CN105274630A - 基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及合成氨基酸变化可控的人源化抗体库的方法，包括：按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3′端的一段序列，直至产生氨基酸变化位点；将中间产物全部收集起来；根据设计的序列要求混合，按比例分组，达到变化数量的可控性；再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；收集中间产物，重新混合均匀，直至产生氨基酸变化位点；根据设计的序列要求，按照上述步骤完成待合成DNA序列和5′端全长序列的合成；重复1-3的步骤产生氨基酸任意位点的任意变化和任意变化的数量的可能性。本发明的方法可控性更强，灵活性高，无突变，合成的人源化抗体库的库容量大。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其是组合合成技术，具体涉及一种基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法与应用。
背景技术
抗体是机体受抗原刺激后由B淋巴细胞产生，能特异性结合或识别入侵的病源微生物，是体液免疫应答中发挥免疫功能的最主要的免疫分子，主要分布于血清中。抗原往往具有多种不同抗原决定簇，从而刺激机体产生多克隆抗体；这种抗体是不均一的，会影响检测抗原的特异性及敏感性，在临床上应用受到很大限制。
20世纪70年代中期B淋巴细胞杂交瘤技术问世，由此制备出的单克隆抗体是抗单个抗原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且亲和力强、效价高，在临床上发挥了重要作用。然而，单克隆抗体在临床和生产中也存在一些问题，主要包括单克隆抗体具有免疫原性，半衰期短，生产复杂，价格较高等问题。
随着人们对抗体基因结构与功能的深入了解和分子生物学技术的发展，应用DNA重组和蛋白质工程技术可以按人们的意愿在基因水平上对抗体分子进行切割，拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子，并赋予抗体分子新的生物学活性。因此基因工程抗体比天然抗体具有更广阔的应用前景。
例如，为了解决抗体的穿透性问题，可对抗体进行改造，保留其抗原结合位点，使之成为小分子抗体如单链抗体：将抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)用连接肽(linker)连接，形成具有抗原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体(singlechainvariablefragment，ScFv)，单链抗体的大小仅为完整抗体的1/6，免疫原性弱，药物动力学优于Fab片段和完整抗体，能有效到达完整抗体无法到达的靶部位。因此单链抗体是目前报道最多，也最有发展前景的基因工程抗体。
单克隆抗体技术是21世纪以来生物医药领域最为热门的研究方向之一，单抗类药物直接与抗原(致病因子、肿瘤细胞等)发生特异性结合，与传统化学药物给药相比，其在临床上具有靶向性、副作用小、疗效高、抗药性小等优势。在过去十几年中，全球单抗药物市场增长迅速，2012年全球单抗药物上市品种46个，市场总额约570亿美金,占同期全球药品市场份额的6.7％。由于单抗药物相对于化疗药物的优势明显，靶向治疗的理念越来越被接受，其强劲的市场需求成为全球制药企业争夺的焦点，目前几乎所有大型制药公司都有单克隆抗体研发项目。
传统单抗制备利用杂交瘤技术，通过脾细胞融合得到稳定单抗株，至少需要花费数月时间，并且单抗筛选范围相对窄，严重影响了高亲和力人源单抗的制备。传统单抗本身都是鼠源单抗，鼠抗体的人源化虽然已有很多成功的报道，也有得到批准上市的抗体，但仍然存在以下问题：难以避免人抗鼠抗体反应，并且在鼠抗人源化过程中亲和力下降、稳定性降低。
近几年，随着多种生物展示技术的发展，定制抗体库技术得到了一个跳跃式的进步。因为定制抗体库方法具有以下优点：定制抗体库方法简单快速，避免了因杂交瘤的不稳定而导致的反复亚克隆；通过定制人源基因框架，完全避免了人源化改造的难题；具有外筛选功能，那些因机体免疫耐受机制而不能反应和增殖的针对自身抗原和毒性分子的抗体，通过抗体库来进行研究和利用也成为了可能。随着分子生物学的发展，定制抗体库本身的随机化和库容量大的特点也越来越完善，因此构建库容量相对较大，高亲和力抗体含量相对较高的人源化抗体库将是各大药厂和研究者的追求目标。
现在常用的定制抗体库技术，对于库容要求低，突变位点少的情况，利用简并合成结合有效的筛选手段即可达到要求。但是此方法会引入无关突变或者终止密码子,造成需要合成较长的序列时肽库质量明显下降，因此无法应用于突变位点多，或者简并位点涉及的氨基酸种类较多的情况,更无法满足完全随机化的要求。一些改进的方案，例如(NNK)n、(NNB)n和(VNN)n方案，其中N＝A、T、C或G；K＝T或G；B＝G、C或T；V＝A、G或C，在一定程度上增加了多样性并减少了终止密码子的参入，但因编码氨基酸的各种密码子在各改进方案中出现的频率差异较大，在化学合成中各种亚磷酸酰胺单体在合成中会存在一定的竞争活性差异，使得所合成序列的氨基酸组成偏向性难以控制，这种氨基酸组成偏向性随目的序列的长度增加而更为明显。利用多核苷酸(双核苷酸或三核苷酸)代替单核苷酸单体合成，特别是三核苷酸的合成方式则优点突出，它以三联体密码子为单位进行合成，形成20种合成单元，利用这20种三联体合成单元的随机组合进行合成,就可以随意调控特定位点参入氨基酸的种类和数量，从而避免了序列随机化以及无关氨基酸和终止密码子的加入，但这种方法中使用的三联体原料非常昂贵，而且这种原料在化学合成中的耦合效率很低，所以在实际操作中绝大多数实验室难以实现。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法与应用，基于组合合成(permutation)技术合成人源化基因工程抗体文库，该技术通过把组合合成数学模型应用于基因合成过程，解决了常规合成过程中偏向性严重的问题；可以根据特定的需求随意的调整氨基酸的种类和数量，达到序列高度随机化、订制化的需求，并且避免无关氨基酸和终止密码子加入，这些特点使其成为一种灵活性和可控性都很高的蛋白文库合成方式。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其包括以下步骤：
第一步：设计人源化抗体库：在预构建的人源化抗体库中的合成序列中，在任意位置或者任意比例引入氨基酸；
第二步：组合合成随机引物库:在氨基酸变化区域，根据反向中心法则和DNA编码规则，设计对应的DNA序列，通过DNA固相亚磷酰胺三酯法合成随机的引物库；
第三步：构建人源化重组抗体库：在扩增体系中加入第二步中获得的引物库中的引物，进行扩增，扩增产物进行酶切后连入载体，获得人源化重组抗体库；
第二步中所述的组合合成随机引物库，包括以下几步：
(1)按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3′端的一段序列，直至产生氨基酸变化位点；
(2)将(1)中合成的中间产物全部收集起来；
(3)根据设计的序列要求混合，按比例分组，从而达到变化数量的可控性；
(4)再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；
(5)根据氨基酸变化位点按照(2)-(4)中的收集、混合分组、合成方法完成所有氨基酸变化位点；
(6)收集(5)中合成的中间产物后无需分组，直接合成5’端一段非氨基酸序列；
根据设计的序列要求，按照所述(1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5′端全长序列的合成。
优选地，第一步所述的设计人源化抗体库，包括：
合成人抗体重链可变区CDR3的序列，构建CDR3库在任意位置或者任意比例引入氨基酸，引入氨基酸原则按照组合合成方式，将氨基酸平均分配或者根据需要的比例引入；
然后将所述氨基酸序列编码后开始合成；
再根据已经公布的氨基酸在哺乳动物、大肠杆菌和酵母菌表达系统中密码子的偏好性，选取密码子出现频率最高的作为编码位点。
优选地，在哺乳动物、大肠杆菌、酵母菌表达系统中氨基酸对应的密码子序列为：
| 氨基酸名称 | Human | Ecoli | Yeast |
| phe | UUC | UUC | UUU |
| Leu | CUG | CUG | UUG |
| Ile | AUC | AUC | AUU |
| Val | GUG | GUU | GUU |
| Ser | AGC | UCU | UCU |
| Pro | CCC | CCG | CCA |
| Thr | ACC | ACU | ACU |
| Ala | GCC | GCU | GCU |
| Tyr | UAC | UAC | UAU |
| His | CAC | CAU | CAU |
| Gln | CAG | CAG | CAA |
| Asn | AAC | AAC | AAU |
| Lys | AAG | AAA | AAA |
| Asp | GAC | GAC | GAU |
| Glu | GAG | GAA | GAA |
| Arg | AGA | CGU | AGA |
| Gly | GGC | GGU | GGU |
| Cys | UGC | UGC | UGU |
。
优选地，第三步中所述构建人源化重组抗体库包括：
构建人源化重组抗体库扩增使用引物为：
VH1F:5′-GGTACCAGTCAGGAGCAGAAGTGAAGAAGCC-3′，
VH1R:5′-GCTAGCGCTGGACACTGTCACCAGTGTTCCC-3′，
以如下扩增体系和扩增调节进行扩增：
| 体系组分 | 用量(μl) |
| 20μmol/L的VH1F | 1 |
| 20μmol/L的VH1R | 1 |
| 5μmol/L的正向单链模板 | 2 |
| 10×PCR缓冲液 | 4 |
| 10mmol/L的dNTPs | 2 |
| TaqDNA聚合酶 | 3U |
| ddH2O | 补充至50 |
| 总量 | 50 |
| 温度(℃) | 时间(S) | 循环 |
| 94 | 300 | -- |
| 94 | 30 | -- |
| 50 | 40 | -- |
| 72 | 40 | 25cycles |
| 72 | 420 | -- |
然后将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，柱离心回收，用KpnI和NotI双酶切消化，连入相应载体，测序。
优选地，构建人源化抗体库在哺乳动物表达系统中相应的载体为pcDNA3.1。
优选地，构建人源化抗体库在大肠杆菌和酵母菌表达系统中相应的载体分别为PET-32a和PYD1。
优选地，所述组合合成应用于小分子肽库、蛋白质合成、酶工程改造、合成抗体库、体外定点突变、合成核苷酸库中。
本发明的有益效果是:
其一、本发明将数学模型应用于基因合成，氨基酸组成无偏好性，可以根据特定的需求随意调整氨基酸的种类和数量，序列高度随机化、定制化，并且避免无关氨基酸和终止密码子加入。
其二、本发明将组合合成技术应用在合成人源化基因工程抗体文库平台上，大大减少对高亲和力、高特异性的抗体进行前期筛选所需的时间，加快抗体药物的研发速度，并且，因为文库的主架结构完全来源于人免疫系统通用序列，所筛选出的抗体序列本身免疫原性很低，可直接用于产生体内诊断或治疗的人源抗体的下一步研究及应用。
其三、本发明的方法可控性更强，灵活性高，无突变，合成的人源化抗体库的库容量大。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中公开了一种基于组合合成技术的氨基酸变化形式与数量均可控制的人源化抗体库的制备方法，本实施例以人抗体重链可变区(VH1)CDR3的序列为例。
1、设计人源化抗体库(VH1)
人的胚系抗体基因VH1家族，其基因序列已知而且在免疫应答反应中该基因家族的利用率高，本实施例中，以人抗体重链可变区(VH1)CDR3的序列合成为例，构建CDR3库需要在任意位置或任意比例方便的引入氨基酸；本实施例中待合成序列的氨基酸序列用单字母氨基酸表示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS,为减少分组数目，其中X表示14个随机氨基酸，按照组合合成方式一般各氨基酸平均分配或视需要以特定比例参入。
本实施例中要求7-11位的苯丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，精氨酸，脯氨酸五种氨基酸按照百分比为20：20：20：20：20的比例参入和要求13-14位的酪氨酸，精氨酸以百分比为80：20的比例参入。
将X序列按表1的方式编码后开始合成，根据已经公布的氨基酸在哺乳动物，大肠杆菌和酵母表达系统中密码子的偏好性，选取密码子出现频率最高的作为本发明的编码位点，具体信息如表1所示。另外，本实施例中的设计方案同样适用于人源化抗体库在大肠杆菌和酵母表达系统中的应用。
表1人、大肠杆菌、酵母表达系统中氨基酸对应的密码子序列
| 氨基酸名称 | Human | Ecoli | Yeast |
| phe | UUC | UUC | UUU |
| Leu | CUG | CUG | UUG |
| Ile | AUC | AUC | AUU |
| Val | GUG | GUU | GUU |
| Ser | AGC | UCU | UCU |
| Pro | CCC | CCG | CCA |
| Thr | ACC | ACU | ACU |
| Ala | GCC | GCU | GCU |
| Tyr | UAC | UAC | UAU |
| His | CAC | CAU | CAU |
| Gln | CAG | CAG | CAA |
| Asn | AAC | AAC | AAU |
| Lys | AAG | AAA | AAA |
| Asp | GAC | GAC | GAU |
| Glu | GAG | GAA | GAA |
| Arg | AGA | CGU | AGA |
| Gly | GGC | GGU | GGU |
| Cys | UGC | UGC | UGU |
2、人源化重组抗体库的组合合成
组合合成策略的基础是在氨基酸变化区域，根据反向中心法则和DNA编码规则，设计对应的DNA序列，通过DNA固相亚磷酰胺三酯法合成所需的随机引物库。
DNA的固相亚磷酸酰胺三酯法合成过程包括：脱保护-活化和连接-封闭-氧化五个步骤。具体的，本实施例中的设计策略所产生的随机引物库制备包括：
(1)按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3′端的一段序列，直至产生氨基酸变化位点；
(2)将(1)中合成的中间产物全部收集起来；
(3)根据设计的序列要求混合，按比例分组，从而达到变化数量的可控性；
(4)再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；
(5)根据氨基酸变化位点按照(2)-(4)中的收集、混合分组、合成方法完成所有氨基酸变化位点；
(6)收集(5)中合成的中间产物后无需分组，直接合成5’端一段非氨基酸序列；
根据设计的序列要求，按照上述(1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5′端全长序列的合成。
3、人源化重组抗体库的构建
扩增使用的引物为：
VH1F:5′-GGTACCAGTCAGGAGCAGAAGTGAAGAAGCC-3′，
VH1R:5′-GCTAGCGCTGGACACTGTCACCAGTGTTCCC-3′，其中下划线位置表示酶切位点。
扩增体系和扩增条件如表2和表3中所示。
表2扩增体系表
| 体系组分 | 用量(μl) |
| 20μmol/L的VH1F | 1 |
| 20μmol/L的VH1R | 1 |
| 5μmol/L的正向单链模 | 2 |
| 10×PCR缓冲液 | 4 |
| 10mmol/L的dNTPs | 2 |
| TaqDNA聚合酶 | 3U |
| ddH2O | 补充至50 |
| 总量 | 50 |
表3扩增条件表
| 温度(℃) | 时间(S) | 循环 |
| 94 | 300 | -- |
| 94 | 30 | -- |
| 50 | 40 | -- |
| 72 | 40 | 25cycles |
| 72 | 420 | -- |
在50μL扩增体系中加入20μmol/L的引物VH1F和VH1R各1μL,加入合成的5μmol/L正向单链模板2μL、10×PCR缓冲液4μL、10mmol/LdNTPs2μL、TaqDNA聚合酶3U,加H2O补至50μL。
94℃预变性5min，以94℃变性30s,50℃退火40s,72℃延伸40s的条件扩增25个循环，最后在72℃延伸7min，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，柱离心回收，用KpnI和NotI双酶切消化，连入相应载体，测序。
在本实施例中，构建人源化抗体库在哺乳动物(尤其是人的)表达系统中相应的载体为pcDNA3.1。
构建人源化抗体库在大肠杆菌和酵母菌表达系统中相应的载体可以是PET-32a和PYD1。
本实施例中的组合合成技术可以应用于小分子肽库、蛋白质合成、酶工程改造、合成抗体库、体外定点突变、合成核苷酸库中。
将构建完成的载体进行测序，测序是按照BigDyeV3.1试剂盒使用说明操作，取20μL测序体系，测序体系如表4中所示：
表4测序体系
| 体系组分 | 用量(μl) |
| DNA | 1 |
| BigDye | 8 |
| 引物(3.2pmol/μL) | 1 |
| ddH2O | 10 |
| 总量 | 20 |
测序PCR热循环条件如表5中所示：
表5测序PCR条件表
| 温度(℃) | 时间(S) | 循环 |
| 96 | 60 | -- |
| 96 | 10 | 25cycles |
| 50 | 5 | 25cycles |
| 60 | 240 | 25cycles |
| 4 | 保温 | -- |
反应结束后，用酒精沉淀纯化，具体步骤如下：
(1)每管加入2μL125mMEDTA到管底，每管加入2μL3MNaAc到管底。
(2)每管加入50μL100％酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15min。
(3)1400-2000xg离心45min或者2000-3000xg离心30min，马上倒置96孔板，离心至185xg停止离心(从离心机启动到达到185xg停止离心总共1min时间)。
(4)每管加入70μL70％酒精，1650xg4℃离心15min；马上倒置96孔板，离心至185xg停止离心(从离心机启动到达到185xg停止离心总共1min时间)。
(5)重复第4步1次。
(6)室温挥发净酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；或者铝箔密封后于4℃保存。
(7)溶解后的样品需要在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min后，上样电泳。
(8)ABI3730XL进行测序。
实施例2
实施例2是利用实施例1中公开的方法，在哺乳动物表达系统中按需求比例合成特定要求的氨基酸。
1、设计人源化抗体库(VH1)
人的胚系抗体基因VH1家族，其基因序列已知而且在免疫应答反应中该基因家族的利用率高，本实施例中，以人抗体重链可变区(VH1)CDR3的序列合成为例，构建CDR3库需要在任意位置或任意比例方便的引入氨基酸；本实施例中待合成序列的氨基酸序列用单字母氨基酸表示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS,为减少分组数目，其中X表示14个随机氨基酸，按照组合合成方式一般各氨基酸平均分配或视需要以特定比例参入。
本实施例中要求7-11位的苯丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，精氨酸，脯氨酸五种氨基酸按照百分比为20：20：20：20：20的比例参入，氨基酸密码子序列表如实施例1中的表1所示。
2、人源化重组抗体库的组合合成
包括以下步骤：
(1)按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3′端的一段序列，直至产生氨基酸变化位点；
(2)将(1)中合成的中间产物全部收集起来；
(3)根据设计的序列要求混合，按比例分组，从而达到变化数量的可控性；
(4)再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；
(5)根据氨基酸变化位点按照(2)-(4)中的收集、混合分组、合成方法完成所有氨基酸变化位点；
(6)收集(5)中合成的中间产物后无需分组，直接合成5’端一段非氨基酸序列；
根据设计的序列要求，按照上述(1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5′端全长序列的合成。
3、人源化重组抗体库的构建
扩增使用的引物为：
VH1F:5′-GGTACCAGTCAGGAGCAGAAGTGAAGAAGCC-3′
VH1R:5′-GCGGCCGCGCTGGACACTGTCACCAGTGTTCCC-3′，其中下划线位置表示酶切位点。
在50μL扩增体系中加入20μmol/L的引物VH1F和VH1R各1μL,加入合成的5μmol/L正向单链模板2μL、10×PCR缓冲液4μL、10mmol/LdNTPs2μL、TaqDNA聚合酶3U,加H2O补至50μL。
94℃预变性5min，以94℃变性30s,50℃退火40s,72℃延伸40s的条件扩增25个循环，最后在72℃延伸7min，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，柱离心回收，用KpnI和NotI双酶切消化，连入相应载体(如pcDNA3.1(+))，将构建完成的载体进行测序。
将构建完成的载体进行测序，测序是按照BigDyeV3.1试剂盒使用说明操作，具体测序方法同实施例1中一致。
实施例2中构建的可控人源化抗体库的结构分析：
为评价利用组合合成(Permutation)技术合成的文库多样性和效率，对实施例2中的14个编码位点的氨基酸出现频率进行了统计，出现率为出现次数与氨基酸总数的比值。因为上述简并区域各序列之间以及位置间的关系都是对等的，所以可以将18条序列的14个位点进行统一计数，对18种氨基酸在252个位点的出现频率统计显示18种设计的氨基酸都已出现，无终止密码子出现，本方法要求在7-11位的苯丙氨酸，亮氨酸，酪氨酸，精氨酸，脯氨酸5种氨基酸以百分比为20：20：20：20：20出现。
实施例3
实施例3采用实施例1中公开的方法，在酵母表达系统中按特定比例合成氨基酸。
1、人源化抗体库(VH1)的设计
人的胚系抗体基因VH1家族，其基因序列已知而且在免疫应答反应中该基因家族的利用率高，合成人抗体重链可变区(VH1)CDR3的序列，待合成序列的氨基酸序列用单字母氨基酸表示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS,为减少分组数目，其中X表示14个随机氨基酸，要求X第13-14位的酪氨酸，精氨酸以百分比为80：20的比例参入，氨基酸密码子序列见实施例1中的表1。
2、人源化重组抗体库的组合合成
(1)按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3′端的一段序列，直至产生氨基酸变化位点；
(2)将(1)中合成的中间产物全部收集起来；
(3)根据设计的序列要求混合，按比例分组，从而达到变化数量的可控性；
(4)再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；
(5)根据氨基酸变化位点按照(2)-(4)中的收集、混合分组、合成方法完成所有氨基酸变化位点；
(6)收集(5)中合成的中间产物后无需分组，直接合成5’端一段非氨基酸序列；
根据设计的序列要求，按照上述(1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5′端全长序列的合成。
3、人源化重组抗体库的构建
扩增使用的引物为：
VH1F:5′-GGTACCAGTCAGGAGCAGAAGTGAAGAAGCC-3′；
VH1R:5′-GCGGCCGCGCTGGACACTGTCACCAGTGTTCCC-3′；其中下划线位置表示酶切位点。
在50μL扩增体系中加入20μmol/L的引物VH1F和VH1R各1μL,加入合成的5μmol/L正向单链模板2μL、10×PCR缓冲液4μL、10mmol/LdNTPs2μL、TaqDNA聚合酶3U,加H2O补至50μL。
94℃预变性5min，以94℃变性30s,50℃退火40s,72℃延伸40s的条件扩增25个循环，最后在72℃延伸7min，扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，柱离心回收，用KpnI和NotI双酶切消化，连入相应载体(如PYD1载体)，将构建完成的载体进行测序。
在实施例3中对构建完成的载体进行测序的方法如实施例1中的测序方法一致。
对实施例3中的结果测试：
使用Taq酶扩增此复杂模板时效率和特异性都很好，对连入载体的18个序列进行测序，将18条序列的14个位点进行统一计数，对18种氨基酸在252个位点的出现频率统计显示18种设计的氨基酸都已出现，无终止密码子出现，每种氨基酸的出现率都接近均值。要求在13-14位酪氨酸，精氨酸以百分比为80：20的比例都已参入，与设计方案相符。
与常规的简并合成方式相比，分组式合成在完全随机化以及选择性参入等方面的优点是显而易见的。实施例1-3中分组式与以三联体核苷酸为原料的合成方法相比，因成本低更易于推广。
序列分析表明，分组式合成法可以克服单纯的简并设计引入的氨基酸组成偏歧，特别是从根本上避免了终止密码子的出现，因为分组式合成可以视需要通过控制分组时载体的质量来控制各种氨基酸参入的比例，所以能更好地反映各种肽库的天然性质，体现出分组法的灵活性和可控性。
本发明将数学模型应用于基因合成，氨基酸组成无偏好性，可以根据特定的需求随意调整氨基酸的种类和数量，序列高度随机化、定制化，并且避免无关氨基酸和终止密码子加入。
本发明将组合合成技术应用在合成人源化基因工程抗体文库平台上，大大减少对高亲和力、高特异性的抗体进行前期筛选所需的时间，加快抗体药物的研发速度，并且，因为文库的主架结构完全来源于人免疫系统通用序列，所筛选出的抗体序列本身免疫原性很低，可直接用于产生体内诊断或治疗的人源抗体的下一步研究及应用。
本发明的方法可控性更强，灵活性高，无突变，合成的人源化抗体库的库容量大。
在本发明中上述的“序列”代表着聚合物中单体的排列顺序，比如氨基酸残基在多肽中的排列或者核苷酸在多核甘酸序列中的排列顺序，上述的“核苷酸序列”“核酸”或者“多核苷酸”指的是单链或者双链中的脱氧核糖核苷酸，核酸序列是由自然的核苷酸A,T,C,G或者其他合成的自然碱基的类似物组成，本发明中，腺嘌呤缩写为A,鸟嘌呤缩写为G,胞嘧啶缩写为C,胸腺嘧啶缩写为T。多核酸序列可以是单链或者双链，若无特别说明，多核苷酸也包括了较长的核苷酸或较短的核苷酸，比如寡核苷酸。本发明采用传统的标记方法来描述多核苷酸序列，单链和左端为5′端，双链的左端为正链5′端，从5′到3′的方向代表着转录起始的方向，与mRNA具有相同序列信息的链也被称作编码链，靠近编码链的5′序列被称为上游序列，而在靠近3′端的称为下游序列。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其包括以下步骤：
第一步：设计人源化抗体库：在预构建的人源化抗体库中的合成序列中，在任意位置或者任意比例引入氨基酸；
第二步：组合合成随机引物库:在氨基酸变化区域，根据反向中心法则和DNA编码规则，设计对应的DNA序列，通过DNA固相亚磷酰胺三酯法合成随机的引物库；
第三步：构建人源化重组抗体库：在扩增体系中加入第二步中获得的引物库中的引物，进行扩增，扩增产物进行酶切后连入载体，获得人源化重组抗体库；
其特征在于，
第二步中所述的组合合成随机引物库，包括以下几步：
(1)按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3′端的一段序列，直至产生氨基酸变化位点；
(2)将(1)中合成的中间产物全部收集起来；
(3)根据设计的序列要求混合，按比例分组，从而达到变化数量的可控性；
(4)再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；
(5)根据氨基酸变化位点按照(2)-(4)中的收集、混合分组、合成方法完成所有氨基酸变化位点；
(6)收集(5)中合成的中间产物后无需分组，直接合成5’端一段非氨基酸序列；
根据设计的序列要求，按照所述(1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5′端全长序列的合成。
2.根据权利要求1所述的基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其特征在于，第一步所述的设计人源化抗体库，包括：
合成人抗体重链可变区CDR3的序列，构建CDR3库在任意位置或者任意比例引入氨基酸，引入氨基酸原则按照组合合成方式，将氨基酸平均分配或者根据需要的比例引入；
然后将所述氨基酸序列编码后开始合成；
再根据已经公布的氨基酸在哺乳动物、大肠杆菌和酵母菌表达系统中密码子的偏好性，选取密码子出现频率最高的作为编码位点。
3.根据权利要求2所述的基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其特征在于，在哺乳动物、大肠杆菌、酵母菌表达系统中氨基酸对应的密码子序列为：
。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其特征在于，第三步中所述构建人源化重组抗体库包括：
构建人源化重组抗体库扩增使用引物为：
VH1F:5′-GGTACCAGTCAGGAGCAGAAGTGAAGAAGCC-3′，
VH1R:5′-GCTAGCGCTGGACACTGTCACCAGTGTTCCC-3′，
以如下扩增体系和扩增调节进行扩增：
然后将扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，柱离心回收，用KpnI和NotI双酶切消化，连入相应载体，测序。
5.根据权利要求4所述的基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其特征在于，构建人源化抗体库在哺乳动物表达系统中相应的载体为pcDNA3.1。
6.根据权利要求4所述的基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其特征在于，构建人源化抗体库在大肠杆菌和酵母菌表达系统中相应的载体包括PET-32a和PYD1。
7.一种权利要求1、2、3、5、6任意一项中所述的基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法的应用，其特征在于，所述组合合成应用于小分子肽库、蛋白质合成、酶工程改造、合成抗体库、体外定点突变、合成核苷酸库中。
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