＤ沈殿
基質（BM Blue POD precipitating substrate）によって行った。低域分子量マ
ーカー(Amersham Life Science #RPN756)はＭと記す。実験の詳細は実施例２．
２に示す。

【図１８】 操作されたファージに表示されたＦａｂ ＭａｃＩ−Ａ８の検
出。 標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS / pBAD-SS-C
-gIII (レーン 5,6,11,12), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS (レーン 3,4,
9,10) および pMorph18-Fab-MacIA8 (レーン 1,2,7,8) 由来のファージを生産し
た。１×１０^１０ファージを、ＤＴＴを含む（レーン１〜６）か、あるいはＤＴ
Ｔを含まない（レーン７〜１２）ＰＢＳ中でプレインキュベートした。還元剤を
欠いているＳＤＳ添加バッファーを加え、ファージを１２％ ＳＤＳ ＰＡＡ Ｒ
ｅａｄｙゲルにアプライし、免疫ブロットで分析した。検出は抗−ｐＩＩＩ抗体
、抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー沈殿基質によっ
て行った。低域分子量マーカー(Amersham Life Science #RPN756)はＭと記す。
実験の詳細は実施例２．２に示す。

【図１９】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−Ｆａｂ
ＭａｃＩ−５。 標準的手法によって、構築体 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS / pBR-C-gI
II (1), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-C-VH-FS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-M
acI5-VL-VH-CFS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC / pBR-C-
gIII (4), pMorphX9-Fab-MacI5-FS (5), および慣用的ファージディスプレーベ
クター pMorph18-Fab-MacI5 (6) 由来のファージを生産した。５μｇ／ウェルの
特異的抗原（Ｎ１−ＭａｃＩ）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイタープレー
トにコーティングし、ウェル当たり１×１０^８（明カラム）および１×１０^９（
暗カラム）ファージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−Ｈ
ＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。各カラムは
２回試験された３個の独立したファージ調製物の平均値を表す。実験の詳細は実
施例２．２に示す。

【図２０】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−Ｆａｂ
ＭａｃＩ−Ａ８。 標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-LHC-VH-FS / pBR-C-gII
I (1), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-C-VH-FS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-M
acIA8-VL-VH-CFS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacIA8-VL-VH-LHC / pBR-
C-gIII (4), pMorphX9-Fab-MacIA8-FS (5), および慣用的ファージディスプレ
ーベクター pMorph18-Fab-MacIA8 (6) 由来のファージを生産した。５μｇ／ウ
ェルの特異的抗原（Ｎ１−ＭａｃＩ）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタイター
プレートにコーティングし、ウェル当たり１×１０^９（明カラム）および１×１
０^１０（暗カラム）ファージとインキュベートした。結合したファージは、抗−
Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。
各カラムは２回試験された３個の独立したファージ調製物の平均値を表す。実験
の詳細は実施例２．２に示す。

【図２１】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−Ｆａｂ
ＩＣＡＭ１−Ｃ８。 標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-LHC-VH-MS / pBR-C-gI
II (1), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-C-VH-MS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab
-ICAM1C8-VL-VH-CMS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-ICAM1C8-VL-VH-LHC /
pBR-C-gIII (4), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS (5), pMorphX9-Fab-ICAM1C8-MS / p
BR-C-gIII (6) 由来のファージを生産した。５μｇ／ウェルの特異的抗原（ＩＣ
ＡＭ１、暗カラム）または非特異的抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc
-Immuno ミクロタイタープレートにコーティングし、ウェル当たり１×１０^９フ
ァージとインキュベートした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュ
ゲートおよびＢＭブルー可溶性基質によって検出した。各カラムは２回試験され
た１個のファージ調製物の平均値を表す。実験の詳細は実施例２．２に示す。

【図２２】 操作されたファージに表示されたＦａｂの特異的結合−ＤＴＴ
の影響。 標準的手法により、構築体 pMorphX10-Fab-MacI5-VL-LHC-VH-FS / pBR-C-gIII (1), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-C-VH-FS / pBR-C-gIII (2), pMorphX10-Fab-Mac
I5-VL-VH-CFS / pBR-C-gIII (3), pMorphX10-Fab-MacI5-VL-VH-LHC / pBR-C-gI
II (4), pMorphX9-Fab-MacI5-FS (5), および慣用的ファージディスプレーベク
ター pMorph18-Fab-MacI5 (6) 由来のファージを生産し、１０ｍＭ ＤＴＴを含
む（＋）か、あるいはＤＴＴを含まない（−）ＰＢＳＴＭ中でプレインキュベー
トした。５μｇ／ウェルの特異的抗原（Ｎ１−ＭａｃＩ、暗カラム）および非特
異的コントロール抗原（ＢＳＡ、明カラム）を Maxisorp Nunc-Immuno ミクロタ
イタープレートにコーティングし、それぞれ１×１０^９ファージとインキュベー
トした。結合したファージは抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲートおよびＢＭブル
ー基質によって検出した。各カラムは２回試験された１個のファージ調製物の平
均値を表す。実験の詳細は実施例２．２に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/70 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA61 CA04 DA06 EA03 FA17 GA19 HA01 HA03 4B063 QA01 QQ05 QQ79 QR82 QS15 QX10 4B065 AA26X AA93Y AA98X AA98Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ポリ）ペプチド／タンパク質をバクテリオファージ粒子表
   面に表示させる方法であって： 該（ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイン残基とバクテリオ
   ファージ粒子のタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基と
   の間にジスルフィド結合を形成させることにより、発現後の該（ポリ）ペプチド
   ／タンパク質と該バクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結
   合させるか、あるいはその結合を可能にすることを含む方法。
2. 【請求項２】 該第二のシステイン残基がバクテリオファージの野生型コー
   トタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 タンパク質コートの該メンバーがバクテリオファージの野生
   型コートタンパク質である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 タンパク質コートの該メンバーがバクテリオファージの野生
   型コートタンパク質の断頭された変異体であり、この断頭された変異体が少なく
   とも、バクテリオファージ粒子のタンパク質コート内へのコートタンパク質の包
   含を生じさせる野生型コートタンパク質の部分を含むものである、請求項２に記
   載の方法。
5. 【請求項５】 タンパク質コートの該メンバーが、バクテリオファージの野
   生型コートタンパク質の修飾された変異体であり、この修飾された変異体がバク
   テリオファージ粒子のタンパク質コート内に包含され得るものである、請求項２
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 該第二のシステイン残基がバクテリオファージの野生型コー
   トタンパク質の対応するアミノ酸位置に存在しない、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 該第二のシステインがバクテリオファージの野生型コートタ
   ンパク質に人工的に導入されたものである、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 該第二のシステインがバクテリオファージの野生型コートタ
   ンパク質の断頭された変異体に人工的に導入されたものである、請求項６に記載
   の方法。
9. 【請求項９】 該第二のシステインがバクテリオファージの野生型コートタ
   ンパク質の修飾された変異体に人工的に導入されたものである、請求項６に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 該第二のシステインが該バクテリオファージ粒子のファー
    ジコートの該メンバーのＣ末端またはＮ末端か、あるいはその近くに存在する、
    請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
11. 【請求項１１】 該バクテリオファージが繊維状バクテリオファージである
    、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバー
    が野生型コートタンパク質ｐＩＩＩであるか、あるいはそれから誘導されたもの
    である、請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 バクテリオファージ粒子のタンパク質コートの該メンバー
    が野生型コートタンパク質ｐＩＸであるか、あるいはそれから誘導されたもので
    ある、請求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 （ａ）該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする核酸
    配列を含む核酸配列を含有する宿主細胞を入手し； （ｂ）該核酸配列を発現させるか、あるいはその発現を可能にし； （ｃ）該宿主細胞内でバクテリオファージ粒子を産生させるか、あるいはその産
    生を可能にすることを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】 該（ポリ）ペプチド／タンパク質が免疫グロブリンまたは
    その機能的断片を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 【請求項１６】 該機能的断片がｓｃＦｖまたはＦａｂ断片である、請求項
    １５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 （ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の、
    １つまたはそれ以上の部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタン
    パク質をファージコート内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分
    を含むもの；および、 （ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に
    存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシス
    テイン残基であるもの； からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコ
    ードする核酸配列。
18. 【請求項１８】 （ａ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の１
    個またはそれ以上の部分であって、そのうち１個が少なくとも、該コートタンパ
    ク質をファージコート内へ包含させるか、あるいはその包含を可能にする部分を
    含むもの； （ｂ）バクテリオファージの野生型コートタンパク質の対応するアミノ酸位置に
    存在しない１〜６個の範囲の追加のアミノ酸残基であって、そのうち１個がシス
    テイン残基であるもの；および、 （ｃ）精製および／または検出目的の１個またはそれ以上のペプチド配列； からなるバクテリオファージの野生型コートタンパク質の修飾された変異体をコ
    ードする核酸配列。
19. 【請求項１９】 請求項１７または１８に記載の核酸を含むベクター。
20. 【請求項２０】 第二のシステイン残基を含む（ポリ）ペプチド／タンパク
    質をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列をさらに含む、請求項１９に記載
    のベクター。
21. 【請求項２１】 該（ポリ）ペプチド／タンパク質が免疫グロブリンまたは
    その機能的断片を含む、請求項２０に記載のベクター。
22. 【請求項２２】 請求項１７または１８に記載の核酸配列、請求項１９〜２
    １のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
23. 【請求項２３】 請求項１７または１８に記載の核酸配列、請求項１９〜２
    １のいずれかに記載のベクターによってコードされるか、あるいは請求項２２に
    記載の宿主細胞によって生産されるバクテリオファージの野生型コートタンパク
    質の修飾された変異体。
24. 【請求項２４】 （ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイ
    ン残基とタンパク質コートのメンバーに含まれる第二のシステイン残基との間に
    ジスルフィド結合を形成させることにより、発現後の該（ポリ）ペプチド／タン
    パク質とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーとを結合させる
    か、あるいはその結合を可能にすることを含む方法によって得られる（ポリ）ペ
    プチド／タンパク質をその表面に表示するバクテリオファージ粒子。
25. 【請求項２５】 （ポリ）ペプチド／タンパク質に含まれる第一のシステイ
    ン残基とバクテリオファージ粒子のタンパク質コートのメンバーに含まれる第二
    のシステイン残基のジスルフィド結合の形成によって生じる結合により、その表
    面に結合された（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示するバクテリオファージ粒
    子。
26. 【請求項２６】 該（ポリ）ペプチド／タンパク質をコードする１個または
    それ以上の核酸配列を含むベクターをさらに含む、請求項２４または２５に記載
    のバクテリオファージ粒子。
27. 【請求項２７】 該ベクターが請求項２０または２１に記載のベクターであ
    る、請求項２６に記載のバクテリオファージ粒子。
28. 【請求項２８】 該バクテリオファージ粒子のそれぞれが（ポリ）ペプチド
    ／タンパク質の種々の集団由来の（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示している
    、請求項２５〜２７のいずれかに記載のバクテリオファージ粒子の種々の集団。
29. 【請求項２９】 （ａ）請求項２８に記載のバクテリオファージ粒子の種々
    の集団を提供し； （ｂ）所望の性質を有する（ポリ）ペプチド／タンパク質を表示する少なくとも
    １個のバクテリオファージ粒子を得るために該種々の集団をスクリーニングし、
    ならびに／あるいは該種々の集団から選択することを含む、所望の性質を有する
    （ポリ）ペプチド／タンパク質を得る方法。
30. 【請求項３０】 該所望の性質が目的の標的との結合である、請求項２９に
    記載の方法。
31. 【請求項３１】 工程（ｂ）が （ｂａ）バクテリオファージ粒子の該種々の集団を目的の標的と接触させ； （ｂｂ）目的の標的と結合しないバクテリオファージ粒子を溶出させ； （ｂｃ）工程（ｂａ）で形成された目的の標的および該目的の標的と結合したバ
    クテリオファージの複合体を還元条件下で処理することによって、目的の標的と
    結合したバクテリオファージ粒子を溶出させることをさらに含む、請求項３０に
    記載の方法。