CN117106084B - 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 - Google Patents
一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域,具体提供了一种抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段,包括重链可变区和轻链可变区,单克隆抗体或其抗原结合片段选自A‑Ⅰ、A‑Ⅱ、A‑Ⅲ或A‑Ⅳ中的一种。本发明提供的抗体与TSLP抗原具有较高的亲和力和结合能力,能够有效抑制TSLP抗原与其受体复合物的结合,进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子,防止哮喘发作并改善哮喘控制;本发明筛选得到的单克隆抗体分子还具有较高的热稳定性,本发明能够用于治疗哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性皮炎;哮喘包括重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞哮喘。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及一种抗TSLP的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
背景技术
哮喘是目前全球最常见的慢性疾病之一,哮喘的发病率约为4.3%,全球约有3亿哮喘病人,各国哮喘患病率1%-18%不等,其中10-20%的严重哮喘患者使用目前的治疗方法很难控制。
哮喘是一种由多种炎症细胞与介质参与的气道慢性炎症性疾病,这种慢性炎症与气道高反应性相关,临床表现为反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状,多在夜间和(或)清晨发作、加剧,多数患者可自行缓解或经治疗缓解;病理学上表现为气道的慢性炎症性改变,以及气道重塑,后者包括气道壁增厚、基质与胶原沉积上皮下纤维化、平滑肌增生和肥大,肌成纤维细胞增殖及黏液腺,杯状细胞化生及增生等,给治疗带来极大的困难。迄今全球上市的哮喘药物有很多种,其中大多为化学药物,随着生物药的不断发展,针对哮喘的生物药研发不断被人们关注。
T2炎症驱动(T2高)的哮喘存在于超过三分之二的重度哮喘患者中,其典型特征是T2炎性生物标志物水平升高,诊断和预测性生物标记物(包括血液嗜酸性粒细胞、血清IgE和呼出气一氧化氮(FeNO)、Periostin等)的鉴定,使重症哮喘的靶向治疗领域发生了革命性的变化。以Th2驱动的炎症为靶点的单克隆抗体在成人中重度哮喘患者中通常是安全的。其余大约三分之一的重度哮喘患者不具有激活的T2炎症通路特征,这类患者的非T2驱动疾病采用临床标准指南治疗症状仍不受控。对非2型哮喘研究尚不明确,需要进一步的研究来确定生物标记物来指导不同形式的非2型哮喘的靶向治疗。
胸腺基质淋巴细胞生成素TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)是一种针对促炎性刺激(例如肺内过敏原、病毒及其他病原体)产生的上皮细胞因子,具有增强胸腺细胞增生的作用。TSLP驱动下游T2细胞因子的释放,包括IL-4、IL-5和IL-13,导致炎症和哮喘症状。TSLP也能激活参与非T2驱动炎症的多种类型细胞。因此,TSLP在炎症级联反应的早期上游活动已被确定为在广泛哮喘患者群体中的一个潜在靶点。
此外,TSLP通过激活未成熟DC、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞来调节免疫。TSLP通过与其特异性受体TSLPR和共同受体IL-7Rα形成复合物来启动细胞内信号传导。TSLP首先与TSLPR高亲和力结合,然后与IL-7Rα的胞外结构域形成三元复合物。TSLP的两个相对面分别与TSLPR和IL-7Rα相互作用。STAT5的激活是TSLP介导的Th2反应所必需的信号。抗TSLP的人源化单克隆抗体能够特异性地结合人TSLP并阻断其与受体复合物的相互作用,由此可能阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子,从而防止哮喘发作并改善哮喘控制。
目前,阿斯利康及其合作伙伴安进公司的Tezepelumab(又名AMG157)是首个靶向TSLP的单克隆抗体药物,但目前仍未上市,通过临床研究显示,抗TSLP的人源化单克隆抗体作用于炎症级联反应的早期上游,适用于广泛的重症不受控哮喘患者,包括非T2驱动的哮喘患者,在轻度、特应性哮喘患者中开展的一项概念验证吸入性过敏原挑战研究证实,证明其能够抑制早期和晚期的哮喘反应,并降低T2炎症生物标志物水平。鉴于TSLP靶点药物在哮喘治疗上的重要性,为了满足国内外哮喘患者的需求,急需开发针对哮喘具有单独治疗或者辅助治疗的单克隆抗体治疗药物。
发明内容
为了满足市场需求,本发明通过对免疫文库的筛选,得到了可以与TSLP特异性结合且具有较高生物学活性的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明具体技术方案如下:
本发明提供了一种抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段,包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区和3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区,所述重链互补决定区HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列,所述重链互补决定区HCDR2包含如SEQ IDNo:11所示的氨基酸序列,所述重链互补决定区HCDR3包含如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列,所述轻链互补决定区LCDR1包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列,所述轻链互补决定区LCDR2包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列,所述轻链互补决定区LCDR3包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
本发明通过对免疫文库的筛选得到能够与TSLP抗原高亲和力结合的单克隆抗体分子,而且结合活性较好,从而阻断其与受体复合物的相互作用,进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子,防止哮喘发作并改善哮喘控制,此外,本发明筛选得到的单克隆抗体分子还具有较高的热稳定性,满足成药条件。
进一步的,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含如SEQ IDNo:23所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列。
本发明通过用TSLP抗原免疫小鼠,优化免疫方法,创建噬菌体展示库,并筛选出上述亲和力较高,活性较好且较为稳定的鼠源抗体分子。
进一步的,还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定区;其中,所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:26所示,所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:27所示,所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:28所示,所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示;所述鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:25所示。
本发明还提供了一种蛋白,其包含所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种多核苷酸分子,所述多核苷酸分子编码所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体,所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞,所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物,所述药物包含所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗免疫性疾病或癌症药物中的应用;
优选的,所述免疫性疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性皮炎;所述哮喘包括重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞性哮喘;
优选的,所述癌症包括胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌或乳腺癌。
本发明的有益效果如下:本发明提供的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段与TSLP抗原具有较高的结合能力,能够有效抑制TSLP抗原与其受体复合物的结合,进而阻止由TSLP靶向的免疫细胞释放促炎性细胞因子,防止哮喘发作并改善哮喘控制,此外,本发明筛选得到的单克隆抗体分子还具有较高的热稳定性,本发明筛选得到的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段能够用于治疗免疫性疾病或癌症,免疫性疾病包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性皮炎;哮喘包括但不限于重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞哮喘;癌症包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌或乳腺癌。
附图说明
图1为本发明实施例2中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱;
图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗TSLP噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图;
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱;
图4为本发明实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图5为本发明实施例6中鼠源抗体与TSLP的结合能力比较图;
图6为本发明实施例7中鼠源抗体与TSLP受体蛋白CRLF2的竞争抑制实验比较图;
图7为本发明实施例12中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图8为本发明实施例15中人源化抗体分子与TSLP的结合能力比较图;
图9为本发明实施例16中人源化抗体与对照抗体的竞争抑制实验比较图;
图10为本发明实施例17中人源化抗体与不同种属的TSLP交叉结合实验图;
图11为本发明实施例18中抗TSLP单克隆抗体抑制TSLP与细胞表面受体结合实验比较图;
图12为本发明实施例19中抗TSLP单克隆抗体生物学活性检测(报告基因法)比较图;
图13为本发明实施例20中抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP诱导mDC细胞释放趋化因子比较图;
图14为本发明实施例21抗TSLP单克隆抗体HA-1热稳定性评价图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明,描述实施例之前,先对本发明某些技术和科学术语作以下说明:
本文所使用的术语“抗体”,包含全抗体及其任一抗原结合片段,抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体,抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体),抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”,即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区),靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区(C区),可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR),每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成,重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示,轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。
本文所使用的术语“鼠源抗体分子”,其来源是用TSLP抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。
本文所使用的术语“嵌合抗体分子”,是将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源抗体在人体内诱发的免疫应答反应。嵌合抗体是利用DNA重组技术,将鼠源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中,这样表达的抗体分子中轻重链的可变区是鼠源的,而恒定区是人源的,整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体,减少了鼠源抗体的免疫原性,同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。
本文所使用的术语“人源化抗体分子”,其是将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区,替代人源抗体CDR,使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性,同时减少其异源性。
术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell);术语“HEK293细胞”为人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293cell),术语“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段,具体包括重链可变区和轻链可变区,重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区,轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区,所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种。
实施例2鼠源抗体分子筛选
本发明通过用TSLP抗原免疫小鼠,优化免疫方法,创建噬菌体展示库并建立抗原位点筛选方法,具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下:
步骤一:TSLP抗原免疫小鼠
1、实验动物:
种属品系:BALB/c,雌性,小鼠;
体重:18-20g;
实验动物提供商:北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫:对小鼠进行免疫,免疫抗原为人TSLP(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因,本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二:噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞,利用Trizol试剂(购买自Ambion,货号:15596026),提取小鼠脾细胞中的总RNA,RT-PCR获得cDNA,以cDNA为模板,采用简并引物(所用简并引物参考文献:Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增,从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL),轻重链分别双酶切,连接至同样分步骤酶切处理过的载体上,构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库,PscFv-DisB-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造,使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体,获得其质粒图谱如图1所示,并以此载体为基础,构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三:以TSLP为抗原包被免疫管,抗原包被量为5μg/500μl/管,4℃包被过夜,再用4%脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库,室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合,噬菌体投入量约为109~1012个,室温反应1h后,使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体,通过0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脱,最后使用1.5MpH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四:将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液,37℃培养箱中静置30min,取出部分菌液进行梯度稀释,涂布于2YTAG平板上,用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清,将菌体沉淀重悬于少量培养基,吸出后涂布于2YTAG大平板,为下一轮筛选做准备。
步骤五:将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下,接菌至2YTAG液体培养基,摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染,在28℃条件下,220rpm培养过夜制备噬菌体,PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选,共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六:TSLP噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选:经过一轮筛选后,挑取分隔良好的单克隆菌落,接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板,在37℃条件下,220rpm的条件下培养至其对数生长期,每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7,在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm,离心15min,弃去上清,菌体用2YTAK重悬沉淀,在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm,4℃的条件下离心15min后,吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定,最终筛选得到四个亲和力较高的抗TSLP的鼠源抗体分子,分别命名为MA-Ⅰ,MA-Ⅱ,MA-Ⅲ和MA-Ⅳ,将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列,经过测序,上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下:
鼠源抗体分子 | 重链可变区序列 | 轻链可变区序列 |
MA-Ⅰ | SEQ ID No:17 | SEQ ID No:18 |
MA-Ⅱ | SEQ ID No:19 | SEQ ID No:20 |
MA-Ⅲ | SEQ ID No:21 | SEQ ID No:22 |
MA-Ⅳ | SEQ ID No:23 | SEQ ID No:24 |
具体的,SEQ ID No:17(MA-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列):
QVQLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLGSLTSEDSAVYYCSRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA;
SEQ ID No:18(MA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSFYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK;
SEQ ID No:19(MA-Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列):
QVKLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYITYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDYWGQGTLVTVSA;
SEQ ID No:20(MA-Ⅱ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK;
SEQ ID No:21(MA-Ⅲ的重链可变区的氨基酸序列):
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA;
SEQ ID No:22(MA-Ⅲ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK;
SEQ ID No:23(MA-Ⅳ的重链可变区的氨基酸序列):
QVKLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA;
SEQ ID No:24(MA-Ⅳ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVITQTPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗TSLP噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例2中获得的4个鼠源抗体分子(MA-Ⅰ,MA-Ⅱ,MA-Ⅲ和MA-Ⅳ)进行单克隆噬菌体的展示和纯化,然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力,对照抗体选择安进公司的抗TSLP的单克隆抗体tezepelumab(又名AMG157,专利申请号为CN201880026131.3,专利名称为用抗TSLP抗体治疗哮喘),具体方法如下:
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP,100ng/孔/100μl,在4℃温度条件下包被过夜,使用PBST洗涤三次,将实施例2中筛选得到的4个噬菌体单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释,每孔加入100μl稀释后的样品,在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板,将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine,货号:GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中,在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色,室温显色10分钟,用2M H2SO4终止后,酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MA-Ⅱ | MA-Ⅲ | MA-Ⅳ | 对照抗体 |
EC50 | 2.28 | 5.515 | 8.038 | 41.38 | 23.14 |
通过上述数据及如图2所示,实施例2筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均能够与TSLP结合,但是与其他3个鼠源抗体分子及对照抗体相比,本发明提供的单克隆抗体MA-Ⅰ与TSLP具有更高的亲和力。
实施例4
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定区;其中,IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:26所示,IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:27所示,IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:28所示,IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:29所示;鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:25所示;具体序列如下:
SEQ ID No:25(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列):
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC;SEQ ID No:26(鼠的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列):
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG;
SEQ ID No:27(鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列):
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK;
SEQ ID No:28(鼠的IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列):
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK;
SEQ ID No:29(鼠的IgG3型的重链恒定区氨基酸序列):
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA。
实施例5抗TSLP鼠源抗体分子制备
本发明实施例5在实施例4的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:26所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:25所示)。抗体制备方法具体如下:
1、在将实施例2筛选出来的4个单克隆抗体的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示),优选的重链恒定区为鼠的IgG1型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:26所示),轻链恒定区为鼠源Ck链(氨基酸序列如SEQID No:25所示),pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所,货号为GNHu43),进行抗体表达,使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体,同时使用BCA试剂盒(购买自:北京汇天东方科技有限公司,货号:BCA0020)进行蛋白浓度测定,之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小,结果如图4所示,从左侧到右侧依次为非还原MA-Ⅰ,MA-Ⅱ,MA-Ⅲ和MA-Ⅳ和蛋白质分子量Marker及还原MA-Ⅰ,MA-Ⅱ,MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗TSLP单克隆抗体,每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6鼠源抗体与TSLP的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP,100ng/孔/100μl,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h,加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ,MA-Ⅱ,MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗体,4种抗体的起始最高浓度均是1μg/ml,分别经过5倍梯度稀释,每个抗体共稀释8个梯度,在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio,货号:SE131),在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色,100μl/孔,室温显色8min,然后用2MH2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MA-Ⅱ | MA-Ⅲ | MA-Ⅳ |
EC50(ng/ml) | 1.099 | 2.041 | 1.983 | 5.572 |
通过上述数据及如图5所示,筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与TSLP进行结合,此外,这4个鼠源抗体分子中MA-Ⅰ的EC50值最低,说明其与TSLP具有更好的结合能力。
实施例7鼠源抗体与TSLP受体蛋白CRLF2的竞争抑制实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被CRLF2-Fc,200ng/孔/100μl,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h,先加入经过1%BSA-PBST稀释至10μg/ml的TSLP-His,50μl/孔,再加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ,MA-Ⅱ,MA-Ⅲ和MA-Ⅳ鼠源抗体及对照抗体,50μl/孔,5种抗体的起始最高浓度均是400μg/ml,分别经过5倍梯度稀释,每个抗体共稀释8个梯度,在37℃温度条件下孵育2h。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入用2%BSA-PBST 1:5000稀释的Anti-His-Tag Mouse-HRP(购买自北京康为世纪生物科技有限公司,货号:CW0285),在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色,100μl/孔,室温显色10min,然后用2MH2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | MA-Ⅰ | MA-Ⅱ | MA-Ⅲ | MA-Ⅳ | 对照抗体 |
IC50(ng/ml) | 1523 | 15626 | 2402 | 11816 | 3460 |
通过上述数据及如图6所示,筛选出的4个不同的鼠源抗体均能与受体蛋白CRLF2产生竞争,此外,本发明提供的4个鼠源抗体分子中MA-Ⅰ的IC50值最低,且明显优于对照抗体,说明其能够有效的抑制了TSLP与受体蛋白CRLF2的结合。
实施例8
本发明实施例8进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子,嵌合抗体分子包括实施例2中鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区,所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:30所示,所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:31所示,所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,所述人Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:33所示;
SEQ ID No:30(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
SEQ ID No:31(人的IgG2型的重链恒定区氨基酸序列):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
SEQ ID No:32(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
SEQ ID No:33(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
实施例9嵌合抗体分子的制备
本发明实施例9在实施例8的基础上进一步限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:30所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:33所示)。
具体的制备方法:
将实施例2中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-Ⅰ的重链可变区VH(SEQID No:17)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:18)保持鼠源序列不变,分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上,重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示),轻链恒定区为人的Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示)。瞬时转染HEK293E细胞(购买自:中国医学科学院基础医学研究所,货号为:GNHu43),进行抗体表达,得到嵌合抗体CA-Ⅰ。
实施例10鼠源抗体分子MA-Ⅰ进行人源化
首先使用实施例2中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库(v-base)比较,寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列,然后将鼠源抗体分子MA-1的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基,从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成,然后再连接到瞬时表达载体上,对人源化得到的轻重链组合分析,得到如下人源化抗体分子:HA-Ⅰ,HA-Ⅱ,HA-Ⅲ,HA-Ⅳ,上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下:
单克隆抗体 | 重链可变区 | 轻链可变区 |
HA-Ⅰ | SEQ ID No:34 | SEQ ID No:35 |
HA-Ⅱ | SEQ ID No:34 | SEQ ID No:36 |
HA-Ⅲ | SEQ ID No:37 | SEQ ID No:38 |
HA-Ⅳ | SEQ ID No:37 | SEQ ID No:36 |
具体的,SEQ ID No:34(HA-Ⅰ和HA-Ⅱ的重链可变区的氨基酸序列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSLDGYFDHWGQGTLVTVSS;
SEQ ID No:35(HA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK;
SEQ ID No:36(HA-Ⅱ与HA-Ⅳ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK;
SEQ ID No:37(HA-Ⅲ和HA-Ⅳ的重链可变区的氨基酸序列):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIG LIDPSDSDTTYNQKFKGRATMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLDGYF DHWGQGTLVTVSS;
SEQ ID No:38(HA-Ⅲ的轻链可变区的氨基酸序列):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAR TLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK。
实施例11
本发明实施例11在实施例10的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包括人源抗体恒定区;人源抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区,IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:30所示,IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:31所示,IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:32所示,人Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:33所示。
上述人源抗体恒定区具体序列与实施例8相同。
实施例12人源化抗体分子的制备
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步的限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:30所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:33所示)。
将上述实施例10人源化得到的4个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示),重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示),轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ IDNO:33所示)。
将对照抗体、和人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所,货号为GNHu43),进行抗体表达,使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体,同时使用BCA试剂盒(购买自:北京汇天东方科技有限公司,货号:BCA0020)进行蛋白浓度测定,之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小,结果如图7所示,从左侧到右侧依次为非还原蛋白质分子量HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ、实施例9中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ、对照抗体、非还原蛋白质分子量Marker1和还原蛋白质分子量Marker2、HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ、嵌合抗体CA-Ⅰ、对照抗体,每条带的分子量大小与理论一致。
实施例13
本发明实施例13在上述实施例的基础上进一步的限定了人源化抗体分子为全长抗体或抗体片段,人源化抗体分子包括Fab、F(ab)2、Fv或ScFv中的一种或几种组合。
实施例14
本发明实施例14在上述实施例的基础上进一步的限定了如下方案:
进一步的,本发明还提供了一种蛋白,其包含上述任意一个实施例限定的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种多核苷酸分子,多核苷酸分子编码上述任意一个实施例限定的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体,重组DNA表达载体包含上述限定的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染上述限定的重组DNA表达载体的宿主细胞,宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞;
优选的,宿主细胞为哺乳动物细胞,哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物,药物包含上述任意一个实施例限定的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗免疫性疾病或癌症药物中的应用;
优选的,免疫性疾病包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性皮炎;所述哮喘包括重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞哮喘。
优选的,癌症包括但不限于胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌或乳腺癌。
实施例15人源化抗体分子与TSLP结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP-His,200ng/孔/100μl,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h,加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和实施例9中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ及对照抗体,6个抗体的起始最高浓度均是5μg/ml,分别经过5倍稀释后每个抗体均做8个梯度,在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZB-2304),在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色,100μl/孔,室温显色5min,然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的EC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HA-Ⅳ | 嵌合抗体CA-Ⅰ | 对照抗体 |
EC50(ng/ml) | 10.16 | 20.12 | 32.9 | 25.57 | 13.06 | 54.99 |
通过上述数据及实验结果如图8所示,4个不同的人源化抗体分子均能与TSLP进行结合,本发明提供的4个不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于对照抗体,说明本发明提供的单克隆抗体与TSLP的结合能力强,亲和力高,此外,从图8及上述数据中还可以得出,4个不同的单克隆抗体中HA-Ⅰ的EC50值最低,说明其与TSLP结合能力最好,亲和力最高;同时HA-Ⅰ的EC50值与嵌合抗体CA-Ⅰ相似,说明人源化后的HA-Ⅰ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ与TSLP的高亲和力。
实施例16人源化抗体与对照抗体的竞争抑制实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被TSLP-His,100ng/孔/100μl,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h,先加入经过1%BSA-PBST稀释至4μg/ml的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ及嵌合抗体CA-Ⅰ,50μl/孔,再加入不同稀释浓度的对照抗体,50μl/孔混合。对照抗体的起始最高浓度是400μg/ml,分别经过3倍梯度稀释,共稀释11个梯度,在37℃温度条件下孵育2h。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1:5000稀释的Anti-Human IgG1-HRP(购买自Sigma,货号:SAB4200768),在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色,100μl/孔,室温显色10min,然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HA-Ⅳ | 嵌合抗体CA-Ⅰ |
IC50(ng/ml) | 475.4 | 626.4 | 1633 | 977.7 | 627.3 |
通过上述数据及如图9所示,筛选出的4个不同的人源化抗体及嵌合抗体均能够抑制TSLP与对照抗体的结合,同时这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低,其抑制效果最佳。
实施例17人源化抗体与不同种属的TSLP交叉结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别包被人TSLP-His、鼠TSLP-His(购买自义翘神州科技股份有限公司,货号:51005-M08H)、猴TSLP-His(购买自近岸蛋白质科技有限公司,货号:CR62)100ng/孔/100μl,在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入1%BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h,加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ,4个人源化抗体的起始最高浓度均是16μg/ml,分别经过4倍稀释后每个抗体均做8个梯度,在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次,再加入用1%BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP,在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色,100μl/孔,室温显色5min,然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数,并计算对应的EC50值,具体数据如下:
通过上述数据及如图10所示,筛选出的4个不同的人源化抗体均能与人TSLP、食蟹猴TSLP进行结合,与鼠TSLP均无结合。此外,这4个人源化抗体分子中,HA-Ⅰ与人TSLP和食蟹猴TSLP的EC50值最低,说明其结合能力强,可在食蟹猴的实验动物模型中进行药理毒理性研究及安全性评价。
实施例18抗TSLP单克隆抗体抑制TSLP与细胞表面受体结合实验
将BaF/3-TSLPR工程细胞株消化计数,利用样品稀释液(其成分包括90%IMDM、10%FBS、300μg/ml Hygromycin)将细胞稀释至1×106cells/ml,加入96孔板中,100μl/孔。人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为200μg/ml,3倍梯度稀释共10个梯度。将稀释好的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体分别加入含有100μl BaF/3-TSLPR细胞的96孔板中,50μl/孔。抗原TSLP利用样品稀释液稀释至8μg/ml,加入上述含有BaF/3-TSLPR细胞、人源化抗体及对照抗体的孔板中,50μl/孔。轻轻混匀后,将96孔板置于4℃条件下孵育1h。孵育结束后3000rpm离心弃上清,收集细胞沉淀。向板中加入提前稀释好的Goat Anti Human IgG-Fc抗体(购买自SouthernBiotech,货号:2048-30),100μl/孔,与每孔细胞沉淀混合均匀,4℃条件下孵育1h。孵育结束后每孔加入100μl PBS缓冲液清洗细胞,3000rpm离心弃上清,每孔加入100μlPBS缓冲液重悬细胞沉淀,流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HA-Ⅳ | 对照抗体 |
IC50(μg/ml) | 0.724 | 0.921 | 1.241 | 1.133 | 1.477 |
通过上述数据及如图11所示,筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均能与TSLP竞争结合细胞表面受体TSLPR。此外,这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且优于对照抗体,说明其在细胞水平上对TSLP与其受体的结合有较好的阻断效果。
实施例19抗TSLP单克隆抗体生物学活性检测(报告基因法)
将表达TSLPR、IL-7Rα、STAT5-Luc的BaF/3(小鼠原B细胞,购买自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,货号:3111C0001CCC000095)细胞消化计数,利用样品稀释液(其成分包括90%IMDM、10%FBS、300μg/ml Hygromycin、0.5μg/ml Puromycin和600μg/ml Geneticin)将细胞稀释至1×106cells/ml,加入TSLP-RAS-His抗原使其浓度至160ng/ml,轻轻混匀后将细胞液加入96孔板,50μl/孔。人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为15μg/ml,3倍梯度稀释共8个梯度,每个样品浓度两个复孔。将稀释好的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ和对照抗体分别加入含有50μl细胞混合液的96孔板中,轻轻混匀后,将96孔板放入细胞培养箱孵育5h,培养条件37℃、5%CO2。5h后将96孔板取出,3000rpm/min离心5min,甩弃溶液,加入Glo Lysis Buffer(购买自Promega,货号:E2661)50μl/孔,室温裂解5分钟,轻拍细胞板将细胞裂解液混匀,转移细胞裂解液至384孔板,10μl/孔,加入等量的Bright-GolTMLuciferase Assay System,室温反应2~15min,在酶标仪下读荧光数值,并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HA-Ⅳ | 对照抗体 |
IC50(ng/ml) | 289.2 | 378.3 | 469.4 | 444.9 | 514.8 |
通过上述数据及如图12所示,筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均能与TSLP进行结合,且能够竞争抑制TSLP与受体复合物结合并发挥作用,阻断胞内信号通路。工程细胞株BaF/3-TSLPR-IL7Rα-STAT5-Luc的构建,可以模拟人肥大细胞在TSLP作用下的增殖反应。TSLP通过与细胞表面TSLPR和IL7Rα受体的结合,激发并上调细胞内增殖信号(STAT5-Luc)的表达。这4个人源化抗体分子能够有效阻断TSLP与细胞表面受体的结合作用,进而抑制细胞内增殖信号的发生发展。此外,这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且明显优于对照抗体,说明其在细胞水平上能够阻断TSLP与其受体的结合,抑制细胞增殖效果最优。
实施例20抗TSLP单克隆抗体阻断TSLP诱导mDC细胞释放趋化因子
复苏PBMC细胞,利用试剂盒分选获得mature DC细胞,使用样品稀释液(其成分包括90%1640和10%FBS)调整细胞密度至4×105cells/mL,将细胞悬液加入96孔板中,50μl/孔。人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HA-Ⅳ及对照抗体分别利用样品稀释液稀释至初始浓度80ng/ml,3倍梯度稀释,共8个梯度,每个样品浓度两个复孔,加入到含有mature DC细胞的96孔板中,25μl/孔。TSLP蛋白用样品稀释液稀释至80ng/ml,加入到含有mature DC细胞、人源化抗体及对照抗体的96孔板中,25μl/孔。轻轻混合均匀后,将96孔板置于37℃CO2培养箱中过夜培养,约24h后取上清,50μl/孔。依据人TARC ELISA试剂盒(购买自达科为生物技术有限公司,货号:1117542)说明书,进行TARC检测。首先利用试剂盒中的稀释液对上清进行3倍稀释,混合均匀。将稀释上清及标准品加入样本孔中,100μl/孔,室温孵育2h。孵育结束后洗液清洗孔板3次。加入Biotinylated antibody稀释液,100μl/孔,室温孵育2h。孵育结束后洗液清洗孔板3次。加入Streptavidin-HRP工作液,100μl/孔,室温孵育20min。孵育结束后洗液清洗孔板3次。加入TMB显色液,100μl/孔,避光室温孵育约15min,100μl/孔终止液终止显色。酶标仪读取450nm处OD值,并计算对应的IC50值,具体数据如下:
克隆 | HA-Ⅰ | HA-Ⅱ | HA-Ⅲ | HA-Ⅳ | 对照抗体 |
IC50(ng/ml) | 100.1 | 241.1 | 313.4 | 261.3 | 584.0 |
通过上述数据及图13所示,筛选出的4个不同的人源化抗体及对照抗体均可以抑制TSLP激活mDC细胞释放趋化因子TARC。此外,这4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ的IC50值最低且明显优于对照抗体,说明其在细胞水平上能够有效抑制TSLP对mDC的激活效应,且抑制效果最好。
实施例21抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ热稳定性评估
将抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ超滤换液到PBS缓冲体系中,12000rpm,在4℃条件下,离心5min,使用多功能蛋白热稳定性分析系统(购买自Unchained Labs)对抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ的热稳定性进行评估。通过监测蛋白内源性荧光随温度变化(从25℃开始,以0.3℃/min的升温速度升温至95℃)检测蛋白构象的变化,从而确定蛋白熔解温度Tm,评估蛋白构象稳定性。样品发生聚集时,会导致散射光波发生干涉,散射光信号增加,通过静态光散射测定蛋白的胶体稳定性(以Tagg进行表征),结果参考如下表和附图14所示。
样品 | Tm(℃) | Tagg 266(℃) |
2mg/ml抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ | 71.7 | 83.0 |
如上表和图14显示,抗TSLP单克隆抗体HA-Ⅰ的温度为71.7℃,平均Tagg为83.0℃,显示出较好的构象稳定性和胶体稳定性。
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区和3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区,所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示,所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示,所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQID No:3所示,所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示,所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示,所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。
2.如权利要求1所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo:24所示。
3.如权利要求2所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,还包括选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的重链恒定区和鼠Ck型的轻链恒定区;其中,所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:26所示,所述IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:27所示,所述IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:28所示,所述IgG3型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:29所示;所述鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:25所示。
4.一种蛋白,其特征在于,其包含权利要求1-3任一项所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
5.一种多核苷酸分子,其特征在于,所述多核苷酸分子编码权利要求1-3任一项所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
6.一种重组DNA表达载体,其特征在于,所述重组DNA表达载体包含权利要求5所述的多核苷酸分子。
7.一种转染如权利要求6所述的重组DNA表达载体的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
9.一种药物,其特征在于,所述药物包含权利要求1-3任一项所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.权利要求1-3任一项所述的抗TSLP的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗免疫性疾病或癌症药物中的应用;
所述免疫性疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、过敏性皮炎;所述哮喘包括重度哮喘、嗜酸细胞性或非嗜酸细胞性哮喘和低嗜酸细胞哮喘;
所述癌症包括胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、结直肠癌或乳腺癌。
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