CN109678957A

CN109678957A - 一种抗人tslp单克隆抗体及其制备与应用

Info

Publication number: CN109678957A
Application number: CN201811487449.XA
Authority: CN
Inventors: 张彦璐; 应国清; 俞敬爱; 易喻; 陈建澍; 梅建凤
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2038-12-06
Also published as: CN109678957B

Abstract

本发明公开了一种抗人TSLP单克隆抗体及其制备与应用，所述抗人TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的CDR1、CDR2、CDR3互补决定区或其功能可变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3互补决定区或其功能可变体；本发明成功制备了抗人TSLP单克隆抗体，该抗体特异性好，能够与人TSLP特异性结合，结合率高，且廉价易得，可以大规模生产，十分有利于开发成为过敏性炎症以及肿瘤免疫治疗的潜在药物。

Description

一种抗人TSLP单克隆抗体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗人胸腺基质淋巴生成素单克隆抗体的制备方法，其可变区序列及其应用。

背景技术

杂交瘤技术(hybridoma technique)，又称单克隆抗体技术，由Koehler和Milstein在1975年提出。利用骨髓瘤细胞在体外无限繁殖以及淋巴细胞分泌特异性抗体的特性，将两种细胞融合，可形成针对特定抗原的高特异性单克隆抗体。

胸腺基质淋巴细胞生成素(thymine stromal lymphopoietin，TSLP)是一种IL-7样，由四个螺旋束组成短链的I型细胞因子，主要由胸腺基质细胞和上皮细胞分泌，肥大细胞和巨噬细胞也能少量分泌。该细胞因子能通过对髓样和淋巴样细胞进行作用，从而平衡体内天然免疫和适应性免疫，在启动及促进由Th2细胞介导的过敏性炎症中扮演着重要的角色。此外，TSLP对乳腺癌，胰腺癌，宫颈癌，结直肠癌等都有一定的作用。目前，TSLP作为过敏性哮喘和其它过敏性疾病的新型治疗靶向正逐渐成为可能。Gail等人发现使用TSLP单克隆抗体治疗过敏性哮喘病人，能减轻支气管收缩以及气道炎症反应。此外，动物实验表明，阻断TSLP/TSLPR信号可以抑制肺树突状细胞(DC)的功能，从而减轻小鼠过敏性气道炎症。

本发明前期通过构建人类TSLP基因的原核表达载体，并将重组载体转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)体内，成功构建了能良好表达人重组TSLP蛋白的工程菌(BL21-PET22b-Q1、BL21-PET30a-Q1)，经过诱导可体外表达出人类TSLP重组蛋白，实现了体外诱导表达该蛋白的技术途径，并确定了最佳的诱导表达条件及蛋白纯化及复性条件。在本发明中，采用工程菌(BL21-PET22b-Q1、BL21-PET30a-Q1)诱导表达并纯化的重组人TSLP蛋白作为抗原，通过杂交瘤技术筛选制备得到高亲和力的抗人TSLP特异性单克隆抗体，并通过体外实验验证其高效生物学活性，为治疗过敏性炎症和肿瘤疾病提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗人TSLP单克隆抗体及其制备方法与应用，该抗体具有高效生物学活性，为治疗过敏性炎症和相关肿瘤疾病提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种抗人TSLP单克隆抗体，所述抗人TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的CDR1、CDR2、CDR3互补决定区或其功能可变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3互补决定区或其功能可变体；所述功能可变体是指与SEQ ID NO.1-6中任意一个氨基酸序列具有至少70％序列同源性的功能活性变体。

所述重链可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1:Asn-Tyr-Gly-Met-Asn(SEQ ID NO.1)；

CDR2:Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly(SEQ ID NO.2)；

CDR3:Gly-Leu-Thr-Gly-Thr-Arg-Gly-Arg-Phe-Ala-Tyr(SEQ ID NO.3)；

所述轻链可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1:Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Ser-Thr-Ala-Val-Ala(SEQ ID NO.4)；

CDR2:Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-His-Thr(SEQ ID NO.5)；

CDR3:Gln-Gln-His-Tyr-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr(SEQ ID NO.6)。

进一步，本发明所述重链可变区的三个互补决定区核苷酸序列分别为：

CDR1：AACTATGGAATGAAC(SEQ ID NO.7)；

CDR2：TGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTC AAGGGA(SEQ IDNO.8)；

CDR3：GGGCTAACTGGGACCAGGGGGCGTTTTGCTTAC(SEQ ID NO.9)；

所述轻链可变区的三个互补决定区核苷酸序列分别为：

CDR1：AAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCC(SEQ ID NO.10)；

CDR2：TGGGCATCCACCCGGCACACT(SEQ ID NO.11)；

CDR3：CAGCAACATTATAGCACTCCTCCGACG(SEQ ID NO.12)。

进一步，所述重链可变区由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的CDR1、CDR2、CDR3组成，氨基酸序列如下：

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGLTGTRGRFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.13)。

进一步，所述轻链可变区由SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3组成，氨基酸序列如下(包括了前文已经列出3个高变区CDR1-3，以及骨架区)：

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.14)。

本发明还提供一种用于制备抗人TSLP单克隆抗体的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2016年9月30日，保藏编号为GDMCC No:60083，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。

本发明还提供一种所述抗人TSLP单克隆抗体的制备方法，所述方法为：以源自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GDMCC No:60083的重组人TSLP蛋白作为抗原，免疫Balb/c小鼠，待其血清效价达到融合要求，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过HAT选择性培养基筛选得到能稳定分泌抗人TSLP抗体的杂交瘤细胞株，经亚克隆化及扩大培养后，在分子水平上进行抗体重链、轻链可变区基因的调取；将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通过Protein A/G亲和层析柱纯化获得抗人TSLP单克隆抗体。

本发明提供了一种抗人TSLP单克隆抗体在制备检测人TSLP蛋白含量试剂盒中的应用。

进一步，所述试剂盒为检测肿瘤细胞中人TSLP蛋白含量的试剂盒，所述肿瘤细胞包括人宫颈癌细胞系Hela。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明成功制备了抗人TSLP单克隆抗体，该抗体特异性好，能够与人TSLP特异性结合，结合率高，且廉价易得，可以大规模生产，十分有利于开发成为过敏性炎症以及肿瘤免疫治疗的潜在药物。

附图说明

图1为实施例3中SDS-PAGE检测Protein A亲和层析柱纯化产物结果。泳道M为蛋白Marker；泳道1为购买的Peprotech公司的人TSLP抗体，泳道2为制备所得的人TSLP单克隆抗体洗脱液中的抗体蛋白；A为非还原SDS-PAGE电泳结果，泳道1为人TSLP抗体标品，泳道2为制备所得的人TSLP单克隆抗体；B为还原性SDS-PAGE，泳道1和2都是制备所得的人TSLP单克隆抗体，泳道3是人TSLP抗体标品。

图2为实施例4中单克隆抗体亚型鉴定ELISA结果示意图。

图3为实施例4中Western-blotting方法检测TSLP抗原蛋白的含量。泳道M为蛋白Marker；泳道1为抗人TSLP抗体标品，泳道2为制备所得的抗体。

图4为实施例4中ELISA方法示出不同稀释倍数的抗体与TSLP抗原蛋白的结合曲线。

图5为实施例4中ELISA实验示出单克隆抗体特异性以及灵敏度。

图6为实施例4中ELISA方法检测Hela细胞上清中TSLP蛋白的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述列举的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1获得免疫小鼠

1、人重组TSLP蛋白(即hTSLP蛋白)：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2016年9月30日，保藏编号为GDMCC No:60083，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。

(1)诱导大肠埃希氏菌表达hTSLP蛋白

将大肠埃希氏菌GDMCC No:60083以体积比1：100接种在含抗性(Kan:30μg/mL，Amp:50μg/mL)2×YT培养基中，37℃，220r/min，过夜培养，作为种子液。种子液以体积比1:50接种于含对应抗性(Kan:30μL/mL，Amp:50μL/mL)的400mL 2×YT培养基，30℃，200r/min，进行扩大培养。培养3h，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导，在37℃继续培养4h，8000r/min离心2min，收集菌体，弃上清液。菌体加入到30mL Buffer A，磁力搅拌器搅拌10min，重悬菌液。将菌液进行超声(400w，工作3s，间隙6s，90次循环)，破碎大肠杆菌。破碎后，菌液12000r/min离心10min，上清液换离心管保存。

(2)hTSLP蛋白梯度洗脱纯化

装柱：取一只层析柱，封闭其下端，先装入1/4体积的去离子水，以除去柱子中的空气，将镍琼脂糖紧靠柱子内壁引流，缓慢加入柱内，打开下端使液体流出，让凝胶自然沉降，保持液面超过2cm。

平衡：用2-5倍柱床体积的去离子水充分平衡柱子，流速为2mL/min。用2-5个柱床体积的金属离子溶液(硫酸镍)上柱，至柱子的颜色由白色变为蓝色，收集液也为蓝色。再用5倍柱床体积的去离子水洗涤层析柱，洗去未螯合的金属离子。最后用2倍柱床体积的Buffer B缓冲液平衡柱子，流速为2mL/min。

上样：步骤(1)破碎后的沉淀(hTSLP在沉淀中)预先用Buffer B裂解包涵体，使目的蛋白变为可溶，12000r/min离心10min后，取上清液，0.45μm滤膜过滤，取滤液作为上样样品。待样品上样完毕，用2倍柱体积的Buffer B平衡柱子。

洗脱：分别用50mM，100mM，250mM，500mM咪唑的Buffer C进行梯度洗脱，流速为1mL/min。收集所有洗脱峰，即为hTSLP蛋白。

Ni²⁺再生：每次柱子用完后，先用去离子水清洗，流速为2mL/min，再用EDTA(100mM、pH 8.0)溶液洗脱镍离子，再用1M的NaOH清洗除菌，用去离子水清洗至中性后，加入0.2mol/L硫酸镍对其进行再生，用去离子水洗去未挂上的镍离子后，保存于4℃冰箱中。

Buffer A：Tri 50mM，NaCl 0.2M，溶剂为去离子水，pH 8.0。

Buffer B：Tri 50mM，NaCl 0.2M，Urea 8M，溶剂为去离子水，pH 8.0。

Buffer C：Tri 50mM，NaCl 0.2M，Urea 8M，咪唑(50mM，100mM，250mM，500mM)，溶剂为去离子水，pH 8.0。

(3)hTSLP蛋白复性

1)用去离子水将hTSLP蛋白浓度稀释到1mg/mL，再装入透析袋(截留分子量3500kDa)中。

2)将透析袋放入1L透析液(Tri 50mM，EDTA 1mM，NaCl 50mM，甘油10％，L-Arg0.4M，GSSG(氧化型谷胱甘肽)0.2mM，GSH(还原型谷胱甘肽)2mM，尿素4M，溶剂为去离子水，pH8.0)中，4℃，静置12h。

3)将透析袋放入1L透析液(Tri 50mM，EDTA 1mM，NaCl 50mM，甘油10％，L-Arg0.4M，GSSG 0.2mM，GSH 2mM，尿素3M，溶剂为去离子水，pH8.0)中，4℃，静置6h。

4)将透析袋放入1L透析液(Tri 50mM，EDTA 1mM，NaCl 50mM，甘油10％，L-Arg0.4M，GSSG 0.2mM，GSH 2mM，尿素2M，溶剂为去离子水，pH8.0)中，4℃，静置12h。

5)将透析袋放入1L透析液(Tri 50mM，EDTA 1mM，NaCl 50mM，甘油10％，L-Arg0.4M，GSSG 0.2mM，GSH 2mM，溶剂为去离子水，pH8.0)中，4℃，静置6h。

6)步骤5)的截留液于4℃，12000r/min，离心30min，收集上清，即为人重组TSLP蛋白，用PBS缓冲液配制成1mg/ml的人重组TSLP蛋白溶液，保存于-20℃冰箱中，用于后续蛋白浓度测量。

2、利用人重组TSLP蛋白作为抗原，免疫8周龄Balb/c小鼠

弗氏完全佐剂和人TSLP重组蛋白分别用PBS缓冲液配制成1mg/ml的溶液后以体积比1：1混合均匀，初次免疫时，分别在小鼠四肢和颈部进行皮下注射，每个点的注射量为50μL/只。两周后再次免疫小鼠，弗氏不完全佐剂和人TSLP重组蛋白分别用PBS缓冲液配制成1mg/ml的溶液后以体积比1：1混合均匀，采用腹腔注射，注射量为200μL/只。每隔一周进行一次弗氏不完全佐剂和人TSLP重组蛋白免疫，重复三次，最后直接脾脏注射人TSLP重组蛋白用PBS缓冲液配的1mg/ml溶液30μL进行加强免疫，缝合小鼠伤口。三天后，采集小鼠脾脏淋巴细胞。

实施例2杂交瘤细胞株的制备

1.细胞融合

饲养层细胞的制备：处死正常Balb/c小鼠，用酒精浸润5min，放于超净工作台上，往腹腔里注射5mL无血清RPMI 1640培养液(购自Hyclone)培养基，轻轻地挤压腹部2-3次，尽可能多地回收腹腔细胞，将细胞转移到50mL无菌尖底离心管。无需培养，直接使用。

将骨髓瘤细胞SP2/0液(PBS配制，0.6-2×10⁷个)以细胞数比1:5加入到装有实施例1制备的小鼠脾脏淋巴细胞液(无血清RPMI 1640培养液配制)的离心管中，加入RPMI1640培养液(购自Hyclone)至总体积40ml，混匀，并以1200r/min离心3min，吸弃上清液。将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内缓慢加入细胞融合剂(聚乙二醇(PEG-1500))1mL。静止1min，逐渐加入40mL已经预温至37℃的RPMI 1640培养液，使PEG因稀释而失去作用。以1200r/min离心2min，吸弃上清液。将沉淀的细胞悬于HAT培养基(购自Sigma)，分装于事先加入1×10⁵个细胞/ml，每孔100μl的饲养层细胞的96孔细胞培养板中，置于5％CO₂，37℃细胞培养箱中培养。第三天更换HAT培养基，第五天改用HT培养基(购自Sigma)继续培养，此时如有细胞生长即为杂交瘤细胞，取出有杂交瘤细胞生长的培养孔中的培养液，即为下一步细胞融合用的上清液。

2.阳性融合细胞的筛选及亚克隆化

将抗原(实施例1制备的0.1mg/ml的人重组TSLP蛋白溶液)用pH7.4碳酸盐缓冲液包被，4℃下过夜，用0.25％Tween-20的PBS(PBST)洗涤后加入150μl封闭液，37℃下封闭1h。弃封闭液用PBST洗涤后加入100μl步骤1制备的杂交瘤细胞上清液，37℃下孵育2h。弃上清液并用PBST洗涤后加入100μl二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG)，37℃下孵育1h。弃二抗用PBST洗涤后加入TMB(四甲基联苯胺)100μl，37℃下显色30min，最后加入100μl 2MH₂SO₄终止反应。测定OD₄₅₀值，选择OD₄₅₀值高的孔，采用有限稀释法将孔中的细胞进行克隆化，经过两次亚克隆后建立稳定分泌人TSLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实施例3抗人TSLP单克隆抗体的制备及纯化

1.腹水收集

将实施例2筛选出的杂交瘤细胞株转移到细胞培养瓶中，用HT培养基在5％CO₂，37℃培养箱进行扩大培养3-5d，待细胞长到将细胞培养瓶底完全覆盖时收集细胞。取杂交瘤细胞用PBS悬浮成10⁷/ml的杂交瘤细胞悬液。弗氏不完全佐剂(sigma)作为诱导剂。向体重20g左右的小鼠Balb/c腹腔注射诱导剂200μl，三天后，腹腔注射10⁷/ml杂交瘤细胞悬液0.5ml，待腹部肿胀即可采集腹水。

2.抗体纯化

将步骤1的腹水30ml用0.06M、pH＝4.0醋酸钠溶液60ml稀释，缓慢滴加1.2ml体积浓度4％正辛酸水溶液，控制流速为0.5mL/min，边滴边搅拌。搅拌30min，以12000r/min离心30min；弃沉淀，上清液用四层纱布过滤，并将滤液装入27MM透析袋(截流分子量为3500kDa)于磷酸盐缓冲液(PB)中透析过夜；取出截留液缓慢加入等体积饱和硫铵(pH＝7.0)，控制硫酸铵速度为3-4mL/min，边加边搅拌，静置2h后，以12000r/min离心10min；弃上清液，用0.6倍体积PB溶解沉淀，将溶解后的溶液装入27MM透析袋(截流分子量为3500kDa)后，继续用PB透析，期间换液3次，每次换液的时间间隔不得少于5h，将截留液以12000r/min离心10min，弃去沉淀，上清液用0.22μm滤器过滤后即为所需的单克隆抗体溶液。用PB稀释5倍后，测定OD₂₈₀值，用PB调整，得到OD₂₈₀值0.2-0.9的抗TSLP单克隆抗体溶液。加入0.02％NaNO₃水溶液，分装后保存于-20℃的冰箱中。

2.抗体纯度及分子量测定

取OD₂₈₀值0.8的抗TSLP单克隆抗体溶液用SDS-PAGE电泳初步鉴定抗体，同时以人TSLP抗体标品(购自Peprotech)为对照，如图1中A及B，A中泳道1为人TSLP抗体标品，泳道2为制备所得的人TSLP单克隆抗体。B中泳道1和2都是制备所得的人TSLP单克隆抗体，泳道3是人TSLP抗体标品。该非还原性电泳显示了蛋白在125kDa附近有条带，符合理论值。

实施例4单克隆抗体的特性鉴定

1.抗体亚型的鉴定

采用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Proteintech)，鉴定实施例3得到的抗人TSLP单克隆抗体的亚型，酶标板上预包被了针对小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM的特异性抗体，具体实验操作见试剂盒说明书。结果如图2，我们得到的抗人TSLP单克隆抗体的重链亚型为IgG1，轻链为Kappa。

所述重链的可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1:Asn-Tyr-Gly-Met-Asn

CDR2:Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly

CDR3:Gly-Leu-Thr-Gly-Thr-Arg-Gly-Arg-Phe-Ala-Tyr

所述轻链的可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1:Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Ser-Thr-Ala-Val-Ala

CDR2:Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-His-Thr

CDR3:Gln-Gln-His-Tyr-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr。

2.Western-blotting检测抗体与TSLP蛋白的结合情况

采用Western-blotting法将实施例3制备的抗人TSLP单克隆抗体以及人TSLP抗体标品(购自Peprotech)进行检测分析。通过制备还原性SDS-PAGE电泳，将实施例1制备所得人TSLP重组蛋白转移到PVDF膜上，并分别将人TSLP单克隆抗体(1：100)以及商业化的人TSLP抗体(1：1000)作为一抗进行孵育，再用HRP缀合的二抗进行孵育，通过化学发光进行检测。实验结果(图3)显示，人TSLP单克隆抗体检测到了人重组TSLP蛋白，大小为15kDa，说明该抗体具有较强的特异性，可以用于人重组TSLP蛋白的检测。

3.单克隆抗体浓度和效价

取OD₂₈₀值0.8的抗人TSLP单克隆抗体溶液用紫外分光光度计测定280nm和260nm处的紫外吸收值，并用下列公式计算抗体含量：抗体含量(mg/mL)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀)×稀释倍数，测得纯化后的单克隆抗体浓度为2.331mg/mL。腹水型单抗在稀释6.55×10⁵倍时，OD值均为阴性对照的2倍以上，表明其效价为6.55×10⁵(图4)，并确定单克隆抗体稀释5000倍为最佳检测浓度。

4.单克隆抗体特异性以及灵敏度检测

将实施例3制备的OD₂₈₀值0.8的抗人TSLP单克隆抗体溶液以及人TSLP抗体标品用PBS稀释10倍后，以2⁰-2¹⁶倍比稀释后作为待测样品，采用ELISA方法检测单克隆抗体的灵敏性，最后根据结果，最终确定人TSLP单克隆抗体以及人TSLP抗体标品的最佳稀释倍数，分别为50倍和10倍，结果(图5)显示本发明制备的人TSLP(hTSLP ELISA Kit)灵敏度高于人TSLP抗体标品(hTSLP-specific mAb)。

5.用单克隆抗体检测肿瘤细胞TSLP蛋白含量

为了检测生物样本中的人TSLP蛋白含量，在12孔板中加入含10％血清的DMEM培养基，接种人宫颈癌细胞系Hela，接种量为10⁶/孔，两天后收集细胞上清液用于检测TSLP含量。ELISA检测前一天，将人TSLP单克隆抗体作为捕获抗体用碳酸盐包被缓冲液稀释至0.1mg/ml，加入到96孔酶标板中，每孔100μL。密封好，在4℃下过夜放置。检测前，将所有的试剂在室温条件下放置，以平衡试剂。吸除包被液，用300μL的ELISA洗涤液(1000mL PBS中加入0.50mL Tween-20，pH7.4)洗涤酶标板4遍，最后翻转酶标板，在滤纸上拍击，甩净残余的缓冲液。每孔用200μL稀释液(PBS+BSA)进行封闭，密封酶标板，室温下1h。吸除封闭液，用300μL的洗涤液洗涤酶标板4遍，最后翻转酶标板，在滤纸上拍击，甩净残余的缓冲液。每孔分别加100μL细胞上清液，密封室温孵育2h。吸除细胞上清液，用300μL的ELISA洗涤液洗涤酶标板4遍，最后翻转酶标板，在滤纸上拍击，甩净残余的缓冲液。每孔加100μL稀释液(PBS+BSA)，密封室温孵育1h。吸除稀释液，用300μL的ELISA洗涤液洗涤酶标板4遍，最后翻转酶标板，在滤纸上拍击，甩净残余的缓冲液。每孔加100μL Avidin-HRP稀释液，密封室温孵育0.5h。吸除Avidin-HRP稀释液，用300μL的ELISA洗涤液洗涤酶标板5遍，最后一遍振摇0.5min，最后翻转酶标板，在滤纸上拍击，甩净残余的缓冲液。每孔加100μL TMB显色剂，室温暗处孵育15分钟。每孔加100μL终止液。30min以酶标仪读取A450，背景A570。计算检测Hela细胞上清液中TSLP含量，并将结果与阳性对照，即人TSLP抗体标品(hTSLP-specificmAb)ELISA试剂盒检测结果(图6)进行对比，无显著性差异，证明获得的人TSLP单克隆抗体(hTSLP ELISA Kit)具有良好的生物学活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种抗人TSLP单克隆抗体及其制备与应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Gly Leu Thr Gly Thr Arg Gly Arg Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

aactatggaa tgaac 15

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

tggataaaca cctacactgg agagccaaca tatgctgatg acttcaaggg a 51

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

gggctaactg ggaccagggg gcgttttgct tac 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

aaggccagtc aggatgtgag tactgctgta gcc 33

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

tgggcatcca cccggcacac t 21

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

cagcaacatt atagcactcc tccgacg 27

<210> 13

<211> 120

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Arg Gly Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种抗人TSLP单克隆抗体，其特征在于所述抗人TSLP单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的CDR1、CDR2、CDR3互补决定区或其功能可变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3互补决定区或其功能可变体；所述功能可变体是指与SEQ ID NO.1-6中任意一个氨基酸序列具有至少70％序列同源性的功能活性变体；

所述重链可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1:Asn-Tyr-Gly-Met-Asn，SEQ ID NO.1；

CDR2:Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly，SEQ ID NO.2；

CDR3:Gly-Leu-Thr-Gly-Thr-Arg-Gly-Arg-Phe-Ala-Tyr，SEQ ID NO.3；

所述轻链可变区的三个互补决定区序列分别为：

CDR1:Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Ser-Thr-Ala-Val-Ala，SEQ ID NO.4；

CDR2:Trp-Ala-Ser-Thr-Arg-His-Thr，SEQ ID NO.5；

CDR3:Gln-Gln-His-Tyr-Ser-Thr-Pro-Pro-Thr，SEQ ID NO.6。

2.如权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体，其特征在于所述重链可变区的三个互补决定区核苷酸序列分别为：

CDR1：AACTATGGAATGAAC，SEQ ID NO.7；

CDR2：TGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGA，SEQ ID NO.8；

CDR3：GGGCTAACTGGGACCAGGGGGCGTTTTGCTTAC，SEQ ID NO.9。

3.如权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体，其特征在于所述轻链可变区的三个互补决定区核苷酸序列分别为：

CDR1：AAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCC，SEQ ID NO.10；

CDR2：TGGGCATCCACCCGGCACACT，SEQ ID NO.11；

CDR3：CAGCAACATTATAGCACTCCTCCGACG，SEQ ID NO.12。

4.如权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体，其特征在于所述重链可变区由SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的CDR1、CDR2、CDR3组成，氨基酸序列如下：

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGLTGTRGRFAYWGQGTLVTVSA，SEQ ID NO.13。

5.如权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体，其特征在于所述轻链可变区由SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3组成，氨基酸序列如下：

DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPPTFGGGTKLEIK，SEQ ID NO.14。

6.一种权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述方法为：以源自大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GDMCC No:60083的重组人TSLP蛋白作为抗原，免疫Balb/c小鼠，待其血清效价达到融合要求，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，通过HAT选择性培养基筛选得到能稳定分泌抗人TSLP抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通过Protein A/G亲和层析柱纯化获得抗人TSLP单克隆抗体；所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2016年9月30日，保藏编号为GDMCC No:60083，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。

7.一种用于制备权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体的大肠埃希氏菌，所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2016年9月30日，保藏编号为GDMCC No:60083，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075。

8.一种权利要求1所述抗人TSLP单克隆抗体在制备检测人TSLP蛋白含量试剂盒中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述试剂盒为检测肿瘤细胞中人TSLP蛋白含量试剂盒。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为人宫颈癌细胞系Hela。