CN114028561A

CN114028561A - 一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)单克隆抗体浓缩溶液的制备方法

Info

Publication number: CN114028561A
Application number: CN202111283570.2A
Authority: CN
Inventors: 薛刚; 朱华杰; 戴长松; 李帅; 许芹; 郭彩明; 陈卫; 吴亦亮
Original assignee: Jiangsu Quanxin Biomedical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Quanxin Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-11-01
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-11-01
Also published as: CN114028561B

Abstract

本申请公开了一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体浓缩溶液的制备方法，包括下述步骤：步骤一：将含有抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的溶液浓缩得到第一浓缩样品；步骤二：采用缓冲溶液置换所述第一浓缩样品，得到置换浓缩液；步骤三：将所述置换浓缩液和氨基酸保护剂母液混匀得到混合液，将所述混合液进行超滤浓缩后得到第二浓缩样品。本申请所述制备方法能够降低高浓度抗体药液的粘度并提高稳定性，方法简单易行，能够进行放大生产，可以保证样品的高纯度并获得较高的回收率。

Description

一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体浓缩溶液的制备方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)单克隆抗体浓缩溶液的制备方法。

背景技术

治疗用生物制品作为一个快速增长的市场，拥有众多的研发管线，同时为患者带来更多创新疗法，针对一些传统小分子药物较难治疗的自身免疫相关的疾病，生物制剂靶向药物提供了更多的选择。另一方面为了降低生物制剂的临床使用成本，并提高患者的依从性，生物制剂剂型逐渐由冻干剂型向水针剂型转变，给药途径也由静脉给药方式向皮下注射剂型转变。由于单克隆抗体注射液的给药剂量通常在100mg～600mg范围，而皮下注射药液体积一般限制在2ml以下，在所述情况下，必须制备高度浓缩的蛋白制剂，通常蛋白含量可达到100mg/ml或者更大的浓度。

高浓度的单克隆抗体注射液给生产工艺的可制造、工艺放大、及最终的患者施用带来了许多挑战。最主要的一个挑战是超高的粘度，由于单克隆抗体的生物高分子特性，以及蛋白分子间相互作用力(如疏水、电荷作用等) 在高浓度条件时增强，倾向于形成高粘性溶液。在某些极端情况下甚至会形成凝胶状物质，这对超滤膜和超滤设备本身带来不小的挑战，比如最终浓缩时压差的急速上升导致的切向流速减小，浓差极化逐渐失控，直至出现蛋白沉淀将膜堵塞的现象，如此必然会造成回收率降低或工艺失败。另一方面，即使通过改进设备或膜包类型获得最终的高浓度蛋白溶液，也难以将其投入到实际的临床应用中，因为皮下给药时需要使用一次性无菌注射器吸取或者采用预充针的最终包装形式，而过高的粘度将导致装药注射器的滑动性能降低，从而无法手动推注入皮下。超滤浓缩高浓度单克隆抗体药液的另一个难题是在高度浓缩时蛋白样品容易聚集形成可溶性聚体，进一步会聚集形成蛋白沉淀。

因此，针对高浓度的抗人TSLP单克隆抗体皮下注射剂的制备，需要开发一种能够有效降低超滤浓缩液的粘度、减少单克隆抗体聚集并提高其稳定性的浓缩液。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本申请提供了一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的浓缩液，所述浓缩液包含蛋白质浓度为 100-300mg/ml的抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体和氨基酸浓度为10～500mM的氨基酸保护剂，所述的浓缩液能够有效降低超滤浓缩液的粘度、减少抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体聚集并提高其稳定性，可以用于注射剂，尤其是皮下注射剂。

QX008N为自主研发的抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体，胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)作为一种新型细胞因子，通常在肺，皮肤和肠屏障表面的上皮细胞中表达。TSLP驱动下游T2细胞因子的释放，包括IL-4、IL-5和IL-13，导致炎症和哮喘症状。TSLP也能激活参与非T2 驱动炎症的多种类型细胞。QX008N可特异性的与TSLP结合，阻止免疫细胞释放促炎细胞因子，从而预防哮喘恶化、改善哮喘控制。

目前国内外尚未有上市的靶向人(TSLP)单克隆抗体药物，其中安进和阿斯利康合作开发的Tezepelumab进度最快，目前正在进行3期临床研究，其制剂浓度为70mg/ml，给药剂量约为210mg，拟给药方式为静脉或皮下注射。体外药效学研究表明QX008N生物学活性与Tezepelumab相当。从降低生物制剂的临床使用成本、提高患者依从性的角度来看，抗TSLP单克隆抗体药物的优选剂型是皮下注射剂，如将QX008N制备成皮下注射液，则该皮下注射液中的蛋白含量要高达100～150mg/mL。

本申请具体技术方案如下：

本申请提供一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体浓缩溶液的制备方法，包括下述步骤：

步骤一：将含有抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的溶液浓缩得到第一浓缩样品；

步骤二：采用缓冲溶液置换所述第一浓缩样品，得到置换浓缩液；

步骤三：将所述置换浓缩液和氨基酸保护剂母液混匀得到混合液，将所述混合液进行超滤浓缩后得到第二浓缩样品；

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)和三个轻链互补决定区 (CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)，其中：

CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

在步骤一中，浓缩条件为流速为120-300L/m²·h，跨膜压差(TMP)为 0.6-1.5bar；

在步骤二中，缓冲溶液的使用量为第一浓缩样品重量的5倍以上、优选 6～8倍、例如7倍；

在步骤三中，混合液中的氨基酸浓度为50～300mmol/L、优选为100mmol/L～250mmol/L、更优选为150mmol/L～200mmol/L，所述第二浓缩样品中的蛋白质浓度为100-200mg/ml。

在本申请中，所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

在本申请中，所述第一浓缩样品中的蛋白质浓度为20～60mg/ml，优选为30～50mg/ml。

在本申请中，所述缓冲溶液的浓度为5-50mM，优选为20mM；

优选地，所述缓冲溶液的pH为5.5～6.5，优选为5.7～6.3。

在本申请中，所述缓冲溶液为组氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠-醋酸缓冲液，优选为组氨酸-盐酸缓冲液。

在本申请中，所述氨基酸保护剂选自盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸中的一种或两种以上。

在本申请中，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸和组氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述组氨酸的浓度为 10-50mM；

优选地，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸和甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述甲硫氨酸的浓度为 2-50mM。

优选地，所述氨基酸保护剂包括组氨酸和甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述组氨酸的浓度为10-50mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM。

优选地，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸、组氨酸以及甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述组氨酸的浓度为10-50mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂母液的浓度为0.5mol/L～2.0mol/L，优选为1mol/L～1.5mol/L。

在本申请中，在所述第二浓缩样品中所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)单克隆抗体的浓度在180mg/mL以上时，所述第二浓缩样品的粘度小于或等于20cP；

优选地，在所述第二浓缩样品中所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)单克隆抗体的浓度在140mg/mL以上时，所述第二浓缩样品的粘度小于或等于10cP。

在本申请中，所述含有抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的溶液通过对表达抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的细胞发酵液进行亲和层析、低pH灭活、阴离子层析、阳离子层析和纳滤得到。

本申请所述的抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体浓缩溶液(即第二浓缩样品)，其包含抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP) 单克隆抗体，并且所述第二浓缩样品的粘度较低，可用注射器轻松推注，因此可以用作注射剂，尤其是皮下注射剂。

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体与现有技术中的抗人TSLP单克隆抗体(Tezepelumab为安进/阿斯利康公司研发的靶向 TSLP的单克隆抗体药物，Tezepelumab治疗重度哮喘的三期临床NAVIGATOR获得成功)相比，结合TSLP的亲和力相当，且细胞水平的中和活性优于Tezepelumab。

本申请的抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体，在细胞水平显示出优于Tezepelumab(根据专利公开序列表达制备)的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。

附图说明

图1是显示构建HZD8G2-57瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。其中， M：Marker；条带1：PCR产物8G2VH-Hu27；条带2：pHZDCH，HindIII/NheI；条带3：PCR产物8G2VK-Hu14；条带4：pHZDCK，HindIII/BsiWI。

图2是瞬转表达流程图。

图3是QX008N(HZD8G2-57)的电泳检测图。

图4是显示QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase细胞中STAT5磷酸化的活性图。

图5是显示QX008N和Tezepelumab中和天然TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性图。

图6是显示QX008N和Tezepelumab中和食蟹猴TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性图。

图7是显示QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人全血释放TARC (CCL17)活性图。

图8是显示QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人PBMC细胞释放TARC(CCL17)活性图。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

在本申请中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。

在本申请中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(K_D)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。

哺乳动物细胞

本申请所述单克隆抗体体外发酵生产使用的哺乳动物细胞包括但不限于目前通用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，优选的是CHO 细胞。

切向流超滤(Tangential Flow Filtration，TFF)

切相流超滤是指液体流动方向切向(平行)于滤膜表面的过滤形式，相比流动方向与滤膜垂直方向的传统过滤方式(NFF)，切向流滤膜表面的颗粒堆积较少，过滤速度稳定，适用于大体积样品的分离。其中，大于膜孔径的分子被截留并逐步浓缩，小于膜孔径的物质透过膜，从大分子溶液中分离出来，实现大分子和小分子的分离。因而切向流超滤常用于生物制品的浓缩、透析、缓冲溶液、不同尺寸分子的分离等。

CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(SYYMS)所示；

CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(FISYGGSAYHATWAQG)所示；

CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(EFRSMTYGAEWGI)所示；

CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASESIYDTLA)所示；

CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(SASSLAS)所示；

CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QQGYTMPDVDKNP)所示。

具体地，在步骤一中，所述流速可以为120L/m²·h、150L/m²·h、180L/m²·h、200L/m²·h、250L/m²·h、300L/m²·h等。

跨膜压差(TMP)可以为0.6bar、0.7bar、0.8bar、0.9bar、1.0bar、1.1bar、 1.2bar、1.3bar、1.4bar、1.5bar等。

在步骤一中，浓缩样品的蛋白质浓度可以为20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml等；

在步骤二中，缓冲溶液的使用量为浓缩样品重量的5倍以上、优选6～8 倍、例如7倍；

具体地，当缓冲溶液的使用量为浓缩样品重量的5倍、6倍、7倍、8 倍、9倍或10倍等时得到步骤二溶液，所述使用量为体积使用量。

在步骤三中，所述混合液中的氨基酸浓度为50～500mmol/L，、优选为 100mmol/L～250mmol/L、更优选为150mmol/L～200mmol/L，所述第二浓缩样品中的蛋白质浓度为100-200mg/ml。

具体地，所述混合液中的氨基酸浓度可以为50mmol/L、100mmol/L、 150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、 450mmol/L或500mmol/L等。

具体地，所述第二浓缩样品中的蛋白质浓度可以为100mg/ml、110mg/ml、 120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml等。

所述单克隆抗体表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本申请使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWV GFISYGGSAYHATWAQGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EFRSMTYGAEWGIWGQGTLVTVSS；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列为 AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASESIYDTLAWYQQKPGKAPKLLIYS ASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTMPDVDKN PFGGGTKVEIK。

在本申请中，人胸腺基质淋巴细胞生成素(Human Thymic StromalLymphopoietin，TSLP)表示一种源自人的细胞因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中，下划线部分表示信号肽。

SEQ ID NO：9：

MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLI TYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKT KAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRR FNRPLLKQQ

在本申请中，“抗人TSLP单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人TSLP，使得所述单克隆抗体可用作靶向人TSLP的诊断剂和/或治疗剂。

本申请的抗人TSLP单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人TSLP以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本申请的抗人TSLP单克隆抗体与作为其靶标的人TSLP的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人TSLP单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。

本申请的抗人TSLP单克隆抗体与其他动物种属的TSLP可以不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如狨猴、食蟹猴、猪、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等；这里，“不结合”是指：在将本申请的抗人TSLP单克隆抗体与作为其靶标的人TSLP的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人TSLP单克隆抗体与其他动物种属的TSLP的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。

本申请的人TSLP单克隆抗体具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤40nM 的平衡解离常数(KD)。

实验结果显示，本申请的抗人TSLP单克隆抗体可以特异性结合人TSLP。

本申请的抗人TSLP单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单克隆抗体产品相当、或优于上市同类单克隆抗体产品。所述生物活性例如中和人、天然、食蟹猴TSLP诱导细胞中STAT5磷酸化的活性、中和人TSLP诱导人全血、人PBMC细胞释放TARC(CCL17)的活性等。

在一个具体实施方式中，本申请的抗人TSLP单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

SEQ ID NO：10

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWV GFISYGGSAYHATWAQGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EFRSMTYGAEWGIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO：11

AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASESIYDTLAWYQQKPGKAPKLLIYS ASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTMPDVDKN PFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

其中，SEQ ID NO：10和11均为经人源化的序列。

在本申请中，“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。

在本申请中，“分离的编码抗TSLP单克隆抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。

在本申请中，“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。

在本申请中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。

在本申请中，“药物组合物”表示这样的制品：其呈现使得包含在其中的活性成分的生物活性能够发挥效果的形式，并且所述组合物不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。

在本申请中，“药学上可接受的载体”表示药物组合物中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在本申请书中，“单克隆抗体”一般为人抗体，其可以使用本领域技术人员公知的技术来制备，例如，人抗体一般描述于van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr. Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过向已经经过修饰而对抗原攻击刺激生产完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备抗体，这些动物通常含有一部分或全部的人类免疫球蛋白基因座，其替换了内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合于动物体内。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活，关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.(自然生物技术)23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584描述的XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429描述的

技术；美国专利No.7,041,870 描述的

技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900 描述的

技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞(参见例如Kozbor,D.,J. Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987), pp.51-63；Boerner,P.等，J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生产的人抗体也记载于Li,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA103:3557-3562(2006)。其他方法包括那些记载于例如美国专利No. 7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)以及Ni,XiandaiMianyixue,26(4)；265-268(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma 技术)也记载于Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20:927-937(2005)；Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in ExperimentalandClinical Pharmacology 27:185-191(2005)。

还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体，然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。

还可以基于自抗体文库选择人抗体，即可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离人抗体。例如，用于生产噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。这种方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等，Methods in Molecular Biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.等，Nature 348:552-554(1990)；Clackson,T.等，Nature 352:624-628(1991)；Marks,J.D. 等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.等，J.Mol.Biol. 338:299-310(2004)；Lee,C.V.等，J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse, F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.等，J. Immunol.Methods284:119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和 VL基因的全集，并在噬菌体文库中随机重组，然后在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体，如记载于Winter,G.等，Ann.Rev.Immunol. 12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由 Griffiths,A.D.等，EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由 Hoogenboom,H.R.andWinter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373 及美国专利公开文本No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、 2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

所述抗体也可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature305:537-540(1983)；WO 93/08829；及Traunecker,A.等，EMBO J.10:3655-3659(1991))和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.等，Science 229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S. A.等，J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber,M.等，J. Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.等，J. Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。

本申请中所述的单克隆抗体还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576)。

本申请中的抗体还可以包括WO 2009/080251、WO 2009/080252、 WO2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、 WO2010/136172、WO 2010/145792、及WO 2010/145793、WO 2011/117330、 WO 2012/025525、WO 2012/025530、WO 2013/026835、WO2013/026831、 WO 2013/164325、或WO 2013/174873中记载的多特异性抗体。

本申请中所述的单克隆抗体也可以是抗体变体，例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。因此，在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体，用于置换突变的感兴趣的位点包括HVR 和FR，例如，可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合性，降低的免疫原性，或改善的ADCC 或CDC。

在本申请中，在步骤一中，所述第一浓缩样品中的蛋白质浓度为 20-60mg/ml，优选为30～50mg/ml。例如所述蛋白质浓度可以为20mg/ml、 30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或60mg/ml。

在本申请中，在步骤二中，对于缓冲溶液的浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如缓冲溶液的浓度为5-50mM，优选为20mM。

对于缓冲溶液的pH，本申请不作任何限制，其只要为偏酸性即可，例如，缓冲溶液的pH为5.5～6.5，优选为5.7～6.3。

具体地，所述缓冲溶液的浓度可以为5mM、10mM、20mM、30mM、 40mM或50mM等；置换溶液的pH可以为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4或6.5等。

具体地，所述柠檬酸缓冲液可以为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

具体地，所述磷酸盐缓冲液可以为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

优选的，使用蠕动泵将置换的缓冲液泵入浓缩样品中，继续超滤，同时调节缓冲溶液的泵入速度与透过流速一致，当缓冲溶液的泵入量为浓缩样品重量的7倍以上时即完成置换。

在本申请中，在步骤三中，所述氨基酸保护剂选自保护剂选自盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸中的一种或两种以上。

在本申请中，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸和组氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，优选为150mM，所述组氨酸的浓度为10-50mM，优选为20mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂由盐酸精氨酸和组氨酸组成，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，优选为150mM，所述组氨酸的浓度为10-50mM，优选为20mM。

具体地，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸浓度可以为100mM、 110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、 190mM或200mM。

具体地，在所述第二浓缩样品中，所述组氨酸的浓度可以为10mM、 11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、 20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、 29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、 38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、 47mM、48mM、49mM、或50mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸和甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，优选为150mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM，优选为10mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂由盐酸精氨酸和甲硫氨酸组成，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，优选为150mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM，优选为10mM。

具体地，在所述第二浓缩样品中，所述甲硫氨酸的浓度可以为2mM、 3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、 31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、 40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、 49mM、或50mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂包括组氨酸和甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述组氨酸的浓度为10-50mM，优选为20mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM，优选为10mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂由组氨酸和甲硫氨酸组成，在所述第二浓缩样品中，所述组氨酸的浓度为10-50mM，优选为20mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM，优选为10mM。

具体地，在所述第二浓缩样品中，所述甲硫氨酸的浓度可以为2mM、 3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、 13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、 31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、 40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、 49mM、或50mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸、组氨酸以及甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述组氨酸的浓度为10-50mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM。

在本申请中，所述氨基酸保护剂由盐酸精氨酸、组氨酸以及甲硫氨酸组成，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述组氨酸的浓度为10-50mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM。

对于氨基酸保护剂母液的浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如在一个实施方案中，所述氨基酸保护剂母液的浓度为0.5-2.0mol/L，优选为1-1.5mol/L。

具体地，所述氨基酸保护剂母液的浓度可以为0.5mol/L、1.0mol/L、 1.5mol/L或2.0mol/L等。

具体地，在步骤三中，计算缓冲溶液中的蛋白质浓度，并计算该置换浓缩液的理论体积，并加入氨基酸保护剂母液混匀，优选的，氨基酸保护剂的体积是置换浓缩液体积的1/9，使得氨基酸的浓度为100mM～150mM，进行超滤浓缩后得到第二浓缩样品中的蛋白质浓度为100-200mg/ml，所述第二浓缩样品的粘度≤20cP。

在本申请中，所第二浓缩样品中所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)单克隆抗体的浓度在180mg/mL以上时，所述第二浓缩样品粘度小于或等于20cP。

在本申请中，所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的浓度在140mg/mL以上时，所述第二浓缩样品粘度小于或等于10cP。

所述细胞发酵液生产使用的哺乳动物包括但不限于目前使用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，优选的是CHO细胞。

所述亲和层析采用ProteinA进行亲和层析。

具体地，在步骤一和步骤二时，使用的超滤膜包的材质包括但不限于改良聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、醋酸纤维素(CA)等，其孔径通常采用30kDa或50kDa，优选的，超滤膜包为默克密理博的Pellicon2/Pellicon3 (A型筛网，30kDa)，以及赛多利斯和颇尔公司的超滤膜包。

本申请使用上述所述的方法来制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素 (TSLP)单克隆抗体浓缩溶液，能够降低粘度，避免堵塞现象，同时抑制蛋白聚集沉淀，起到保护剂作用。并且所述的方法简单易行，能够进行放大生产，可以保证样品的高纯度并获得较高的回收率。同时，经过对不同亚型的高浓度抗体进行验证，证明本申请中的添加氨基酸保护剂母液降低粘度的方法具有较强的适用性及良好的稳定性。

实施例

本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1抗人TSLP单克隆抗体QX008N的制备

从上海近岸科技有限公司采购人胸腺基质淋巴细胞生成素(hTSLP)，用于免疫新西兰兔，运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合人TSLP并具有人TSLP抑制活性的单克隆抗体。通过Binding ELISA和Blocking ELISA检测细胞上清，挑选出目标克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。

先后挑选出7个克隆进行重组表达，并测序。经测定，8G2的细胞中和活性最好。因此，对8G2克隆进行人源化改造。利用NCBI IgBlast进行人 IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将8G2克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQ IDNo:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-12*01作为轻链CDR移植模板，将8G2克隆轻链的CDR区(即 CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ ID No:6))移植入IGKV1-12*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，获得本申请的单克隆抗体QX008N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

上述重链可变区(SEQ ID NO：7)的基因和轻链可变区(SEQ ID NO：8) 的基因，利用PCR扩增获得。用HindIII和NheI双酶切重链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pHZDCK；用Infusion重组酶将PCR 扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒 pHZDCH-8G2VH-Hu27和轻链表达质粒pHZDCK-8G2VK-Hu14。

通过核酸电泳检测PCR扩增的可变区基因片段和双酶切的质粒结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链可变区PCR 扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，重链可变区约477bp，轻链可变区约447bp。

将序列正确的重链表达质粒pHZDCH-8G2VH-Hu27(所表达的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)和轻链表达质粒pHZDCK-8G2VK-Hu14(所表达的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×10⁶个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×10⁶个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。

转染后第6天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE 电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX008N(HZD8G2-57)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(49.3kDa)和轻链(23.6kDa)理论分子量一致。

实施例2平衡解离常数(KD)的测定

用Biacore T200检测QX008N(HZD8G2-57)与人TSLP的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。

除此之外，将QX008N(HZD8G2-57)与目前已经处于临床III期的针对人 TSLP的单克隆抗体，即Tezepelumab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX008N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中 Tezepelumab根据专利US20110274687A1提供的A5序列，构建表达质粒，瞬转ExpiCHO-S细胞自制获得。

表1抗人TSLP单克隆抗体结合人TSLP的亲和力

样品名称	k<sub>a</sub>(10<sup>6</sup>M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>)	k<sub>d</sub>(10<sup>-5</sup>S<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(10<sup>-11</sup>M)
				QX008N	1.74	2.99	1.75
Tezepelumab	2.70	6.46	2.38

表中的数据为：每个样品检测三次，计算平均值的数据。

实施例3 QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性利用SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞系测定QX008N拮抗人TSLP 通过TSLPR-IL-7R介导的胞内信号分子STAT5磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×10⁴细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO₂条件下培养过夜。向细胞中加入提前孵育的抗体和人TSLP混合液，其中QX008N的终浓度范围为0至50ng/ml，Tezepelumab的终浓度范围为0至400ng/ml，TSLP 的终浓度为0.5ng/ml。然后在37℃和5％CO₂条件下培养24小时，弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-Luciferase Reagent检测试剂，作用30min，每孔取100μl至白色96孔板，检测Luminescence荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图4所示。

图4所示的结果显示，QX008N能够抑制人TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化，QX008N抑制人 TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的 IC₅₀为0.837ng/ml，而Tezepelumab抑制人TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为 3.8ng/ml。

实施例4 QX008N和Tezepelumab中和天然TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性利用SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞系测定QX008N拮抗天然TSLP 通过TSLPR-IL-7R介导的胞内信号分子STAT5磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×10⁴细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO₂条件下培养过夜。向细胞中加入提前孵育的抗体和天然TSLP混合液，其中QX008N的终浓度范围为0至50ng/ml，Tezepelumab的终浓度范围为0至400ng/ml，天然TSLP的终浓度为原液稀释62.5倍。然后在37℃和5％CO₂条件下培养 24小时，弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-Luciferase Reagent检测试剂，作用30min，每孔取100μl至白色96孔板，检测Luminescence 荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图5所示。

图5所示的结果显示，QX008N能够抑制天然TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化，QX008N抑制天然 TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的 IC₅₀为0.462ng/ml，而Tezepelumab抑制天然TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为 1.45ng/ml。

实施例5 QX008N和Tezepelumab中和食蟹猴TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性利用SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞系测定QX008N拮抗食蟹猴 TSLP通过TSLPR-IL-7R介导的胞内信号分子STAT5磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×10⁴细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO₂条件下培养过夜。向细胞中加入提前孵育的抗体和食蟹猴TSLP混合液，其中 QX008N的终浓度范围为0至50ng/ml，Tezepelumab的终浓度范围为0至 400ng/ml，食蟹猴TSLP的终浓度为0.5ng/ml。然后在37℃和5％CO₂条件下培养24小时，弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-Luciferase Reagent检测试剂，作用30min，每孔取100μl至白色96孔板，检测Luminescence荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图6所示。

图6所示的结果显示，QX008N能够抑制食蟹猴TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化，QX008N抑制食蟹猴TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为0.889ng/ml，而Tezepelumab抑制食蟹猴TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为 1.88ng/ml。

实施例6 QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人全血释放TARC (CCL17)活性

利用人全血测定QX008N拮抗人TSLP通过TSLPR-IL-7R诱导的TARC (CCL17)释放活性：将全血按照100μl/孔加入到96孔板中，暂存于37℃和5％CO₂条件下，向全血中加入提前孵育的抗体和人TSLP混合液，其中抗体的终浓度范围为0至10μg/ml，人TSLP的终浓度为0.5ng/ml，并加入终浓度为0.5ng/ml的IL-33。然后在37℃和5％CO₂条件下培养48小时，收集细胞培养上清采用夹心ELISA法检测上清中TARC(CCL17)的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图7所示。

从图7所示的结果显示，QX008N能够抑制人TSLP诱导的全血释放 TARC(CCL17)，QX008N抑制人TSLP诱导的全血释放TARC(CCL17) 活性的IC₅₀为0.839ng/ml，而Tezepelumab抑制人TSLP诱导的全血释放 TARC(CCL17)活性的IC₅₀为23.9ng/ml。

实施例7 QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人PBMC细胞释放TARC(CCL17)活性利用人PBMC细胞测定QX008N拮抗人TSLP通过TSLPR-IL-7R诱导的 TARC(CCL17)释放活性：按密度梯度离心法分离出PBMC，将PBMC按照300000个/孔加入到96孔板中，暂存于37℃和5％CO₂条件下，向PBMC 中加入提前孵育的抗体和人TSLP混合液，其中抗体的终浓度范围为0至 10μg/ml，人TSLP的终浓度为0.5ng/ml，并加入终浓度为0.5ng/ml的IL-33。然后在37℃和5％CO₂条件下培养48小时，收集细胞培养上清采用夹心 ELISA法检测上清中TARC(CCL17)的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图8所示。

从图8所示的结果显示，QX008N能够抑制人TSLP诱导的PBMC细胞释放TARC(CCL17)，QX008N抑制人TSLP诱导的PBMC细胞释放TARC (CCL17)活性的IC₅₀为77.1ng/ml，而Tezepelumab抑制人TSLP诱导的 PBMC细胞释放TARC(CCL17)活性的IC₅₀为216ng/ml。

实施例8包含抗人TSLP单克隆抗体高浓度超滤浓缩后粘度的比较

使用CHO细胞作为宿主细胞，在2L规模的生物反应器上进行发酵，生产实施例1所得到的抗体QX008N，通过离心机或深层膜包过滤获得澄清发酵液，采用ProteinA层析进行目的蛋白的捕获，再经过低pH值病毒灭活、阴离子和阳离子层析去除杂质，即获得待超滤的中间体样品。

步骤一：采用上述中间体样品进行超滤，超滤设备选用默克密理博的 Labscale小型超滤仪(夹持两块50cm² PelliconXL膜包，截留量30KD)。以120～300L/m²·h的流速，TMP维持在0.6～1.5bar基础上将上述中间体样品浓缩至约30～50mg/ml得到第一浓缩样品。

步骤二：缓冲溶液选用20mM的组氨酸-盐酸缓冲，pH值为6.0，使用蠕动泵将组氨酸-盐酸缓冲液泵入至所述第一浓缩样品中混合得到混合液，将所述混合液继续超滤，同时调节组氨酸-盐酸缓冲液的泵入速度与透过流速一致，即保持样品的重量恒定，待组氨酸-盐酸缓冲液的体积为第一浓缩样品重量的7倍时即完成置换得到置换浓缩液。

步骤三：取样测定置换浓缩液中蛋白质的浓度，并计算此时置换浓缩液的理论体积，并加入1/9理论体积的氨基酸保护剂母液，混匀，使得缓冲体系如表2所示，然后使用默克密理博的30kDa的超滤离心管浓缩至蛋白质浓度为表2的浓度得到第二浓缩溶液。

采用锐欧森的μVISC粘度计测定该浓缩液的粘度，其操作步骤如下：

1.取一次性专用注射器，抽取200～400微升待检样品，排尽注射器内气泡，并用无尘纸轻擦残留液体；

2.用将注射器安放至管槽中固定，点击仪器主机界面，设置剪切速率，设置完成后，点击“Run”进行检测，记录粘度值，一般多次测量取平均值；

3.对于多个样品的检测，前一个样品完成检测后，取出注射器，排空管内液体，无尘纸轻柔擦拭管口后及可进行下一个样品的吸取测量。

表2粘度结果

一般认为，粘度小于30cP的第二浓缩样品适合用作皮下注射剂，由表2 的结果表明，随着蛋白浓度的提高，该抗人TSLP抗体的粘度值呈指数级增加，若无添加剂加入，该抗人TSLP单克隆抗体在浓度为200mg/ml时粘度值会达到45.1cP，如此高的粘度值无法使用常规的超滤膜实现浓缩工艺。通过添加100mM～200mM的氨基酸保护剂母液可以将相同蛋白浓度条件下的抗体粘度值降至原来的50％以下，小于20cP。通过加入氨基酸保护剂(盐酸精氨酸、赖氨酸、脯氨酸或几种氨基酸组合)上述第二浓缩样品，可以明显降低样品药液的粘度值，综上本申请所述的第二浓缩样品，QX008N单克隆抗体注射液的皮下注射给药浓度至少可以达到140mg/mL。

实施例9不同方法的比较

含有抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体QX008N的溶液(UF0)的制备、步骤一和步骤二的方法均与实施例8相同。

步骤三：将步骤二得到的置换浓缩液分成两份分别进行浓缩工艺：

A.从第一份中取样测定置换浓缩液中蛋白质的浓度，并计算此时置换浓缩液的理论体积，并加入1/9理论体积的盐酸精氨酸母液(1.5mol/L)混匀，然后使用默克密理博的30kDa的超滤离心管浓缩得到第二浓缩样品，所述第二浓缩样品的蛋白质浓度为150mg/ml，记为浓缩溶液1(U1F2)；

B.将第二份直接采用步骤一的方法进行浓缩，得到第二浓缩样品，所述第二浓缩样品的蛋白质浓度为150mg/ml，记为浓缩溶液2(U2F2)；

分别检测浓缩溶液1(U1F2)和2(U2F2)的粘度和纯度，其中粘度的测定方法与实施例8的方法相同，纯度的测定方法如下：

1.采用高效液相色谱仪(Agilent 1260或等效仪器)、色谱柱(Waters，

规格：3.5μm，7.8×300mm；或等效色谱柱)，流动相为PBS缓冲液；

2.拧开四元泵管路，在5ml/min流速条件下100％流动相冲洗管路3分钟，拧紧四元泵开关，接上色谱柱，在1.0ml/min流速条件下100％流动相冲洗色谱柱30min；

3.样品分析方法设置：流速为1.0ml/min，分析时间为15min，进样量为50mg；检测波长为280nm；进样前需先检查系统适应性(使用参考品连续进样，进样次数不少于5次，取后5次结果计算)，然后分析1针空白样品，接着分析样品。

4.按照聚合体、主峰及降解产物等顺序依次积分每个样品的色谱峰，所有与空白样品保留时间不一致的色谱峰均应积分，以面积归一法计算各峰比例。

测定结果如表3所示。

表3不同方法处理的粘度和纯度结果

由表3结果可知，在步骤三中的超滤浓缩在添加精氨酸后粘度值由原来的27.5cP下降至8.2cP，同时盐酸精氨酸也作为保护剂一定程度上抑制聚体形成。高浓度的抗人TSLP单抗加入盐酸精氨酸后其粘度值明显降低，不会引起过高的反压，有利于超滤工艺的流速和膜压力的控制，提高了工艺的可操作性。

实施例10放大实验

基于上述实验结果，将实施例8进一步放大至200L中试规模，采用默克密理博Pellicon手动超滤系统，夹持两块0.5m² Pellicon 2型膜包。纳滤后的样品(UF0)以流速120～300L/m²·h，TMP控制在0.6～1.5bar，先进行步骤一的浓缩(UF1)，将样品浓缩至30～50mg/ml；然后进行步骤二采用UA 进行7倍等体积置换(DF)，将样品置换至20mmol/L组氨酸，pH6.0；置换结束，加入盐酸精氨酸母液至终浓度为150mM，之后进行步骤三将样品过浓缩(UF2)，回收样品，实验结果汇总如下表4所示。

表4：

由表4结果可知，超滤工艺放大后，超滤的过程中流速和膜压力的控制参数和收率基本与小试规模一致，顺利实现放大。添加的盐酸精氨酸抑制聚体，超滤后样品的纯度与超滤前基本一致，且在180～200mg/ml范围时粘度值控制在20cP以下，若无精氨酸添加剂则无法通过上述的超滤系统浓缩至如此高浓度。

综上所述，本申请所述的方法能够制备出高浓度、低粘度的抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的浓缩溶液，蛋白质浓度为 100-200mg/ml时，粘度控制在20cP以下，所得到的浓缩溶液可以用于制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体皮下注射剂。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

序列表

<110> 江苏荃信生物医药股份有限公司

<120> 一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体浓缩溶液的制备方法

<130> TPE01807

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 1

Ser Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 2

Phe Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr His Ala Thr Trp Ala Gln Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 3

Glu Phe Arg Ser Met Thr Tyr Gly Ala Glu Trp Gly Ile

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 4

Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 5

Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 6

Gln Gln Gly Tyr Thr Met Pro Asp Val Asp Lys Asn Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr His Ala Thr Trp Ala Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Phe Arg Ser Met Thr Tyr Gly Ala Glu Trp Gly Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 8

Ala Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asp Thr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Met Pro Asp

85 90 95

Val Asp Lys Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 9

Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys

1 5 10 15

Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr

20 25 30

Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn

50 55 60

Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln

65 70 75 80

Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu

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Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

100 105 110

Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg

115 120 125

Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu

130 135 140

Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

145 150 155

<210> 10

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr His Ala Thr Trp Ala Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Phe Arg Ser Met Thr Tyr Gly Ala Glu Trp Gly Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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340 345 350

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355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

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450

<210> 11

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 11

Ala Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asp Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Met Pro Asp

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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体浓缩溶液的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)，其中：

CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

在步骤一中，浓缩条件为流速为120-300L/m²·h，跨膜压差(TMP)为0.6-1.5bar；

在步骤二中，缓冲溶液的使用量为第一浓缩样品重量的5倍以上、优选6～8倍、例如7倍；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一浓缩样品中的蛋白质浓度为20～60mg/ml，优选为30～50mg/ml。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的浓度为5-50mM，优选为20mM；

优选地，所述缓冲溶液的pH为5.5～6.5，优选为5.7～6.3。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为组氨酸-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠-醋酸缓冲液，优选为组氨酸-盐酸缓冲液。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸保护剂选自盐酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸中的一种或两种以上。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸和组氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述组氨酸的浓度为10-50mM；

优选地，所述氨基酸保护剂包括盐酸精氨酸和甲硫氨酸，在所述第二浓缩样品中，所述盐酸精氨酸的浓度为100-200mM，所述甲硫氨酸的浓度为2-50mM。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸保护剂母液的浓度为0.5mol/L～2.0mol/L，优选为1mol/L～1.5mol/L。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述第二浓缩样品中所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的浓度在180mg/mL以上时，所述第二浓缩样品的粘度小于或等于20cP；

优选地，在所述第二浓缩样品中所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的浓度在140mg/mL以上时，所述第二浓缩样品的粘度小于或等于10cP。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述含有抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的溶液通过对表达抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的细胞发酵液进行亲和层析、低pH灭活、阴离子层析、阳离子层析和纳滤得到。