CN108883164B - 针对tigit的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够特异性结合TIGIT的单克隆抗体。所述单克隆抗体具有通过抑制TIGIT与CD155的结合而实质上激活T细胞和天然杀伤细胞的能力。在其他应用中，所述单克隆抗体可用于治疗癌症和传染性疾病。

Description

针对TIGIT的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月4日提交的美国临时专利申请号62/304,045，以及2016年10月26日提交的美国临时专利申请号62/413,025的优先权，其公开内容通过引用方式被全部并入本文。
发明领域
本发明尤其提供的是特异性结合于免疫检查点分子从而导致免疫细胞的大量激活的单克隆抗体及其用途，其中包括在其他应用中，用于治疗癌症和传染病等。
背景技术
抗原特异性免疫应答是一种复杂的生物过程，受到多层的正负调节因子的控制。T细胞最初通过T细胞受体(TCR)，经由T细胞受体识别由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)分子所呈递的同源肽抗原而被刺激。最佳T细胞活化需要由例如CD28之类的共刺激分子所提供的“第二信号”。免疫应答进一步受到共刺激分子的正调节(例如属于TNF受体超家族的OX40、GITR和4-1BB)，并且受到免疫应答受检查点分子(如PD-1和CTLA-4)的负调节。检查点分子的功能是防止体内免疫系统的不利的反应过度；然而，它们也限制了免疫系统有效对抗癌症和传染病的能力。据报道，用拮抗性的单克隆IgG抗体阻断PD-1或CTLA-4的功能，对于人类癌症的免疫治疗是有效的(对于评论，见Pardoll,Nat.Rev.Cancer,12:252-264,2012；Mahoney等,Nat.Rev.Drug Discov.14:561-584,2015；Shin等,Curr.Opin.Immunol.33:23-35,2015；Marquez-Rodas等Ann.Transl.Med.3:267,2015)。
其他检查点分子已经被报道，例如TIM-3、LAG-3、TIGIT、BTLA和VISTA(Mercier等，Front.Immunol.6:418,2015)。TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)是免疫球蛋白超家族的成员，其在细胞质尾部具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，TIGIT在活化的T细胞和自然杀伤(NK)细胞的亚群上表达(Yu等，Nat.Immunol.10:48–57,2009)。已知TIGIT与CD155(也称为PVR和necl-5)、CD112(也称为PVRL2和粘连蛋白-2)以及可能与CD113(也称为PVRL3和粘连蛋白-3)相互作用(Mercier等，supra；Martinet等，Nat.Rev.Immunol.15:243-254,2015)。已报道，TIGIT与在抗原呈递细胞上表达的高亲和力配体CD155的结合会抑制T细胞和NK细胞的功能(Mercier等，同上；Joller等，J.Immunol.186：1338–1342,2011；Stanietsky等,Eur.J.Immunol.43:2138-2150,2013；Li等,J.Biol.Chem.289:17647-17657,2014；Zhang等Cancer Immunol.Immunother.发表于2016年2月3日)。TIGIT还被报道通过调节树突细胞的细胞因子产生来间接抑制T细胞(Yu等，同上)。
肿瘤构成高度抑制性的微环境，在微环境中浸润的T细胞被耗尽并且NK细胞被例如PD-1和TIGIT的检查点分子沉默，从而逃避免疫应答(Johnston等,Cancer Cell.26:926-937,2014；Chauvin等,J.Clin.Invest.125:2046-2058,2015；Inozume等,J.Invest.Dermatol.发表于2015年10月12日)。据报道，CD8+T细胞上TIGIT的高水平表达与AML受试者的不良临床结果相关(Kong等,Clin.Cancer Res.发表于2016年1月13日)。据报道，来自AML受试者的耗尽的TIGIT+CD8+T细胞的功能缺陷，被siRNA介导的TIGIT表达降低所逆转(Kong等，同上)。据报道，在HIV感染期间的血液中和在SIV感染期间的淋巴组织中，效应子CD8+T细胞表现出更高水平的TIGIT(Chew等,PLOS Pathogens,12:e1005349,2016)。此外，据报道，用离体抗体阻断TIGIT，可恢复病毒特异性的CD8+T细胞效应子响应。
概述
本发明尤其提供了与TIG1、TIG2或TIG3中的任何一种竞争结合人TIGIT的抗体。抗体TIG1的特征在于具有序列为SEQ ID NO：14的成熟轻链可变区和序列为SEQ ID NO：10的成熟重链可变区，抗体TIG2的特征在于具有序列为SEQ ID NO：22的成熟轻链可变区和序列为SEQ ID NO：18的成熟重链可变区，抗体TIG3的特征在于具有序列为SEQ ID NO：30的成熟轻链可变区和序列为SEQ ID NO：26的成熟重链可变区，以用于特异性结合TIGIT。一些抗体结合于人TIGIT上的与TIG1、TIG2或TIG3结合的相同的表位。一些抗体抑制人TIGIT与CD155的结合。一些抗体包含三个轻链CDR和三个重链CDR，这些CDR基本上来自TIG1相应的三个轻链CDR和三个重链CDR。一些抗体包含TIG1、TIG2或TIG3的三个轻链CDR和三个重链CDR。一些抗体包含TIG1(轻链中CDR为SEQ ID NO:15-17，重链中CDR为SEQ ID NO:11-13)、TIG2(轻链中CDR为SEQ ID NO:23-25,重链中CDR为SEQ ID NO:19-21)或TIG3(轻链中CDR为SEQ IDNO:31-33，重链中CDR为SEQ ID NOs:27-29)中任一抗体中的如Kabat所定义的三个重链CDR和如Kabat所定义的三个轻链CDR。
一些单克隆抗体与人TIGIT的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO：1的残基35和37和/或SEQ ID NO：1的残基49和51。一些单克隆抗体与人TIGIT的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO：1的残基35、37、49和51。一些单克隆抗体结合于一肽，该肽由SEQ ID NO：1中残基35-51和SEQ ID NO：1中在任一侧不超过5个侧翼氨基酸构成。一些单克隆抗体与由SEQID NO：1的残基35-51所构成的肽结合。所述一些单克隆抗体结合于由SEQ ID NO：1的3至20个连续残基所构成的表位。
一些抗体是嵌合的、人源化的、经饰面的(veneered)或人的。一些抗体具有人IgG1kappa同种型。一些抗体具有人IgG4 kappa同种型。抗体可以是完整抗体或单链抗体、Fab或F(ab')2片段。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含任一上述抗体和药学上可接受的载体。
本发明还提供了在受试者中对肿瘤进行治疗或实现的方法，包括：向患有癌症或有患癌风险的受试者施用有效方案(或有效量)的任一上述抗体。在一些方法中，所述受试者患有急性髓性白血病或成人T细胞白血病。
在一些其他实施方案中，本发明包括将本文所述的抗体与免疫检查点抑制剂的组合使用。免疫检查点的阻断导致抗原特异性T细胞应答的放大，已被证明是人类癌症治疗中的有前途的方法。免疫检查点(配体和受体)的一些例子，其中一些在各种不同类型的肿瘤细胞中被选择性上调，是进行阻断的候选者，包括PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)；PD-L1(程序性死亡配体-1)；BTLA(B和T淋巴细胞衰减因子)；CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)；TIM-3(T细胞膜蛋白3)；LAG-3(淋巴细胞活化基因3)；T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)；CD96；A2aR(腺苷A2a受体)；A2bR(腺苷A2b受体)；CD73(胞外-5'-核苷酸酶)；CD39(ENTPD1、NTPD酶1)；精氨酸酶；吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)；色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)和杀手抑制受体。免疫检查点抑制剂及其组合疗法，在本文其他地方会详细讨论。
本发明进一步提供了治疗受病原体感染的受试者的方法，包括给受试者施用有效方案的任何上述抗体。在一些方法中，所述病原体是HIV或SIV。在一些其他方法中，病原体是病毒、细菌、真菌或原生动物。
在一些另外的方面，本文提供了抗TIGIT抗体，其在包含D51的一个或多个氨基酸残基上与TIGIT多肽结合，其中TIGIT多肽具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体是嵌合的、人源化的或饰面的。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体不结合包含L44、I47或H55的一个或多个氨基酸残基。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体包含SEQ ID NO：14的成熟轻链可变区和SEQ ID NO：10的成熟重链可变区。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列上与TIG1结合于相同的表位。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体包含三个轻链CDR，其包含SEQ ID NO：15-17，和三个重链CDR，其包含SEQ ID NO：11-13。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体包含与SEQ ID NO：35具有至少90％序列同一性的成熟重链可变区和与SEQ IDNO：37具有至少90％序列同一性的成熟轻链可变区。在一些实施方式中，所述成熟重链可变区包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：40的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQ ID NO：41的轻链恒定区连接。
在另一方面，本发明提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体与TIG1、TIG2或TIG3中的任一个竞争结合人TIGIT，其中，抗体TIG1的特征在于具有序列为SEQ ID NO：14的成熟轻链可变区和序列为SEQ ID NO：10的成熟重链可变区，抗体TIG2的特征在于具有序列为SEQ ID NO：22的成熟轻链可变区和序列为SEQ ID NO：18的成熟重链可变区，抗体TIG3的特征在于具有序列为SEQ ID NO：30的成熟轻链可变区和序列为SEQ ID NO：26的成熟重链可变区，以便特异性结合于CD155。在一些实施方式中，所述抗体与TIG1、TIG2或TIG3中任一个结合于人TIGIT上的相同表位。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体抑制CD155与人TIGIT的结合。在一些实施方式中，所述抗体包含三个轻链CDR和三个重链CDR，这些CDR对应于TIG1、TIG2或TIG3中任一个的三个轻链CDR和三个重链CDR。在一些实施方式中，所述抗体包含TIG1、TIG2或TIG3中任一个的三个重链CDR和三个轻链CDR。在一些实施方式中，所述抗体包含TIG1、TIG2和TIG3中任意一个中的如Kabat所定义的三个重链CDR和如Kabat所定义的三个轻链CDR，即TIG1(轻链中的序列为SEQ ID NO:15-17，重链中的序列为SEQ ID NO:11-13)、TIG2(轻链中的序列为SEQ ID NO:23-25,重链中的序列为SEQ ID NO:19-21)或TIG3(轻链中的序列为SEQ ID NO:31-33，重链中的序列为SEQ ID NO:27-29)。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体是嵌合的、人源化的或饰面的。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体具有人IgG1 kappa同种型。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体是完整抗体。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体是单链抗体、Fab或F(ab')2片段。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体包含与SEQ ID NO：35具有至少90％序列同一性的成熟重链可变区和与SEQ ID NO：37具有至少90％序列同一性的成熟轻链可变区。在一些实施方式中，所述成熟重链可变区与SEQ ID NO：35具有至少95或99％的序列同一性，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO：37具有至少95或99％的序列同一性。在一些实施方式中，所述成熟重链可变区具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：40的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQ ID NO：41的轻链恒定区连接。在一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：60的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQ ID NO：64的轻链恒定区连接。在一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：61的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQ ID NO：64的轻链恒定区连接。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体包含与SEQ ID NO：43具有至少90％序列同一性的成熟重链可变区和与SEQ ID NO：45具有至少90％序列同一性的成熟轻链可变区。在一些实施方式中，所述成熟重链可变区与SEQ ID NO：43具有至少95或99％的序列同一性，并且所述成熟轻链可变区与SEQ ID NO：45具有至少95或99％的序列同一性。在一些实施方式中，所述成熟重链可变区具有SEQ ID NO：43的氨基酸序列，并且所述成熟轻链可变区具有SEQ IDNO：45的氨基酸序列。在一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：48的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQ IDNO：49的轻链恒定区连接。在一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：62的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQID NO：65的轻链恒定区连接。在一些实施方式中，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与包含SEQ ID NO：63的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与包含SEQ ID NO：65的轻链恒定区连接。在一些其他方面，本文提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体结合于包含SEQ ID NO：1的残基35和37和/或SEQ ID NO：1的残基49和51的表位。在一些实施方式中，所述抗体结合于包含SEQ ID NO：1的残基35、37、49和51的表位。在一些实施方式中，所述抗体结合于由SEQ ID NO：1的残基35-51和任一侧上SEQ ID NO：1的不超过五个侧翼氨基酸所组成的肽。在一些实施方式中，所述抗体结合于由SEQ ID NO：1的残基35-51所构成的肽。在一些实施方式中，所述表位包含SEQ ID NO：1的3至20个连续残基。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗体具有以下一种或多种特性：(a)抑制TIGIT与CD155的结合，任选地IC50为15-100ng/ml，(b)在表达CD155的抗原呈递细胞存在时，增加内在T细胞的活化，这可通过IL-2的产量进行测量，任选地1.5-3倍，(c)增加抗原特异性T细胞的活化，这可通过IL-12的产量进行测量，任选地1.5-3倍，(d)增加自然杀伤细胞的活化，这可通过IL-2、IL-6、TNFα或IFNγ中的任意一个的产量进行测量，任选地1.5-3倍，(e)增加T细胞产生至少一种促炎细胞因子的产量，任选地1.5-3倍，和(f)减少T细胞产生至少一种抗炎细胞因子的产量，任选地1.5-3倍。
在另一方面，本文提供了药物组合物，包含本文所述的任何抗体和药学上可接受的载体。
在一些其他方面，本文提供了用于治疗癌症或实现癌症预防的方法，包括：向患有癌症或处于患癌风险的对象施用有效方案或治疗有效量的本文公开的任何抗体。在一些实施方案中，所述癌症是急性髓性白血病或成人T细胞白血病。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用被所述抗体激活的肿瘤浸润性T细胞。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用诱导针对癌症的免疫应答的疫苗，所述免疫应答被所述抗体增强。在一些实施方式中，所述疫苗包含在癌细胞表面上表达的抗原或其片段。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用天然杀伤细胞，所述天然杀伤细胞针对癌症的细胞毒性被所述抗体增强。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向所述对象施用针对在癌细胞表面上表达的抗原的第二抗体，从而使得所述第二抗体的效应子介导的针对癌症的细胞毒性被所述抗体增强。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向对象施用针对在免疫细胞表面上表达的抗原的第二抗体。在一些实施方式中，所述免疫细胞是T细胞或天然杀伤细胞。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗原是CTLA-4、PD-1或PD-L1。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向所述对象施用一种或多种选自下组的疗法：化学疗法、放射疗法、基于细胞的疗法和外科手术。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向对象施用一种或多种免疫检查点受体或配体的抑制剂。在一些实施方式中，所述抑制剂选自下组：伊匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)(也称为兰姆伯单抗(lambrolizumab))和阿妥佐单抗(atezolizumab)。
在一些另外的方面，本文提供了用于治疗被病原体感染的对象的方法，包括向对象施用有效方案或治疗有效量的本文公开的任何抗体。在一些实施方式中，所述病原体是病毒、细菌、真菌或原生动物。在一些实施方式中，所述病原体是HIV、SIV、肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、虫媒病毒性脑炎病毒、衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、淋球菌、克雷白氏杆菌、变形杆菌、沙雷菌、假单胞菌、军团菌、白喉杆菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱孤菌、破伤风梭菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、瘟疫、钩端螺旋体和莱姆病细菌。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，用诱导针对病原体的免疫应答的疫苗治疗对象，所述免疫应答被所述抗体增强。在一些实施方式中，所述疫苗包含病原体蛋白或其片段。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，进一步向对象施用针对病原体的第二抗体，其中第二抗体的效应子介导的针对病原体的细胞毒性被所述抗体增强。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，进一步向对象施用抗病毒剂、抗寄生虫剂、抗细菌剂或抗真菌剂中的一种或多种。
在另一方面，本文提供了用于辅助治疗癌症的方法，包括向患有癌症的对象施用治疗有效量的本文公开的任何抗体。在一些实施方式中，所述癌症是急性髓性白血病或成人T细胞白血病。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用被抗体激活的肿瘤浸润性T细胞。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用诱导针对癌症的免疫应答的疫苗，所述免疫应答被所述抗体增强。在一些实施方式中，所述疫苗包括在癌细胞表面上表达的抗原或其片段。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用天然杀伤细胞，所述天然杀伤细胞针对癌症的细胞毒性被所述抗体增强。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，向所述对象施用针对在癌细胞表面上表达的抗原的第二抗体，从而使得所述第二抗体的效应子介导的针对癌症的细胞毒性被所述抗体增强。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向对象施用针对在免疫细胞表面上表达的抗原的第二抗体。在一些实施方式中，所述免疫细胞是T细胞或天然杀伤细胞。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，所述抗原是CTLA-4、PD-1或PD-L1。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向所述对象施用一种或多种选自下组的疗法：化学疗法、放射疗法、基于细胞的疗法和外科手术。在本文公开的任何实施方案的一些实施方式中，还向对象施用一种或多种免疫检查点受体或配体的抑制剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点受体或配体选自下组：CTLA-4、PD-1和PD-L1。在一些实施方式中，所述抑制剂选自下组：伊匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)(兰姆伯单抗(lambrolizumab))和阿妥佐单抗(atezolizumab)。
除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除，否则本文描述的每个方面和实施例能够一起使用。
附图的简要说明
图1是用于重组TIGIT和CD155蛋白的表达载体的示意结构。
图2显示了抗TIGIT抗体对TIGIT-CD155相互作用的抑制。
图3显示了TIG1 VH的氨基酸序列。
图4显示了TIG1 VL的氨基酸序列。
图5显示了TIG2 VH的氨基酸序列。
图6显示了TIG2 VL的氨基酸序列。
图7显示了TIG3 VH的氨基酸序列。
图8显示了TIG3 VL的氨基酸序列。
图9A显示了HuTIG1 VH基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列，而图9B显示了HuTIG1 VL基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列。
图10显示了表达载体pHuTIG1.AA的示意性结构。
图11显示了HuTIG1-IgG1.AA与人TIGIT结合的ELISA分析结果。
图12显示了HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA与人TIGIT的结合的FACS分析。
图13显示了HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA阻断人TIGIT和人CD155之间的相互作用。
图14A显示了HuTIG3 VH基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列，而图14B显示了HuTIG3 VL基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列。
图15显示了HuTIG3-IgG1.AA与人TIGIT结合的ELISA分析。
图16显示了在抗原特异性回忆刺激中TIG1产生的IL-2产量增加。
图17显示了在抗原特异性回忆刺激中TIG1产生的CD4+和CD8+T细胞增加。
图18显示了K562细胞(顶部)上的CD155和NK细胞(底部)上的TIGIT的表达。
图19显示了在K562靶细胞上由TIG1所引起的增强的NK细胞介导的细胞毒性。
图20表明HuTIG1-IgG1.AA增强了细胞因子效应子反应。
图21显示了Jurkat-TIGIT细胞系在其细胞表面上表达人TIGIT。
图22表明HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA不引发CDC活性。
图23显示了在抗人TIGIT抗体的体外T细胞拮抗活性测定中，HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA增强了内在T细胞的活化。
图24显示了GM-CSF/IL-4分化的单核细胞衍生的树突细胞(moDC)表达CD112、CD155和PD-L1。
图25显示了加入HuTIG1-IgG1.AA、抗PD-L1抗体以及HuTIG1-IgG1.AA与抗PD-L1抗体的组合后，IFNγ的分泌增强。
图26A显示了TIGIT和CD96在人淋巴和骨髓细胞上的表达。图26B显示了在各种表达水平下的抗TIGIT染色的代表性直方图。
图27显示了通过流式细胞术绘制的HuTIG1-IgG1.AA表位图。
图28显示了人TIGIT的细胞外IgV结构域的带状图，其中编号的表位残基侧链以棒状图显示。
图29A和图29B显示了CD4+T细胞亚群的TIGIT表达的分析结果。
图30A和图30B显示了T CD8+T细胞亚群的IGIT表达的分析结果。
图31显示了在K562靶细胞上由HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA所引起的增强的NK细胞介导的细胞毒性。
图32A显示了在来自分离的肿瘤样品中的肿瘤浸润淋巴细胞上的TIGIT表达。图32B显示了在各种表达水平下的抗TIGIT染色的代表性直方图。
具体实施方式
本发明尤其提供了特异性结合于TIGIT胞外结构域的单克隆抗体，所述TIGIT是免疫球蛋白超家族的成员，在胞质尾区具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。所述单克隆抗体抑制TIGIT与CD155的结合，从而可以激活T细胞和/或NK细胞。在其他应用中，所述单克隆抗体可用于治疗癌症和传染病。
I.定义
单克隆抗体或其他生物实体，例如TIGIT片段通常以分离的形式提供。这意味着抗体或其他生物学实体通常在干扰蛋白和抗体生产或纯化过程中产生的其他污染物中具有至少50％w/w的纯度，但不排除单克隆抗体与额外的药学上可接受的载体或者其它促进其功能的载体进行组合的可能性。有时单克隆抗体在干扰蛋白和生产或纯化过程中产生的污染物中具有至少60、70、80、90、95或99％w/w的纯度。通常，分离的单克隆抗体或其他生物实体试剂是其纯化后剩余的主要大分子物质。
单克隆抗体与其靶抗原的特异性结合是指通过例如实施例15的测定所确定的至少106、107、108、109或1010M-1的亲和力(结合常数或Ka)。特异性结合可被检测出更高的量级，并且可与至少一个不相关的靶标发生的非特异性结合区分开。特异性结合可以是在特定官能团之间形成键或特定空间拟合(例如锁和钥匙型)的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定意味着单克隆抗体结合一个且仅一个靶标。
抗体基础结构单元是亚单元的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多氨基酸的可变区。所述可变区最初表达连接于可切割的信号肽。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区是指没有轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区。
轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。(一般参见基础免疫学(FundamentalImmunology，Paul，W.等，第二次编辑，Raven印刷，纽约，1989)，第7章)(其所有用途通过引用整体并入)。
每个轻/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点。除双功能或双特异性抗体外，两个结合位点是相同的。所有链都表现出相同的一般结构，即由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)，。来自每对两条链的CDR通过框架区对齐，能够结合特定的表位。从N末端到C末端，轻链和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸的分配与Kabat的定义一致，免疫学蛋白质序列(美国国立卫生研究院，(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health)，Bethesda，医学博士，1987年和1991年)，或Chothia和Lesk，分子生物学(Mol.Biol.)196:901-917(1987)；Chothia等,自然(Nature)342:878-883(1989)。Kabat还提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基被指定相同的编号。
术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。因此，除非上下文另有要求，否则对抗体的任何提及应理解为指完整形式的抗体或结合片段。通常，片段与其衍生来源的完整抗体竞争性地特异性结合靶标，包括单独的重链、轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、纳米抗体和scFv、双抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、bis-scFv、三抗体和四抗体。片段可以通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离产生。术语“抗体”还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体(参见例如Songsivilai和Lachmann，免疫学临床试验(Clin.Exp.Immunol)，79:315-321(1990)；Kostelny等，免疫学杂志(J.Immunol.),148:1547-53(1992))。
术语“表位”是指与抗体结合的抗原上位点。表位可以由连续氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸(也称为线性表位)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含独特空间构象中的至少3个、更通常地至少5个或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如表位绘制方法(Epitope Mapping Protocols)，发表于分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)，卷66，Glenn E.Morris编辑(1996)。
识别相同或重叠表位的抗体可以通过简单的免疫分析鉴定，所述免疫分析显示一种抗体与另一种抗体竞争性结合靶抗原能力。抗体的表位也可以通过与其抗原结合的抗体的X射线晶体学方法来确定，以鉴定接触残基。或者，如果抗原中能够减弱或消除其与一种抗体结合能力的所有氨基酸突变都能减弱或消除其与另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果抗原中能够减弱或消除其与一种抗体结合能力的一些氨基酸突变能够减弱或消除其与另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
抗体之间的竞争通过测试来确定，其中测试条件下的抗体抑制了参照抗体与共同抗原的特异性结合(参见例如Junghans等,肿瘤研究(Cancer Res)50:1495，1990)。如果过量的测试抗体(例如，至少2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、70x、80x、90x、100x或更多，包括落在这些值之间的数字)抑制了至少50％但优选地75％、90％或99％的与参照抗体的结合，则测试抗体与参照抗体竞争。在一些其他实施方式中，在竞争性结合测试中，如果过量的测试抗体抑制了至少约55％、60％、65％、70％，或优选地至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一值的与参照抗体的结合，则测试抗体与参照抗体竞争。通过竞争测试法鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体结合相同表位的抗体和与参照抗体结合的表位充分接近的相邻表位结合的抗体，以发生空间位阻。优选地，竞争性的评估如实施例14。
术语“受试者”包括人和其他哺乳动物受试者。在一些情况下，本发明的方法可用于实验动物、兽医应用和疾病动物模型的开发，包括但不限于啮齿动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠以及灵长类动物，例如猿。在一些实施方式中，受试者接受预防性或治疗性治疗或为其候选者。
如本文所用，感兴趣的氨基酸序列的氨基酸残基“对应于”或“相当于”或“一致于”参照氨基酸序列的氨基酸残基表示该感兴趣序列的氨基酸残基位于与参照氨基酸序列中列举的残基的类似或等同的位置。本领域技术人员可以确定多肽中特定氨基酸残基的位置，例如TIGIT多肽，是否对应于同源参照序列的位置。例如，可以使用已知技术(例如，基本局部比对搜索工具(BLAST)、ClustalW2、基于结构的序列比对程序(STRAP)等)将TIGIT多肽的序列与参照序列的序列比对。另外，参照序列的晶体结构坐标可用于帮助确定同源多肽残基的三维结构(Stengel等，ProcNatl.Acad.Sci.美国109：5399-5404,2012。在另一方面，可以在三级结构水平通过同源性来鉴定等同的残基。使用这些方法，可以根据参照序列的相应氨基酸残基位置编号对TIGIT多肽变体的氨基酸残基进行编号。例如，SEQ ID NO：1的氨基酸序列：可以用来确定感兴趣的TIGIT变体或表位的每个氨基酸残基的氨基酸残基位置编号。在一些实施方式中，如果一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，则所述一个氨基酸序列相似于所述另一个氨基酸序列。
为了将氨基酸取代分类为保守的或非保守的，将氨基酸分组如下：I组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；II组(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；III组(酸性侧链)：asp、glu；IV组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；V组(影响链方向的残基)：gly、pro；以及VI组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代涉及同一类氨基酸之间的取代。非保守取代涉及将这些类别中的一个类别的成员交换为另一个类别成员。
用通过Kabat编号方法最大化比对的抗体序列确定序列同一性百分比。比对后，如果将受试者的抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参照抗体的相同区域进行比较，则受试者和参照抗体区域之间的序列同一性百分比是在受试者和参照抗体区域中相同氨基酸占据的位置数除以两个区域的比对位置的总数(不计数间隙)，乘以100以转换成百分比。
“包含”一种或多种列举元素的组合物或方法可包括未具体列举的其他元素。例如，包含抗体的组合物可以单独含有抗体或含有抗体的与其他成分的组合。
除非从上下文中另外明确描述，否则对范围的引用包括该范围内的所有整数以及由这些整数定义的所有子范围。
II.靶标分子
除非另有说明，TIGIT表示人类TIGIT。示例性人序列被指定为Swiss-Prot登录号Q495A1。完整的人TIGIT序列具有244个氨基酸，其中氨基酸1-21是信号肽，22-244构成成熟蛋白(SEQ ID NO：1)。近似地残基22-141构成胞外结构域(SEQ ID NO：3)。近似地残基142-162构成跨膜结构域，并且近似地残基163-244构成胞质结构域。
除非另有说明，CD155是指该蛋白质的人源形式。人CD155的示例性人源序列指定为Swiss-Prot P15151，其为417个氨基酸的蛋白质，其中约1-20残基是信号肽，21-343是胞外结构域(SEQ ID NO：6)，344-367是跨膜结构域，以及368-417是胞质结构域。
除非从上下文中另外明确描述，否则提及上述蛋白质之一至少意指蛋白质的胞外结构域，并且通常是除可切割信号肽之外的完整蛋白质。
III.本发明抗体
A.结合特异性和功能特性
本发明提供了与TIGIT蛋白胞外结构域内表位结合的单克隆抗体。名为TIG1，TIG2和TIG3的抗体就是三种这样的示例性小鼠抗体。这些抗体的重链和轻链成熟可变区的序列为SEQ ID NO：10和14，18和22以及26和30，分别对应的TIG1、TIG2和TIG3特异性结合人TIGIT的胞外结构域。
本发明的一些抗体与名为TIG1、TIG2或TIG3的抗体结合相同或重叠的表位。具有这种结合特异性的其他抗体可以通过用TIGIT或其包括所需表位的部分免疫小鼠，并筛选与TIGIT胞外结构域结合的所得抗体，任选地与TIG1，TIG2或TIG3竞争来产生。还可以针对TIGIT抗原的诱变形式筛选抗体，以鉴定显示与TIG1、TIG2或TIG3的突变变化的类群具有相同或相似结合特征的抗体。突变可以是丙氨酸(或如果丙氨酸已经存在，是丝氨酸)的系统替换，在TIGIT抗体的胞外结构域中或在其中已知表位所在的部分，一次一个残基或更宽距离的间隔。
实施例16将SEQ ID NO：1的残基35,37,49和51划分为形成TIG1抗体表位的残基。在这些残基中的任何一个上的丙氨酸取代基本上消除了抗体的结合力。因此，本发明包括与人TIGIT表位结合的其他抗体，所述表位包含了SEQ ID NO：1的残基35和37和/或SEQ IDNO：1的残基49和51，优选地表位包含了所有这些残基。表位可以是线性的(例如，3-20、3-17或5-10个连续残基)或具有构象的。一些此类抗体与由SEQ ID NO：1的残基35-51和SEQ IDNO：1中任一侧不超过5个侧翼氨基酸构成的肽结合。一些此类抗体与由SEQ ID NO：1的残基35-51组成的肽结合。通过用这些肽免疫可以产生一些这样的抗体。实施例19还揭示，除了SEQ ID NO：1的残基35、37、49和51之外，SEQ ID NO：1的残基90对于人源化(Hu)TIG1抗体与TIGIT的结合是关键的。在一些其他实施方式中，所述抗体(例如HuTIG1抗体)结合包含一个或多个对应于SEQ ID NO：1的氨基酸位置35、37、49、51和/或90的残基的表位。在一些其他实施方式中，所述抗体(例如HuTIG1抗体)不结合对应于SEQ ID NO：1的34、39、44、47、52、55、86、88、92和/或96的一个或多个残基。
具有所选鼠抗体(例如，TIG1，TIG2或TIG3)结合特异性的抗体也可以使用噬菌体展示方法的变体产生。参见Winter，WO 92/20791。所述方法特别适用于产生人抗体。在所述方法中，使用所选鼠抗体的重链或轻链可变区作为起始材料。例如，如果选择轻链可变区作为起始材料，则构建噬菌体文库，其中成员显示相同的轻链可变区(即鼠起始材料)和不同的重链可变区。例如重链可变区可以从重排的人重链可变区文库中获得。选择显示出对TIGIT结合特异性强的噬菌体(例如，至少108，优选地至少109M-1)。然后来自所述噬菌体的重链可变区用作构建另一噬菌体文库的起始材料。在该文库中，每个噬菌体显示相同的重链可变区(即，从第一显示文库鉴定的区域)和不同的轻链可变区。轻链可变区可以从例如重排的人可变轻链区的文库中获得。再次，选择显示针对TIGIT结合特异性强的噬菌体。所得抗体通常具有与鼠起始材料相同或相似的表位特异性。
一些抗体具有包含完全或基本上来自TIG1的CDR H1、H2和H3的成熟重链可变区和包含完全或基本上来自TIG1的CDR L1、L2和L3的成熟轻链区。一些抗体具有包含完全或基本上来自TIG2的CDR H1、H2和H3的成熟重链可变区和包含完全或基本上来自TIG2的CDRL1、L2和L3的成熟轻链区。一些抗体具有包含完全或基本上来自TIG3的CDR H1、H2和H3的成熟重链可变区和包含完全或基本上来自TIG3的CDR L1、L2和L3的成熟轻链区。CDR可由任何常规定义来定义，包括Kabat、Chothia、Kabat和Chothia相结合、AbM或Contact定义，如下表所示：
Figure BDA0001788655270000131
其他抗体可以通过诱变示例性抗体(例如TIG1、TIG2或TIG3)的重链和轻链编码cDNA来获得。与TIG1、TIG2或TIG3的成熟重链和/或轻链可变区的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中任一同一性并保持其功能特性的单克隆抗体，和/或通过少量功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入而与相应的抗体不同的单克隆抗体，也包括在本发明中。可变区框架中可能对结合重要的氨基酸可以如下文关于人源化的部分中所述进行鉴定。还包含了具有至少1个、优选地所有6个如Kabat所定义的CDR的单克隆抗体，所述CDR对应于TIG1、TIG2或TIG3的CDR具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
抗体优选地具有一种或多种以下特性(i)抑制人TIGIT与人CD155的结合，(ii)抑制TIGIT与其他配体如CD112和CD113的结合，(iii)增强抗原特异性T细胞的应答，(iv)激活自然杀伤细胞，(v)刺激内在T细胞活化，和(vi)刺激一种或多种免疫刺激细胞因子的产生和/或减少免疫系统中T细胞和其他细胞产生的一种或多种免疫抑制细胞因子。在实施例中提供了用于测定这些特性的示例性方法。
优选的抗体完全或部分抑制TIGIT与CD155的结合。一些抗体可以抑制这种相互作用，如实施例中所测量的，IC50为约25-300ng/ml、25-75ng/ml、25-50ng/ml、40-75ng/ml、50-75ng/ml、50-90ng/ml、50-100ng/ml、75-100ng/ml、50-150、75-175ng/ml、100-200ng/ml、125-225ng/ml、100-250ng/ml、150-300ng/ml、175-250ng/ml、200-300ng/ml、25-275ng/ml、250-300ng/ml、49+/-10％ng/ml、65+/-10％ng/ml，或76+/-10％ng/ml中的任一值。在一些其他实施方式中，抗体可以完全或部分抑制TIGIT与CD155的结合，IC50为至少约25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、125ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、275ng/ml或300ng/ml中的任一值或更高，包括介于这些值之间的浓度。一些抗体可使抗原特异性T细胞反应增加1.5-3倍，如实施例中所测量的，例如约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3倍中的任一值或更高。一些抗体可将NK细胞的IL-2、IL-6、TNFα和IFNγ中的1、2、3种或所有的产量增加1.5-3倍，如实施例中所测，例如约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3倍中的任一值或更高。一些抗体可使内在T细胞活性增加1.5-3倍，如实施例中所测，例如约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3倍中的任一值或更高。如动物模型或临床试验中所示，一些抗体可以抑制癌症或传染病。将人癌细胞注射到免疫缺陷的实验室动物(例如小鼠或大鼠)中的癌症动物模型是广泛可用的。
相对于起始小鼠抗体，人源化或嵌合抗体延长了体内半衰期。例如在人类中，所产生的半衰期可以是10-50天。半衰期可以通过药代动力学研究来测定，例如Kim等，欧洲免疫学杂志(Eur J of Immunol)24：542(1994)所述。
B.非人源抗体
抗TIGIT的其他非人单克隆抗体(例如鼠、豚鼠、灵长类动物、兔、鸡或大鼠)的产生可以通过例如用TIGIT或其片段或带有TIGIT的细胞免疫动物来实现。参见Harlow和Lane，抗体，实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual,CSHP NY，1988)(出于所有目的通过引用并入)。这种免疫原可以从天然来源、通过肽合成或通过重组表达获得。任选地，所述免疫原可以与载体蛋白融合或以其他方式复合。任选地，所述免疫原可以与佐剂一起施用。可以使用如下所述几种类型的佐剂。对于实验动物的免疫，优选为完全弗氏佐剂，其次是不完全佐剂。兔或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。筛选抗体用于特异性结合TIGIT。任选地，进一步筛选抗体用于特异性结合于TIGIT的特定区域。这种筛选可以通过测定抗体与TIGIT缺失突变体类群的结合并确定哪些缺失突变体可与抗体结合来完成。例如可以通过Western印迹、FACS或ELISA评估结合。
C.人源化抗体
减少或消除HAMA(人抗小鼠(也适用于人抗大鼠或人抗兔或人抗仓鼠等)抗体)反应是临床上开发合适的治疗剂的重要方面。参见例如Khaxzaeli等,J.Natl.Cancer Inst.(1988),80:937；Jaffers等，移植(Transplantation)(1986),41:572；Shawler等，免疫学杂志(J.Immunol)(1985)，135:1530；Sears等，J.Biol.Response Mod.(1984),3:138；Miller等，血液(Blood)(1983),62:988；Hakimi等，免疫学杂志(J.Immunol.)(1991)，147:1352；Reichmann等，自然(Nature)(1988)，332:323；Junghans等，肿瘤研究(Cancer Res.)(1990)，50:1495。如本文所述，本发明提供人源化的抗体，从而减少或消除HAMA反应。可以使用本领域已知的常规方法进一步获得这些抗体的变体，其中一些方法在下文进一步描述。
人源化抗体是基因工程抗体，其中来自非人“供体”抗体的CDR被移植到人“受体”抗体序列中(参见例如，Queen，US 5,530,101和5,585,089；Winter，US 5,225,539，Carter，US 6,407,213，Adair，US 5,859,205 6,881,557，Foote，US 6,881,557)。受体抗体序列可以是，例如，成熟人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。因此，人源化抗体是包含完全或基本上来自供体抗体的一些或全部CDR，以及可变区框架序列和恒定区的抗体，如果存在的话，完全或基本上来自人抗体序列。类似地，人源化重链包含完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个或两个且通常地全部三个CDR，以及重链可变区框架序列和重链恒定区，如果存在的话，基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列。类似地，人源化轻链包含完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个或两个且通常地全部三个CDR，以及轻链可变区框架序列和轻链恒定区，如果存在的话，基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列。除纳米抗体和dAb之外，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。这里与本申请中的其他地方一样，当受试者抗体中的CDR与参照抗体的相应CDR(如Kabat所定义)具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相应残基(如Kabat所定义)同一性时，则受试者抗体的CDR基本上来自于参照抗体的相应CDR；然而，当受试者抗体中的CDR H2(如Kabat所定义)与参照抗体的相应的CDR具有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相应残基(如Kabat所定义)同一性时，则所述受试者抗体中的CDR H2基本上来自于参照抗体的相应CDR。当抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别与人可变区框架序列或人恒定区具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相应残基(如Kabat所定义)序列同一性时，则抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区框架序列或人恒定区。
虽然人源化抗体通常包含来自非人(例如小鼠)抗体的所有六个CDR(优选地由Kabat定义)，但它们也可以用少于所有CDR(例如，至少3,4或5个)的非人抗体制备(例如，Pascalis等，免疫学杂志(J.Immunol.)169:3076,2002；Vajdos等，分子生物学(Journal ofMolecular Biology)，320:415-428,2002；Iwahashi等,分子免疫(Mol.Immunol.)36:1079-1091,1999；Tamura等,免疫学杂志(Journal of Immunology),164:1432-1441,2000)。
在一些抗体中，仅需要部分CDR以保持人源化抗体中的结合，所述部分CDR即结合所需的CDR残基子集，称为SDR。可以基于先前的研究，通过分子模拟和/或根据经验，或如Gonzales等，分子免疫(Mol.Immunol.)41：863，2004所述的方法，从位于Chothia高变环(Chothia，分子生物学(J.Mol.Biol.)196:901，1987)之外的Kabat CDR区域鉴定出不与抗原接触而不在SDR中的CDR残基(例如，通常不需要CDR H2中的残基H60-H65)。在这样的人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在的位置或缺少了整个供体CDR的位置，占据该位置的氨基酸可以是占据受体抗体序列中相应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。受体CDR中包含供体氨基酸的这种取代的数量反映了竞争考虑的平衡。这种取代可能有利于减少人源化抗体中小鼠氨基酸的数量，从而降低潜在的免疫原性。然而，取代也可以引起亲和力的变化，并且优选地避免亲和力的显着降低。CDR内的取代位置和取代的氨基酸也可凭经验选择。
虽然所述受体可以在序列上与所选择的人框架序列相同，无论是来自人免疫球蛋白还是人共有框架，本发明都考虑到受体序列可能包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列预先存在的氨基酸取代。这些预先存在的取代优选是最小化的；通常相对于人免疫球蛋白序列或共有框架序列仅有四个、三个、两个或一个氨基酸的差异。
人受体抗体序列可以任选地选自许多已知的人抗体序列，以提供在人受体序列可变区框架和供体抗体链的相应可变区框架之间的高度序列同一性(例如，65-85％同一性)。
可以基于来自人可变区框架残基的某些氨基酸对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响，选择它们来用于取代。对这种可能影响的研究是通过对特定位置的氨基酸特征进行建模、测定，或对特定氨基酸取代或诱变的影响的经验观察来完成的。
例如，当非人可变区框架残基和选定的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，人框架氨基酸可以被非人抗体的等同框架氨基酸取代，其中合理预知氨基酸：
(1)直接非共价结合抗原，
(2)与CDR区相邻，
(3)或者与CDR区相互作用(例如在CDR区的约
Figure BDA0001788655270000171
内)。
其他取代候选物是受体人框架氨基酸，其在该位置对人免疫球蛋白来说不常见。这些氨基酸可以被来自非人供体抗体的等同位置的氨基酸或更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸取代。其他取代候选物是受体人框架氨基酸，其在该位置对人免疫球蛋白来说不常见。
优选的人源化抗体包含一个成熟重链可变区和一个成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区与SEQ ID NO：35具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％的同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO：3具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％7的同一性。优选地，任何取代发生在可变区框架残基上，而不是那些被鉴定为对结合可能重要的残基(参见第[0073]段)。优选地，任何取代都是保守氨基酸取代。优选的抗体包含具有SEQ IDNO：35序列的成熟重链可变区和具有SEQ ID NO：37序列的成熟轻链可变区。为了表达全长抗体，当C-末端赖氨酸存在或不存在的情况下，成熟重链可变区优选与由SEQ ID NO：40组成或包含SEQ ID NO：40的重链恒定区连接，并且成熟轻链可变区优选与由SEQ ID NO：41组成或包含SEQ ID NO：41的轻链恒定区连接。
另一个优选的人源化抗体包含一个成熟重链可变区和一个成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区与SEQ ID NO：43具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％的同一性，且所述轻链可变区与SEQ ID NO：45具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或小于100％的同一性。优选地，任何取代发生在可变区框架残基上，而不是那些被鉴定为对结合可能重要的残基(参见原英文版第[0073]段和实施例)。优选地，任何取代都是保守氨基酸取代。优选的抗体包含具有SEQ ID NO：43序列的成熟重链可变区和具有SEQ ID NO：45序列的成熟轻链可变区。为了表达全长抗体，当C-末端赖氨酸存在或不存在的情况下，成熟重链可变区优选与由SEQ ID NO：48组成或包含SEQ ID NO：48的重链恒定区连接，并且成熟轻链可变区优选与由SEQ ID NO：49组成或包含SEQ ID NO：49的轻链恒定区连接。
D.嵌合或饰面的抗体
本发明还提供了非人抗体的嵌合和饰面形式，特别是实施例中的TIG1、TIG2和TIG3抗体。
嵌合抗体是非人抗体(例如小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。此类抗体基本上或完全保留非人抗体的结合特异性，并且是约三分之二的人序列。
饰面抗体是一种人源化抗体，其保留非人抗体的一些(通常为所有)CDR和一些非人可变区框架残基，但用人抗体序列的相应位置的残基取代可能有助于B或T细胞表位的其他可变区框架残基，例如暴露的残基(Padlan，分子免疫(Mol.Immunol.)28:489，1991)。所得抗体中，其中CDR完全或基本上来自非人抗体，并且非人抗体的可变区框架通过取代而变得更接近人抗体。TIG1、TIG2或TIG3抗体的饰面形式包括在本发明中。
E.人抗体
通过下述多种技术提供针对TIGIT的人抗体。一些人抗体可以通过竞争性结合实验、上述的Winter噬菌体展示方法，或其他方式被选择，以具有与特定小鼠抗体相同的表位特异性，例如实施例中描述的小鼠单克隆抗体之一。还可以通过仅使用TIGIT片段作为靶抗原，和/或通过筛选针对TIGIT缺失突变体类群的抗体，来筛选特定表位特异性的人抗体。
产生人抗体的方法包括：三体瘤方法，Oestberg等人，Hybridoma 2：361-367(1983)；Oestberg，美国专利No.4,634,664；和Engleman等，美国专利4,634,666，使用包括人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的方法(参见，例如，Lonberg等，WO93/12227(1993)；US 5,877,397，US 5,874,299，US 5,814,318，US 5,789,650，US 5,770,429，US 5,661,016，US5,633,425，US 5,625,126，US 5,569,825，US 5,545,806，自然148,1547-1553(1994)，自然生物技术(Nature Biotechnology)14,826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991)和噬菌体展示方法(参见，例如，Dower等，WO 91/17271和McCafferty等，WO 92/01047，US 5,877,218，US 5,871,907，US 5,858,657，US 5,837,242，US 5,733,743和US 5,565,332)。
F.恒定区的选择
嵌合、人源化(包括饰面)或人抗体的重链和轻链可变区可以与人恒定区的至少一部分连接。恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性补体和/或细胞介导的细胞毒性。例如，人同位素IgG1和IgG3具有补体介导的细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4则不具有。轻链恒定区可以是λ或κ。对于针对不表达TIGIT的癌症或病原体的免疫疗法，通常优选人IgG2或IgG4或具有降低的效应子功能的减弱形式的人IgG1。对于人IgG4，通常优选在重链上包含S228P(Eu编号)工程化突变以防止Fab臂交换。然而，为了消除表达TIGIT的癌细胞(例如，T细胞或NK细胞的肿瘤)或为了免疫抑制，通常优选人IgG1或IgG3。
人恒定区显示不同个体之间的异型变化和同种异型变化，即恒定区在一个或多个多态性位置上，不同个体中是可以不同的。同种异型不同于异型，因为识别同种异性的血清与一种或多种其他同种型的非多态性区域结合。对人恒定区的提及包括具有任何天然异型或在天然异型中占据多态性位置任何排列的残基的恒定区。
轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸，例如重链的C末端赖氨酸，可能在一部分或全部分子中缺失或衍生。可以在恒定区中进行取代以减少或增加效应子功能，例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如，Winter等，美国专利No.5,624,821；Tso等，美国专利No.5,834,597；和Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，103:4005,2006)，或延长在人中的半衰期(参见例如，Hinton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem)279:6213，2004)。示例性取代包括250位的Gln和/或428位的Leu(Eu编号)，用于延长抗体的半衰期。
通过引入恒定区突变来改造本发明的一些抗体以使其具有降低的效应子功能，例如与没有突变的相同抗体相比的CDC和ADCC或ADCP。优选地，与没有突变的抗体相比，这些效应子功能中的每一种或全部减少至少50％、75％、90％或95％。本示例显示了如何测量CDC。其它试验的描述参见Shields等，2001，生物化学(J.Biol.Chem)，276卷，6591-6604页；Chappel等，1993生物化学，268卷，25124-25131页；Lazar等，2006PNAS,103；4005-4010.
位置234、235、236和/或237中的任何一个或全部的取代降低了对Fcγ受体，特别是FcγRI受体的亲和力(参见，例如，US 6,624,821)。丙氨酸是优选的取代残基，L234A/L235A是优选的双重突变，以降低效应子功能。其它降低效应子功能的突变组合包括L234A/L235A/G237A、E233P/L234V/L235A/G236、A327G/A330S/P331S、K322A、L234A和L235A、L234F/L235E/P331S。任选地，人IgG2中的位置234、236和/或237被丙氨酸取代，并且位置235被谷氨酰胺取代。(参见例如US 5,624,821。)EU索引位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代减弱了补体结合(参见Tao等，J.ExpMed.178:661(1993)和Canfield和Morrison,J.Exp.Med.173:1483(1991))。IgG2在位置233-236处的残基和IgG4在位置327、330和331处的残基的人IgG1替换大大降低了ADCC和CDC(参见例如，Armour KL等，1999Eur J Immunol.29(8):2613-24；和Shields RL.等,2001.生物化学276(9):6591-604)。N297A、N297Q，或N297G(Eu编号)突变降低糖基化并从而减弱效应子功能。
G.重组抗体的表达
嵌合、人源化(包括饰面)和人抗体通常通过重组表达产生。重组多核苷酸构建体通常包括与抗体链的编码序列可操作地连接的表达控制序列，包括天然相关或异源启动子区。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦将载体引入合适的宿主中，宿主保持适于核苷酸序列高水平表达且重组抗体收集和纯化的条件下。
哺乳动物细胞是表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的优选宿主。参见Winnacker，从基因到克隆，(VCH出版社，纽约，1987)。本领域已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞和不产生抗体的骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。优选地，细胞是非人的。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子(Queen等，Immunol.Rev.89:49(1986))和必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等，免疫学杂志148：1149(1992)。
一旦表达，可以根据本领域的标准程序纯化抗体，包括HPLC纯化、柱层析、凝胶电泳等(通常参见Scopes，蛋白纯化(Springer-Verlag，纽约，1982))。
IV.治疗应用
所述抗体可用于增强癌症和传染病治疗中的免疫应答。可用本发明的抗体治疗的疾病包括但不限于癌症，包括血液恶性肿瘤和实体瘤。所述癌症可表达也可不表达TIGIT或CD155。针对TIGIT的抗体对不表达TIGIT的癌症有效，因为抑制TIGIT与CD155的相互作用刺激针对此类癌症的免疫应答。血液系统恶性肿瘤的实例包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，包括急性髓性白血病、成人T细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、急性单核细胞白血病、霍奇金和非-霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。实体瘤的实例包括但不限于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌(小细胞或非小细胞)、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌(肝癌)、肾细胞癌(肾癌)、头颈部肿瘤、间皮瘤、黑色素瘤、肉瘤和脑肿瘤(例如神经胶质瘤，例如胶质母细胞瘤)。
本发明的方法可以以辅助方式实施。“辅助方式”是指这样一种临床方式：受试者具有增殖性疾病史，特别是癌症病史，并且通常(但不一定)对治疗有反应，所述治疗包括但不限于手术、放射疗法，和/或化学疗法。然而，由于增殖性疾病的病史，这些受试者被认为有该疾病进展的风险。“辅助方式”中的治疗或给药是指随后的治疗方式。在一些实施方式中，本文提供了用于治疗或实现癌症预防的方法，其包括通过以辅助方式向患有癌症或有患癌风险的受试者施用治疗有效量的本发明公开的任何抗体。
本发明提供的方法还可以按“新辅助方式”实施，即，所述方法可以在初次/最后的治疗之前进行。在一些方面，所述受试者先前已被治疗。在另一些方面，所述受试者先前未被治疗。在一些方面，所述治疗是一线治疗。在一些实施方式中，本文提供了用于治疗或实现癌症预防的方法，其包括通过以新辅助方式向患有癌症或有患癌风险的受试者施用治疗有效量的本发明公开的任何抗体。
可通过本发明的抗体治疗的其他疾病包括以下感染性疾病：病毒、细菌、真菌、原生动物和其他病原体(例如，肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-II，和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、HIV、SIV、和虫媒病毒性脑炎病毒、衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷白氏杆菌、变形杆菌、沙雷菌、假单胞菌、军团菌、白喉杆菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱孤菌、破伤风梭菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、瘟疫、钩端螺旋体和莱姆病细菌。
A.抗体的施用
本发明所述的抗体以有效方案施用，所述有效方案意指延迟疾病发作、降低严重性、抑制进一步恶化，和/或改善至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果受试者已经患有疾病，则可以将该方案称为治疗有效方案。如果受试者相对于一般人群具有较高的疾病风险但尚未出现症状，则该方案可被称为预防有效方案。在一些情况下，相对于个体受试者的历史对照或过去经历，可以在相同受试者中观察到治疗或预防功效。在一些其他情况下，可以在受治疗的受试者群体中，通过临床前或临床试验，证明相对于未受治疗的对照受试者群体的治疗或预防功效。
在一些方面，本发明描述的任何方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的一种或多种本发明所述的抗体。如本文所用，抗癌疗法(例如本文所述的任何抗TIGIT抗体)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是足以产生有益或期望结果的量。对于治疗用途，有益或期望的结果包括例如减少由癌症引起的一种或多种症状、提高患有癌症的受试者的生活质量、减少治疗癌症所需的其他药物的剂量、增强另一种药物(例如通过靶向的药物)的效果、延迟疾病的进展，和/或延长存活期的临床结果。有效剂量可以是一次或多次给药。出于本发明的目的，抗癌疗法的有效剂量是足以直接或间接完成治疗或预防性治疗的量。如在临床背景中所理解的，抗癌疗法的治疗有效剂量可以与或不与另一种抗癌疗法联合实现。
本发明所述任何抗体的示例性剂量为约0.1-20mg/kg或0.5-5mg/kg公斤体重(例如约0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg)或作为固定剂量的10-1500mg(例如任何低于10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg或1500mg或更高，包括这些数值之间的值)。所述剂量取决于受试者的状况和对先前治疗的反应(如果有的话)、治疗是预防性的还是治疗性的、以及该病症是急性的还是慢性的、以及其他因素。
给药可以是肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、肿瘤内、局部、鼻内或肌肉内的。优选为通过静脉内或皮下给药进入体循环。静脉内给药可以是，例如，在30-90分钟的时间内输注。
给药频率取决于循环中抗体的半衰期、受试者的状况和给药途径以及其他因素。所述频率可以是每日、每周、每月、每季度或不定期间隔，以响应受试者的状况或所治疗疾病进展的变化。静脉内给药的示例性频率是在每周和每季度之间的连续治疗，尽管也可以更频繁或更不频繁地给药。对于皮下施用，示例性给药频率是每日至每月，尽管也可以更频繁或更不频繁地给药。
给药剂量的次数取决于该病症是急性的还是慢性的，以及该病症对治疗的反应。对于急性病症或慢性病症的急性恶化，1至10次剂量通常就足够了。有时单次剂量(任选地以分开的形式)，足以用于急性病症或慢性病症的急性恶化。当急性病症或急性恶化再次发作可以重复治疗。对于慢性病症，可以定期施用抗体，例如每周、每两周、每月、每季度、每六个月，施用至少1年、5年或10年，或受试者的终身。
包括抗TIGIT抗体在内的治疗可通过延长患有癌症的受试者的无进展生存期中位数或总生存时间来缓解疾病，相对于对照受试者延长至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％，但优选地至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％甚至100％，或将这些时间增加2周、1、2或3个月，或优选地4或6个月，或甚至9个月或一年。此外或或者，包括抗TIGIT抗体的治疗可以提高受试者的完全响应率、部分响应率或客观响应率(完全+部分)，与对照组相比提高至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％，但优选地至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％。除了抗TIGIT抗体之外，对照受试者接受的治疗与接受抗TIGIT抗体的受试者相同。因此，如果接受抗TIGIT抗体的受试者还接受安慰剂或安慰剂和除抗TIGIT抗体之外的一些化学治疗剂的组合，则对照受试者也接受这些。
本文公开的抗TIGIT抗体可以增强NK细胞介导的表达CD155细胞(例如但不限于K562细胞)的细胞毒性，相对于在不使用本文公开的一种抗TIGIT抗体的情况下，CD155表达细胞的NK细胞介导的细胞毒性约增强10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％或更高的任一值。
通常，在临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中，相对于对照受试者，用抗TIGIT抗体治疗的受试者的中位无进展存活和/或响应率的增加，具有统计学显著性，例如在p＝0.05或0.01或甚至0.001水平。所述完全和部分响应率由癌症临床试验中常用的客观标准确定，例如，如国家癌症研究所和/或食品和药品管理局列出或接受的，并且可包括例如肿瘤体积、肿瘤数量、转移、生存时间和生活质量测定等。
用于肠胃外给药的药物组合物优选是无菌的并且基本上是等渗的并且在GMP条件下制造。药物组合物可以以单位剂量的形式提供(即，单次给药的剂量)。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂配制药物组合物。配方取决于所选择的给药途径。对于注射剂，可以将抗体配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中，例如Hank溶液、林格氏液或生理盐水或乙酸盐缓冲液(以减少注射部位的不适)。溶液可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体可以是冻干形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无致热源水)制备。液体制剂中抗体的浓度可以介于约10-150mg/ml。在一些制剂中，所述浓度为约25-50mg/ml。
B.联合治疗
本发明考虑将抗TIGIT抗体与一种或多种活性治疗剂(例如化学治疗剂)或其他预防或治疗方式(例如放射)联合使用。在所述联合治疗中，各种活性剂通常具有不同的、互补的作用机制。通过允许一种或多种药剂的剂量减少，从而减少或消除与一种或多种药剂相关的副作用，所述联合治疗可能是特别有优势的。此外，所述组合疗法可对基础疾病、病症或状态具有协同治疗或预防作用。
如本文所用，“组合”意指包括可以单独施用的疗法，例如，单独配制用于单独施用(例如，可以在试剂盒中提供)和可以在单一制剂中一起施用的疗法(即，“共同制剂”)。
在某些实施方式中，本文公开的任何抗TIGIT抗体被顺序施用或应用，例如，在一种或多种其他药剂之前施用一种药剂。在一些其他实施方式中，所述抗体被同时施用，例如，两种或更多种药剂同时或大约在同时被施用；所述两种或更多种药剂可以以两种或更多种单独的制剂存在或被组合成单一制剂(即共同制剂)。无论两种或更多种药剂是顺序施用还是同时施用，它们被认为是为了本发明的目的而联合施用。
本发明所述的抗体可以在一定情况下以任何适合的方式与至少一种其他(活性)药剂联合使用。在一个实施方式中，一段时间内维持用至少一种活性剂和本发明的至少一种抗TIGIT抗体的治疗。在另一个实施方式中，减少或中断用至少一种活性剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，而用本发明的抗TIGIT抗体治疗在给药方案中维持恒定剂量。在另一个实施方式中，减少或中断用至少一种活性剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，同时减少用本发明的抗TIGIT抗体治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或时间更短的治疗方案)。在另一个实施方式中，减少或中断用至少一种活性剂的治疗(例如，当受试者稳定时)，并且增加用本发明的抗TIGIT抗体治疗(例如，更高剂量、更高频率给药或时间更长的治疗方案)。在另一个实施方式中，维持用至少一种活性剂的治疗，并且减少或中断用本发明的抗TIGIT抗体治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或时间更短的治疗方案)。在另一个实施方式中，减少或中断用至少一种活性剂的治疗和用本发明的抗TIGIT抗体治疗(例如，更低剂量、更低频率给药或时间较短的治疗方案)。
用本发明所述的抗体治疗可以与有效对抗所治疗疾病的其他治疗联合。当用于治疗增殖性病症、癌症、肿瘤或癌前病变、疾病或病症时，本发明的抗体可与化疗、放射(例如，局部放射疗法或全身放射疗法)、干细胞治疗、手术与其他生物制剂联合治疗。
在某些实施方式中，本发明提供了抑制肿瘤生长的方法，包括施用本发明公开的抗TIGIT抗体与信号转导抑制剂(STI)相结合，以实现对肿瘤生长的加和或协同抑制。如本文所用，术语“信号转导抑制剂”是指选择性地抑制信号传导途径中的一个或多个步骤的药剂。本发明的信号转导抑制剂(STI)包括：(i)BCR-Abl激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC))；(ii)表皮生长因子(EGF)受体抑制剂，包括激酶抑制剂和抗体；(iii)HER-2/neu受体抑制剂(例如，HERCEPTIN)；(iv)Akt家族激酶或Akt通路的抑制剂(例如雷帕霉素)；(v)细胞周期激酶抑制剂(例如，夫拉平度)；和(vi)磷脂酰肌醇激酶抑制剂。参与免疫调节的药剂也可以与本发明公开的抗TIGIT抗体联合用于抑制癌症患者的肿瘤生长。
化学治疗剂的实例包括但不限于：烷化剂例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimines)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustards)例如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝基脲(nitrosurea)例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、争光霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycini)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药例如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟二氧嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，例如卡芦睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼毒素酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼(2-ethylhydrazide)；甲基苄肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺(2,2',2”-trichlorotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(Ara-C)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替派(thiotepa)；类毒素(即紫杉烷)，例如紫杉醇、紫杉酚和多西他赛(doxetaxel)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂和铂配位物，例如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；去甲长春碱(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂；喜树碱(camptothecins)；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；抗代谢物(例如，咪唑硫嘌呤)；蒽环类(anthracycline)；植物生物碱(包括例如，长春花生物碱)；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
化学治疗剂还包括用于调节或抑制肿瘤中激素作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方式中，联合治疗包括施用激素或相关的激素剂。
可以与本文公开的抗TIGIT抗体联合使用的其他治疗方式包括放射疗法、针对肿瘤抗原的单克隆抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植或抗原呈递细胞(例如，树突细胞疗法)或基于细胞-细胞的疗法。如本文所用的术语“基于细胞的疗法”是指为了获得期望的治疗效果而涉及到细胞引入的任何疗法，例如修复受损或复制的成体细胞群或组织，或增强针对病原体或增殖细胞(如癌细胞)的免疫应答。在一些其他的实施方式中，基于细胞的疗法包括引入能够分化成实现期望治疗效果所需的特定细胞类型的非分化细胞(例如干细胞或其他多功能或全能细胞)，例如，修复受损或复制的成体细胞群或组织，或增强针对病原体或增殖细胞(如癌细胞)的免疫应答。在一些实施方式中，本发明所述的抗体还可以与肿瘤浸润性T细胞或天然杀伤细胞一起施用，所述细胞任选地离体经扩增或选择用于靶向肿瘤。本发明的抗体有助于这些细胞的活化。
优选的组合是本发明的抗体与第二抗体，所述第二抗体直接结合于表面抗原，所述表面抗原相对于对照的正常组织，在癌细胞上优先表达。一些在肿瘤治疗中可与本发明所述抗体联合使用的抗体实例包括：针对HER2抗原的赫赛汀
Figure BDA0001788655270000271
(曲妥珠单抗(trastuzumab))，针对VEGF的阿瓦斯汀
Figure BDA0001788655270000272
(贝伐单抗(bevacizumab))，或针对EGF受体的抗体，例如(爱必妥
Figure BDA0001788655270000273
西妥昔单抗(cetuximab))和维克替比
Figure BDA0001788655270000274
(帕尼单抗(panitumumab))。可以施用的其他药剂包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、4-1BB、BTLA、VISTA、TIM-3和LAG-3中的任一种的抗体或其他抑制剂；或其他下游信号传导抑制剂，例如mTOR和GSK3β抑制剂；和细胞因子，例如干扰素-γ、IL-2和IL-15。其他药剂的一些具体实例包括：伊匹木单抗(ipilimumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、达沙替尼(dasatinib)、派姆单抗(pembrolizumab)、INCR024360、达拉菲尼(dabrafenib)、曲美替尼(trametinib)、阿妥佐单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、埃罗替尼(tarceva)、柯比美替尼(cobimetinib)和纳武单抗(nivolumab)。用于联合治疗的第二抗体或其他药剂的选择取决于所治疗的癌症。任选地，测试癌症表达或优先表达的抗原，以指导选择合适的抗体。第二抗体的同种型优选是人IgG1，以促进效应子的功能，例如ADCC、CDC和吞噬作用。
本发明的抗体还可以与引发针对癌症的免疫应答的疫苗一起施用。本发明的抗体增强了这种免疫应答。所述疫苗可包括有效诱导免疫应答的癌症(细胞)表面上表达的抗原或其片段，任选地与载体分子连接。
本发明考虑了将本发明所述的抗TIGIT抗体与免疫检查点抑制剂联合使用。
所有癌症特有的大量遗传和表观遗传改变提供了多种抗原，免疫系统可以以用这些抗原来区分肿瘤细胞和对应的正常细胞。在T细胞中，通过T细胞受体(TCR)抗原识别启动的响应的最终幅度(例如，细胞因子产生或增殖的水平)和质量(例如，产生的免疫应答的类型，例如细胞因子产生的模式)，通过共刺激和抑制信号(免疫检查点)之间的平衡来调节。在正常生理条件下，免疫检查点对于预防自身免疫(即维持自身耐受)以及在免疫系统对病原性感染作出反应时保护组织免受损害至关重要。免疫检查点蛋白的表达可因肿瘤失调，是重要的免疫抗性机制。
免疫检查点(配体和受体)的一些例子，其中一些在各种类型的肿瘤细胞中被选择性上调，是阻断剂的候选者，包括PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)；PD-L1(程序性死亡配体-1)；BTLA(B和T淋巴细胞衰减因子)；CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)；TIM-3(T细胞膜蛋白3)；LAG-3(淋巴细胞活化基因3)；T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制因子(VISTA)；CD96；A2aR(腺苷A2a受体)；A2bR(腺苷A2b受体)；CD73(胞外-5'-核苷酸酶)；CD39(ENTPD1、NTPD酶1)；精氨酸酶；吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)；色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)和杀伤抑制受体，其可根据结构特征被分为两类：i)杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，和ii)C型凝集素受体(II型跨膜受体家族的成员)。其他不太明确的免疫检查点已在文中描述，包括受体(例如2B4(也称为CD244)受体)和配体(例如某些B7家族抑制配体，如B7-H3(也称为CD276))和B7-H4(也称为B7-S1、B7x和VCTN1))。参见Pardoll，(2012年4月)Nature Rev.Cancer12：252-64。
本发明考虑使用本发明公开的任何抗TIGIT抗体与上述免疫检查点受体和配体的抑制剂，以及尚未描述的免疫检查点受体和配体的联合使用。目前可获得某些免疫检查点调节剂，而其他调节剂处于后期开发阶段。举例而言，当完全人源化的CTLA-4单克隆抗体伊匹木单抗(ipilimumab)(YERVOY；布里斯托尔-迈尔斯斯奎布)在2011年被批准用于治疗黑色素瘤时，成为第一个在美国获得监管批准的免疫检查点抑制剂。包含CTLA-4和抗体(CTLA-4-Ig；阿巴西普(ORENCIA；百时美施贵宝))的融合蛋白已被用于治疗类风湿性关节炎，并且其他融合蛋白已被证明在对EB病毒敏感的肾移植患者中有效。抗PD-1抗体正在开发中(例如，纳武单抗(nivolumab)(百时美施贵宝)和派姆单抗pembrolizumab(兰姆伯单抗lambrolizumab)(默克))，并且还评估了抗PD-L1抗体(例如，MPDL3280A(罗氏))。纳武单抗(Nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)在黑色素瘤、肺癌和肾癌患者中显示出前景。
类似的联合疗法可用于治疗或预防感染性疾病，例如病毒、细菌、真菌和寄生虫疾病，病症和情况，以及与其相关的病症。例如，本发明的抗体可以与针对病原体的抗体或针对病原体的疫苗组合，例如针对劳氏肉瘤病毒的帕利珠单抗(palivizumab)。疫苗可以是有效诱导免疫应答的病原体或其片段的蛋白质。本发明的抗体增强了针对病原体的抗体或疫苗的免疫应答。本发明的抗体还可以与离体扩增的T细胞或天然杀伤细胞一起施用。
这种联合疗法包括靶向各种病毒生命周期阶段并具有不同作用机制的抗病毒剂，包括但不限于以下：病毒脱壳的抑制剂(例如，金刚烷胺和金刚乙胺)；逆转录酶抑制剂(例如，阿昔洛韦，齐多夫定和拉米夫定)；针对整合酶的药剂；阻止转录因子与病毒DNA连接的药剂；影响翻译的药剂(例如反义分子)(例如，福米韦生fomivirsen)；调节翻译/核酶功能的药剂；蛋白酶抑制剂；病毒装配调节剂(例如利福平)；抗逆转录病毒药剂，例如核苷类似物逆转录酶抑制剂(例如叠氮胸苷(AZT)、ddl、ddC、3TC、d4T)；非核苷类逆转录酶抑制剂(如依法韦仑、奈韦拉平)；核苷酸类似物逆转录酶抑制剂；和防止病毒颗粒释放的药剂(例如扎那米韦和奥司他韦)。治疗和/或预防某些病毒感染(例如HIV)通常需要一组(“鸡尾酒”)抗病毒剂。
其他预期与本文公开的任何抗TIGIT抗体联合使用的抗病毒剂包括但不限于以下：阿巴卡韦(abacavir)、阿德福韦(adefovir)、金刚烷胺(amantadine)、安普那韦(amprenavir)、聚肌胞(ampligen)、阿比朵尔(arbidol)、阿扎那韦(atazanavir)、立普妥(atripla)、波西普韦(boceprevirertet)、西多福韦(cidofovir)、可比韦(combivir)、达芦那韦(darunavir)、地拉夫定(delavirdine)、去羟肌苷(didanosine)、二十二醇(docosanol)、依度尿苷(edoxudine)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦肽(enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、泛昔洛韦(famciclovir)、膦沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、福斯菲特(fosfonet)、更昔洛韦(ganciclovir)、伊巴他滨(ibacitabine)、异丙肌苷(imunovir)、碘苷(idoxuridine)、咪喹莫特(imiquimod)、印地那韦(indinavir)、肌苷(inosine)、各种干扰素(例如聚乙二醇干扰素α-2a)、洛匹那韦(lopinavir)、洛韦胺(loviride)、马拉维若(maraviroc)、吗啉胍(moroxydine)、甲吲噻腙(methisazone)、那非那韦(nelfinavir)、耐昔韦(nexavir)、喷昔洛韦(penciclovir)、帕拉米韦(peramivir)、普来可那立(pleconaril)、足叶草毒素(podophyllotoxin)、雷特格韦(raltegravir)、三(氮)唑核苷(ribavirin)、利托那韦(ritonavir)、嘧啶(pyramidine)、沙奎那韦(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、特拉普韦(telaprevir)、替诺福韦(tenofovir)、替拉那韦(tipranavir)、曲氟尿苷(trifluridine)、阿巴卡韦(trizivir)、醋胺金刚烷(tromantadine)、特鲁瓦达(truvada)、缬昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、维维罗克(vicriviroc)、阿糖腺苷(vidarabine)、塔利韦林(viramidine)和扎西他宾(zalcitabine)。
本发明考虑了本文公开的任何抗TIGIT抗体与抗寄生虫药剂的组合的用途。所述药剂包括但不限于噻苯达唑(thiabendazole)、双羟萘酸噻吩嘧啶(pyrantel pamoate)、甲苯咪唑(mebendazole)、吡喹酮(praziquantel)、氯硝柳胺(niclosamide)、硫双二氯酚(bithionol)、奥沙尼喹(oxamniquine)、美曲膦酯(metrifonate)、伊佛霉素(ivermectin)、阿苯达唑(albendazole)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、美拉胂醇(melarsoprol)、喷他脒(benznidazole)、硝呋噻氧(nifurtimox)和硝基咪唑(nitroimidazole)。技术人员知道可以用于治疗寄生虫病的其他药剂。
本发明的实施方案考虑了本文公开的任何抗TIGIT抗体与可用于治疗或预防细菌病症的药剂组合的用途。抗菌剂可以以各种方式分类，包括基于作用机理、基于化学结构和基于活性谱。抗菌剂的实例包括靶向细菌细胞壁(例如头孢菌素和青霉素)或细胞膜(例如多粘菌素)，或干扰必需细菌酶(例如磺胺、利福霉素和喹啉)的药剂。大多数靶向蛋白质合成的抗菌剂(例如四环素类和大环内酯类)是抑菌的，而诸如氨基糖苷类的药剂是杀菌的。另一种对抗菌剂进行分类的方法是基于它们的目标特异性；“窄谱”药剂靶向特定类型的细菌(例如，革兰氏阳性细菌，例如链球菌)，而“广谱”药剂具有针对更广范围的细菌的活性。本领域技术人员知道适用于特定细菌感染的抗菌剂类型。
本发明的实施方案考虑了本文公开的任何抗TIGIT抗体与可用于治疗或预防真菌病症的药剂组合的用途。抗真菌剂包括多烯(例如，两性霉素、制霉菌素和匹马菌素)；唑类(如氟康唑、伊曲康唑和酮康唑)；烯丙胺类(如萘替芬和特比萘芬)和吗啉(如阿莫罗芬)；和抗代谢药物(如5-氟胞嘧啶)。
本发明包括上述药剂(以及药剂所属家族的成员)的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
针对TIGIT的抗体可以与所述的用于共同治疗的任何第二抗体或药剂组合作为药物组合物的组分。在药物组合物中，药剂可以与一种或多种所述的药学上可接受的载体组合。
V.其它用途
抗TIGIT抗体可用于在临床诊断或治疗或研究中检测TIGIT。例如，所述抗体可用于检测T细胞、天然杀伤细胞和癌细胞中TIGIT的存在，作为受试者患有适合治疗的癌症或感染性疾病的指示。TIGIT在患有癌症或传染病的受试者的T细胞、天然杀伤细胞和/或癌细胞上的表达也提供了癌症或感染性疾病适合用本发明的抗体治疗的指示。所述抗体还可作为实验室研究试剂出售，用于检测T细胞、自然杀伤细胞和癌细胞以及它们对各种刺激的反应。在这些用途中，单克隆抗体可以用荧光分子、自旋标记的分子、酶或放射性同位素标记，并且可以以试剂盒的形式提供，所述试剂盒具有进行TIGIT测定的所有必需试剂。所述抗体也可用于纯化TIGIT，例如通过亲和层析。
VI.试剂盒
针对TIGIT的抗体可以与所述的用于共同治疗的任何第二抗体或药剂组合作为试剂盒的一部分。本发明提供了一种或多种试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种本发明公开的抗体以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体(例如但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、无菌水、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油、芝麻油、乳液如油/水乳液或水/油乳液、微乳液、纳米载体和各种类型的润湿剂)。添加剂如醇、油、二醇、防腐剂、调味剂、着色剂、悬浮剂等也可以与载体、稀释剂或赋形剂一起包含在本发明的试剂盒中。在一个实施方式中，适用于本发明公开的抗体组合物的药学上可接受的载体是无菌的、无病原体的和/或对于向受试者施用是安全的，没有相关感染和其他不适当的副作用的风险。在试剂盒中，可以在单独的小瓶中提供各试剂，及其组合的说明，随后是施用或单独施用的说明。所述试剂盒还可以包括用于正确处理和储存本发明公开的任何抗TIGIT抗体的书面说明书。
在整个说明书中给出的每个最大数值限制都包括每个较低的数值限制，如同这些较低的数值限制在本文中明确写出一样。在整个说明书中给出的每个最小数值限制将包括每个更高的数值限制，如同这些较高的数值限制在本文中明确写出一样。本说明书中给出的每个数值范围将包括落入这样更宽的数值范围内的每个较窄的数值范围，如同这些较窄的数值范围都在本文中明确写出一样。
上文或下文引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等均出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独的项目被具体和单独地指出通过引用并入。如果序列的不同版本与一个登记号在不同时间相关联，则特指与本申请的有效提交日期的登记号相关联的版本。所述有效提交日期是指与登记号相关的实际提交日期或优先权申请的提交日期的较早日期(若适用)。同样地，如果不同版本的出版物、网站等在不同时间发布，则除非另有说明，否则表示与本申请的有效提交日期最近的发布的版本。除非另外特别指出，否则本发明的任何特征、步骤、元件、实施例或方面可以与任何其他组合使用。
尽管出于清楚和便于理解的目的，通过说明和实施例详细地描述了本发明，但是显而易见的是，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。
实施例
以下实施例讨论了针对人TIGIT的单克隆抗体的产生、表征和人源化，并且还提供了示例性方法，通过所述方法可以确定本申请中描述的抗体的结合特征。
实施例1：重组人TIGIT蛋白的表达
本研究工作中的基因克隆、突变和质粒构建采用标准分子生物学技术进行，例如参见Sambrook和Russel(分子克隆，实验室手册，第三版,2001,冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，Kostelny等(Int.J.Cancer 93:556-565，2001)和Cole等(免疫159:3613-3621，1997)。
用于产生与人免疫球蛋白γ1链的Fc区融合的人TIGIT的胞外区(hTIGIT-Fc；SEQID NO：59)的哺乳动物表达载体pFCm404(图1)含有以下遗传组分。从图1中的pFCm404的SalI位点顺时针方向，质粒含有hTIGIT-Fc的转录单位，起始于人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(图1中的CMV-P)。CMV启动子之后是信号肽(sp；SEQ ID NO：2)的编码区、人TIGIT的胞外区(hTIGIT；SEQ ID NO：3)的编码区、多肽接头(SEQ ID NO：4)和人γ1Fc区(SEQ ID NO：5)的编码区，然后是人γ1重链基因的多腺苷酸化位点。hTIGIT-Fc基因之后是SV40早期启动子(SV40-P)、用于产生对嘌呤霉素的抗性的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因(puro)，以及含有SV40多腺苷酸化位点(SV40-A)的片段。最后，pFCm404含有质粒pUC19的一部分，包含细菌复制起点(pUC ori)和β内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。图中的箭头表示转录的方向。相关的限制性内切酶位点显示在图中。
用编码人CD155胞外区的DNA片段(hCD155；SEQ ID NO：6)替换pFCm404中人TIGIT胞外区的编码区，于是产生新的表达载体pFCm406(图1)。与人γ1的Fc区融合的人CD155的胞外区(hCD155-Fc；SEQ ID NO：7)，由pFCm406表达。
将pFCm404中AgeI和EagI位点之间的γ1的Fc区的编码区替换为一DNA片段，该DNA片段编码FLAG肽(FLAG；SEQ ID：8)以及之后的人CD55的糖基磷脂酰肌醇连接信号(GPI；SEQID：9)，于是产生新的表达载体pFCm407(图1)。与FLAG和GPI(编码的pFCm406)融合的人TIGIT的胞外区(hTIGIT-GPI)被表达在细胞表面上。
为了获得在培养上清液中稳定产生hTIGIT-Fc和hCD155-Fc的细胞系，将表达载体pFCm404和pFCm406分别导入小鼠骨髓瘤细胞系NS0(欧洲动物细胞培养物保藏中心，索尔兹伯里市，威尔特郡，英国)的染色体。NS0细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培养基中，于37℃在7.5％CO2培养箱中生长。向NS0的稳定转染通过电穿孔进行，如Bebbington等人所述(生物/技术10：169-175，1992)。在转染之前，使用FspI将表达载体线性化。用10μg线性化质粒转染大约107个细胞，悬浮在含有10％FBS的DME培养基中，并接种到几个96孔板中。24小时后，使用选择性培养基(含有10％FBS和3μg/ml嘌呤霉素的DME培养基)。在开始选择后大约10天，通过ELISA检测培养物上清液的Fc融合蛋白的产生，其中用山羊抗人γ链抗体进行包被和用HRP偶联的山羊抗人γ链来检测Fc融合蛋白。
产生高水平Fc融合蛋白的NS0稳定转染子，在杂交瘤-SFM培养基(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国马萨诸塞州)中适应并扩增，并在摇瓶中生长至耗尽。离心并过滤后，将培养上清液上样到蛋白-A琼脂糖凝胶柱(GE医疗，皮斯卡塔韦，新泽西)上。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤柱子，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)洗脱Fc融合蛋白。用1M Tris-HCl(pH8)中和后，通过透析将洗脱的Fc融合蛋白的缓冲液更换为PBS。
为了获得细胞表面上表达hTIGIT-GPI的细胞系，将表达载体pFCm407稳定转染到NS0细胞中。使用大鼠抗FLAG单克隆抗体和PE标记的山羊抗大鼠IgG、Fc特异性抗体，通过流式细胞术监测细胞表面上hTIGIT-GPI的表达。细胞表面上表达高水平hTIGIT-GPI的NS0细胞系(NS0-hTIGIT)，被用于筛选抗TIGIT抗体。
实施例2：抗TIGIT单克隆抗体的产生和表征
按照标准杂交瘤技术，例如GenomONE CF EX细胞融合试剂(Cosmo Bio公司，卡尔斯巴德，美国加州)，在JN生物科技公司(山景城，美国加州)产生抗人TIGIT单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞。作为免疫原，使用人TIGIT-Fc融合蛋白和NS0-hTIGIT细胞。
将杂交瘤细胞的培养上清液中分泌的小鼠抗体进行一系列筛选，以鉴定具有以下特性的抗体：(1)与纯化的hTIGIT-Fc融合蛋白结合，(2)与NS0-hTIGIT细胞结合，(3)不与NS0细胞结合，(4)与植物血凝素处理的人外周血单核细胞来源的CD3+T细胞结合，以及(5)阻断hCD155-Fc融合蛋白与NS0-hTIGIT细胞的结合。使用针对小鼠κ和λ轻链的HRP偶联的的山羊抗体(SouthernBiotech公司，伯明翰，美国亚拉巴马州)，通过ELISA测试结合hTIGIT-Fc的第一特性，以用于鉴定小鼠的抗TIGIT抗体。使用PE标记的山羊抗小鼠γ链抗体(SouthernBiotech)，通过流式细胞术检测第二、第三和第四特性，以检测与细胞结合的小鼠抗体。如下所述，通过流式细胞术分析第五特性。发现三种小鼠单克隆抗体(TIG1、TIG2和TIG3)具有所有这五种特性。如上所述，通过蛋白A柱层析从杂交瘤细胞的培养上清液中纯化出TIG1、TIG2和TIG3单克隆抗体。TIG1、TIG2和TIG3的同种型分别是小鼠IgG2bκ、IgG2a/κ和IgG2a/κ。
通过流式细胞术，分析TIG1、TIG2和TIG3阻断TIGIT和CD155之间相互作用的活性。在存在(或不存在)各种浓度的抗TIGIT单克隆抗体(作为竞争剂)的情况下，将NS0-hTIGIT细胞与亚饱和浓度的hCD155-Fc一起温育。用DyLight488标记的山羊抗人IgG、Fc特异性抗体(杰克逊免疫研究，西格罗夫，美国宾夕法尼亚州)，对与NS0-hTIGIT细胞结合的hCD155-Fc进行检测。如图2所示，TIG1、TIG2和TIG3以剂量依赖性方式抑制hCD155-Fc与NS0-hTIGIT细胞的结合。阻断hCD155-Fc和NS0-hTIGIT细胞之间相互作用的半数最大抑制浓度(IC50)，对于TIG1为49ng/ml，对于TIG2为197ng/ml，对于TIG3为460ng/ml。阻断CD155与TIGIT结合的95％以上所需的抗体浓度，对于TIG1为0.63μg/ml，对于TIG2为1.25μg/ml，对于TIG3为2.5μg/ml。
实施例3：抗TIGIT单克隆抗体的V基因测序
按照Tsurushita等人(方法36：69-83,2005)描述的方法，进行小鼠抗TIGIT抗体的重链和轻链可变区(分别为VH和VL)序列的测定。使用TRIzol试剂(英杰公司，卡尔斯巴德，美国加州)并根据供应商的方案，从约107个细胞中提取总RNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，山景城，美国加州)并根据供应商的方案，合成用于5'-RACE的寡聚dT-引导合成的cDNA。使用高保真DNA聚合酶(赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国马萨诸塞州)，通过聚合酶链式反应(PCR)，使用3'引物和5'引物扩增VH和VL的cDNA，其中所述3'引物特异性地分别退火结合于小鼠重链或轻链恒定区(Tsurushita等，同上)，而所述5'引物由SMARTerRACE cDNA扩增试剂盒提供。使用CloneJet PCR克隆试剂盒(赛默飞世尔科技)克隆经扩增的VH和VL基因，并用CloneJet PCR克隆试剂盒中提供的引物进行测序。对几个VH和VL克隆进行测序，鉴定出与标准的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。
TIG1的成熟VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)如图3所示。TIG1 VH的CDR1、2和3的氨基酸序列分别是NFGMH(SEQ ID NO：11)、FISSGSSSIYYADTVKG(SEQ ID NO：12)和MRLDYYAMDY(SEQ ID NO：13)。
TIG1的成熟VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)示于图4中。TIG1 VL的CDR1、2和3的氨基酸序列分别是RASKSISKYLA(SEQ ID NO：15)、SGSTLQS(SEQ ID NO：16)和QQHNEYPWT(SEQ ID NO：17)。
TIG2的成熟VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)如图5所示。TIG2 VH的CDR1、2和3的氨基酸序列分别是EYTMH(SEQ ID NO：19)、GINPNNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO：20)和PGWYNYAMDY(SEQ ID NO：21)。
TIG2的成熟VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)示于图6中。TIG2 VL的CDR1、2和3的氨基酸序列分别是KASQGVSTAVA(SEQ ID NO：23)、SASYRYT(SEQ ID NO：24)和QQHYITPWT(SEQ ID NO：25)。
TIG3的成熟VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)如图7所示。TIG3 VH的CDR1、2和3的氨基酸序列分别是DYDMS(SEQ ID NO：27)、YISDGGYNTYYPDTVKG(SEQ ID NO：28)和QILLRYYFDY(SEQ ID NO：29)。
TIG3的成熟VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)示于图8中。TIG3 VL的CDR1、2和3的氨基酸序列分别是KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO：31)、WASTRES(SEQ ID NO：32)和QQYHSYPWT(SEQ ID NO：33)。
图3-8中CDR序列的分配和氨基酸位置的编号，是依据Kabat等(1991)得出。图中CDR1、CDR2和CDR3的序列用下划线标出。
实施例4：人源化TIG1抗体的构建和表达
TIG1的VH和VL的人源化，依据Queen等(美国科学院院报(ProcNatl.Acad.Sci.USA)86:10029-10033，1989)和Tsurushita等(方法36:69-83，2005)所述的步骤进行。简而言之，首先使用JN Biosciences的专有算法构建TIG1可变区的三维分子模型。接下来，使用分子模型，鉴定对于形成TIG1的互补决定区(CDR)的结构重要的框架氨基酸残基。同时，选择分别与TIG1 VH和VL具有高度同源性的cDNA衍生的人VH和VL氨基酸序列。最后，将CDR序列和对维持CDR结构重要的框架氨基酸残基一起从TIG1的VH和VL转移到相应的被选定的人框架序列中。
设计的人源化TIG1 VH(HuTIG1 VH)的氨基酸序列是：MDSRLNLVFLVLILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：34)。成熟HuTIG1 VH氨基酸序列是：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:35)，该序列从SEQ IDNO:34中位置20开始。
设计的人源化TIG1 VL(HuTIG1 VL)的氨基酸序列是：MRFQVQVLGLLLLWISGAQCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:36)。成熟HuTIG1 VL氨基酸序列是：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:37)，该序列从SEQ ID NO:36中位置21开始。
编码HuTIG1 VH的基因作为外显子被合成，包括在编码区3'末端的剪接供体信号、在片段5'末端的SpeI位点和在片段3'末端的HindIII位点。两边为SpeI和HindIII位点的合成HuTIG1 VH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：38)，在图9A中与推导的氨基酸序列(SEQ IDNO：34)一起显示。
编码HuTIG1 VL的基因作为外显子被合成，包括在编码区3'末端的剪接供体信号、在片段5'末端的NheI位点和在片段3'末端的EcoRI位点。两边为NheI和EcoRI位点的合成HuTIG1 VL基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：39)，在图9B中与推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)一起显示。
制备用于产生小鼠抗人TIGIT单克隆抗体TIG1的人源化IgG1/κ形式(HuTIG1-IgG1.AA)的哺乳动物表达载体pHuTIG1.AA(图10)，其含有以下遗传组分。从图10中的SalI位点顺时针开始，所述载体含有重链转录单元，其从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(图中的CMV-P)开始，以启动抗体重链基因的转录。CMV启动子之后是编码人源化形式TIG1的重链可变区(HuTIG1 VH)的外显子(其两边为SpeI和HindIII位点)、含有人γ1重链恒定区(包括CH1、铰链区、CH2和CH3外显子以及介于其间的内含子)的基因组序列，以及人γ1重链基因的多腺苷酸化位点。在pHuTIG1.AA中编码的CH2区，将位置234和235(Eu编号)处的氨基酸残基替换为丙氨酸残基(L234A/L235A)，从而消除效应子功能(Hezareh等，J.Virol.75:12161-12168，2001)。在重链基因序列之后，轻链转录单元以CMV启动子和增强子(CMV-P)开始，接着是编码人源化形式的TIG1轻链可变区(HuTIG1 VL)的外显子(其侧翼为NheI和EcoRI位点)、含有人κ-链恒定区外显子(Cκ)的基因组序列(其前面有一部分内含子)，以及排在Cκ外显子之后的人κ链基因的多腺苷酸化位点。在轻链基因之后是SV40早期启动子(SV40-P)、赋予抗嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因(puro)，以及含有SV40多腺苷酸化位点(SV40-A)的片段。最后，pHuTIG1.AA含有质粒pUC19的一部分，其包含细菌复制起点(pUC ori)和β内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。图中的箭头表示转录的方向。
pHuTIG1.AA中编码的HuTIG1-IgG1.AA的成熟γ重链的氨基酸序列为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:40)。
C端的赖氨酸可存在或不存在。
pHuTIG1.AA中编码的HuTIG1-IgG1.AA的成熟κ轻链的氨基酸序列为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:41)。
将表达载体pHuTIG1.AA导入中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCC，马纳萨斯州，VA)的染色体中，以获得稳定产生HuTIG1-IgG1.AA的细胞系。CHO-K1细胞在SFM4CHO培养基(GE医疗生命科学，洛根，犹他州)中，于37℃在7.5％CO2培养箱中生长。通过电穿孔，对CHO-K1进行稳定转染。在转染之前，用FspI将pHuTIG1.AA线性化。在典型的实验中，用20μg线性化质粒转染大约107个细胞，悬浮于SFM4CHO培养基中，并在适当稀释细胞后以100μl/孔接种在几个96孔板中。48小时后，以100μl/孔加入含有20μg/ml嘌呤霉素的SFM4CHO培养基，以便分离出稳定的转染子。在开始选择后大约10天，测定转染子的培养物上清液是否有抗体产生。
通过夹心ELISA测量HuTIG1-IgG1.AA的表达。在典型的实验中，用山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体包被ELISA板，用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温20的PBS)洗涤，并用ELISA缓冲液(含有2％脱脂牛奶和0.05％吐温20的PBS)封闭。用洗涤缓冲液洗涤后，将在ELISA缓冲液中适当稀释的测试样品加到ELISA板。使用合适的人源化IgG1/κ抗体作为标准品。在室温下孵育ELISA板1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，使用HRP偶联的山羊抗人κ链多克隆抗体检测结合的抗体。在室温下孵育平板0.5小时并用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入100μl/孔的ABTS底物(西格玛-奥德里奇公司)开始显色，并用100μl/孔的2％草酸终止。在405nm处读取吸光度。
高产HuTIG1-IgG1.AA的CHO-K1稳定转染子，在SFM4CHO中扩增，直至细胞活力小于50％。离心并过滤后，将培养上清液上样到蛋白A柱(HiTrap MABSelect SuRe，GE医疗,皮斯卡塔韦,新泽西州)上。用PBS洗涤柱子，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)洗脱抗体。用1MTris-HCl(pH 8)中和含洗脱的抗体的缓冲液，然后通过透析将其换为PBS。通过测量280nm处的吸光度，测定抗体浓度(1mg/ml＝1.4OD)。
实施例5：HuTIG1-IgG1.AA的特性
通过ELISA检测HuTIG1-IgG1.AA与人TIGIT的结合。将ELISA板在含有5μg/mlhTIGIT-Fc的PBS中(100μl/孔)，在4℃下包被过夜，用洗涤缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤，并用200μl/孔的SuperBlock封闭液(赛默飞世尔科技)封闭。用洗涤缓冲液洗涤孔后，加入HuTIG1-IgG1.AA(初始为2.5μg/ml，并在SuperBlock封闭液中进行连续2倍的稀释)，以结合于结合在板上的人TIGIT。在室温下孵育ELISA板1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，用100μl/孔的HRP偶联的山羊抗人κ链多克隆抗体(Southern生物科技公司)(在ELISA中以1/2,000稀释)，检测结合的抗体。在室温下孵育30分钟并用洗涤缓冲液洗涤后，用100μl/孔的ABTS底物开始显色，并用100μl/孔的2％草酸终止。在405nm处读取吸光度。如图11所示，HuTIG1-IgG1.AA以剂量依赖性方式与人TIGIT结合。HuTIG1-IgG1.AA与TIGIT结合的半数最大有效浓度(EC50)为65ng/ml。这表明HuTIG1-IgG1.AA是人TIGIT的优良结合物。
还通过流式细胞术检测了HuTIG1-IgG1.AA与人TIGIT的结合。在存在(或不存在)各种浓度的HuTIG1-IgG1.AA(初始为10μg/ml，并进行连续2倍的稀释)的情况下，将NS0-hTIGIT细胞(8×105个细胞)在160μl FACS缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的PBS)中，在4℃下孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤后，用FACS缓冲液中的PE标记的山羊抗人IgG抗体，检测结合于NS0-hTIGIT细胞的HuTIG1-IgG1.AA。孵育20分钟并用FACS缓冲液洗涤后，使用FACScan流式细胞仪(BD生物科技公司，圣何塞，加利福尼亚州)对细胞进行流式细胞术，以获得每种抗体浓度下的平均通道荧光(MCF)。图12显示了每种抗体浓度(横轴)的MCF(竖轴)图。EC50值为60ng/ml。这表明HuTIG1-IgG1.AA是对细胞表面上表达的人TIGIT的优良结合物。
用NS0-hTIGIT细胞，通过流式细胞术分析HuTIG1-IgG1.AA阻断人TIGIT与人CD155之间相互作用的活性。在存在(或不存在)各种浓度的HuTIG1-IgG1.AA(初始为10μg/ml，并进行连续2倍的稀释)的情况下，将NS0-hTIGIT细胞(106个细胞)与亚饱和浓度(125ng/ml)的FITC标记的hCD155-Fc融合蛋白(hCD155-Fc-FITC)在200μl FACS缓冲液中，在4℃下孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤后，使用FACScan流式细胞仪(BD生物科技公司，圣何塞，加利福尼亚州)对NS0-hTIGIT细胞进行流式细胞术。为了检查hCD155-Fc-FITC与细胞的结合，在每种抗体浓度下获得MCF。如图13所示，HuTIG1-IgG1.AA以剂量依赖性方式阻断hCD155-Fc-FITC和细胞表面的TIGIT的相互作用。HuTIG1-IgG1.AA阻断TIGIT-CD155相互作用的半数最大抑制浓度(IC50)为67ng/ml。这表明HuTIG1-IgG1.AA是CD155和TIGIT之间相互作用的有效阻断剂。
实施例6：人源化TIG3抗体的构建和表达
按照实施例4中描述的一般步骤，进行TIG3 VH和VL的人源化。设计的人源化TIG3VH(HuTIG3 VH)的氨基酸序列是：MNFGLRLIFLVLTLKGVNCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:42)。成熟HuTIG3 VH的氨基酸序列是：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:43)，该序列从SEQ ID NO:42的位置20开始。
设计的人源化TIG3 VL(HuTIG3 VL)的氨基酸序列是：MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:44)。成熟HuTIG3 VL的氨基酸序列是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:45)，该序列从SEQ ID NO:44的位置21开始。
编码HuTIG3 VH的基因作为外显子被合成，包括在编码区3'末端的剪接供体信号、在片段5'末端的SpeI位点和小片段3'末端的HindIII位点。合成的HuTIG3 VH基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)，在图14A中与推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：42)一起显示。
编码人源化HuTIG3 VL(HuTIG3 VL)的基因作为外显子被合成，包括在编码区3'末端的剪接供体信号、在片段5'末端的NheI位点和在片段3'末端的EcoRI位点。合成的HuTIG3VL基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)，在图14B中与推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)一起显示。
制备用于产生抗人TIGIT单克隆抗体TIG3的人源化IgG1/κ形式(HuTIG3-IgG1.AA)的哺乳动物表达载体pHuTIG3.AA，其通过以下方式对pHuTIG1.AA进行改造：(1)在SpeI和HindIII位点之间用HuTIG3 VH基因替换HuTIG1 VH基因，和(2)在NheI和EcoRI位点之间用HuTIG3 VL基因替换HuTIG1 VL基因。在pHuTIG3.AA中编码的CH2区,将位置234和235(Eu编号)(L234A/L235A)处的氨基酸残基替换为丙氨酸残基，以消除效应子功能。
pHuTIG3.AA中编码的HuTIG3-IgG1.AA的成熟γ重链的氨基酸序列为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:48)。
C端的赖氨酸可存在或不存在。
pHuTIG3.AA中编码的HuTIG3-IgG1.AA的成熟κ轻链的氨基酸序列为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:49)。
根据供应商的方案，将pHuTIG3.AA瞬时转染到100ml指数生长的Expi293细胞(赛默飞世尔科技公司)中。如上所述，通过pHuTIG3.AA的电穿孔，也产生高产HuTIG3-IgG1.AA的CHO-K1稳定转染子，并在SFM4CHO中扩增直至细胞活力小于50％。如上所述，通过蛋白A亲和柱从瞬时转染的Expi293细胞和稳定转染的CHO-K1细胞的培养物上清液中纯化HuTIG3-IgG1.AA。
实施例7：HuTIG3-IgG1.AA的表征
如实施例5的描述，通过ELISA检测HuTIG3-IgG1.AA与人TIGIT的结合。如图15所示，HuTIG3-IgG1.AA以剂量依赖性方式与人TIGIT结合。HuTIG3-IgG1.AA与TIGIT结合的半数最大有效浓度(EC50)为85ng/ml。这表明HuTIG3-IgG1.AA是人TIGIT的优良结合物。
如实施例5的描述，还通过流式细胞术检测HuTIG3-IgG1.AA与人TIGIT的结合。如图12所示，HuTIG3-IgG1.AA以剂量依赖性方式与人TIGIT结合。HuTIG3-IgG1.AA与TIGIT结合的半数最大有效浓度(EC50)为370ng/ml。这表明HuTIG3-IgG1.AA是人TIGIT的优良结合物。
用NS0-hTIGIT细胞，通过流式细胞术和FITC标记的hCD155Fc分析HuTIG3-IgG1.AA阻断人TIGIT与人CD155之间相互作用的活性。如图13所示，HuTIG3-IgG1.AA以剂量依赖性方式阻断人TIGIT与CD155的结合。HuTIG3-IgG1.AA阻断TIGIT-CD155相互作用的最大半数抑制浓度(IC50)为279ng/ml。这表明HuTIG3-IgG1.AA是CD155和TIGIT之间相互作用的有效阻断剂。
实施例8：TIGIT阻断增强了人T细胞对破伤风类毒素的IL-2细胞因子反应
使用针对破伤风类毒素的体外抗原特异性回忆试验，检测了鼠抗TIGIT抗体增强抗原特异性T细胞应答的能力(参见例如，Piersma等，Vaccine.2006年4月12日；24(16):3076-83；Zaunders等，免疫杂志；2009年8月15日；183(4):2827-36)。通过加强注射实现对破伤风类毒素的充分疫苗保护，其允许免疫系统诱导CD4+和CD8+T细胞记忆反应。作为有效性的替代衡量标准(参见例如，Plotkin等，Clin Vaccine Immunol.(2010)7月；17(7)：1055-1065；Goulon等，1972年11月，Presse Med.1:3049-3050.)，抗破伤风类毒素0.1IU/mL的血清水平表明了维持的免疫应答。
获得来自用破伤风类毒素接种的人类志愿者的外周血单核细胞(PBMC)(iQ生物科学公司)，通过ELISA(Genway)确认志愿者的破伤风血液滴度高于1.0IU/ml。在96孔圆底板(Nunc)中，在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养800,000个PBMC。在3.3μg/ml或10μg/ml的浓度的小鼠抗PD-1抗体(Biolegend，克隆EH12.2H7)或抗TIGIT抗体(TIG1)存在下，将2μg/ml破伤风类毒素(List Biological Laboratories公司)加入含有PBMC的孔中，在37℃5％CO2培养箱中培养4天。作为对照，将2μg/ml的破伤风类毒素加入到没有任何抗体的PBMC中。收集来自培养孔的上清液，并通过流式细胞术(BDFACSCalibur)通过细胞因子珠阵列(BD Pharmingen公司，CBA Th1/Th2细胞因子试剂盒)，测定指示T细胞活化的细胞因子IL-2。如图16所示，仅破伤风类毒素刺激所产生的IL-2为31pg/ml。在分别以3.3μg/ml和10μg/ml的小鼠抗TIGIT抗体TIG1存在下，IL-2产量进一步增至70pg/ml和86pg/ml。在分别以3.3μg/ml和10μg/ml的小鼠抗PD-1抗体EH12.2H7存在下，通过破伤风类毒素刺激的IL-2产量进一步增至39pg/ml和57pg/ml。这些数据表明：TIG1具有增强抗原特异性T细胞的细胞因子反应的功能。
实施例9：通过TIGIT阻断增强人T细胞对破伤风类毒素的增殖反应
使用针对破伤风类毒素的体外抗原特异性回忆试验，检测了鼠抗TIGIT抗体增强抗原特异性T细胞应答的能力(参见例如，Piersma等，Vaccine.2006年4月12日；24(16):3076-83；Zaunders等，免疫杂志，2009年8月15日；183(4):2827-36)。如实施例8中所述，获得来自用破伤风类毒素接种的人类志愿者的PBMC(iQ生物科学发送)。PBMC用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(赛默飞世尔公司)标记，该试剂用于体外和体内标记细胞，以通过流式细胞术使用染料稀释液来追踪多代。将250,000个CFSE标记的PBMC在96孔圆底板(Nunc)的AIM-V培养基(英杰公司)中培养。在每个孔存在小鼠抗PD-1抗体(Biolegend公司克隆EH12.2H7)或TIG1(粘度为2.5μg/ml、5μg/ml或10μg/ml)的情况下，向每个孔中加入2μg/ml破伤风类毒素(Astarte生物制品有限责任公司)。将细胞在37℃，5％CO2培养箱中培养4天。在第4天，将IL-2[50单位/ml](派普泰克公司)加入到培养物中，并且在第6天，收集PBMC，通过流式细胞术(BD FACSCalibur)，测定CD4+T细胞或CD8+T细胞上CFSE稀释度，以测定增殖情况。
如图17(上图)所示，破伤风类毒素分别诱导来自供体1和2的4.5％和6.5％人CD4+T细胞的增殖。在所有测试的抗体浓度(2.5μg/ml，5μg/ml和10μg/ml)下，添加的TIG1进一步增强CD4+T细胞增殖，所述增殖效果与在这些剂量范围内用抗PD-1抗体观察到增殖效应相类似。
如图17(下图)所示，破伤风类毒素分别诱导来自供体1和2的15％和15.5％人CD8+T细胞的增殖。在所有测试的抗体浓度(2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml)下，添加的TIG1进一步增强CD8+T细胞增殖，所述增殖效果与在这些剂量范围内用抗PD-1抗体EH12.2H7观察到增殖效应相类似。这些结果证明：TIG1具有增强抗原特异性T细胞增殖反应的能力。
实施例10：通过TIGIT阻断，增加NK细胞介导的人类初级效应子细胞和K562靶细胞 的细胞毒性
人NK细胞能够对缺乏MHC I的靶细胞例如K562，这是一种慢性髓性白血病(CML)细胞系，引起天然细胞毒性(参见例如，Nagel等，Cancer Res1981；41:2284-2288；Andersson等，Int J Cancer.1979年2月；23(2):143-7.；Lozzio等，Leuk Res.1979；3(6):363-70)。使用商业化抗体(Biolegend公司的抗CD155克隆SKII.4)确认CD155(PVR)在K562细胞(ATCC)上的表达。如图18(上图)所示，发现98％的K562细胞表达高水平的CD155(黑色直方图)。在3个代表性的人供体上也证实了，使用商业化抗体(eBiosciences公司的抗TIGIT克隆MBSA43和Biolegend公司的抗CD56克隆HCD56)，在PBMC(iQ生物科学公司)中的人CD56阳性NK细胞上有TIGIT表达(图18，下图)。
用和不用TIG1情况下，测定由NK细胞介导的K562细胞的裂解。将PBMC在白介素-2(IL-2)[200单位/ml](派普泰克公司)存在下，在AIM-V培养基(英杰公司)中，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，在10μg/ml TIG1存在下，将K562细胞进行CFSE标记并与PBMC以1：100(靶细胞：PBMC；一个K562细胞对应100个包含约5％NK细胞的PBMC)，在37℃、5％CO2培养箱中共培养4小时。孵育期后，收获细胞并用5nM Sytox Red(赛默飞世尔公司)染色，以通过(CFSE+Sytox Red+)来区分死靶细胞。通过流式细胞术(FACSCalibur；FlowJo分析)测定被NK细胞裂解的K562靶细胞的百分比。如图19所示，在没有TIG1的情况下，裂解了2％的K562细胞。当加入TIG1时，4.4％的K562细胞被裂解。添加的TIG1使NK细胞介导的对K562细胞的天然细胞毒性增强两倍，这证明TIG1具有增强人效应子细胞亚群杀死靶细胞水平的能力。
实施例11：TIGIT阻断增强了SEB诱导的人T细胞产生细胞因子
超抗原如SEB(葡萄球菌肠毒素B)，通过将抗原呈递细胞上的MHC II类分子与TCR的νβ元件连接而激活T细胞，从而导致细胞因子的产生，所述细胞因子包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)(参见例如，Krakauer等，Toxins(巴塞尔).2010年8月；2(8)：1963-1983)。与典型的回忆抗原诱导的T细胞反应(其中0.1-0.001％的T细胞可能被激活)相比，SEB能够激活人血液中高达10-20％的T细胞，其取决于在每个特定血液供体中发现的携带νβ3、νβ12、νβ14和νβ17的T细胞的比例。因此，SEB可用于基于T细胞的细胞因子分泌测定，用人全血细胞(WBC)，来测定TIGIT阻断所导致靶调节水平。
抽取新鲜分离的WBC样品(斯坦福血液中心)，其中在抽血4小时内使用肝素钠，并且没有观察到溶血迹象。将250μl等分至96孔圆底板(Nunc)中的孔中，并在10μg/ml人源化抗PD-1单克隆抗体或10μg/ml HuTIG1-IgG1.AA存在下，用终浓度为1μg/ml的SEB(毒素技术公司)，在37℃、5％CO2培养箱中刺激24小时。24小时后，将96孔板短暂离心以分离血浆层，以便收集。收集血浆样品后，通过细胞因子珠阵列(Biolegend，LEGENDplexTM人CD8/NK板)，使用流式细胞术(BD FACSCalibur)测量IL-2、IL-6、TNFα和IFNγ的表达水平，并用Biolegend软件进行分析以获得定量测定结果。
为了确定IL-2、IL-6、TNFα和IFNγ的每种因子的表达水平的变化，对于每个受试者，用测试抗体(加上SEB)存在下的细胞因子水平除以没有抗体的存在下的细胞因子水平。因此，2倍的变化(例如在抗TIGIT抗体存在下所检测到的)意味着在实验中测量的细胞因子的绝对浓度是在SEB刺激的对照条件下发现的数量的两倍。如图20所示，在10μg/ml人源化抗PD-1或10μg/ml HuTIG1-IgG1.AA存在下，健康供体血细胞在SEB刺激下所产生的IL-2、IL-6、TNFα或IFNγ产量增加。在这些条件下，WBC中SEB诱导的细胞因子的产生及其受HuTIG1-IgG1.AA的调节，体现了细胞因子效应子反应被增强。如本文所示的测定中通过刺激IL-2、IL-6、TNFα和IFNγ的产生所证明的那样，HuTIG1-IgG1.AA能够增强免疫应答。
实施例12：HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA介导的补体依赖性细胞毒性表征
补体依赖性细胞毒性(CDC)是指在补体存在下，表达其靶分子的细胞发生裂解(参见例如，Gazzano-Santoro等，免疫方法杂志，202:163)。经典补体途径的激活，是通过补体系统的第一组分(C1q)与抗体(适当的亚类)的结合而起始，所述抗体与细胞表面上的同源抗原结合。为了评估补体激活，对人T细胞Jurkat双重报告亲本细胞系(Dual Jurkat；英杰)进行工程化，从而在表面上稳定表达人TIGIT(Jurkat-TIGIT)。如图21所示，TIGIT在Jurkat-TIGIT细胞表面上的表达，用商业化的PE标记的抗TIGIT抗体(eBiosciences公司的克隆MSBA43)，通过流式细胞术进行确认。因此，Jurkat-TIGIT被用作组成型表达膜结合的TIGIT的靶细胞，因此可用于在补体存在下经受抗体结合的CDC活性。
在HuTIG1-IgG1.AA、HuTIG3-IgG1.AA或兔抗胸腺细胞球蛋白(ATG)(Fresenius生物技术有限公司)以渐增至50μg/毫升的浓度存在下，用Jurkat-TIGIT细胞和人补体进行CDC测定。由于ATG与Jurkat细胞的反应性，因此ATG被用作阳性对照，并且记录其与Jurkat细胞的补体依赖性的细胞毒性活性(参见例如，Eiermann等，J Hematother Stem CellRes.2001年6月；10(3):385-90.；Ayuk等，抗肿瘤研究，29:1355-1360(2009))。将在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基(英杰)中的50,000个Jurkat-TIGIT细胞，接种至在96孔圆底板(Nunc)中。加入处理抗体，其中从最高浓度50μg/ml开始，然后进行一系列的三倍稀释，并使其与细胞在37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时。孵育1小时后，加入人补体，并在37℃、5％CO2培养箱中再培养3小时。在该3小时孵育结束后，加入5μg/ml碘化丙啶(赛默飞世尔公司)，通过流式细胞仪(BD FACSCalibur)分析样品，以确定碘化丙锭阳性的百分比，作为细胞死亡的读数结果。
为了确定标准化变化，通过流式细胞术测量存活率百分比，并评估碘化丙啶阳性细胞的百分比作为死细胞。未处理的样品的值被归一化为100％。用存在抗体时样品的存活率百分比除以归一化的未处理时的值，从而得到存活率的倍数变化。如图22所示，高达50μg/ml的HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA均未诱导CDC活性。这些数据表明，HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA与TIGIT的结合，均不导致补体所介导的T细胞发生细胞死亡。
实施例13：HuurG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA的Jurkat双报告细胞系的表征
使用Jurkat-TIGIT报告细胞系，分析阻断人TIGIT受体的功能性结果，该细胞系在染色体中携带分泌型荧光素酶报告基因，该报告基因由与5个拷贝的NF-κB共转录反应元件和3个拷贝的c-Rel结合位点融合的IFNβ最小启动子进行驱动。Jurkat-TIGIT细胞还在ISG54最小启动子与五个IFN刺激型应答元件的控制下，表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。
该测定包括代表T效应子细胞(Jurkat-TIGIT)和抗原呈递细胞的两种细胞系。T效应子细胞稳定表达在T细胞受体(TCR)下游被激活的荧光素酶报告基因。抗原呈递细胞(人工抗原呈递细胞或“aAPC”)稳定地表达T细胞激活蛋白，所述激活蛋白以抗原非依赖性方式结合并激活T效应子细胞，例如Jurkat-TIGIT(Promega)。aAPC细胞被进一步改造，以表达CD155。当T效应子细胞与其相应的aAPC细胞共培养时，TIGIT与CD155的相互作用抑制T效应子细胞的活化并降低荧光素酶的表达。添加抗TIGIT的阻断抗体，可释放允许荧光素酶活性表达的抑制信号。
在该测定中，将表达人CD155和T细胞活化蛋白的16,000个aAPC(TCR活化蛋白CD155 CHO-K1)(Promega)，接种到96孔的半区域板上，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。第二天，在HuTIG1-IgG1.AA或HuTIG3-IgG1AA不存在或存在(起始浓度为10μg/ml并连续两倍稀释)的情况下，将50,000个人Jurkat-TIGIT细胞与TCR活化剂CD155 CHO-K1细胞共培养24小时。收集上清液并使用QUANTI-Luc(英杰)和多模板读数器(珀金埃尔默EnSpire)，测量分泌的荧光素酶，作为相对的光单位。为了确定相对光单位倍数变化，将在不同浓度的抗TIGIT抗体存在下与TCR活化剂CD155 CHO-K1共培养的Jurkat-TIGIT的相对光单位，除以没有抗体时的相对光单位。所以，例如2倍增加(例如在抗-TIGIT存在下所检测的)因而意味着在实验中测得的相对光单位是仅在刺激的对照条件中测得的TCR-活化剂细胞中数值的两倍。
如图23所示，HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA均能够增加内在T细胞活化信号，这是通过在每种阻断型TIGIT抗体以浓度为0.6μg/ml至10μg/ml存在下，所诱导的相对光单位的增加来确定的，即增加了约1.5至2.5倍。这些数据表明，抗TIGIT抗体通过阻断TIGIT的功能和增加内在T细胞活性而具有拮抗活性。
实施例14：与TIGIT的竞争性结合
流式细胞术被用于鉴定与TIG1竞争结合人TIGIT的抗体。根据制造商的方案，使用Pierce FITC抗体标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，用荧光染料FITC标记TIG1。使用NS0-hTIGIT细胞，通过流式细胞术检查所得的FITC标记的TIG1与人TIGIT的结合。将10万个NS0-hTIGIT细胞与不同浓度的FITC标记的TIG1(初始浓度为10μg/ml并且连续两倍稀释)，在200μl FACS缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白和0.05％叠氮化钠的PBS)中，在4℃下一起孵育30分钟。用2ml FACS缓冲液洗涤后，将NS0-hTIGIT细胞悬浮于0.2ml FACS缓冲液中，并使用FACScan流式细胞仪(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)进行流式细胞术分析，并获得每种抗体浓度的平均通道荧光(MCF)。对于FITC标记的TIG1，测定达到90％最大荧光水平时的亚饱和浓度。
在存在(或不存在)200倍高浓度的测试抗体的情况下，将亚饱和浓度的FITC标记的TIG1与10万个NS0-hTIGIT细胞在200μlFACS缓冲液中，于4℃孵育30分钟。例如，当0.1μg/ml的FITC标记的TIG1用于结合NS0-hTIGIT细胞时，将20μg/ml的测试抗体加入细胞悬浮液中。作为背景对照，在没有任何抗体的情况下孵育10万个NS0-hTIGIT细胞。用2ml FACS缓冲液洗涤后，将NS0-hTIGIT细胞悬浮于0.2ml FACS缓冲液中，并进行流式细胞术分析。
将与FITC标记的TIG1孵育的NS0-hTIGIT细胞的MCF[MCF A]，被归一化为100％，并且将没有与抗体孵育的NS0-hTIGIT细胞的MCF[MCF B]归一化为0％。用FITC标记的TIG1和测试抗体孵育的NS0-hTIGIT细胞的MCF[MCF C]通过下式归一化处理：100×([MCF C]-[MCFB])/([MCF A]-[MCF B])。当用FITC标记的TIG1和测试抗体孵育的NS0-hTIGIT细胞的归一化MCF小于20％时，则认为测试抗体与TIG1竞争结合人TIGIT。
相同的测定可用于鉴定与TIG2或TIG3竞争的抗体。
实施例15：亲和力测定
单克隆抗体的抗原结合亲和力，可通过无标记的光学表面等离子体共振(SPR)生物传感器，例如Biacore T100(GE医疗生命科学公司，马尔伯勒，马萨诸塞州)，ProteOnXPR36(伯乐公司，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)，Octet RED384(ForteBio，门罗帕克，加利福尼亚州)和IBIS MX96(Wasatch Microfluidics，盐湖城，犹他州)进行测定(Yang等，分析生物化学，508:78-96，2016)。如Yang等人所述，使用Biacore T100测定TIG1、TIG2和TIG3各自的抗原结合亲和力(同上)。使用标准偶联方案，将蛋白A/G(赛默飞世尔科技公司)固定在CM5传感器芯片(GE医疗生命科学公司)中的流动池上。在CM5传感器芯片上，通过蛋白A/G捕获测试抗体(TIG1、TIG2或TIG3)。各种浓度的重组人TIGIT蛋白，例如His标记的重组人TIGIT(Creative BioMart，雪莉，纽约)，被用于流式分析，以结合传感器芯片上的测试抗体。使用BIAevaluation软件(GE医疗生命科学公司)，获得测试抗体和人TIGIT之间的相互作用的结合速率(ka)和解离速率(kd)。对于TIG1、TIG2和TIG3中的每一个，通过将结合速率(ka)除以解离速率(kd)，计算得出结合常数(Ka)。通过将解离速率(kd)除以结合速率(ka)，计算出解离常数(Kd)。
针对HuTIG1-IgG1AA的生物传感器研究，在BioRad ProteOn XPR36系统上，在10mMHEPES、150mM NaCl、pH7.4、0.005％吐温-20和0.2mg/ml BSA中，于25℃下进行。将HuTIG1-IgG1.AA稀释至3.7、1.2和0.4nM，并在涂有约10,000RU的GE抗人IgG抗体的GLM传感器芯片上捕获5分钟。His标记的可溶性重组人TIGIT(Cat#TIT-H52H3；Acro生物系统公司，纽瓦克，特拉华州)被用于进行测定，最高浓度为100nM并连续3倍稀释至最低浓度为1.2nM。来自三个不同密度抗体表面的数据，使用局部Rmax进行全局拟合至1：1相互作用模型。获得的结合速率(ka)和解离速率(kd)分别为(4.42±0.02)×105M-1s-1和(4.09±0.02)×10-4s-1。计算的解离常数(Kd)为925±7pM。
实施例16：表位定位
为了定位TIGIT分子中被TIG1、TIG2和TIG3中每个抗体所识别的表位，使用重叠-延伸PCR方法，通过定点诱变在TIGIT的胞外区(SEQ ID NO：3)中产生单个氨基酸取代的突变体(Higuchi，R.，1989,在“PCR技术:DNA扩增的原理和应用”，Erlich，H.A.，编辑，Stockton出版社，纽约，纽约州，61-70页)。在TIGIT胞外区中的以下六个突变体用于测定：Q35A(SEQ ID NO:50)、N37A(SEQ ID NO:51)、Q39A(SEQ ID NO:52)、N49A(SEQ ID NO:53)、D51A(SEQ ID NO:54)和F86A(SEQ ID NO:55)。每个突变体名称左边的字母、中间的数字，以及名称右边的字母分别表示野生型TIGIT中的氨基酸残基、通过从TIGIT胞外区(SEQ IDNO：3)的N末端甲硫氨酸残基开始的位置计数，以及突变体中的氨基酸。氨基酸残基是单字符代码。这六种突变体中的每一种都携带位于TIGIT-CD155复合物的界面附近的氨基酸取代(Stengel，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，109：5399-5404，2012)。
哺乳动物表达载体pFCm179具有与pFCm404(图1)相同的结构，除了(i)嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因被大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因取代，和(ii)人TIGIT胞外区被人IL-15取代。将编码人TIGIT胞外区的六种丙氨酸取代突变体的DNA片段，分别引入pFCm179中以替换IL-15编码区。得到的表达载体pFCm179-Q35A、pFCm179-N37A、pFCm179-Q39A、pFCm179-N49A、pFCm179-D51A和pFCm179-F86A，分别在TIGIT编码区携带Q35A、N37A、Q39A、N49A、D51A和F86A突变，并且除了对每种突变体特异的单个氨基酸取代之外，表达与pFCm404中编码的相同的TIGIT-Fc融合蛋白序列。
野生型和突变体TIGIT-Fc融合蛋白，在人胚肾细胞系HEK293中瞬时表达。HEK293细胞在含有10％FCS的DMEM培养基中，于37℃在7.5％CO2培养箱中生长。用聚乙烯亚胺法，将野生型和突变型TIGIT-Fc融合蛋白(pFCm404、pFCm179-Q35A、pFCm179-N37A、pFCm179-Q39A、pFCm179-N49A、pFCm179-D51A和pFCm179-F86A)的表达载体，分别转染到HEK293细胞中(Durocher等，Nucl.Acids Res.30：e9，2002)。通过ELISA测定培养上清液中TIGIT-Fc融合蛋白的产量水平。简而言之，ELISA板用100μl/孔的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体(西格玛奥德里奇公司)包被(1/2,000稀释于PBS中)，4℃过夜，用洗涤缓冲液洗涤，并用200μl/孔的ELISA缓冲液在室温下封闭20分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，将在ELISA缓冲液中适当稀释的瞬转HEK293细胞的培养上清液(100μl/孔)加到ELISA板。纯化的hTIGIT-Fc被作为标准品使用。在室温下孵育ELISA板30分钟并用洗涤缓冲液洗涤后，用100μl/孔的HRP偶联的山羊抗人IgG多克隆抗体(Southern生物科技公司)(在ELISA缓冲液中以1/2000稀释)，检测结合的Fc融合蛋白。在室温下孵育平板30分钟并用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入100μl/孔的ABTS底物(西格玛-奥德里奇公司)开始显色，并用100μl/孔的2％草酸终止。在405nm处读取吸光度。
通过ELISA检测小鼠TIG1、TIG2和TIG3抗体中每种抗体与TIGIT突变体的结合。用100μl/孔的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆抗体(Sigma-Aldrich)包被ELISA板(1/2,000稀释在PBS中)，在4℃下过夜，用洗涤缓冲液洗涤，并用200μl/孔ELISA缓冲液在室温下封闭20分钟。用洗涤缓冲液洗涤后，将在ELISA缓冲液(100μl/孔)中的带有野生型TIGIT或六种TIGIT突变体之一的0.5μg/ml瞬时表达的TIGIT-Fc融合蛋白，一式两份加到ELISA板中，在室温下孵育30分钟。作为阴性对照，使用未转染的HEK293细胞的培养上清液。用洗涤缓冲液洗涤后，以100μl/孔加入ELISA缓冲液(100μl/孔)中的200ng/ml测试抗体(TIG1、TIG2或TIG3)。在室温下孵育ELISA板30分钟并用洗涤缓冲液洗涤后，用100μl/孔的HRP偶联的山羊抗小鼠κ链多克隆抗体(Bethyl实验室,蒙哥马利,得克萨斯州)(在ELISA中以1/2,000稀释)，检测结合的抗体。在室温下孵育平板0.5小时并用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入100μl/孔的ABTS底物(西格玛-奥德里奇公司)开始显色，并用100μl/孔的2％草酸终止。在405nm处读取吸光度。
表1 TIG1、TIG2和TIG3与TIGIT突变体的结合
Figure BDA0001788655270000471
对于TIG1、TIG2和TIG3，其每一种与每种TIGIT突变体的相应结合在下式中计算。将与野生型TIGIT-Fc融合蛋白的平均吸光度[Abs A]归一化为100％，将与未转染的HEK293细胞的培养上清液的平均吸光度[Abs B]归一化至0％。与突变TIGIT-Fc融合蛋白的平均吸光度[Abs C]用下式归一化：100×([Abs C]-[Abs B])/([Abs A]-[Abs B])。结果总结于表1中。当35、37、49或51位的氨基酸残基被丙氨酸取代时，TIG1的相对结合小于5％，这表明这四个位置的氨基酸残基对于TIG1与TIGIT的结合是至关重要的。在该测定中使用的TIGIT突变体均未消除TIG2和TIG3与TIGIT的结合。
实施例17：一旦加入HuTIG1-IgG1.AA、抗PD-L1抗体以及HuTIG1-IgG1.AA与抗PD- L1抗体的组合后，IFNγ的分泌增强。
首先，通过在密度梯度介质(Lymphoprep；STEMCELL；07801)上分层血液，并离心后从分离相之间收集PBMC，从而从白细胞(buffy coat)中分离人PBMC。在下一步中，根据制造商的方案，通过CD14阳性筛选(EasySep公司的人CD14阳性筛选试剂盒；STEMCELL；Cat#18058)，从PBMC中分离人单核细胞，并在补充有5％FBS和0.1μg/ml GM-CSF(R&D；Cat#215-GM-050/CF)和0.1μg/ml IL-4(R&D；Cat#204-IL-050/CF)的RPMI培养基中培养6天。收集分化的单核细胞衍生的树突细胞(moDC)，并通过流式细胞术检测CD155、CD112和PD-L1的表达(图24)。
通过负耗竭(RosetteSep公司的人CD4T细胞富集混合物；STEMCELL；#15062)，从白细胞层分离来自4个不同供体的人CD4+细胞，并使用流式细胞术测定纯度。
将moDC和CD4+细胞以1：4比例(25,000个moDC；100,000个CD4+细胞)混合，并在含有HuTIG1-IgG1.AA(5μg/ml或15μg/ml)或抗PD-L1抗体(10μg/ml；克隆243.55.S1；SEQ IDNO：56和57)或同时存在HuTIG1-IgG1.AA(15μg/ml)和抗PD-L1抗体(10μg/ml)的情况下，在无血清培养基(X-Vivo-20；LONZA；Cat#04-448Q)中培养4天，之后使用细胞计数珠阵列(CBA；人IFNγFlex集；BD；Cat#560111)定量IFNγ。人IgG1Fc(25μg/ml；BioXcell；货号BE0096)被用作对照。
如图25所示，与适当的同种型对照抗体相比，HuTIG1-IgG1.AA和抗PD-L1抗体阻断，可各自独立地增加了IFNγ的产量。与两者各自单一疗法相比，HuTIG1-IgG1.AA与抗PD-L1抗体的组合显着且协同地增加IFNγ的产量。
实施例18：HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA检测人淋巴和骨髓细胞上表达的 TIGIT
从10个供体分离的总人PBMC，用直接偶联的抗体进行共染色，以描绘出T细胞、B细胞、NK细胞和骨髓谱系亚群。使用活/死可固定的Aqua死细胞染色试剂盒，来排除死细胞。使用与Alexa647染料偶联的HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA抗体，测定TIGIT的表达。使用市售的抗CD96抗体(克隆NK92.39)测定CD96的表达。在图26A中，加号(+)表示高于背景的表达，(+++)表示观察到的最高表达。加/减(+/-)符号表示只有指定群体中的一部分细胞以高于背景的水平表达TIGIT或CD96，而减号(-)表示缺乏高于背景水平的表达。在所有情况下，使用改良的荧光减一(FMO)方法测定背景，其中除了靶抗体(即HuTIG1-IgG1.AA、HuTIG3-IgG1.AA、抗CD96抗体)之外，添加染色组中所有使用的荧光染料。然而，用相同偶联的IgG特异性同种型对照抗体，来替换靶抗体。图26B显示了在各种表达水平的PBMC中，抗TIGIT抗体染色的代表性直方图，其用于表示图26A中CD96的表达水平。浅直方图表示改良的FMO。深直方图代表HuTIG1-IgG1.AA或HuTIG3-IgG1.AA染色。
来自黑素瘤、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和肾透明细胞癌的分离的肿瘤细胞，均购自商业来源，并用描绘T细胞和抗原呈递细胞亚群的直接偶联的抗体进行染色。使用泛同种型抗CD45抗体(克隆HI30)鉴定白细胞。使用活/死可固定的Aqua死细胞染色试剂盒，排除死细胞。使用与Alexa647染料偶联的HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA抗体测定TIGIT的表达。在所有情况下，使用改良的荧光减一(FMO)方法测定背景，其中除了靶抗体(即HuTIG1-IgG1.AA)之外，添加染色组中所有使用的荧光染料。然而，用相同偶联的IgG特异性同种型对照抗体替换靶抗体。图32B显示了在各种表达水平下(如图32A所示)，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的抗TIGIT染色的代表性直方图。浅直方图表示改良的FMO。深直方图代表HuTIG1-IgG1.AA染色。
实施例19：通过流式细胞术对抗人TIGIT抗体HuTIG1-IgG1.AA的表位进行定位
将人TIGIT cDNA克隆到pcDNA 3.1(+)中，所述pcDNA 3.1(+)具有9个残基的血凝素(HA)肽标签，并且在21个残基的天然信号肽之后和成熟TIGIT蛋白的N末端之前插入10个残基肽接头(SEQ ID NO：58)。将人TIGIT的胞外区中感兴趣的氨基酸残基(T34、Q35、N37、E39、L44、I47、N49、D51、L52、H55、F86、I88、H90、Y92和T96)突变为丙氨酸，一次突变一个氨基酸。纯化质粒并根据制造商的建议，使用Fugene 6(普洛麦格公司)转染试剂，瞬时转染到CHO-K1细胞中。通过抗HA抗体检测，确认带HA标记的人TIGIT突变体的表达。
为了抗hTIGIT抗体结合表位的流式细胞术分析，将具有或不具有单个氨基酸突变的HA标记的人TIGIT蛋白瞬时转染到CHO-K1细胞中。24小时后，将转染的细胞悬浮于HBSS缓冲液(赛默飞世尔科技公司，货号14175095)中，并与50μL体积的不同浓度的HuTIG1-IgG1.AA抗体一起孵育。在4℃温育1小时后，洗涤细胞并用50μL Alexa488偶联的抗人IgG(H+L)二抗(赛默飞世尔科技公司，货号A-11013)进行第二次孵育，以检测被抗体结合的细胞。将细胞与抗HA抗体(西格玛公司，货号H7411)一起孵育作为阳性对照，并将未转染的CHO-K1细胞用作阴性对照。在Attune NxT细胞计数器(赛默飞世尔科技公司)上分析细胞，并使用FlowJo软件处理数据。对于每种突变体，将结合饱和抗体MFI(平均荧光强度)归一化为100％POC(对照的百分比)，并且将没有结合一抗的对照MFI归一化为0％POC。然后使用GraphPad Prism 7曲线拟合法，将数据拟合到四参数非线性S形曲线，其中使用以下公式：Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10((LogEC50-X)*坡面(HillSlope)))。
在该测定中，HuTIG1-IgG1.AA与野生型人TIGIT结合的EC50＝1.28nM。十五个TIGIT单点丙氨酸突变体中的五个突变体,与HuTIG1-IgG1.AA的结合亲和力降低超过10倍。人TIGIT(SEQ ID NO：3)具有N49A、D51A、H90A、N37A或Q35A突变后，与HuTIG1-IgG1.AA的结合效力降低，分别为EC50＝17.7到176nM(图27)。所有这些残基共同定位于TIGIT IgV胞外结构域的前β-折叠结构上的一个离散区域(图28)。
实施例20：施用HuTIG1-IgG1.AA的非人灵长类动物全血T细胞亚群的离体免疫表 型分析
由Charles River Laboratories(里诺，内达华州)进行药代动力学研究。本实施例的目的是检测来自用单剂量10mg/kg抗TIGIT(HuTIG1-IgG1.AA)抗体治疗的食蟹猴的离体全血样品，以便间接评估TIGIT的受体结合率。
向三只用于实验的幼小的雌性食蟹猴(#67、#68和#69)，施用单次静脉内剂量10mg/kg的HuTIG1-IgG1.AA抗体。在最后一次采样时间点的24小时内接收肝素钠中的所有全血样品，其对应于给药前、给药后第1、2、7、14、21和28天时间点。为了全血的流式细胞术研究，来自BioLegend公司的荧光标记的抗人TIGIT抗体(克隆MBSA43)，被用于测定食蟹猴血液淋巴细胞亚群上TIGIT的表达水平，因为已显示它与非人灵长类动物有交叉反应(PLoSPathog.2016年1月；12(1)；BioLegend)。通过FACSCalibur获得活细胞并通过FlowJo软件分析。
当染色给药前全血样品时，抗TIGIT抗体(MBSA43)能够结合CD4+和CD8+T细胞亚群。给药后，抗TIGIT(MBSA43)无法检测这些T细胞亚群的TIGIT表达，直到第14天或第21天才可检测到，这取决于检测的不同猴子；并且，在第21天或第28天根据不同的动物会回到给药前的检测水平(图29B和30B)。无法检测TIGIT表达不是由于CD4+或CD8+T细胞数量的显着变化(分别参见图29A和30A)，这表明表面的TIGIT被处理抗体(HuTIG1-IgG1.AA)所占据，而不是由于T细胞亚群耗尽。
这些数据支持抗TIGIT抗体HuTIG1-IgG1.AA与食蟹猴交叉反应，并且使用来自BioLegend的抗人TIGIT(克隆MBSA43)提供了对TIGIT受体结合率的评估。
实施例21：在K562靶细胞上HuTIG1-IgG1.AA和HuTIG3-IgG1.AA引起增强的NK细胞 介导的细胞毒性
使用纯化的NK细胞代替PBMC，重复实施例10中描述的NK细胞介导的细胞毒性测定。为了获得足够的和合适的纯化NK细胞用于这些实验，筛选具有高NK细胞数量、足够的TIGIT表面表达和足够的CD226表达的供体PBMC是很重要的。获得外周血LeukoPak(由100亿个细胞或更多细胞组成)，并使用Miltenyi autoMACS专业分离器，根据制造商的说明书(Miltenyi Biotec，目录号130-092-657)进行NK细胞分离。将纯化的NK细胞重悬于6孔板中的含有白细胞介素-2(IL-2)[200单位/ml]的培养基中。将6孔板置于37℃、5％CO2培养箱中24小时，然后用从孔中收获的细胞，进行天然细胞毒性研究。
在用和不用抗TIGIT抗体(TIG1)情况下，测定由纯化的NK细胞介导的K562细胞的裂解。将NK细胞在白介素-2(IL-2)[200单位/ml](派普泰克公司)存在下，在RPMI1640培养基(英杰公司)中在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，将K562细胞进行CFSE标记并与NK细胞以1:20的比例(靶细胞：NK；一个K562细胞对应20个NK细胞)共培养，其在10μg/ml利妥昔单抗或人源化抗TIGIT抗体(HuTIG1-IgG1.AA或HuTIG3-IgG1.AA)存在下，在37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。利妥昔单抗用作阴性对照，因为K562细胞不表达CD20。孵育期后，收获细胞并用5nM Sytox Red(赛默飞世尔)染色，以便通过(CFSE+Sytox Red+)区分死的靶细胞。通过流式细胞术(FACSCalibur；FlowJo分析)测定被NK细胞裂解的K562靶细胞的百分比。
如图31所示，当使用纯化的NK细胞时，添加抗TIGIT抗体增强了NK细胞介导的对K562细胞的天然细胞毒性，这证明抗TIGIT抗体(HuTIG1-IgG1.AA或HuTIG3-IgG1.AA)具有提高人效应子细胞亚群对靶细胞的杀伤水平的能力(相对于“无抗体”或利妥昔单抗归一化的百分比，分别增加了28％或19％)。
序列
SEQ ID NO:1：成熟的人TIGIT的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
SEQ ID NO:2：人TIGIT的胞外区上游的信号肽的氨基酸序列：
MGWSWIFFFLLSGTASVLS
SEQ ID NO:3：人TIGIT(hTIGIT)胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:4：hTIGIT的下游紧接着的多肽接头的氨基酸序列：
TGGG
SEQ ID NO:5：人γ1Fc区的氨基酸序列：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:6：人CD155胞外区的氨基酸序列：
DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGMSRNA
SEQ ID NO:7：融合至人γ1Fc区链的人CD155的胞外区(hCD155-Fc)的氨基酸序列：DVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGMSRNATGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:8：FLAG肽(FLAG)的氨基酸序列：DYKDDDDK
SEQ ID NO:9：人CD55的糖基磷脂酰肌醇连接信号(GPI)的氨基酸序列：
PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT
SEQ ID NO:10：TIG1 VH的氨基酸序列：
DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPEKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARMRLDYYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:11：TIG1 VH CDR1的氨基酸序列：NFGMH
SEQ ID NO:12：TIG1 VH CDR2的氨基酸序列：FISSGSSSIYYADTVKG
SEQ ID NO:13：TIG1 VH CDR3的氨基酸序列：MRLDYYAMDY
SEQ ID NO:14：TIG1 VL的氨基酸序列：
DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:15：TIG1 VL CDR1的氨基酸序列：RASKSISKYLA
SEQ ID NO:16：TIG1 VL CDR2的氨基酸序列：SGSTLQS
SEQ ID NO:17：TIG1 VL CDR3的氨基酸序列：QQHNEYPWT
SEQ ID NO:18：TIG2 VH的氨基酸序列：
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKNLEWIGGINPNNGGTSYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMELRSLTSDDSAVYYCARPGWYNYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:19：TIG2 VH CDR1的氨基酸序列：EYTMH
SEQ ID NO:20：TIG2 VH CDR2的氨基酸序列：GINPNNGGTSYNQKFKG
SEQ ID NO:21：TIG2 VH CDR3的氨基酸序列：PGWYNYAMDY
SEQ ID NO:22：TIG2 VL的氨基酸序列：
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQGVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYHCQQHYITPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:23：TIG2 VL CDR1的氨基酸序列：KASQGVSTAVA
SEQ ID NO:24：TIG2 VL CDR2的氨基酸序列：SASYRYT
SEQ ID NO:25：TIG2 VL CDR3的氨基酸序列：QQHYITPWT
SEQ ID NO:26：TIG3 VH的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSDYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCARQILLRYYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:27：TIG3 VH CDR1的氨基酸序列：DYDMS
SEQ ID NO:28：TIG3 VH CDR2的氨基酸序列：YISDGGYNTYYPDTVKG
SEQ ID NO:29：TIG3 VH CDR3的氨基酸序列：QILLRYYFDY
SEQ ID NO:30：TIG3 VL的氨基酸序列：
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMTCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:31：TIG3 VL CDR1的氨基酸序列：KSSQSLLYSSNQKNYLA
SEQ ID NO:32：TIG3 VL CDR2的氨基酸序列：WASTRES
SEQ ID NO:33：TIG3 VL CDR3的氨基酸序列：QQYHSYPWT
SEQ ID NO:34：设计的人源化TIG1 VH(HuTIG1 VH)的氨基酸序列：
MDSRLNLVFLVLILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:35：成熟HuTIG1 VH的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:36：设计的人源化TIG1 VL(HuTIG1 VL)的氨基酸序列：
MRFQVQVLGLLLLWISGAQCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:37：成熟HuTIG1 VL的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:38：pHuTIG1.AA中合成的HuTIG1 VH基因的核苷酸序列：
ACTAGTACCACCATGGACTCCAGGCTCAATCTGGTTTTCCTTGTCCTTATTCTGAAAGGCGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTTTGGAATGCACTGGGTTCGACAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATTCATTAGTAGTGGCAGTAGTTCCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCAAGAATGAGACTGGATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGTATGGCCTCTAAGCTT
SEQ ID NO:39：pHuTIG1.AA中合成的HuTIG1 VL基因的核苷酸序列：
GCTAGCACCACCATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATCTCAGGAGCCCAGTGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTCTTTCTGCATCTGTTGGAGATAGAGTCACTATTACTTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATCTGGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGGAAAGCTCCTAAGCTGCTTATCTACTCTGGGTCCACTTTGCAATCTGGAGTTCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACCTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCCTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAAGTCGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAAGAATTC
SEQ ID NO:40：pHuTIG1.AA中编码的HuTIG1-IgG1.AA的成熟γ重链的氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:41：pHuTIG1.AA中编码的HuTIG1-IgG1.AA的成熟κ轻链的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:42：设计的人源化TIG3 VH(HuTIG3 VH)的氨基酸序列：
MNFGLRLIFLVLTLKGVNCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:43：成熟HuTIG3 VH的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:44：设计的人源化TIG3 VL(HuTIG3 VL)的氨基酸序列：
MDSQAQVLMLLLLWVSGTCGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:45：成熟HuTIG3 VL的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:46：pHuTIG3.AA中合成的HuTIG3 VH基因的核苷酸序列：
ACTAGTACCACCATGAACTTTGGGCTCAGATTGATTTTCCTTGTCCTTACTCTGAAAGGCGTGAACTGTGAAGTCCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTTGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTGACTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGGCTCCTGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTGATGGCGGTTATAACACCTACTATCCAGACACTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAAATGAACAGTCTGAGGGCTGAGGACACAGCCGTCTATTACTGTGCAAGACAAATTCTGCTGCGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTGTCACAGTCTCCTCAGGTGAGTCCTTAAAACAAGCTT
SEQ ID NO:47：pHuTIG3.AA中合成的HuTIG3 VL基因的核苷酸序列：
GCTAGCACCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGCTGCTGCTGCTCTGGGTTTCTGGAACCTGTGGGGACATTCAGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCCTCAGTTGGAGACAGGGTTACTATCACCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTTCTGTATAGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAGGCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTAGTCGCTTCTCAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGACTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATCATAGCTATCCCTGGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAACGTAAGTAGAATCCAAAGAATTC
SEQ ID NO:48：pHuTIG3.AA中编码的HuTIG3-IgG1.AA的成熟γ重链的氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:49：pHuTIG3.AA中编码的HuTIG3-IgG1.AA的成熟κ轻链的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:50：具有Q35A突变的人TIGIT胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTAVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:51：具有N37A突变的人TIGIT胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVAWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:52：具有Q39A突变的人TIGIT胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWAQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:53：具有N49A突变的人TIGIT胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICAADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:54：具有D51A突变的人TIGIT胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNAALGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:55：具有F86A突变的人TIGIT胞外区的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYACIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTG
SEQ ID NO:56：成熟的抗人PD-L1抗体重链的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:57：成熟分抗人PD-L1抗体轻链的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLFTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:58：融合至成熟人TIGIT的信号肽、HA标签和连接肽氨基酸序列：
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGYPYDVPDYAGGGGSGGGGSMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG
SEQ ID NO:59：融合至人免疫球蛋白γ1链的Fc区的人TIGIT的胞外区(hTIGIT-Fc)的氨基酸序列：
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPTGTGGGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:60：HuTIG1-IgG1.Q的成熟γ重链的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:61：HuTIG1-IgG4.P的成熟γ重链的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAFISSGSSSIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMRLDYYAMDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:62：HuTIG3-IgG1.Q的成熟γ重链的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:63：HuTIG3-IgG4.P的成熟γ重链的氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISDGGYNTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQILLRYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:64：HuTIG1-IgG1.Q和HuTIG1-IgG4.P的成熟κ轻链的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:65：HuTIG3-IgG1.Q和HuTIG3-IgG4.P的成熟κ轻链的氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYHSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
序列表
<110> JN生物科学有限责任公司
安伯诺治疗有限责任公司
曹仲欣
鹤下直也
欧马·杜拉梅德
<120> 针对TIGIT的抗体
<130> 50658-504001WO
<140> 未指定
<141> 2017-03-03
<150> US 62/304,045
<151> 2016-03-04
<150> US 62/413,025
<151> 2016-10-26
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr
        115                 120                 125
Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg
    130                 135                 140
Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg
145                 150                 155                 160
Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu
            180                 185                 190
Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu
        195                 200                 205
Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly
    210                 215                 220
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Phe Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Leu Ser
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Thr Gly Gly Gly
1
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
        35                  40                  45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
    50                  55                  60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
                85                  90                  95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
            100                 105                 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
        115                 120                 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
                165                 170                 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
            180                 185                 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
        195                 200                 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
    210                 215                 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225                 230
<210> 6
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
            20                  25                  30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
        35                  40                  45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
    50                  55                  60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
                85                  90                  95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
            100                 105                 110
Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln
        115                 120                 125
Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly
    130                 135                 140
Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro
145                 150                 155                 160
Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr
                165                 170                 175
Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val
            180                 185                 190
Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr
        195                 200                 205
Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr
    210                 215                 220
Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp
225                 230                 235                 240
Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met
                245                 250                 255
Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile
            260                 265                 270
Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr
        275                 280                 285
Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu
    290                 295                 300
Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala
305                 310                 315
<210> 7
<211> 553
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr
            20                  25                  30
His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met
        35                  40                  45
Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg
    50                  55                  60
Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys
                85                  90                  95
Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu
            100                 105                 110
Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln
        115                 120                 125
Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly
    130                 135                 140
Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro
145                 150                 155                 160
Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr
                165                 170                 175
Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val
            180                 185                 190
Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr
        195                 200                 205
Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr
    210                 215                 220
Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp
225                 230                 235                 240
Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met
                245                 250                 255
Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile
            260                 265                 270
Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr
        275                 280                 285
Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu
    290                 295                 300
Gly Pro Pro Ser Glu His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Thr Gly Gly
305                 310                 315                 320
Gly Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
                325                 330                 335
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
            340                 345                 350
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
        355                 360                 365
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
    370                 375                 380
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
385                 390                 395                 400
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
                405                 410                 415
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
            420                 425                 430
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
        435                 440                 445
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
    450                 455                 460
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
465                 470                 475                 480
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
                485                 490                 495
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
            500                 505                 510
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
        515                 520                 525
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
    530                 535                 540
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545                 550
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr
            20                  25                  30
Met Gly Leu Leu Thr
        35
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Asn Phe Gly Met His
1               5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1               5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
            20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Gly Trp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Glu Tyr Thr Met His
1               5
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Pro Gly Trp Tyr Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Asn Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr His Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Lys Ala Ser Gln Gly Val Ser Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1               5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Trp Thr
1               5
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Asp Tyr Asp Met Ser
1               5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr
1               5
<210> 34
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Asn Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
    130                 135
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 36
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Met Arg Phe Gln Val Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser
        35                  40                  45
Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
    50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn
            100                 105                 110
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 38
<211> 448
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
actagtacca ccatggactc caggctcaat ctggttttcc ttgtccttat tctgaaaggc 60
gtccagtgtg aagtgcagct ggtggagtct gggggaggcc tggtgcagcc tggagggtcc 120
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc actttcagta actttggaat gcactgggtt 180
cgacaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtcgcattca ttagtagtgg cagtagttcc 240
atctactatg cagacacagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300
agcctgtacc tgcaaatgaa cagtctgagg gctgaggaca ctgccgtgta ttactgtgca 360
agaatgagac tggattacta tgctatggac tactggggtc aaggaaccat ggtcaccgtc 420
tcctcaggta agtatggcct ctaagctt 448
<210> 39
<211> 416
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
gctagcacca ccatgaggtt ccaggttcag gttctggggc tccttctgct ctggatctca 60
ggagcccagt gtgatatcca gatgacccag tctccatctt ctctttctgc atctgttgga 120
gatagagtca ctattacttg cagggcaagt aagagcatta gcaaatatct ggcctggtat 180
caacagaaac ctgggaaagc tcctaagctg cttatctact ctgggtccac tttgcaatct 240
ggagttccat caagattcag tggcagtgga tctggtacag atttcactct caccatcagt 300
agcctgcagc ctgaagattt tgcaacctat tactgtcaac agcataatga atacccctgg 360
accttcggcg gaggcaccaa agtcgaaatc aaacgtaagt agaatccaaa gaattc 416
<210> 40
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210> 41
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 42
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Asn Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
        35                  40                  45
Ser Asp Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
        115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    130                 135
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 44
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
        115                 120                 125
Lys Val Glu Ile Lys
    130
<210> 45
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 46
<211> 448
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
actagtacca ccatgaactt tgggctcaga ttgattttcc ttgtccttac tctgaaaggc 60
gtgaactgtg aagtccagct cgtggagtct gggggaggcc ttgtgcagcc tggagggtcc 120
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc gctttcagtg actatgacat gtcttgggtt 180
cgccaggctc ctggcaaggg gctggagtgg gtcgcataca ttagtgatgg cggttataac 240
acctactatc cagacactgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac 300
tccctgtacc tgcaaatgaa cagtctgagg gctgaggaca cagccgtcta ttactgtgca 360
agacaaattc tgctgcggta ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tgtcacagtc 420
tcctcaggtg agtccttaaa acaagctt 448
<210> 47
<211> 434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
gctagcacca ccatggattc acaggcccag gttcttatgc tgctgctgct ctgggtttct 60
ggaacctgtg gggacattca gatgacacag tctccatcct ccctgtctgc ctcagttgga 120
gacagggtta ctatcacctg caagtccagt cagagtcttc tgtatagtag caatcaaaag 180
aactacttgg cctggtacca gcagaaacca gggaaggctc ctaaactgct gatttactgg 240
gcatccacta gggaatctgg ggtccctagt cgcttctcag gcagtggatc tgggacagat 300
ttcactctca ccatcagcag tctgcagcct gaagacttcg cagtttatta ctgtcagcaa 360
tatcatagct atccctggac cttcggcgga ggcaccaagg tggaaatcaa acgtaagtag 420
aatccaaaga attc 434
<210> 48
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210> 49
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
        115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
            180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Ala Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 51
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Ala Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 52
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Ala Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 53
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Ala Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 54
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Ala Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 55
<211> 122
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Ala Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly
        115                 120
<210> 56
<211> 447
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
        355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Phe Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 58
<211> 263
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1               5                   10                  15
Pro Leu Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly
            20                  25                  30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr
        35                  40                  45
Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys
    50                  55                  60
His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln
65                  70                  75                  80
Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile
                85                  90                  95
Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu
            100                 105                 110
Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile
        115                 120                 125
Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu
    130                 135                 140
Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
145                 150                 155                 160
Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val
                165                 170                 175
Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His
            180                 185                 190
Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp
        195                 200                 205
Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala
    210                 215                 220
Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu
225                 230                 235                 240
Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys
                245                 250                 255
Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly
            260
<210> 59
<211> 358
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
            20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
        35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
    50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
                85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
            100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Thr Gly Thr Gly Gly Gly Glu Pro
        115                 120                 125
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
    130                 135                 140
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145                 150                 155                 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
                165                 170                 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
            180                 185                 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
        195                 200                 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
    210                 215                 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
                245                 250                 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
            260                 265                 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
        275                 280                 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
    290                 295                 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
                325                 330                 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
            340                 345                 350
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        355
<210> 60
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210> 61
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Arg Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 62
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
    210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
                245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val
    290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
            340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
    370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
                405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
            420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
Lys
<210> 63
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gln Ile Leu Leu Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
        115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
                165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
            180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
        195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 64
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 65
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr His Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
        115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
                165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
            180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215                 220

Claims (14)

1.一种抗TIGIT抗体，其特征在于，所述抗TIGIT抗体与TIGIT在其胞外结构域内特异性结合，
并且其中所述抗TIGIT抗体包含：
重链CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID No: 11；
重链CDR2，其氨基酸序列为SEQ ID No: 12；
重链CDR3，其氨基酸序列为SEQ ID No: 13；
轻链CDR1，其氨基酸序列为SEQ ID No: 15；
轻链CDR2，其氨基酸序列为SEQ ID No: 16；和
轻链CDR3，其氨基酸序列为SEQ ID No: 17。
2.一种如权利要求1所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，所述抗TIGIT抗体是单克隆抗体。
3.一种如权利要求1或2所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，所述抗TIGIT抗体是嵌合的、人源化的或饰面的。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，所述抗TIGIT抗体包含氨基酸序列为SEQ ID NO: 35的成熟重链可变区，和氨基酸序列为SEQ ID NO: 37的成熟轻链可变区。
5.如权利要求4所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与氨基酸序列为SEQ ID NO: 40的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与氨基酸序列为SEQ ID NO: 41的轻链恒定区连接。
6.如权利要求4所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与氨基酸序列为SEQ ID NO: 60的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与氨基酸序列为SEQ ID NO: 64的轻链恒定区连接。
7.如权利要求4所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，当C-末端赖氨酸存在或不存在时，所述成熟重链可变区与氨基酸序列为SEQ ID NO: 61的重链恒定区连接，并且所述成熟轻链可变区与氨基酸序列为SEQ ID NO: 64的轻链恒定区连接。
8.如上述任一项权利要求所述的抗TIGIT抗体，其特征在于，所述抗体具有以下一种或多种特性：(a)抑制TIGIT与CD155的结合，(b)在表达CD155的抗原呈递细胞存在时，增加内在T细胞的活化，通过IL-2的产量进行测量，(c)增加抗原特异性T细胞的活化，通过IL-12的产量进行测量，(d)增加自然杀伤细胞的活化，通过IL-2、IL-6、TNFα或IFNγ中的任意一个的产量进行测量，和(e)增加T细胞产生至少一种促炎细胞因子的产量。
9.如权利要求8所述的抗TIGIT抗体，其中抑制TIGIT与CD155的结合的IC50为15-100ng/ml。
10.如权利要求8所述的抗TIGIT抗体，其中与不存在所述抗体相比，存在所述抗体的情况下所述内在T细胞的活化增加了1.5-3倍。
11.如权利要求8所述的抗TIGIT抗体，其中与不存在所述抗体相比，存在所述抗体的情况下所述抗原特异性T细胞的活化增加了1.5-3倍。
12.如权利要求8所述的抗TIGIT抗体，其中与不存在所述抗体相比，存在所述抗体的情况下所述自然杀伤细胞的活化增加了1.5-3倍。
13.如权利要求8所述的抗TIGIT抗体，其中与不存在所述抗体相比，存在所述抗体的情况下T细胞产生至少一种促炎细胞因子的产量增加了1.5-3倍。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含上述任一项权利要求所述的抗体和药学上可接受的载体。
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