CN116251181B - 一种抗tslp单克隆抗体的注射制剂 - Google Patents

一种抗tslp单克隆抗体的注射制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，所述注射制剂包括：抗TSLP单克隆抗体、缓冲盐、蛋白保护剂和表面活性剂；其中，所述注射制剂的pH值为5.5‑6.5。本发明提供的注射制剂通过缓冲盐、蛋白保护剂、表面活性剂相互作用，协同配合，为抗TSLP单克隆抗体提供了良好的存储环境，在贮存和运输过程中，能有效降低制剂中聚集物和降解物的生成速率，提高抗体的物理稳定性，确保活性的同时降低潜在的安全性风险；本发明制剂制备工艺简单，成本低廉，为高浓度的抗TSLP单克隆抗体提供了稳定的制剂环境，有效保证了蛋白的可溶性和体液平衡(pH)以及血液等渗性，可延长抗体制剂的保存期。

Description

一种抗TSLP单克隆抗体的注射制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗TSLP单克隆抗体的注射制 剂。
背景技术
哮喘(asthma)为一种肺部疾病，其特征为可逆性气道阻塞，气道炎症和对 多种刺激的气道反应性增高。哮喘的气道阻塞由联合因素所致，包括有：气道平 滑肌痉挛、气道黏膜水肿、黏液分泌增加、气道壁细胞(尤其是嗜酸性细胞和淋巴细胞)浸润、气道上皮损伤和脱屑。目前哮喘已成为全球最常见的慢性疾病之 一，严重哮喘患者使用现有的治疗方法很难控制，而且治疗费用巨大。
截止目前，哮喘治疗的药物中，化药品种琳琅满目，可获批的生物药寥寥无 几。粗略统计目前已获批上市的哮喘药物中，生物药占比远不足13％，随着生物 药的不断发展，针对哮喘的生物药研发不断被人们关注。
在重度哮喘患者中，有超过三分之二的患者T2炎症驱动(T2高)，其典型 特征是T2炎性生物标志物水平升高，诊断和预测性生物标记物(包括血液嗜酸性粒细胞、血清IgE和呼出气一氧化氮(FeNO)、Periostin等)的鉴定，使重症 哮喘的靶向治疗领域发生了革命性的变化。胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP (Thymic stromal lymphopoietin)是一种针对促炎性刺激(例如肺内过敏原、病 毒及其他病原体)产生的上皮细胞因子，具有增强胸腺细胞增生的作用。TSLP 驱动下游T2细胞因子的释放，包括IL-4、IL-5和IL-13，导致炎症和哮喘症状。 TSLP也能激活参与非T2驱动炎症的多种类型细胞。因此，TSLP在炎症级联反 应的早期上游活动已被确定为在广泛哮喘患者群体中的一个潜在靶点。
同时，TSLP通过激活未成熟DC、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜 酸性粒细胞来调节免疫。抗TSLP的人源化单克隆抗体能够特异性地结合人TSLP 并阻断其与受体复合物的相互作用，由此阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎 性细胞因子，从而防止哮喘发作并改善哮喘控制。目前，阿斯利康及其合作伙伴 安进公司的Tezepelumab(又名AMG157)是首个靶向TSLP的单克隆抗体药物， 但目前仍未上市，通过临床研究显示，抗TSLP的人源化单克隆抗体作用于炎症 级联反应的早期上游，适用于广泛的重症不受控哮喘患者，包括非T2驱动的哮 喘患者，在轻度、特应性哮喘患者中开展的一项概念验证吸入性过敏原挑战研究 证实，证明其能够抑制早期和晚期的哮喘反应，并降低T2炎症生物标志物水平。 鉴于TSLP靶点药物在哮喘治疗上的重要性，为了满足国内外哮喘患者的需求，急需开发针对哮喘具有单独治疗或者辅助治疗的单克隆抗体治疗药物。
此外，抗体药物在形成制剂或存储过程中，很容易发生变性、聚集和沉淀等， 保持蛋白的结构稳定是发挥它们生物学活性的最基本要求，这些降解及聚集的产 物会对生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的 免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡，此外，单抗类药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存和使 用过程中保持结构稳定，所以针对TSLP靶点药物研发过程中同时需要对其制剂 条件进行摸索，从而研发一种更加适应抗TSLP单克隆抗体的注射制剂。
发明内容
为了能够保证抗TSLP单克隆抗体在长期储存、运输等过程中的长期稳定性， 本发明专门提供了一种针对抗TSLP单克隆抗体的注射制剂。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，所述注射制剂包括：
其中，所述注射制剂的pH值为5.5-6.5。
本发明的目的是提供了一种专门针对抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，该制 剂是通过皮下注射途径给药，该注射制剂中包括不同含量的单克隆抗体、缓冲盐、 蛋白保护剂和表面活性剂，各成分协同配合，有效保证了高浓度的抗TSLP单克 隆抗体的稳定性、粘度和渗透压，进而保证了制剂在存放、运输和使用过程中的 长期稳定性和药效。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体的蛋白含量为120-150mg/mL；所述抗 TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别 用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，所述轻链可变区包括3 个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述抗TSLP单克 隆抗体选自以下任意一种：
A-Ⅰ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列， 所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定 区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2 包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-Ⅱ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列， 所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定 区LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2 包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如 SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-Ⅲ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列， 所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定 区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2 包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如 SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；
A-Ⅳ：所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列， 所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定 区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR2 包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区LCDR3包含如 SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
本发明通过对免疫文库的筛选得到上述4种能够与TSLP抗原高亲和力结合 的单克隆抗体分子，而且结合活性较好，从而阻断其与受体复合物的相互作用， 进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子，防止哮喘发作并改善哮 喘控制，此外，本发明筛选得到的单克隆抗体分子还具有较高的热稳定性，满足成药条件。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子选 自以下任意一种：
MA-Ⅰ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻 链可变区包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；
MA-Ⅱ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述轻 链可变区包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列；
MA-Ⅲ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻 链可变区包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；
MA-Ⅳ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:23所示的氨基酸序列，所述轻 链可变区包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列；
优选的，所述鼠源抗体分子为MA-Ⅰ。
本发明通过用TSLP抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，并 筛选出上述亲和力较高，活性较好且较为稳定的鼠源抗体分子，通过大量的细胞 水平实验验证，发现相对其他3个鼠源抗体分子，MA-Ⅰ具有更高的生物学活性， 为此，本发明优选的选择MA-Ⅰ。
进一步的，所述鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型 或IgG3型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定区；其中，所述IgG1型的重链恒 定区氨基酸序列如SEQ ID No:26所示，所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列 如SEQ ID No:27所示，所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:28 所示，所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示；所述鼠Ck 型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；
优选的，所述鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链 恒定区。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体为嵌合抗体分子，所述嵌合抗体分子包 括所述鼠源抗体分子的重链可变区、所述鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体 恒定区。
嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的可变区序列和人源抗体恒定区，嵌合抗体 分子的设计用于验证本发明恒定区人源化后没有改变CDR的特异功能，为人源 化抗体分子的研究提供了进一步的研发基础。
进一步的，所述抗TSLP单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分 子选自以下任意一种：
HA-Ⅰ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列，所述轻链 可变区包含如SEQ ID No:35所示的氨基酸序列；
HA-Ⅱ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列，所述轻链 可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列；
HA-Ⅲ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链 可变区包含如SEQ ID No:38所示的氨基酸序列；
HA-Ⅳ：所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链 可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列；
优选的，所述人源化抗体分子为HA-Ⅰ。
本发明针对鼠源抗体分子进行人源化设计后筛选得到人源化抗体分子，通过 体内外的实验验证发现本发明提供的4种人源化抗体分子中，HA-Ⅰ的生物学活 性较高，药效最为显著，所以本发明优选HA-Ⅰ。
进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区。
进一步的，所述人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型 的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如 SEQ ID No:30所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示， 所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，所述人Ck型的轻 链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:33所示；
优选的，所述人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区和人Ck型的轻 链恒定区。
进一步的，所述缓冲盐包括组氨酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲 液中的一种或多种组合；
优选的，所述缓冲盐为20-40mM的组氨酸盐缓冲液。
本发明通过大量实验筛选，发现缓冲盐优选为组氨酸盐缓冲液在能够保证注 射制剂酸性环境的条件下，同时能够保证注射制剂的稳定性。
进一步的，所述注射制剂的pH值为6.0-6.5。
进一步的，所述蛋白保护剂包括山梨醇、甘露醇、海藻糖、精氨酸、赖氨酸、 甘氨酸或脯氨酸中的一种或多种组合；
优选的，所述蛋白保护剂为山梨醇或海藻糖。
本发明中优选的蛋白保护剂为山梨醇能够对抗体进行有效保护，同时本发明 优选的山梨醇和海藻糖能够保证抗体的渗透压和粘度，稳定性较好。
进一步的，所述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的 一种或多种组合；
优选的，所述表面活性剂为0.01-0.02％w/v的聚山梨酯80。
本发明的有益效果如下：本发明提供的注射制剂通过缓冲盐、蛋白保护剂、 表面活性剂相互作用，协同配合，为抗TSLP单克隆抗体提供了良好的存储环境， 在贮存和运输过程中，能有效降低制剂中抗体的聚集物和降解物的生成速率，提 高抗体的物理稳定性，确保活性的同时降低潜在的安全性风险；本发明制剂制备 工艺简单，成本低廉，为高浓度的抗TSLP单克隆抗体提供了稳定的制剂环境， 有效保证了蛋白的可溶性和体液平衡(pH)以及血液等渗性，延长抗体制剂的保 存期。
附图说明
图1为本发明实施例3中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例4中梯度稀释ELISA抗TSLP噬菌体单克隆抗体相对亲 和力的比较图；
图3为本发明实施例6中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例6中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例7中鼠源抗体与TSLP的结合能力比较图；
图6为本发明实施例8中鼠源抗体与TSLP受体蛋白CRLF2的竞争抑制实验 比较图；
图7为本发明实施例13中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8为本发明实施例14中人源化抗体分子与TSLP的结合能力比较图；
图9为本发明实施例15中人源化抗体与对照抗体的竞争抑制实验比较图；
图10为本发明实施例16中人源化抗体与不同种属的TSLP交叉结合实验图；
图11为本发明实施例17中抗TSLP单克隆抗体抑制TSLP与细胞表面受体 结合实验比较图；
图12为本发明实施例18中抗TSLP单克隆抗体生物学活性检测(报告基因 法)比较图；
图13为本发明实施例19中抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP诱导mDC细胞释 放趋化因子比较图；
图14为本发明实施例20抗TSLP单克隆抗体HA-1热稳定性评价图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术 语作以下说明：
本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括 鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体也可以是Fab、F(ab)2、 Fv或ScFv(单链抗体)，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突 变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段 的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C 区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变 区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通 过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2 和LCDR3表示。
本文所使用的术语“鼠源抗体分子”，其来源是用TSLP抗原免疫注射小鼠 后得到的抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体分子”，是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的 恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合 抗体是利用DNA重组技术，将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体 恒定区的表达载体中，这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的，而恒定 区是人源的，整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了鼠源抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
本文所使用的术语“人源化抗体分子”，其是将鼠源单抗的CDR移植至人源 抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性， 同时减少其异源性。
术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；术语“HEK293细胞”为人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293cell)，术语“NS0 细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，注射制剂包括：
其中，注射制剂的pH值为5.5-6.5。
进一步的，缓冲盐包括组氨酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液中 的一种或多种组合。
进一步的，蛋白保护剂包括山梨醇、甘露醇、海藻糖、精氨酸、赖氨酸、甘 氨酸或脯氨酸中的一种或多种组合；
进一步的，表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种 或多种组合。
实施例2
本发明实施例2在实施例1的基础上进一步限定了抗TSLP单克隆抗体的蛋 白含量为120-150mg/mL；抗TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区， 重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区， 轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区， 抗TSLP单克隆抗体选自以下任意一种。
实施例3鼠源抗体分子筛选
本发明实施例3通过用TSLP抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展 示库并建立抗原位点筛选方法，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：TSLP抗原免疫小鼠
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；
体重：18-20g；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人TSLP(南京金斯瑞生物科技有限 公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号： 15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板， 采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods 233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库 (VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切 处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，PscFv-DisB-HS载体是采 用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础， 构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以TSLP为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被 过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭 1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量 约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过 0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下 来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃ 培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用 于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基， 吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培 养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm 培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮 噬菌体库富集筛选。
步骤六：TSLP噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分 隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔板，在37℃条件 下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体 M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上 清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm， 4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛 选得到四个亲和力较高的抗TSLP的鼠源抗体分子，分别命名为MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序 列，经过测序，上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下：
鼠源抗体分子 重链可变区序列 轻链可变区序列
MA-Ⅰ SEQ ID No:17 SEQ ID No:18
MA-Ⅱ SEQ ID No:19 SEQ ID No:20
MA-Ⅲ SEQ ID No:21 SEQ ID No:22
MA-Ⅳ SEQ ID No:23 SEQ ID No:24
具体的，SEQ ID No:17(MA-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIG LIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLGSLTSEDSAVYYCSRSLDGYF DHWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:18(MA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSFYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:19(MA-Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVKLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIG VIDPSDSYITYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFD YWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:20(MA-Ⅱ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAK TLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK ；
SEQ ID No:21(MA-Ⅲ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIG VIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYF DHWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:22(MA-Ⅲ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNA KTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEI K；
SEQ ID No:23(MA-Ⅳ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVKLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIG VIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYF DHWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:24(MA-Ⅳ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVITQTPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTK TLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK 。
实施例4梯度稀释ELISA比较抗TSLP噬菌体单克隆抗体的亲和力
本发明实施例4将实施例3中获得的4个鼠源抗体分子(MA-Ⅰ，MA-Ⅱ， MA-Ⅲ和MA-Ⅳ)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释 ELISA实验鉴定亲和力，对照抗体选择安进公司的抗TSLP单克隆抗 体tezepelumab(又名AMG157，专利申请号为CN201880026131.3，专利名称为 用抗TSLP抗体治疗哮喘)，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包 被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例3中筛选得到的4个噬菌体单克隆抗体 分别用PBST四倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小 时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自 Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置 1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，酶标仪在 450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图2所示，实施例3筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均 能够与TSLP结合，但是与其他3个鼠源抗体分子及对照抗体相比，本发明提供 的单克隆抗体MA-Ⅰ与TSLP具有更高的亲和力。
实施例5
本发明实施例5在实施例3的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括选自 鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定 区；其中，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:26所示，IgG2a型的 重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:27所示，IgG2b型的重链恒定区氨基酸序 列如SEQ ID No:28所示，IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示； 鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；具体序列如下：
SEQ ID No:25(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列)：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；
SEQ ID No:26(鼠的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVH TFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHT AQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQ PIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:27(鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHT FPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNV EVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTIS KPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSR TPGK；
SEQ ID No:28(鼠的IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHT FPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQIS WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGH TEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKT ISRSPGK；
SEQ ID No:29(鼠的IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRT VSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNK EVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDY KNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQ TAIPDYRNMIGQGA。
实施例6抗TSLP鼠源抗体分子制备
本发明实施例6在实施例5的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的 IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:26所示)和鼠Ck型的轻链 恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:25所示)。抗体制备方法具体如下：
1、将实施例3筛选出来的4个单克隆抗体的重链VH和轻链VL的编码基因 分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链 恒定区为鼠的IgG1型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:26所示)，轻链恒定区 为鼠源Ck链(氨基酸序列如SEQ IDNo:25所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE 载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个 单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货 号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如 图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ和蛋白质分子量Marker及还原MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗TSLP单克隆 抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例7鼠源抗体与TSLP的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下 过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件 下封闭1h，加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗体，4 种抗体的起始最高浓度均是1μg/ml，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释8 个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用 1％BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio，货号： SE131)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显 色8min，然后用2MH2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对 应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MA-Ⅱ MA-Ⅲ MA-Ⅳ
EC50(ng/ml) 1.099 2.041 1.983 5.572
通过上述数据及如图5所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与TSLP进 行结合，此外，这4个鼠源抗体分子中MA-Ⅰ的EC50值最低，说明其与TSLP 具有更好的结合能力。
实施例8鼠源抗体与TSLP受体蛋白CRLF2的竞争抑制实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被CRLF2-Fc，200ng/孔/100μl，在4℃的温度条 件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度 条件下封闭1h，先加入经过1％BSA-PBST稀释至10μg/ml的TSLP-His，50μl/ 孔，再加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗体及对照抗 体，50μl/孔，5种抗体的起始最高浓度均是400μg/ml，分别经过5倍梯度稀释， 每个抗体共稀释8个梯度，在37℃温度条件下孵育2h。用300μl/孔PBST洗涤 五次，再加入用2％BSA-PBST 1:5000稀释的Anti-His-Tag Mouse-HRP(购买自北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0285)，在37℃温度条件下孵育1h。 TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2MH2SO4终止显色。 酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MA-Ⅱ MA-Ⅲ MA-Ⅳ 对照抗体
IC50(ng/ml) 1523 15626 2402 11816 3460
通过上述数据及如图6所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与受体蛋白 CRLF2产生竞争，此外，本发明提供的4个鼠源抗体分子中MA-Ⅰ的IC50值最 低，且明显优于对照抗体，说明其能够有效的抑制了TSLP与受体蛋白CRLF2 的结合。
实施例9
本发明实施例9进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分 子，嵌合抗体分子包括实施例3中鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的 轻链可变区和人源抗体恒定区。人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型 或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，所述IgG1型的重链恒定区氨 基酸序列如SEQ ID No:30所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，所述 人Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:33所示；
SEQ ID No:30(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK；
SEQ ID No:31(人的IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK；
SEQ ID No:32(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS LGK；
SEQ ID No:33(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C。
实施例10嵌合抗体分子抗体的制备
本发明实施例10在实施例9的基础上进一步限定了人源抗体恒定区包括人 的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:30所示)和人Ck型的轻 链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:33所示)。
具体的制备方法：
将实施例3中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-Ⅰ的重链可变区 VH(SEQID No:17)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:18)保持鼠源序列不变， 分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上， 重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，轻链恒定区为 人的Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示)。瞬时转染HEK293E细胞(购买 自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，得到 嵌合抗体CA-Ⅰ。
实施例11鼠源抗体分子MA-Ⅰ进行人源化
首先使用实施例3中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库 (v-base)比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将 鼠源抗体分子MA-1的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基 酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗 体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接 到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子： HA-Ⅰ，HA-Ⅱ，HA-Ⅲ，HA-Ⅳ，上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下：
具体的，SEQ ID No:34(HA-Ⅰ和HA-Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIG LIDPSDSDTTYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSLDGYF DHWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:35(HA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:36(HA-Ⅱ与HA-Ⅳ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:37(HA-Ⅲ和HA-Ⅳ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIG LIDPSDSDTTYNQKFKGRATMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLDGYF DHWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:38(HA-Ⅲ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK。
实施例12
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包 括人源抗体恒定区；人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型 的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示，IgG4 型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示，人Ck型的轻链恒定区氨基酸 序列如SEQ ID No:33所示。
上述人源抗体恒定区具体序列与实施例9相同。
实施例13人源化抗体分子的制备
本发明实施例13在实施例12的基础上进一步的限定了人源抗体恒定区包括 人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:30所示)和人Ck型的 轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:33所示)。
将上述实施例11人源化得到的4个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的 编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)，轻链恒定 区为Ck链(氨基酸序列如SEQ IDNO:33所示)。
将对照抗体、和人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ分别瞬时转 染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进 行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时 使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进 行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图7所示，从左侧 到右侧依次为非还原蛋白质分子量HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ、实施例10 中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ、对照抗体、非还原蛋白质分子量Marker1和还原蛋白 质分子量Marker2、HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ、嵌合抗体CA-Ⅰ、对照抗 体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例14人源化抗体分子与TSLP结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP-His，200ng/孔/100μl，在4℃的温度条 件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度 条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA- Ⅳ和实施例10中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ及对照抗体，6个抗体的起始最高浓度均 是5μg/ml，分别经过5倍稀释后每个抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵 育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)， 在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色5min， 然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50 值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HA-Ⅳ 嵌合抗体CA-Ⅰ 对照抗体
EC50(ng/ml) 10.16 20.12 32.9 25.57 13.06 54.99
通过上述数据及实验结果如图8所示，4个不同的人源化抗体分子均能与 TSLP进行结合，本发明提供的4个不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于对 照抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与TSLP的结合能力强，亲和力高，此外， 从图8及上述数据中还可以得出，4个不同的单克隆抗体中HA-Ⅰ的EC50值最 低，说明其与TSLP结合能力最好，亲和力最高；同时HA-Ⅰ的EC50值与嵌合 抗体CA-Ⅰ相似，说明人源化后的HA-Ⅰ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ与TSLP的 高亲和力。
实施例15人源化抗体与对照抗体的竞争抑制实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP-His，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条 件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度 条件下封闭1h，先加入经过1％BSA-PBST稀释至4μg/ml的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA- Ⅲ、HA-Ⅳ及嵌合抗体CA-Ⅰ，50μl/孔，再加入不同稀释浓度的对照抗体，50μl/ 孔混合。对照抗体的起始最高浓度是400μg/ml，分别经过3倍梯度稀释，共稀释 11个梯度，在37℃温度条件下孵育2h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用 1％BSA-PBST 1:5000稀释的Anti-Human IgG1-HRP(购买自Sigma，货号：SAB4200768)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温 显色10min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计 算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HA-Ⅳ 嵌合抗体CA-Ⅰ
IC50(ng/ml) 475.4 626.4 1633 977.7 627.3
通过上述数据及如图9所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及嵌合抗体均 能够抑制TSLP与对照抗体的结合，同时这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50 值最低，其抑制效果最佳。
实施例16人源化抗体与不同种属的TSLP交叉结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别包被人TSLP-His、鼠TSLP-His(购买自义翘 神州科技股份有限公司，货号：51005-M08H)、猴TSLP-His(购买自近岸蛋白质 科技有限公司，货号：CR62)100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。 用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h， 加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ，4个人源化抗 体的起始最高浓度均是16μg/ml，分别经过4倍稀释后每个抗体均做8个梯度， 在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显 色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色5min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪 在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图10所示，筛选出的4个不同的人源化抗体均能与人 TSLP、食蟹猴TSLP进行结合，与鼠TSLP均无结合。此外，这4个人源化抗体 分子中，HA-Ⅰ与人TSLP和食蟹猴TSLP的EC50值最低，说明其结合能力强， 可在食蟹猴的实验动物模型中进行药理毒理性研究及安全性评价。
实施例17抗TSLP单克隆抗体抑制TSLP与细胞表面受体结合实验
将BaF/3-TSLPR工程细胞株消化计数，利用样品稀释液(其成分包括 90％IMDM、10％FBS、300μg/ml Hygromycin)将细胞稀释至1×106cells/ml，加入 96孔板中，100μl/孔。人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体分 别利用样品稀释液稀释至初始浓度为200μg/ml，3倍梯度稀释共10个梯度。将 稀释好的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体分别加入含有 100μl BaF/3-TSLPR细胞的96孔板中，50μl/孔。抗原TSLP利用样品稀释液稀释 至8μg/ml，加入上述含有BaF/3-TSLPR细胞、人源化抗体及对照抗体的孔板中， 50μl/孔。轻轻混匀后，将96孔板置于4℃条件下孵育1h。孵育结束后3000rpm 离心弃上清，收集细胞沉淀。向板中加入提前稀释好的Goat Anti Human IgG-Fc 抗体(购买自SouthernBiotech，货号：2048-30)，100μl/孔，与每孔细胞沉淀混 合均匀，4℃条件下孵育1h。孵育结束后每孔加入100μl PBS缓冲液清洗细胞， 3000rpm离心弃上清，每孔加入100μlPBS缓冲液重悬细胞沉淀，流式细胞仪上 机检测。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HA-Ⅳ 对照抗体
IC50(μg/ml) 0.724 0.921 1.241 1.133 1.477
通过上述数据及如图11所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体 均能与TSLP竞争结合细胞表面受体TSLPR。此外，这4个人源化抗体分子中 HA-Ⅰ的IC50值最低且优于对照抗体，说明其在细胞水平上对TSLP与其受体的结合有较好的阻断效果。
实施例18抗TSLP单克隆抗体生物学活性检测(报告基因法)
将表达TSLPR、IL-7Rα、STAT5-Luc的BaF/3(小鼠原B细胞，购买自中 国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，货号：3111C0001CCC000095)细 胞消化计数，利用样品稀释液(其成分包括90％IMDM、10％FBS、300μg/ml Hygromycin、0.5μg/ml Puromycin和600μg/ml Geneticin)将细胞稀释至 1×106cells/ml，加入TSLP-RAS-His抗原使其浓度至160ng/ml，轻轻混匀后将细 胞液加入96孔板，50μl/孔。人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照 抗体分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为15μg/ml，3倍梯度稀释共8个梯度， 每个样品浓度两个复孔。将稀释好的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体 分别加入含有50μl细胞混合液的96孔板中，轻轻混匀后，将96孔板放入细胞 培养箱孵育5h，培养条件37℃、5％CO2。5h后将96孔板取出，3000rpm/min离 心5min，丢弃溶液，加入Glo Lysis Buffer(购买自Promega，货号：E2661)50μl/孔，室温裂解5分钟，轻拍细胞板将细胞裂解液混匀，转移细胞裂解液至384孔 板，10μl/孔，加入等量的Bright-GolTMLuciferase Assay System，室温反应 2～15min，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HA-Ⅳ 对照抗体
IC50(ng/ml) 289.2 378.3 469.4 444.9 514.8
通过上述数据及如图12所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体 均能与TSLP进行结合，且能够竞争抑制TSLP与受体复合物结合并发挥作用， 阻断胞内信号通路。工程细胞株BaF/3-TSLPR-IL7Rα-STAT5-Luc的构建，可以模 拟人肥大细胞在TSLP作用下的增殖反应。TSLP通过与细胞表面TSLPR和IL7R α受体的结合，激发并上调细胞内增殖信号(STAT5-Luc)的表达。这4个人源 化抗体分子能够有效阻断TSLP与细胞表面受体的结合作用，进而抑制细胞内增殖信号的发生发展。此外，这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且明 显优于对照抗体，说明其在细胞水平上能够阻断TSLP与其受体的结合，抑制细 胞增殖效果最优。
实施例19抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP诱导mDC细胞释放趋化因子
复苏PBMC细胞，利用试剂盒分选获得mature DC细胞，使用样品稀释液(其 成分包括90％1640和10％FBS)调整细胞密度至4×105cells/mL，将细胞悬液加 入96孔板中，50μl/孔。人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ及对照抗体 分别利用样品稀释液稀释至初始浓度80ng/ml，3倍梯度稀释，共8个梯度，每 个样品浓度两个复孔，加入到含有mature DC细胞的96孔板中，25μl/孔。TSLP 蛋白用样品稀释液稀释至80ng/ml，加入到含有mature DC细胞、人源化抗体及 对照抗体的96孔板中，25μl/孔。轻轻混合均匀后，将96孔板置于37℃CO2培 养箱中过夜培养，约24h后取上清，50μl/孔。依据人TARC ELISA试剂盒(购 买自达科为生物技术有限公司，货号：1117542)说明书，进行TARC检测。首 先利用试剂盒中的稀释液对上清进行3倍稀释，混合均匀。将稀释上清及标准品加入样本孔中，100μl/孔，室温孵育2h。孵育结束后洗液清洗孔板3次。加入 Biotinylated antibody稀释液，100μl/孔，室温孵育2h。孵育结束后洗液清洗孔板 3次。加入Streptavidin-HRP工作液，100μl/孔，室温孵育20min。孵育结束后洗液清洗孔板3次。加入TMB显色液，100μl/孔，避光室温孵育约15min，100μl/ 孔终止液终止显色。酶标仪读取450nm处OD值，并计算对应的IC50值，具体 数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HA-Ⅳ 对照抗体
IC50(ng/ml) 100.1 241.1 313.4 261.3 584.0
通过上述数据及图13所示，筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均 可以抑制TSLP激活mDC细胞释放趋化因子TARC。此外，这4个人源化抗体分 子中HA-Ⅰ的IC50值最低且明显优于对照抗体，说明其在细胞水平上能够有效抑制TSLP对mDC的激活效应，且抑制效果最好。
实施例20抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ热稳定性评估
将抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ超滤换液到PBS缓冲体系中，12000rpm，在4℃ 条件下，离心5min，使用多功能蛋白热稳定性分析系统(购买自Unchained Labs) 对抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ的热稳定性进行评估。通过监测蛋白内源性荧光随 温度变化(从25℃开始，以0.3℃/min的升温速度升温至95℃)检测蛋白构象的 变化，从而确定蛋白熔解温度Tm，评估蛋白构象稳定性。样品发生聚集时，会 导致散射光波发生干涉，散射光信号增加，通过静态光散射测定蛋白的胶体稳定性(以Tagg进行表征)，结果参考如下表和附图14所示。
样品 Tm(℃) Tagg 266(℃)
2mg/ml抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ 71.7 83.0
如上表和图14显示，抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ的温度为71.7℃，平均Tagg 为83.0℃，显示出较好的构象稳定性和胶体稳定性。
实施例21
本发明实施例21在实施例13-20中选择与TSLP结合能力最高、活性最好的 抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ作为蛋白分子，同时优选缓冲盐为20-40mM的组氨酸 盐缓冲液。
实施例22
本发明实施例22在实施例1-21基础上进一步限定了注射制剂的pH值为 6.0-6.5。
实施例23
本发明实施例23在实施例21的基础上进一步限定了蛋白保护剂为160mM 的山梨醇。
实施例24
本发明实施例24在实施例21的基础上进一步限定了表面活性剂为 0.01-0.02％w/v的聚山梨酯80。
实施例25稳定性检测实验
抗TSLP单克隆抗体的注射制剂制备方法：首先通过实施例14-20中筛选于 TSLP结合能力最高、活性最好的抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ作为药效蛋白分子 备用，通过超滤管将分离纯化好的抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ换液至不同pH值 的缓冲盐溶液体系中，并将浓缩后的样品稀释至所需浓度，样品用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，1ml/瓶。分装完毕后检测蛋白的热稳定性， 同时放置40±2℃的培养箱中，分别进行纯度和电荷异构体的稳定性检测。
分析检测方法：
热稳定性：采用多功能蛋白质稳定性分析系统(Uncle)检测热变性温度(Tm)、 变性起始温度(Tonset)、聚集温度(Tagg)；
纯度检测：采用分子排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析；
电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量(CEX-HPLC)。
(1)不同pH值对制剂稳定性的影响
通过多功能蛋白质稳定性分析系统(Uncle)考察蛋白构象稳定性(Tm和 Tonset)和胶体稳定性(Tagg)，通过40±2℃加速试验考察蛋白纯度(SEC-HPLC) 和电荷异构体(CEX-HPLC)主峰含量变化，筛选相对稳定的pH范围和适宜的 缓冲盐体系；通过上述方法配置成不同成分含量的6种抗TSLP单克隆抗体的注 射制剂作为实验例样品，不同实验例提供的制剂包括以下含量的成分：
热稳定性检测结果如下：
40±2℃加速稳定性考察结果：
通过上述热稳定性结果显示，缓冲液pH5.5-6.5范围内，蛋白的Tm和Tagg 相对于其他缓冲液均较高。
通过上述40±2℃加速稳定性考察结果显示，40℃条件下放置2周，各实验 例中纯度均不同程度下降，实验例6下降最多(下降6％左右)，实验例2和实验 例3下降最少(下降3％左右)；各实验例酸区含量均有所增加，实验例3增加最 少(增加6％左右)，实验例6增加最多(增加16％左右)；各实验例样品主峰含 量均有所下降，实验例3和实验例4下降最少(下降17％左右)，实验例1下降 最多(下降20％左右)；各实验例中碱区含量均有所增加，实验例6增加最少(增 加3％左右)，实验例1增加最多(增加11％左右)。初步结果显示，在pH5.5-6.5 范围内，抗TSLP单克隆抗体相对较稳定。
(2)不同缓冲盐对制剂稳定性的影响
通过上述pH值的范围筛选，发现pH 5.5-6.5范围内抗TSLP单克隆抗体相 对较稳定，为此在初步筛选pH值范围内，选择缓冲能力在5.5-6.5左右的缓冲液 内展开缓冲液体系和pH值的优化筛选，主要通过热稳定性(Tm、Tonset、Tagg) 检测，考察蛋白构象稳定性和胶体稳定性，通过40±2℃加速试验考察蛋白纯度 (SEC-HPLC)和电荷异构体(CEX-HPLC)主峰含量变化，筛选合适的缓冲盐 体系及相对更稳定的pH值范围，通过上述方法配置成不同成分含量的6种抗 TSLP单克隆抗体的注射制剂作为实验例样品，不同实验例提供的制剂包括以下 含量的成分：
热稳定性检测结果如下：
40±2℃加速稳定性考察结果：
通过上述热稳定性结果显示，在pH5.5-6.5范围内，无论是组氨酸盐缓冲液 还是在枸橼酸盐缓冲液中蛋白的Tm和Tagg均较高。
通过上述加速稳定性的结果显示，40℃条件下放置2周，各实验例中纯度均 不同程度下降，实验例7单体纯度下降比例最少(下降2％左右)；随着pH增高， 单体纯度下降比例逐渐增多，且实验例7-9单体纯度下降比例小于实验例10-12。 40±2℃放置2周后，各实验例的酸区含量均有所增加，实验例2增长比例最小 为3.0％；各实验例的主峰含量均有所下降，实验例12下降比例最小为10.8％； 各实验例的碱区含量均有所增加，实验例9与实验例12增长比例最少为6.7％。 综合各考察结果显示，在如上几个实验例中蛋白在组氨酸盐缓冲液体系和枸橼酸 盐缓冲液体系，且pH值在6.0-6.5条件下均可以有效的维持抗TSLP单克隆抗体 的稳定特性，组氨酸盐缓冲液体系优于枸橼酸盐缓冲液体系。
(3)不同蛋白保护剂对制剂稳定性的影响
抗TSLP单克隆抗体的注射制剂制备方法：首先通过实施例14-20中筛选于 TSLP结合能力最高、活性最好的抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ作为药效蛋白分子 备用，通过上述缓冲盐和pH值的筛选，选择组氨酸盐缓冲液体系和pH值为6.0 的条件下，并按照以下实验例添加蛋白保护剂，通过超滤管将分离纯化好的抗 TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ换液至缓冲盐溶液体系中，并将浓缩后的样品稀释至所 需浓度，样品用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，1ml/瓶。分装 完毕后检测蛋白的热稳定性，同时放置40±2℃的培养箱中，分别进行纯度和电荷异构体的稳定性检测。
分析检测方法：
纯度检测：采用分子排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析；
电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量(CEX-HPLC)。
通过40±2℃加速稳定性实验，在上一轮缓冲盐和pH值范围筛选的基础上 开展蛋白保护剂及表面活性剂的筛选，拟定缓冲盐为20mM组氨酸-组氨酸盐酸 盐，pH6.0，蛋白浓度为150mg/ml，制剂实验例组成设计如下表所示：
40±2℃加速稳定性考察结果：
通过上述加速稳定性的结果显示，40±2℃条件下放置4周，各实验例纯度 均不同程度下降，实验例14和实验例24单体纯度下降比例最少(下降3.4％)。 40±2℃放置4周，各实验例的酸区含量均有所增加，实验例26增长比例最少为 10％左右；各实验例的主峰含量均有所下降，实验例14和实验例24下降比例最 少为22.5％；各实验例的碱区含量均有所增加，实验例14增长比例最少为11.2％， 为此，糖类保护剂比氨基酸类保护剂对抗TSLP单克隆抗体的稳定性相对较好， 其中山梨醇和海藻糖表现较优，此外，通过实施例24-26可以得出，表面活性剂 优选的聚山梨酯80对蛋白稳定性帮助较大。
(4)不同表面活性剂对制剂稳定性的影响
通过早期的制剂评估与筛选，选择组氨酸盐缓冲液为制剂缓冲盐，枸橼酸盐 缓冲液为候选制剂缓冲体系，以山梨醇和海藻糖为蛋白保护剂，对表面活性剂含 量及不同蛋白浓度的实验例进行对比，通过40±2℃的加速稳定性试验考察，对制剂实验例进行筛选。
分析检测方法：
热稳定性：多功能蛋白质稳定性分析系统检测热变性温度(Tm)、聚集温度(Tagg)；
纯度检测：采用分子排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析；
电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量 (WCX-HPLC)。
亚可见颗粒：采用微流成像法检测。
B22(第二维里系数)：多功能蛋白质稳定性分析系统检测不同蛋白浓度条件 下的静态散射光强。
制剂实验例组成设计如下表所示：
40±2℃加速稳定性考察结果
通过实施例30和33的Tagg实验结果可以看出，蛋白在组氨酸盐缓冲体系 中Tagg比在枸橼酸盐缓冲体系中高，抗TSLP单克隆抗体在组氨酸盐缓冲液体 体系中的胶体稳定性更好；通过B22实验结果可以看出各实验例中B22值均为正 值，蛋白在溶液中存在弱排斥作用力，且在组氨酸盐缓冲体系中的斜率明显比在 枸橼酸盐缓冲体系中高，抗TSLP单克隆抗体在组氨酸盐缓冲体系中弱排斥力更大，抗TSLP单克隆抗体在组氨酸盐缓冲体系中相对更稳定，为此本发明优选组 氨酸盐缓冲体系。
通过加速稳定性的结果显示，40±2℃条件下放置4周，通过实验例28-31 可以看出，在添加不同浓度的非离子型表面活性剂聚山梨酯80后，抗TSLP单克隆抗体制剂均具有很好的稳定性。非离子型表面活性剂含量太低时≥25um的 颗粒数目明显增多，蛋白有聚集的倾向，而表面活性剂含量太高可能产生副作用， 影响制剂输注的安全性，为此，选择本发明制剂中表面活性剂优选含量为 0.01-0.02％w/v的聚山梨酯80。
通过加速稳定性的结果显示，40±2℃条件下放置4周，实施例28-35提供 的制剂中，抗TSLP单克隆抗体浓度为150mg/ml和120mg/ml时在纯度、电荷异 构体、亚可见微粒等方面均无明显差异；实施例36提供的制剂中抗TSLP单克 隆抗体浓度为200mg/ml时纯度相对略低，为此，本发明提供的制剂优选的抗 TSLP单克隆抗体蛋白浓度为120-150mg/mL。
此外，加速稳定性的结果显示，40±2℃条件下放置4周，通过实施例30和 32-34的数据结果得知，使用山梨醇和海藻糖作为保护剂的处方在纯度、电荷异 构体、亚可见微粒等方面均无明显差异，但是考虑海藻糖粘度比山梨醇大，粘度 大不仅会影响整个生产工艺，还会影响到给药时对皮肤的局部严重刺激，同时也 会影响药品的吸收，所以本发明优选的蛋白保护剂为山梨醇。
综上所述，我们选择我们选择以组氨酸盐为缓冲体系、以山梨醇为蛋白保护 剂、以0.01-0.02％w/v的的聚山梨酯80为表面活性剂，以及选择抗TSLP单克 隆抗体蛋白浓度为120-150mg/mL，对对实验例进行确认。
(5)缓冲体系的摩尔浓度的筛选及处方确认
因本发明提供的制剂为高浓度的蛋白制剂，在浓缩换液过程中组氨酸含量可 能会发生变化，故将组氨酸盐缓冲液的摩尔浓度范围设定在10-40mM(设置为 10、20、30和40mM)，并针对该缓冲液浓度区间进行确认试验。
蛋白液体制剂制备方法：通过超滤管将分离纯化好的抗TSLP单克隆抗体换 液至不同浓度的组氨酸盐缓冲液中，按照以下实验例列表的要求补加各种辅料并 将蛋白稀释至所需浓度，样品用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至1ml预灌封玻 璃注射器针管中，1ml/支。分装完毕后检测蛋白的热稳定性，同时进行加速试验 及影响因素试验，分别对纯度、电荷异构体和亚可见微粒的稳定性进行检测。各实验例的制剂组成设计如下表所示：
分析检测方法：
热稳定性：多功能蛋白质稳定性分析系统检测热变性温度(Tm)、聚集温度(Tagg)；纯度检测：采用分子排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析；电 荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量(WCX-HPLC)。亚 可见颗粒：采用微流成像法检测。
处方确认实验：处方确认试验包括加速试验(40±2℃)、冻融稳定性试验 (-20℃)、振摇稳定性试验(25℃条件下120r/min水平振摇)及光照稳定性试验。
加速稳定性试验结果：
实验例37中抗TSLP单克隆抗体的Tagg低于实验例38-40；加速稳定性的 结果显示，40±2℃条件下放置4周，实验例37中抗TSLP单克隆抗体蛋白纯度也低于实验例38-40，所以本发明中优选20-40mM组氨酸盐缓冲液作为抗TSLP 单克隆抗体的缓冲盐。
冻融稳定性结果：
由上表可以看出，抗TSLP单克隆抗体在-20℃冻融5次后，各实验例中抗体 纯度和电荷异构体主峰含量均无明显变化；≥25um的微粒个数略有增加，但各 实验例之间无明显差异。
振摇稳定性试验结果：
由上表可以看出，抗TSLP单克隆抗体在25℃条件下，120转/分钟，水平振 摇7天后，各实验例中抗体的下纯度和电荷异构体主峰含量均无明显变化；≥25um的微粒个数略有增加，但各实验例之间无明显差异。
光照稳定性试验结果：
由上表可以看出，抗TSLP单克隆抗体在25℃、光照强度4500±500lx条件 下放置7天后，各实验例条件下纯度和电荷异构体主峰含量均不同程度下降，各 实验例之间无明显变化；≥25um的微粒个数略有增加，但各实验例之间无明显 差异。
由冻融稳定性试验、振摇稳定性试验及光照稳定性试验可以看出，抗TSLP 单克隆抗体在10-40mM组氨酸盐缓冲溶液中均很稳定；由40±2℃加速稳定性试 验可以看出，抗TSLP单克隆抗体在20-40mM组氨酸盐缓冲溶液中的稳定性优于 在10mM组氨酸盐缓冲溶液，为此，本发明优选的缓冲盐为20-40mM的组氨酸 盐缓冲液。
综上所述，经过40℃加速试验、冻融试验、振摇试验及光照试验，进一步验证了抗TSLP单克隆抗体在20-40mM组氨酸盐缓冲液、160mM山梨醇、0.02％w/v 的聚山梨酯80及pH6.0的制剂条件中具有较好的稳定性。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他 各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同 或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司
<120> 一种抗TSLP单克隆抗体的注射制剂
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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Ser Tyr Trp Met His
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<211> 17
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Gly
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Gly
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Gly
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Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Thr Val Ser Ala
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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Phe Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ala
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ala
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<400> 23
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
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Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
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Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
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Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
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Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
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Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
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Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
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Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
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Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
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Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
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Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
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Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
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Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
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Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
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Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
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Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
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Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
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His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
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Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
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Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
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Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
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Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
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Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
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Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys
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Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys
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Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
130 135 140
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
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Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
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Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val
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Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
195 200 205
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
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Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu
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Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys
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Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser
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Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp
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Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser
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Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly
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Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 29
Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser
1 5 10 15
Asp Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Gly Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu
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Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp
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Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu
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Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
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225 230 235 240
Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe
245 250 255
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 30
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 31
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 34
<211> 117
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Gly Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (7)

1.一种抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述注射制剂包括：
抗TSLP单克隆抗体 120-200mg/mL；
缓冲盐 10-40mM；
蛋白保护剂 50-200mM；
表面活性剂 0.005-0.04% w/v；
其中，所述注射制剂的pH值为5.5-6.5；
所述抗TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示；
所述缓冲盐包括组氨酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液中的任意一种；
所述蛋白保护剂包括山梨醇、甘露醇、海藻糖、精氨酸、甘氨酸或脯氨酸中的任意一种；
所述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的任意一种。
2.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗TSLP单克隆抗体还包括人源抗体恒定区。
3.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗TSLP单克隆抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示。
4.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述缓冲盐为20-40 mM的组氨酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述注射制剂的pH值为6.0-6.5。
6.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述蛋白保护剂为山梨醇或海藻糖。
7.如权利要求1所述的抗TSLP单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂为0.01-0.02% w/v的聚山梨酯80。
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