ES2643241T3 - Composición medicinal para tratar y/o prevenir el cáncer - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tienen reactividad inmunológica con un polipéptido parcial de CAPRINA-1, que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 5.

Description

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quiméricos. El anticuerpo monoclonal se puede preparar por el cultivo de hibridomas obtenidos por la fusión entre células esplénicas de mamíferos no humanos (por ejemplo, ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, pollos, o conejos) inmunizados con proteínas CAPRINA-1 o un fragmentos de las mismas y células de mieloma. El anticuerpo quimérico es un anticuerpo que se prepara por la combinación de secuencias derivadas de diferentes
5 animales y es, por ejemplo, un anticuerpo compuesto de las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo de ratón y las regiones constantes de cadena pesada y ligera de anticuerpo humano. El anticuerpo se puede preparar utilizando un método conocido en la técnica que implica, por ejemplo, unir los ADN que codifican las regiones V de anticuerpo de ratón con los ADN que codifican las regiones C de anticuerpo humano; incorporando los productos de la unión resultantes en vectores de expresión; e introduciendo los vectores en huéspedes de manera que se produzcan los anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales que tienen reactividad inmunológica con el polipéptido parcial de CAPRINA-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 5 y tiene efecto antitumoral se preparan por un método que se describe posteriormente en los Ejemplos.
15 El anticuerpo humanizado, también llamado anticuerpo humano reformado, es un anticuerpo modificado. El anticuerpo humanizado se construye injertando regiones determinantes de complementariedad de anticuerpo humano con CDR de anticuerpo derivadas de un animal inmunizado. Por lo tanto también se conoce una estrategia general de recombinación genética.
Específicamente, las secuencias de ADN diseñadas para unirse con, por ejemplo, las CDR de anticuerpos de ratón, conejo o pollo, y las regiones marco conservadas humanas (FR) se sintetizan por PCR utilizando varios oligonucleótidos preparados que tienen partes terminales solapadas entre ellas. Los ADN obtenidos se unen con ADN que codifican regiones constantes de anticuerpos humanos. Posteriormente, los productos de unión resultantes
25 se incorporan en vectores de expresión que se introducen entonces en huéspedes para la producción de anticuerpo para obtener el anticuerpo de interés (véase la Publicación de Solicitud de Patente europea Nº EP239400 y la Publicación Internacional Nº WO96/02576).
Las FR de anticuerpo humano conectadas mediante las CDR se seleccionan de manera que las regiones determinantes de complementariedad formen un sitio de unión al antígeno favorable. Si fuera necesario, los aminoácidos de las regiones marco conservadas de las regiones variables de anticuerpo se pueden sustituir de manera que las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo humano reformado resultante forme un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Además, estas FR se pueden sustituir con regiones marco conservadas de anticuerpos humanos de clases o subclases diferentes de las
35 mismas (véase la Publicación Internacional Nº WO99/51743).
Los aminoácidos de las regiones variables (por ejemplo, las FR) o las regiones constantes del anticuerpo quimérico
o el anticuerpo humanizado preparado de esta manera se pueden sustituir, por ejemplo, por otros aminoácidos.
La sustitución de aminoácidos es la sustitución de, por ejemplo menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6
o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos aminoácidos, preferentemente 1 a 5 aminoácidos, más preferentemente 1 o 2 aminoácidos. El anticuerpo sustituido debería ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitución será una sustitución de aminoácidos deseablemente conservadora, que es la sustitución entre aminoácidos con propiedades similares tales como la carga, cadenas laterales, polaridad, y aromaticidad. Los
45 aminoácidos se pueden clasificar en términos de propiedades similares por ejemplo, en: aminoácidos básicos (arginina, lisina, e histidina); aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); aminoácidos polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína, y tirosina); aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina); aminoácidos ramificados (leucina, valina, e isoleucina); y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano, e histidina).
Ejemplos de aminoácidos modificados pueden incluir anticuerpos unidos con distintas moléculas tales como polietilenglicol (PEG). En el anticuerpo modificado de la presente invención, la sustancia que se va a unir no está limitada. Con el fin de obtener dicho anticuerpo modificado, el anticuerpo modificado se puede modificar químicamente. Por lo tanto ya se ha establecido un método en la técnica.
55 En este contexto, la frase “funcionalmente equivalente” significa que el anticuerpo a que se hace referencia tiene una actividad biológica o bioquímica similar a la del anticuerpo de la presente invención, específicamente el anticuerpo al que se hace referencia tiene la función de dañar un tumor y no produce esencialmente reacciones adversas cuando se aplica en seres humanos, por ejemplo. Ejemplos de dicha actividad puede incluir la actividad inhibidora del crecimiento y actividad de unión.
Un método para preparar un polipéptido funcionalmente equivalente a cierto polipéptido, que implica la introducción de una mutación en un polipéptido, es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los expertos en la técnica pueden introducir apropiadamente una mutación en el anticuerpo de la presente invención utilizando la 65 mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., y Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz,
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biespecífico de la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos (I) a (II), por ejemplo, en la forma de (b):
(I) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1, CDR2, y CDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 9, y 14, respectivamente, regiones
5 marco conservadas derivadas de un anticuerpo humanizado o las secuencias de aminoácidos con partes de las mismas sustituidas y una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1, CDR2, y CDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12, y 13, respectivamente, regiones marco conservadas de un anticuerpo humano o secuencias de aminoácidos con partes de las mismas sustituidas; y
(II) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y una región constante de cadena pesada derivada de un anticuerpo humano, y una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 y una región constante de cadena ligera derivada de un anticuerpo humano.
15 Las secuencias de la región constante y variable de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano están disponibles, por ejemplo, en NCBI (EE. UU.; GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, se puede hacer referencia a las secuencias siguientes: Registro Nº J00228 para la región constante de cadena pesada de IgG1 humana; Registro Nº J00230 para una región constante de cadena pesada de IgG2 humana; Registro Nº X03604 para una región constante de cadena pesada de IgG3 humana; Registro Nº K01316 para una región constante de cadena pesada de IgG4 humana; Registros Nº V00557, X64135, X64133, etc. para una región constante κ de cadena ligera humana; y los Registros Nº X64132, X64134, etc. para una región constante λ de cadena ligera humana.
Preferentemente, estos anticuerpos tienen una actividad citotóxica y por eso pueden ejercer un efecto antitumoral.
25 Las secuencias particulares anteriores de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de cada anticuerpo se proporcionan simplemente con el fin de ilustración. Es obvio que el anticuerpo de la presente invención no se limita por las secuencias particulares. Los hibridomas capaces de producir anticuerpos humanos anti-CAPRINA-1 humana o anticuerpo de animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos de ratón) diferentes de los descritos anteriormente, se preparan, y los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas se recuperan y evalúan según se valore que sean (o no sean) los anticuerpos de interés con su actividad de unión inmunológica contra la CAPRINA-1 humana y la actividad citotóxica como índices. Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales de interés se identifican de esta manera. Luego, se producen los ADN que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos de interés a partir de los hibridomas y se secuencian, como se ha descrito anteriormente. Los ADN se utilizan para la preparación de los diferentes anticuerpos.
35 Cada uno de los anticuerpos anteriores pueden tener la sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos, particularmente en la secuencia de la región marco conservada y/o la secuencia de la región constante, siempre que el anticuerpo tenga dicha especificidad que pueda reconocer la CAPRINA-1. En este contexto, el término “varios” significa preferentemente 2 a 5, más preferentemente 2 o 3.
La constante de afinidad Ka (kon/koff) del anticuerpo de la presente invención por una proteína CAPRINA-1 o un fragmento de la misma es preferentemente al menos de 107 M-1, al menos de 108 M-1, al menos de 5 x 108 M-1, al menos de 109 M-1, al menos de 5 x 109 M-1, al menos de 1010 M-1, al menos de 5 x 1010 M-1, al menos de 1011 M-1, al menos de 5 x 1011 M-1, al menos de 1012 M-1, o al menos de 1013 M-1 .
45 El anticuerpo de la presente invención se puede conjugar con un agente antitumoral. La conjugación del anticuerpo con el agente antitumoral se puede llevar a cabo mediante un espaciador que tenga un grupo (por ejemplo, un grupo succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridilditio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, o un grupo hidroxilo) que reacciona con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un grupo tiol, o similares.
Ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos públicamente en las bibliografías, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bullatacina, bullatacinona, camptotecina, briostatina, 55 calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido hidrocloruro de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, calicreamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, 65 floxuridina, andrógenos (por ejemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, y testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glucósido, ácido
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tiene unidos grupos funcionales aceptores de electrones mediante espaciadores tales como el oligoetilenglicol. El anticuerpo de la presente invención se puede hacer reaccionar con la placa y evaluarse en cuanto a su reactividad con el epítopo mediante la reacción con un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, marcado con peroxidasa de rábano rusticano) que se une al anticuerpo de la presente invención, es decir, se puede confirmar el epítopo al
5 que se une el anticuerpo de la presente invención. El epítopo del polipéptido de SEQ ID NO: 5 que se utiliza en la inmovilización en la placa es una secuencia que comprende en ella al menos el epítopo de la secuencia de SEQ ID NO: 5 o una parte modificada del mismo (por ejemplo, con los restos del extremo N o el extremo C modificados con varios aminoácidos arbitrarios o una proteína tal como KLH o un (poli)péptido modificado con una proteína MAP). El anticuerpo de la presente invención solo necesita unirse a cualquiera de estos (poli)péptidos.
Por otra parte, incluso el anticuerpo de la presente invención puede no reaccionar con el polipéptido de SEQ ID NO: 5, es decir, no se puede confirmar el epítopo, en el método anterior. En este caso, el anticuerpo se hace reaccionar con un antígeno en condiciones de solución que faciliten la unión entre el antígeno y el anticuerpo. Después de obtener el complejo antígeno-anticuerpo por un complejo de inmunoprecipitación, se puede separar un polipéptido
15 parcial unido con el anticuerpo y examinar su secuencia de aminoácidos para confirmar el epítopo para el anticuerpo de la presente invención. En este contexto, el antígeno, por ejemplo, es el propio polipéptido de SEQ ID NO: 5 o una parte modificada del mismo. De manera alternativa, se puede utilizar incluso una proteína CAPRINA-1 siempre que el epítopo que reacciona con el anticuerpo de la presente invención se pueda confirmar por el método anterior.
< Efecto antitumoral >
El efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se utiliza en la presente invención sobre las células cancerosas que expresan CAPRINA-1 parece producirse por el siguiente mecanismo: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediada por células efectoras (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento
25 (CDC) contra las células que expresan CAPRINA-1. Sin embargo no se pretende que este mecanismo limite el alcance de la presente invención.
El efecto antitumoral basado en el mecanismo se sabe que se correlaciona con el número de moléculas diana expresadas en la superficie de las células cancerosas con las que se une el anticuerpo (Niwa R., Clinical Cancer Research 2005 Mar 15; 11 (6): 2327-2336). El número de moléculas diana expresadas en la superficie de las células cancerosas se pueden examinar utilizando un kit de ensayo existente capaz de medir el número de moléculas de superficie celular. Específicamente, el número de moléculas diana a las que se une el anticuerpo se puede determinar por: haciendo reaccionar anticuerpos primarios tales como los anticuerpos contra las moléculas diana con células cancerosas; hacer reaccionar estos con anticuerpos marcados fluorescentemente contra los anticuerpos
35 primarios junto con perlas con un número de moléculas conocido para una curva de calibración; y midiendo la intensidad de fluorescencia media de las muestras para obtener una curva de calibración.
Por lo tanto, el anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se utiliza en la presente invención se puede evaluar en cuanto a su actividad, como se muestra específicamente en los Ejemplos posteriores, ensayando la actividad ADCC o CDC contra las células cancerosas que expresan CAPRINA-1 ex vivo o examinando el número de moléculas de CAPRINA-1 que se expresan en la superficie de las células cancerosas utilizando el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de acuerdo con la presente invención como anticuerpo primario.
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se utiliza en la presente invención se una a una proteína CAPRINA-1 en las
45 células cancerosas y presenta un efecto antitumoral mediante la actividad. Por lo tanto, el anticuerpo anti-CAPRINA1 de la presente invención presumiblemente es útil en el tratamiento o prevención del cáncer. Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención del cáncer, que comprende el anticuerpo anti-CAPRINA-1 como principio activo. El anticuerpo anti-CAPRINA-1 que se utiliza con el fin de la administración a cuerpos humanos (terapia con anticuerpo) preferentemente es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.
Un anticuerpo anti-CAPRINA-1 con mayor afinidad de unión por una proteína CAPRINA-1 en la superficie de células cancerosas ejerce una actividad antitumoral más fuerte. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente invención tiene alta afinidad de unión para la proteína CAPRINA-1 y por lo tanto puede esperarse que tenga un efecto antitumoral más
55 fuerte. En consecuencia, el anticuerpo de la presente invención es adaptable a una composición farmacéutica que se pretende para el tratamiento y/o prevención del cáncer. Dicha alta afinidad de unión del anticuerpo de la presente invención es preferentemente al menos de M-1, al menos de 108 M-1, al menos de 5 3 108 M-1, al menos de 109 M-1 , al menos de 5 3 109 M-1, al menos de 1010 M-1, al menos de 5 3 1010 M-1, al menos de 1011 M-1, al menos de 5 3 1011 M-1, al menos de 1012 M -1, o al menos de 1013 M -1, en términos de una constante de asociación (constante de afinidad) Ka (kon/koff), como se ha descrito anteriormente.
El anticuerpo anti-CAPRINA-1 se une a un gran número de moléculas de CAPRINA-1 en la superficie de células cancerosas produce una actividad antitumoral más fuerte. Deseablemente, el número de moléculas de CAPRINA-1 en un ensayo que utiliza el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de la presente invención es 104 o más, preferentemente 105 65 o más, por célula cancerosa a los cuales se une el anticuerpo según las expectativas del efecto antitumoral. El tumor (células cancerosas) que tienen un gran número de moléculas de CAPRINA-1 en la superficie celular es
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Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) codificadas por el ADN que tiene estas secuencias sirven como regiones que determinan la especificidad del anticuerpo. Las secuencias que codifican las toras regiones (es decir, regiones constantes y regiones marco conservadas) del anticuerpo por lo tanto pueden ser secuencias derivadas de otros anticuerpos. En este contexto, “otros anticuerpos” incluye también anticuerpos derivados de
5 organismos no humanos y son preferentemente los derivados de seres humanos desde el punto de vista de reducir las reacciones adversas. Específicamente, en el ADN descrito anteriormente, las regiones que codifican cada región marco conservada y cada región constante en las cadenas pesada y ligera comprenden preferentemente secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes derivadas de un anticuerpo humano o un derivado del mismo con una sustitución parcial de aminoácidos.
Ejemplos adicionales del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención incluye un ADN que codifica una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, y un ADN que codifica la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en el caso del anticuerpo (b).
15 En este contexto, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, por ejemplo, es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, por ejemplo, es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 17. Cuando dicho ADN comprende una región que codifica cada región constante de cadena pesada y ligera, esta región comprende preferentemente una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano (la secuencia de aminoácidos de cada región constante de la cadena pesada y ligera).
Estos ADN de anticuerpo se pueden obtener por ejemplo, por los métodos descritos anteriormente o el siguiente método: primero, se preparan los ARN totales a partir de hibridomas que producen el anticuerpo de la presente invención utilizando un kit de extracción de ARN disponible en el mercado, y se sintetizan los ADNc utilizando una
25 transcriptasa inversa y cebadores aleatorios o similares. Posteriormente, los ADNc que codifican la región variable se amplifican por PCR utilizando cebadores de oligonucleótido para las secuencias conservadas de cada región variable en genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo de conejo. Las secuencias que codifican las regiones constantes se pueden obtener por la amplificación por PCR de secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos del ADN se puede incorporar en un plásmido o un fago por secuenciación, por ejemplo, y se determina de acuerdo con un método de rutina.
La presente invención proporciona adicionalmente los siguientes polipéptidos y ADN relacionados con el anticuerpo
(a) o (i):
35 (i) un polipéptido que se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 52 y 54, SEQ ID NO: 16 y 18, SEQ ID NO: 21 y 23, SEQ ID NO: 25 y 23, SEQ ID NO: 29 y 33, SEQ ID NO: 39 y 43, y SEQ ID NO: 49 y 43, y un ADN que codifica el polipéptido;
(ii) un polipéptido CDR de cadena pesada que se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 8, 9, y 10, SEQ ID NO: 8, 9, y 14, SEQ ID NO: 26, 27, y 28, SEQ ID NO: 36, 37, y 38, y SEQ ID NO: 46, 47, y 48, y un ADN que codifica el polipéptido; y
(iii) un polipéptido CDR de cadena ligera que se selecciona de entre el grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 11, 12, y 13, SEQ ID NO: 30, 31, y 32, y SEQ ID NO: 40, 41, y 42, y un ADN que codifican el polipéptido.
45 Estos polipéptidos y ADN se pueden preparar utilizando técnicas de recombinación genética como se ha descrito anteriormente.
< Sumario de la presente invención >
Los aspectos de la presente invención descritos anteriormente se resumen a continuación.
(1) Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tienen una reactividad inmunológica con un polipéptido parcial de CAPRINA-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 5.
(2) El anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con (1), en donde el anticuerpo o un fragmento del 55 mismo tiene actividad citotóxica contra células cancerosas que expresan una proteína CAPRINA-1.
(3)
El anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con (1) o (2), en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal.
(4)
El anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (3), en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena sencilla, o una anticuerpo multiespecífico.
(5)
El anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (4), en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo comprenden una región variable de cadena pesada que comprende regiones determinantes de complementariedad que consisten en SEQ ID NO: 8, 9 y 10 (CDR1, CDR2, y CDR3, respectivamente) y una región variable de cadena ligera que comprende regiones determinantes de
65 complementariedad que consisten en SEQ ID NO: 11, 12, y 13 (CDR1, CDR2, y CDR3, respectivamente) y tienen una reactividad inmunológica con la proteína CAPRINA-1.
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Ejemplos
De aquí en adelante, la presente invención se describirá más específicamente en referencia a Ejemplos. Sin embargo, no se tiene la intención de que el alcance de la presente invención se limite a estos ejemplos específicos. 5
Ejemplo 1 Análisis de expresión de CAPRINA-1 en cada tejido
Se examinó la expresión del gen de CAPRINA-1 en tejidos caninos y humanos normales y distintas líneas celulares mediante RT-PCR de acuerdo con el Ejemplo 1 (4) del documento WO2010/016526. Como resultado, se vio una fuerte expresión en los testículos entre los tejidos caninos sanos, mientras que la expresión se vio tejidos de cáncer de mama canino, y adenocarcinomas. Como resultado de la confirmación de la expresión también en tejidos humanos, se confirmó la expresión solo en los testículos entre los tejidos normales, como con el gen de CAPRINA-1 canina. Por el contrario, la expresión se detectó en muchos tipos de líneas celulares de cáncer, incluyendo 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, y
15 MRK-nu-1) y 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, y BxPc-3), entre las líneas cancerosas. Estos resultados demostraban que la CAPRINA-1 se expresa en líneas celulares de cáncer de mama y líneas celulares de cáncer pancreático, aunque su expresión no se ve en tejidos normales distintos de los testículos.
Ejemplo 2 Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón contra CAPRINA-1
(1) Preparación de anticuerpo anti-CAPRINA-1 nº 1 de ratón
Se mezclaron 100 mg de una proteína CAPRINA-1 humana que tenía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 como se prepara en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 con una cantidad igual de adyuvante MPL+TDM 25 (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.). Esta mezcla se utilizó como solución de antígeno para ratón. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada ratón Balb/c de 6 semanas de edad (fabricado por Japan SLC, Inc.). Después, se llevaron a cabo 7 refuerzos cada semana para completar la inmunización. Tres días después de la última inyección se extirpó el bazo de cada ratón y se trituró entre dos portaobjetos de cristal esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y la retirada del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron tres veces para obtener las células esplénicas. Las células esplénicas obtenidas se mezclaron con células de mieloma de ratón SP2/0 (adquiridas en la ATCC) a una relación de 10:1. Se calentaron 200 µl de un medio RPMI1640 que contenía un 10 % de FBS a 37 C y se mezcló con 800 µl de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH), y la solución de PEG preparada de esta manera se añadió a la mezcla celular, que se dejó en reposo durante 5 minutos para la fusión celular. Tras retirar el
35 sobrenadante por centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 150 ml de un medio RPMI1640 que contenía un 15 % de FBS suplementado con un 2 % equivalente de una solución HAT (fabricada por Life Technologies, Inc. /Gibco) (Medio selectivo HAT). Esta suspensión se inoculó en quince placas de 96 pocillos (fabricadas por Thermo Fisher Scientific Inc. /Nunc) a una concentración de 100 µl/pocillo. Las células esplénicas y las células de mieloma se fusionaron mediante cultivo a 37 C durante 7 días en condiciones de un 5 % de CO2 para obtener los hibridomas.
Los hibridomas se exploraron en cuanto a afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra las proteínas CAPRINA-1 como índice. Se añadió una solución de 1 µg/ml de las proteínas CAPRINA-1 preparada según la estrategia descrita en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 a una placa de 96 pocillos a una 45 concentración de 100 µl/pocillo y se dejó en reposo a 4 C durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de seroalbúmina bovina (BSA) (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) a la misma a una concentración de 400 µl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución de cada pocillo se desechó y se lavó tres veces cada pocillo con 400 µl de PBS-T. Después, el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente se añadió a los mismos a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después se añadieron anticuerpos anti-IgG de ratón (H+L) marcados con HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) se diluyeron 5000 veces con PBS a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después se añadió una solución de sustrato TMB a la misma (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó reposar durante
55 15 a 30 minutos para producir la reacción del color. Tras el desarrollo del color, la reacción se finalizó por la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 µl/pocillo. Se midió la absorbancia a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrofotómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que producen anticuerpos que tenían alta absorbancia.
Los hibridomas seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a una densidad de 0,5 células/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana más tarde, los hibridomas que formaban colonias únicas en los pocillos se observaron. Las células de estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se exploraron en cuanto a la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas contra las proteínas CAPRINA-1 como índice. Se añadió 1 µg/ml de solución de las proteínas CAPRINA-1 preparadas mediante la estrategia descrita 65 en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 a una placa de 96 pocillos a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó en reposo a 4 C durante 18 horas, Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una
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Los fragmentos amplificados de los genes que codifican la región variable se obtuvieron a partir de los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de ratón nº 1, nº 2 y nº 3 que se obtuvieron en los ejemplos 2 (1) y 2 (3) y se analizaron en cuanto a sus secuencias genéticas y secuencias de aminoácidos de los mismos de acuerdo con el método descrito en el 5 Ejemplo 5 del documento WO2010/016526. La secuencia genética resultante que codificaba la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 1 se muestra en SEQ ID NO: 34, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 29. La secuencia genética que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 1 también se muestra en SEQ ID NO: 35, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 33. La secuencia genética resultante que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 2 se muestra en SEQ ID NO: 44, y la secuencia de aminoácido de la misma se muestra en SEQ ID NO: 39. La secuencia genética que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CARPINA-1 de ratón nº 2 se muestra en SEQ ID NO: 45, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 43. La secuencia genética resultante que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 3 se muestra adicionalmente en SEQ ID NO:
15 50, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 49. La secuencia genética que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 3 se muestra en SEQ ID NO: 45, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en SEQ ID NO: 43.
Específicamente, se confirmó que el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 1 comprende una región variable de cadena pesada consiste en SEQ ID NO: 29 y una región variable de cadena ligera consiste en SEQ ID NO: 33, en las que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 27, y 28, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, 31, y 32, respectivamente. Se confirmó también que el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 2 comprende una región variable de cadena pesada
25 de SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 43, en las que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 37, y 38, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, 41, y 42, respectivamente. Se confirmó adicionalmente que el anticuerpo anti-CAPRINA-1 de ratón nº 3 comprende una región variable de cadena pesada que consisten en SEQ ID NO: 49 y una región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 43, en las que las CDR1, CDR2, y CDR3, de la región variable de cadena pesada consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, 47, y 48, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, 41, y 42, respectivamente.
35 Ejemplo 3 Preparación de un anticuerpo policlonal contra un polipéptido parcial de CAPRINA-1 presente en la superficie de células cancerosas
Con el objetivo de obtener anticuerpos policlonales contra los polipéptidos parciales de CAPRINA-1 presentes en la superficie de las células cancerosas, un polipéptido (péptido derivado de CAPRINA-1 que se muestra en SEQ ID NO: 5) que comprende la región del epítopo para el anticuerpo anti-CAPRINA-1 nº 1 que se obtiene en el Ejemplo 1 (1), se sintetizaron un polipéptido que tenía una región de restos de aminoácidos de número 50 a 98 en la secuencia de aminoácidos de CAPRINA-1 humana de SEQ ID NO: 2, y un polipéptido que tiene la región de restos de aminoácidos de número 233 a 305 de SEQ ID NO: 2. Se mezcló un mg de cada uno de estos péptidos como un antígeno con un volumen igual de una solución de adyuvante incompleto de Freund (IFA). Esta mezcla se administró
45 por vía subcutánea a cada conejo cuatro veces cada dos semanas. Después, se recolectó sangre para obtener el antisuero que contenía cada anticuerpo policlonal. El antisuero se purificó adicionalmente utilizando una proteína G portadora (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.) y se sustituyó con PBS para obtener los anticuerpos policlonales contra los polipéptidos parciales de CAPRINA-1 presentes en la superficie de células cancerosas. Además, se purificó el suero de un conejo que no recibió antígeno utilizando una proteína G portadora de la misma manera que anteriormente y se utilizó como anticuerpos de control.
Ejemplo 4 Análisis de la expresión de proteína CAPRINA-1 en la superficie de la membrana de células cancerosas utilizando anticuerpos policlonales contra polipéptidos parciales de CAPRINA-1
55 A continuación, se examinaron 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, y MRK-nu-1) de las que se había confirmado que tenían un gran nivel de expresión genética de CAPRINA-1 en cuanto a su expresión de proteínas CAPRINA-1 en la superficie celular. Se centrifugaron 5 x 105 células de cada línea celular de cáncer de mama humano confirmado de esta manera que tenían expresión genética en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadieron 2 mg (5 µl) de cada uno de los anticuerpos policlonales contra péptidos derivados de CAPRINA-1 (SEQ ID NO: 5) preparados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3 y 95 µl de PBS que contenía un 0,1 % de suero fetal bovino y se mezclaron, y se dejaron en reposo durante 1 hora en hielo. Después del lavado con PBS, la solución resultante se mezcló añadiendo 1 µl de anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo marcado con Alexa 488 (fabricados por Invitrogen Corp.) y 98 µl de PBS que contenía un 0,1 % de suero fetal bovino (FBS) y se dejó en reposo durante 30 horas en hielo. Tras el
65 lavado con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando FACScalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otra parte, se llevó a cabo la misma operación anterior utilizando los anticuerpos de control que se prepararon
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derivados del ratón descritos en el documento WO2010/016526 [un anticuerpo comparativo 1 que tiene una región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 26 (lo que se describe en dicho documento; se mantiene como cierto para la descripción posterior) y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 27; un anticuerpo comparativo 2 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 28 y la región 5 variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 29; un anticuerpo comparativo 3 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 30 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 31; un anticuerpo comparativo 4 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 32 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 33; un anticuerpo comparativo 5 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 34 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 35; un anticuerpo comparativo 6 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 36 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 37; un anticuerpo comparativo 7 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 38 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 39; un anticuerpo comparativo 8 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 40 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 41; un anticuerpo 15 comparativo 9 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 42 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 43; un anticuerpo comparativo 10 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 44 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 45; y un anticuerpo comparativo 11 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 46 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 47], anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 descritos en el documento WO2011/096517 [un anticuerpo comparativo 12 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 43 (lo que se describe en dicho documento; se mantiene como cierto para la descripción posterior) y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 47; y un anticuerpo comparativo 13 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO, anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 descritos en el documento WO2011/096528 [un 25 anticuerpo comparativo 14 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 43 (lo que se describe en dicho documento; se mantiene como cierto para la descripción posterior) y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 47; un anticuerpo comparativo 15 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 51 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 55; un anticuerpo comparativo 16 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 59 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 63; un anticuerpo comparativo 17 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 76 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 80; un anticuerpo comparativo 18 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 84 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 88; y un anticuerpo comparativo 19 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 92 y la región variable de cadena ligera que consiste en 35 SEQ ID NO: 96], un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 descrito en el documento WO2011/096519 [un anticuerpo comparativo 20 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 42 (lo que se describe en dicho documento; se mantiene como cierto para la descripción posterior) y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 46], anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 descritos en el documento WO2011/096533 [un anticuerpo comparativo 21 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 43 (lo que se describe en dicho documento; se mantiene como cierto para la descripción posterior) y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 51; un anticuerpo comparativo 22 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 47 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 51; y un anticuerpo comparativo 23 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 63 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 67], anticuerpos monoclonales anti
45 CAPRINA-1 descritos en el documento WO2011/096534 [un anticuerpo comparativo 24 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 43 (lo que se describe en dicho documento; se mantiene como cierto para la descripción posterior) y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 47; un anticuerpo comparativo 25 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 43 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 51; y un anticuerpo comparativo 26 que tiene la región variable de cadena pesada que consiste en SEQ ID NO: 63 y la región variable de cadena ligera que consiste en SEQ ID NO: 67]. Cada línea celular preparada se cultivó durante 5 días en matraces de 150 cm2 a una densidad de 5 x 105 células/ml utilizando 30 ml de medio OptiCHO libre de suero (fabricado por Invitrogen Corp.) para obtener los sobrenadantes de los cultivos que contengan cualquiera de los anticuerpos monoclonales quiméricos humanos-de ratón comparativos 1-26.
55 Ejemplo 6 Evaluación de la expresión de CAPRINA-1 en la superficie de distintas células cancerosas utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1
A continuación, se examinaron 8 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, y MRK-nu-1), las 2 líneas celulares de cáncer de riñón (Caki-1 y Caki-2), la línea celular de cáncer de vejiga urinaria (T24), la línea celular de cáncer ovárico (SKOV3), las 2 líneas celulares de cáncer de pulmón (QG56 y A549), la línea celular de cáncer de próstata (PC3), la línea celular de cáncer de cuello uterino (SW756), la línea celular de fibrosarcoma (HT1080), las 2 líneas celulares de tumor cerebral (T98G y U87MG), la línea celular de cáncer gástrico (MNK28), las 3 líneas celulares de cáncer de intestino grueso (Lovo, 65 DLD-1, y HCT-116), y las 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, y BxPC-3) de las que se había confirmado que tenían expresión genética de CAPRINA-1 en cuanto a su expresión de proteínas
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Ejemplo 8 El número de moléculas de CAPRINA-1 en la superficie de distintas células cancerosas reconocidas por el anticuerpo anti-CAPRINA-1 nº 1
Se examinaron una línea celular de cáncer de mama humano (MDA-MB-231V), una línea celular de cáncer de riñón
5 (Caki-1), una línea celular de cáncer de vejiga urinaria (T24), una línea celular de cáncer ovárico (SKOV3), líneas celulares de cáncer de pulmón (QC56 y A549), una línea celular de cáncer pancreático (Capan-2), una línea celular de cáncer de próstata (PC3), una línea celular de cáncer de cuello uterino (SW756), una línea celular de fibrosarcoma (HT1080), una línea celular de tumor cerebral (T98G), una línea celular gástrica (MKN28), líneas celulares de cáncer de intestino grueso (Lovo y DLD-1), una línea celular de leucemia (AML5), y una línea celular de linfoma (Ramos) utilizando un kit “QIFIKIT” de número de moléculas (fabricado por Dako Japan Inc.) en cuanto al número de moléculas de CAPRINA-1 sobre su superficie celular reconocidas por los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de ratón nº 1, nº 2 y nº 3. De manera similar, el número de CAPRINA-1 de la superficie de estas distintas células de cáncer también se examinaron utilizando los anticuerpos monoclonales anti-CAPRINA-1 comparativos 1 a 26 preparados en el Ejemplo 5.
15 De acuerdo con el protocolo adjunto al kit, cada anticuerpo (anticuerpos anti-CAPRINA-1 nº 1 y anticuerpos comparativos 1 a 26) se diluyó en 5 µg/ml (en términos de concentración final) con PBS, y esta dilución se añadió a cada línea celular y se dejó reaccionar durante 30 minutos. Tras el lavado con PBS, se añadieron anticuerpos anti-IgG de ratón marcado fluorescentemente adjunto en el kit, a cada línea celular y se dejó en reposo durante 45 minutos en hielo. Cada línea celular y las perlas de calibración se lavaron con PBS. Después, se midió la intensidad de fluorescencia utilizando un FACScalibur (Becton, Dickinson and Company), para obtener un valor (medio) de intensidad de fluorescencia media. También se obtuvo un valor (medio) de intensidad de fluorescencia media por el mismo ensayo anterior para los anticuerpos comparativos. El control negativo que se utilizó eran células que se hacían reaccionar con anticuerpos de isotipo de control, y también se obtuvo una media. Cada valor (medio) de
25 intensidad de fluorescencia media se utilizó para calcular el número de moléculas de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Como resultado, el número de moléculas de CAPRINA-1 de la superficie de distintas células cancerosas reconocidas por los anticuerpos anti-CAPRINA-1 de ratón nº 1, nº 2 y nº 3 y los anticuerpos comparativos 12 a 26 eran 105 o más por células para todas las líneas celulares de cáncer humano examinadas. Por otra parte, el número de moléculas reconocidas por los anticuerpos comparativos 1 a 11 era menor de 105 por célula.
Ejemplo 9 Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 utilizando conejos
(1) Preparación de anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo
35 Se mezclaron 300 mg de una proteína antigénica (proteína CAPRINA-1 humana) con una cantidad igual de adyuvante completo de Freund. Esta mezcla se utilizó como una solución de antígeno por conejo. Una mezcla del antígeno con el adyuvante incompleto de Freund se utilizó para los refuerzos. La solución de antígeno se administró por vía intraperitoneal a cada conejo de 7 semanas de edad. Después, se llevaron a cabo 7 refuerzos cada 4 semanas para completar la inmunización. Cuatro días después de la última inyección se extirpó el bazo de cada conejo y se trituró entre dos portaobjetos de cristal esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y retirada del sobrenadante por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos se repitieron 3 veces para obtener las células esplénicas. Las células esplénicas obtenidas se mezclaron con células de mieloma de conejo a una relación de 5:1. Se calentaron 200 µl de medio IMDM que contenía un 10 %
45 deFBS a37 C y se mezcló con 800 µl de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH), y la solución de PEG preparada de esta manera se añadió a la mezcla celular, que se dejó en reposo entonces durante 5 minutos para la fusión celular. Tras retirar el sobrenadante por centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos, las células se suspendieron en 300 ml de un medio IMDM que contenía un 10 % de FBS suplementado con un 2 % equivalente de una solución HAT (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc. /Nunc) a una concentración de 100 µl/pocillo. Las células esplénicas y las células de mieloma de conejo se fusionaron por cultivo a 37 C durante 7 días en condiciones de un 5 % de CO2 para obtener los hibridomas.
Los hibridomas preparados se exploraron en cuanto a la reactividad de los anticuerpos producidos por los hibridomas con las proteínas CAPRINA-1 como índice. Se añadió una solución de proteína CAPRINA-1 1 µg/ml a
55 una placa de 96 pocillos a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó en reposo durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió un 0,5 % de solución de seroalbúmina bovina (BSA) (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) a una concentración de 400 µl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución en cada pocillo se desechó, y cada pocillo se lavó tres veces con 400 µl de PBS-T. Después, el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente se añadió a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después se añadieron anticuerpos anti-conejo marcado con HRP diluido 5000 veces con PBS a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T. Después, se añadió una solución de sustrato TMB (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.) a una concentración de 100 µl/pocillo y se dejó en reposo durante 15 a 30 minutos para producir la reacción de color. Tras el desarrollo
65 del color, la reacción se finalizó con la adición de ácido sulfúrico 1 N a una concentración de 100 µl/pocillo. La absorbancia se midió a 450 nm y 595 nm utilizando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se
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documento WO2010/016526. Específicamente, se extrajo el ARNm del hibridoma que producía el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo nº 1. Se obtuvieron los genes de la región variable de cadena pesada (HV) y la región variable de cadena ligera (VL) de este anticuerpo se obtuvieron por RT-PCR utilizando cebadores específicos delas secuencias variables de conejo. Para la secuenciación, los genes se clonaron en vectores pCR2.1
5 (fabricados por Invitrogen Corp.). Las secuencias genéticas de las regiones VH y VL de cada plásmido que se obtuvieron por clonación se determinaron cada uno utilizando un cebador directo M13 y un cebador inverso M13, y un secuenciador de fluorescencia.
Como resultado, se confirmó que el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo nº 1 comprende una región variable de cadena pesada que se muestra en SEQ ID NO: 52, en el que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena pesada consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que se muestra en SEQ ID NO: 54, en el que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12, y 13, respectivamente.
15
(2) Preparación del anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humano-de conejo nº 1
Un gen que se muestra en SEQ ID NO: 51 para la expresión de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo nº 1 que se obtuvo anteriormente y un gen que se muestra en SEQ ID NO: 53 para la expresión de la región variable de cadena ligera del mismo se insertaron en un vector para la expresión en células de mamífero que tenían un gen insertado de una región constante de cadena pesada de IgG1 humana y un vector para la expresión en células de mamífero que tenía un gen insertado de una región constante de cadena ligera de IgG1 humana, respectivamente. Estos dos vectores de expresión recombinantes preparados se introdujeron en células de mamífero de acuerdo con un método de rutina para obtener un sobrenadante de cultivo
25 que contenía un anticuerpo de conejo anti-CAPRINA-1 humanizado (anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humanode conejo nº 1).
(3) Especificidad, reactividad con células cancerosas, y actividad antitumoral del anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humano-de conejo nº 1
El sobrenadante del cultivo del anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humano-de conejo nº 1 obtenido en el Ejemplo 9 (2) se purificó de acuerdo con un método de rutina utilizando una Sepharose FF Hitrap Proteína A (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Tras la sustitución con PBS (-), la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 mm (fabricado por Millipore Corp.) y entonces se evaluó en cuanto a su especificidad de antígeno, reactividad con
35 células cancerosas, y efecto antitumoral.
En primer lugar, el anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humano-de conejo nº 1 se examinó en cuento a su reactividad con las proteínas CAPRINA-1 y un polipéptido que tenía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 como epítopo para el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo nº 1. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humano de conejo nº 1 tenía especificidad de reacción con la proteína CAPRINA-1 y el polipéptido que tenía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, como con el anticuerpo monoclonal anti-CAPRINA-1 de conejo nº 1.
A continuación, se examinó el anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humano-de conejo nº 1 respecto a su
45 reactividad con las proteínas CAPRINA-1 de la superficie de las 9 líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231, MRK-nu-1 y MDA-MB-468), las 3 líneas celulares de cáncer de riñón (Caki-1, Caki-2 y ACHN), la línea celular de cáncer de vejiga urinaria (T24), las 3 líneas celular de cáncer ovárico (SKOV3, IGROV1, y OVCAR3), las 2 líneas celulares de cáncer de pulmón (QG56 y A549), las líneas celulares de cáncer de próstata (PC3 y DU-145), la línea celular de cáncer de cuello uterino (SW756), la línea celular de fibrosarcoma (HT1080), las 2 líneas celulares de tumor cerebral (T98G y U87MG), la línea celular de cáncer gástrico (MNK28), las 3 líneas celulares de cáncer de intestino grueso (Lovo, DLD-1, y HCT116), las 4 líneas celulares de cáncer pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, y BxPC-3), la línea celular de leucemia AML5, y la línea celular de linfoma Ramos de las que se había confirmado que tenían expresión genética de CAPRINA-1. Se centrifugaron 106 células de cada línea celular en cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cada
55 sobrenadante del cultivo (100 µl) que contenía el anticuerpo se añadió al tubo y se dejó en reposo durante 1 hora en hielo. Tras el lavado con PBS, se añadieron los anticuerpos de cabra anti-IgG (H+L) humana marcados con Alexa 488 (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 100 veces con PBS que contenía un 0,1 % de FBS y se dejaron en reposo a 4 C durante 60 minutos. Tras el lavado con PBS (-), se midió la intensidad de fluorescencia utilizando FACScalibur (Becton, Dickinson and Company). El control negativo que se utilizó eran las células que se hacían reaccionar solo con los anticuerpos secundarios. Como resultado, el anticuerpo quimérico anti-CAPRINA-1 humanode conejo nº 1 presentaba reactividad con una intensidad de fluorescencia al menos un 30 % más fuerte que la del control negativo. Esto demostraba que una parte de la proteína CAPRINA-1 que se muestra en SEQ ID NO: 5 se expresaba en la superficie de la membrana celular de las líneas celulares de cánceres humanos. La tasa anterior de aumento de intensidad de fluorescencia se indicaba por la tasa de aumento en la intensidad de fluorescencia media
65 (MFI) en cada línea celular y se calculó de acuerdo con la siguiente expresión: Tasa de incremento en la intensidad de fluorescencia media (Tasa de aumento de intensidad de fluorescencia (%) = ((MFI de células que reaccionan con
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