KR20080080653A - Ｈｃｄｒ３ 영역들의 신규한 집합 및 그 사용 - Google Patents

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KR20080080653A
KR20080080653A KR1020087017753A KR20087017753A KR20080080653A KR 20080080653 A KR20080080653 A KR 20080080653A KR 1020087017753 A KR1020087017753 A KR 1020087017753A KR 20087017753 A KR20087017753 A KR 20087017753A KR 20080080653 A KR20080080653 A KR 20080080653A
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마커스 엔젤베르거
스테파니 띠엘
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모르포시스 아게
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Abstract

본 발명은 항체 중 사슬 상보성 결정 영역 3(HCDR3) 요소들의 집합의 제조 및 사용에 관한 것으로서, 집합의 다양성은 HCDR3 요소들의 길이의 함수이다. HCDR3 영역들의 집합의 다양성은 인간 레퍼토리 내의 HCDR3의 천연 아미노산 분포를 실질적으로 나타낸다. 따라서, 이러한 천연 아미노산 분포는 트리뉴클레오티드 돌연변이 유발(TRIM) 기술을 이용하여 DNA 서열을 엔코딩하는 HCDR3 내에서 아미노산들의 완전한 무작위적 분포를 바이어스되게 하여 제시될 수 있다. 본 발명의 HCDR3 요소들의 집합은 합성된 항체들 또는 항체 단편들의 라이브러리를 형성하는 항체(또는 그 단편)의 가변 영역 내에 각각 포함될 수 있다. 본 발명의 합성 항체 라이브러리들은 여기에 기술된 바와 같이 제조된 HCDR3 영역을 포함하여 하나 이상의 CDR 영역들을 플랭킹하는 독특한 제한 사이트들을 포함할 수 있는 화학적으로 합성된 "총괄 유전자(master gene)" 골격 영역들과 같은 모듈형 특성들을 포함하도록 설계될 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 다양한 집합을 엔코딩하는 핵산 분자들 및 이를 제조하고 사용하는 방법들을 제공한다.
중 사슬 상보성 결정 영역 3(heavy chain complementarity determining region 3: HCDR3), 집합(collection), 트리뉴클레오티드 돌연변이 유발(TRIM) 기 술, 정렬 유형(type of alignment), 다양성(diversity)

Description

ＨＣＤＲ３ 영역들의 신규한 집합 및 그 사용{NOVEL COLLECTION OF HCDR3 REGIONS AND USES THEREFOR}
관련출원
본 출원은 2005년 12월 20일에 제출된 가출원 번호 60/751,633의 우선권을 주장하며, 그 내용은 여기에 그대로 참고로 포함되어 있다.
면역글로불린 중 사슬의 제 3 상보성-결정 영역(H-CDR3)은 기존의 항원-결합 사이트의 중심을 형성하며 종종 항체의 특이성 및 친화도를 측정하는 데 주도적인 역할을 한다. 후천성 면역 시스템을 지닌 모든 알려진 종들에서, H-CDR3는 함께 항원-결합 사이트의 외부 경계를 형성하는 H-CDR3은 함께 항원-결합 사이트의 외부 경계를 형성하는 다섯 개의 다른 CDR 영역들(H-CDR1, H-CDR2, L-CDR1, L-CDR2 또는 L-CDR3)의 임의의 것보다 더 다양하다(Tonegawa , 1983; Chothia et al ., 1989).
상기 종들에 이용가능한 항원-결합 구조들의 범위에 미치는 영향이 대단하여 항체 레퍼토리(antibody repertoire)의 기능에 미치는 영향이 클 수 있는(Johnson & Wu , 1998; Collis et al ., 2003) H-CDR3의 평균 길이와 HCDR3 길이들의 범위는 쥐들에서 인간 그리고 소로 감에 따라 증가한다는 것을 알게 되었다(Wu et al ., 1993). 예를 들어, 인간 및 쥐에게서, H-CDR3 길이들의 범위와 H-CDR3의 다양성은 개체발생 동안에 증가한다(Feeney , 1992; Zemlin et al ., 2002).
H-CDR3 영역은 항원 결합에서의 주도적 역할로 인하여, 치료 항체들을 엔지니어링 하기 위하여 사용될 수 있는 합성 항체 라이브러리들에 과변이(hypervariability)를 도입하는 운반체로서 사용되어 왔다(Knappik et al., 2000). 이 영역을 고안된 프라이머들(degenerate primers)로 무작위화(randomization) 시키면 엄청난 서열 다양성이 생기지만, 이러한 구조들의 대부분은 아닐지라도 많은 경우에는 뒤틀려지고 작용을 하지 않는다(Zemlin et al., 2003). 따라서, 아주 큰 합성 항체 라이브러리들은 주어진 표적에 대항하여 우수한 친화도들을 얻는 데 필요하다.
Zemlin은 쥐와 인간의 독특한 기능적인 공개된 H-CDR3 영역들의 Zemlin 분석을 한 이후에, 인간에서의 H-CDR3 영역들이 쥐 H-CDR3 영역들에 비하여 더 큰 범위의 길이를 보인다는 것을 알게 되었다. Zemlin은 또한 HCDR3의 길이가 증가함에 따라 일정한 아미노산들의 빈도(frequency)가 변화한다는 것도 알게 되었다. 예를 들어, Zemlin은 세린의 빈도가 8 내지 14 개의 아미노산 잔기들의 서열들에 대한 길이가 증가함에 따라 증가하였지만, 길이가 14 개 아미노산 잔기들을 초과하는 서열들에서는 뒤섞인 패턴을 보였다고 보고하였다.
최근에, Hoet et al., Nature Biotech 23:(3) March 2005은 부분적으로는 합성이지만, 인간 기증자들로부터 구해진 HCDR3 영역들을 포함하는 가변적인 무거운(VH) 서열들을 함유하는 항체 라이브러리의 구성(construction)을 기술하였다. 특히, HCDR3 영역(FR1-H-CDR1-FR2-H-CDR2-FR3)을 포함하지 않은 VH 사슬의 일 부분 은 합성되고 VH 유전자 내에 포함되었다; 그리고 HCDR3 영역(H-CDR3-FR4)를 포함하는 VH 사슬의 일 부분은 자연발생적 인간 자가면역 환자들로부터 유래 되었다.
Hoet는 유사한 정도의 기능적 라이브러리 다양성과 그로 인한 품질은 합성으로 생성된 HCDR3 영역을 VH 사슬로 포함시켜서는 달성될 수 없다는 근거로 인간 기증자들로부터 구한 HCDR3 서열들을 포함시키기로 하였다. 이는 기존의 통념에 따라 가능한 한 수많은 다양성을 포함하도록 목표로 하여, 라이브러리 스크리닝을 필요한 것보다 더 성가신 일로 만들 만큼 라이브러리 내에서의 비기능성 결합제들(non-functional binders)의 농도를 낮추려는 시도에서 다양성이 제어되는(분석을 알려진 V, D 및 J 세그먼트들(segments)로 한정시킴으로써) 소위 집중 HCDR3 라이브러리들을 발생시키는 접근법을 취한다는 사실을 본다면 그리 놀랄만한 일은 아니다. 진실로, Hoet는 자연발생적 인간 항체들에서, HCDR3은 그 잔기들이 4 내지 35 개를 초과하는 것으로 다양하며 비무작위적(nonrandom) 서열 다양성을 가질 뿐만 아니라, 자연적인 H-CDR3 레퍼토리들에서 발견되는 서열 및 길이 다양성 양쪽 모두를 엔코딩하는 DNA를 합성하는 것이 가능하다는 것도 알게 되었다. 그러한 목적을 위하여, Hoet는 배선(germline) D 세그먼트들은 HCDR3 라이브러리 요소들의 접힘과 결합을 조장하도록 선택되었으며, D 세그먼트들을 라이브러리로 포함시키는 것이 바람직하다는 것을 주목함으로써 특허 출원 '93A1에서 알게 된 HCDR3 라이브러리의 사용을 기술하고자 한다. 특허 출원 '937A1에서 알게 된 집중된 라이브러리의 실질적인 일 결과는 그것이 V, D 및 J 세그먼트들이라는 이름으로 알려진 제한된 데이터 집합으로 구성되었으며, 모든 아미노산 잔기에서 최적의 다양성이나 반문형 성(variegation)을 달성할 수 없다는 것이다.
Hoet와 특허 출원 '937A1의 가르침과는 대조적으로, 본 발명은 특히 천연 H-CDR3 레퍼토리들에서 본질적으로 발견되는 다양성을 가지며, DNA 서열을 엔코딩하는 H-CDR3 내에서 아미노산들의 완전한 무작위적 분포를 바이어스시켜(biasing) 천연 아미노산 분포를 모방하는 합성된 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공한다. 이러한 견지에서, 본 발명은 지금까지는 구성하기 불가능한 것으로 여겨졌던 방식으로 구성되는 항체 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 아미노산들의 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들이 상이하다.
H-CDR3의 적어도 일 부분은 길이가 약 4 내지 약 22 아미노산들에 이르는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
또한, 제 1 범위의 아미노산들이 약 4 내지 약 13 아미노산들이며, 제 2 범위의 아미노산들이 약 14 내지 약 22 아미노산들인 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
일 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자(diversity factor)에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 3 다양성 인자에 따라 제 3 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며 상기 다양성 인자들은 상이하다. 본 발명의 그러한 집합은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들을 포함할 수 있으며, 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 9 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 10 내지 약 16 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 3 범위는 약 17 내지 약 22 개의 아미노산들이다.
다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 3 다양성 인자에 따라 제 3 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 4 다양성 인자에 따라 제 4 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 5 다양성 인자에 따라 제 5 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 6 다양성 인자에 따라 제 6 범위의 아미노산들 내에서 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며 상기 다양성 인자들은 상이하다. 본 발명의 그러한 집합은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들을 포함할 수 있으며, 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 6 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 7 내지 약 9 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 3 범위는 약 10 내지 약 12 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 4 범위는 약 13 내지 약 15 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 제 5 범위는 약 16 내지 약 18 개의 아미노산들이고 아미노산들의 상기 제 6 범위는 약 19 내지 약 22 개의 아미노산들이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 3 다양성 인자에 따라 제 3 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 4 다양성 인자에 따라 제 4 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 5 다양성 인자에 따라 제 5 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 6 다양성 인자에 따라 제 6 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 7 다양성 인자에 따라 제 7 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고, 제 8 다양성 인자에 따라 제 8 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며 상기 다양성 인자들은 상이하다. 본 발명의 그러한 집합은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들을 포함할 수 있으며, 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 6 내지 약 7 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 3 범위는 약 8 내지 약 9 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 4 범위는 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 제 5 범위는 약 12 내지 약 13 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 6 범위는 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 7 범위는 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 제 8 범위는 약 18 내지 약 19 아미노산들이고 아미노산들의 제 9 범위는 약 20 내지 약 22 개의 아미노산들이다.
또한 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적으로서, 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 8 아미노산들이며, 상기 제 1 범위는 하기 사항을 필요로 한다: 알라닌은 위치(position) 1에서 약 80%의 빈도 비율(frequency rate)을 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 3에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 7에서 약 50%의 빈도 비율을 가지고 티로신은 위치 8에서 약 40%의 빈도 비율을 가진다.
다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 9 내지 약 15 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 하기 사항을 필요로 한다: 알라닌은 위치 1에서 약 90%의 빈도 비율 변화율을 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 70%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 3에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 10에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 11에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 12에서 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 페닐알라닌은 위치 13에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 14에서 약 80%의 빈도 비율을 가지고 티로신은 위치 15에서 약 40%의 빈도 비율을 가진다.
본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 하기 사항을 필요로 한다: 알라닌은 위치 1에서 약 90%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 3에서 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 4에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 5에서 약 10%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 6에서 약 10%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 7에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 15에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 16에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 17에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 18에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 19에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 메티오닌은 위치 20에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 21에서 약 95%의 빈도 비율을 가지고 발린은 위치 22에서 약 60%의 빈도 비율을 가진다.
다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 만약 항체 H-CDRR3 영역의 아미노산 길이가 약 9 내지 약 15 개의 아미노산들이라면, 그 다양성은 상기 H-CDR3 영역 내의 고 함량의 글리신 및 세린으로 인하여 발생된다. 본원에서, 아미노산 또는 그의 군(group)과 관련하여 "고 함량(high content)"이라는 용어는 그러한 아미노산 또는 그의 군이 10% 초과하는 빈도 율(frequency rate)로 정의된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 만약 항체 H-CDRR3 영역의 아미노산 길이가 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들이라면, 그 다양성은 상기 H-CDR3 영역 내의 고 함량의 세린, 상기 H-CDR3 영역의 말단부에서의 고 함량의 염기성 아미노산들, 상기 H-CDR3의 전단부에서의 아스파르트산 및 상기 전체 H-CDR3 영역 상의 고 함량의 방향족 아미노산으로 인하여 발생된다.
또한 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적으로서, 만약 항체 H-CDR3 영역의 아미노산 길이가 5 개의 아미노산들이라면, 상기 아미노산 조성물은 위치 1에서 60% 알라닌, 20% 트레오닌 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.58%의 혼합물, 위치 2에서 30% 아르기닌, 30% 라이신, 30% 트레오닌 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.55%의 혼합물, 위치 3에서 40% 아스파르트산, 40% 페닐알라닌 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.58%의 혼합물, 위치 4에서 30% 아스파르트산, 30% 글리신, 30% 메티오닌 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.63%의 혼합물 및 위치 5에서 30% 티로신, 30% 아스파르트산 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.58%의 혼합물이다.
다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적으로서, 만약 항체 H-CDR3 영역의 아미노산 길이가 12 개의 아미노산들이라면, 상기 아미노산 조성물은 위치 1에서 85% 알라닌 및 트레오닌과 발린의 혼합물 15%, 위치 2에서 70% 아르기닌 및 세린, 트레오닌, 글리신 및 알라닌의 혼합물 30%, 위치 9에서 알라닌, 세린 및 티로신의 혼합물 20% 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.63%, 위치 10에서 60% 페닐알라닌, 10% 메티오닌 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.58%, 위치 11에서 80% 아스파르트산, 5% 글리신 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.58% 및 위치 12에서 50% 티로신, 발린 및 이소류신의 혼합물 10% 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.63%이다.
또한 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적으로서, 만약 항체 H-CDR3 영역의 아미노산 길이가 20 개의 아미노산들이라면, 상기 아미노산 조성물은 위치 1에서 100% 알라닌, 위치 2에서 50% 아르기닌 및 50% 라이신, 위치 3에서 30% 글리신 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.55%, 위치 4에서 20% 아르기닌, 20% 글리신, 20% 류신 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.63%, 위치 14에서 20% 세린, 20% 트레오닌, 20% 시스테인 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.63%, 위치 21에서 95% 아스파르트산 및 위치 22에서 50% 발린 및 시스테인을 제외한 모든 자연발생적 아미노산들의 0.55%이다.
본 발명은 또한 아미노산들의 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬들의 집합에 관한 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생된다.
다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 다양한 범위들의 아미노산들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 포함하는 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬들의 집합을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬들의 집합을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들을 포함하는 합성된 인간 또는 인간화 항체 라이브러리를 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 복수의 DNA 분자들을 합성하는 단계를 포함하는, 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 핵산 분자들의 집합을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 각각의 DNA 분자는 H-CDR3 영역을 엔코딩하며, 상기 H-CDR3 영역들은 다양한 범위이며, 제 1 범위의 아미노산들의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 DNA 분자들은 제 1 다양성 인자에 따라 합성되며, 제 2 범위의 아미노산들의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 DNA 분자들은 제 2 다양성 인자에 따라 합성되며, 상기 다양성 인자들은 상이하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 다양한 인간 또는 인간 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 엔코딩하는 핵산들의 집합에 관한 것이다.
본 발명은 아미노산들의 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 엔코딩하는 핵산들의 집합에 관한 것이기도 하며, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들은 상이하다.
핵산 분자들의 집합을 발현시키는 단계를 포함하는, 변화하는 길이들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 획득하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이기도 하다.
본 발명의 맥락에서, 다양한 다른 H-CDR3 영역에서의 하나 이상의 아미노산 위치들은 불변한 상태를 유지할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 당업자는 상기 H-CDR3 영역들 내에서 다양성을 도입하는 트리뉴클레오티드들의 혼합물들을 합성하는 효율 및 다양한 H-CDR3 영역들을 클로닝하는 효율을 위하여, 하나 이상의 불변 위치들을 H-CDR3 영역 내에 삽입시키는 것이 바람직할 수 있다는 것을 알 것이다.
따라서, 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것도 본 발명의 목적으로서, 만약 상기 집합의 요소들이 4 내지 8 개의 아미노산들의 길이를 가진다면, 4 내지 8 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2 또는 3 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다(define). 본 발명은 또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합에 관한 것으로서, 상기 집합의 요소들이 9 내지 10 개의 아미노산들의 길이를 가진다면, 9 내지 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2 또는 3 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다.
본 발명은 또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합에 관한 것으로서, 만약 상기 집합의 요소들이 11 내지 13 아미노산들의 길이를 가진다면, 11 내지 13 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2 또는 3 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다. 또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적으로서, 만약 상기 집합의 요소들이 14 개의 아미노산들의 길이를 가진다면, 14 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다.
본 발명은 또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합에 관한 것으로서, 만약 상기 집합의 요소들이 15 내지 16 개의 아미노산들의 길이를 가진다면, 15 내지 16 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다.
또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것이 본 발명의 목적으로서, 만약 상기 집합의 요소들이 16 내지 17 개의 아미노산들의 길이를 가지다면, 16 내지 17 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다.
본 발명은 또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합에 관한 것으로서, 만약 상기 집합의 요소들이 18 아미노산들의 길이를 가진다면, 18 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 불변 아미노산 위치들을 정의한다.
본 발명은 또한 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합에 관한 것으로서, 만약 상기 집합의 요소들 19 개 이상의 아미노산들의 길이를 가진다면, 19 개 이상의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 다양성은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하다.
도 1: 좌측 정렬(Left alignment); 도 1b에 도시된 "층계(staircase)"에서의 각각의 계단은 하나의 정의된 HCDR3-길이를 지니는 평균 380 개의 서열들의 일치 서열을 나타낸다. 좌측 정렬에서, 좌측에서 우측으로 길이가 증가하면서 대각선을 따라 추가로 아미노산 잔기들을 입력함으로써 상이한 길이들이 정렬된다.
도 2: 우측 정렬(Right alignment); 도 2b에 도시된 "층계"에서의 각각의 계 단은 하나의 정의된 HCDR3-길이를 지니는 평균 380 개의 서열들의 일치 서열을 나타낸다. 우측 정렬에서, 우측에서 좌측으로 길이가 증가하면서 대각선을 따라 추가로 아미노산 잔기들을 입력함으로써 상이한 길이들이 정렬된다.
도 3a + 3b + 3c: 중앙 정렬(플랭킹(flanking)-영역, 루프-영역, 혼합-중앙); 우측 도면에서 도시된 각각의 층은 하나의 정의된 HCDR3-길이를 지니는 평균 380 개의 서열들의 일치-서열을 나타낸다. 플랭킹 영역 정렬에서, 외부 중앙에서 내부로(플랭킹 영역에서 루프-영역쪽으로) 길이가 증가하면서 대각선을 따라 추가로 아미노산 잔기들을 입력함으로써 상이한 길이들이 정렬된다. 짙은 회색 정사각형들은 새로 더해진 잔기들에 대한 예들이다.
도 4: 항체 가변 영역들의 번호부여 방식들(numbering schemes)의 예들이다.
일 태양에서, 본 발명은 특히 천연 H-CDR3 레퍼토리들에서 본질적으로 발견되는 다양성을 가지며, 천연 아미노산 분포를 모방하는 합성된 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공한다; 이는 특정한 H-CDR 영역의 길이에 따라서 DNA 서열을 엔코딩하는 H-CDR3의 아미노산들의 무작위적 분포를 바이어스되게 하여 실행된다.
한정된 데이터 집합을 사용하는 대신에, 기존의 이용가능한 데이터베이스들로부터 이용가능한 V, D 및 J 세그먼트들이라는 이름의 알려진 인간 항체 서열들이 분석되고 H-CDR3 영역들내에서 아미노산 분포를 측정하는 기준으로 사용될 수 있다.
이런 의미에서, 본 발명은 지금까지는 구성하기 불가능한 것으로 여겨졌던 방식으로 구성되는 항체 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 아미노산들의 변화하는 길이들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생된다.
본 발명의 맥락에서, "다양성 인자"라는 용어는 각각의 H-CDR3 영역에서 아미노산 잔기들의 주어진 영역에 대하여, 상기 H-CDR3 영역에서의 하나 이상의 주어진 위치들에서 아미노산들이 발생하는 빈도 비율로서 정의된다. 본 발명의 맥락에서, 주어진 위치에서의 아미노산의 "빈도 비율"은 그러한 위치에서 나타나는 아미노산의 확률로서 정의되며, 빈도는 여기에 설명된 가르침들에 따라서 0% 내지 100%일 수 있다. 자연발생적 항체들에서, 상기 H-CDR3 영역들은 길이가 약 4 내지 35 아미노산들로 다양하다. 따라서, 본 발명은 각각의 H-CDR3 영역에서의 아미노산 잔기들의 길이는 4 내지 35 사이에 있을 수 있으며, 바람직하게는 길이가 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 아미노산 잔기들이며, 특정한 다양성 인자가 적용되는 아미노산들의 범위는 여기에 더 충분히 기술된 바와 같이 변할 수 있다. 인간 또는 인간화 것이든 간에, 본 발명의 항체들 및/또는 항체 H-CDR3 영역들은 여기에 좀 더 기술되는 많은 맥락에서 사용될 수 있다.
일 태양에서, 본 발명은 2 내지 4 개의 다양성 인자들에 따라 변화하는 길이의 아미노산들의 H-CDR3 영역들의 다양화를 제공한다. 따라서, 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 제 1 다양성 인자 및 제 2 다양성 인자는 상이하다. 아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 13 아미노산들이며 아미노산들의 제 2 범위는 약 14 내지 약 22 아미노산들이다. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기 사항들을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 10 내지 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자 및 약 17 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자. 또한, 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 예를 들어, 하기 사항을 적용시켜 발생된다: 약 4 내지 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 9 내지 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 14 내지 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자 및 약 19 내지 약 22 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자.
다른 태양에서, 본 발명은 5 내지 7 개의 다양성 인자들에 따라 아미노산들의 변화하는 길이의 아미노산들의 H-CDR3 영역들의 다양화를 제공한다. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 8 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 12 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 16 내지 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자 및 약 20 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기 사항을 적용시켜 발생될 수도 있다: 약 4 내지 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 7 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 10 내지 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 13 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 16 내지 18 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자 및 약 19 내지 약 22 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 7 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 10 내지 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 13 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 16 내지 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 19 내지 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자 및 약 21 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 제 7 다양성 인자.
다른 태양에서, 본 발명은 약 8 내지 10 개의 다양성 인자들에 따라 아미노산들의 변화하는 길이들의 H-CDR3 영역들의 다양화를 제공한다. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 7 내지 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 9 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 12 내지 약 14 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 15 내지 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 17 내지 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 19 내지 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자 및 약 21 내지 약 22 개의 아미노산들 의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자. 또한, 다양한 인간 또는 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 내지 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 8 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 12 내지 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 18 내지 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자 및 약 20 내지 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 내지 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 8 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 12 내지 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소 들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 18 내지 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 20 내지 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자.
다른 태양에서, 본 발명은 11 내지 14 개의 다양성 인자들에 따라 아미노산들의 변화하는 길이들의 H-CDR3 영역들의 다양화를 제공한다. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에 있어서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 내지 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 9 내지 약 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 12 내지 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 18 내지 약 19 개의 아미노산들의 길이 를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자 및 약 21 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 또한 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 8 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 11 내지 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 19 내지 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자 및 약 21 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길 이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 8 내지 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 11 내지 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 19 내지 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 또한 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인 자, 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 13 내지 약 14 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 15 내지 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 18 내지 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자, 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 14 다양성 인자.
또 다른 태양에서, 본 발명은 15 내지 17 개의 다양성 인자들에 따라 아미노산들의 변화하는 길이의 H-CDR3 영역의 다양화를 제공한다. 다양한 인간 또는 인간화 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 17 내지 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자, 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 14 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 15 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H- CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 14 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자, 약 18 내지 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 14 다양성 인자, 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 15 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 16 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 6 내지 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 14 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자, 약 17 내지 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자, 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 14 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 15 다양성 인자, 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 16 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 17 다양성 인자.
다른 태양에서, 본 발명은 18 내지 19 개의 다양성 인자들에 따라 아미노산들의 변화하는 길이의 H-CDR3 영역들의 다양화를 제공한다. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 14 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자, 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자, 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 14 다양성 인자, 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 15 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 16 다양성 인자, 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 17 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 18 다양성 인자. 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합에서의 다양성은 또한 하기사항을 적용시켜 발생될 수 있다: 약 4 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 1 다양성 인자, 약 5 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 2 다양성 인자, 약 6 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 3 다양성 인자, 약 7 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 4 다양성 인자, 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 5 다양성 인자, 약 9 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 6 다양성 인자, 약 10 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 7 다양성 인자, 약 11 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 8 다양성 인자, 약 12 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 9 다양성 인자, 약 13 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 10 다양성 인자, 약 14 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 11 다양성 인자, 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 12 다양성 인자, 약 16 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 13 다양성 인자, 약 17 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 14 다양성 인자, 약 18 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 15 다양성 인자, 약 19 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 16 다양성 인자, 약 20 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 17 다양성 인자 및 약 21 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 18 다양성 인자 및 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소들에 대한 제 19 다양성 인자.
당업자는 다양성 인자들의 개수는 정의된 길이를 가지는 H-CDR3 영역 요소에서의 아미노산 위치들의 최대 개수까지 이를 수 있다는 것을 알 것이다. 바람직하게는. 최대 19 개 다양성 인자들이 사용되고 본 발명의 다양화된 H-CDR3 영역들의 집합들은 가변 중 사슬 구역 또는 전장 또는 실질적으로 전장 면역글로불린 사슬의 단독으로 또는 일부로서 다양화된 H-CDR3 영역들의 다양한 집합들을 형성하도록 조합될 수 있다.
예
하기 비한정 예들은 아미노산들(aa)의 특정한 범위 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 적용될 수 있는 일정한 다양성 인자들에 대한 파라미터들을 명기함으로써 본 발명의 다양한 실시예들을 더 특징적으로 정의한다. 당업자는 하기에 언급된 이론적 설계들로부터 다양성에 있어서 어느 정도 발생하는 편차(아미노산 빈도)는 예를 들어, 적어도 부분적으로 그러한 이론적 설계들에 기반하여 라이브러리를 구성하는 데 있어서 일정한 클로닝 효율들을 실행하려는 욕구가 존재할 수 있으므로, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 허용된다는 것을 알 것이다.
H-CDR3-설계들의 제조에 대한 서열들의 검색 및 편집:
분석을 위한 데이터-집합들은 NCBI-서버 상의 Ig-BLAST로부터 구하였다. Ig-BLAST의 데이터-레코드들을 포함하는 하기의 파일은 다운로드 되었다: fttp://ftp.ncbi.hih.gov/blast/db/FASTA/igSeqProt.gz. 총 40,808 개의 데이터-레코드들이 다운로드 되었으며, 이들은 인간, 쥐 또는 FASTA 포맷의 데이터-입력들에서 네임-태그(name-tag)에 지정되지 않았다. MS-Word에서 네임-태그의 "인간"이라는 키워드로 데이터를 필터링하여, 인간 항체들에 대한 22,500 개의 입력들이 추출되었다. 인간 항체들에 대한 22,500 개 입력들 중에서, 13,235 개는 중 사슬들에 지정되었고 5,490 개는 경 사슬들에 지정되었다. 나머지 항체들은 키워드들이 네임-태그에서 전혀 발견되지 않았으므로, hc, lc-카파(kappa) 및 lc-람다(lambda)에 더 지정되었다. 중 사슬들에 대하여, 길이-의존성 H-CDR3 집합은 MS-Excel에서 상이한 길이들에 대하여 상이한 워크쉬트들을 사용하여 컴파일되었다. 상기 H-CDR3-분석에 대하여, 중 사슬에 대한 13,235 개의 서열들 중 8,886 개가 분석될 수 있었다.
길이-의존성 H-CDR3-설계;
일례로, 3 개의 다양성 인자들에 따라 하기 3 개의 분리된 설계들이 발생되었다:
4aa-7aa
8aa-14aa
15aa-23aa
케벳(Kabat) 위치 102에서 Y-함량은 길이 8aa-23aa보다 50%에서 5%로 감소됨을 보이는 반면에, 이 위치에서 V-함량은 12%에서 65%로 증가한다. 또한, 위치 101에서 D-함량은 75%에서 100%로 증가한다. 본 발명의 범위를 한정하지 않으면서 상기 길이에 대한 상이한 aa의 결과들을 실행하기 위하여, 8-14aa로부터 1 개 및 15-23aa로부터 1 개라는 2 개의 상이한 다양성 인자들이 루프-계 설계하에서 바람직하다는 것이 결정된 반면에, 4-7aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 적용되는 다양성 인자는 좌측(left) 설계에 따를 수 있다.
정렬-유형
몇가지 aa-길이들의 설계를 요약하기 위하여, 하기 유형의 정렬들은 8-14aa 및 15-23aa를 포함하는 라이브러리 요소들의 설계에 대한 대표적인 대안들이다(표 1): 좌측에의 정렬, 우측(right)에의 정렬 및 좌우대칭 정렬.
Figure 112008052048898-PCT00001
상기 표 1은 정렬 유형들에 관한 것이며, 최초 3 개 위치들 및 최종 위치는 H-CDR3 영역을 플랭크하는(flanking) 골격 영역들의 불변 아미노산 위치들이다.
상기 "층계(staircase)"의 각각의 계단은 일정한 길이의 일치-서열(consensus-sequence)을 나타낸다. 최초 3 개 위치들은 이웃하는 골격 영역들의 부분들을 나타낸다: 케벳-위치들 92, 93 및 93에서의 CAR-영역 및 케벳-위치 103에서의 FW4의 시작의 W(WGQG).
좌측 정렬(표 1 + 도 1):
최초 3 개의 위치들(케벳 위치 96,97 및 98)은 블록으로 정렬되었다. 이러한 위치들은 V-세그먼트 및 D-세그먼트 사이의 경계에 있으며 V-엔코딩될 수 있다(=배선). 따라서, 이러한 위치들은 조성에 있어서 나머지 HCDR3와는 상이할 수 있으며 분리된 상태를 유지한다. 위치 96 및 97은 여기서 Y-함량이 감소하므로 다른 H-CDR3 위치들과는 상이한 반면에, 위치 96에서는 D-함량은 증가된다. 지배적인 FDY-서열들을 포함하는 최종 5 개 위치들(케벳 위치 l, m, n, 101 및 102)은 블록으로 지정되었다. 위치들 101 및 102는 종종 J-세그먼트 엔코딩되므로, 유사한 아미노산 분포들을 보인다.
우선, 최초 3 개 및 최종 5 개 위치들을 aa로 채운 이후에, 좌측으로의 정렬은 케벳 위치 99로 시작하였으며 케벳 위치 99 및 "l" 사이의 간격을 순차적으로 채워넣었다.
우측 정렬(표 1 + 도 2):
여기서 케벳-위치들 96, 97 및 98뿐만 아니라 케벳 위치들 l, m, n, 101 및 102도 블록으로 지정되었으며, 좌측 정렬에 대하여 기술된 바와 동일한 고려사항들을 따랐다. 우선 최초 3 개 및 최종 5 개 위치들을 aa로 채운 이후에, 우측으로의 정렬은 케벳 위치 "l"로 시작하였으며 케벳 위치 "l" 및 99 사이의 간격을 순차적으로 채워넣었다.
중앙 정렬(표 1 + 도 3a, 3b, 3c);
구조적 태양들에 대하여, 좌우대칭 정렬은 바람직한 정렬 유형이며 또한 상기 루프에서 상호작용하는 aa를 신속히 확인시켜 준다. 여기 새로운 아미노산들이 일정한 위치에 좌우대칭으로 첨가된다. 좌우대칭 정렬은 면역글로불린 가변 구역들에 대한 또 다른 번호부여 방식들에서 기술된 바와 같이 AHO-위치 123에 중앙으로 시행되었다: 자동 모델링 분석 도구, A. Honegger, A. Pluckthun, J. Mol.Biol(2001)309, 657-670.
2 개의 좌우대칭 정렬들이 있을 수 있다: 하나의 정렬은 위치 123에 간격을 위치시키며, 상기 서열들을 골격-영역으로 쉬프팅시키고, 다른 정렬은 좌우대칭 축의 위치 123 쪽으로 상기 서열들을 쉬프팅시키며 상기 서열들을 aa의 동일한 번호로 2 개 부분으로 나눈다. 제 1 정렬은 플랭킹 영역들의 aa-분포를 기술하는 반면에(도 3a) 비록 동일한 서열들을 취하고 다른 방식으로 정렬될 수 있지만, 제 2 정렬은 H-CDR3 영역의 루프-팁(loop-tip)을 기술한다(도 3b). 루프에 대하여, 새로운 아미노산들이 루프의 기저에 좌우대칭으로 입력된다. 혼합-중앙 정렬에서(도 3c), 상기 서열들은 루프 및 플랭킹 영역들에 대한 정렬들을 포함하지만 AHO-위치 123에 좌우대칭으로 배양된다. 위치 123을 둘러싸는 5aa의 블록은 불변으로 유지되는 반면에, 다른 서열들은 플랭킹 영역들로 정렬되었다. 항체 가변 구역들에 대하여 이용될 수 있는 번호부여 시스템들의 예들은 도 4에 도시되어 있다.
표 2는 4 내지 7 아미노산 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬(플랭킹-영역)의 결과를 도시한다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다.
Figure 112008052048898-PCT00002
상기 표 2는 4 내지 7개의 아미노산 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬에 관한 것이다.
하기 표 3은 4-77aa 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다.
Figure 112008052048898-PCT00003
상기 표 3은 4-7aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다.
하기 표 4는 4-7aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 좌측 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다.
Figure 112008052048898-PCT00004
상기 표 4는 4-7aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 좌측 정렬을 나타낸 것이다.
하기 표 5는 4-7aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 우측 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다.
Figure 112008052048898-PCT00005
상기 도 5는 4-7aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 우측 정렬에 관한 것이다.
하기 표 6은 8-14aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬(플랭킹-영역)의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 7은 8-14aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬(루프-영역)의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 8은 8-14aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬(혼합-중앙)의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 9는 8-14aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 좌측 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 10은 8-14aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 좌측 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 11은 15-23aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중심 정렬(플랭킹 영역)의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 12는 15-23aa의 길이를 가지는 H-CDR3에 대한 중앙 정렬(루프 영역)의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 13은 15-23aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 중앙 정렬(혼합-중앙)의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 14는 15-23aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 좌측 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다. 표 15는 15-23aa의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들에 대한 우측 정렬의 결과를 보여준다. "all"은 시스테인 없는 모든 19aa의 균일한 분포를 기술한다.
하기 표 6은 8-14aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00006
하기 표 7은 8-14aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00007
하기 표 8은 8-14aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00008
하기 표 9는 8-14aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 좌측 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00009
하기 표 10은 8-14aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 우측 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00010
하기 표 11은 15-23aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00011
하기 표 12는 하기 15-23aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00012
하기 표 13은 하기 15-23aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 중앙 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00013
하기 표 14는 하기 15-23aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 좌측 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00014
하기 표 15는 하기 15-23aa 길이들을 지닌 H-CDR3 영역들의 우측 정렬에 관한 것이다:
Figure 112008052048898-PCT00015
다른 비-한정 예에서, 본 발명은 변화하는 길이의 다양한 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 H-CDR3 영역들의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 약 4 내지 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생될 수 있으며, 상기 제 1 다양성 인자는 하기사항을 필요로 한다: 알라닌은 위치 1에서 약 80%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 3에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 7에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 5에서 약 10%의 빈도 비율을 가지고 티로신은 위치 8에서 약 40%의 빈도 비율을 가진다(표 16).
Figure 112008052048898-PCT00016
상기 표 16은 제 1 범위의 아미노산들 내에서 약 4 내지 약 8 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화하시키는 다양성 인자에 대한 예를 보여준다.
다른 비-한정 예에서, 본 발명은 변화하는 길이의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 H-CDR3 영역들의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 약 9 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생될 수 있으며, 상기 제 1 다양성 인자는 하기사항을 필요로 한다: 알라닌은 위치 1에서 약 90%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 70%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 10에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 10에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 11에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 12에서 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 페닐알라닌은 위치 13에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 14에서 약 80%의 빈도 비율을 가지고 티로신은 위치 15에서 약 40%의 빈도 비율을 가진다. 바람직하게는, 약 9 내지 약 15 개의 아미노산들의 아미노산 길이를 가지는 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역의 다양성은 H-CDR3 영역 내에서 고 함량의 글리신 및 세린에 의하여 발생된다(표 17).
Figure 112008052048898-PCT00017
상기 표 17은 제 1 범위의 아미노산들 내에서 약 9 내지 약 15 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키는 다양화 인자에 대한 예를 보여준다.
또 다른 비-한정적 실시예에서, 본 발명은 변화하는 길이의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 H-CDR3 영역들의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생될 수 있으며, 상기 제 1 다양성 인자는 하기사항을 필요로 한다: 알라닌은 위치 1에서 약 90%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 3에서 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 4에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 5에서 약 10%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 6에서 약 10%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 7에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 15에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 16에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 17에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 18에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 19에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 메티오닌은 위치 20에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 21에서 약 95%의 빈도 비율을 가지고 발린은 위치 22에서 약 60%의 빈도 비율을 가진다(표 18).
Figure 112008052048898-PCT00018
상기 표 18은 제 1 범위의 아미노산들 내에서 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키는 다양화 인자에 대한 예를 보여준다.
또한, 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들의 아미노산 길이를 가지는 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합의 다양성은 H-CDR3 영역 내의 고 함량의 세린, H-CDR3 영역의 말단부(C-터미널)의 고 함량의 염기성 아미노산들, HCDR3 영역의 전단부(N-터미널)의 아스파르트산 및 전체 H-CDR3 영역 상의 고 함량의 방향족 아미노산에 의하여 발생될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, H-CDR3 영역 내의 임의의 주어진 아미노산 위치에서, 정의된 아미노산 위치에서의 정의된 빈도 비율로 명시되지 않은 아미노산들은 서로간에 실질적으로 균일한 비율로 발생하거나 몇몇 아미노산들은 그러한 위치에서의 다른 아미노산들과 비교하여 더 높은 빈도 비율을 가질 수 있으며, 몇몇 경우들에는, 일정한 아미노산들이 하나 이상의 정의된 아미노산 위치들에서 생략될 수 있다(예컨대, 시스테인).
본 발명의 맥락에서, 다양한 H-CDR3 영역들의 설계는 DNA 서열을 엔코딩하는 H-CDR3 내에서 아미노산들의 완전한 무작위적 분포를 바이어스되게 하여 실행된다. 다양한 H-CDR3 영역들의 발생은 각각의 단일한 위치에서 아미노산들의 임의의 원하는 혼합물을 임의적으로 합성하게 하여 임의의 위치에서 임의의 아미노산 바이어스를 도입하는 트리뉴클레오티드 돌연변이 유발(TRIM) 기술(Virnekas et al., 1994)을 이용하여 실시될 수 있다. 일반적으로, 상기 TRIM 기술은 표준 DNA 합성에 대한 입력으로서 사전-조립된(pre-assembled) 트리뉴클레오티들에 의존하여, 틀이동(frameshift)들, 종결 코돈들 또는 원하지 않는 아미노산들을 회피하게 되고 엄청난 서열 다양성을 발생시킨다. 따라서, 충분히 광범위한 기능적 서열 공간을 발생시키는 데 아주 큰 라이브러리 사이즈들이 요구된다. 이에 따라, TRIM 기술과 병행하여 길이-의존성 아미노산 조성물을 알고 있으면 훨씬 더 높은 기능성 함량을 지닌 H-CDR3 의 더 작은 집합의 설계를 가능하게 할 것이다.
다른 태양에서, 본 발명은 다양한 H-CDR3 영역들의 집합을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬들의 집합을 제공하는 것으로서, 각각의 H-CDR3 영역의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 2 다양성 인자에 의하여 아미노산들의 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 각각의 다양성 인자는 각각의 H-CDR3 영역의 아미노산 길이의 함수이다. 또한, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들의 각각이 본 발명에 따라 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들의 집합을 제공한다. 본 발명의 맥락에서, 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들이 집합의 발생에 대하여, 당업자는 다양한 H-CDR3 영역들의 집합의 이론적인 설계를 변형시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 낮은 빈도 비율로 나타나는 아미노산들(예컨대, 5 % 이하 또는 바람직하게는 3 % 미만의 빈도의 아미노산들)에 대한 설계의 변형은 예를 들어, 그러한 빈도 비율 미만으로 나타나는 그러한 아미노산들을 서로간에 등몰(equimolar) 농도로 첨가함으로써 가능하며; 따라서 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들의 집합들은 그러한 농도에서의 그러한 아미노산들의 혼합물들을 포함시켜 발생될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들의 집합을 포함하는 합성된 인간 또는 인간화 항체 라이브러리를 제공한다. 합성된 일치 서열들은 인간 게놈 내에서 엔코딩되는 항체들의 구조적 레퍼토리를 포함할 수 있다. 합성된 인간 또는 인간화 항체 라이브러리는 새로운 표적 항원들에 대항하는 특이성들의 원천들로서 사용될 수 있는 항체들 또는 항체 단편들, 바람직하게는 Fv, 이황화물-연결 Fv, 단일 사슬 Fv(scFv) 또는 Fab 단편들에 근거할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 합성된 인간 또는 인간화 항체 라이브러리는 실리코(silico) 내에서 설계되고 합성으로 만들어지는 핵산들에 의하여 엔코딩되는 아미노산 서열들에 근거할 수 있다. 항체 서열의 인 실리코(in silico) 설계는 예를 들어, 인간 서열들의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 구해진 데이터를 이용하는 폴리펩티드 서열을 고안하여 실행된다. 인간 면역글로불린 가변 구역들의 알려진 배선 아미노산 서열들을 분석함으로써, 항체 유전자들은 서열 상동성 및 표준 구조들(Chothia et al., 1992; Tomlinson et al., 1995)에 따라 아과들(sub-families)로 나눠진다. 하나의 아과 내에서의 아미노산 서열 및 표준 구조들의 견지에서 높은 상동성으로 인하여, 7 VH 및 7 VL 일치 서열들(총괄 유전자들(master genes))은 설계되고 조합되어 49 개의 총괄 골격 조합들(master framework combinations)을 발생시킬 수 있다(Knappik et al., 2000). 상기 총괄 유전자들은 모든 기능 모듈들을 플랭킹시키는 독특한 제한 사이트들을 도입함으로써 화학적으로 합성되어 완전한 모듈형 유전자 구조를 발생시킬 수 있다.
인 실리코-발생 서열들을 설계하고 획득하는 방법들이 예를 들어, 여기에 그대로 참고로 포함된 Knappik et al., J. MoI. Biol. (2000) 296:57; Krebs et aL J. Immunol. Methods. (2001) 254:67; 및 Knappik et al.,에게 발행된 U.S. Patent No. 6,300,064에 개시되어 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 핵산 분자들의 집합을 제조하는 방법들을 제공한다. 이는 예를 들어, DNA 분자 각각이 H-CDR3 영역을 엔코딩하고, 그 H-CDR3 영역들이 다양한 범위들에 있는 복수의 DNA 분자들을 합성하여 실행될 수 있다. 본 목적을 위하여, 제 1 범위의 아미노산들의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 DNA 분자들은 제 1 다양성 인자에 따라 합성되고 제 2 범위의 아미노산들의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 DNA 분자들은 제 2 다양성 인자에 따라 합성되며, 상기 다양성 인자들은 상이하다.
일 태양에서, 본 발명은 아미노산들의 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 엔코딩하는 핵산들의 집합을 제공하는 것으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들은 상이하다.
다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 획득하는 방법들도 본 발명 내에서 제공된다. 이는 본 발명에 따라 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 엔코딩하는 핵산들의 집합을 발현시켜 실행될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 주어진 표적과 결합하는 본 발명의 하나 이상의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 하나 이상의 유전자들을 확인하는 방법들을 제공한다. 이는 예컨대, H-CDR3 영역들을 발현시키고 이후 이들을 스크리닝하여 주어진 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 H-CDR3 영역들을 분리시켜서 실행된다. H-CDR3 영역은 항체 가변 중 사슬 내에 포함될 수 있다. 스크리닝은 파지 디스플레이 또는 시스디스플레이(CysDisplay)와 같이 당업자에게 잘 알려진 방법들 중 하나를 이용하여 수행될 수 있다(예컨대 US Pat. No. 6,753,136에 기술됨).
본 발명의 맥락에서, 인간 또는 인간화 항체 라이브러리는 인간 기증자들로 유래된 유전자 단편들을 설계된 합성 DNA와의 조합에 근거할 수 있다. 일례로, 경 사슬 가변 영역 및 중 사슬 영역의 범위를 엔코딩하는 인간-기증자-원천 단편들은 특이적인 사이트들에서 도입되는 다양성을 지닌 인간 항체 서열들을 엔코딩하는 합성 DNA와 조합된다.
본 발명은 또한 여기에 개시된 항체 또는 그 단편으로부터 유래된 돌연변이 또는 최적화된 항체들(또는 그 단편들)을 제공한다. 항체는 2 개의 펩티드 사슬들로 구성되어 있으며, 각각은 1 개(경 사슬) 또는 3 개(중 사슬)의 불변 구역들 및 하나의 가변 영역들 포함하며(VL, VH), 그 중 후자는 각각의 경우에 4 개의 FR 영역들 및 3 개의 사이공간이 있는(interspaced) CDR들로 구성되어 있다. 항원-결합 사이트는 하나 이상의 CDR들에 의하여 형성되지만, FR 영역들은 CDR들에 대한 구조적 골격을 제공하며 항원 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. CDR 또는 FR 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기들을 변경시켜, 당업자는 예를 들어, 새롭거나 개선된 특성의 여부를 위해 항원에 대항하여 스크리닝될 수 있는 돌연변이 되거나 다양화된 항체 서열들을 발생시킬 수 있다.
또한, 여기에 사용된 "면역글로불린"(Ig)은 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 클래스(또는 그들의 임의의 아클래스(subclass))에 속하는 단백질로서 정의되며 기존에 알려진 항체들과 그 기능적 단편들을 모두 포함한다. 항체/면역글로불린의 "기능적 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항원/면역글로불린(예컨대, IgG의 가변 영역)의 단편으로 여기에 정의된다. 통상적으로 항체의 "항원-결합 영역"은 항체의 하나 이상의 초가변(hypervariable) 영역(들), 즉, CDR-1, -2 및/또는 -3 영역들에서 발견된다; 그러나, 가변 "골격(framework)" 영역들은 CDR들에 스케폴드(scaffold)를 제공하는 것과 같은 중요한 역할도 수행할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 가변 경(VL) 사슬의 적어도 4 내지 103 개의 아미노산 잔기들 및 가변 중(VH) 사슬의 적어도 5 내지 109 개의 아미노산 잔기들을 포함하며, 바람직하게는 VL의 3 내지 107 개의 아미노산 잔기들 및 VH의 4 내지 111 개의 아미노산 잔기들을 포함하며, 그리고 완전한 VL 및 VH 사슬들이 특히 바람직하다(VL의 아미노산 위치들 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113; WO 97/08320에 따른 번호부여). 본 발명에 사용을 위한 면역글로불린들의 바람직한 클래스는 IgG이다. 본 발명의 "기능적 단편들"은 F(ab')2 단편, Fab 단편 및 scFv의 구역을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 구역들 사이에서 발생하는 분자간 이황화물 상호작용들을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.
여기에 사용된 "초가변 영역"이라는 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 유래된 아미노산 잔기들(즉, 경 사슬 구역에서의 24-34(L1), 50-56(L2) 및 95-102(L3) 잔기들 및 중 사슬 가변 구역에서의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터 그러한 잔기들(즉, 경 사슬 가변 구역에서의 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중 사슬 가변 구역에서의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). "골격" 또는 "FR" 잔기들은 여기에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기들과는 다른 가변 구역 잔기들이다.
"인간" 항체 또는 기능적 인간 항체 단편은 키메라되지 않으며(즉 "인간화"가 아닌) 인간이 아닌 종으로부터 유래되지(전체 또는 부분적으로) 않은 항체 또는 항체 단편으로 여기에 정의된다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편은 인간으로부터 유래될 수 있거나 합성된 인간 항체일 수 있다. "합성된 인간 항체"는 알려진 인간 항체 서열들의 분석에 근거한 합성된 서열들로부터 전체적으로 또는 부분적으로 인 실리코에 유래된 서열을 가지는 항체로 여기에 정의된다. 인간 항체 서열 또는 그 단편의 인 실리코 설계는 예를 들어, 인간 항체 또는 항체 단편 서열들의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 얻은 데이터를 이용하여 폴리펩티드 서열을 고안하여 실시될 수 있다. 인간 항체 또는 기능적 항체 단편의 다른 예는 인간 기원의 항체 서열들의 라이브러리(즉, 천연적인 인간 원천으로부터 취해진 항체들에 근거한 그러한 라이브러리)로부터 분리된 핵산에 의하여 엔코딩되는 항체 또는 항체 단편이다.
"인간화 항체" 또는 기능적 인간화 항체 단편은 (i) 항체가 인간 배선 서열에 근거한 부분적으로 인간이 아닌 원천(예컨대, 이종성 면역 시스템을 가지는 형질전환 쥐)으로부터 유래되거나; (ii) 키메라된 것으로서, 가변 구역의 적어도 일 부분이 인간이 아닌 기원으로부터 유래되고 불변 구역이 인간 기원으로부터 유래되거나 또는 (iii) CDR-이식(CDR-grafted)으로서, 가변 구역의 CDR들의 적어도 일 부분이 인간이 아닌 기원으로부터 유래된 반면에, 가변 구역의 하나 이상의 골격들은 인간 기원이며 불변 구역(있다고 하더라도)은 인간 기원인 항체 또는 항체 단편으로 여기에 정의된다.

Claims (32)

  1. 아미노산들의 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합(collection)로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜서 발생되는 것을 특징으로 하는 집합(collection).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 H-CDR3 영역들의 적어도 일부는 길이가 약 4 내지 약 22 개의 아미노산들에 이르는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  3. 청구항 2에 있어서,
    아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 13 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 14 내지 약 22 개의 아미노산들인 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내 에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜고 제 3 다양성 인자에 따라 제 3 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들은 상이한 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  5. 청구항 4에 있어서,
    아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 9 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 10 내지 약 16 개의 아미노산들이고 아미노산들의 상기 제 3 범위는 약 17 내지 약 22 개의 아미노산들인 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 3 인자에 따라 제 3 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 4 인자에 따라 제 4 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 5 인자에 따라 제 5 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 6 다양성 인자에 따라 제 6 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들은 상이한 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  7. 청구항 6에 있어서,
    아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 6 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 7 내지 약 9 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 3 범위는 약 10 내지 약 12 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 4 범위는 약 13 내지 약 15 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 5 범위는 약 16 내지 약 18 개의 아미노산들이고 아미노산들의 상기 제 6 범위는 약 19 내지 약 22 개의 아미노산들인 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 3 다양성 인자에 따라 제 3 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 4 다양성 인자에 따라 제 4 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 5 다양성 인자에 따라 제 5 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 6 다양성 인자에 따라 제 6 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 7 다양성 인자에 따라 제 7 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키며, 제 8 다양성 인자에 따라 제 8 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역을 다양화시키고 제 9 다양성 인자에 따라 제 9 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들은 상이한 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  9. 청구항 8에 있어서,
    아미노산들의 상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 5 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 2 범위는 약 6 내지 약 7 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 3 범위는 약 8 내지 약 9 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 4 범위는 약 10 내지 약 11 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 5 범위는 약 12 내지 약 13 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 6 범위는 약 14 내지 약 15 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 7 범위는 약 16 내지 약 17 개의 아미노산들이며, 아미노산들의 상기 제 8 범위는 약 18 내지 약 19 개의 아미노산들이고 아미노산들의 상기 제 9 범위는 약 20 내지 약 22 개의 아미노산들인 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  10. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 4 내지 약 8 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 알라닌이 위치 1에서 약 80%의 빈도 비율 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 3에서 약 40 %의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 7에서 약 50%의 빈도 비율을 가지고 티로신은 위치 8에서 약 40%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  11. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 9 내지 15 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 알라닌이 위치 1에서 약 90%의 빈도 비율 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 70%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 10에서 약 20 %의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 11에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 12에서 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 페닐알라닌은 위치 13에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 14에서 약 40%의 빈도 비율을 가지고 티로신은 위치 15에서 약 40%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  12. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 알라닌이 위치 1에서 약 90%의 빈도 비율 가지며, 아르기닌은 위치 2에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 3에서 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 위치 4에서 약 20 %의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 5에서 약 10%의 빈도 비율을 가지며, 아르기닌은 위치 6에서 약 10%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 7에서 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 15에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 16에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 17에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 18에서 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 티로신은 위치 19에서 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 메티오닌은 위치 20에서 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 위치 21에서 약 95%의 빈도 비율을 가지고 발린은 위치 22에서 약 60%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합..
  13. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 9 내지 약 15 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 상기 제 1 범위 내에서의 적어도 2 개의 아미노산 위치들에서 고 함량의 글리신 및 세린을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  14. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 16 내지 약 22 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 (i) 상기 제 1 범위 내에서의 적어도 하나의 아미노산 위치에서 고 함량의 세린을, (ii) H-CDR3 영역의 말단부에서 고 함량의 염기성 아미노산들을, 그리고 (iii) H-CDR3의 전단부에서 고 함량의 아스파르트산을, 그리고 (iv) 상기 제 1 범위 내에서의 적어도 2 개의 아미노산 위치들에서 고 함량의 방향족 아미노산들을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  15. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 5 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 위치 1에서: 알라닌은 60%의 빈도 비율을 가지며, 트레오닌은 약 20%의 빈도 비율을 가지고 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.58%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 2에서: 아르기닌은 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 라이신은 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 트레오닌은 약 30%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.55%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 3에서: 아스파르트산은 약 40%의 빈도 비율을 가지며, 페닐알라닌은 약 40%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.58%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 4에서: 아스파르트산은 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 메티오닌은 약 30%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.63%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 5에서; 티로신은 약 30%의 빈도 비율을 가지며, 아스파르트산은 약 30%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.58%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  16. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 12 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 위치 1에서: 알라닌은 약 80%의 빈도 비율을 가지고, 트레오닌과 발린은 합쳐서(collectively) 약 15%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 2에서: 아르기닌은 약 70%의 빈도 비율을 가지고, 세린, 트레오닌, 글리신 및 알라닌은 합쳐서 약 30%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 9에서: 알라닌, 세린 및 티로신은 합쳐서 약 20%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.63%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 10에서: 페닐알라닌은 약 60%의 빈도 비율을 가지며, 메티오닌은 약 10%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.58%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 11에서: 아스파르트산은 약 80%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 약 5%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.58%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위 치 12에서: 티로신은 약 50%의 빈도 비율을 가지며, 발린 및 이소류신은 합쳐서 약 10%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.63%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  17. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 1 범위는 약 20 개의 아미노산들이며, 상기 제 1 다양성 인자는 위치 1에서: 알라닌은 약 100%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 2에서: 아르기닌은 약 50%의 빈도 비율을 가지고, 라이신은 약 50%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 다양성 인자는 위치 3에서: 글리신은 합쳐서 약 30%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.55%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 4에서: 아르기닌은 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 글리신은 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 류신은 약 20%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.63%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 다양성 인자는 위치 14에서: 세린은 약 20%의 빈도 비율을 가지며, 트레오닌은 약 20%의 빈도 비율을 가지고, 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.63%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 제 1 다양성 인자는 위치 21에서: 아스파르트산은 약 95%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하며; 상기 다양성 인자 위치 22에서: 발린은 약 50%의 빈도 비율을 가지고 시스테인을 제외한 다른 모든 아미노산들은 약 0.55%의 빈도 비율을 가질 것을 필요로 하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합.
  18. 청구항 1에 따른 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬들의 집합.
  19. 청구항 18에 따른 인간 또는 인간화 항체 가변 중 사슬들의 집합을 포함하는 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들의 집합.
  20. 청구항 19에 EKfms 다양한 인간 또는 인간화 항체들 또는 그 기능적 단편들의 집합을 포함하는 합성된 인간 또는 인간화 항체 라이브러리.
  21. 복수개의 DNA 분자들을 합성하는 단계를 포함하는, 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 핵산 분자들의 집합을 제조하는 방법으로서, 각각의 DNA 분자는 H-CDR3 영역을 엔코딩하며, 상기 H-CDR3 영역들은 다양한 범위들이며, 제 1 범위의 아미노산들의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 DNA 분자들은 제 1 다양성 인자에 따라 합성되며, 제 2 범위의 아미노산들의 H-CDR3 영역들을 엔코딩하는 DNA 분자들은 제 2 다양성 인자에 따라 합성되며, 상기 다양성 인자들은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 21의 방법에 의하여 생성된 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 엔코딩하는 핵산들의 집합.
  23. 아미노산들의 다양한 범위들의 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 엔코딩하는 핵산들의 집합으로서, 상기 집합의 다양성은 제 1 다양성 인자에 따라 제 1 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시키고 제 2 다양성 인자에 따라 제 2 범위의 아미노산들 내에서 임의의 길이를 가지는 H-CDR3 영역들을 다양화시켜 발생되며, 상기 다양성 인자들은 상이한 것을 특징으로 하는 핵산들의 집합.
  24. 청구항 22 또는 23에 따른 핵산들의 상기 집합을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1에 따른 다양한 인간 또는 인간화 항체 H-CDR3 영역들의 집합을 획득하는 방법.
  25. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 4 내지 8 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 4 내지 8 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2 또는 3 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  26. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 9 내지 10 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 9 내지 10 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2 또는 3 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  27. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 11 내지 13 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 11 내지 13 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2 또는 3 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  28. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 14 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 14 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  29. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 15 내지 16 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 15 내지 16 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  30. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 16 내지 17 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 16 내지 17 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  31. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 18 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 18 개의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
  32. 청구항 1에 있어서,
    상기 집합의 요소들이 19 개의 아미노산들의 길이를 가지면, 19 개 이상의 아미노산들의 상기 길이를 가지는 상기 요소들에 적용되는 상기 다양성 인자(들)은 상기 길이를 가지는 상기 요소들의 상기 H-CDR3 영역들 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 불변 아미노산 위치들을 정의하는 것을 특징으로 하는 다양한 인간 또는 인간화 H-CDR3 영역들의 집합.
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