CN107074949B - 抗神经酰胺抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了抑制细胞凋亡的针对神经酰胺的单克隆抗体。还公开了所述抗体的人源化和scFv形式。公开了通过施用抗神经酰胺抗体预防或治疗受试者中的细胞凋亡的方法。

Description

抗神经酰胺抗体
在先申请的交叉引用
本申请要求于2014年8月7日提交的美国临时申请第62/034,453号的优先权。
技术领域
本申请主要涉及抑制细胞死亡的抗体。尤其是，本发明涉及用针对神经酰胺的抗体抑制细胞死亡。
背景技术
急性辐射综合征(ARS)(有时称为辐射中毒或辐射病)是在极短时间内(例如，在几分钟内)通过高剂量的穿透辐射(如高能X射线、γ射线和中子)照射大部分身体导致的急性病。这种综合征的主要原因是特定组织中的未成熟实质干细胞的耗竭。患有ARS的人的实例是广岛和长崎原子弹的幸存者，在1986年切尔诺贝利核电站(Chernobyl Nuclear PowerPlant)事件之后首次响应的消防队员，以及无意暴露于灭菌辐照器的一些。通常，虽然在剂量低至0.3戈瑞(Gy)或30拉德(rads)时可以观察到轻微的症状，但是用于诱导ARS的辐射剂量大(即，大于0.7戈瑞(Gy)或70拉德)。
虽然一些综合征可发生在低至6Gy或600拉德时，但是辐射胃肠(GI)综合征会通常发生在剂量大于大约10Gy(1000拉德)时。由于胃肠道和骨髓的破坏性和不可修复的变化，这种综合征的存活极其不可能。辐射胃肠综合征一般可以分成三个时期。前驱期出现在暴露后的数小时内，并且综合征包括厌食、严重恶心、呕吐、肌痛性痉挛和腹泻。潜伏期在大约两天后开始，并且患者可能出现和感觉良好，然而，排列在肠胃道的细胞和骨髓中的干细胞正在死亡。暴露后不到一周，显病期开始，伴随包括不适、厌食、严重腹泻、发烧、脱水和电解质失衡的症状。由于感染、脱水和电解质不平衡，死亡通常发生在2周内。
除了急性辐射综合征的治疗之外，目前使用骨髓移植来治疗一些恶性的和非恶性的疾病，其包括急性和慢性白血病、骨髓瘤、实体瘤。然而，骨髓移植经常在宿主中诱发多种免疫应答，其导致排斥移植物或移植物抗宿主病(在下文中，称为“GvHD”)。为除去或抑制患者的免疫系统而设计的移植前需要的预处理方案，使患者易受肿瘤复发和感染的影响。近来使用的非亲属供体和HLA非全同供体已经不幸地增加了GvHD的发生率。虽然T细胞从供体骨髓移植中的去除改善了GvHD，但是该策略仍增加了移植失败率，并且显著减小了治疗有益的移植物对肿瘤的影响。因此，总存活率没有改善。此外，尽管强有力的临床前数据，但是通过向皮质类固醇添加TNF拮抗剂来减少炎症细胞因子作用而改善GvHD结果的尝试(急性GvHD的护理标准)提供了有限的治疗益处。
因此，迫切需要替代策略以降低辐射GI综合征和GvHD的发生率和严重性。
发明内容
概述
本申请的一个方面涉及抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。
本申请的另一个方面涉及抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，其与本申请所述的抗神经酰胺抗体相同的抗原决定簇结合。所述scFv包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。
本申请的另一个方面涉及一种在有此需要的受试者中抑制细胞死亡的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
本申请的又一个方面涉及一种在受试者中治疗辐射GI综合征或改善辐射GI综合征的症状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
本申请的再一个方面涉及一种在有此需要的受试者中减轻GI综合征中的细胞死亡的方法。所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射后，施用有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
本申请的还一个方面涉及一种在有此需要的受试者中抑制GvHD中的细胞凋亡的方法。所述方法包括在所述受试者接受移植之前，或在所述受试者接受移植之后但在GvHD发病之前，施用有效量的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在本申请的另一个方面中，所述移植是骨髓移植。
附图说明
附图图示本公开的一个或多个实施方式，并且与书面的说明书一起用于解释本公开的示例性实施方式的原理。
图1A-B显示：(A)mAb 2A2的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列，和(B)2A2克隆和人种系序列的氨基酸序列比对。
图2A-B显示：(A)人源化2A2重链序列，和(B)人源化2A2重链序列。
图3是使用粗上清液在体外对h2A2、9H10、9H11、7B10、9A2、6B5和6C8的生物活性的图。
图4是用纯化抗体抑制Jurkat细胞凋亡的示例性的图，10Gy。
图5是使用人源化2a2和鼠7B10、6c8和6b5抑制隐窝致死率的示例性的图。
图6是小鼠抗体6B5、6C8、7B10、9H10、9H11、2A2和人源化2A2抗体(h2A2)的示例性序列的图，以及抗神经酰胺共有序列的描述。使用计算机程序MUSCLE多序列对比产生对比序列和共有序列。由于给出每个柱的得分的直方图，所以保守性在对比序列或序列组上可视化。保守的柱由“*”表示(11分，以默认氨基酸性质分组)，并且具有所有性质都保守的突变的柱用“+”表示(10分，表示所有性质都保守)，“-”表示间隙。
图7是在体外6B5 scFv抑制Jurkat细胞凋亡的示例性的图。
图8是当暴露前施用时在体内对GI隐窝消耗的6B5 scFv保护的示例性的图。
图9是当暴露后施用时在体内对GI隐窝消耗的6B5 scFv保护的示例性的图。
图10是抗神经酰胺scFv以剂量依赖方式保护肠隐窝的图。15Gy全身照射(TBI)前15分钟，通过静脉注射向C57BL/6小鼠施用人源化抗神经酰胺2A2(0-1000微克/小鼠)或重组抗神经酰胺scFv 6B5(0-100微克/小鼠)。TBI后3.5天小鼠被安乐死，并且去除近空肠的部分，切成3个15mm的段，并且放入4％的多聚甲醛中。横切近空肠段，制标本，并在根据Withers和Elkind(1970)的方法定量存活隐窝之前将载玻片进行H&E染色。因为肠隐窝是肠干细胞的部位，所以微集落测定通常用作肠干细胞存活的替代物。N＝每组5只小鼠。
图11是当通过代替注射施用时，抗神经酰胺scFv保持功效的图。在暴露于15Gy全身照射前15分钟，通过静脉(IV)、腹膜内(IP)或皮下(SC)注射向C57BL/6小鼠施用人源化2A2抗神经酰胺抗体(50mg/kg)。或者，在15Gy全身照射(TBI)前15分钟，通过IV、IP、SC或肌内(IM)注射向小鼠施用7.5mg/kg抗神经酰胺scFv 6B5。TBI后3.5天小鼠被安乐死，并且去除近空肠的部分，切成3个15mm的段，并且放入4％的多聚甲醛中。横切近空肠段，制标本，并在根据Withers和Elkind(1970)的方法定量存活隐窝之前将载玻片进行H&E染色。因为肠隐窝是肠干细胞的部位，所以微集落测定通常用作肠干细胞存活的替代物。N＝每组5只小鼠。
图12是抗神经酰胺h2a2和scFv保护并减轻辐射GI综合征的致死效应的图。(左图)在14.5Gy全身照射(TBI)前15分钟，通过静脉注射向C57BL/6小鼠施用抗神经酰胺2A2(1000微克/小鼠)或通过皮下注射向C57BL/6小鼠施用重组抗神经酰胺scFv 6B5(100微克/小鼠)。小鼠在TBI后16小时接受5x106自体骨髓细胞并且每天监测发病率和死亡率。将被认为垂死的小鼠立即安乐死。数据表示通过时间等级检验分析的卡普兰-迈耶存活曲线。对于h2A2和scFv组两者对盐水对照P＜0.05。(右图)。除了在14.5Gy全身照射(TBI)后24小时，通过静脉注射施用人源化抗神经酰胺2A2(1000微克/小鼠)或通过皮下注射施用重组抗神经酰胺scFv 6B5(100微克/小鼠)之外，与左图完全一样地进行实验。N＝每组5只小鼠。对于h2A2和scFv组两者对盐水对照P＜0.05。
图13是抗神经酰胺scFv保护小鼠免于致死性急性移植物抗宿主病的图。在1100cGy分次剂量全身照射(TBI)前15分钟，通过静脉注射向C57BL/6小鼠(MHC H2b单倍型)施用PBS或7.5mg/kg神经酰胺scFv 6B5。在由来自B10.BR供体小鼠(MHC H2k2单倍型)的5x106骨髓(BM)或BM和2x106 CD5+初始T细胞组成的TBI后16-20小时，小鼠接受同种异体骨髓移植。小鼠在第4、8、12和16天接受PBS或7.5mg/kg抗神经酰胺scFv 6B5。每周对小鼠进行GvHD相关发病率评分，包括体重减轻、皮肤损伤、毛皮皱褶和损失，以及脊柱后凸，并且监测存活率。数据表示通过时间等级检验分析的卡普兰-迈耶存活曲线。对于scFv组对盐水对照P＜0.05。
图14是抗神经酰胺scFv在致死性急性移植物抗宿主病期间保护小鼠肠干细胞的图。在1100cGy分次剂量全身照射(TBI)前15分钟，通过静脉注射向C57BL/6小鼠(MHC H2b单倍型)施用PBS、50mg/kg人源化h2A2抗体或7.5mg/kg抗神经酰胺scFv 6B5。在由来自B10.BR供体小鼠(MHC H2k2单倍型)的5x106骨髓(BM)或BM和2x106 CD5+初始T细胞组成的TBI后16-20小时，小鼠接受同种异体骨髓移植。小鼠在第4和8天接受PBS或7.5mg/kg7.5mg/kg抗神经酰胺scFv 6B5。移植后10天小鼠被安乐死，并且去除近空肠的部分，切成3个15mm的段，并且放入4％的多聚甲醛中。横切近空肠段，制标本，并在根据Withers和Elkind(1970)的方法定量存活隐窝之前将载玻片进行H&E染色。因为肠隐窝是肠干细胞的部位，所以微集落测定通常用作肠干细胞存活的替代物。N＝每组5只小鼠。
图15是抗神经酰胺h2A2和scFv增加肠系膜淋巴结中的CD4+和CD8+淋巴细胞的保留的图。在1100cGy分次剂量全身照射(TBI)前15分钟，通过静脉注射向C57BL/6小鼠(MHCH2b单倍型)施用PBS、50mg/kg人源化h2A2抗体或7.5mg/kg抗神经酰胺scFv 6B5。在由来自B10.BR供体小鼠(MHC H2k2单倍型)的5x106骨髓(仅BM)或BM和2x106 CD5+初始T细胞组成的TBI后16-20小时，小鼠接受同种异体骨髓移植。小鼠在第4和8天接着接受PBS、h2A2或scFv6B5。移植后10天小鼠被安乐死，并且通过流式细胞术分析肠系膜淋巴结。数据表示来自整个供体(H2k2单倍型阳性)的CD45+淋巴细胞池的CD4+和CD8+细胞的总数。N＝每组5只小鼠。
具体实施方式
显示以下详细描述以使本领域中的任何技术人员能够做出并使用本发明。为了解释的目的，提出了特定的命名以提供对本发明的透彻理解。然而，对本领域的技术人员明显可见的是不需要这些具体细节来实践本发明。仅提供具体申请的说明作为代表实施例。不意欲将本发明局限于所示实施方式，而是与符合在此公开的原理和特征的最宽可能范围一致。
在此使用的“治疗有效量”指化合物的量是实现所需生物学或治疗效果的量，即预防、减少或改善治疗或预防所列举的疾病的一种或多种症状的量。
在此使用的术语“治疗(动词)”、“治疗(动名词)”或“治疗(名词)”指减轻或消除疾病和/或其伴随症状的方法。在此使用的术语“预防(动词)”、“预防(动名词)”或“预防(名词)”指一种阻止受试者获得疾病和/或其伴随症状的方法。在某些实施方式中，术语“预防(动词)”、“预防(动名词)”或“预防(名词)”指减少获得疾病和/或其伴随症状的风险的方法。
如在此使用的关于治疗的术语“减轻(动词)”、“减轻(动名词)”和“减轻(名词)”指在事件发生后急性事件的治疗，例如，暴露后24小时减轻辐射损伤。
类似地，如在此使用的关于治疗的术语“保护(动词)”、“保护(动名词)”和“保护(名词)”指预防性施用用于在所述事件发生之前预防或抑制事件的治疗剂。
如在此使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫学活性部分，即，含有特异性结合抗原(与抗原进行免疫反应)的抗原结合位点的分子。术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体地包含单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、重组抗体(如scFv)，和抗体片段，只要它们显示出所需的生物活性。通过“特异性结合”或“与...免疫反应”指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，并且不与其他抗原(包括多肽和脂类)反应(即，结合)或以低得多的亲和力与其他抗原结合。
术语“抗体”还包括包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区的抗体片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链可变片段(scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。在本发明的某些实施方式中，抗体片段，而不是完整抗体，用于增加组织穿透力或肿瘤穿透力。在另一些实施方式中，进一步修饰抗体片段以增加其血清半衰期。
如在此使用的术语“单克隆抗体”指由基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可以少量存在的可能自然发生的突变之外，包含所述群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体在此具体包括“嵌合”抗体和该抗体的片段，在所述“嵌合”抗体中重链和/或轻链的一部分与来自特殊物种或属于特殊抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与来自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们显示出所需的生物活性。
非人类抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有来自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，来自受体的高变区的残基被来自具有所需的特异性、亲和性和/或能力的非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的高变区的残基替换。用于制作人源化和其他嵌合抗体的方法是本领域中已知的。
“双特异性抗体”是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。用于制作双特异性抗体的方法是本领域中已知的。
“异源偶联抗体”的使用也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已经提出这样的抗体将免疫系统细胞靶向有害的细胞(美国专利第4,676,980号)。预期所述抗体能够使用合成蛋白质化学中已知的方法(包括涉及交联剂的那些)在体外制备。
如在此使用的术语“LD50”指“致死剂量，50％”或“半数致死剂量”并且是杀死50％的受试群体需要的物质的量。
细胞外神经酰胺是辐射诱导的细胞凋亡所必需的
脂质筏是在液态无序大块质膜内产生液态有序结构域的由与鞘脂类(尤其是鞘磷脂)紧密相关的胆固醇组成的不同质膜微区。筏在其蛋白质和脂质组成上不同于周围膜，容纳包括糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白、Src家族的双酰化酪氨酸激酶和跨膜蛋白的信号分子。此外，筏作为多个受体在其激活时移入或移出的位点，包括在遇到抗原时的B细胞受体(BCR)。证据表明这些易位事件对多信号转导级联是关键的。
鞘脂类是细胞膜的结构成分并且是通过神经酰胺产生的信号转导的重要调节剂。C16神经酰胺在分化、增殖和生长停滞中具有重要的作用。其还是细胞凋亡信号的主要成分。神经酰胺产生已经被鉴定为多重细胞因子-、病毒/病原体-、环境压力-和化疗-诱导的细胞凋亡事件的必要条件。此外，靶细胞质膜上的富含神经酰胺区域对细胞毒素T淋巴细胞(CTL)诱导的细胞死亡的敏感性是至关重要的。
致命性GI综合征的治疗和预防
位于自肠腺底部起的位置1-3的循环隐窝基底柱状(CBC)细胞近来已经被定义为肠干细胞群。该细胞群不断地增殖和分化，补充来自绒毛顶端的肠细胞和其他分化的上皮细胞的生理损失，从而保持粘膜的结构和功能完整。这个隔室的完全或几乎完全耗尽似乎需要永久破坏隐窝-绒毛单位，而存活干细胞无性系时，尽管甚至每个隐窝一个，能够再生完全功能的隐窝。
辐射靶向胃肠微脉管系统和肠干细胞隔室。在辐射后四小时作为细胞凋亡检测的微血管内皮的功能障碍，表示导致GI综合征的主要损伤。内皮功能障碍将对CBC的损伤从亚致死转变为致死，导致再生隐窝的损失并促进GI毒性。免疫组织化学以及用[3H]TdR和BrdUrd的标记研究显示出隐窝干细胞死亡在辐射暴露后不急剧发生。在一定程度上，最早可检测的反应是通过晚期S期关卡和有丝分裂停滞的进展中的临时剂量依赖性延迟，其显然通过辐射诱导的DNA双链断裂(dsb)发信号。在辐照后的第一个24小时期间，在生长停滞的细胞中发生快速凋亡死亡，在12Gy，等于总死亡的33％。在哺乳动物细胞中，DNA dsbs激活DNA损伤识别和修复的途径，以及细胞周期关卡活性的协同调控。肠干细胞有丝分裂停滞似乎代表了该途径中的调节事件。在该第二个24小时期间发生有丝分裂形式的死亡，占总死亡的66％。在这个阶段，显然每个肠周围的隐窝数量没有显著变化，尽管由于隐窝转移和分化的细胞从隐窝继续正常迁移到绒毛的上皮层和从绒毛尖端的损失隐窝尺寸日益减少。在12-18小时恢复有丝分裂活性与隐窝干细胞无性系的快速耗尽和每周的隐窝数的减少有关。
GI干细胞无性系的致命性最好通过辐射暴露后3.5天存活的隐窝数评估，其随剂量增加呈指数下降(C.S.Potten and M.Loeffler,Development 110(4),1001(1990),H.R.Withers,Cancer 28(1),75(1971),和J.G.Maj,F.Paris,A.Haimovitz-Friedman etal.,Cancer Res 63,4338(2003))。含有存活干细胞的隐窝以加速率增殖，产生典型的再生隐窝，其裂开或发芽以产生新的隐窝，直到场粘膜恢复正常的体系。一些小鼠模型的TBI实验表明暴露于8-12Gy后存活隐窝干细胞的数量通常足够支持粘膜的完全恢复。然而，达到较高剂量时，大量干细胞无性系损失可导致隐窝-绒毛系统的几乎完全崩溃、粘膜剥露以及由GI综合征引起的动物死亡。诱发GI死亡的阈剂量，以及产生50％GI致死性(LD50)的TBI剂量似乎是种特异性的。暴露于TBI的C57BL/6小鼠的尸体解剖研究显示出暴露于14Gy的25％的小鼠和暴露于15Gy的100％的那些在6.8+/-0.99天死于GI综合征，预测GI死亡的LD50在14和15Gy之间。相反地，报告的BALB/c小鼠的LD50D6(第六天的LD50,作为GI死亡的替代标志)是8.8+/-0.72Gy，BDF1小鼠的是11.7+/-0.22Gy，C3H/He小鼠的是12.5+/-0.1Gy，C3H/SPF小鼠的是14.9Gy(95％置信界限13.9-16.0Gy)，并且B6CF1小鼠的是16.4+/-0.2Gy，表明小鼠对源于GI综合征的死亡的敏感性的种特异性范围。已经报告了其他器官对辐射的敏感性的种变异，如骨髓和肺。
通常，认为穿透辐射(IR)通过直接损伤基因组DNA杀死细胞，其导致基因组不稳定并且造成细胞生殖期死亡。Haimovitz-Friedman等人(Cancer Res 63,4338(2003))在无核系统中证明，细胞凋亡信号可通过IR与细胞膜的相互作用交替产生。神经酰胺介导的筏聚簇参与IR诱导的细胞凋亡和无性系细胞死亡。早就被接受的是胃肠(GI)粘膜的克隆形成隔室对诱导GI损伤的辐射是特异性和直接靶标。
本申请的一个方面涉及抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。
如在此使用的术语“CDR”指免疫球蛋白(抗体)分子的“互补决定区”。CDR是抗体可变结构域的一部分，其中抗体结合其特异性抗原。CDR对由淋巴细胞产生的抗原特异性的多样性是至关重要的。对于IgG分子中的总共12个CDR和IgM分子中的总共60个CDR，每个可变结构域有三个CDR(即,轻链的可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3和重链的可变结构域中的CDR1、CDR2和CDR3)。在所述可变结构域中，在多肽链的可变(V)区中发现CDR1和CDR2，CDR3显示出最大可变性，因为其在轻链区的情况下由VJ的重组编码，在重链区的情况下由VDJ的重组编码。
在一些实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1包含序列GYTFTDHTIH(SEQ ID NO:1)，所述重链可变区CDR2包含序列YNYPRDGSTKYNEKFKG(SEQID NO:2)，重链可变区CDR3包含序列GFITTVVPSAY(SEQ ID NO:3)，所述轻链可变区CDR1包含序列RASKSISKYLA(SEQ ID NO:4)，轻链可变区CDR2包含序列SGSTLQS(SEQ ID NO:5)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列QQHNEYPWT(SEQ ID NO:6)。
在另外的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含：包含序列QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYNYPRDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAKGFITTVVPSAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:48)的重链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:48的重链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；和/或包含SEQ ID NO:8的轻链可变区序列，或与包含DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:8)的轻链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
在其他的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1包含序列GYAFSSYWMN(SEQ ID NO:9)，所述重链可变区CDR2包含序列QIYPGDGDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:10)，重链可变区CDR3包含序列RCYYGLYFDV(SEQ ID NO:11)，所述轻链可变区CDR1包含序列KASQDINRYLS(SEQ ID NO:12)，轻链可变区CDR2包含序列RANRLVD(SEQ IDNO:13)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列LQYDEFPYT(SEQ ID NO:14)。
在另外的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含：包含序列QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTRRCYYGLYFDVWGTGTTVTVSS(SEQ ID NO:15)的重链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:15的重链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；和/或包含序列DIKMTQSPSSRYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:51)的轻链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:51的轻链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
在其他实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1包含序列GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:17)，所述重链可变区CDR2包含序列YINPSSGYTKYNQFKD(SEQID NO:18)，重链可变区CDR3包含序列GGYYGFAY(SEQ ID NO:19)，所述轻链可变区CDR1包含序列SASSSVSYMY(SEQ ID NO:20)，轻链可变区CDR2包含序列LTSNLAS(SEQ ID NO:21)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列QQWSSNPLT(SEQ ID NO:22)。
在另外的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含：包含序列QVQLQQSGAELAKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTYEDSAVYYCARGGYYGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:23)的重链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:23的重链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；和/或包含序列QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:24)的轻链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:24的轻链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
在其他实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1包含序列GFSLTGYGVH(SEQ ID NO:25)，所述重链可变区CDR2包含序列VIWSGGSTDYNAAFIS(SEQID NO:26)，重链可变区CDR3包含序列NYGYDYAMDY(SEQ ID NO:27)，所述轻链可变区CDR1包含序列RASQSIGTSIH(SEQ ID NO:28)，轻链可变区CDR2包含序列YASESIS(SEQ ID NO:29)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列QQSNSWPFT(SEQ ID NO:30)。
在另外的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含：包含序列SEQID NO:49的重链可变区序列，或与包含序列QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLSISKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARNYGYDYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:49)的重链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；和/或包含序列DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:32)的轻链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:32的轻链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
在其他实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段的重链可变区CDR1包含序列GYTFTNYWMH(SEQ ID NO:33)，所述重链可变区CDR2包含序列AIYPGDSDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:34)，重链可变区CDR3包含序列GLYYGYD(SEQ ID NO:35)，所述轻链可变区CDR1包含序列KSSQSLIDSDGKTFLN(SEQ ID NO:36)，轻链可变区CDR2包含序列LVSKLDS(SEQ IDNO:37)，并且所述轻链可变区CDR3包含序列WQGTHFPYT(SEQ ID NO:38)。
在另外的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含：包含序列EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPVQGLEWIGAIYPGDSDTSYNQKFKGKAKLTAVTSTSTAFMELSSLTNEDSAVYYCTGLYYGYDWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:39)的重链可变区序列，或与包含SEQ ID NO:39重链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；和/或包含SEQ ID NO:40的轻链可变区序列，或与包含序列DVLMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLIDSDGKTFLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:40)的轻链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
在其他实施方式中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段包含：a)包含选自SEQID NO:48、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:39的序列的重链可变区序列，或与包含选自SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:49和SEQID NO:39的序列的重链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列；和/或a)包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40的序列的轻链可变区序列，或与包含选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40的序列的轻链可变区序列具有至少约80％、85％、90％或95％序列同一性的序列。
在特定的实施方式中，所述抗神经酰胺抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、重组抗体和scFv。
本申请的另一个方面涉及一种抗神经酰胺单链可变片段(scFv)，其与本申请所述的抗神经酰胺抗体结合相同的抗原决定簇。所述scFv包含：10个氨基酸的重链可变区CDR1，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第6位上的Thr或His以及自N-末端起第10位上的His或Asn；16-17个氨基酸的重链可变区CDR2，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn，自C-末端起第2和第4位上的Lys或Ala；7-11个氨基酸的重链可变区CDR3，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr；10-16个氨基酸的轻链可变区CDR1，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe；7个氨基酸的轻链可变区CDR2，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp；以及9个氨基酸的轻链可变区CDR3，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。
单链可变片段(scFv)实际上不是抗体的片段，而是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。所述接头通常富含甘氨酸用于柔性，以及丝氨酸或苏氨酸用于溶解性，并且所述接头可以将VH的N-末端与VL的C-末端连接，反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头，scFv仍保留原始免疫球蛋白的特异性。
在一些实施方式中，所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv使用重组DNA技术来制备。用于重组蛋白的表达和纯化的步骤在本领域中是良好建立的。
为了在生物系统中表达本申请所述的抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv，构建编码所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv的多核苷酸。在某些实施方式中，重组多核苷酸对于在选择的原核或真核宿主细胞(例如细菌、哺乳动物、植物或昆虫细胞)中的表达进行密码子优化。为了促进复制和表达，多核苷酸可以被并入载体(如原核或真核表达载体)中。尽管在此公开的多核苷酸可以被包括在多种载体中的任意一种中(包括例如细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；来自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA(如牛痘、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和许多其它病毒)组合的载体)，然而最通常载体将是适合于产生多肽表达产物的表达载体。在表达载体中，编码所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv的多核苷酸通常布置在适当的转录控制序列(启动子，并且任选地，一个或多个增强子)的附近和方向来指导mRNA合成。即，目的多核苷酸序列可操作地连接到合适的转录控制序列。所述启动子的实例包括：CMV、LTR或SV40启动子的立即早期启动子，杆状病毒的多面体启动子，大肠杆菌(E.coli)lac或trp启动子，噬菌体T7和λPL启动子，以及其他已知控制原核或真核细胞或者它们的病毒的表达的启动子。所述表达载体通常还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。所述载体任选地包含用于扩增表达的适当序列。此外，所述表达载体任选地包含一种或多种可选择的标记基因来提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如对于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者如在E.coli中的四环素或氨苄西林抗性。
例如，为了改善翻译的效率，所述表达载体还可包含另外的表达元件。这些信号可包括，例如，ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况下，例如，翻译起始密码和有关序列元件与目的多核苷酸序列同时被插入到适当的表达载体中(例如，天然起始密码子)。在这样的情况下，不需要另外的翻译控制信号。然而，在仅插入多肽编码序列或其部分的情况下，提供外源翻译控制信号(包括ATG起始密码子)用于表达抗神经酰胺抗体或scFv。起始密码子置于正确的读码框以确保目的多核苷酸序列的翻译。外源转录元件和起始密码子可以是多种来源的，天然和合成的。如果需要，通过在使用中包括适合于细胞系统的增强子，可以进一步提高表达效率。
携带本申请所述的抗神经酰胺抗体或scFv的表达载体可以通过多种已知的方法中的任意一种引入到宿主细胞中，如电穿孔、脂质体介导的转染、磷酸钙沉淀、感染、转染等，这取决于载体和宿主细胞的选择。
因此，含有抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv编码核苷酸的宿主细胞也是本公开的特征。适合的宿主细胞包括原核(即，细菌)宿主细胞，如E.coli，和许多真核宿主细胞，包括真菌(例如,酵母,如酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母菌(Picchia pastoris))细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(如CHO细胞)。
所述宿主细胞可以在修改为适合于激活启动子、选择转化体或扩增插入的多核苷酸序列的常规营养培养基中培养。培养基条件(如温度、pH等)通常是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对本领域的技术人员来说将是显而易见的。任选地就其调节插入序列的表达或以所需方式加工表达的蛋白质的能力，选择宿主细胞。蛋白质这样的修饰包括但是不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂化和酰化)。例如将前体形式切割成蛋白质的成熟形式(例如，通过费林蛋白酶)的翻译后的加工在宿主细胞的环境下任选地进行。不同宿主细胞(如3T3、COS、CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等等)具有特定的细胞机制和这种翻译后的活性特征机制，并且可以选择以确保引入的外源蛋白的正确修饰和加工。
对于重组抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv多肽的长期高产率生产，通常使用稳定的表达系统。例如，将编码抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv的多核苷酸使用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体引入到宿主细胞中。在载体引入后，允许细胞在它们被转换到选择培养基之前在富集培养基中生长1-2天。选择标记的用途是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和回收。例如，可以使用适合于细胞类型的组织培养技术使稳定转化细胞的抗性组或集落增殖。任选地在适合于从细胞培养物中表达和回收编码的蛋白质的条件下培养用编码抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv的核苷酸转化的宿主细胞。
在转导适合的宿主细胞系并且宿主细胞生长至适当细胞密度后，通过适当方法(例如，温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，并且将细胞再培养一段时间。然后从培养基中回收分泌的多肽产物。或者，可以通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破碎，并且保留所得粗提液以进一步纯化。用于表达蛋白质的真核或微生物细胞可以通过任意适合方法来破碎，其包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂，或者本领域中的技术人员熟知的其他方法。
表达的抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv可以通过本领域中熟知的一些方法(包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法(例如,使用在此记录的任何标记系统)、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法)中的任意一种从重组细胞培养物中回收或纯化。如需要，蛋白质折叠步骤可以用于完成成熟蛋白质的构型。最后，高效液相色谱法(HPLC)可以用于最终的纯化步骤。
在某些实施例中，将核苷酸引入到适合于在真核细胞(例如，E.coli细胞)中引入并表达的载体。在一些实施方式中，(例如，通过电穿孔)将所述表达载体引入到适合的细菌宿主内。在另一些实施例中，使用杆状病毒表达载体系统(BEVS)将编码抗神经酰胺抗体或scFv的多核苷酸序列引入到昆虫细胞中。相似地，可以使用替代的昆虫细胞，如与SF9密切相关的SF21，和源自甘蓝银纹夜蛾粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的High Five(Hi5)细胞系。
在其他实施方式中，所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv通过质粒载体或病毒载体在细胞内表达。
在某些实施方式中，所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段和scFv通过化学合成来制备。简单地，抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv可以通过将一个氨基酸C末端的羧基偶联到另一个氨基酸N末端的氨基来合成。由于意想不到的反应的可能性，保护基团可能是必需的。化学肽合成在肽的C末端开始而在N末端终止。这与在N末端开始的蛋白质生物合成相反。
在一些实施方式中，所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段和scFv可以使用传统液相或固相合成来合成。Fmoc和t-Boc固相肽合成(SPPS)可以用来使肽从羧基生长到氨基末端。在某些实施方式中，加入反应的最后一个“氨基酸”是PEG化的。所述最后一个氨基酸通常被称为羧基-PEG-胺、羧基-PEO-胺或胺-PEG-酸，因此胺被封闭以防止反应，并且酸免于与来自反应中先前加入的氨基酸的胺基进行反应。PEG(聚乙二醇)和PEO(聚氧化乙烯)是由乙二醇和环氧乙烷单体的重复亚单元组成的聚合物。在一个实施方式中，PEG化的抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段和scFv将具有连接到多肽的氨基末端的组氨酸残基(H)的PEG部分。在一个实施方式中，所述PEG部分的大小是5至30kDa。在另一个实施方式中，所述PEG部分的大小是10至20kDa。
除了在合成期间使用PEG化的末端氨基酸之外，抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv可以通过PEG化来聚乙二醇化。PEG化是聚乙二醇聚合物链与另一个分子(通常是药物或治疗蛋白质)共价连接的过程。PEG化可以通过培养PEG的反应衍生物与目标抗神经酰胺抗体或scFv来实现。PEG与抗神经酰胺抗体或scFv的共价连接可以“掩蔽”所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv免于宿主的免疫系统(降低的免疫原性和抗原性)，增加所述抗神经酰胺抗体、其抗原结合片段或scFv的流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)，其通过减少肾清除率延长其循环时间。PEG化还可向疏水蛋白提供水溶性。
抑制细胞凋亡的方法
本申请的另一个方面涉及一种在有此需要的受试者中抑制细胞死亡的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本申请所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗神经酰胺抗体是抗神经酰胺scFv。
在一些实施方式中，所述细胞死亡与选自移植物抗宿主病、放射病、GI综合征和自身免疫疾病的疾病有关。在另外的一些实施方式中，所述疾病是放射病或GI综合征，并且在所述受试者暴露于辐射之前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
本申请的另一方面涉及一种在有此需要的受试者中减轻GI综合征中的细胞死亡的方法，所述方法包括施用有效量的抗神经酰胺抗体。在一些实施方式中，所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射之后，向所述受试者立即施用所述抗神经酰胺抗体。在其他实施方式中，所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射之后一小时内，向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体。在其他实施方式中，所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射之后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或18小时内，向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体。在特定的实施方式中，所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射之后24小时内，向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体。在其他实施方式中，所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射之后30、36、42、48、54、60、66或72小时内，向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体。在其他实施方式中，所述方法包括在所述受试者暴露于穿透辐射之前48、36、24、18、12、10、8、6、4、2或1小时内，或者45、30或15分钟内，向所述受试者施用所述抗神经酰胺抗体。
在其它另外的实施方式中，所述疾病是移植物抗宿主病，并且在所述受试者接受移植之前施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述移植是骨髓移植。在其他另外的实施方式中，在所述受试者接受移植之后但在移植物抗宿主病发病之前，施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。在其他另外的实施方式中，在移植物抗宿主病发病之后以有效减轻移植物抗宿主病中的细胞凋亡的量向有此需要的受试者施用所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段。
抗体施用
可以用已知方法(例如通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服，局部或吸入途径，作为推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注)向所述受试者施用所述抗体或其抗原结合片段。
本发明所述的抗体和其抗原结合片段可以以通常接受的药学上可接受的载体施用。可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖盐水。固体支持物、脂质体、纳米颗粒、微粒、纳米球或微球也可以用作载体来施用所述抗体或其抗原结合片段。
所述抗体或其抗原结合片段的适当剂量(“治疗有效量”)将取决于例如取决于，例如，待治疗的疾病，疾病的严重性和病程，是否为了预防或治疗目的施用抗体，先前的治疗，患者的临床历史和对抗体的反应，使用的抗体或其抗原结合片段的类型，以及主治医生的判断。将所述抗体或其抗原结合片段适当地一次或通过一系列治疗施用于患者，并且在从诊断开始的任何时间可以施用于患者。考虑可以将所述抗体或其抗原结合片段作为单独的治疗或与用于治疗所述疾病的其它药物或疗法联合施用。
作为一般性建议，无论通过一次或多次施用，所施用的治疗有效量的抗体或其抗原结合片段将在大约1ng/kg体重/天至大约100mg/kg体重/天的范围内。在特定的实施方式中，施用的抗体的范围是大约1ng/kg体重/天至大约1μg/kg体重/天，1ng/kg体重/天至大约100ng/kg体重/天，1ng/kg体重/天至大约10ng/kg体重/天，10ng/kg体重/天至大约1μg/kg体重/天，10ng/kg体重/天至大约100ng/kg体重/天，100ng/kg体重/天至大约1μg/kg体重/天，100ng/kg体重/天至大约10μg/kg体重/天，1μg/kg体重/天至大约10μg/kg体重/天，1μg/kg体重/天至大约100μg/kg体重/天，10μg/kg体重/天至大约100μg/kg体重/天，10μg/kg体重/天至大约1mg/kg体重/天，100μg/kg体重/天至大约10mg/kg体重/天，1mg/kg体重/天至大约100mg/kg体重/天和10mg/kg体重/天至大约100mg/kg体重/天。
在另一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以每次注射1ng-10ng，每次注射10ng至100ng，每次注射100ng至1μg，每次注射1μg至10μg，每次注射10μg至100μg，每次注射100μg至1mg，每次注射1mg至10mg，每次注射10mg至100mg和每次注射100mg至1000mg的剂量范围施用。
在另一个特定的实施方式中，施用的抗体或其抗原结合片段的剂量范围是大约1ng/kg至大约100mg/kg。在又一个特定的实施方式中，施用的抗体的剂量范围是大约1ng/kg至大约10ng/kg，大约10ng/kg至大约100ng/kg，大约100ng/kg至大约1μg/kg，大约1μg/kg至大约10μg/kg，大约10μg/kg至大约100μg/kg，大约100μg/kg至大约1mg/kg，大约1mg/kg至大约10mg/kg，大约10mg/kg至大约100mg/kg，大约0.5mg/kg至大约30mg/kg和大约1mg/kg至大约15mg/kg。
在另一个特定的实施方式中，施用的抗体或其抗原结合片段的量是或大约是0.0006、0.001、0.003、0.006、0.01、0.03、0.06、0.1、0.3、0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600和1000mg/天。如所预期的，剂量将取决于患者的疾病、大小、年龄和状况。
所述抗体或其抗原结合片段可以适当地或指示地以单次剂量作为推注或通过连续输注，或作为多次剂量通过推注或通过连续输注施用。可以施用多次剂量，例如，每天多次，每天一次，每2、3、4、5、6或7天1次，每周1次，每2、3、4、5或6周1次，或者每月1次。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术容易地监测该疗法的进展。
通过以下不应解释为限制本发明的实施例进一步说明本发明。通过本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利的内容和图片以及表格在此通过引用并入。
实施例1：2A2 Ab人源化和产物
来自杂交瘤的2A2的可变轻链和重链的克隆
通过离心分离收获2A2杂交瘤细胞并且使用RNA纯化试剂盒从细胞中提取总RNA。所述总RNA用于cDNA合成，并且最终使用在“噬菌体表达手册(Phage display manual)”中公开的引物组分离2A2的V区基因。图1A显示2A2的可变重链(VH)和轻链(VL)序列。
2A2的可变区的人源化
通常，啮齿类动物抗体对人类可以产生免疫，并且导致极其严重的副作用，包括HAMA(人抗小鼠抗体)反应或过敏性休克。为了解决该问题，已经使用抗体工程来人源化非人抗体。因此，使用CDR移植方法人源化2A2的VL和VH。
CDR移植是目前最常用的用于人源化啮齿动物mAb的策略。在该方法中，构成啮齿动物mAb的抗原结合位点的CDR环被移植到相应的人构架区中。
为了识别与2A2的那些同源的人VL和VH，使用VBASE在线数据库(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)比较2A2的可变区与人种系序列的可变区。由此，发现两种人种系序列VL和VH序列。2A2克隆和人种系序列的氨基酸序列显示在图1B中显示。
发现选择的2A2 VH序列与来自VH1家族和人J基因JH6的人V基因1-46最同源。发现选择的2A2 VL序列与来自Vk2家族和人J基因Jk2的人V基因A1最同源。因此，将各自含有三个小鼠CDR序列的合成的VL和VH移植到所选择的人框架序列中用于2A2mAb的人源化。
用于表达哺乳动物细胞中的人源化2A2 IgG1的载体构建
2A2mAb最初是鼠IgM。IgM抗体转化为IgG1形式，因为IgG1在血清中是最丰富的(9mg/ml)，其半衰期(21天)比任何其它抗体长，并且目前大多数商业治疗性抗体是IgG1形式。为了构建在哺乳动物表达载体中的人源化2A2 IgG1，使用pOptiVEC和pcDNA 3.3(Invitrogen)载体。
用于在哺乳动物细胞中表达人源化2A2 IgG1的载体
示例性载体含有用于在广泛范围的哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白的人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子。为了构建人源化2A2IgG1，合成各自具有小鼠2A2的三个CDR的人可变轻链和重链，并且通过PCR将这两个DNA片段与人恒定区轻链和重链连接。最后，将人源化2A2轻链克隆到pcDNA3.3 TOPO中，并且将人源化2A2重链克隆到pOptiVEC TOPO抗体表达载体中。人2A2IgG1的序列在图2A-B中显示，其表明在构建整个人源化轻链期间缺失人恒定区轻链的第一个氨基酸(精氨酸，红色阴影)。在构建这些人2A2Ab表达载体后，将DNA质粒共转染到来自CHO的DHFR阴性DG44细胞中以产生了产生2A2hIgG1抗体的稳定细胞系。
用于抗体产生的稳定细胞系的开发
为了获得产生高水平抗体的细胞系，通过使用CD OptiCHO培养基和具有500μg/ml遗传霉素的CD OptiCHO培养基进行两轮选择，接着在96孔板半固体培养基中进行MTX基因组扩增选择和两轮的单细胞克隆选择来选择稳定转染的细胞池。通过ELISA测定定量筛选抗体表达水平，并且选择的h2A2IgG1-CHO细胞(G3A10，C5G6和D5F11)系被缓慢放大。
实施例2：另外的抗神经酰胺抗体的产生
产生一组单克隆抗体用于在小鼠中重复施用研究以研究免疫原性。使用抗原(与白蛋白偶联的ω-COOH C16-神经酰胺)，通过ELISA进行筛选杂交瘤以选择抗神经酰胺Mabs。针对与白蛋白偶联的BSA和ω-COOH C16-二氢神经酰胺计数筛选阳性取样数(Positive hit)。然后进行Mabs的生物测试(Jurkat细胞凋亡的体外抑制，辐射GI综合征的体内抑制)。选择命名为9H10、9H11、9A2、7B10、6B5和6C8的克隆用于测试选择，并且除了9A2之外，所有的生物体外活性都被证实。如表1所示，一组克隆优先结合C16:0羧基神经酰胺-BSA。Ag1是C16:0羧基神经酰胺-BSA包被的@300ng/孔，Ag2是C16:0二氢-羧基神经酰胺-BSA包被的@300ng/孔，并且Ag3是游离BSA(Sigma A6003)包被的@300ng/孔。
表1-抗神经酰胺mAbs
Figure GDA0002728259200000231
Figure GDA0002728259200000241
克隆6B5和6C8被识别为IgG，而克隆7B10、9H10和9H11被识别为IgM。被识别为IgG的那些的其他数据在表2中。Ag1是在碳酸氢钠中C16:0羧基神经酰胺-BSA包被的@500ng/孔，Ag2是在碳酸氢钠中C-16:0二氢-羧基神经酰胺-BSA包被的@500ng/孔，并且Ag3是在碳酸氢钠中游离BSA(Sigma A6003)包被的@500ng/孔。
表2-抗神经酰胺mAbs的浓度曲线
Figure GDA0002728259200000242
Figure GDA0002728259200000251
图3显示克隆9H10、9H11、7B10、6B5和6C8证明了在体外的生物学活性。
通过将Jurkat细胞暴露于10Gy的穿透辐射来筛选阳性克隆的生物活性。单克隆抗体刚好在IR前以指定剂量加入到培养基中，并且在培养16小时后固定所述细胞。细胞凋亡通过HOESCHST双苯酰亚胺染色和形态学检查来定量。所得结果在图4中显示。
针对克隆7B10(IgM)、6B5(IgG)和6C8(IgG)研究隐窝致死率。图5显示在15GyIR之前15分钟施用时，所有剂量依赖的抑制隐窝致死率。
对6B5、6C8、7B10、9H10和9H11的CDR进行测序。序列数据显示这些Mab之间以及与2A2的CDR(通过替代性免疫/筛选方案产生)的显著同源性。IgM似乎在彼此和2A2之间具有甚至更大的同源性。以相同的方式，两个IgG彼此最相似。图6显示六种鼠抗体重链和轻链可变区序列以及人源化h2A2(源自m2A2)的序列的序列比对，以及计算机产生的共有序列的描述。在重链可变区的CDR1中，每个抗体包含10个氨基酸，其包含自N-末端起第1位上的Gly，自N-末端起第2位上的Tyr或Phe，自N-末端起第4位上的Phe或Leu，和自N-末端起第5位上的Thr或Ser以及自N-末端起第10位上的His或Asn。在重链可变区的CDR2中，每个抗体包含16-17个氨基酸，其包含自N-末端起第2位上的Asn或Ile，自N-末端起第4位上的Phe或Ser，自C-末端起第9位上的Thr，自C-末端起第7位上的Tyr，自C-末端起第6位上的Asn或Arg，自C-末端起第4位上的Lys或Ala和自C-末端起第3位上的Phe。在小鼠抗体的重链可变区的CDR3中，每个抗体包含7-11个氨基酸，其包含自N-末端起第4位上的Tyr或Thr。在轻链可变区的CDR1中，每个抗体包含10-16个氨基酸，其包含自N-末端起第2位上的Ala或Ser，自N-末端起第3位上的Ser，自N-末端起第5位上的Ser或Asp，和自C-末端起第3位上的Tyr、Ser或Phe。在轻链可变区的CDR2中，每个抗体包含7个氨基酸，其包含自N-末端起第3位上的Ser或Asn，自N-末端起第5位上的Lys或Ser，和自N-末端起第7位上的Ser或Asp。在轻链可变区的CDR3中，每个抗体包含9个氨基酸，其包含自N-末端起第1位上的Gln、Leu或Trp，自N-末端起第2位上的Gln，自N-末端起第7位上的Pro，和自N-末端起第9位上的Thr。
图6中还显示了基于来自6B5、6C8、7B10、9H10和9H11的CDR序列的序列信息的抗神经酰胺共有序列重链和轻链CDR。本发明的发明人惊奇地发现，抗神经酰胺抗体的轻链和重链可变区的CDR区具有某些保守的氨基酸残基。在一些实施方式中，由两种或更多种抗神经酰胺抗体6B5、6C8、7B10、9H10、9H11和2A2的序列确定的共有序列可用于产生scFv抗体，所述scFv抗体包含共有CDR，共有可变区，或包含与共有可变区序列至少约80％、90％或95％的序列同一性的可变区。
实施例3：抗神经酰胺SCFV的产生
基于Mab功效数据，选择6B5的CDR(连同2a2)被工程化为单链Fv。将两个单链(sc)Fv构建体工程化以表达scFv并提供纯化的scFv用于功效测试。6B5 scFv容易表达和纯化。如用Mabs，使用Jurkat细胞凋亡的体外抑制和辐射GI综合征的体内抑制进行scFv的生物学测试。图5显示通过微集落测定法6B5 IgG保护免于隐窝死亡。图7显示scFv抑制jurkat细胞凋亡。图8显示当15Gy暴露之前15分钟施用时，6B5scFv在体内保护免受GI隐窝消耗。图9显示当15Gy暴露之后24小时施用时，6B5scFv在体内减轻体内GI隐窝消耗。
抗神经酰胺scFv保护小鼠免于致死性急性移植物抗宿主病
通过所示的施用途径和给药方案向C57BL/6小鼠(MHC H2b单倍型)施用盐水、50mg/kg人源化抗神经酰胺h2A2或7.5mg/kg抗神经酰胺scFv 6B5。在1100cGy分次剂量全身照射(TBI)之前15分钟开始给药。小鼠随后在TBI后16-20小时接受同种异体骨髓移植，其由来自B10.BR供体小鼠(MHC H2k2单倍型)的5x106同种异体骨髓(BM)或BM和2x106同种异体CD5+初始T细胞组成。每天监测小鼠的存活。数据表示第10天的存活，确定为90天存活的代表。在第0、4和8天的给药方案中用盐水进行的静脉内施用途径导致10天后30％的存活率。在第0、4和8天的给药方案中用h2A2单克隆抗体进行的静脉内施用途径导致10天后100％存活率(p＜0.001对盐水对照)。在第0、4和8天的给药方案中用scFv进行的静脉内施用途径导致10天后60％的存活率(p＜0.05对盐水对照)。在第0、2、4、6和8天的给药方案中用盐水进行的皮下施用途径导致10天后0％存活率。在第0、2、4、6和8天的给药方案中用盐水进行的皮下给药途径导致10天后100％存活率(p＜0.001对盐水对照)。
如图10所示，抗神经酰胺scFV以剂量依赖性方式保护肠道隐窝。如图11所示，当通过替代注射施用时，抗神经酰胺scFv保留功效。如图12所示，抗神经酰胺h2A2和scFv保护和减轻辐射GI综合征的致死作用。如图13所示，抗神经酰胺scFv保护小鼠免于致死性急性移植物抗宿主病。如图14所示，抗神经酰胺scFv在致死性急性移植物抗宿主病期间保护小鼠肠干细胞。如图15所示，抗神经酰胺h2A2和scFv增加了CD4+和CD8+淋巴细胞在肠系膜淋巴结内的保留(图15)。
以上描述是为了教导本领域普通技术人员如何实施本发明，并且其并非意欲在阅读说明书时，详细说明所有那些对本领域技术人员而言显而易见的明显修改和变化。然而，所有这些明显的修改和变化旨在包括在由所附权利要求限定的本发明的范围内。除非上下文具体指示相反，否则权利要求旨在覆盖以有效满足预期目的的任何顺序的组成和步骤。
Figure IDA0002728259250000011
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Claims (22)

1.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，其中
所述VH包括由序列GYTFTDHTIH (SEQ ID NO: 1)构成的重链可变区CDR1，由序列YNYPRDGSTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 2)构成的重链可变区CDR2，以及由序列GFITTVVPSAY(SEQ ID NO: 3)构成的重链可变区CDR3，并且
所述VL包括由序列RASKSISKYLA (SEQ ID NO: 4)构成的轻链可变区CDR1，由序列SGSTLQS (SEQ ID NO: 5)构成的轻链可变区CDR2，以及由序列QQHNEYPWT (SEQ ID NO: 6)构成的轻链可变区CDR3。
2.一种抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其包含
QVQLQQSDAELVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYNYPRDGSTKYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYFCAKGFITTVVPSAYWGQGTLVTVSA的重链可变区序列，和
DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK的轻链可变区序列。
3.如权利要求1或2所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段选自单克隆抗体、嵌合抗体和scFv。
4.如权利要求3所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段为scFv。
5.如权利要求1或2所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体。
6.如权利要求1或2所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在制备用于在有此需要的受试者中抑制细胞凋亡的药物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段为scFv。
8.如权利要求6或7所述的用途，其中，所述细胞凋亡与选自移植物抗宿主病和放射病的疾病有关。
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述放射病是辐射胃肠综合征。
10.如权利要求8所述的用途，其中，所述疾病是放射病，并且在所述受试者暴露于辐射之前施用所述药物。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述放射病是辐射胃肠综合征。
12.如权利要求8所述的用途，其中，所述疾病是移植物抗宿主病，并且在所述受试者接受移植之前施用所述药物。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述移植是骨髓移植。
14.如权利要求6或7所述的用途，其中，所述药物被配制为静脉内，肌肉内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，滑膜内，鞘内，口服或通过吸入施用。
15.如权利要求6或7所述的用途，其中，所述药物被配制为局部施用。
16.如权利要求8所述的用途，其中，所述疾病是放射病并且在所述受试者暴露于辐射之后施用所述药物。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述放射病是辐射胃肠综合征。
18.如权利要求16所述的用途，其中，在所述受试者暴露于穿透辐射之后，立即施用所述药物。
19.如权利要求16所述的用途，其中，在所述受试者暴露于穿透辐射之后，24小时内施用所述药物。
20.如权利要求1或2所述的抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段在制备用于在患有GvHD的受试者接受移植之前，或在所述受试者接受移植之后但在GvHD发病之前，在所述受试者中抑制细胞凋亡的药物中的用途。
21.如权利要求20所述的用途，其中，所述移植是骨髓移植。
22.如权利要求20所述的用途，其中，所述抗神经酰胺抗体或其抗原结合片段为scFv。
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