PT2740796T - Composição farmacêutica para o tratamento e/ou profilaxia de cancro - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO E/OU PROFILAXIA

DE CANCRO

Campo da técnica A presente invenção refere-se a uma utilização inovadora de um anticorpo contra CAPRIN-1 ou um fragmento do mesmo num fármaco como um agente terapêutico e/ou preventivo para o cancro. Técnica anterior 0 cancro é a causa principal de morte. Esta doença é atualmente tratada principalmente por terapêutica cirúrgica, em combinação com terapêutica de radiação e/ou quimioterapia. Apesar de desenvolvimentos recentes de técnicas cirúrgicas inovadoras ou da descoberta de agente anticancro inovadores, o tratamento existente para o cancro tem um resultado insuficientemente melhorado, exceto para alguns tipos de cancro. Com os avanços recentes da biologia molecular ou imunologia de cancro, foram identificados anticorpos que reagem especificamente com o cancro, antigénios de cancro que são reconhecidos por células T citotóxicas, genes que codificam tais antigénios de cancro e semelhantes, aumentando as expetativas sobre a terapêutica específica contra o cancro direcionada aos antigénios do cancro (literatura de não patente 1).

Para reduzir as reações adversas da terapêutica do cancro, é desejável que péptidos, polipéptidos ou proteínas reconhecidos como antigénios do cancro devam existir de forma rara nas células normais e existir especificamente nas células de cancro. Em 1991, Boon et al, (Ludwig Institute for Cancer Research, Bélgica) isolaram um antigénio MAGE1 de melanoma humano reconhecido por células T CD8-positivas através de um método de clonagem de expressão de ADNc utilizando linhas celulares de cancro autólogas e células T reativas com cancro (Literatura de não patente 2) . Posteriormente, foi relatado um método SEREX (identificação sorológica de antigénios através de clonagem de expressão recombinante) , que adota uma abordagem de clonagem de expressão génica para identificar antigénios tumorais reconhecidos por anticorpos produzidos em resposta a cancro autólogo in vivo num paciente com cancro (Literatura de não patente 3 e Literatura de patente 1) . De acordo com este método, foram isolados alguns antigénios de cancro que são raramente expressos nas células normais e são especificamente expressos no cancro (Literaturas de não patente 4 a 9) . Adicionalmente, a terapêutica celular utilizando imunócitos que reagem especificamente com antigénios de cancro ou a imunoterapia específica de cancro utilizando vacinas ou semelhantes que compreendem antigénios de cancro, está sob ensaios clínicos direcionando alguns dos antigénios de cancro isolados.

Nos últimos anos, emergiram no mundo vários fármacos de anticorpos para o tratamento de cancro direcionados a proteínas antigénicas ou células cancerosas. Estes fármacos receberam atenção devido à sua certa eficácia como agentes terapêuticos específicos de cancro. Uma grande maioria de proteínas antigénicas alvo dos fármacos, contudo, são também expressas em células normais. Como um resultado da administração dos anticorpos, as células cancerosas, bem como células normais que expressam os antigénios, são danificadas, resultando de forma desvantajosa em reações adversas. Consequentemente, se for possível identificar os antigénios de cancro especificamente expressos na superfície das células cancerosas e se os anticorpos direcionados aos antigénios puderem ser utilizados como fármacos, pode ser esperado que estes fármacos de anticorpos alcancem o tratamento com menos reações adversas. A proteína 1 citoplasmática e associada com a proliferação (CAPRIN-1) tem sido conhecida como uma proteína intracelular que é expressa após ativação ou divisão celular de células normais em repouso e forma grânulos de stress citoplasmáticos com ARNs em células para participar na regulação do transporte e tradução de ARNm. Verificou-se que esta proteína é especificamente expressa na superfície das células cancerosas e está, portanto, sob estudo como um alvo de fármacos de anticorpos para o tratamento do cancro (Literatura de patente 2).

Lista de citações Literatura de patente

Literatura de patente 1: documento de patente U.S. N.0 5698396

Literatura de patente 2: W02010/016526 Literatura de não patente

Literatura de não patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese

Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Vol. 24, p. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy

Publishers Inc., Japão)

Literatura de não patente 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Literatura de não patente 3: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Literatura de não patente 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

Literatura de não patente 5: Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998)

Literatura de não patente 6: Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998)

Literatura de não patente 7: Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999)

Literatura de não patente 8: Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996)

Literatura de não patente 9: Hum. Mol. Genet. 6:33-39 (1997)

Sumário da invenção Problema técnico

Um objeto da presente invenção consiste em produzir um anticorpo direcionado a CAPRIN-1 expresso especificamente na superfície de células cancerosas e que tem uma melhor atividade antitumoral do que os anticorpos convencionais, e proporcionar o anticorpo para utilização como um agente terapêutico e/ou preventivo para o cancro.

Solução ao problema A presente invenção tem os seguintes aspetos: A presente invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com um polipéptido CAPRIN-1 parcial que tem a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo como um ingrediente ativo, e uma combinação farmacêutica conforme definida nas reivindicações. A invenção também proporciona a dita composição farmacêutica e a dita combinação farmacêutica, cada uma para utilização num método para tratar e/ou prevenir cancro.

Numa forma de realização da presente invenção, o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro colorretal, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

Noutra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

Numa forma de realização alternativa, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples, ou um anticorpo multiespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico). Efeitos vantajosos da invenção 0 anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção danifica as células cancerosas. Consequentemente, o anticorpo contra CAPRIN-1 é útil no tratamento e/ou prevenção do cancro.

Descrição das formas de realização 0 anticorpo de acordo com a presente invenção é um anticorpo que reconhece e se liga a um polipéptido parcial predeterminado de CAPRIN-1 e tem atividade antitumoral. 0 anticorpo de acordo com a presente invenção é mais especificamente um anticorpo que reconhece (ou seja, tem reatividade imunológica com) um polipéptido parcial de uma proteína CAPRIN-1 (polipéptido de CAPRIN-1 parcial) que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5. A presente invenção revelou que este anticorpo exibe atividade antitumoral. A presente invenção refere-se a todos os anticorpos que se ligam aos fragmentos das proteínas CAPRIN-1 como descrito acima e que exibem atividade antitumoral. 0 anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo que pode exercer atividade antitumoral e inclui, por exemplo, anticorpos recombinantes, por exemplo, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos humanos e os seus fragmentos de anticorpos, por exemplo, Fab, F (ab' ) 2 e Fv. Estes anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser preparados por métodos conhecidos para os peritos na especialidade. Desejavelmente, o anticorpo de acordo com a presente invenção tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 ou um polipéptido parcial da mesma, ou seja, liga-se à proteína CAPRIN-1 através de uma reação de antigénio-anticorpo, preferentemente, liga-se especificamente à proteína CAPRIN-1. Neste contexto, a frase "liga-se especificamente à proteína CAPRIN-1" significa que o anticorpo se liga especificamente à proteína CAPRIN-1 sem ligação substancial a outras proteínas. 0 anticorpo de acordo com a presente invenção é preferentemente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser um anticorpo policlonal desde que possam ser produzidos de forma estável anticorpos homogéneos. No caso de um indivíduo humano, um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado é desejável para evitar ou suprimir a rejeição. 0 anticorpo contra o polipéptido de CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção pode ser examinado quanto a sua atividade antitumoral, conforme descrito posteriormente, examinando in vivo a inibição do crescimento tumoral num animal portador de cancro ou examinando ex vivo a presença ou ausência de atividade citotóxica mediada por imunócitos ou complemento exibida pelo anticorpo contra células tumorais que expressam o polipéptido. 0 indivíduo que tem de receber o tratamento e./ou prevenção do cancro de acordo com a presente invenção é um mamífero como um ser humano, um animal de estimação, animal pecuário ou animal de desporto, preferentemente um ser humano.

Doravante, a presente invenção será descrita em maior detalhe. <Preparação do antigénio para preparação de anticorpos>

Proteínas ou fragmentos das mesmas utilizados como antigénios de sensibilização para obter o anticorpo contra CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção não são limitados pela espécie animal que serve como a sua origem, incluindo seres humanos, cães, gado, cavalos, ratinhos, ratos e galinhas. As proteínas ou os fragmentos das mesmas, contudo, são preferentemente selecionados tendo em conta a compatibilidade com as células parentais para utilização na fusão celular. No geral, proteínas derivadas de mamíferos são preferidas. Particularmente, proteínas derivadas de seres humanos são preferidas. Por exemplo, quando CAPRIN-1 é uma CAPRIN-1 humana, podem ser utilizadas proteínas CAPRIN-1 humanas, péptidos parciais das mesmas ou células que expressas CAPRIN-1 humana.

As sequências de nucleótidos e as sequências de aminoácidos de CAPRIN-1 humana e homólogos da mesma estão disponíveis, por exemplo, acedendo ao GenBank (NCBI, EUA) e utilizando o algoritmo BLAST ou FASTA (Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 5873-5877, 1993; e Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

Na presente invenção, com referência à sequência de nucleótidos (SEQ ID NO: 1 ou 3) ou sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2 ou 4) de CAPRIN-1 humana, a CAPRIN-1 alvo são ácidos nucleicos ou proteínas que consistem em sequências que têm 70 % a 100 %, preferentemente 80 % a 100 %, mais preferentemente 90% a 100%, ainda mais preferentemente 95 % a 100 %, por exemplo, 97 % a 100 %, 98 % a 100 %, 99 % a 100 %, ou 99,5 % a 100 % de identidade de sequência com a sequências de nucleótidos ou sequência de aminoácidos da ORF ou porção madura da sequência de referência. Neste contexto, o termo "% de identidade de sequência" significa uma percentagem (%) do número de aminoácidos idênticos (ou bases nucleotídicas) ao número total de aminoácidos (ou bases nucleotídicas) quando duas sequências são alinhadas de tal modo que o grau máximo de semelhança (ou identidade) pode ser alcançado com ou sem lacunas introduzidas.

Como os fragmentos de cada proteína CAPRIN-1, podem ser utilizados aqueles que compreendem um epítopo (ou uma determinante antigénica), que é a unidade mais pequena reconhecida por um anticorpo, e tendo comprimentos que variam desde o comprimento do aminoácido do epítopo até menos do comprimento completo da proteína. 0 epítopo refere-se a um fragmento polipeptídico tendo antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferentemente seres humanos. A sua unidade mais pequena consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoãcidos, por exemplo, 8 a 11 aminoácidos. 0 fragmento da proteína CAPRIN-1 a ser utilizado na preparação do anticorpo de acordo com a presente invenção consiste na sequência de aminoãcidos mostrada pela SEQ ID NO: 5 reconhecida pelo anticorpo da presente invenção.

Os fragmentos polipeptídicos que compreendem as proteínas CAPRIN-1 humanas acima e péptidos parciais das mesmas podem ser sintetizados de acordo com métodos de síntese químicos, por exemplo, métodos de Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) e tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japão), 1981). Igualmente, estes polipéptidos podem ser sintetizados por métodos convencionais utilizando vários sintetizadores peptídicos comercialmente disponíveis.

Alternativamente, polinucleótidos que codificam os polipéptidos podem ser preparados utilizando abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica (Sambrook et al., Molecular Cloning, a 2a edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, a 3a edição, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley &amp; Sons; etc.) e incorporados em vetores de expressão, que são depois introduzidos nas células hospedeiras para produzir os polipéptidos nas células hospedeiras. Desta forma, podem obter-se as proteínas CAPRIN-1 humanas ou fragmentos polipeptídicos das mesmas de interesse.

Os polinucleótidos que codificam os polipéptidos podem ser prontamente preparados por abordagens de engenharia genética conhecidas na técnica ou através de métodos convencionais utilizando sintetizadores de ácidos nucleicos comercialmente disponíveis. Por exemplo, um ADN que compreende a sequência de nucleótidos do gene CAPRIN-1 humano pode ser preparado por PCR utilizando uma biblioteca de ADNc ou ADN cromossómico humano como um molde e um par de iniciadores concebidos de modo a ser capazes de amplificar a sequência nucleotídica. As condições de reação para esta PCR podem ser determinadas de forma apropriada. Exemplos das condições podem incluir, mas não se limitam a, 30 ciclos envolvendo, cada um, etapas de reação que consistem em 94 °C durante 30 segundos (desnaturação), 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (hibridação) e 72 °C durante 2 minutos (alongamento) utilizando ADN polimerase termoestável (por exemplo, Taq polimerase, Pfu polimerase ou semelhantes) e um tampão de PCR contendo Mg2+, seguida por reação a 72 °C durante 7 minutos. A abordagem, condições de PCR, etc. são descritas em, por exemplo, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, a 3a edição, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley &amp; Sons (particularmente, Capítulo 15).

Igualmente, sondas ou iniciadores apropriados podem ser preparados com base na informação sobre as sequências nucleotídicas do gene CAPRIN-1 e as sequências de aminoácidos das proteínas CAPRIN-1 e utilizados no rastreio de, por exemplo, uma biblioteca de ADNc humana, para isolar o ADN desejado. Preferentemente, uma tal biblioteca de ADNc é produzida a partir de células, órgãos ou tecidos que expressam proteínas de CAPRIN-1. Exemplos de tais células ou tecidos incluem células ou tecidos derivados a partir dos testículos ou a partir de cancros ou tumores como leucemia, cancro da mama, linfoma, tumor cerebral, cancro pulmonar, cancro pancreático e cancro colorretal. Estas operações, incluindo a preparação de sondas ou iniciadores, a construção de uma biblioteca de ADNc, o rastreio da biblioteca de ADNc e a clonagem do gene de interesse, são conhecidas para os peritos na especialidade e podem ser realizadas de acordo com métodos descritos em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a 2 a edição, Current Protocols in Molecular Biology (1989) e Ausubel et al. (ibid.), os ADN que codificam as proteínas CAPRIN-1 humanas e os péptidos parciais das mesmas podem ser obtidos a partir do ADN assim obtido.

As células hospedeiras nas quais os vetores de expressão são introduzidos podem ser qualquer célula capaz de expressar os polipéptidos anteriores. Exemplos de células procarióticas incluem, mas não se limitam a, E. coli. Exemplos de células eucarióticas incluem, mas não se limitam a: células de mamífero como células de rim de macaco COSI e células de ovário de hamster chinês CHO; uma linha celular de células renais embrionãrias humanas HEK293; linha celular de pele embrionária de ratinho NIH3T3; células de leveduras como leveduras em gemulação e células de leveduras em fissão; células de bicho-da-seda e células de ovos de Xenopus.

No caso de se utilizarem células procarióticas como as células hospedeiras, os vetores de expressão utilizados podem ter uma origem que permite a replicação nas células procarióticas, um promotor, um sítio de ligação ribossomal, um sítio de multiclonagem, um terminador, um gene de resistência a fármacos, um gene complementar auxotrófico, etc. Exemplos de vetores de expressão para E. coli podem incluir sistemas de expressão da série pUC, pBluescript II, pET e sistemas de expressão pGEX. Os ADN que codificam os polipéptidos anteriores podem ser incorporados em tais vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras procarióticas são depois transformadas, seguido por cultura dos transformantes obtidos de modo que os polipéptidos codificados pelos ADN sejam expressos nas células hospedeiras procarióticas. A este respeito, os polipéptidos podem ser expressos como proteínas de fusão com outras proteínas .

No caso de se utilizarem células eucarióticas como as células hospedeiras, vetores de expressão para células eucarióticas tendo um promotor, uma região de splicing, um sítio de adição de poli(A), etc. podem ser utilizadas como os vetores de expressão. Exemplos de tais vetores de expressão podem incluir os vetores pKAl, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 e pYES2. Da mesma maneira como acima, os ADN que codificam os polipéptidos anteriores podem ser incorporados em tais vetores de expressão, com os quais as células hospedeiras eucarióticas são depois transformadas, seguido por cultura dos transformantes obtidos de modo que os polipéptidos codificados pelos ADN sejam expressos nas células hospedeiras eucarióticas. No caso de se utilizarem vetores de expressão como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl ou pEGFP-Cl, os polipéptidos podem ser expressos como várias proteínas de fusão marcadas com uma etiqueta His (por exemplo, (His)6 a (His) i0) , etiqueta FLAG, etiqueta myc, etiqueta HA, GFP, ou semelhantes.

Os vetores de expressão podem ser introduzidos nas células hospedeiras utilizando métodos bem conhecidos como eletroporação, um método de fosfato de cálcio, um método de lipossomas, um método de DEAE dextrano, microinjeção, infeção virai, lipofeção e ligação com péptidos de penetração celular. 0 polipéptido de interesse pode ser isolado e purificado a partir das células hospedeiras através de uma combinação de operações de separação conhecidas na técnica. Exemplos das mesmas incluem, mas não se limitam a, tratamento com um desnaturante (por exemplo, ureia) ou um tensioativo, ultrassonicação, digestão enzimática, salificação, fracionamento e precipitação de solvente, diálise, centrifugação, ultrafiltração, filtração em gel, SDS-PAGE, eletroforese de focagem isoelétrica, cromatografia de permuta iónica, cromatografia hidrofõbica, cromatografia de afinidade e cromatografia de fase reversa.

De modo a preparar o anticorpo de acordo com a presente invenção, antigénios assim preparados podem ser utilizados como antigénios de sensibilização como descrito posteriormente. <Estrutura do anticorpo>

Anticorpos (imunoglobulina) são normalmente glicoproteínas heteromultiméricas compreendendo, cada uma, pelo menos duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As imunoglobulinas, exceto a IgM, são glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150 kDa cada, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve está conectada a uma cadeia pesada através de uma ligação de dissulfureto covalente simples, embora o número de ligações de dissulfureto entre as cadeias pesadas varie entre isotipos de imunoglobulina diferentes. Cada uma das cadeias pesadas e leve também tem uma ligação de dissulfureto intracadeia. Cada cadeia pesada tem um domínio variável (região VH) numa extremidade, seguida por uma série de regiões constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (região VL) numa extremidade e tem uma região constante simples na outra extremidade. A região constante de cadeia leve está alinhada com a primeira região constante de cadeia pesada, enquanto o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável de cadeia pesada. Regiões particulares designadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) nos domínios variáveis do anticorpo exibem variabilidade específica e conferem especificidade de ligação ao anticorpo. Porções relativamente conservadas nas regiões variáveis são designadas regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis de cadeia pesada e leve completos compreendem, cada um, quatro FRs conectadas através de três CDRs. Estas três CDRs são designadas CDRH1, CDRH2 e CDRH3 nesta ordem desde o terminal N da cadeia pesada. Igualmente, as CDRs são designadas CDRL1, CDRL2 e CDRL3 na cadeia leve. A CDRH3 é a mais importante para a especificidade de ligação do anticorpo para o seu antigénio. Adicionalmente, CDRs em cada cadeia são mantidas próximas umas às outras pelas regiões FR e contribuem para a formação de um sítio de ligação a antigénio no anticorpo, juntamente com CDRs na outra cadeia. As regiões constantes não contribuem diretamente para a ligação de anticorpo-antigénio, mas exibem várias funções efetoras, por exemplo, envolvimento na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (AD-CC), fagocitose mediada por ligação a um recetor Fcy, semivida/taxa de eliminação mediada por um recetor Fc neonatal (FcRn) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) mediada por um componente Clq na cascata do complemento. <Preparação do anticorpo> 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção significa um anticorpo que tem reatividade imunológica com uma proteína CAPRIN-1 ou um fragmento da mesma. Particularmente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é um anticorpo que se liga imuno1ogicamente a um polipéptido parcial de uma proteína CAPRIN-1 (polipéptido de CAPRIN-1 parcial) que é um péptido contendo um epítopo e que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5. 0 anticorpo da presente invenção reconhece preferentemente um epítopo que consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoácidos consecutivos, por exemplo, 8 a 11 aminoácidos consecutivos, na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5. Este anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção pode ligar-se especifícamente à proteína CAPRIN-1 de comprimento completo. 0 anticorpo da presente invenção pode ser obtido através da seleção de um anticorpo que se liga imuno1ogicamente a um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5, de acordo com um método de rotina de entre os anticorpos obtidos com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas como antigénios.

Neste contexto, a "reatividade imunológica" significa a propriedade da ligação do anticorpo ao antigénio CAPRIN-1 (uma proteína CAPRIN-1 de comprimento completo ou um polipéptido parcial do mesmo) in vivo. Através de tal ligação do anticorpo da presente invenção a CAPRIN-1, o anticorpo exerce a função de danificar (por exemplo, matar, suprimir ou regredir) as células tumorais. 0 anticorpo da presente invenção pode danificar tumores como cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro colorretal (por exemplo, cancro do cólon), cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma como resultado da ligação à proteína CAPRIN-1. 0 anticorpo da presente invenção pode ser qualquer tipo de anticorpo. Exemplos do tipo do anticorpo de acordo com a presente invenção incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos sintéticos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv). Igualmente, o anticorpo é qualquer classe de molécula de imunoglobulina, por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, ou IgY, ou qualquer subclasse, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl ou IgA2.

Adicionalmente, o anticorpo pode ser modificado por acetilação, formilação, amidação, fosforilação, PEGuilação ou semelhantes, bem como glicosilação.

Doravante, serão mostrados exemplos de preparação de vários anticorpos.

Quando o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal, por exemplo, linhas celulares de cancro da mama SK-BR-3 que expressam CAPRIN-1 são administradas a cada ratinho para imunização. 0 baço é extraído deste rato. Depois da separação das células do baço, as células são fusionadas com células de mieiorna de ratinho. Os clones que produzem anticorpos tendo um efeito inibitório do crescimento de células cancerosas são selecionados de entre as células de fusão obtidas (hibridomas). Alternativamente, os clones que produzem anticorpos que se ligam a um polipéptido consistindo na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5 podem ser selecionados. Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais que têm um efeito inibitório do crescimento de células cancerosas ou os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais contra os polipéptidos da SEQ ID NO: 5, etc. são isolados e cultivados. 0 anticorpo da presente invenção pode ser preparado através de purificação a partir do sobrenadante da cultura de acordo com um método de purificação por afinidade geral.

Os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais podem ser preparados, por exemplo, conforme se segue. Em primeiro lugar, os animais são imunizados com antigénios de sensibilização de acordo com um método conhecido na técnica. Este método de imunização envolve geralmente a injeção intraperitoneal ou subcutânea dos antigénios de sensibilização em mamíferos. Especificamente, os antigénios de sensibilização são diluídos com, ou suspensos em PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou semelhantes numa quantidade apropriada e depois misturados, se desejado, com uma quantidade apropriada de um adjuvante convencional, por exemplo, um adjuvante completo de Freund. Após emulsificação, administra-se a cada mamífero várias vezes cada 4 a 21 dias. Alternativamente, um veículo apropriado pode ser utilizado para a imunização com antigénios de sensibilização.

Depois da confirmação de um aumento do nível do anticorpo desejado no soro do animal (tipicamente, mamífero) assim imunizado, os imunócitos são recolhidos a partir do animal e submetidos a fusão celular. Exemplos preferidos dos imunócitos incluem particularmente células de baço. Células de mieloma mamífero, por exemplo, podem ser utilizadas como células parentais parceiras para ser fusionadas com os imunócitos. Várias linhas celulares conhecidas na técnica, por exemplo, P3U1 (P3-X63Ag8Ul), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), MS-1 (Kohler. G. e Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R21Q (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133), são preferentemente utilizadas como as células de mieloma. A fusão celular entre os imunócitos e as células de mieloma pode ser realizada basicamente de acordo com um método conhecido na técnica, por exemplo, o método de Kohler e Milstein (Kohler, G. e Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) .

Mais especificamente, a fusão celular é levada a cabo, por exemplo, na presença de um promotor da fusão celular num meio nutritivo convencional. Por exemplo, polietilenoglicol (PEG) ou vírus hemaglutinante do Japão (HVJ) é utilizado como o promotor de fusão. Se for desejado, um auxiliar como dimetilsulfõxido pode ser ainda adicionado de modo a potenciar a eficiência da fusão. A razão entre os imunócitos e as células de mieloma utilizada pode ser definida de forma arbitrária. Por exemplo, a quantidade dos imunõcitos é preferentemente definida para 1 a 10 vezes a quantidade das células de mieloma. Exemplos do meio que pode ser utilizado na fusão celular incluem os meios RPMI1640 e MEM adequados para o crescimento das linhas celulares de mieloma bem como meios convencionais para utilização neste tipo de cultura celular. Adicionalmente, um suplemento de soro como soro fetal bovino (FCS) pode ser utilizado em combinação com estes meios.

Para a fusão celular, os imunócitos e as células de mieloma são bem misturadas numa quantidade predeterminada do meio. Uma solução de PEG (massa molecular média: por exemplo, aproximadamente 1000 a 6000) preaquecida até aproximadamente 37 °C é normalmente adicionada à mistura numa concentração de 30 a 60 % (p/v) e misturada com o mesmo para formar os hibridomas de interesse. Subsequentemente, procedimentos de adicionar sequencialmente um meio apropriado e de remover o sobrenadante por centrifugação são preferentemente repetidos para remover agentes de fusão celular ou semelhantes, desfavoráveis para o crescimento dos hibridomas.

Os hibridomas assim obtidos são cultivados num meio seletivo convencional, por exemplo, um meio HAT (meio contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) para seleção. Continua-se a cultura no meio HAT durante um período (habitualmente vários dias a várias semanas) suficiente para a morte das células (células não fusionadas) além dos hibridomas de interesse. Subsequentemente, os hibridomas que produzem o anticorpo de interesse são rastreados e clonados como clones simples através de um método de diluição limitante convencional.

Além de tal obtenção dos hibridomas pela imunização de animais não humanos com antigênios, os hibridomas que produzem anticorpos humanos tendo a atividade desejada (por exemplo, atividade inibitória do crescimento celular) podem ser obtidos através de sensibilização de linfócitos humanos, por exemplo, linfócitos humanos infetados com vírus EB, com proteínas, células que expressam proteínas ou lisados das mesmas in vitro e fusionando os linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de ser humano capazes de se dividirem permanentemente, por exemplo, U266 (N.0 de acesso TIB196).

Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais assim preparados podem ser subcultivados num meio convencional e podem também ser armazenados durante um longo período em azoto líquido.

Especificamente, os antigénios desejados ou células que expressam os antigénios desejados são utilizados como antigénios de sensibilização na imunização de acordo com um método de imunização convencional. Os imunócitos obtidos são fusionados com células parentais conhecidas na técnica de acordo com um método de fusão celular convencional. Células produtoras de anticorpos monoclonais (hibridomas) podem ser rastreadas através de um método de rastreio convencional para preparar os hibridomas que produzem anticorpos monoclonais de interesse.

Outro exemplo do anticorpo que pode ser utilizado na presente invenção é um anticorpo policlonal. 0 anticorpo policlonal pode ser obtido, por exemplo, conforme se segue: o soro é obtido a partir de pequenos animais como ratinhos, ratinhos produtores de anticorpos humanos, ou coelhos imunizados com proteínas CAPRIN-1 naturais ou proteínas CAPRIN-1 recombinantes expressas como proteínas de fusão com GST ou semelhantes em microrganismos como E. coli, ou péptidos parciais dos mesmos. Alternativamente, o soro pode ser obtido a partir de mamíferos imunizados com polipéptidos de fragmento de CAPRIN-1 cada um compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos tendo 80 % ou mais, preferentemente 85 % ou mais, mais preferentemente 90 % ou mais, ainda mais preferentemente 95 % ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos (preferentemente, um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5) ou polipéptidos cada um compreendendo (preferentemente, consistindo em) um epítopo que consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoácidos consecutivos, por exemplo, 8 a 11 aminoácidos consecutivos, na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos tendo 80 % ou mais, preferentemente 85 % ou mais, mais preferentemente 90 % ou mais, e ainda mais preferentemente 95 % ou mais de identidade de sequência com a sequência aminoácidos, como antigénios de sensibilização. Estes soros são purificados utilizando, por exemplo, precipitação por sulfato de amónio, colunas de proteína A ou proteína G, cromatografia de permuta iónica de DEAE ou colunas de afinidade acopladas com proteínas CAPRIN-1 ou péptidos sintéticos para preparar o anticorpo policlonal anti-CAPRIN-1. 0 anticorpo policlonal da presente invenção inclui anticorpos obtidos a partir de animais produtores de anticorpos humanos (por exemplo, ratinhos) imunizados com proteínas CAPRIN-1.

Neste contexto, por exemplo, ratinhos KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) e ratinhos Xeno (Amgen Inc.) são conhecidos como os ratinhos produtores de anticorpos humanos (por exemplo, Publicações Internacionais N.°s WO02/43478 e W002/092812). Anticorpos policlonais humanos completos podem ser obtidos a partir do sangue de tais ratinhos imunizados com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas. Alternativamente, as células esplénicas podem ser isoladas a partir dos ratinhos assim imunizados e fusionadas com células de mieloma. Desta forma, podem ser obtidos os anticorpos monoclonais humanos.

Os antigénios podem ser preparados de acordo com, por exemplo, um método que utiliza células animais (Publicação de Patente JP (Kohyo) N.° 2007--530068 A (2007)) ou um método que utiliza baculovírus (por exemplo, Publicação Internacional N.° W098/46777). Os antigénios tendo uma baixa imunogenicidade podem ser ligados a macromoléculas imunogénicas como albumina para a imunização. Os antigénios podem ser administrados com adjuvantes para a imunização.

Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode ser obtido como anticorpos recombinantes, que são produzidos utilizando uma técnica de engenharia genética que envolve: clonagem dos genes de anticorpo a partir dos hibridomas; incorporação dos genes de anticorpo em vetores apropriados e introdução dos vetores nos hospedeiros (veja-se, por exemplo, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especificamente, os ADNc da região variável (região V) do anticorpo são sintetizados a partir dos ARNm de hibridomas utilizando transcriptase reversa. Depois da obtenção dos ADNs que codificam as regiões V do anticorpo de interesse, os ADN são ligados com ADN que codificam as regiões constantes (regiões C) de anticorpo desejadas. Os produtos de ligação resultantes são incorporados em vetores de expressão. Alternativamente, os ADN que codificam a região V do anticorpo podem ser incorporados em vetores de expressão que contêm os ADN da região C do anticorpo. Estes ADN são incorporados nos vetores de expressão de modo a serem expressos sob o controlo das regiões de controlo de expressão, por exemplo, um potenciador e um promotor. A seguir, as células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão resultantes e deixadas a expressar os anticorpos. O anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é preferentemente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo geneticamente modificado (anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, etc.) ou semelhantes. 0 anticorpo monoclonal inclui anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais de animais não humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais de ratinho, rato, coelho e galinha), anticorpos monoclonais quiméricos e semelhantes. 0 anticorpo monoclonal pode ser preparado pela cultura de hibridomas obtidos pela fusão entre células esplénicas a partir de animais não humanos (por exemplo, ratinhos ou ratinhos, galinhas e coelhos produtores de anticorpos humanos) imunizados com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas e células de mieloma. Alternativamente, genes de regiões variáveis de cadeia pesada e leve a partir das células esplénicas de animais não humanos (por exemplo, ratinhos, ratinhos, galinhas e coelhos produtores de anticorpos humanos) imunizados com proteínas CAPRIN-1 ou fragmentos das mesmas podem ser incorporados através de ligantes em vetores fagemídeos, que são depois introduzidos em E. coli de modo que anticorpos de cadeia simples sejam expressos através de fagos auxiliares para preparar os anticorpos de interesse. 0 anticorpo quimérico é um anticorpo preparado a partir de uma combinação de sequências derivadas a partir de animais diferentes e é, por exemplo, um anticorpo composto por regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpo de ratinho e regiões constantes de cadeia pesada e leve de anticorpo humano. 0 anticorpo quimérico pode ser preparado utilizando um método conhecido na técnica que envolve, por exemplo: ligar ADN que codificam as regiões V de anticorpo com ADN que codificam as regiões C de anticorpo humano; incorporar os produtos de ligação resultantes em vetores de expressão e introduzir os vetores em hospedeiros de modo que os anticorpos sejam produzidos.

Os anticorpos monoclonais que têm reatividade imunológica com um polipéptido de CAPRIN-1 parcial que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5 e têm um efeito antitumoral são preparados por métodos descritos posteriormente nos Exemplos. Estes anticorpos monoclonais compreendem cada um, por exemplo, uma região variável de cadeia pesada (VH) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, 19, 58, 63, 69 ou 77 e uma região variável de cadeia leve (VL) tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, 23, 53, 62, 65, 73 ou 81. Nestes anticorpos monoclonais, a região VH pode compreender a CDR1 mostrada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, 16, 55, 66 ou 74, CDR2 mostrada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, 17, 56, 67 ou 75, e CDR3 mostrada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, 18, 57, 68 ou 76, ea região VL pode compreende a CDR1 mostrada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, 20, 50, 59, 70 ou 78, CDR2 mostrada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, 21, 51, 60, 64, 71 ou 79, e CDR3 mostrada pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, 22, 52, 61, 72 ou 80. 0 anticorpo humanizado, também designado anticorpo humano remodelado, é um anticorpo manipulado. O anticorpo humanizado é construído através do enxerto de CDRs de anticorpo derivadas a partir de um animal humanizado nas regiões de determinação de complementaridade de um anticorpo humano. Portanto, também é conhecida uma abordagem de recombinação génica geral.

Especificamente, por exemplo, sequências de ADN desenhadas para ligar CDRs de anticorpos de ratinho, coelho e galinha e regiões estruturais (FRs) de anticorpos humanos são sintetizadas por PCR utilizando vários oligonucleótidos preparados tendo porções terminais que se sobrepõem umas com as outras. Os ADN obtidos são ligados com ADNs que codificam as regiões constantes de anticorpo humano. Subsequentemente, os produtos de ligação resultantes são incorporados em vetores de expressão, que são depois introduzidos em hospedeiros para a produção de anticorpos para obter o anticorpo de interesse (veja-se a Publicação de Pedido de Patente Europeu N.° EP239400 e Publicação Internacional N.0 WO96/02576). As FRs de anticorpo humano conectadas através de CDRs são selecionadas de modo que as regiões de determinação de complementaridade formem um sítio de ligação a antigénio favorável. Se for necessário, os aminoãcidos nas regiões estruturais das regiões variáveis de anticorpos podem ser substituídos de tal modo que as regiões determinantes da complementaridade do anticorpo humano remodelado resultante formem um sítio de ligação a antigénio apropriado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Adicionalmente, estas regiões estruturais podem ser substituídas com regiões estruturais derivadas a partir de vários anticorpos humanos (veja-se a Publicação Internacional N.° W099/51743) .

As regiões estruturais de anticorpo humano conectadas através de CDRs são selecionadas de modo que as regiões de determinação de complementaridade formem um sítio de ligação a antigénio favorável. Se for necessário, os aminoácidos nas regiões estruturais das regiões variáveis de anticorpos podem ser substituídos de tal modo que as regiões determinantes da complementaridade do anticorpo humano remodelado resultante formem um sítio de ligação a antigénio apropriado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53 : 851-856) .

Os aminoácidos nas regiões variáveis (por exemplo, FRs) ou regiões constantes do anticorpo quimérico ou do anticorpo humanizado assim preparados podem ser substituídos, por exemplo, por outros aminoácidos. A substituição de aminoácidos é a substituição de, por exemplo, menos de 15, menos de 10, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos aminoácidos, preferentemente 1 a 5 aminoácidos, mais preferentemente 1 ou 2 aminoácidos. 0 anticorpo substituído deveria ser funcionalmente equivalente a um anticorpo não substituído. A substituição é desej avelmente uma substituição de aminoãcidos conservative, que é a substituição entre aminoãcidos com propriedades semelhantes como carga, cadeias lateral, polaridade e aromaticidade. Os aminoãcidos podem ser classificados em termos de propriedades semelhantes em, por exemplo: aminoãcidos básicos (arginina, lisina e histidina); aminoãcidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoãcidos polares sem carga (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína e tirosina); aminoãcidos não polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina); aminoãcidos ramificados (leucina, valina e isoleucina) e aminoãcidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina).

Exemplos de anticorpos modificados podem incluir anticorpos ligados com várias moléculas como polietilenoglicol (PEG). No anticorpo modificado da presente invenção, a substância a ser ligada não está limitada. De modo a obter tal anticorpo modificado, o anticorpo obtido pode ser quimicamente modificado. Portanto, um método já foi estabelecido na técnica.

Neste contexto, a frase "funcionalmente equivalente" significa que um anticorpo em questão tem uma atividade biológica ou bioquímica semelhante à do anticorpo da presente invenção, especificamente, o anticorpo em questão tem a função de danificar o tumor e não provoca essencialmente qualquer rej eição quando aplicado a seres humanos, por exemplo. Exemplos de tal atividade podem incluir atividade inibitória do crescimento celular e atividade de ligação.

Um método para a preparação de um polipéptido funcionalmente equivalente a um determinado polipéptido, que envolve a introdução de uma mutação num polipéptido, é bem conhecido para os peritos na especialidade. Por exemplo, os peritos na especialidade podem introduzir uma mutação conforme apropriado no anticorpo da presente invenção utilizando mutagénese sítio dirigida (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ., e Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. e Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA. , (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; e Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) ou semelhantes, preparando assim uma funcionalidade de anticorpo equivalente ao anticorpo da presente invenção.

Um anticorpo que reconhece um epítopo de uma proteína CAPRIN-1 descrita acima ou um fragmento de polipéptido de CAPRIN-1 incluindo do mesmo pode ser obtido por um método geralmente conhecido para os peritos na especialidade. Por exemplo, o anticorpo pode ser obtido por um método que envolve determinar o epítopo da proteína CAPRIN-1 reconhecido pelo anticorpo anti-CAPRIN-1 que tem um efeito inibitório do crescimento de células cancerosas obtido pelo anterior através de um método convencional (por exemplo, o mapeamento de epítopos ou um método para identificar um epítopo como descrito mais adiante) e preparar um anticorpo utilizando um polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos contida no epítopo como um imunogénio ou um método que implique a determinação de um epítopo para um anticorpo preparado por um método convencional e selecionar um anticorpo que reconheça o mesmo epítopo que aquele para o anticorpo anti-CAPRIN-1. Neste contexto, o "epítopo" refere-se a um fragmento polipeptídico tendo antigenicidade ou imunogenicidade em mamíferos, preferentemente seres humanos. A sua unidade mais pequena consiste em aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, preferentemente 8 a 11 aminoácidos. 0 anticorpo da presente invenção é um anticorpo que tem reatividade imunológica com CAPRIN-1, um anticorpo que reconhece especificamente CAPRIN-1 ou um anticorpo que se liga especificamente a CAPRIN-1 e exibe atividade citotóxica ou efeito inibitório do crescimento tumoral sobre o cancro. 0 anticorpo preferentemente tem uma estrutura que causa pouca ou nenhuma rejeição nos animais recetores. Exemplos de tais anticorpos incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos quiméricos de humano-ratinho), anticorpos de cadeia simples e anticorpos biespecíficos quando os animais recetores são seres humanos. Estes anticorpos têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivadas a partir de um anticorpo humano ou têm regiões variáveis de cadeia pesada e leve que consistem em regiões de determinação de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3) derivadas a partir de um anticorpo animal não humano e regiões estruturais derivadas a partir de um anticorpo humano. Alternativamente, estes anticorpos são anticorpos recombinantes tendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve derivadas a partir de um anticorpo de animal não humano e regiões constantes de cadeia pesada e leve derivadas a partir de um anticorpo humano. 0 anticorpo da presente invenção é preferentemente os dois anticorpos anteriores.

Tais anticorpos recombinantes podem ser preparados como se segue: ADNs que codificam anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais de ser humano, ratinho, rato, coelho e galinha) contra CAPRIN-1 humana são clonados a partir das células produtoras de anticorpos como hibridomas e utilizados como moldes para preparar ADNs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos por RT-PCR ou semelhantes. As sequências respetivas das regiões variáveis de cadeia pesada e leve e as respetivas sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 em cada região são determinadas com base no sistema de numeração EU de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Um ADN que codifica cada região variável ou um ADN que codifica cada CDR é preparado utilizando uma técnica de engenharia genética (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) ou um sintetizador de ADN. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos acima mencionados podem ser preparados imunizando animais produtores de anticorpos humanos (por exemplo, ratinhos) com CAPRIN-1 humana e depois fusionando células esplénicas excisadas a partir dos animais imunizados com células de mieloma. Separadamente, ADNs que codificam regiões constantes e variáveis de cadeia leve e pesada derivadas a partir de um anticorpo humano são preparados, se for necessário, utilizando uma técnica de engenharia genética ou um sintetizador de ADN.

Para o anticorpo humanizado, um ADN que codifica o anticorpo humanizado pode ser preparado produzindo ADNs nos quais as sequências de codificação de CDR nos ADNs que codificam regiões variáveis de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpos humanos são substituídas por sequências de codificação de CDR correspondentes de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho ou galinha), ligando os ADNs resultantes com os ADNs que codificam regiões constantes de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpo humano, respetivamente.

Para o anticorpo quimérico, pode preparar-se um ADN codificando o anticorpo quimérico ligando ADNs codificando regiões variáveis de cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho ou galinha) com ADNs que codificam regiões constantes de cadeia leve ou pesada derivadas de anticorpo humano. 0 anticorpo de cadeia simples significa um anticorpo no qual regiões variáveis de cadeia pesada e leve são linearmente ligadas umas às outras através de um ligante. Um ADN que codifica o anticorpo de cadeia simples pode ser preparado ligando o ADN que codifica a região variável de cadeia pesada, um ADN que codifica o ligante e um ADN que codifica a região variável de cadeia leve. Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve são ambas derivadas a partir de um anticorpo humano ou derivadas a partir de um anticorpo humano no qual apenas as CDRs são substituídas por CDRs de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho ou galinha). 0 ligante consiste em 12 a 19 aminoácidos. Exemplos do mesmo incluem (G4S)3 consistindo em 15 aminoácidos (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9) : 425-432) . 0 anticorpo biespecífico (diacorpo) significa um anticorpo capaz de se ligar especificamente a dois epítopos diferentes. Um ADN que codifica o anticorpo biespecífico pode ser preparado, por exemplo, ligando o ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada A, um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve B, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada B, e um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve A nesta ordem, em que o ADN que codifica a região variável de cadeia leve B e o ADN que codifica a região variável de cadeia pesada B estão ligados através de um ADN que codifica um ligante como descrito acima. Neste contexto, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve são todas derivadas a partir de um anticorpo humano ou derivadas a partir de um anticorpo humano no qual apenas as CDRs são substituídas por CDRs de um anticorpo derivado de animal não humano (por exemplo, ratinho, rato, coelho ou galinha).

Os ADNs recombinantes assim preparados podem ser incorporados num ou mais vetores apropriados, que são depois introduzidos em células hospedeiras (por exemplo, células de mamífero, células de levedura e células de inseto) e os ADNs são (co) expressos para produzir anticorpos recombinantes (veja-se P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd e C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; e J.W. Goding. , Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Exemplos do anticorpo da presente invenção preparados por qualquer dos métodos descritos acima incluem os seguintes anticorpos (a) a (g) obtidos nos Exemplos descritos posteriormente: (a) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12 (por exemplo, um anticorpo tendo uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13); (b) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22 (por exemplo, um anticorpo construído utilizando uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 23) ; (c) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 50, 51 e 52 (por exemplo, um anticorpo construído utilizando uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 53); (d) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61 (por exemplo, um anticorpo construído utilizando uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 58 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 62) ,* (e) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 59, 64 e 61 (por exemplo, um anticorpo construído utilizando uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 65) ; (f) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 66, 67 e 68 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 70, 71 e 72 (por exemplo, um anticorpo construído utilizando uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 6 9 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 73); (g) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 78, 79 e 80 (por exemplo, um anticorpo construído utilizando uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 7 7 e uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81) ;

Neste contexto, as sequências de aminoácidos mostradas pelas SEQ ID NOS: 6, 7 e 8 e SEQ ID NQs: 16, 17 e 18 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável da cadeia pesada derivada de anticorpo de ratinho. As sequências de aminoãcidos mostradas pelas SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, SEQ ID NOs: 20, 21 e 22 e SEQ ID NOs: 50, 51 e 52 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável da cadeia leve derivada de anticorpo de ratinho. As sequências de aminoácidos mostradas pelas SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, SEQ ID NOs: 66, 67 e 68 e SEQ ID NOs: 74, 75 e 76 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável da cadeia pesada derivada de anticorpo de galinha. As sequências de aminoácidos mostradas pelas SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, SEQ ID NOs: 59, 64 e 61, SEQ ID NOs: 70, 71 e 72 e SEQ ID NOs: 78, 7 9 e 80 correspondem a CDR1, CDR2 e CDR3, respetivamente, de uma região variável da cadeia leve derivada de anticorpo de galinha.

Exemplos do anticorpo humanizado, do anticorpo quimérico, do anticorpo de cadeia simples ou do anticorpo biespecífico da presente invenção incluem anticorpos descritos abaixo. Os seguintes anticorpos são formas de realização ilustrativas do anticorpo (a), mas também podem existir formas de realização semelhantes dos outros anticorpos (b) a (g). (i) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de anticorpo humano e uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12 e as sequências de aminoácidos de regiões estruturais derivadas de anticorpo humano. (ii) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e as sequências de aminoácidos de regiões estruturais derivadas de anticorpo humano, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano, uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12 e as sequências de aminoácidos das regiões estruturais derivadas de anticorpo humano e uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano. (iii) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano, uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, uma região constante de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano.

As sequências das regiões constantes e variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo humano estão disponíveis a partir de, por exemplo, NCBI (EUA; GenBank, UniGene, etc.). Por exemplo, as seguintes sequências podem ser referidas para: N.° de acesso J00228 para região constante de cadeia pesada de IgGl humana; N.° de acesso J00230 para região constante de cadeia pesada de IgG2 humana; N.° de acesso X03604 para região constante de cadeia pesada de IgG3 humana; N.° de acesso K01316 para região constante de cadeia pesada de IgG4 humana; N.°s de acesso V00557, X64135 e X64133 para uma região constante κ de cadeia leve humana e N.°s de acesso X64132 e X64134 para uma região constante λ de cadeia leve humana.

Preferentemente, estes anticorpos têm atividade citotóxica e podem, desta forma, exercer um efeito antitumoral.

As sequências particulares acima das regiões variáveis de cadeia pesada e leve e CDRs nos anticorpos anteriormente mencionados são proporcionadas meramente para fins ilustrativos, e é óbvio que o anticorpo da presente invenção não é limitado pelas sequências particulares. São preparados hibridomas capazes de produzir anticorpos humanos anti-CAPRIN-1 humana ou anticorpos de animais não humanos (por exemplo, anticorpos de ratinho) diferentes dos especificamente descritos acima e os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas são recuperados e é determinado se os anticorpos recuperados são ou não os anticorpos de interesse usando a atividade de ligação imunológica contra CAPRIN-1 humana e atividade citotóxica como indicadores. Os hibridomas produtores de anticorpos monoclonais de interesse são assim identificados. Posteriormente, os ADNs que codificam regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos de interesse são preparados a partir dos hibridomas e sequenciados, conforme descrito acima. Os ADNs são utilizados para a preparação de anticorpos diferentes. 0 anticorpo descrito acima pode ser qualquer dos anticorpos (a) a (g), etc. tendo a substituição, eliminação ou adição de um ou vários aminoácidos, em particular, numa região diferente das CDRs, por exemplo, numa sequência de região estrutural e/ou uma sequência de região constante, desde que o anticorpo tenha tal especificidade que possa reconhecer especificamente CAPRIN-1. No presente documento, o termo "vários" significa preferivelmente 2 a 5, mais preferentemente 2 ou 3. 0 anticorpo da presente invenção tem uma constante de afinidade Ka (kon/koff) de preferentemente pelo menos 107 M~ 1, pelo menos 108 M"1, pelo menos 5 x 108 M_1, pelo menos 109 M"1, pelo menos 5 x 109 M"1, pelo menos IO10 M'1 pelo menos 5 x IO10 M“l pelo menos IO11 M"1 pelo menos 5 x 1011 M‘L, pelo menos 1012 M"1, ou pelo menos 1013 M"1 para a proteína CAPRIN-1 ou o fragmento da mesma. 0 anticorpo da presente invenção pode ser conjugado com um agente antitumoral. A conjugação do anticorpo com o agente antitumoral pode ser realizada através de um espaçador tendo um grupo reativo com um grupo amino, um grupo carboxilo, um grupo hidroxi, um grupo tiol ou semelhantes (por exemplo, um grupo succinimidilo, um grupo formilo, um grupo 2-piridilditio, um grupo maleimidilo, um grupo alcoxicarbonilo ou um grupo hidroxi).

Exemplos do agente antitumoral incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos na literatura, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, bussulfano, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, canfotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosmfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, noga1amicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubi c ina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, β-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, androgénios (por exemplo, calusterona, propionato de dromostalonona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glicósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina e sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado em combinação com um agente antitumoral para produzir um efeito terapêutico mais elevado. Esta abordagem é adaptável a um paciente com um cancro que expressa CAPRIN-1 seja antes ou depois da operação cirúrgica. Esta abordagem pode ser aplicada, particularmente depois da cirurgia, a cancro que expressa CAPRIN-1, que foi tratado convencionalmente com um agente antitumoral isoladamente, para produzir uma maior prevenção da recorrência de cancro ou prolongamento do tempo de sobrevivência.

Exemplos do agente antitumoral utilizado na administração combinada com o anticorpo da presente invenção incluem os seguintes agentes antitumorais conhecidos na literatura, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, bussulfano, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carboquona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, bulatacinona, canfotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosmfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, ácido micofenólico, noga1ami c ina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodo rub i c i na, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de drornosta1onona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, ácido frolínico, aceglatona, glicósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, epotilona, etoglúcido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilinico, 2-etil-hidrazida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermânio, ácido tenuazónico, triaziquona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6 -tioguanina, mercaptopurina, cisplatina, oxaliplatina, carboplatina, vinblastina, etopósido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, tenipósido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecano, inibidores da topoisomerase, difluorometilornitina (DMFO), ácido retinoico, capecitabina e sais (conhecidos na técnica) e derivados (conhecidos na técnica) farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Destes agentes antitumorais, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel ou vinorelbina são particularmente utilizados com preferência. 0 anticorpo da presente invenção pode ser ligado a um radioisótopo conhecido na literatura, etc., como 211At, 131I, 125I, 90Y, i8oRe, 188Re, 153Sm, "^Bi, 32P, i75Lu ou i76Lu. Preferentemente, é utilizado um radioisótopo eficaz para o tratamento ou diagnóstico do tumor. Um tal radioisótopo está também incluído no âmbito do agente antitumoral de acordo com a presente invenção. <1dentificação do epítopo> 0 anticorpo da presente invenção reconhece a sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5 como um epítopo, como mostrado abaixo nos Exemplos. Um exemplo de um método para confirmar o epítopo para o anticorpo da presente invenção compreende imobilizar o polipéptido da SEQ ID NO: 5 (epítopo) numa placa e avaliar o anticorpo quanto à sua reatividade contra este epítopo. Especificamente, o polipéptido da SEQ ID NO: 5 é imobilizado sobre uma placa através da reação com um grupo funcional eletrofílico ligado através de um espaçador de por exemplo, oligoetilenoglicol, à placa e depois submetido a reação com o anticorpo da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo secundário marcado com HRP (peroxidase de rábano) capaz de se ligar ao anticorpo da presente invenção pode ser submetido a reação com o mesmo para avaliar a reatividade do anticorpo (para confirmar o epítopo para o anticorpo da presente invenção) . 0 polipéptido da SEQ ID NO: 5 a ser imobilizado numa placa pode ser utilizado como uma forma consistindo na sequência da SEQ ID NO: 5 ou uma forma parcialmente modificada (por exemplo, uma forma modificada do polipéptido no resíduo N ou C terminal com quaisquer vários aminoácidos ou uma proteína como KLH ou uma forma modificada do polipéptido com uma proteína MAP), desde que o anticorpo da presente invenção se ligue a estas formas polipeptídicas.

Alguns anticorpos da presente invenção podem não reagir com o polipéptido da SEQ ID NO: 5 (isto é, o epítopo não é confirmado) no método anterior. Num tal caso, o epítopo para o anticorpo da presente invenção pode ser confirmado submetendo o anticorpo a reação com o antigénio sob condições de solução que facilitam a ligação de antigénio-anticorpo como descrito no Exemplo 2, obtendo o complexo de antigénio-anticorpo resultante através de um método de imunoprecipitação e, posteriormente, separando uma fração polipeptídica ligada ao anticorpo, e determinando a sua sequência de aminoácidos. 0 antigénio pode ser um polipéptido que consiste na sequência da SEQ ID NO: 5, um seu parcialmente modificado ou uma proteína CAPRIN-1 desde que um epítopo reativo com o anticorpo da presente invenção possa ser confirmado para o mesmo através dos métodos mencionados anteriormente. <Efeito antitumoral>

Considera-se que o efeito antitumoral do anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção em células cancerosas que expressam CAPRIN-1 é ocasionado pelo seguinte mecanismo: citotoxicidade mediada por células efetoras dependentes de anticorpo (ADCC) contra as células que expressam CAPRIN-1 e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) contra as células que expressam CAPRIN-1. Contudo, o âmbito da presente invenção não se destina a ser limitado pelo mecanismo.

Sabe-se que o efeito antitumoral baseado no mecanismo se correlaciona com o número de moléculas alvo que se ligam a anticorpos expressas na superfície de célula cancerosas (Niwa R., Clinical Cancer Research (2005) Mar 15; 11 (6): 2327-2336). O número de moléculas alvo expressas na superfície das células cancerosas pode ser examinada utilizando um kit de ensaio existente, capaz de medir o número de moléculas na superfície das células. Especificamente, o número de moléculas alvo que se ligam a anticorpos pode ser determinado: submetendo as células cancerosas a reação com, por exemplo, anticorpos contra as moléculas alvo como anticorpos primários; submetendo a reação com os mesmos anticorpos marcados com fluorescência contra os anticorpos primários, juntamente com esferas de curva de calibração com o número preliminarmente conhecido de moléculas; medindo a intensidade de fluorescência média das amostras e determinando o número das moléculas alvo com base na curva de calibração obtida.

Consequentemente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção pode ser testado quanto à sua atividade determinando a atividade ADCC ex vivo ou a atividade CDC contra células cancerosas que expressam CAPRIN-1 ou examinando o número de moléculas de CAPRIN-1 expressas na superfície das células cancerosas no caso de se utilizar o anticorpo anti-CAPRIN-1 de acordo com a presente invenção como um anticorpo primário, como especificamente mostrado abaixo nos Exemplos. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado na presente invenção liga-se a proteínas CAPRIN-1 em células cancerosas e exibe um efeito antitumoral através da atividade. Consequentemente, o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção é considerado como sendo útil no tratamento ou prevenção de cancro. Especificamente, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção do cancro, compreendendo o anticorpo anti-CAPRIN-1 como um ingrediente ativo. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 a ser utilizado para os fins de administração a corpos humanos (terapêutica com anticorpos) é preferentemente um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado para reduzir a imunogenicidade. 0 anticorpo anti-CAPRIN-1 com uma afinidade de ligação mais elevada para uma proteína CAPRIN-1 na superfície das células cancerosas exerce uma atividade antitumoral mais forte. Consequentemente, espera-se que o anticorpo da presente invenção tenha um efeito antitumoral mais forte devido à afinidade de ligação alta para a proteína CAPRIN-1 e, portanto, pode ser utilizado como uma composição farmacêutica para utilização no tratamento e/ou prevenção de cancro. Preferentemente, o anticorpo de acordo com a presente invenção tem uma afinidade de ligação alta com uma constante de associação (constante de afinidade) Ka (kon/koff) de preferentemente pelo menos 107 M"1, pelo menos 108 M"1, pelo menos 5 x 108 M"1, pelo menos 109 M"1, pelo menos 5 x ΙΟ9 ΝΓ1, pelo menos 10i0 M'1, pelo menos 5 x IO10 M~ 1, pelo menos 1011 M"1, pelo menos 5 x 1011 M"1, pelo menos 1012 M'1 ou pelo menos 1013 M'1, conforme descrito acima.

Um número maior de moléculas de CAPRIN-1 que se podem ligar a anticorpos anti-CAPRIN-1 na superfície das células cancerosas produz uma atividade antitumoral mais forte.

Desejavelmente, de modo a produzir o efeito antitumoral esperado, o número de moléculas de CAPRIN-1 às quais os anticorpos se ligam é 104 ou mais, preferentemente 105 ou mais moléculas de CAPRIN-1 por célula cancerosa, conforme medido utilizando o anticorpo anti-CAPRIN-1 da presente invenção. Um tumor (células cancerosas) tendo um grande número de moléculas de CAPRIN-1 na sua superfície celular é particularmente preferido como um cancro submetido à administração do anticorpo da presente invenção. cLigação a células que expressam antigénios A capacidade do anticorpo para se ligar a CAPRIN-1 pode ser determinada através da utilização de um ensaio de ligação utilizando, por exemplo, ELISA, Western blot, imunofluorescência e análise de citometria de fluxo, como descrito nos Exemplos. cColoração imunohistoquímica> 0 anticorpo que reconhece CAPRIN-1 pode ser testado quanto à sua reatividade com CAPRIN-1 por um método de imunohistoquímica bem conhecido pelos peritos na especialidade utilizando uma secção congelada fixada com paraformaldeído ou acetona ou uma secção de tecido incorporada em parafina fixada com paraformaldeído de um tecido obtido a partir de um paciente durante a operação cirúrgica ou a partir de um animal portador de tecido de xenoenxerto inoculado com uma linha celular que expressa CAPRIN-1 de forma espontânea ou após transfeção.

Para a coloração imunohistoquímica, o anticorpo reativo com CAPRIN-1 pode ser corado por vários métodos. Por exemplo, o anticorpo pode ser visualizado através da reação com um anticorpo de cabra anti-ratinho anticorpo de cabra anti-coelho ou anticorpo de cabra anti-galinha conjugado com peroxidase de rábano. <Composição farmacêutica e meios para tratar e/ou prevenir o cancro

Um alvo da composição farmacêutica para tratamento e/ou prevenção de cancro da presente invenção não está particularmente limitado desde que o alvo seja (células de) cancro que expressam um gene CAPRIN-1.

Os termos "tumor" e "cancro" utilizados no presente documento significam um neoplasma maligno e são utilizados indistintamente um com o outro. 0 cancro alvo da presente invenção é um cancro que expressa um gene que codifica uma proteína CAPRIN-1 e é preferentemente cancro da mama, cancro renal, cancro pancreãtico, cancro colorretal, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.

Exemplos específicos destes cancros incluem, mas não se limitam a, adenocarcinoma da mama, adenocarcinoma da mama do tipo complexo, tumor misto maligno da glândula mamária, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma pulmonar, cancro de células escamosas, cancro de células pequenas, cancro de células grandes, glioma que é um tumor do tecido neuroepitelial, ependimoma ventricular, tumor neuronal, tumor neuroectodérmico embrionário, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentar, linfoma de tipo de células pequenas a médias, cancro do ceco, cancro do cólon ascendente, cancro do cólon descendente, cancro do cólon transversal, cancro do cólon sigmoide, cancro retal, cancro ovárico epitelial, tumor de células germinativas, tumor de células do estroma, carcinoma ductal pancreático, carcinoma ductal pancreático invasivo, adenocarcinoma pancreático, carcinoma das células acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de células gigantes, neoplasma mucino-papilar intraductal, neoplasma cístico mucinoso, pancreatoblastoma, c i s t adenoc arc i noma seroso, tumor papilar sólido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endócrina múltipla de tipo 1 (síndrome de Wermer) , tumor de células de ilhotas não funcionais, somatostatinoma e VIPoma. 0 indivíduo (paciente) como o recetor é preferentemente um mamífero, por exemplo, mamíferos incluindo primatas, animais de estimação, gado e animais de desporto, e particularmente de forma preferida seres humanos, cães e gatos.

Quando se utiliza o anticorpo da presente invenção numa composição farmacêutica, a composição farmacêutica pode ser formulada através de um método conhecido pelos peritos na especialidade. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser utilizada sob a forma de uma injeção parentérica de uma solução ou suspensão asséptica com água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada com o anticorpo misturado numa forma farmacêutica unitária necessária para a prática farmacêutica geralmente aceite, em combinação com um portador ou meios farmaceuticamente aceitáveis, especificamente, água esterilizada, solução salina fisiológica, óleo vegetal, um emulsionante, um agente de suspensão, um tensioativo, um estabilizante, um agente aromatizante, um excipiente, um veículo, um conservante, um aglutinante, etc, conforme adequado. A quantidade do ingrediente ativo em tal preparação determina-se para que se possa obter uma dose apropriada dentro do intervalo indicado.

Uma composição asséptica para injeção pode ser formulada de acordo com a prática farmacêutica convencional utilizando um veículo como água destilada injetável.

Exemplos de soluções aquosas para injeção incluem solução salina fisiológica, soluções isotónicas contendo glucose e outros adjuvantes, por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D-manitol e cloreto de sódio. Estas soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante apropriado, por exemplo, um álcool (particularmente, etanol) ou um poliãlcool (por exemplo, propilenoglicol e polietilenoglicol), ou um tensioativo nâo iõnico, por exemplo, polissorbato 80 (TM) ou HCO-60.

Exemplos de soluções oleosas incluem aquelas que usam óleo de sésamo ou óleo de soja. As soluções podem ser utilizadas em combinação com um solubilizante como benzoato de benzilo ou álcool benzílico. Um tampão (por exemplo, uma solução tampão de fosfato ou uma solução tampão de acetato de sódio), um agente calmante (por exemplo, cloridrato de procaína), um estabilizador (por exemplo, álcool benzílico ou fenol), ou um antioxidante podem ser adicionados às soluções. As soluções de injeção assim preparadas são geralmente carregadas em ampolas apropriadas. A composição farmacêutica da presente invenção é administrada por via oral ou parentérica, preferentemente parentérica. Exemplos específicos das suas formas farmacêuticas incluem injeções, agentes de administração intranasal, agentes de administração transpulmonar e agentes de administração percutânea. Exemplos de injeções incluem injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal e injeção subcutânea, através das quais a composição farmacêutica pode ser administrada de forma sistémica ou local.

Igualmente, o método de administração pode ser selecionado adequadamente dependendo da idade, peso, sexo, sintomas, etc. de um paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo o anticorpo ou um polinucleótido que codifica o anticorpo pode ser selecionada dentro de um intervalo de, por exemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dose. Alternativamente, a dose pode ser selecionada dentro de um intervalo de, por exemplo, 0,001 a 100000 mg/corpo de um paciente, embora a dose não esteja necessariamente limitada a estes valores numéricos. Embora a dose e o método de administração variem dependendo do peso, idade, sexo, sintomas, etc. de um paciente, os peritos na especialidade podem selecionar, de forma apropriada, a dose e o método. A composição farmacêutica incluindo o anticorpo da presente invenção ou os fragmentos do mesmo pode ser administrada a um indivíduo para tratar e/ou prevenir o cancro, preferentemente cancro da mama, cancro renal, cancro pancreático, cancro colorretal, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma. A presente invenção engloba ainda meios para o tratamento e/ou prevenção de cancro, através de administração da composição farmacêutica da presente invenção em combinação com o agente antitumoral como exemplificado acima ou uma composição farmacêutica compreendendo o agente antitumoral a um indivíduo. 0 anticorpo da presente invenção ou o fragmento do mesmo pode ser administrado ao indivíduo simultaneamente com ou separadamente do agente antitumoral. No caso de se administrarem separadamente estas composições farmacêuticas, qualquer uma pode ser administrada primeiro ou posteriormente. Os seus intervalos de dosagem, doses, vias de administração e o número de doses podem ser apropriadamente selecionados por um especialista. As outras formas farmacêuticas a serem administradas simultaneamente também incluem, por exemplo, composições farmacêuticas formuladas por mistura do anticorpo da presente invenção ou do fragmento do mesmo ou do agente antitumoral num veículo (ou meio) farmacologicamente aceitável. As descrições acima sobre composição, formulação, vias de administração, doses, cancro, etc. quanto às composições farmacêuticas e formas farmacêuticas que contêm o anticorpo da presente invenção também são aplicáveis a qualquer das composições farmacêuticas e formas farmacêuticas mencionadas anteriormente contendo o agente antitumoral.

Consequentemente, a presente invenção também proporciona uma combinação farmacêutica tal como definida nas reivindicações, compreendendo a composição farmacêutica da presente invenção e uma composição farmacêutica que compreende o agente antitumoral como exemplificado acima, e um método para o tratamento e/ou prevenção do cancro, que compreende a administração das mesmas. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção do cancro, c omp re e nde ndo o anticorpo ou o fragmento do mesmo da presente invenção e o agente antitumoral juntamente com um veículo farmacologicamente aceitável. cPolipéptido e ADN> A presente invenção proporciona ainda um ADN que codifica o anticorpo da presente invenção ou o fragmento (fragmento de ligação ao anticorpo) do mesmo. 0 ADN pode

ser um ADN que codifica as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo ou pode ser um ADN que codifica as regiões variáveisde cadeia pesada e/ou leve do anticorpo. 0 DNA também pode ser um ADN que codifica cada uma ou uma combinação das regiões de determinação da complementaridade do anticorpo. Um tal ADN inclui, por exemplo, um ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de nucleõtidos que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de nucleótidos que codificam as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, no caso do anticorpo (a) mencionado acima.

As regiões de determinação da complementaridade (CDRs) codificadas pelo ADN que possui estas sequências servem como regiões que determinam a especificidade do anticorpo. Sequências que codificam as outras regiões (isto é, regiões constantes e regiões estruturais) do anticorpo podem, portanto, ser sequências derivadas de outros anticorpos. Neste contexto, "outros anticorpos" também incluem anticorpos derivados de organismos não humanos, mas são de preferência aqueles derivados de seres humanos do ponto de vista da redução de reações adversas. Especificamente, no ADN da presente invenção, as regiões que codificam cada região estrutural e cada região constante nas cadeias pesadas e leves compreendem preferentemente sequências de nucleótidos que codificam sequências de aminoácidos derivadas de anticorpos humanos correspondentes.

Exemplos adicionais do ADN que codifica o anticorpo da presente invenção incluem ADN que codifica uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 e um ADN que codifica uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, no caso do anticorpo (a) mencionado acima. Neste contexto, um exemplo de sequências nucleotídicas que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 é a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 14. Um exemplo de sequências nucleotídicas que codificam a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 é a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 15. Quando tal ADN compreende regiões que codificam regiões constantes das cadeias pesadas e leves, cada uma das regiões compreende preferentemente uma sequência de nucleótidos que codifica uma sequência de aminoácidos derivada de anticorpo humano correspondente (sequência de aminoácidos de cada região constante das cadeias pesadas e leves).

Estes ADNs do anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, através dos métodos descritos acima, ou pelo método seguinte. Em primeiro lugar, os ARNs totais são preparados a partir de hibridomas que produzem o anticorpo da presente invenção utilizando um kit de extração de ARN comercialmente disponível, e os ADNc são sintetizados a partir deles utilizando transcriptase reversa e iniciadores aleatórios ou semelhantes. Subsequentemente, os ADNc que codificam anticorpos são amplificados por PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos para sequências conservadas de regiões variáveis em genes de cadeia pesada e leve de anticorpos de ratinho. As sequências que codificam as regiões constantes podem ser obtidas por amplificação por PCR das sequências conhecidas. A sequência de nucleõtidos do ADN pode ser incorporada num plasmídeo ou um fago para sequenciamento, por exemplo, e determinada de acordo com um método convencional. A presente invenção proporciona adicionalmente os seguintes polipéptidos e ADNs relacionados com os anticorpos (a) a (g) anteriormente mencionados: (i) um polipéptido compreendendo qualquer das sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 9, 19, 58, 63, 69 e 77, e um ADN que codifica o polipéptido (por exemplo, um ADN que compreende qualquer das sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 14 e 24); (ii) um polipéptido compreendendo qualquer das sequências de aminoãcidos das SEQ ID NOs: 13, 23, 53, 62, 65, 73 e 81, e um ADN que codifica o polipéptido (por exemplo, um ADN que compreende qualquer das sequências de nucleótidos das SEQ ID NOs: 15, 25 e 54); (iii) polipéptidos de CDR de cadeia pesada selecionados a partir do grupo que consiste nas sequências de aminoãcidos mostradas pelas SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, SEQ ID NOs: 66, 67 e 68 e SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, e um ADN que codifica os polipéptidos; e (iv) polipéptidos de CDR de cadeia leve selecionados a partir das sequências de aminoãcidos mostradas pelas SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, SEQ ID NOs: 50, 51 e 52, SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, SEQ ID NOs: 59, 64 e 61, SEQ ID NOS: 70, 71 e 72 e SEQ ID NOs : 78, 79 e 80, e um ADN que codifica os polipéptidos.

Estes polipéptidos e ADNs podem ser preparados utilizando técnicas de engenharia genética como descrito acima.

Exemplos

Doravante, a presente invenção será descrita especificamente com referência aos Exemplos. Contudo, o âmbito da presente invenção não se destina a ser limitado por estes exemplos específicos.

Exemplo 1 Análise da expressão de CAPRIN-1 em cada tecido A expressão do gene CAPRIN-1 nos tecidos normais humanos e caninos e em várias linhas celulares foi examinada por RT-PCR de acordo com o Exemplo 1 (4) do documento W02010/016526. Como resultado, observou-se uma forte expressão nos testículos de entre os tecidos caninos saudáveis, enquanto a expressão foi observada nos tecidos de adenocarcinoma e cancro da mama caninos. Adicionalmente, como resultado do exame da expressão em tecidos humanos, a expressão foi observada apenas nos testículos entre os tecidos normais, como com o gene CAPRIN-1 canino. Em contraste, a expressão foi detetada em muitos tipos de linhas celulares de cancro, incluindo 8 linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1) e 4 linhas celulares de cancro pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, e BxPc-3), entre células cancerosas. Estes resultados demonstraram que a expressão de CAPRIN-1 não foi verificada em tecidos normais diferentes dos testículos, enquanto a CAPRIN-1 é expressa nas linhas celulares de cancro da mama e linhas celulares de cancro pancreático.

Exemplo 2 Preparação de anticorpo monoclonal de ratinho contra CAPRIN-1 (1) Preparação de anticorpo monoclonal de ratinho n.° 1 100 pg de proteínas CAPRIN-1 humanas (tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2) preparados no Exemplo 3 do documento W02010/016526 foram misturados com uma quantidade igual de adjuvante MPL+TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mistura foi utilizada como uma solução antigénica por ratinho. A solução antigénica foi administrada por via intraperitoneal a cada ratinho Balb/c de 6 semanas de idade (preparado por Japan SLC, Inc.). Posteriormente, foram realizadas 7 administrações cada 1 semana para completar a imunização. Três dias depois da imunização final, o baço de cada ratinho foi excisado e triturado entre duas lâminas de vidro esterilizadas. Procedimentos de lavagem com PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos para remover o sobrenadante foram repetidos três vezes para obter células esplénicas. As células esplénicas obtidas foram misturadas com células de mieloma de ratinho SP2/0 (adquiridas de ATCC) a uma razão de 10:1. Uma solução de PEG preparada por mistura de 200 μΐ de um meio RPMI164 0 contendo FBS a 10 %, que foi aquecida até 37 °C, com 800 μΐ de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH) foi adicionada à mistura de células e depois foi deixada a repousar durante 5 minutos para fusão celular. Depois da remoção do sobrenadante através de centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos, as células foram suspensas em 150 ml de um meio RPM11640 contendo FBS a 15 % suplementado com 2 % equivalente de uma solução de HAT (Gibco) (meio seletivo HAT). Esta suspensão foi semeada sobre quinze placas de 96 poços (Nunc) a 100 μΐ/poço. As células esplénicas e as células de mieloma foram fusionadas por cultura durante 7 dias a 3 7 °C, 5 % de C02 para obter hibridomas.

Os hibridomas preparados foram rastreados quanto à afinidade de ligação dos anticorpos produzidos pelos hibridomas contra proteínas CAPRIN-1 como um indicador. Uma solução a 1 pg/ml da proteína CAPRIN-1 preparada no Exemplo 3 do documento W02010/016526 foi adicionada a uma placa de 96 poços a 100 μΐ/poço e deixada a repousar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, uma solução de albumina sérica bovina (BSA) a 0,5 % (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) foi adicionada aos mesmos a 400 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi removida e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Depois disso, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, anticorpos anti-IgG (H+L) de ratinho marcados com HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram adicionados aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, uma solução de substrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 15 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Depois do desenvolvimento de cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N a 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrofotõmetro de absorção. Como resultado, selecionaram-se vários hibridomas produtores de anticorpos tendo uma elevada absorvância.

Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços a 0,5 células/poço e cultivados na placa. Uma semana depois, foram observados hibridomas que formam colónias individuais nos poços. As células nestes poços foram adicionalmente cultivadas e os hibridomas clonados foram rastreados quanto à afinidade de ligação dos anticorpos produzidos pelos hibridomas contra proteína CAPRIN-1 como um indicador. Uma solução a 1 pg/ml da proteína CAPRIN-1 preparada no Exemplo 3 do documento W02010/016526 foi adicionada a uma placa de 96 poços a 100 μΐ/poço e deixada a repousar a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, uma solução de BSA a 0,5 % foi adicionada aos mesmos a 400 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi removida e cada poço foi lavado três vezes com 400 μΐ de PBS-T. Depois disso, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, anticorpos anti-IgG (H+L) de ratinho marcados com HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram adicionados aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, uma solução de substrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 15 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Depois do desenvolvimento de cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N a 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrofotómetro de absorção. Como resultado, produziram-se 88 linhas de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais reativos com a proteína CAPRIN-1. A seguir, estes anticorpos monoclonais foram rastreados quanto a anticorpos reativos com a superfície de células de cancro da mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 106 células de uma linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V foram centrifugadas num tubo de microcentrí fuga de 1,5 ml. 100 μΐ do sobrenadante da cultura do hibridoma obtido acima foram aí adicionados e deixou-se a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho marcados com FITC (fabricados por Invitrogen Corp.) diluídos 500 vezes com PBS contendo FBS a 0,1 % foram aí adicionados e deixou-se a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação como acima foi realizada utilizando o soro de cada ratinho Balb/c de 6 semanas de idade não tratado, diluído 500 vezes com um meio para cultura de hibridomas, em vez dos anticorpos, para preparar um controlo. Como resultado, um anticorpo monoclonal (n.° 1) tendo uma intensidade de fluorescência mais forte do que aquela do controlo, ou seja, reativo com a superfície das células de cancro da mama, foi selecionado. (2) Identificação de epítopo de CAPRIN-1 reconhecido pelo anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 n.° 1. 0 anticorpo monoclonal n.° 1 anti-CAPRIN-1 reativo com a superfície das células cancerosas obtido na secção (1) foi utilizado para identificar uma região de epítopo de CAPRIN-1 por ele reconhecida. 100 pg de proteínas CAPRIN-1 recombinantes foram dissolvidos num tampão de dissolução isento de inibidor de proteína e submetidos a reação com o anticorpo monoclonal de ratinho n.0 1. Uma enzima digestiva tripsina ou quimiotripsina foi adicionada à solução para realizar a reação de digestão numa temperatura adequada. Depois da reação, um veículo de proteína G sefarose foi adicionado à mistura de reação, submetido a reação com a mesma e precipitado por centrifugação. Depois da remoção do sobrenadante, o veículo foi lavado com um tampão de dissolução e PBS e dissolvido em ácido fórmico a 0,1 % e o sobrenadante foi recolhido. A amostra de sobrenadante recolhida foi aplicada a uma coluna de fase reversa (Cartucho de extração HLB (Oasis)) para remoção de anticorpos, para obter uma solução de amostra. A amostra obtida foi submetida a cromatografia líquida de fase reversa (Chromatography Nanosystem (KYA Tech Corp.)) para recuperar uma solução contendo apenas péptidos, que foi depois introduzida num espectrómetro de massa quadrupolo-espectrómetro de massa TOF em tandem (Waters-MicroMass) para análise de MS/MS, para detetar os péptidos contidos na amostra. Como resultado, um polipéptido consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 foi identificado como uma sequência de CAPRIN-1 parcial reconhecida pelo anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 n.° 1. (3) Preparação de anticorpos monoclonais de ratinho n.° 2 e n. ° 3

De um modo semelhante ao descrito na secção (1) , uma proteína de fusão da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 identificada na secção (2) e uma proteína transportadora KLH (hemocianina de lapa californiana) foi misturada como um imunogénio com uma quantidade igual de um adjuvante TiterMax Gold (R) (CytRx Corp.) e esta mistura foi administrada por via subcutânea a uma dose de 20 pg/injeção a cada ratinho em intervalos de 7 dias. Depois da administração com quatro injeções no total, as células esplénicas foram obtidas a partir do ratinho 3 dias após a imunização final e fusionadas com células de mieloma de ratinho da mesma maneira que na secção (1) para produzir hibridomas. Posteriormente, os anticorpos foram rastreados quanto a, como um indicador, reatividade dos anticorpos contidos nos sobrenadant.es de cultura dos hibridomas produzidos com uma solução a 1 pg/ml de proteínas CAPRIN-1 preparada no Exemplo 3 do documento W02010/016526 ou uma proteína de fusão (utilizada como imunogénio) da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma proteína transportadora KLH. A solução a 1 pg/ml de proteínas CAPRIN-1 preparada no Exemplo 3 do documento W02010/016526 e a proteína de fusão (30 pg/ml) da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma proteína transportadora KLH foram adicionadas a 100 μΐ/poço a placas de 96 poços e deixadas em repouso a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, uma solução Blockace (DS Pharma Biomedical Co., foi adicionada aos mesmos a 400 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi removida e cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 2 horas. Cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, anticorpos anti-IgG (H+L) de ratinho marcados com HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluídos 5000 vezes com PBS foram adicionados aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, uma solução de substrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 5 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Depois do desenvolvimento de cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N a 100 ul/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrofotómetro de absorção. Como resultado, selecionaram-se hibridomas produtores de anticorpos tendo uma elevada absorvância.

Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços a 0,3 células/poço e cultivados na placa. Uma semana depois, foram observados hibridomas que formam colónias individuais nos poços. As células nestes poços foram adicionalmente cultivadas e os hibridomas clonados foram rastreados da mesma forma que acima quanto à afinidade de ligação dos anticorpos produzidos pelos hibridomas para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 como uma sequência de CAPRIN-1 parcial como um indicador para obter hibridomas que produzem anticorpos contra o aminoácido da SEQ ID NO: 5.

Os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas obtidos foram rastreados quanto a anticorpos reativos com a superfície de células de cancro da mama que expressam CAPRIN-i. Especificamente, 106 células de uma linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231 V foram centrifugadas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. 100 μΐ do sobrenadante da cultura do hibridoma obtido acima foram aí adicionados e deixou-se a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho marcados com FITC (fabricados por Invitrogen Corp.) diluídos 500 vezes com PBS contendo FBS a 0,1 % foram aí adicionados e deixou-se a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação como acima foi realizada para preparar uma amostra utilizando o soro de cada ratinho Balb/c de 6 semanas de idade não tratado, diluído 500 vezes com um meio para cultura de hibridomas ou preparar uma amostra de controlo negativo através da reação apenas com anticorpos secundários, em vez dos anticorpos. Como resultado, 2 anticorpos monoclonais (n.° 2 e n.° 3) tendo uma intensidade de fluorescência mais forte do que aquela do controlo negativo, ou seja, reativos com a superfície das células de cancro da mama, foram obtidos.

Os anticorpos monoclonais de ratinho n.° 2 e n.° 3 obtidos foram examinados quanto à sua reação específica com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 como uma sequência de CAPRIN-1 parcial utilizada com um imunogénio. Uma solução a 3 0 pg/ml da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 preparada com uma solução aquosa de carbonato de sódio a 0,1 M e uma sequência de CAPRIN-1 parcial livre da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 foram cada uma adicionadas a uma placa de 96 poços Immobilizer Amino para ELISA (Nunc) a 100 pg/ml e submetidas a reação durante todo um dia e noite a 4 °C para ligar os péptidos aos poços. Uma solução aquosa de carbonato de sódio a 0,1 M contendo etanolamina a 10 mM foi adicionada aos poços com péptido ligado e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução em cada poço foi removida e cada poço foi depois lavado com PBS-T. Posteriormente, uma solução Blockace foi adicionada aos mesmos a 400 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi removida e cada poço foi lavado com de PBS-T. Posteriormente, o sobrenadante da cultura contendo o anticorpo monoclonal de ratinho n.° 2 foi adicionado aos mesmos a 50 μΐ/poço e submetido a reação à temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, cada poço foi lavado com PBS-T, e anticorpos anti-IgG (H+L) de ratinho marcados com HRP (fabricados por Invitrogen) diluídos 5000 vezes com uma solução Blockace foram adicionados aos mesmos a 50 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi completamente lavado com PBS-T. Posteriormente, uma solução de substrato TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) foi adicionada aos mesmos a 100 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 5 a 30 minutos para provocar a reação de cor. Depois do desenvolvimento de cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 1 N a 100 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 450 nm e 595 nm utilizando um espectrof otómetro de absorção. Como resultado, os anticorpos monoclonais de ratinho n. 0 2 e n. 0 3 não reagiram com a sequência de CAPRIN-1 parcial livre da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, mas reagiu especificamente apenas com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Os resultados demonstraram que o polipéptido da SEQ ID NO: 5 contém uma região de epítopo para os anticorpos anti-CAPRIN-1 n.° 2 e n.° 3. Exemplo 3 Preparação de anticorpo monoclonal de galinha contra CAPRIN-1

Anticorpos monoclonais derivados de galinha foram preparados utilizando como um imunogénio uma proteína de fusão da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 identificada no Exemplo 2(2) e uma proteína transportadora KLH (hemocianina de lapa californiana) . 300 pg do imunogénio foram misturados com uma quantidade igual de um adjuvante completo de Freund. Esta mistura foi utilizada como uma solução antigénica por galinha. A solução de antigénio administrou-se por via intraperitoneal a cada galinha de 7 semanas de idade. Posteriormente, foram realizadas 7 administrações cada 4 semanas para completar a imunização. Quatro dias depois da imunização final, o baço de cada galinha foi excisado e triturado entre duas lâminas de vidro esterilizadas. Procedimentos de lavagem com PBS (-) (fabricado por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos para remover o sobrenadante foram repetidos três vezes para obter células esplénicas. As células esplénicas obtidas foram misturadas com células de mieloma de galinha deficientes em cadeia leve, estabelecidas a partir de galinhas por transformação utilizando o vírus da reticuloendoteliose aviar, a uma razão de 5:1. Uma solução de PEG preparada por mistura de 200 μΐ de um meio IMDM contendo FBS a 10 %, que foi aquecida até 37 °C, com 800 μΐ de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH) foi adicionada à mistura de células e depois foi deixada a repousar durante 5 minutos para fusão celular. Depois da remoção do sobrenadante através de centrifugação a 1700 rpm durante 5 minutos, as células foram suspensas em 300 ml de um meio IMDM contendo FBS a 10 % suplementado com 2 % equivalente de uma solução de HAT (Gibco) (meio seletivo HAT) . Esta suspensão foi semeada sobre trinta placas de 96 poços (Nunc) a 100 μΐ/poço. As células esplénicas e as células de mieloma de galinha foram fusionadas por cultura durante 7 dias a 37 °C, 5 % de C02 para obter hibridomas. Posteriormente, os anticorpos foram rastreados quanto a, como um indicador, reatividade do anticorpo contido nos sobrenadantes de cultura dos hibridomas preparados com uma solução de proteínas CAPRIN-1 preparada com descrito no Exemplo 3 do documento W02010/016526 ou uma proteína de fusão (utilizada como imunogénio) da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma proteína transportadora BSA. Especificamente, a solução a 1 pg/ml de proteínas CAPRIN-1 preparada no Exemplo 3 do documento W02010/016526 e a proteína de fusão (1 pg/ml) da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e a proteína transportadora BSA foram adicionadas a 50 μΐ/poço a placas de 96 poços e deixadas em repouso a 4 °C durante 18 horas. Cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, uma solução Blockace (DS Pharma Biomedical Co., foi adicionada aos mesmos a 300 μΐ/poço e deixou-se a repousar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução em cada poço foi removida e cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, o sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foi adicionada aos mesmos a 50 μΐ/poço e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado com PBS-T. Posteriormente, Anticorpos anti-IgY de galinha marcados com HRP (fabricados por KPL, Kirkegaard &amp; Perry Laboratories, Inc.) diluídos 1000 vezes com PBS foram aí adicionados a 100 μΐ/poço e deixados a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada poço foi lavado três vezes com PBS-T. Posteriormente, uma solução de substrato OPD foi adicionada aos mesmos a 50 μΐ/poço e deixou-se a repousar durante 5 a 15 minutos para provocar a reação de cor. Depois do desenvolvimento de cor, a reação foi terminada pela adição de ácido sulfúrico a 2 N a 50 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 490 nm e 630 nm utilizando um espectrofotómetro de absorção. Como resultado, selecionaram-se vários hibridomas produtores de anticorpos tendo uma elevada absorvância.

Os hibridomas selecionados foram adicionados a uma placa de 96 poços a 0,5 células/poço e cultivados na placa. Uma semana depois, foram observados hibridomas que formam colónias individuais nos poços. As células nestes poços foram adicionalmente cultivadas, e os hibridomas clonados foram rastreados quanto a, como um indicador, a afinidade de ligação de anticorpos produzidos pelos hibridomas às proteínas CAPRIN-1 ou a reatividade dos anticorpos contra a proteína de fusão (utilizada como um imunogénio) da sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 5 e a proteína transportadora BSA, para obter anticorpos monoclonais de galinha. A seguir, estes anticorpos monoclonais foram rastreados quanto a anticorpos reativos com a superfície de células de cancro da mama que expressam CAPRIN-1. Especificamente, 2 x 105 células de uma linha celular de cancro da mama humano MDA-MB-231V foram centrifugadas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. 50 μΐ do sobrenadante da cultura de cada hibridoma obtido acima foram aí adicionados e deixou-se a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, Anticorpos de cabra anti-IgG de galinha marcados com FITC (fabricados por SouthernBiotech) diluídos 100 vezes com PBS contendo FBS a 0,5 % foram aí adicionados e deixou-se a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação que acima foi realizada utilizando um meio para cultura de hibridomas para preparar uma amostra de controlo negativo. Como resultado, 4 anticorpos monoclonais de galinha (anticorpos monoclonais de galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n. 0 4) tendo uma intensidade de fluorescência mais forte do que aquela do controlo, ou seja, reativos com a superfície das células de cancro da mama que expressam CAPRIN-1, foram selecionados. Estes anticorpos pode ligar-se a CAPRIN-1 expressa na superfície de células de cancro da mama.

Exemplo 4 Caracterização de anticorpo monoclonal selecionado (1) Caracterização do anticorpo monoclonal de ratinho

Os fragmentos de amplificação de genes que codificam as regiões variáveis dos anticorpos monoclonais de ratinho obtidos no Exemplo 2 foram obtidos de acordo com um método descrito no Exemplo 5 do documento W02010/016526 e analisados quanto às suas sequências génicas e sequências de aminoácidos codificadas. A sequência génica resultante que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal derivado de ratinho n.0 1 ê mostrada na SEQ ID NO: 24 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 19; e a sequência génica que codifica a região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 2 5 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 23. A sequência génica resultante que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal derivado de ratinho n.° 2 é mostrada na SEQ ID NO: 14 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 9; e a sequência génica que codifica a região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 15 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 13. A sequência génica resultante que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal derivado de ratinho n.° 3 é mostrada na SEQ ID NO: 14 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 9; e a sequência génica que codifica a região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 54 e a sequência de aminoácidos é mostrada na SEQ ID NO: 53.

Por outras palavras, verificou-se que o anticorpo monoclonal de ratinho n° 1 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 23, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22, respetivamente. Verificou-se que o anticorpo monoclonal de ratinho n° 2 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12, respetivamente. Verificou-se que o anticorpo monoclonal de ratinho n° 3 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 53, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 50, 51 e 52, respetivamente. (2) Caracterização do anticorpo monoclonal de galinha

Os fragmentos de amplificação dos genes que codificam as regiões variáveis dos anticorpos monoclonais de galinha (anticorpos monoclonais de galinha n.° 1, n.° 2, n. ° 3 e n.° 4) obtidos no Exemplo 3 foram obtidos de acordo com o método descrito no Exemplo 4 do documento WO2011/096519 e analisados quanto às suas sequências génicas e sequências de aminoácidos codificadas. A sequência de aminoácidos resultante da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de galinha n.° 1 é mostrada na SEQ ID NO: 58, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 62. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de galinha n.° 2 é mostrada na SEQ ID NO: 63, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 65. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de galinha n.° 3 é mostrada na SEQ ID NO: 69, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 73. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de galinha n.° 4 é mostrada na SEQ ID NO: 77, e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve do mesmo é mostrada na SEQ ID NO: 81.

Por outras palavras, verificou-se que o anticorpo monoclonal de galinha n° 1 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 58 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 62, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respetivamente. Verificou-se que o anticorpo monoclonal de galinha n° 2 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 65, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59, 64 e 61, respetivamente. Verificou-se que o anticorpo monoclonal de galinha n° 3 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 69 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 73, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 66, 6 7 e 68, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 70, 71 e 72, respetivamente. Verificou-se que o anticorpo monoclonal de galinha n° 4 compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 81, em que a região variável de cadeia pesada tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 74, 75 e 76, respetivamente, e a região variável de cadeia leve tinha CDR1, CDR2 e CDR3 consistindo nas sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 78, 79 e 80, respetivamente.

Exemplo 5 Preparação de anticorpo policlonal contra polipéptido CAPRIN-1 parcial presente na superfície das células cancerosas

Com o objetivo de obter anticorpos policlonais contra polipéptidos CAPRIN-1 parciais presentes na superfície das células cancerosas, um polipéptido (péptido derivado de CAPRIN-1 mostrado na SEQ ID NO: 5) compreendendo as regiões de epítopo para os anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 n.° 1, n. 0 2 e n. 0 3, um polipéptido tendo uma região dos resíduos de aminoácidos 50 a 98 na sequência de aminoácidos de CAPRIN-1 humana da SEQ ID NO: 2 e um polipéptido tendo uma região de resíduos de aminoácidos 233 a 305 da SEQ ID NO: 2 foram sintetizados. 1 mg destes péptidos foram misturados como um antigénio com um volume igual de uma solução adjuvante de Freund incompleta (IFA). Esta mistura foi administrada por via subcutânea ao coelho quatro vezes a cada duas semanas. Posteriormente, o sangue foi recolhido a partir deste para obter anticorpo policlonal contendo anti-soro contra cada antigénio. 0 anti-soro foi ainda purificado utilizando um veículo de proteína G (fabricado pela GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.), seguido por substituição com PBS, para obter anticorpos policlonais contra polipéptidos de CAPRIN-1 parciais presentes na superfície das células cancerosas. Adicionalmente, o soro de um coelho que não recebeu antigénio foi preparado por purificação utilizando um veículo de proteína G do mesmo modo que acima e utilizado como anticorpo de controlo. Exemplo 6 Análise da expressão da proteína CAPRIN-1 em células cancerosas A seguir, 8 linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB- 231V, e MRK-nu-1) observadas como tendo um elevado nível de expressão do gene CAPRIN-1 foram examinadas quanto à sua expressão de proteínas CAPRIN-1 na superfície celular. 5 x 105 células das linhas celulares de cancro da mama que foram observadas acima como tendo expressão do gene foram, cada uma, centrifugadas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Depois de adicionar 2 pg (5 μΐ) dos anticorpos policlonais contra os péptidos derivados de CAPRIN-1 preparados como descrito acima no Exemplo 5 ao mesmo, as células foram adicionalmente misturadas com 95 μΐ de PBS contendo soro fetal bovino a 0,1 % e deixadas a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, a solução resultante foi misturada com 2 μΐ de anticorpos de cabra anti-IgG de coelho marcados com Alexa 488 (fabricados pela Invitrogen Corp.) e 98 μΐ de PBS contendo soro fetal bovino (FBS) a 0,1 % e deixada a repousar durante 30 horas em gelo. Após lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por outro lado, a mesma operação como acima foi realizada usando os anticorpos de controlo preparados como descrito acima no Exemplo 5 em vez dos anticorpos policlonais contra os péptidos derivados de CAPRIN-1 para preparar um controlo. Como resultado, as células cancerosas tratadas com os anticorpos anti-CAPRIN-1 exibiram uma intensidade de fluorescência pelo menos 35 % mais forte do que a do controlo. Isto demonstrou que as proteínas CAPRIN-1 são expressas na superfície da membrana celular das linhas celulares de cancro humano. As taxas de potenciação na intensidade de fluorescência são expressas como as taxas de aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) nas respetivas linhas celulares, que são calculadas de acordo com a seguinte fórmula.

Taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (Taxa de potenciação na intensidade de fluorescência) (%) = ((MFI das células reagidas com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (MFI de controlo)) / (MFI de controlo) x 100

Igualmente, a intensidade de fluorescência foi medida em 3 linhas celulares de cancro renal (Caki-l, Caki-2 e A4 98) , uma linha celular de cancro de bexiga (T24), uma linha celular de cancro de ovário (SK0V3), uma linha celular de cancro pulmonar (QG56), uma linha celular de cancro de próstata (PC3) , uma célula de cancro de colo do útero (HeLa), uma linha celular de fibrossarcoma (HT1080), 2 linhas celulares de tumor cerebral (T98G e U87MG), uma linha celular de cancro gástrico (MNK28), uma linha celular de cancro colorretal (Lovo) e linhas celulares de cancro pancreático (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 e BxPC-3) utilizando a mesma abordagem que acima. Como resultado, todas as células cancerosas tinham uma intensidade de fluorescência pelo menos 35 % mais forte que aquela do controlo.

Tal como com os resultados obtidos acima, a expressão de CAPRIN-1 também foi confirmada utilizando o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticorpo monoclonal de ratinho n.0 1) tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 23, o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticorpo monoclonal de ratinho n.° 2) tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 13, e o anticorpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticorpo monoclonal de ratinho n.0 3) tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 9 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 53, que foram obtidos no Exemplo 2, e o anticorpo monoclonal de galinha anti-CAPRIN-1 n.° 1 possuindo a região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 58 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 62, o anticorpo monoclonal de galinha anti-CAPRIN-1 n.° 2 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 63 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 65, o anticorpo monoclonal de galinha anti-CAPRIN-1 n.° 3 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 6 9 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 73, o anticorpo monoclonal de galinha anti-CAPRIN-1 n.° 4 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 77 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: SI (anticorpos monoclonais de galinha n.0 1 a n. 0 4) que foram obtidos no Exemplo 3. Exemplo 7 Coloração imunohistoquímica (1) Expressão de CAPRIN-1 em tecidos caninos e de ratinho normais

Um ratinho (Balb/c, fêmea) e um cão (beagle, fêmea) foram sangrados sob anestesia com éter e sob anestesia com quetamina/isoflurano e submetidos a secção abdominal. Posteriormente, cada órgão (estômago, fígado, globo ocular, timo, músculo, medula óssea, útero, intestino delgado, esófago, coração, rim, glândulas salivares, intestino grosso, glândulas mamárias, cérebro, pulmão, pele, glândulas adrenais, ovário, pâncreas, baço e bexiga) foi transferido para uma placa de 10 cm contendo PBS. Cada órgão foi aberto por corte em PBS e fixado por perfusão durante a noite numa solução tampão de fosfato a 0,1 M (pH 7,4) contendo de paraformaldeído (PFA) a 4 %. 0 perfusado foi descartado e a superfície do tecido de cada órgão foi enxaguada com PBS. Cada tecido foi colocado numa solução de PBS contendo sacarose a 10 % num tubo de centrífuga de 50 ml e agitado a 4 °C durante 2 horas usando um rotor. A solução foi substituída por uma solução de PBS contendo sacarose a 20 %, e a solução resultante foi deixada em repouso a 4 °C até o tecido ter sido precipitado. Posteriormente, A solução foi substituída por uma solução de PBS contendo sacarose a 30 %, e a solução resultante foi deixada em repouso a 4 °C até o tecido ter sido precipitado. O tecido foi retirado e as porções necessárias foram cortadas com um bisturi. A seguir, composto OCT (Tissue Tek) foi vertido na superfície do tecido e espalhado sobre a superfície. Posteriormente, o tecido foi montado em Cryomold. 0 Cryomold foi colocado em gelo seco para congelar rapidamente o tecido e, em seguida, o tecido foi cortado com 10 a 20 pm de espessura usando Cryostat (fabricado por Leica Biosystems) e seco ao ar, juntamente com a lâmina de vidro, durante 30 minutos usando um secador de cabelo para preparar uma lâmina de vidro com uma fatia de tecido colocada sobre a mesma. A seguir, a lâmina de vidro foi colocada num frasco de coloração preenchido com PBS-T (solução salina fisiológica contendo Tween 20 a 0,05 %), e os procedimentos de substituição de PBS-T com um novo a cada 5 minutos foram realizados três vezes. Água redundante em torno de cada secção foi limpa com Kimwipe. A secção na lâmina de vidro foi rodeada com uma caneta Dako (fabricada por Dako Japan Inc.). Posteriormente, reagente de bloqueio de Ig de ratinho MOM (Vectastain) para os tecidos de ratinho e uma solução de PBS-T contendo FBS a 10 % para os tecidos caninos foram aplicados às mesmas e a lâmina de vidro foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora numa câmara húmida. A seguir, um anticorpo policlonal reativo com a superfície das células cancerosas contra o péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) preparado no Exemplo 5 foi preparado numa solução a 10 pg/ml com uma solução de bloqueio, e esta solução foi aplicada ao mesmo. A lâmina de vidro foi deixada a repousar durante a noite a 4 °C numa câmara húmida. Depois de lavagem com PBS-T durante 10 minutos três vezes, anticorpos anti-IgG marcados com biotina MOM (Vectastain) diluídos 250 vezes com uma solução de bloqueio foram aqui aplicados e a lâmina de vidro foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 1 hora numa câmara húmida. Depois de lavagem com PBS-T durante 10 minutos três vezes, reagente Avidina-Biotina ABC (Vectastain) foi aqui aplicado e a lâmina de vidro foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 5 minutos numa câmara húmida. Depois de lavagem com PBS-T durante 10 minutos três vezes, uma solução de coloração de DAB (10 mg

de DAB + 10 μΐ de H202 a 30 %/50 ml de tris-HCl a 0,05 M (pH 7,6)) foi aqui aplicada e a lâmina de vidro foi deixada a repousar à temperatura ambiente durante 30 minutos numa câmara húmida. Depois de se enxaguar com água destilada, foi aqui aplicado um reagente de hematoxilina (fabricado por Dako Japan Inc.) e a lâmina de vidro foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 1 minuto e depois enxaguada com água destilada. A lâmina de vidro foi colocada em soluções de etanol a 70 %, 80 %, 90 %, 95 % e 100 % nesta ordem durante 1 minuto por solução e depois deixada a repousar durante a noite em xileno. A lâmina de vidro foi retirada e montada e meio de montagem Glycergel (fabricado por Dako Japan Inc.), seguido por observação. Como resultado, a expressão intracelular de CAPRIN-1 foi ligeiramente observada nos tecidos respetivos da glândula salivar, rim, cólon e estômago. A sua expressão, contudo, não foi observada na superfície celular destes tecidos. Adicionalmente, não foi observada qualquer expressão nos tecidos derivados a partir de outros órgãos. (2) Expressão de CAPRIN-1 em tecido de cancro da mama canino

Tecidos de cancro de mama congelados de cães patologicamente diagnosticados como cancro de mama maligno foram utilizados na preparação de lâminas de secções congeladas e coloração imunohistoquímica usando os anticorpos policlonais contra o péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) preparados no Exemplo 5, da mesma maneira como acima. Como resultado, a expressão de CAPRIN-1 foi observada nos tecidos de cancro da mama canino. (3) Expressão de CAPRIN-1 em vários tecidos de cancro humano Várias amostras de matrizes de tecido de cancro humano incorporadas em parafina (fabricadas por US Biomax, Inc.) foram utilizadas na coloração imunohistoquímica utilizando os anticorpos policlonais (preparados no Exemplo 5) contra pêptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) da mesma maneira como acima. Como resultado, a expressão de CAPRIN-1 foi observada no cancro do esófago, cancro do cólon, cancro retal, cancro pulmonar, cancro pancreãtico, cancro renal, cancro da bexiga e cancro do colo do útero.

Exemplo 8 Preparação de anticorpo monoclonal quimérico de humano-ratinho 0 fragmento de amplificação gênica preparado no Exemplo 4 que compreende a sequência (SEQ ID NO: 14) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de ratinho n.° 2 foi tratado com uma enzima de restrição, depois purificado e inserido de acordo com um método convencional num vetor pcDNA4/myc-His (fabricado pela Invitrogen Corp.) que já possui inserções génicas de uma sequência líder derivada de anticorpo de ratinho e uma região constante da cadeia H de IgGi humana compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Igualmente, o fragmento de amplificação génica que compreende a sequência (SEQ ID NO: 15) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal de ratinho n. 0 2 foi tratado com uma enzima de restrição, depois purificado e inserido de acordo com um método convencional num vetor pcDNA3.1/myc-His (fabricado pela Invitrogen Corp.) que já possui inserções génicas de uma sequência líder derivada de anticorpo de ratinho e uma região constante da cadeia L de IgGi humana compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. A seguir, o vetor recombinante tendo a inserção da sequência de nucleótidos que codifica a região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 14) do anticorpo monoclonal de ratinho n.° 2 e o vetor recombinante tendo a inserção da sequência de nucleótidos que codifica a região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 15) do anticorpo monoclonal de ratinho n.° 2 foram introduzidos em células CH0-K1 (obtidas de Riken Cell Bank). Especificamente, 2 x 105 células CHO-K1 foram cultivadas num meio F12 de Ham (fabricado por Invitrogen Corp.) contendo 1 ml de FBS a 10 % por poço numa placa de cultura de 12 poços e lavadas com PBS (-) . Posteriormente, um meio F12 de Ham novo contendo 1 ml de FBS a 10 % por poço foi adicionado aos mesmos. Foram misturados 250 ng de cada um dos vetores em 30 μΐ de OptiMEM (fabricado pela Invitrogen Corp.) com 30 μΐ de reagente de transfeção Polyfect (fabricado por Qiagen N.V.) e esta mistura foi adicionada a cada poço. As células CHO-K1 cotransfectadas com os vetores recombinantes foram cultivadas num meio F12 de Ham contendo FBS a 10 % suplementado com Zeocin a 200 pg/ml (fabricado por Invitrogen Corp.) e de Geneticin a 200 pg/ml (fabricado por Roche Diagnostics KK) e depois semeadas numa placa de 96 poços a 0,5 células/poço para preparar uma linha celular que produz de forma estável um anticorpo monoclonal quimérico de humano-ratinho n.° 1 (n.° 1) tendo as regiões variáveis do anticorpo monoclonal de ratinho n.° 1. As linhas celulares que produzem de forma estável um anticorpo monoclonal quimérico de humano-ratinho n.° 2 (n.° 2) ou um anticorpo monoclonal quimérico de humano-ratinho n.° 3 (n.0 3) também foram preparadas do mesmo modo que acima, quanto aos anticorpos monoclonais de ratinho n.° 2 e n.° 3.

Cada linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num balão de 150 cm2 a 5 x 105 células/ml em 30 ml de um meio OptiCHO isento de soro (fabricado pela Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultura contendo n.° 1, n.° 2 ou n.° 3.

Igualmente, as linhas celulares que produzem de forma estável anticorpos comparativos quiméricos de humano-ratinho 1 a 11 foram preparadas da mesma forma como acima, respetivamente, com base nos seguintes anticorpos monoclonais derivados de ratinho anti-CAPRIN-1 divulgados no documento W02010/016526 como anticorpos comparativos: um anticorpo comparativo 1 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 26 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 27; um anticorpo comparativo n° 2 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2 8 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 29; um anticorpo comparativo n° 3 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 30 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 31; um anticorpo comparativo n° 4 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 32 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 33; um anticorpo comparativo n° 5 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 34 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 35; um anticorpo comparativo n° 6 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 36 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 37; um anticorpo comparativo n° 7 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 38 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 39; um anticorpo comparativo n° 8 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 40 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 41; um anticorpo comparativo n° 9 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 42 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 43; um anticorpo comparativo n° 10 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 44 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 45; e um anticorpo comparativo n° 11 tendo a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 4 6 e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 47. Cada linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num balão de 150 cm2 a 5 x 10b células/ml em 3 0 ml de um meio OptiCHO isento de soro (fabricado pela Invitrogen Corp.) para obter sobrenadantes de cultura contendo os respetivos anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de humano-ratinho 1 a 11.

Exemplo 9 Preparação de anticorpo monoclonal quimérico de humano-ga1inha

Com base no anticorpo monoclonal de galinha n.° 1 obtido no Exemplo 3, foi preparada uma linha celular que produz de forma estável um anticorpo quimérico de humano-galinha n.° 1 tendo as regiões variáveis do anticorpo monoclonal de galinha n.° 1 de acordo com o método descrito no Exemplo 4(2) do documento W02011/096519 com base em. A linha celular preparada foi cultivada durante 5 dias num balão de 150 cm2 a 5 x 105 células/ml em 30 ml de um meio OptiCHO isento de soro (fabricado pela Invitrogen Corp.) para obter um sobrenadante de cultura contendo o anticorpo quimérico de humano-galinha n.° 1.

Igualmente, com base nos anticorpos monoclonais de galinha n.° 2, n.0 3 e n.° 4, linhas celulares que produzem de forma estável um anticorpo quimérico de humano-galinha n. ° 2, n.° 3 ou n.° 4 também foram preparadas utilizando a mesma abordagem como acima. Cada linha celular preparada foi utilizada para obter sobrenadantes de cultura contendo o anticorpo quimérico de humano-ga1inha η.° 1, n.° 2, n.° 3 ou n.° 4 .

Exemplo 10 Análise da expressão de CAPRIN-1 na superfície de várias células cancerosas utilizando anticorpos monoclonais de ratinho n.° 1, n.° 2 e n.° 3 e anticorpos monoclonais de galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 . A seguir, as linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK-nu-1), as linhas celulares de cancro renal (Caki-1, Caki-2, A498 e ACHN), a linha celular de cancro de bexiga (T24), a linha celular de cancro de ovário (SKOV3), as linhas celulares de cancro pulmonar (QG56 e A549), as linhas celulares de cancro de pâncreas (Capan-2 e MIAPaCa-2), a linha celular de cancro de próstata (PC3), a linha celular de cancro de colo do útero (SW756) , a linha celular de fibrossarcoma (HT1080), as linhas celulares de tumor cerebral (TS8G, U87MG, U251, SNB19 e U373), as linhas celulares de cancro gástrico (MNK28 e MNK45), as linhas celulares de cancro colorretal (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 e HCT116), a linha celular de leucemia (AML5) e a linha celular de linfoma (Ramos) observadas como tendo expressão do gene CAPRIN-1 foram examinadas quanto à sua expressão de proteínas CAPRIN-1 na superfície celular usando os sobrenadantes da cultura contendo, respetivamente, o n.° 1, n.° 2 e n.0 3 obtidos no Exemplo 2 e os anticorpos monoclonals de galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.0 4 obtidos no Exemplo 3. Centrifugaram-se 106 células de cada linha celular num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cada sobrenadante de cultura (100 μΐ) contendo qualquer dos anticorpos n.° 1, n.° 2 e n.° 3 e anticorpos monoclonais de galinha n. 0 1, n.° 2, n. 0 3 e n.° 4 foi adicionado ao tubo e deixado a repousar durante 1 hora em gelo. Após lavagem com PBS, anticorpos de cabra anti-IgG (H+L) de ratinho marcados com FITC (fabricado por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) diluídos com PBS contendo FBS a 0,1 % para os anticorpos derivados de ratinho ou anticorpos de cabra anti-IgG (H+L) de galinha marcados com FITC (fabricados por SouthernBiotech) diluídos 100 vezes com PBS contendo FBS a 0,1 % para os anticorpos derivados de galinha foram aqui adicionados e deixados a repousar a 4 °C durante 30 minutos. Após lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). O controlo negativo utilizado foram células submetidas a reação apenas com anticorpos secundários. Como resultado, todas as células, cada tratada com qualquer dos anticorpos n.° 1, n.° 2 e n.° 3 e os anticorpos monoclonais de galinha n.° 1 a n.° 4 tiveram uma intensidade de fluorescência pelo menos 35 % mais forte do que aquela do controlo negativo. Isto demonstrou que as proteínas CAPRIN-1 são expressas na superfície da membrana celular das linhas celulares de cancro humano. As taxas de potenciação na intensidade de fluorescência foram expressas como as taxas de aumento na intensidade de fluorescência média (MFI) nas respetivas linhas celulares, que são calculadas de acordo com a seguinte fórmula.

Taxa de aumento na intensidade de fluorescência média (Taxa de potenciação na intensidade de fluorescência) (%) = ((MFI das células reagidas com os anticorpos anti-CAPRIN-1) - (MFI de controlo)) / (MFI de controlo) x 100 Exemplo 11 Atividade antitumoral contra células cancerosas do anticorpo contra o péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5)

De modo a avaliar os anticorpos contra o péptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) quanto à força da sua citotoxicidade contra células cancerosas que expressam CAPRIN-1, foi determinada atividade ADCC. Os anticorpos policlonais (preparados no Exemplo 5) contra o péptido mostrado na SEQ ID NO: 5 foram utilizados nesta avaliação. Uma avaliação semelhante foi realizada utilizando anticorpos policlonais contra outros péptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticorpos policlonais contra resíduos de aminoácidos 50 a 98 na sequência de aminoãcidos de CAPRIN-1 humana e anticorpos policlonais contra os resíduos de aminoãcidos 233 a 305 na sequência de aminoácidos de CAPRIN-1 humana, que foram preparados no Exemplo 5) como anticorpos para comparação ou os anticorpos de controlo derivados de soro de coelho preparados no Exemplo 5 como controlo negativo. 106 células da linha celular de cancro da mama MCF7, a linha celular de cancro colorretal humano HCT-116, a linha celular de cancro pancreãtico humano MIAPaCa-2, a linha celular de cancro renal humano Caki-2, e a linha celular de cancro pulmonar humano QG56 observadas como tendo expressão de CAPRIN-1 foram, cada uma, recolhidas num tubo de centrífuga de 50 ml e 100 pCi de crómio 51 foram depois aqui adicionados, seguido por incubação a 37 °C durante 2

horas. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI164 0 contendo soro fetal bovino a 10 % e adicionadas a 2 x 103 células/poço a uma placa de fundo em V de 96 poços. Os anticorpos policlonais contra o péptido derivado de CAPRIN-1 humano (SEQ ID NO: 5) e dois tipos de anticorpos policlonais contra outros péptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticorpos policlonais contra os resíduos de aminoãcidos 50 a 98 de CAPRIN-1 humana e anticorpos policlonais contra os resíduos de aminoãcidos 233 a 305 de CAPRIN-1 humana) foram cada aqui adicionados a 1 pg/poço. Linfócitos separados do sangue periférico humano de acordo com um método convencional foram ainda adicionados a 4 x 10a células/poço e cultivados durante 4 horas a 37 °C, 5 % de C02 - Depois da cultura, a quantidade de crómio (Cr) 51 libertada de a partir das células cancerosas danificadas foi medida no sobrenadante de cultura para calcular a atividade ADCC contra as células cancerosas devido aos anticorpos policlonais contra os péptidos derivados de CAPRIN-1 humana. Como resultado, todos os anticorpos policlonais obtidos por imunização com os péptidos parciais CAPRIN-1 humanos tendo a sequência de aminoãcidos dos resíduos de aminoãcidos 50 a 98 ou os resíduos de aminoãcidos 233-305 de CAPRIN-1 humana tiveram atividade inferior a 10 % contra a linha celular de cancro de mama humano MCF7, a linha celular de cancro colorretal humano HCT-116, a linha celular de cancro pancreático humano MIAPaCa-2, a linha celular de cancro renal humano Caki-2 e a linha celular de cancro pulmonar humano QG56. Em contraste, os grupos das células tratadas com os anticorpos policlonais contra o péptido derivado de CAPRIN-1 humana (SEQ ID NO: 5) exibiram uma atividade citotóxica de 25 % ou mais contra todas as linhas celulares de cancro. Os anticorpos de controlo negativo tiveram atividade inferior a 4 % contra todas as células cancerosas. Estes resultados revelaram que anticorpos contra CAPRIN-1 mostrada na SEQ ID NO: 5 exercem forte atividade citotóxica contra células cancerosas que expressam CAPRIN-1.

Estes resultados foram obtidos através da determinação da atividade citotóxica por, conforme descrito anteriormente, mistura do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, linfõcitos e 2 x 103 células de cada linha celular de cancro com crómio 51 incorporado; cultura das células durante 4 horas; depois da cultura, medição da quantidade de crómio 51 libertado para o meio e cálculo da atividade citotóxica contra cada linha celular de cancro de acordo com a seguinte fórmula*. *Expressão: Atividade citotóxica (%) = [Quantidade de crómio 51 libertada das células alvo tratadas com o anticorpo contra CAPRIN-1 e linfócitos] / [Quantidade de crómio 51 libertada a partir de células alvo tratadas com ácido clorídrico 1 N] x 100

Os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho n.° 1, n.° 2 e n. ° 3 obtidos no Exemplo 8 e os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n. ° 3 e n.° 4 obtidos no Exemplo 9 foram avaliados quanto à sua atividade citotóxica contra células de cancro humano. O sobrenadante de cultura de cada linha celular que produz qualquer de n.° 1, n.° 2 ou n.° 3 e os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.0 2, n.° 3 e n.° 4 foi purificado utilizando Hitrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.). Depois da substituição com PBS(-), a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 pm (fabricado por Millipore Corp.). O anticorpo resultante foi utilizado para o ensaio de atividade. 106 células da linha celular de cancro da mama MCF7, da linha celular de cancro colorretal humano HCT-116, da linha celular de cancro pancreático humano MIAPaCa-2, da linha celular de cancro renal humano Caki-2, e da linha celular de cancro pulmonar humano QG56 foram recolhidas num tubo de centrífuga de 50 ml e 100 pCi de crómio 51 foram depois aqui adicionados, seguido por incubação a 37 °C durante 2 horas. Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI1640 contendo FBS a 10 % e adicionadas a 2 x 103 células/poço a uma placa de fundo em V de 96 poços para preparar células alvo. Os anticorpos purificados (anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho η. ° 1, n.° 2 ou n.° 3 e anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n,° 3 e n.° 4) e os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos humano-ratinho 1 a 11 obtidos no Exemplo 8 foram cada um deles aqui adicionado a 1,3 pg/poço. Uma população de células contendo células NK humanas foi separada utilizando um método convencional a partir de linfócitos de sangue periférico humano preparados de acordo com um método convencional. A população de células contendo células NK humanas que foi utilizada nesta avaliação foi preparada da seguinte forma: células mononucleares de sangue periférico humano separadas usando uma solução de separação por gravidade específica

Histopaque para separação de células mononucleares de sangue periférico (Sigma-Aldrich Corp.) foram submetidas a reação com anticorpos marcados com corante fluorescente FITC (anticorpo anti-CD3 humano, anticorpo anti-CD20 humano, anticorpo anti-CD19 humano, anticorpo anti-CDllc humano ou anticorpo anti-HLA-DR (Becton e Dickinson e

Company)); e uma população celular contendo células NK não coradas com os anticorpos foi separada da mesma usando um classificador de células (FACS Vantage SE (Becton e

Dickinson and Company)), ou uma população de células foi separada com kit de separação de células NK humanas (fabricado por Miltenyi Biotec K.K.). A população celular separada contendo células NK foi adicionada à placa a 2 x 10b células/poço e cultivada durante 4 horas a 37 °C, 5 % de C02. Depois da cultura, a quantidade de crómio 51 libertada a partir das células tumorais danificadas foi medida no sobrenadante de cultura para calcular a atividade citotõxica de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células cancerosas. 0 controlo negativo utilizado foram células tratadas com anticorpos de controlo de isotipo. Como resultado, os anticorpos de controlo do isotipo utilizados e os anticorpos monoclonais comparativos quiméricos de humano-ratinho 1 a 11 tinham atividade citotóxica inferior a 5 % contra MCF7, menos de 3 % contra HCT-116, 7 % contra MIAPaCa-2, menos de 8 % contra Caki-2 e menos de 5 % contra QG56. Em contraste, o anticorpo monoclonal quimérico de humano-rato n.0 1 e os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1 a n.° 4 tiveram uma atividade citotóxica de 30 % ou mais contra MCF7, 19 % ou mais contra HCT-116, 2 8 % ou mais contra MIAPaCa-2, 34 % ou mais contra Caki-2 e 10 % ou mais contra QG56. Igualmente, os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho n.° 2 e n.° 3 tiveram uma atividade citotóxica de 32 % ou superior contra MCF7, 18 % ou superior contra HCT-116, 32 % ou mais contra MIAPaCa-2, 18 % ou mais contra Caki-2 e 10 % ou mais contra QG56. Igualmente, os anticorpos de controlo de isotipo utilizados e os anticorpos comparativos 1 a 11 utilizados tiveram atividade citotóxica inferior a 4 % contra todas as outras células cancerosas: linhas celulares de cancro de mama ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V e MRK-nu-1, linhas celulares de glioma T98G e U373, uma linha celular de cancro pulmonar A549, linhas celulares de cancro renal Caki-1 e ACHN, uma linha celular de cancro do colo do útero SW756, uma linha celular de cancro de bexiga T24, linhas celulares de cancro gástrico MKN28 e MKN45, uma linha celular de cancro colorretal SW480, uma linha celular de leucemia AML5 e uma linha celular de linfoma Ramos. Em contraste, os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho n.° 1, n.° 2 ou n.° 3 e os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 foram observados como tendo 10 % ou mais de atividade citotõxica contra estas linhas celulares. Estes resultados mostraram que os anticorpos monoclonais obtidos n.° 1, n.° 2 ou n.° 3 e anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha η. ° 1, n.° 2, n.° 3 e n.0 4 contra CAPRIN-1 danificam células cancerosas que expressam CAPRIN-1 através da sua atividade ADCC e foi demonstrado que os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-ratinho n.° 1, n.° 2 ou n.° 3 e os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 exibem uma atividade citotõxica mais forte contra células cancerosas humanas do que aquela dos anticorpos comparativos 1 a 11.

Igualmente, os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 foram avaliados da mesma forma como acima quanto à sua atividade citotõxica contra a linha celular de cancro de mama humano MDA-MB-436, a linha celular de cancro renal humano Caki-1, a linha celular de cancro pulmonar humano A549, a linha celular de cancro pancreático humano Panc-1 e as células de cancro colorretal humano DLD-1 observadas como tendo expressão do gene CAPRIN-1. Adicionalmente, os anticorpos quiméricos de humano-galinha n.° 1 e n.° 2 contra CAPRIN-1 descritos no Exemplo 4 do documento WO2011/096517 foram utilizados como anticorpos comparativos 12 e 13, respetivamente; foi utilizado um anticorpo quimérico de humano-galinha n.° 1 contra CAPRIN-1 descrito no Exemplo 4 do documento WQ2011/096519 como um anticorpo comparativo 13; um anticorpo quimérico de humano-galinha n.0 1 e anticorpos monoclonais de ratinho n.° 2, n.° 3, n.° 4, n.° 5 e n.° 6 contra CAPRIN-1 descritos no Exemplo 4 do documento WO2011/096528 foram utilizados como anticorpos comparativos, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 respetivamente; anticorpos monoclonais de ratinho n.° 1, n.° 2 e n.° 3 contra CAPRIN-1 descritos no Exemplo 3 do documento WO2011/096533 foram utilizados como anticorpos comparativos 20, 21 e 22, respetivamente; e anticorpos monoclonais de ratinho η.0 1, n.° 2 e n.° 3 contra CAPRIN-1 descritos no Exemplo 3 do documento WO2011/096534 foram utilizados como anticorpos comparativos 23, 24 e 25, respetivamente, para avaliação da atividade citotóxica. Especificamente, 106 células da linha celular de cancro colorretal humano DLD-1 foram recolhidas num tubo de centrífuga de 50 ml e 100 pCi de crómio 51 foram depois adicionados às mesmas, seguido por incubação a 37 °C durante 1 hora, Posteriormente, as células foram lavadas três vezes com um meio RPMI1640 contendo FBS a 10 % e adicionadas a 2 x 103 células/poço a uma placa de fundo em V de 96 poços para preparar células alvo. A seguir, os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1 a n.° 4 e os anticorpos comparativos 12 a 25 foram aqui adicionados a 1 pg/poço. Uma população de células contendo células NK humanas preparadas de acordo com um método convencional foi ainda aqui adicionada a 10s células/poço e cultivadas durante 4 horas a 37 °C, 5 % de C02. Depois da cultura, a quantidade de crómio 51 libertada a partir das células tumorais danificadas foi medida no sobrenadante de cultura para calcular a atividade citotóxica de cada anticorpo anti-CAPRIN-1 contra as células cancerosas. A citotoxicidade contra MDA-MB-436, Caki-1, A549 e Panc-1 também foi avaliada da mesma forma como acima. Como resultado, todos os anticorpos comparativos 12 a 25 apresentaram uma atividade citotóxica de 5 % ou menos contra MDA-MB-436, enquanto os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.0 1, n.° 2, n.0 3 e n.° 4 exibiram uma atividade citotóxica de 18 % ou mais contra esta linha celular. Todos os anticorpos comparativos 12 a 25 apresentaram uma atividade citotóxica de 5 % ou menos contra Caki-1, enquanto os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.0 1, n. ° 2, n. 0 3 e n.° 4 exibiram uma atividade citotóxica de 14 % ou mais contra esta linha celular. Todos os anticorpos comparativos 12 a 25 apresentaram uma atividade citotóxica de 5 % ou menos contra A549, enquanto os anticorpos monoclonals quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 exibiram uma atividade citotóxica de 12% ou mais contra esta linha celular. Todos os anticorpos comparativos 12 a 25 apresentaram uma atividade citotóxica de 5 % ou menos contra Pane-1, enquanto os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 exibiram uma atividade citotóxica de 18 % ou mais contra esta linha celular. Todos os anticorpos comparativos 12 a 25 apresentaram uma atividade citotóxica de 7% ou menos contra DLD-1, enquanto os anticorpos monoclonais quiméricos de humano-galinha n.° 1, n.° 2, n.° 3 e n.° 4 exibiram uma atividade citotóxica de 15% ou mais contra esta linha celular.

Estes resultados foram obtidos através da determinação da atividade citotóxica por, conforme descrito anteriormente, mistura do anticorpo anti-CAPRIN-1 utilizado na presente invenção, linfócitos (população celular contendo células NK) e 2 x 103 células de cada linha celular de cancro com crómio 51 incorporado; cultura das células durante 4 horas; depois da cultura, medição da quantidade de crómio 51 libertado para o meio e cálculo da atividade citotóxica contra cada linha celular de cancro de acordo com a seguinte fórmula*. *Expressão: Atividade citotóxica (%) = [Quantidade de crómio 51 libertada das células alvo tratadas com o anticorpo contra CAPRIN-1 e linfócitos] (população celular contendo células NK) ] / [Quantidade de crómio 51 libertada a partir de células alvo tratadas com ácido clorídrico 1 N] x 100

Exemplo 12 0 número de moléculas CAPRIN-1 na superfície de várias células cancerosas reconhecidas pelos anticorpos monoclonais anti-CAPRIN-1 n.° 1, n.° 2 e n.° 3

Linhas celulares de cancro da mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V e MRK- nu-1), linhas celulares de cancro renal (Caki-1, Caki-2, A498 e ACHN), uma linha celular de cancro de bexiga (T24), uma linha celular de cancro de ovário (SK0V3), linhas celulares de cancro pulmonar (QG56 e A549), linhas celulares de cancro pancreático (MIAPaCa-2 e Capan-2), uma linha celular de cancro de próstata (PC3), uma linha celular de cancro de colo do útero (5W756) , uma linha celular de fibrossarcoma (HT1080), linhas celulares de tumor cerebral (T98G, U87MG, U251, SNB19 e U373), linhas celulares de cancro gástrico (MNK28 e MNK4 5), linhas celulares de cancro colorretal (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 e HCT116), uma linha celular de leucemia (AML5) e uma linha celular de linfoma (Ramos) foram examinadas usando um kit de ensaio para o número de moléculas "QIFIKIT" (fabricado pela Dako Japan Inc.) para o número de moléculas de CAPRIN-1 na sua superfície celular reconhecidas pelos anticorpos monoclonais de ratinho n.° 1, n.° 2 e n.° 3 obtidos no Exemplo 2. De forma semelhante, o número de moléculas CAPRIN-1 na superfície destas várias células cancerosas também foi examinado utilizando os anticorpos monoclonais comparativos 1 a 11.

Especificamente, de acordo com o protocolo incluído no kit, cada anticorpo (anticorpos monoclonais de ratinho n.° 1, n.0 2 e n.° 3 e anticorpos comparativos 1 a 11) foi diluído em 5 pg/ml na concentração final com PBS, e esta diluição foi adicionada a cada linha celular e submetida a reação durante 30 minutos. Após lavagem com PBS, anticorpos anti-IgG de ratinho marcados com fluorescência ligados ao kit foram adicionados como anticorpos secundários, em conjunto com esferas de calibração ligadas ao kit, a cada linha celular e deixados a repousar durante 45 minutos em gelo. Cada linha celular e as esferas de calibração foram lavadas com PBS. Posteriormente, a intensidade de fluorescência foi medida usando FACSCalibur (Becton,

Dickinson e Company) para obter urn valor médio de intensidade de fluorescência (média) para todos os anticorpos descritos acima. 0 controlo negativo utilizado foram as células submetidas a reação com anticorpos de controlo de isotipo e também foi obtida uma média. Cada valor médio de intensidade de fluorescência (média) foi utilizado para calcular o número de moléculas de acordo com o protocolo incluído no kit. Como resultado, o número de moléculas CAPRIN-1 na superfície de várias células de cancro reconhecidas pelos anticorpos monoclonais de ratinho n.° 1, n.° 2 e n.° 3 foi de 105 ou mais por célula para todas as linhas celulares de cancro humano examinadas. Por outro lado, o número de moléculas reconhecidas pelos anticorpos comparativos 1 a 11 foi inferior a 105 por célula.

Aplicabilidade Industrial 0 anticorpo da presente invenção é útil no tratamento e/ou prevenção do cancro.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Toray Industries, Inc. <120> Composição farmacêutica para o tratamento e prevenção de cancro

<130> PH-5299-PCT <150> JP 2011-171300 <151> 04-08-2011 <160> 81 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 5562

<212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (190) . . (2319) <223 > <400> 1 cagagggctg ctggctggct aagtccctco cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcage tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 130 gcgcgcacg atg oco teg geo acc ago oao age ggg age ggc age aag teg 231

Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 15 10 tee gga cog oca ccg ccg teg ggt tee tee ggg agt gag geg gee geg 279

Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gee ggg gee gee geg ceg get tet cag cac cec gca acc ggc acc 327

Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gin His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc get gtc eag aeo gag gee atg aag cag att etc ggg gtg ate gac 375

Gly Ala Val Gin Thr Gin Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Val lie Asp 50 55 60 aag aaa ett egg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ett gat gat tac 423

Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa ega atg aac aaa ggg gaa agg ett aat caa gat cag ctg gat 471

Gin Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp 80 85 90 gee gtt tet aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gea aaa 519

Ala Val Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca eta agt caa gat att cag aaa aca 567

Glu Leu Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr 115 120 125 ata aag aag asa gca cgt egg gag cag ctt atg aga gaa gaa get gaa 615

He Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663

Gin lya Arg Leu Lys Thr val Leu Glu Leu Gin. Tyr Vai Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg egg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711

Leu Gly Asp Asp Glu Vai Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tea ttg ttg gat gaa ttc tat 759 val Pro lie Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr 175 180 185 190 aag cta gta gac cct gaa egg gac atg age ttg agg ttg aat gaa cag 807

Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin 195 200 205 tat gaa cat gee tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855

Tyr Glu ais Ala Ser He ais Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt cta aag gaa att gtt gag 903

Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu II· Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tea aac tac ttt gac age acc cac aac cac cag aat 951

Arg Val Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr Ris Asn His Gin Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gee tea gca cct gca gtt gaa gac 999

Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa get gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047

Gin Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin 275 280 285 agt gaa gtt gaa tea aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095

Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143

Thr Gin Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tea etc cag cag caa cct cag get gca 1191

Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala 320 325 330 tcc cct tea gta cca gag acc cac tet ttg act cca gtg get cag gca 1239

Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gca caa atg 1287

Asp Pro Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tea atg ctg gat ttt gaa aat 1335

Gin Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn 370 375 380 cag aca ctt gat cct gcc att gta tct gca cag cct atg aat cca aca 1383

Gin Thr Leu Asp Pro Ala Ila Val Sar Ala Gin Pro Mot Asn Pro Thr 385 390 395 caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tct gaa 1431

Gin Asci Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Gin 400 405 410 tct aga ctt get cag cct aat caa gtt cct gta caa cca gaa geg aca 1479

Ser Arg Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tea tcc aca agt gag ggg tac aca gca tct caa 1527

Gin Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tct cat get aca gag caa ega cca cag aag gaa 1575

Pro Leu. Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gca aca ate tct tta aat aca gac cag act 1623

Pro He Asp Gin He Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr 465 470 475 aca gca tea tea tcc ctt cct get geg tct cag cct caa gta ttt cag 1671

Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin val Phe Gin 480 485 490 get ggg aca age aaa cct tta cat age agt gga ate aat gta aat gca 1719

Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly lie Asn Val Asn Ala 495 ' 500 505 510 get cca ttc caa tcc atg caa aeg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767

Ala Pro Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815

Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin 530 535 540 gcc agt tat aac cag age ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863

Ala Ser Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Val Glu Gin 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911

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Gly Ser Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt age aat cag ccc tat tac aat 2007

Pro Gin Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Sar Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc cgt ggt get aga ggc ttg atg 2055

Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac egg ggc cct gcc aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103

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Gin Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 670 cag cag aat ttc aag ega ggc tet ggg cag agt gga cca egg gga gee 2247

Gin Gin Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 ' 680 685 cca ega ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg caa 2295

Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gin 690 695 700 atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt ttaatcgcca 2349 Met Asn Thr Gin Gin Vai Asn 705 aaaacacact ggccagtgta ceataatatg ttaccagaag agttattatc tatttgttct 2409 ccctttcagg aaacttattg taaagggact gttttcatcc cat&amp;aagaca ggactacaat 2469 tgtcagcttt ctattacctg gatatggaag gaaactattt ttactctgca tgttctgtcc 2529 taagcgtcat cttgagcett gcacatgata ctcagattcc tcacccttgc ttaggagtaa 2589 aacaatatac tttacagggt gataataatc tccatagtta tttgaagtgg ettgaaaaag 2649 gcaagattga cttttatgac attggataaa atctacaaat cagccctcga gttattcaat 2709 gataactgae aaactaaatt atttccctag aaaggaagat gaaaggagtg gagtgtggtt 2769 tggcagaaea actgcatttc acagctttte cagttaaatt ggagcactga acgttcagat 2829 gcataccaaa ttatgcatgg gtcctaatca cacatataag gctggctacc agctttgaca 2889 cagcactgtt catctggcca aacaactgtg gttaaaaaca catgtaaaat gctttttaac 2949 agctgatact gtataagaca aagccaagat gcaaaattag gctttgattg gcactttttg 3009 aaaaatatgc aacaaatatg ggatgtaatc cggatggccg cttctgtact taatgtgaaa 3069 tatttagata cctttttgaa cacttaacag tttctttgag acaatgactt ttgtaaggat 3129 tggtactatc tatcattcct tatgacatgt acattgtctg tcactaatcc ttggattttg 3189 ctgtattgtc acctaaattg gtacaggbac tgatgaaaat etetagtgga taatcataac 3249 actctcggtc acatgttttt ccttcagctt gaaagctttt ttt.taaaagg aaaagatacc 3309 aaatgcctgc tgctaccacc cttttcaatt gctatctttt gaaaggcacc agtatgtgtt 3369 ttagattgat ttccctgttt cagggaaatc acggacagta gtttcagttc tgatggtata 3429 agcaaaacaa ataaaacgtt tataaaagtt gtatcttgaa acactggtgt tcaacagcta 3489 gcagcttatg tgattcaccc catgccacgt tagtgtcaca aattttatgg tttatctcca 3549 gcaacatttc tctagtactt gcacttatta tcttttgtct aatttaacct taactgaatt 3609 ctccgtttct cctggaggca tttatattca gtgataattc cttcccttag atgcataggg 3669 agagtctcta aatttgatgg aaatggacac ttgagtagtg acttagcctt atgtactctg 3729 ttggaatttg tgctagcagt ttgagcacta gttctgtgtg cctaggaagt taatgctgct 3789 tattgtctca ttctgacttc atggagaatt aatcccacct ttaagcaaag gctactaagt 3849 taatggtatt ttctgtgcag aaattaaatt ttattttcag eatfctagccc aggaattctt 3909 ccagtaggtg ctcagctatt taaaaacaaa actattctca aacattcatc attagacaac 3969 tggagttttt gctggttttg taacctacca aaatggatag gctgttgaac attccacatt 4029 caaaagtttt gtagggtggt gggaaatggg ggatcttcaa tgtttatttt aaaataaaat 4089 aaaataagtt cttgactttt ctcatgtgtg gttgfcggtac atcatattgg aagggttaac 4149 ctgttacttt ggcaaatgag tatttttttg ctagcacctc cccttgcgtg ctttaaatga 4209 catctgcotg ggatgtacca caaccatatg ttacctgtat cttaggggaa tggataaaat 4269 atttgtggtt tactgggtaa tccctagatg atgtatgctt gcagtcctat ataaaactaa 4329 atttgctatc tgtgtagaaa ataatttcat gacatttaca atcaggactg aagtaagtto 4389 ttcacacagt gacctctgaa tcagtttcag agaagggatg ggggagaaaa tgccttctag 4449 gttttgaact tctatgcatt agtgcagatg ttgtgaatgt gtaaaggtgt tcatagtttg 4509 actgtttcta tgtatgtttt ttcaaagaat tgttcctttt tttgaactat aatttttctt 4569 tttttggtta ttttaccatc aoagt-ttaaa tgtatatctt ttatgtctct actcagacca 4629 tatttttaaa ggggtgcctc attatggggc agagaacttt tcaataagtc tcattaagat 4689 ctgaatcttg gttctaagoa ttctgtataa tatgtgattg cttgtcctag ctgcagaagg 4749 ccttttgttt ggtcaaatgc atattttagc agagtttcaa ggaaatgatt gtcacacatg 4809 tcactgtagc etcttggtgt agcaagctca catacaaaat acttttgtat atgcataata 4869 taaatcatct catgtggata tgaaacttct tttttaaaac ttaaaaaggt agaatgttat 4929 tgattacctt gattagggca gttttatttc cagafccctaa taafctcctaa aaaatatgga 4989 aaagtttttt tteaatcatt gtaccttgat attaaaacaa atatccttta agtatttcta 5049 atcagttagc ttctacagtt attttgtctc attttatatg oagctcttaa gtgggagaat 5109 tttccactta aaggagacat agaatgtgtg cttattctca gaaggttcat taactgaggt 5169 gatgagttaa caactagttg agcagtcagc ttcctaagtg ttttaggaca tttgttcatt 5229 atattttccg tcatataact agaggaagtg gaatgcagat aagtgccgaa ttcaaaccct 5289 tcattttatg tttaagctcc tgaatctgca ttccacttgg gttgttttta agcattctaa 5349 attttagttg attataagtt agatttcaca gaatcagtat tgcccttgat cttgtccttt 5409 ttatggagtt aacggggagg aagacccctc aggaaaacga aagtaaattg ttaaggctca 5469 tcttcatacc tttttccatt ttcjaatccta caaaaatacfc gcaaaaQ'act aQ'fccj'&amp;atQ'fc.t. 5559 taaaattaca ctagattaaa taatatgaaa gtc 5562

<210> 2 <211> 709 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

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Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30

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Val Gin Thr Glu Ala Met Lys Gin lie Leu Gly Val lie Asp Lys Lys 50 55 60

Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gin Glu 65 70 75 80

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Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110

Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr lie Lys 115 120 125

Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gin Lys 130 135 140

Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160

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Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin Tyr Glu 195 200 205

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Val Cys Gly Thr Thr ryr Lys Val Leu Lys Glu lie Val Glu Arg Val 225 230 235 240

Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn Gly Leu 245 250 255

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Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu Thr Gin 290 295 300

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Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala Ser Pro 325 330 335

Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gin Ala Asp Pro 340 345 350

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Met Asp Met Pro Gin Leu val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415

Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr Gin Val 420 425 430

Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin Pro Leu 435 440 445

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Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr Thr Ala 465 470 475 480

Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin Ala Gly 4B5 490 495

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Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Val Val Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575

Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro Pro Gin 580 585 590

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Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr The Gin Ser Gin Phe 645 650 655

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Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gin Met Asn 690 695 700

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<210> 3 <211> 3553 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (190) . . (2274) <223 > <400> 3 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgcco 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgeacg atg ccc teg gee ace age eac age ggg age gge age aag teg 231

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Gin Glu Arg Met Asn Lys Gly Gin Arg Leu Asn Gin Asp Gin Leu Asp 80 85 90 gee gtt tet aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519

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Gin Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg egg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711

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Pro Leu Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lya Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gea aca ate tet tta aat aca gac cag act 1623

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Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly lie Asn Val Aan Ala 495 500 505 510 get cca ttc caa tec atg caa aag gtg ttc aat atg aat gee cca gtt 1767

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Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin 530 535 540 gee agt tat aac cag age ttt tet agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863

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<210> 4 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

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Ser Lys Tyr Gin Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110

Gin Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gin Asp lie Gin Lys Thr lie Lys 115 120 125

Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gin Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu Gin Lys 130 135 140

Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gin Tyr Val Leu Asp Lys Leu Gly 145 150 155 160

Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gin Gly Leu Asn Gly Val Pro 165 170 175 lie Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr Lys Leu 180 185 190

Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gin Tyr Glu 195 200 205

His Ala Ser lie His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu Lys Pro 210 215 220

Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu lie Val Glu Arg Val 225 230 235 240

Phe Gin Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gin Asn Gly Leu 245 250 255

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Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gin Ser Glu 275 280 285

Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gin Phe Met Ala Glu Thr Gin 290 295 300

Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gin Val Asp Glu Trp Thr Val Glu Thr 305 310 315 320

Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gin Gin Gin Pro Gin Ala Ala Ser Pro 325 330 335

Ser val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro val Ala Gin Ala Asp Pro 340 345 350

Leu Val Arg Arg Gin Arg Val Gin Asp Leu Met Ala Gin Met Gin Gly 355 360 365

Pro Tyr Asn Phe lie Gin Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn Gin Thr 370 375 380

Leu Asp Pro Ala lie Val Ser Ala Gin Pro Met Asn Pro Thr Gin Asn 385 390 395 400

Met Asp Met Pro Gin Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu Ser Arg 405 410 415

Leu Ala Gin Pro Asn Gin Val Pro Val Gin Pro Glu Ala Thr Gin Val 420 425 430

Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gin Pro Leu 435 440 445

Tyr Gin Pro Ser His Ala Thr Glu Gin Arg Pro Gin Lys Glu Pro lie 450 455 460

Asp Gin lie Gin Ala Thr lie Ser Leu Asn Thr Asp Gin Thr Thr Ala 465 470 475 480

Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gin Pro Gin Val Phe Gin Ala Gly 485 490 435

Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly He Asn Val Asn Ala Ala Pro 500 505 510

Phe Gin Ser Met Gin Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro 515 520 525

Vai Asn Glu Pro Glu The Leu Lys Gin Gin Asn Gin Tyr Gin Ala Ser 530 535 540

Tyr Asn Gin Ser Phe Ser Ser Gin Pro His Gin Vai Glu Gin Thr Glu 545 550 555 560

Leu Gin Gin Glu Gin Leu Gin Thr Vai Vai Gly Thr Tyr His Gly Ser 565 570 575

Pro Asp Gin Ser His Gin Val Thr Gly Asn His Gin Gin Pro Pro Gin 580 585 590

Gin Asn Thr Gly Phe Pro Arg Ser Asn Gin Pro Tyr Tyr Asn Ser Arg 595 600 605

Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met Asn Gly 610 615 620

Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Arg 625 630 635 640

Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Gin Phe 645 650 655

Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gin Arg Asp Gly Tyr Gin, Gin 660 665 670

Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gin Ser Gly Pro Arg Gly Ala Pro Arg 675 680 685

Gly Asn lie Leu Trp Trp 690

<210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Vai Phe Asn Met Asn Ala Pro Val Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr 1 5 10 15

Leu Lys

<210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6

Ser Tyr Gly Met Ser 1 5

<210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7

Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10

<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8

Leu Ala Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 15 10 <210> 9

<211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9

Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 1 5 10 15

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin 20 25 30

Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly 35 40 45

Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser 50 55 60

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg 65 70 75 80

Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Ala Ser Tyr Tyr 35 90 95

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 10 <211> 15

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 10

Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie Asn Leu Asn 15 10 15 <210> 11 <211> 7

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 11

Gly Ala Ser Ser Leu Glu Asp 1 5

<210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12

Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Thr Phe 15 10

<210> 13 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13

Gly Ala Arg Cys Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15

Ala Ser Leu Gly Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly 20 25 30

Thr Ser lie Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Cys Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75 80

Ser Leu Glu Asp Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser 85 90 95

Tyr Leu Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110

Arg

<210> 14 <211> 330 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 14 gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc otgaaactct cctgtgcagc ctetggattc 60 actttcagta gctatggcat gtcttgggtfc cgccagactc cggagaagag gctggagtgg 120 gtcgcaacca ttagtagtgg tggtagttac acctactatc cagacagtgt gaagggtcga 180 ttcaccatct cc&amp;gagacaa tgccaagaac accctgtacc tgcaaatgag cagtctgagg 240 tctgaggaca cggccatgta ttactgtgca agcctggcct cctactactt tgactactgg 300 ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 330

<21Q> 15 <211> 339 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 15 ggtgccagat gtgatgtcca gatgattcag totocatcct ccctgtctgc atctttggga 60 gacatagtca ccatgacttg ccaggcaagt cagggcacta gcattaattt aaactggttt 120 cagcaaaaac cagggaaagc tcotaagctc ctgatctatg gtgcaagcag cttggaagat 180 ggggtcccat caaggttcag tggoagttgt tttgggacag atttcactct caccatcagc 240 agcctggagg atgaagatat ggcaacttat ttctgtctac agcatagtta tctccctccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgt 339

<210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

Thr Tyr Asp Leu His 1 5

<210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

Val lie Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe lie Ser 15 10 15

<21G> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18

Asn Tyr Gly Tyr Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp 15 10

< 210 > 19 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19

Gly Pro Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr 15 10 15

Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Asp Leu His Trp Val Arg Gin 20 25 30

Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val lie Trp Ser Gly Gly 35 40 45

Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe lie Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys 50 55 60

Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gin Ala 65 70 75 80

Asn Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Ala 85 90 95

Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

100 105 HO <210> 20

< 211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20

Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Sec Asn 15 10 15

<210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 22 <211> 9

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 22

Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5

<210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23

Pro Ala Ser Ser Ser Asp Vai Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15

Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin 20 25 30

Ser lie Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin 35 40 45

Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75 80

Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 85 90 95

Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 100 105 110

Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 <210> 24 <211> 333

<212> ADN <213> Mus musculus <400> 24 ggacctggcc tagtgcagcc ctcacagagc ctgtccatca cctgcacagt ctctggtttc 60 tcattgacta cctatgattt acactgggtt cgccagtctc caggaaaggg tctggagtgg 120

ctgggagtga tatggagtgg tggaagcaca gaotataatg cagctttcat atccagactg ISO agcatcagca aggacaattc caagagccaa gttttattta aaatgaacag tctgcaagct 240 aatgacacag caatatatta ctgrtgccaga aactacggct actccgcctg gtttgcttac 300 tggggceaag ggactetggt caetgtctct gca 333

<21G> 25 <211> 354 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 25 cctgcttcca gcagtgatgt tttgatgacc caaactccac tctccctgcc tgtcagtctt 60 ggagatcaag cctccatctc ttgcagatct agtcagagca ttgtacatag taatggaaac 120 acctatttag aatggtacct gcagaaacca ggocagtotc caaagotcot gatctacaaa 180 gtttccaacc gatttfcctgg ggtcccagac aggttcagtg gcagfcggatc agggacagat 240 ttcacactca agatcagcag acftggaggct gaggatctgg gagtttatta ctgctttcaa 300 ggttcacatg ttccgctcac gttcggtgct gggaccaagc tggagctgaa acgt 354

<210> 26 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe He Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp He Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 27 <211> 139 <212> PRT <213> Mu8 musculus <400> 27 M«t Ser Vai Leu Thr Gin Vai Leu Gly L*u Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45 lie His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro 50 55 60

Gin Leu Leu Vai Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Vai Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys lie Asn 85 90 95

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp 100 105 lio

Ser Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 115 120 125

Asp Ala Ala Pro Thr vai Ser Asn Pro Tyr Asp 130 135

<210> 28 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <4Q0> 28

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lya Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 29 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29

Ala Val Leu Arg Cys Ser Arg Gly Leu Leu Val lie Trp lie Ser Aap 15 10 15 lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly Glu 20 25 30

Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Trp Ser Val 35 40 45

Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Arg Gin Pro 50 55 60

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser lie Arg Glu Ser Trp Val Pro 65 70 75 80

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 85 90 95

Ser Asn Val His Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin His Asn 100 105 lio

His Gly Ser Phe Leu Pro Ser Arg Ser Glu Gin Val Pro Ser Trp Arg 115 120 125

Ser Asn Asn Arg 130

<210> 30 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 31 <211> 117 <212> PRT <213> Mu8 musculus <400> 31

Arg Thr Thr Ser His Met Asp Ser Asp lie Gin Leu Thr Gin Ser Pro 1 5 10 15

Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Arg 20 25 30

Ala Ser Gly Asn lie His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin 35 40 45

Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser 65 70 75 80

Leu Lys lie Asn Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 85 90 95

Gin His Phe Trp Ser Thr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 lie Lys Gin Ser Asp 115

<210> 32 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15

Vai Leu Ser Glu Vai Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Vai Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Vai Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 €0

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Vai Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Vai Tyr 145

<210> 33 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33

Ser Gly Asp Arg Vai Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser 15 10 15

Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30

Leu ile Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe 35 40 45

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Vai 50 55 60

Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp 65 70 75 30

Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gin 85 90

<210> 34 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gin Leu His Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60

Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80

Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140

Pro Ser Val Tyr 145

<210> 35 <211> 105 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35

Gly Leu Phe Cys Ser Val Glu Arg Cys His Tyr Gin Leu Gin Ser Ser 1 5 10 15

Gin Asn Leu Leu Ser lie Val Asn Arg Tyr His Tyr Met Ser Gly Asn 20 25 30

Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Pro Ala Leu Leu lie Tyr Glu Ala Ser 35 40 45 lie Thr Lys Ser Cys Val Pro Asp Arg Phe Thr Arg Ser Gly Ser Gly 50 55 60

Thr Asn Phe Thr Leu Thr lie Asn Phe Val His Ala Asp Asp Leu lie 65 70 75 80

Phe Tyr Tyr Cys Gin His Asn Arg Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ser Ser 85 90 95

Val Gin Val Pro Arg Arg Arg Ser Asn 100 105

< 210 > 36 <211> 100 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36

Asp lie Leu Gin Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 15 10 15

Trp Val Lye Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp lie Gly Leu lie 20 25 30

Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys 35 40 45

Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 50 55 60

Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp 65 70 75 80

Gly Val Trp Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 85 90 95

Val Ser Ser Lys 100

<210> 37 <211> 90 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37

Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Arg Thr Ala 15 10 15

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Arg Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie 20 25 30

Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Asp Thr Gly Leu Pro Asp Arg Phe Pro Gly 35 40 45

Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie Thr Asn Val Gin Ser 50 55 60

Glu Asp Leu Glu Asp Tyr Phe Cys Leu Gin His Cys Asn Tyr Pro Asn 65 70 75 80

Glu Phe Arg Gly Cys Thr Lys Val Pro lie 85 90 <210> 38 <211> 116

<212> PRT <213> Mus musculus <400> 38

Leu Gin Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 15 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gin 20 25 30

Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Ala lie 35 40 45

Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gin Leu 65 70 75 80

Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 85 90 95

Glu Tyr Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110

Val Ser Ser Asn 115

<210> 39 <211> 100 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39

Thr Ser Asp Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala 15 10 15

Ser Gin Asp lie Asn Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Lys Ser Pro Lys Thr Leu lie Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly 35 40 45

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu 50 55 60

Thr lie Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly lie Tyr Tyr Cys Leu 65 70 75 80

Gin Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 85 90 95 lie Lys Gin Lys 100

<210> 40 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40

Ala Trp Leu Ser Gin Leu Ser Cys Thr Ala Sec Gly Phe Asn lie Lys 15 10 15

Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu 20 25 30

Trp lie Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro 35 40 45

Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 50 55 60

Ala Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 65 70 75 80

Tyr Cys Ala Arg Pro lie His Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ala Tyr 85 90 95

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105

<210> 41 <211> 104 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41

Glu Phe His Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg 1 5 10 15

Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lye Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser 35 40 45

Asn Leu Glu Ser Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg 50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala

65 70 75 SO

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Gly Arg Ser Glu Val 85 90 95

Val Pro Ser Trp Arg Ser Asn Lys 100

<210> 42 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42

Pro Arg Ala Ser Leu Gly Val Ser Glu Thr Leu Leu Cys Thr Ser Gly 1 5 10 15

Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly 20 25 30

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe lie Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr 35 40 45

Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg 50 55 60

Asp Asn Ser Gin Ser lie Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala 65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Trp Ala Phe Asp 85 90 95

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys 100 105

<210> 43 <211> 94 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43

Ser Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser 1 5 10 15

Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu 20 25 30

Leu lie Lys Tyr Ala Ser Gin Ser lie Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe 35 40 45

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Ser Val 50 55 60

Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Asn Ser Trp 65 70 75 80

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Gin 85 90

<210> 44 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44

Pro Ala Cys Leu Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser 15 10 15

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Vai Arg Gin Pro Pro 20 25 30

Gly lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Aen Gly 35 40 45

Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 50 55 €0

Arg Asp Asn Ser Gin Ser lie Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Pro Leu Leu Tyr 85 90 95

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 100 105 110

<210> 45 <211> 102 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45

Arg Leu Pro Phe Tyr Ser Leu Glu Gin Arg Ala Thr lie Ser Tyr Arg 1 5 10 15

Ala Ser Lys Asn Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn 20 25 30

Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser 35 40 45

Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 €0

Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Gin His lie Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Leu Val 85 90 95

Pro Ser Trp Lys Ser Asn 100

< 210 > 4 6 <211> 101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46

Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 15 10 15

Trp Vai Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Met lie 20 25 30

Asp Pro Ser Asn Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys 35 40 45

Ala Thr Leu Asn Vai Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu 50 55 €0

Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 65 70 75 S0

Leu Arg His Tyr Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai 85 90 95

Thr Vai Ser Ser Lys 100

<210> 47 < 211> 9 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47

Thr lie Leu Trp Arg Glu Gly Pro Phe Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser 1 5 10 15

Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro 20 25 30

Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 35 40 45

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60

Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80

Gin His lie Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Glu Val Pro Ser Trp Arg 85 90 95

Ser Asn Lys

< 210 > 4 8 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val Ser val Leu Thr val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Yal Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 49 <211> 106 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15

Leu Lye Ser Gly Thr Ala Ser Val val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30

Pro Arg Glu Ala Ly« Val Gin Trp Lye Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45

Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 30

Hie Lye Val Tyr Ala Cye Glu Val Thr Hie Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

< 210 > 50 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50

Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn 15 10

<210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 52

< 211 > 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52

Gin Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 53

< 211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53

Gly Val lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Leu 15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr 20 25 30

Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 50 55 60

Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80

Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin 85 90 95

Gin Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110

Ile Lys Arg 115

<210> 54 <211> 345 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 54 ggggtcafcfcg fcgatgtcaea gtctecatcc fcecctagcfcg tgtcacttgg agagaaggtt 60 actatgagct gcaagtccag tcagagcctt ttatatagta gcaatcaaaa gaactacttg 120 gcctggtacc agcagaaacc agggcagtct cctaaactgc tgatttactg ggcatccact 130 agggaatctg gggtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctgggacaga tttcaotctc 240 accatcagca gtgtgaaggc tgaagacctg gcagtttatt actgtcagoa atattatago 300 tatccattca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa aacgt 345 < 210 > 55

< 211 > 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 55

His Ser Met Phe 1

<210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 56

Gly lie Tyr Gly Val Gly Arg Ser rie Arg Tyr Gly Ser Ala Val Lys 15 10 15

Gly

< 210 > 57 <211> 20 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 57

Ser Gly Tyr Phe Ser Asn Ser Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Ala Tyr Phe 15 10 15 lie Asp Ala Trp 20 < 210 > 58 <211> 127

< 212 > PRT <213> Gallus gallus <400> 58

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gin Thr Pro Gly Gly 15 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30

Ser Met Phe Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr val 35 40 45

Ala Gly He Tyr Gly Val Gly Arg Ser lie Arg Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Met Ser Arg Asp Asn Gly Gin Ser Thr Val Arg 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Ser Gly Tyr Phe Ser Asn Ser Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Ala 100 105 110

Tyr Phe He Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val He Val Ser 115 120 125

<210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 59

Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Tyr Gly 1 5

< 210 > 6 0 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 60

Tyr As η Asp Lys Arg Pro Ser 1 5

< 210 > 61 <211> 12 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 61

Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Ala Gly lie Phe 15 10

<210> 62 <211> 103 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 62

Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 15 10 15

Glu lie Thr Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Tyr Gly Trp Tyr Gin Gin 20 25 30

Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val lie Tyr Tyr Asn Asp Lys 35 40 45

Arg Pro Ser Asp lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60

Thr Ala Thr Leu Thr lie Thr Gly Val Gin Ala Glu Asp Glu Ala Val 65 70 75 80

Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Ala Gly lie Phe Gly 85 90 95

Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 100

<210> 63 <211> 127 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 63

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gin Thr Pro Gly Gly 15 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30

Ser Met Phe Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45

Ala Gly lie Tyr Gly Val Gly Arg Ser lie Arg Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Met Ser Arg Asp Asn Gly Gin Ser Thr Val Arg 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Ser Gly Tyr Phe Ser Asn Arg Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Ala 100 105 110

Tyr Phe lie Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val lie Val Ser 115 120 125

<210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 64

Glu Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5

<210> 65 <211> 103 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 65

Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val 1 5 10 15

Glu lie Thr Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Tyr Gly Trp Tyr Gin Gin 20 25 30

Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val lie Tyr Tyr Asn Asp Lys 35 40 45

Arg Pro Ser Asp lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 €0

Thr Gly Thr Leu Thr lie Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val

65 70 75 SO

Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Ala Gly lie Phe Gly 85 90 95

Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 100

<210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 66

Phe Gly Met Phe 1

<210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Gallus gallus <4Q0> 67

Ser lie Ser Asp Asn Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Ala Vai Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 68

Asn Ala Tyr Vai Gly Arg Gly Cys Cys Phe Ser Tyr Ser lie Asp Ala 1 5 10 15

Trp

< 210 > 6 9 <211> 124 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 69 Α1» val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Le« Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15

Giy Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30

Gly Met Phe Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45

Ala Ser He Ser Asp Asn Gly Arg Ser Thr Tvr Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr lie Ser Arg Asp Asp Gly Gin Ser Thr Val Arg 65 70 75 go

Leu Gin Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Asn Ala Tyr Val Gly Arg Gly Cys Cys Phe Ser Tyr Ser He 100 105 no

Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val He Val Ser 115 120

<210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 70

Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Ala Tyr Gly 15 10

<210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 71

Asn Gly Ser Asn Arg Pro Ser 1 5

<210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 72

Gly Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Vai Gly Ile Phe 15 10

< 210 > 73 <211> 106 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 73

Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Val Asn Pro Gly Glu Thr Val 15 10 15

Lys lie Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Ala Tyr Gly Trp 20 25 30

Tyr Gin Gin Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu lie Tyr Asn 35 40 45

Gly Ser Asn Arg Pro Ser His lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr 50 55 60

Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr lie Thr Gly Val Gin Val Glu Asp 65 70 75 80

Glu Ala lie Tyr Phe Cys Gly Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Val Gly 85 90 95 lie Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105

<21Q> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <4Q0> 74

Tyr Gly Met Gly 1

<210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 75

Ala He Arg Lys Asp Gly Set Tht Asn Tyt Gly Pro Ala Val Lys Gly 1 5 10 15

< 210 > 7 6 <211> 14 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 76

Arg Ser His Thr Gly Val Asn Ala Ala Lys lie Asp Ala Trp 15 10

<210> 77 <211> 120 <212> PRT <213> Gallus gallus <40G> 77

Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gin Thr Pro Gly Gly 15 10 15

Ala Val Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45

Ala Ala lie Arg Lys Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Pro Ala Val Lys 50 55 60

Gly Arg Ala Thr lie Ser Arg Asp Asn Gly Gin Ser Thr Val Arg Leu

65 70 75 SO

Gin Leu Ser Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys Arg Ser His Thr Gly Val Asn Ala Ala Lys lie Asp Ala Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Glu Val He Val Ser 115 120

<210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Gcil-l-tis cjcí3.-Ilzs <400> 78

Ser Gly Ala Ser His Asn Tyr Gly 1 5

< 210 > 7 9 <211> 7 <212> PRT <213> Gcil-l-tis cjcí3.-Ilzs <4QG> 79

Ser Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5

<210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 80

Gly Gly Tyr Asn lie Tyr Gly Pro Thr Phe 1 5 10

<210> 81 <211> 101 <212> PRT <213> Gallus gallus < 4 0 0 > 81

Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 15 10 15

Lys lie Thr Cys Ser Gly Ala Ser His Asn Tyr Gly Trp Phe Gin Gin 20 25 30

Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val lie Tyr Ser Asn Asp Lys 35 40 45

Arg Pro Ser Asp lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60

Thr Ala Thr Leu Thr lie Thr Gly Val Gin Ala Asp Asp Glu Ala Val 65 70 75 80

Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asn lie Tyr Gly Pro Thr Phe Gly Ala Gly 85 90 95

Thr Thr Leu Thr Val 100

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não ê parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5698396 A [0006] • WO 2010016526 A [0006] [0123] [0124] [0125] [0126] [0129] [0133] [0136] [0151] • WO 0243478 A [0054] • WO 02092812 A [0054] • JP2007530068 A[0055] • WO 9846777 A [0055] • EP 239400 A [0061] • WO 9602576 A [0061] • WO 9951743 A [0061] • WO 2011096519 A [0138] [0152] [0160] • WO 2011096517 A [0160] • WO 2011096528 A [0160] • WO 2011096533 A [0160] • WO 2011096534 A [0160] • JP 2011171300 A[0165]

Documentos de não patente citados na descrição • BOON et al. Ludwig Institute for Cancer Research, 1991 [0003] • TSUYOSHI AKIYOSHI. Japanese Journal of Cancer and

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Molecular Biology. AUSUBEL et al. Short Protocols in

Molecular Biology. John Wiley &amp; Sons, 1995 [0026] • Current Protocols in Molecular Biology. SAMBROOK et al. Molecular Cloning. 1989 [0027] • J. Immunol., 1979, vol. 123, 1548-1550 [0043] • Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, vol. 81, 1-7 [0043] • KOHLER. G. ; MILSTEIN, C. Eur. J. Immunol. , 1976, vol. 6, 511-519 [0043] • MARGULIES. D.H. et al. Cell, 1976, vol. 8, 405-415 [0043] • SHULMAN, M. et al. Nature, 1978, vol. 276, 269-270 [0043] • GROTH, S.F. et al. J. Immunol. Methods, 1980, vol. 35, 1-21 [0043] • TROWBRIDGE, I.S. J. Exp. Med., 1978, vol. 148, 313-323 [0043] • GALFRE, G. et al. Nature, 1979, vol. 277, 131-133 [0043] • KOHLER, G. ; MILSTEIN, C. Methods Enzymol., 1981, vol. 73, 3-46 [0044]

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um anticorpo ou um fragmento do mesmo que tem reatividade imunológica com um polipéptido CAPRIN-1 parcial que consiste na sequência de aminoácidos mostrada pela SEQ ID NO: 5, 2. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou o fragmento do mesmo tem atividade citotóxica contra uma célula cancerosa que expressa uma proteína CAPRIN-1. 3. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal. 4. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo policlonal, 5. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o anticorpo ê um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples ou um anticorpo muitiespecífico. 6. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 10, 11 e 12 e tem uma reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 7. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 16, 17 e 18 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22 e tem uma reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 8. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 50, 51 e 52 e tem uma reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 9. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 59, 60 e 61 e tem uma reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 10. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 55, 56 e 57 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 59, 64 e 61 e tem uma reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 11. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 66, 67 e 6 8 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 70, 71 e 72 e tem uma reatividade imunolõgica com a proteína CAPRIN-1.
2. 12. O anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 74, 75 e 7 6 e uma região variável de cadeia leve que compreende regiões de determinação de complementaridade das SEQ ID NOs: 78, 79 e 80 e tem uma reatividade imunológica com a proteína CAPRIN-1. 13. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o anticorpo ou o fragmento do mesmo é conjugado com um agente antitumoral. 14. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, para utilização num método para o tratamento e/ou prevenção de cancro. 15. 0 anticorpo ou o fragmento do mesmo para utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreãtico, cancro colorretal, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
3. 16. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 como um ingrediente ativo.
4. 17. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, para utilização num método para o tratamento e/ou prevenção de cancro.
5. 18. A composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreãtico, cancro colorretal, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
6. 19. Uma combinação farmacêutica que compreende uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16 e uma composição farmacêutica que compreende um agente antitumoral.
7. 20. A combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, para utilização num método para o tratamento e/ou prevenção de cancro.
8. 21. A combinação farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 20, em que o cancro é cancro da mama, cancro renal, cancro pancreãtico, cancro colorretal, cancro pulmonar, tumor cerebral, cancro gástrico, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro de próstata, cancro da bexiga, cancro esofágico, leucemia, linfoma, fibrossarcoma, mastocitoma ou melanoma.
9. 22. Um ADN que codifica o anticorpo ou o fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.