KR101979208B1 - 암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 암 항원 단백질을 표적으로 한 항체 및 그 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도, 구체적으로는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CAPRIN-1 부분 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트, 및 그것을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다.

Description

암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT AND/OR PROPHYLAXIS OF CANCER}

본 발명은 CAPRIN-1에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서 신규한 의약 용도에 관한 것이다.

암은 전체 사망 원인의 제 1 위를 차지하는 질환이고, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합시킨 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 상관없이, 일부의 암을 제외하고, 암의 치료 성적은 그다지 향상하고 있지 않는다는 것이 현재의 상태이다. 최근, 분자 생물학이나 암면역학의 진보에 의해, 암에 특이적으로 반응하는 항체류, 세포장해성 T 세포에 의해 인식되는 암항원류, 암항원을 코딩하는 유전자류 등이 동정되고 있고, 암항원류를 타겟으로 한 특이적 암치료법으로의 기대가 높아지고 있다(비특허문헌 1).

암치료법에 있어서는 부작용을 경감시키기 위해서, 그 항원으로서 인식되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 정상 세포에는 거의 존재하지 않고, 암 세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 바람직하다. 1991년, 벨기에국 Ludwig 연구소의 Boon 등은 자기암 세포주와 암반응성 T 세포를 사용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T 세포가 인식하는 인간 멜라노마 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 2).그 후, 암환자의 생체내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 종양 항원을 유전자의 발현 클로닝의 방법을 도입하여 동정하는 SEREX(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되고(비특허문헌 3 및 특허문헌 1), 이 방법에 의해, 정상 세포에는 거의 발현되지 않고, 암에 특이적으로 발현되는 몇개의 암항원이 단리되고 있다(비특허문헌 4∼9). 또한, 그 일부를 타깃으로 해서, 암항원에 특이적으로 반응하는 면역 세포를 사용한 세포 요법이나, 암항원을 포함하는 백신 등의 암특이적 면역 요법의 임상시험이 실시되고 있다.

한편, 최근, 암 세포상의 항원 단백질을 표적으로 한 암을 치료하기 위한 각종 항체 의약이 세상에 대두해 왔다. 암특이적 치료약으로서 일정한 약효가 얻어져 주목받고 있지만, 표적이 되는 항원 단백질의 대부분은 정상 세포에도 발현되는 것이어서, 항체 투여의 결과, 암 세포뿐만 아니라, 항원이 발현되는 정상 세포도 장해되어버려 그 결과 발생하는 부작용이 문제가 되고 있다. 따라서, 암 세포 표면에 특이적으로 발현되는 암항원을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체를 의약품으로서 사용할 수 있으면, 보다 부작용이 적은 항체 의약에 의한 치료가 가능하게 된다고 기대된다.

Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1(CAPRIN-1)은 정지기의 정상 세포가 활성화나 세포 분열을 일으킬 때에 발현되고, 또한 세포내에서 RNA와 세포내 스트레스 과립을 형성해서 mRNA의 수송, 번역의 제어에 관여하는 것 등이 알려져 있는 세포내 단백질로서 알려져 있었지만, 암 세포의 표면에 특이적으로 발현되는 것이 발견되어, 암치료를 위한 항체 의약의 타깃으로서 연구가 진행되고 있다(특허문헌 2).

미국특허 제5698396호 WO2010/016526

아키요시 쯔요시, 「암과 화학 요법」, 1997년, 제24권, p55-519(암과 화학요법사, 일본) Bruggen P.et al., Science, 254:1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995) Int.J. Cancer, 72:965-971(1997) Cancer Res., 58:1034-1041(1998) Int.J.Cancer, 29:652-658(1998) Int.J.Oncol., 14:703-708(1999) Cancer Res., 56:4766-4772(1996) Hum. Mol. Genet 6:33-39, 1997

본 발명의 목적은 암 세포의 표면에 특이적으로 발현되는 CAPRIN-1을 표적으로 한 종래의 항체보다도 항종양 활성이 뛰어난 항체를 제작하고, 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 이하의 특징을 갖는다.

본 발명은 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CAPRIN-1의 부분 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트, 및 그것을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다.

그 일실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 임파종, 섬유육종, 비만세포종 또는 멜라노마이다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 항체는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체이다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체(예를 들면, 2중 특이성 항체)이다.

본 명세서는 본원의 우선권 주장의 기초가 되는 일본국 특허 출원 2011-171300호의 개시 내용을 포함한다.

(발명의 효과)

본 발명에 따른 CAPRIN-1에 대한 항체는 암 세포를 장해한다. 따라서, CAPRIN-1에 대한 항체는 암의 치료나 예방에 유용하다.

본 발명에 따른 항체는 CAPRIN-1의 소정 부분 폴리펩티드를 인식해서 결합하는 항체이고, 항종양 활성을 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 보다 구체적으로는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열이 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, CAPRIN-1 단백질의 부분 폴리펩티드(CAPRIN-1 부분 폴리펩티드)를 인식하는(즉, 면역학적 반응성을 갖는다) 항체이다. 본 발명에서는 이 항체가 항종양 활성을 나타내는 것을 밝혔다. 본 발명은 상기와 같은 CAPRIN-1 단백질의 단편에 결합하고, 또한 항종양 활성을 나타내는 모든 항체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기의 CAPRIN-1에 대한 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체이어도 좋고, 예를 들면 재조합 항체, 예를 들면 합성 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면, 2중 특이성 항체), 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(scFv) 등, 인간 항체, 그들의 항체 프래그먼트, 예를 들면 Fab나 F(ab')₂, Fv 등을 포함한다. 이들 항체 및 그 프래그먼트는, 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 항체는 CAPRIN-1 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 즉, 항원-항체 반응을 통하여 CAPRIN-1 단백질과 결합하는, 바람직하게는 CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 여기서, 「CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합한다」란 CAPRIN-1 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 항체는 모노클론 항체인 것이 바람직하지만, 균질한 항체를 안정하게 산생할 수 있는 한, 폴리클론 항체이어도 된다. 또한, 피험자가 인간인 경우에는, 거절 반응을 회피 또는 억제하기 위해서 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 CAPRIN-1 폴리펩티드에 대한 항체의 항종양 활성은 후술하는 바와 같이, 생체내에서 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써, 또는 생체외에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여, 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타내는지 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상인 피험자는 인간, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등의 포유 동물이며, 바람직한 피험자는 인간이다.

이하에, 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.

<항체 제작용 항원의 제작>

본 발명에 따른 CAPRIN-1에 대한 항체를 취득하기 위한 감작 항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은 인간, 개, 소, 말, 마우스, 래트, 닭 등, 그 유래가 되는 동물종에 제한되지 않는다. 그러나, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 포유 동물 유래의 단백질이 바람직하고, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 예를 들면, CAPRIN-1이 인간 CAPRIN-1의 경우, 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드, 인간 CAPRIN-1을 발현하는 세포 등을 사용할 수 있다.

인간 CAPRIN-1 및 그 호모 로그의 염기 서열 및 아미노산 서열은 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)에 액세스하고, BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993； Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다.

본 발명에서는 인간 CAPRIN-1의 염기 서열(서열 번호 1 또는 3) 또는 아미노산 서열(서열 번호 2 또는 4)을 기준으로 한 경우, 이들의 ORF 또는 성숙 부분의 염기 서열 또는 아미노산 서열과 70%∼100%, 바람직하게는 80%∼100%, 보다 바람직하게는 90%∼100%, 더욱 바람직하게는 95%∼100%, 예를 들면 97%∼100%, 98%∼100%, 99%∼100% 또는 99.5%∼100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 핵산 또는 단백질이 타깃의 CAPRIN-1이 된다. 여기서, 「% 서열 동일성」은 2개의 서열을 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고, 최대의 유사도(또는 일치도)가 되도록 얼라인먼트(정렬)했을 때, 아미노산(또는 염기)의 총수에 대한 동일 아미노산(또는 염기)의 퍼센트(%)를 의미한다.

CAPRIN-1 단백질의 단편으로서는 항체가 인식하는 최소 단위인 에피토프(항원 결정기)를 포함하고, 또한 그 에피토프 아미노산 길이∼상기 단백질의 전장 미만의 길이를 갖는 것을 사용할 수 있다. 에피토프는 포유 동물, 바람직하게는 인간에 있어서, 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 나타내고, 그 최소 단위는 약 7∼12개 아미노산, 예를 들면 8∼11개 아미노산으로 이루어진다. 본 발명에 따른 항체의 제작에 사용하는 CAPRIN-1 단백질의 단편은 본 발명의 항체가 인식하는, 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그들의 아미노산 서열 중의 연속하는 약 7∼12개 아미노산, 예를 들면 연속하는 8∼11개 아미노산으로 이루어지는 에피토프를 적어도 포함하는 단편인 것이 바람직하다.

상기한 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 단편은 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법을 따라서 합성할 수 있다(일본 생화학회 편, 생화학 실험 강좌 1, 단백질의 화학 IV, 화학 수식과 펩티드 합성, 토쿄 화학 동인(일본), 1981년). 또한 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 통상의 방법에 의해 합성할 수도 있다.

또한, 공지의 유전자 공학적 방법(Sambrook 등, Molecular Cloning, 제2판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons 등)을 이용하여, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 조립하여 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포 중에서 폴리펩티드를 산생시킴으로써 목적으로 하는 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 폴리펩티드 단편을 얻을 수도 있다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 공지의 유전자 공학적 수법이나 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해, 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들면, 인간 CAPRIN-1 유전자의 염기 서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는cDNA 라이브러리를 주형으로서 사용하고, 상기 염기 서열을 증폭할 수 있게 설계한 한 쌍의 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 제조할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당하게 설정할 수 있고, 예를 들면 내열성 DNA 폴리메라제(예를 들면 Taq 폴리메라제, Pfu 폴리메라제 등) 및 Mg^{2 +} 함유 PCR 버퍼를 이용하여, 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초∼1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 하고, 예를 들면 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. PCR의 방법, 조건 등에 대해서는, 예를 들면 Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology, 제3판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히 제15장)에 기재되어 있다.

또한, CAPRIN-1 유전자의 염기 서열이나 CAPRIN-1 단백질의 아미노산 서열 정보에 기초하여 적당한 프로브나 프라이머를 제조하고, 그것을 이용하여 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 CAPRIN-1의 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한 세포나 조직의 예는 정소, 백혈병, 유방암, 임파종, 뇌종양, 폐암, 췌장암, 대장암 등의 암 또는 종양에서 유래하는 세포 또는 조직이다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 제조, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝, 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이고, 예를 들면 Sambrook 등, Molecular Cloning, 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Ausbel 등 (상기) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 DNA로부터, 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.

발현 벡터를 도입하는 상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현 가능한 세포이면 어떠한 것이어도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예 로서는 원숭이 신장세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유 동물 세포, 인간 태아 신장 세포주 HEK293, 마우스 태아 피부 세포주 NIH3T3, 출아 효모, 분열 효모 등의 효모 세포, 누에 세포, 개구리 난세포 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.

숙주 세포로서 원핵 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 멀티 클로닝 사이트, 터미네이터, 약제 내성 유전자, 영양 요구성 상보 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용할 수 있다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescript II, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터로 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.

숙주 세포로서 진핵 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용할 수 있다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 같이, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 조립하고, 상기 벡터로 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후, 얻어진 형질 전환체를 배양하면, 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용한 경우에는, His 태그(예를 들면 (His)₆∼(His)₁₀), FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서, 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.

발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 마이크로인젝션, 바이러스 감염, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.

숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합시켜서 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심 분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기 영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등이 열거되지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 항체를 제작하기 위해서, 이상과 같이 해서 제작한 항원을 후술한 바와 같이, 감작 항원으로서 사용할 수 있다.

<항체의 구조>

항체(면역 글로블린)은 통상, 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당 단백질이다. IgM은 별도로서, 면역 글로블린은 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당 단백질이다. 전형적으로는 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 각종 면역 글로블린 아이소 타입의 중쇄간의 디술피드 결합의 수는 변동한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는, 또한 쇄내 디술피드 결합도 갖는다. 각각의 중쇄는 일방 끝에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 그것에 몇 개의 정상 영역이 이어진다. 각각 경쇄는 가변 도메인(VL 영역)을 갖고, 그 반대 끝에 1개의 정상 영역을 갖는다. 경쇄의 정상 영역은 중쇄의 최초의 정상 영역과 정렬하고 있고, 또한 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬하고 있다. 항체의 가변 도메인은 특정한 영역이 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 특정한 가변성을 나타내서 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역의 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임 워크 영역(FR)이라고 불리고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 3개의 CDR은 중쇄에서는 그 N 말부터 순차적으로 CDRH 1, CDRH 2, CDRH 3, 마찬가지로 경쇄에서는 CDRL 1, CDRL 2, CDRL 3이라고 불리고 있다. 항체의 항원으로의 결합 특이성에는 CDRH 3이 가장 중요하다. 또한, 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 근접한 상태에서 함께 유지되어, 타방의 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 정상 영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여하지 않지만, 각종 이펙터 기능, 예를 들면 항체 의존성 세포성 세포 장해 활성(ADCC)으로의 관여, Fcγ 수용체로의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성 요소를 통한 보체 의존성 세포 장해(CDC)를 나타낸다.

<항체의 제작>

본 발명에 있어서의 항 CAPRIN-1 항체란 CAPRIN-1 단백질의 전장 또는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다. 특히, 본 발명의 항 CAPRIN-1 항체는 CAPRIN-1 단백질의 부분 폴리펩티드(CAPRIN-1 부분 폴리펩티드)이고 에피토프를 포함하는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 면역학적으로 결합하는 항체이다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중의 연속하는 약 7∼12개 아미노산, 예를 들면 연속하는 8∼11개 아미노산으로 이루어지는 에피토프를 인식한다. 본 발명의 이 항 CAPRIN-1 항체는 전장 CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편을 항원으로서 얻어진 항체 중에서, 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 면역학적으로 결합하는 항체를 통상의 방법에 의해 선택함으로써 취득할 수 있다.

여기서, 「면역학적 반응성」이란 생체내에서 항체와 CAPRIN-1 항원(CAPRIN-1 단백질의 전장 또는 그 부분 폴리펩티드)이 결합하는 특성을 의미한다. 본 발명의 항체의 CAPRIN-1로의 이러한 결합을 통하여 종양 세포를 장해(예를 들면 사멸, 억제 또는 퇴치 또는 축소)하는 기능이 발휘된다. 본 발명의 항체는 CAPRIN-1 단백질과 결합해서 종양, 예를 들면 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암(예를 들면 결장암), 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 임파종, 섬유육종, 비만세포종 또는 멜라노마 등을 장해할 수 있다.

본 발명의 항체는 임의의 종류(타입)의 항체이어도 된다. 본 발명의 항체의 종류의 예로서는 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 항체 프래그먼트(예를 들면, Fab나 F(ab')₂, Fv) 등을 포함한다. 또한, 항체는 면역글로블린 분자의 임의의 클래스, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY 또는 임의의 서브 클래스, 예를 들면 IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1, IgA 2 등이다.

항체는 글리코실화 이외에, 아세틸화, 포르밀화, 아미드화, 인산화 또는 페그(PEG)화 등에 의해 더 수식되어 있어도 된다.

이하에, 각종 항체의 제작예를 나타낸다.

항체가 모노클론 항체일 때에는, 예를 들면 CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 SK-BR-3 등을 마우스에 투여해서 면역하고, 동 마우스로부터 비장을 추출하고, 세포를 분리한 후, 상기 세포와 마우스 미엘로마 세포를 융합시키고, 얻어진 융합 세포(하이브리도마) 중에서 암 세포 증식 억제 작용을 갖는 항체를 산생하는 클론을 선택한다. 또는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드와 결합하는 항체를 산생하는 클론을 선택해도 된다. 암 세포 증식 억제 작용을 갖는 모노클론 항체 산생 하이브리도마 또는 서열 번호 5 등의 폴리펩티드에 대한 모노클론 항체를 산생하는 하이브리도마를 단리하고, 상기 하이브리도마를 배양하고, 배양 상청으로부터 일반적인 어피니티 정제법에 의해 항체를 정제함으로써 본 발명의 항체를 제조하는 것이 가능하다.

모노클론 항체를 산생하는 하이브리도마는 예를 들면, 이하와 같이 하여도 제작할 수 있다. 우선, 공지의 방법에 따라서, 감작 항원을 동물에 면역한다. 일반적 방법으로서 감작 항원을 포유 동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는 감작 항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리 식염수 등으로 적당량 희석, 현탁한 것으로 소망에 의해 통상의 아쥬반트, 예를 들면 프로인트 완전 아쥬반트를 적당량 혼합하고, 유화 후, 포유 동물에 4∼21일 마다 수회 투여한다. 또한, 감작 항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

이렇게 동물(전형적으로는, 포유 동물)을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 동물로부터 면역 세포를 채취하고, 세포 융합을 행하지만, 바람직한 면역 세포로서는 특히 비세포가 열거된다.

상기 면역 세포와 융합되는 타방의 친세포로서, 예를 들면 포유 동물의 미엘로마 세포를 사용할 수 있다. 이 미엘로마 세포로서는 공지의 각종 세포주, 예를 들면 P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978) 276, 269-270), FO(deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980)35, 1-21), S194(Trowbridge, I.S. J.Exp.Med.(1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277, 131-133) 등이 바람직하게 사용된다.

상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 콜러와 밀스테인 등의 방법(Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol.(1981) 73, 3-46) 등에 따라서 행할 수 있다.

보다 구체적으로는 상기 세포 융합은 예를 들면, 세포 융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 소망에 의해 융합 효율을 높이기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 더 첨가 사용할 수도 있다.

면역 세포와 미엘로마 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 미엘로마 세포에 대하여 면역 세포를 1∼10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는 예를 들면, 상기 미엘로마 세포주의 증식에 바람직한 RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, 그 밖의 이 종류의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 또한 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액(補掖)을 병용할 수도 있다.

세포 융합에서는 상기 면역 세포와 미엘로마 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1000∼6000 정도)을 통상 30∼60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 하이브리도마를 형성한다. 이어서, 적당한 배양액을 차차 첨가하고, 원심 해서 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거하는 것이 바람직하다.

이렇게 하여 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데 충분한 시간(통상, 몇일∼몇주일) 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 임파구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염된 인간 임파구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현 세포 또는 그 용해물로 감작하고, 감작 임파구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 미엘로마 세포, 예를 들면 U266(등록 번호 TIB196)과 융합시켜, 소망의 활성(예를 들면, 세포 증식 억제 활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다.

이렇게 하여 제작되는 모노클론 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하고, 또한 액체 질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.

즉, 소망의 항원이나 소망의 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의해, 모노클론 항체 세균이 고분자 물질을 생합성하는 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 목적의 모노클론 항체를 산생하는 하이브리도마를 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용 가능한 항체의 다른 예가 폴리클론 항체이다. 폴리클론 항체는 예를 들면, 다음과 같이해서 얻을 수 있다.

천연의 CAPRIN-1 단백질 또는 GST 등과의 융합 단백질로서 대장균 등의 미생물에 있어서 발현시킨 재조합 CAPRIN-1 단백질 또는 그 부분 펩티드를 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 토끼 등의 소동물에 면역해서 혈청을 얻는다. 또는, CAPRIN-1의 단편인 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(바람직하게는 상기 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드) 또는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 중의 연속하는 약 7∼12개 아미노산, 예를 들면 연속하는 8∼11개 아미노산으로 이루어지는 에피토프를 포함하는(바람직하게는 상기 에피토프로 이루어짐) 폴리펩티드를 감작 항원으로서, 포유 동물에 면역하고, 혈청을 얻을 수도 있다. 이들의 혈청을 예를 들면, 황산암모늄 침전, 단백질 A, 단백질 G 칼럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, CAPRIN-1 단백질이나 합성 펩티드를 커플링한 어피니티 칼럼 등에 의해 정제함으로써, 항 CAPRIN-1 폴리클론 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리클론 항체에는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 CAPRIN-1 단백질을 면역해서 얻어지는 항체가 포함된다.

여기서, 인간 항체 산생 마우스로서는 예를 들면, KM 마우스(키린 파머/Medarex) 및 Xeno 마우스(Amgen)이 알려져 있다(예를 들면, 국제공개 제WO02/43478호, 동 제 WO02/092812호 등). 이러한 마우스를 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편으로 면역할 때에는, 완전 인간 폴리클론 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역 후의 마우스로부터 비장 세포를 인출하고, 미엘로마 세포와의 융합법에 의해 인간형 모노클론 항체를 제작할 수 있다.

항원의 조제는 예를 들면, 동물 세포를 사용한 방법(일본 특허 공표 2007-530068)나 바큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면 국제공개 제 WO98/46777호 등)등에 따라서 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮을 경우에는 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜 면역을 행하면 된다. 항원은 아쥬반트와 함께 투여해서 면역해도 된다.

본 발명의 항체는 또한, 그 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 조합하는 기술을 사용하여 산생시킨 유전자 재조합형 항체로서도 얻을 수 있다(예를 들면, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체의 가변 영역(V 영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA가 얻어지면, 이것을 소망의 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 조립한다. 또한, 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 항체 C 영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 조립해도 된다. 발현 제어 영역, 예를 들면, 인핸서, 프로모터의 제어를 기초로 발현되도록 발현 벡터에 조립한다. 다음에 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하고, 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 항 CAPRIN-1 항체는 모노클론 항체인 것이 바람직하다. 그러나, 폴리클론 항체, 유전자 개변 항체(키메라 항체, 인간화 항체 등) 등이어도 된다.

모노클론 항체에는, 인간 모노클론 항체, 비인간 동물 모노클론 항체(예를 들면, 마우스 모노클론 항체, 래트 모노클론 항체, 토끼 모노클론 항체, 닭 모노클론 항체 등), 키메라 모노클론 항체 등이 포함된다. 모노클론 항체는 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편으로 면역한 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 닭, 토끼 등)로부터의 비세포와 미엘로마 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양함으로써 제작될 수 있다. 또는 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편으로 면역한 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 닭, 토끼 등)의 비세포의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 유전자를 링커를 통하여 파지미드 벡터에 조립하여 대장균에 도입하고, 헬퍼 파지를 통하여 단쇄형 항체로서 발현시킴으로써도 제작할 수 있다. 키메라 항체는 다른 동물 유래의 서열을 조합시켜서 제작되는 항체이고, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있고, 예를 들면 항체 V 영역을 코딩하는 DNA와 인간 항체 C 영역을 코딩하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 조립하여 숙주에 도입해서 산생시킴으로써 얻어진다.

또한, 후술의 실시예에 기재된 방법에 의해, 항종양 효과를 갖는 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 CAPRIN-1 부분 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 모노클론 항체가 제작된다. 이 모노클론 항체는 예를 들면, 서열 번호 9, 서열 번호 19, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 69 또는 서열 번호 77의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 영역과, 서열 번호 13, 서열 번호 23, 서열 번호 53, 서열 번호 62, 서열 번호 65, 서열 번호 73 또는 서열 번호 81의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 것이다. 본 모노클론 항체는 상기 VH 영역에 서열 번호 6, 서열 번호 16, 서열 번호 55, 서열 번호 66 또한 서열 번호 74의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR 1, 서열 번호 7, 서열 번호 17, 서열 번호 56, 서열 번호 67 또는 서열 번호 75의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR 2 및 서열 번호 8, 서열 번호 18, 서열 번호 57, 서열 번호 68 또는 서열 번호 76의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR 3을 포함하고, 상기 VL 영역에, 서열 번호 10, 서열 번호 20, 서열 번호 50, 서열 번호 59, 서열 번호 70 또는 서열 번호 78의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR 1, 서열 번호 11, 서열 번호 21, 서열 번호 51, 서열 번호 60, 서열 번호 64, 서열 번호 71 또는 서열 번호 79의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR 2 및 서열 번호 12, 서열 번호 22, 서열 번호 52, 서열 번호 61, 서열 번호 72 또는 서열 번호 80의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR 3을 포함할 수 있다.

인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역으로 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다.

구체적으로는, 예를 들면 마우스 항체, 토끼 항체나 닭 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임 워크 영역(framework region； FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 오버래핑하는 부분을 갖도록 제작한 몇 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 조립하고, 이것을 숙주에 도입해 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허 출원공개 제EP239400호, 국제공개 제WO96/02576호 참조). CDR을 통하여 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임 워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53:851-856). 또한, 각종 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역에 치환해도 된다(국제공개 제WO99/51743호 참조).

CDR을 통하여 연결되는 인간 항체의 프레임 워크 영역은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임 워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53:851-856).

키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에, 가변 영역(예를 들면 FR)이나 정상 영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 등해도 된다.

아미노산의 치환은 예를 들면, 15개 미만, 10개 미만, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 아미노산, 바람직하게는 1∼5개 아미노산, 보다 바람직하게는 1개 또는 2개 아미노산의 치환이고, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사하는 아미노산간의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은 예를 들면, 염기성 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파라트산, 글루탐산), 무전하 극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 무극성 아미노산(로이신, 이소로이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분기쇄 아미노산(로이신, 발린, 이소로이신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.

항체 수식물로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

여기서 「기능적으로 동등」이란 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 같은 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 장해하는 기능을 갖는 것, 인간으로의 적용시에 거절 반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 나타낸다. 이러한 활성으로서는 예를 들면 세포 증식 억제 활성 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.

어떤 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 제조하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492, Kunkel(1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 이용하여, 본 발명의 항체에 적당하게 변이를 도입함으로써 상기 항체와 기능적으로 동등한 항체를 제조할 수 있다.

상기 CAPRIN-1 단백질의 에피토프 또는 그것을 포함하는 CAPRIN-1 단편 폴리펩티드를 인식하는 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 얻어지는 것이 가능하다. 예를 들면 상기에서 얻어지는 암 세포 증식 억제 작용을 갖는 항 CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면, 에피토프 매핑이나 후술에 있는 에피토프의 동정의 방법 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법에 의해 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항 CAPRIN-1 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 얻어질 수 있다. 여기서, 「에피토프」는 포유 동물, 바람직하게는 인간에 있어서, 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 나타내고, 그 최소 단위는 약 7∼12개 아미노산, 바람직하게는 8∼11개 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 항체는 CAPRIN-1과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식하는 항체, 또는 CAPRIN-1과 특이적으로 결합하는 항체이며, 암에 대한 세포 장해 활성 또는 종양 증식 억제 작용을 나타내는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상 동물에 있어서 거절 반응이 거의 또는 완전히 회피되는 구조를 갖는 항체인 것이 바람직하다. 그러한 항체로서는 예를 들면, 대상 동물이 인간인 경우, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면 인간-마우스 키메라 항체), 단쇄 항체, 2중 특이성 항체 등이 열거된다. 이들 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 항체 유래의 것이거나 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물 항체 유의 상보성 결정 영역(CDR 1, CDR 2 및 CDR 3)과 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역으로 이루어지는 것이거나, 또는 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 비인간 동물항체 유래의 것이고, 또한 중쇄 및 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 것인 재조합형 항체이다. 바람직한 항체는 앞의 2개의 항체이다.

이들의 재조합형 항체는 다음과 같이 해서 제작할 수 있다. 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 인간 CAPRIN-1에 대한 모노클론 항체(예를 들면, 인간 모노클론 항체, 마우스 모노클론 항체, 래트 모노클론 항체, 토끼 모노클론 항체, 닭 모노클론 항체 등)를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 해서 상기 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하고, Kabat EU numbering system(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 기초하여 경쇄 및 중쇄의 각 가변 영역의 서열 또는 각 CDR 1, CDR 2, CDR 3의 서열을 결정한다.

또한, 이들의 각 가변 영역을 코딩하는 DNA 또는 각 CDR을 코딩하는 DNA를 유전자 재조합 기술(Sambrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 또는 DNA 합성기를 이용하여 제작한다. 여기서, 상기 인간 모노클론 항체 산생 하이브리도마는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 인간 CAPRIN-1을 면역한 후, 상기 면역 동물로부터 절제한 비세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이것과는 별도로, 필요에 따라, 유전자 재조합 기술 또는 DNA 합성기를 이용하여 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역을 코딩하는 DNA를 제작한다.

인간화 항체의 경우에는 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 중의 CDR 코딩 서열을, 그들에 대응하는 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 닭 등) 유래의 항체의 CDR 코딩 서열과 치환한 DNA를 제작하고, 그것에 의해서 얻어진 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써, 인간화 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.

키메라 항체의 경우에는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 닭 등) 유래의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써, 키메라 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다.

단쇄 항체의 경우에는 이 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 링커를 통하여 직선상으로 연결된 항체이고, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 링커를 코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 결합함으로써 단쇄 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래인 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다. 또한, 링커는 12∼19개 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15개 아미노산의 (G₄S)₃(G.-B. Kim 등, Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432)가 열거된다.

2중 특이성 항체(diabody)의 경우에는 이 항체는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이고, 예를 들면 중쇄 가변 영역 A를 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA, 중쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역 A를 코딩하는 DNA를 이 순서로 결합하는(단, 경쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA와 중쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA는 상기와 같은 링커를 코딩하는 DNA를 통하여 결합된다) 것에 의해 2중 특이성 항체를 코딩하는 DNA를 제작할 수 있다. 여기서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면 마우스, 래트, 토끼, 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다.

상기한 바와 같이 해서 제작된 재조합 DNA를 1개 또는 복수의 적당한 벡터에 조립하고, 이것을 숙주 세포(예를 들면, 포유 동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입하고, (공)발현시킴으로써 재조합형 항체를 제작할 수 있다(P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS； J.W. Goding., Monoclonal Antibodies： principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

상기의 방법에 의해 제작되는 본 발명의 항체로서는 예를 들면, 후술의 실시예에서 취득된 이하의 (a)∼(g)의 항체가 열거된다.

(a) 서열 번호 6, 7 및 8의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 10, 11 및 12의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 9의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 13의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(b) 서열 번호 16, 17 및 18의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 20, 21 및 22의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 19의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 23의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(c) 서열 번호 6, 7 및 8의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 50, 51 및 52의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 9의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(d) 서열 번호 55, 56 및 57의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 59, 60 및 61의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 58의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 62의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(e) 서열 번호 55, 56 및 57의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 59, 64 및 61의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 63의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 65의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(f) 서열 번호 66, 67 및 68의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 70, 71 및 72의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 69의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 73의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

(g) 서열 번호 74, 75 및 76의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 78, 79 및 80의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 77의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 81의 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).

여기서, 서열 번호 6, 7 및 8, 서열 번호 16, 17 및 18에 나타내는 아미노산 서열은 각각, 마우스 항체 유래의 중쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3이고, 또한 서열 번호 10, 11 및 12, 서열 번호 20, 21 및 22, 서열 번호 50, 51 및 52에 나타내는 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 유래의 경쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3이다. 서열 번호 55, 56 및 57, 서열 번호 66, 67 및 68, 및 서열 번호 74, 75 및 76에 나타내는 아미노산 서열은 닭 항체 유래의 중쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3이고, 또한 서열 번호 59, 60 및 61, 서열 번호 59, 64 및 61, 서열 번호 70, 71 및 72, 및 서열 번호 78, 79 및 80에 나타내는 아미노산 서열은 닭 항체 유래의 경쇄 가변 영역의 CDR 1, CDR 2 및 CDR 3이다.

또한, 본 발명의 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중 특이성 항체는 예를 들면 이하의 항체이다. 이하에는 항체(a)에 대해서 예시하지만, 다른 항체(b)∼ (g)에 관해서도 동일한 형태가 있을 수 있다.

(i) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 6, 7 및 8의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체.

(ii) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 6, 7 및 8의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임 워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체.

(iii) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체.

또한, 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 정상 영역 및 가변 영역의 서열은 예를 들면 NCBI(미국:GenBank, UniGene 등)로부터 입수 가능하고, 예를 들면 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에 관해서는 등록 번호 J00228, 인간 IgG2 중쇄 정상 영역에 관해서는 등록 번호 J00230, 인간 IgG3 중쇄 정상 영역에 관해서는 등록 번호 X03604, 인간IgG4 중쇄 정상 영역에 관해서는 등록 번호 K01316, 인간 경쇄 κ정상 영역에 관해서는 등록 번호 V00557, X64135, X64133 등, 인간 경쇄 λ정상 영역에 관해서는 등록 번호 X64132, X64134 등의 서열을 참조할 수 있다.

상기 항체는 바람직하게는 세포 장해 활성을 갖고 있고, 이것에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 상기 항체에 있어서의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이나 CDR의 특정한 서열은 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 특정한 서열에 한정되지 않는 것은 명확하다. 인간 CAPRIN-1에 대한 다른 인간 항체 또는 비인간 동물 항체(예를 들면, 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 산생하는 모노클론 항체를 회수하고, 인간 CAPRIN-1과의 면역학적 결합성 및 세포 장해 활성을 지표로서 목적의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해서 목적의 모노클론 항체 산생 하이브리도마를 식별한 후, 상기한 바와 같이, 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제작하여 서열 결정하고, 상기 DNA를 다른 항체의 제작을 위해 이용한다.

또한, 상기 항체는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식한다고 하는 특이성을 갖는 한, 상기 (a)∼(g)의 각 항체의 특히 CDR 이외의 영역, 예를 들면 프레임 워크 영역의 서열 및/또는 정상 영역의 서열에 있어서, 1개 또는 몇 개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가가 있어도 된다. 여기서 몇 개란, 바람직하게는 2∼5개, 보다 바람직하게는 2개 또는 3개를 의미한다.

본 발명의 항체의 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편에 대한 친화 정수Ka(k_on/k_off)는 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1 또는 적어도 10¹³M^-1이다.

본 발명의 항체는 항종양제와 콘쥬게이팅할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면, 숙신산 이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)을 갖는 스페이서를 통하여 행할 수 있다.

항종양제의 예는, 문헌 등에서 공지된 하기의 항종양제, 즉, 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조도파, 칼보콘, 머츄어도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신(bullatacin), 불라타시논, 캄프토테신(camptothecin), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), 크립토피신 1(cryptophycin 1), 크립토피신 8, 돌라스타틴(dolastatine), 듀오카마이신(duocarmycin), 엘루테로빈( eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕틴(sarcodictyin), 설폰디스타틴, 클로람부실(chlorambucil), 클로나파진(chlornaphazine), 클로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine), 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란(melphalan), 노벰비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실무스타드(uracil mustard), 칼무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴(lomustine), 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아미신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트(clodronate), 에스페라마이신, 아클라시노마이신(aclacinomycin), 액티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르로이신, 아드리아마이신(adriamycin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페프로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 우베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미푸린, 티오구아닌, 안시타빈(ancitabine), 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카모풀(karmofu), 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine); 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄, 프롤린산(frolinic acid), 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미토크산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피랄비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조피란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테뉴아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 로리딘(roridine) A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토부로니톨, 미톨락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 독세탁셀(docetaxel), 클로람부실, 겜시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 에토포시드(etoposide), 이포스파미드, 마이토크산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈(vinorelbine), 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드론에이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라제 인히비터(topoisomerase inhibitor), 디플루오로메틸올니틴(DMFO), 레티노인산, 카페시타빈(capecitabine) 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 포함한다.

또한, 본 발명의 항체와 항종양제를 병용 투여함으로써 보다 높은 치료 효과를 얻을 수 있다. 본 방법은 CAPRIN-1이 발현되고 있는 암환자에 대하여, 외과적 수술 전후 모두 있어서 적응할 수 있다. 특히, 수술 후에 종래 항종양제 단독으로 처치되고 있던 CAPRIN-1이 발현되고 있는 암에 대하여, 보다 높은 암재발 방지나 생존 기간의 연장이 얻어진다.

본 발명의 항체와의 병용 투여에 사용되는 항종양제의 예는 문헌 등에서 공지된 하기의 항종양제, 즉, 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조도파(benzodopa), 칼보콘, 머츄어도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸올로멜라민(trimethylolomelamine), 불라타신, 불라타시논, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토피신 1, 크립토피신 8, 돌라스타틴, 듀오카마이신, 엘루테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴(sarcodictyin), 설폰디스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chlornaphazine), 클로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실무스타드(mustard), 칼무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아마이신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트, 에스페라마이신, 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 칼미노마이신, 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이신, 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르로이신(norleucine), 아드리아마이신(adriamycin), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페프로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미푸린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카모풀, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄, 프롤린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미토크산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나메트(phenamet), 피랄비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조피란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테뉴아존산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 로리딘(roridine) A, 안구이딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토부로니톨, 미톨락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 독세탁셀, 클로람부실, 겜시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 이포스파미드, 마이토크산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트렉세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드론에이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소머라제 인히비터, 디플루오로메틸올니틴(DMFO), 레티노인산, 카페시타빈(capecitabine) 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 (공지의) 염 또는 (공지의) 유도체도 포함한다. 상기 중, 특히 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 독세탁셀, 비노렐빈이 바람직하게 사용된다.

또한, 본 발명의 항체에는, 문헌 등에서 공지된 ²¹¹At, ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁵³SM, ²¹²Bi, ³²P, ¹⁷⁵Lu, ¹⁷⁶Lu 등의 방사성 동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성 동위체는 종양의 치료나 진단을 위해 유효한 것이 바람직하다. 이러한 방사성 동위체도 본 발명에 있어서의 항종양제에 포함된다.

<에피토프의 동정>

본 발명의 항체는 이하의 실시예에 나타내는 바와 같이, 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 에피토프로 한다. 본 발명의 항체에 대한 에피토프를 확인하는 방법의 하나로서, 서열 번호 5의 폴리펩티드(에피토프)를 플레이트에 고정화하고, 본 에피토프에 대한 항체의 반응성을 평가하는 방법이 열거된다. 구체적으로는 올리고에틸렌글리콜 등의 스페이서를 통하여 흡전자성 관능기가 붙은 플레이트에 서열 번호 5의 폴리펩티드를 반응시켜서 고정화한 것에 본 발명의 항체를 반응시켜, HRP(Horseradish Peroxidase) 등으로 표식된 본 발명의 항체에 결합하는 2차 항체를 반응시킴으로써 항체의 반응성을 평가(본 발명의 항체의 에피토프를 확인)할 수 있다. 또한, 플레이트에 고정화하는 서열 번호 5의 폴리펩티드는 본 서열 그 자체 또는 일부 수식된 것(N 말단 잔기나 C 말단 잔기에 몇 개의 임의의 아미노산이나 KLH 등의 단백질이 수식된 것, 혹은 MAP 단백질에 폴리펩티드를 수식한 것 등)이 사용되고, 이들 중 어느 하나의 펩티드에 대하여 본 발명의 항체가 결합하면 된다.

한편, 본 발명의 항체이어도 상기 방법으로 서열 번호 5의 폴리펩티드에 반응하지 않는(에피토프를 확인할 수 없음) 경우가 있다. 그 경우에는, 실시예 2에 기재된 바와 같이 항원과 항체가 결합하기 쉬운 용액 조건 하에서 항원과 항체를 반응시켜 면역 침강법에 의해 항원-항체 복합체를 취득한 후, 항체에 결합한 부분의 폴리펩티드를 분리하고, 그 아미노산 서열을 조사함으로써 본 발명의 항체의 에피토프를 확인할 수 있다. 또한, 항원은 상기의 서열 번호 5의 폴리펩티드 그 자체, 일부 수식된 것 또는 CAPRIN-1 단백질이어도, 상기 방법으로 본 발명의 항체가 반응하는 에피토프가 확인되면 된다.

<항종양 효과>

본 발명에서 사용되는 항 CAPRIN-1 항체에 의한 CAPRIN-1 발현암 세포에 대한 항종양 효과는 이하의 기서에 의해 일어난다고 생각된다: CAPRIN-1 발현 세포의 이펙터―세포 항체 의존적 세포 장해성(ADCC) 및 CAPRIN-1 발현 세포의 보체 의존적 세포 장해성(CDC). 단, 이 기서에 의해 본 발명의 범위를 한정하는 것은 의도하지 않는다.

또한, 상기 기서에 의한 항종양 효과는 암 세포의 세포 표면에 발현되는 항체가 결합하는 표적 분자의 수에 상관하는 것이 알려져 있다(Niwa R., Clinical Cancer Research 2005 Mar 15; 11(6):2327-2336). 암 세포의 세포 표면에 발현되는 표적 분자의 수는 세포 표면의 분자수를 측정할 수 있는 기존의 측정 키트를 이용하여 조사하는 것이 가능하다. 즉, 항체가 결합하는 표적 분자의 수는 표적 분자 에 대한 항체 등을 1차 항체로서 암 세포에 반응시키고, 미리 분자수가 알려진 검량선 비드와 함께, 형광 표식된 항1차 항체를 반응시켜, 샘플의 평균 형광 강도를 측정하고, 검량선을 얻어서 표적 분자의 수를 알 수 있다.

따라서, 본 발명에서 사용되는 항 CAPRIN-1 항체의 활성 평가는 이하 실시예에 구체적으로 나타내는 바와 같이, 생체외에서 CAPRIN-1을 발현하는 암 세포에 대하여 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정하는 것 또는 본 발명에 있는 항 CAPRIN-1 항체를 1차 항체로서 사용한 경우의 암 세포의 세포 표면에 발현하는 CAPRIN-1 분자의 수를 조사함으로써 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 항 CAPRIN-1 항체는 암 세포상의 CAPRIN-1 단백질과 결합하고, 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내기 때문에, 암의 치료 또는 예방에 유용하다고 생각된다. 즉, 본 발명은 항 CAPRIN-1 항체를 유효 성분으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항 CAPRIN-1 항체를 인체에 투여하는 목적(항체 치료)으로 사용하는 경우에는 면역원성을 저하시키기 때문에, 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.

또한, 항 CAPRIN-1 항체와 암 세포 표면상의 CAPRIN-1 단백질의 결합 친화성이 높을수록 항 CAPRIN-1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, 본 발명의 항체는 CAPRIN-1 단백질과 높은 결합 친화성을 갖기 때문에, 보다 강한 항종양 효과를 기대할 수 있고, 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능하게 된다. 본 발명의 항체는 높은 결합 친화성으로서, 상술한 바와 같이, 결합 정수(친화 정수) Ka(k_on/k_off)가 바람직하게는 적어도 10⁷M^-1, 적어도 10⁸M^-1, 적어도 5×10⁸M^-1, 적어도 10⁹M^-1, 적어도 5×10⁹M^-1, 적어도 10¹⁰M^-1, 적어도 5×10¹⁰M^-1, 적어도 10¹¹M^-1, 적어도 5×10¹¹M^-1, 적어도 10¹²M^-1 또는 적어도 10¹³M^-1을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 항 CAPRIN-1 항체와 결합하는 암 세포 표면상의 CAPRIN-1 분자의 수가 많을수록 항 CAPRIN-1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 항종양 효과를 기대하기 위해서는 CAPRIN-1 분자의 수는 본 발명의 항 CAPRIN-1 항체를 측정에 사용한 경우에 상기 항체가 결합하는 암 세포 1개당의 CAPRIN-1 분자의 수가 10⁴개 이상, 바람직하게는 10⁵개 이상이 바람직하다. 세포 표면상의 CAPRIN-1 분자의 수가 많은 종양(암 세포)이 본 발명의 항체의 투여 대상이 되는 암으로서 특히 바람직하다.

<항원 발현 세포로의 결합>

항체가 CAPRIN-1에 결합하는 능력은 실시예에서 설명한 바와 같은, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블로팅법, 면역 형광 및 플로우 사이토메트리 분석 등을 사용한 결합 애세이를 이용하여 특정할 수 있다.

<면역 조직 화학 염색>

CAPRIN-1을 인식하는 항체는 당업자에게 주지된 방법에서의 면역 조직 화학에 의해, 외과 수술 사이에 환자로부터 얻은 조직이나, 자연히 또는 트랜스펙션 후에 CAPRIN-1을 발현하는 세포계를 접종한 이종 이식 조직을 담지하는 동물로부터 얻은 조직으로부터, 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정된 동결 절편 또는 파라포름알데히드로 고정된 파라핀 포매된 조직 절편을 사용하여, CAPRIN-1과의 반응성에 관해서 시험할 수 있다.

면역 조직 화학 염색을 위해서, CAPRIN-1에 대하여 반응성이 있는 항체를 각종 방법으로 염색할 수 있다. 예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 복합 염소 항 마우스 항체, 염소 항 토끼 항체나 염소 항 닭 항체를 반응시킴으로써 가시화할 수 있다.

<의약 조성물 및 암의 치료 및/또는 예방 방법>

본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물의 표적은 CAPRIN-1 유전자를 발현하는 암(세포)이면 특별하게 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라고 하는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.

본 발명에 있어서 대상이 되는 암으로서는 CAPRIN-1 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하고 있는 암이고, 바람직하게는 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 임파종, 섬유육종, 비만세포종 또는 멜라노마이다.

이들 특정한 암에는 예를 들면 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 폐선암, 편평 상피암, 소세포암, 대세포암, 신경 상피 조직성 종양인 신경 교종, 뇌실 상의종, 신경 세포성 종양, 태아형의 신경 외배엽성 종양, 신경 초종, 신경 섬유종, 수막종, 만성형 임파구성 백혈병, 임파종, 소화관형 임파종, 소화기형 임파종, 소∼중 세포형 임파종, 맹장암, 상행 결장암, 하행 결장암, 횡행 결장암, S상 결장암, 직장암, 난소 상피암, 배세포 종양, 간질 세포종양, 췌관암, 침윤성 췌관암, 췌장암의 선암, 선방 세포암, 선편평 상피암, 거세포종, 췌장관내 유두 점액성 종양, 점액성 낭포선암, 췌장 배아종, 장액성 낭포선암, 고체유두상암, 가스트리노마, 글루카고노마, 인슐리노마, 다발성 내분비선종증 1(Wermer 증후군), 비기능성도세포종, 소마토스타티노마, VIP 산생 종양이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한, 대상이 되는 바람직한 피험자(환자)는 포유 동물이고, 예를 들면 영장류, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유 동물이고, 특히 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항체를 의약 조성물로서 사용하는 경우에는, 당업자에게 공지된 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형으로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적당하게 조합하고, 일반적으로 확인된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 생각된다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용하여 통상의 제제 실시에 따라서 처방할 수 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨이 열거되고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리솔베이트 80(TM), HCO-60과 병용해도 된다.

유성액으로서는 참깨유, 대두유가 열거되고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질 알코올과 병용해도 된다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합해도 된다. 제조된 주사액은, 통상 적당한 앰플에 충전된다.

투여는 경구 또는 비경구이고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형 등이 열거된다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

또한, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 의해 적당하게 투여 방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는 예를 들면, 1회에 대해서 체중 1kg당 0.0001mg∼1000mg의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면 환자당 0.001∼100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만, 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 등에 의해 변동하지만, 당업자라면 적당하게 선택하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트를 포함하는 상기의 의약 조성물을 피험자에게 투여함으로써 암, 바람직하게는, 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 임파종, 섬유육종, 비만세포종 또는 멜라노마를 치료 및/또는 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물을 위에서 예시한 것 같은 항종양제 또는 항종양제를 포함하는 의약 조성물과 조합시키고, 피험자에게 병용 투여하는 것을 포함한, 암의 치료 및/또는 예방 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제는 동시에 또는 각각 피험자에게 투여될 수 있다. 각각 투여하는 경우에는 어느 쪽의 의약 조성물이 앞이어도 또는 뒤이어도 되고, 그들의 투여 간격, 투여량, 투여 경로 및 투여 회수는 전문의에 의해 적당하게 선택될 수 있다. 동시에 투여하는 별도의 의약제형에는 예를 들면, 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 약리학상 허용되는 담체(또는 매체) 중에서 혼합하여 제제화해서 얻어지는 의약 조성물도 포함되는 것으로 한다. 또한, 항종양제를 함유하는 상기 의약 조성물 및 제형 중 어디에 대해서도, 본 발명의 항체를 함유하는 의약 조성물 및 제형에 관한 처방, 제제화, 투여 경로, 용량, 암 등의 설명을 적용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 의약 조성물과 위에서 예시한 것 같은 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품 및 그것을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 및/또는 예방 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 약리학상 허용되는 담체와 함께 포함하는, 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물도 제공한다.

<폴리펩티드 및 DNA>

본 발명은 또한, 본 발명의 상기 항체 또는 그 프래그먼트(항체 결합 프래그먼트)를 코딩하는 DNA도 제공한다. 그러한 DNA는 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 DNA이어도 되고, 상기 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA이어도 된다. 그러한, DNA는 또한 상기 항체의 각 상보성 결정 영역을 단독으로 또는 조합하여 코딩하는 DNA이어도 된다. 그러한 DNA는 예를 들면, 상기 항체(a)의 경우, 서열 번호 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 서열 번호 10, 11 및 12의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 등을 포함한다.

이들 서열의 DNA에 의해 코딩되는 상보성 결정 영역(CDR)이 항체의 특이성을 결정하는 영역이기 때문에, 항체의 그 이외의 영역(즉, 정상 영역 및 프레임 워크 영역)을 코딩하는 서열은 다른 항체 유래의 서열이어도 된다. 여기서 다른 항체란 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만, 부작용 저감의 관점으로부터는 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기의 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임 워크 영역 및 각 정상 영역을 코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 다른 예는, 예를 들면 상기 항체(a)의 경우, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열 번호 13의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 등이다. 여기서, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 14의 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 15의 염기 서열이다. 이들의 DNA에서도, 중쇄 및 경쇄의 각정상 영역을 코딩하는 영역을 포함하는 경우, 그 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열(중쇄 및 경쇄의 각 정상 영역의 아미노산 서열)을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

이들 항체의 DNA는 예를 들면, 상기의 방법 또는 이하의 방법으로 얻을 수 있다. 우선, 본 발명의 항체를 산생하는 하이브리도마로부터, 시판의 RNA 추출 키트를 이용하여 전 RNA를 제조하고, 랜덤 프라이머 등을 이용하여 역전 사진 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서 기지의 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변 영역에 있어서 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머에 사용한 PCR법에 의해, 항체를 코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 코딩하는 서열에 대해서는 기지의 서열을 PCR법으로 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기 서열은 서열 결정용 플라스미드 또는 파지에 조립 등하여, 통상의 방법에 의해 결정할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 항체(a)부터 (g)에 관한 이하의 폴리펩티드 및 DNA도 제공한다.

(i) 서열 번호 9, 서열 번호 19, 서열 번호 58, 서열 번호 63, 서열 번호 69 및 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(예를 들면, 서열 번호 14 및 서열 번호 24의 염기 서열을 포함하는 DNA).

(ii) 서열 번호 13, 서열 번호 23, 서열 번호 53, 서열 번호 62, 서열 번호 65, 서열 번호 73 및 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(예를 들면, 서열 번호 15, 서열 번호 25 및 서열 번호 54의 염기 서열을 포함하는 DNA).

(iii) 서열 번호 6, 7 및 8, 서열 번호 16, 17 및 18, 서열 번호 55, 56 및 57, 서열 번호 66, 67 및 68, 및 서열 번호 74, 75 및 76에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.

(iv) 서열 번호 10, 11 및 12, 서열 번호 20, 21 및 22, 서열 번호 50, 51 및 52, 서열 번호 59, 60 및 61, 서열 번호 59, 64 및 61, 서열 번호 70, 71 및 72, 및 서열 번호 78, 79 및 80에 나타내는 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 CDR 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.

이들의 폴리펩티드 및 DNA는 상기한 바와 같이, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.

<본 발명의 요약>

위에서 설명한 본 발명을 이하에 요약한다.

(1) 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 CAPRIN-1 부분 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트.

(2) CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암 세포에 대하여 세포 장해 활성을 갖는 상기 (1)에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(3) 상기 항체가 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체인 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(4) 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(5) 서열 번호 6, 7 및 8의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 10, 11 및 12의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(6) 서열 번호 16, 17 및 18의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 20, 21 및 22의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(7) 서열 번호 6, 7 및 8의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 50, 51 및 52의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(8) 서열 번호 55, 56 및 57의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 59, 60 및 61의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(9) 서열 번호 55, 56 및 57의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 59, 64 및 61의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(10) 서열 번호 66, 67 및 68의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 70, 71 및 72의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(11) 서열 번호 74, 75 및 76의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 78, 79 및 80의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 상기 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(12) 항종양제가 콘쥬게이팅된 상기 (1)∼(11) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트.

(13) 상기 (1)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.

(14) 상기 암이 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 임파종, 섬유육종, 비만세포종 또는 멜라노마인 상기 (13)에 기재된 의약 조성물.

(15) 상기 (13) 또는 (14)에 기재된 의약 조성물과 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함해서 이루어지는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품.

(16) 상기 (1)∼(11) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 코딩하는 DNA.

(17) 상기 (1)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트, (13) 또는 (14)에 기재된 의약 조성물, 또는 상기 (15)에 기재된 조합 의약품을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.

( 실시예 )

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.

실시예 1 각 조직에서의 CAPRIN-1 발현 해석

CAPRIN-1 유전자의 개 및 인간의 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 WO2010/016526의 실시예 1(4)을 따라서 RT-PCR 법에 의해 조사했다. 그 결과, 건강한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 나타나는 한편, 개 유방암 및 선암 조직에서 발현이 나타났다. 또한, 인간 조직에서의 발현을 아울러 확인한 바, 개 CAPRIN-1 유전자와 같이, 정상 조직에서 발현을 확인할 수 있었던 것은 정소뿐이었지만, 암 세포에서는 인간 유방암 세포주 8종(ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1) 및 췌장암 세포주 4종(Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, BxPc-3) 등, 다종류의 암 세포주에서 발현이 검출되었다. 이 결과로부터, CAPRIN-1은 정소 이외의 정상 조직에서는 발현이 나타나지 않는 한편, 유방암 세포주 및 췌장암 세포주에서 발현하고 있는 것이 확인되었다.

실시예 2 CAPRIN-1에 대한 마우스 모노클론 항체의 제작

(1) 마우스 모노클론 항체 #1의 제작

WO2010/016526의 실시예 3에서 제조한 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 CAPRIN-1 단백질 100μg을 등량의 MPL+TDM 아쥬반트(sigma사 제품)와 혼합하고, 이것을 마우스 1마리당의 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 6주령의 Balb/cc 마우스(일본 SLC사 제품)의 복강내에 투여 후, 1주일 마다 7회 투여를 행하여, 면역을 완료했다. 최후 면역으로부터 3일 후에 적출한 각각의 비장을 멸균한 2매의 슬라이드 글래스에 끼워서 문지르고, PBS(-)(니스수이사 제품)를 이용하여 세정하고 1500rpm으로 10분간 원심하여 상청을 제거하는 조작을 3회 반복해서 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장 세포와 마우스 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC으로부터 구입)을 10:1의 비율로 혼화하고, 여기에 37℃로 가온한 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지 200μl와 PEG1500(베링거사 제품) 800μl을 혼화해서 제조한 PEG 용액을 가해서 5분간 정치하여 세포 융합을 행했다. 1700rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 제거 후, Gibco사 제작의 HAT 용액을 2% 당량 첨가한 15% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지(HAT 선택 배지) 150ml로 세포를 현탁하고, 96웰 플레이트(NUNC사 제품)의 1웰당 100μl씩, 플레이트 15매에 파종했다. 7일간, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양함으로써 비장 세포와 미엘로마 세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다.

제작한 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백질에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. WO2010/016526의 실시예 3에서 제조한 CAPRIN-1 단백질 용액 1μg/ml를 96웰 플레이트 1웰당에 100μl 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액(sigma사 제품)을 1웰당 400μl 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, 1웰당 400μl의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100μl 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정한 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스IgG(H+L) 항체(Invitrogen사 제품)를 1웰당 100μl 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사 제품)을 1웰당 100μl 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100μl 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 450nm와 595nm의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수개 선발했다.

선발된 하이브리도마를 96웰 플레이트 1웰당 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가하여 배양했다. 1주일 후, 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰 세포를 더 배양하고, 클로닝된 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백질에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. WO2010/016526의 실시예 3에서 제조한 CAPRIN-1 단백질 용액 1μg/ml를 96웰 플레이트 1웰당 100μl 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% BSA 용액을 1웰당 400μl 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, 1웰당 400μl의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100μl 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 항체(Invitrogen사 제품)를 1웰당 100μl 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사 제품)을 1웰당 100μl 첨가해서 15∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100μl 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 450nm와 595nm의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, CAPRIN-1 단백질에 반응성을 나타내는 모노클론 항체를 산생하는 88개의 하이브리도마주를 얻었다.

다음에 그들 모노클론 항체의 중, CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는 10⁶개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231V를 1.5ml 부피의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청 100μl를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항 마우스 IgG 항체(Invitrogen사 제품)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 주식회사의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 동일한 조작을 항체 대신에 아무것도 처리하지 않는 6주령의 Balb/c 마우스의 혈청을 하이브리도마 배양용 배지로 500배 희석한 것을 이용하여 행하고, 대조군으로 했다. 그 결과, 대조군에 비해서 형광 강도가 강한 즉, 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 모노클론 항체 1개(#1)를 선발했다.

(2) 항 CAPRIN-1 모노클론 항체 #1이 인식하는 CAPRIN-1 에피토프의 동정

(1)에서 취득한 암 세포의 세포 표면에 반응하는 CAPRIN-1에 대한 모노클론 항체 #1을 사용하고, 인식하는 CAPRIN-1 에피토프 영역의 동정을 행했다. CAPRIN-1 재조합 단백질 100μg을 단백질 조해제를 포함하지 않는 용해 버퍼에 용해하고, 마우스 모노클론 항체 #1과 반응시켰다. 그 용액에, 트립신 또는 키모트립신 소화 효소를 첨가하고, 적정 온도에서 소화 반응을 행했다. 반응 후 프로테인 G 세파로오스 담체를 가해서 반응시켜서 원심 조작에 의해 담체를 침전시켰다. 상청을 제거한 후, 용해 버퍼와 PBS로 세정해서 0.1%의 포름산에 용해시키고, 그 상청을 회수했다. 회수한 상청 샘플을 역상 칼럼(HLB Extraction Cartridge(OASIS사))에 걸러서, 항체를 제거한 샘플 용액을 얻었다. 얻어진 샘플을 역상 액체 크로마토그래피(크로마토그래피나노시스템(KYA사)을 이용하여 펩티드만이 포함된 용액을 회수하고, 탠덤형 질량분석계 quadrupole-TOF mass spectrometer(Waters-Micromass사)에 도입해서 MS/MS해석을 행하여 샘플내에 포함되는 펩티드를 검출했다. 그 결과, 항 CAPRIN-1 모노클론 항체 #1이 인식하는 CAPRIN-1의 부분 서열로서, 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드가 동정되었다.

(3) 마우스 모노클론 항체 #2, #3의 제작

(1)과 같은 방법으로, (2)로 동정한 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 KLH(Keyhole limpet haemocyanin)의 융합 단백질을 면역원으로 하고, 등량의 아쥬반트제 TiterMax Gold(등록상표) CytRx사)와 혼합해서 7일 간격으로 마우스의 피하에 1회당 20μg 투여했다. 합계 4회의 투여를 행한 후, 최종 면역으로부터 3일 후의 마우스로부터 비장 세포를 얻고, 상기 (1)과 같은 방법으로 마우스 미엘로마 세포와 융합해서 하이브리도마를 제작했다. 그 후, 제작한 하이브리도마의 배양 상청 중에 포함되는 각 항체와 WO2010/016526의 실시예 3에서 제조한 CAPRIN-1 단백질 용액 1μg/ml 또는 면역원으로서 사용한 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 KLH의 융합 단백질과의 반응성을 지표로 항체를 선발했다. WO2010/016526의 실시예 3에서 제조한 CAPRIN-1 단백질 용액 1μg/ml와 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 KLH의 융합 단백질 30μg/ml을 각각 96웰 플레이트 1웰당 100μl 첨가해서 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 세정 후, 블록 에이스(DS Pharma Biomedical사) 용액을 1웰당 400μl 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, PBS-T로 웰을 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 100μl 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 세정한 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Invitrogen사 제품)를 1웰당 100μl 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사 제품)을 1웰당 100μl 첨가해서 5∼30분간 정치하여 발색 반응을 행했다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100μl 첨가해서 반응을 정지시키고, 흡광도계를 이용하여 450nm와 595nm의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 선발했다.

선발된 하이브리도마를 96웰 플레이트 1웰당 0.3개가 되도록 플레이트에 첨가하여 배양했다. 1주일 후, 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰의 세포를 더 배양하고, 클로닝된 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1의 부분 서열의 서열 번호 5의 아미노산 서열에 대한 결합 친화성을 지표로 상기와 같은 방법을 이용하여, 서열 번호 5의 아미노산에 대한 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻었다.

얻어진 하이브리도마가 산생하는 모노클론 항체의 중, CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는, 10⁶개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231V를 1.5ml 부피의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청 100μl를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항 마우스 IgG항체(Invitrogen사 제품)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 주식회사의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을, 항체 대신에 아무것도 처리하지 않는 6주령의 Balb/c 마우스의 혈청을 하이브리도마 배양용 배지로 500배 희석한 것을 사용한 샘플 및 2차 항체만을 반응시킨 샘플을 음성 대조군으로 하여 행했다. 그 결과, 음성 대조군에 비해서 형광 강도가 강한, 즉, 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 모노클론 항체 2개(#2 및 #3)을 얻었다.

얻어진 마우스 모노클론 항체 #2 및 #3이 면역원인 CAPRIN-1의 부분 서열인 서열 번호 5의 아미노산 서열에 특이적으로 반응하는 것을 조사했다. 0.1M의 탄산나트륨 수용액으로 30μg/ml로 제조한 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 용액 및 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하지 않는 CAPRIN-1의 부분 서열을 각각 ELISA용 96웰 플레이트 이모빌라이저 아미노(NUCK사)에 100μg/ml씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켜서 펩티드를 웰에 결합시켰다. 펩티드가 결합한 웰에 10mM 에탄올 아민을 포함하는 0.1M 탄산나트륨 수용액을 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. 웰내의 용액을 제거 후, PBS-T로 세정한 후, 블록 에이스 용액을 1웰당 400μl첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 웰내의 용액을 제거하고, PBS-T로 세정 후, 마우스 모노클론 항체 #2를 포함하는 배양 상청을 1웰당 50μL 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 PBS-T로 세정하고, 블록 에이스 용액으로 5000배로 희석한 HRP 표식 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Invitrogen사 제품)를 1웰당 50μl 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 충분하게 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사 제품)을 1웰당 100μl 첨가해서 5∼30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후, 1규정 황산을 1웰당 100μl 첨가해서 반응을 정지시키고, 흡광도계를 이용하여 450nm과 595nm의 흡광도값을 측정한 바, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하지 않는 CAPRIN-1의 부분 서열에는 전혀 반응하지 않고, 서열 번호 5의 아미노산 서열만에 마우스 모노클론 항체 #2 및 #3이 특이적으로 반응했다. 따라서, 서열 번호 5의 폴리펩티드가 항 CAPRIN-1 항체 #2, #3의 에피토프 영역을 포함하고 있는 것이 확인되었다.

실시예 3 CAPRIN-1에 대한 닭 모노클론 항체의 제작

실시예 2(2)에서 동정한 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 KLH(Keyhole limpet haemocyanin)의 융합 단백질을 면역원으로 하여, 닭 유래의 모노클론 항체를 제작했다. 상기 면역원 300μg를 등량의 프로인트의 완전 아쥬반트(Frund's complete adjuvant)와 혼합하고, 이것을 닭 1 마리당의 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 7주령의 닭의 복강내에 투여 후, 4주일 마다 7회 투여를 행해 면역을 완료했다. 최후 면역으로부터 4일 후에 적출한 각각의 비장을 멸균한 2매의 슬라이드 글래스에 끼워서 문지르고, PBS(-)(니스수이사 제품)를 이용하여 세정해서 1500rpm으로 10분간 원심하여 상청을 제거하는 조작을 3회 반복해서 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장 세포와 조류 세망 내피증 바이러스를 이용하여 닭으로부터 형질 전환법에 의해 수립한 경쇄가 결손하고 있는 닭 미엘로마 세포를 5:1의 비율로 혼화하고, 여기에 37℃로 가온한 10% FBS를 포함하는 IMDM 배지 200μl와 PEG 1500(베링거사 제품) 800μl을 혼화해서 제조한 PEG 용액을 가해서 5분간 정치하여 세포 융합을 행했다. 1700rpm으로 5분간 원심하고, 상청을 제거 후, Gibco사제작의 HAT 용액을 2% 당량 첨가한 10% FBS를 포함하는 IMDM 배지(HAT 선택 배지) 300ml로 세포를 현탁하고, 96웰 플레이트(NUCK사 제품)의 1웰당 100μl씩, 플레이트 30매에 파종했다. 7일간, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양함으로써 비장 세포와 닭 미엘로마 세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다. 그 후, 제작한 하이브리도마의 배양 상청 중에 포함되는 각 항체와 WO2010/016526의 실시예 3에 기재된 바와 같이 하여 제조한 CAPRIN-1 단백질 용액 또는 면역원으로서 사용한 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 BSA의 융합 단백질과의 반응성을 지표로 항체를 선발했다. 구체적으로는 WO2010/016526의 실시예 3에서 제조한 CAPRIN-1 단백질 용액 1μg/ml 및 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 BSA의 융합 단백질 1μg/ml을 각각 96웰 플레이트 1웰당 50μl 첨가하여 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T에서 세정 후, 블록 에이스(DS Pharma Biomedical사) 용액을 1웰당 300μl 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, PBS-T로 웰을 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청을 1웰당 50μl 첨가하고, 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 세정한 후, PBS로 1000배로 희석한 HRP 표식 항 닭 IgY 항체(KPL사 제품)를 1웰당 100μl 첨가하여 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, OPD 기질 용액을 1웰당 50μl 첨가해서 5∼15분간 정치하여 발색 반응을 행했다. 발색 후, 2규정 황산을 1웰당 50μl 첨가해서 반응을 정지시켜 흡광도계를 이용하여 490nm와 630nm의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 높았던 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수개 선발했다.

선발된 하이브리도마를 96웰 플레이트 1웰당 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가하여 배양했다. 1주일 후, 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰의 세포를 더욱 배양하고, 클로닝된 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백질에 대한 결합 친화성 또는 면역원으로서 사용한 서열 번호 5의 아미노산 서열과 캐리어 단백질의 BSA의 융합 단백질과의 반응성을 지표로 닭 모노클론 항체를 얻었다.

다음에 그들 모노클론 항체의 중, CAPRIN-1이 발현되는 유방암 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는 2×10⁵개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231V를 1.5ml 부피의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청 50μl를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.5% FBS를 포함하는 PBS로 100배 희석한 FITC 표식 염소 항 닭 IgG(H+L) 항체(Southern Biotech사 제품)를 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 주식회사의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을 하이브리도마 배양용 배지를 이용하여 행하여 음성 대조군의 샘플로 했다. 그 결과, 대조군에 비해서 형광 강도가 강한, 즉, CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 닭 모노클론 항체 4개 (닭 모노클론 항체 #1, #2, #3, #4)를 선발했다. 이들 항체는 유방암 세포의 세포 표면 상에 발현된 CAPRIN-1과 결합할 수 있다.

실시예 4 선발한 모노클론 항체의 특징 평가

(1) 마우스 모노클론 항체의 특징 평가

실시예 2에서 얻은 마우스 모노클론 항체에 대해서, WO2010/016526의 실시예 5에 기재된 방법을 따라서 가변 영역을 코딩하는 유전자의 증폭 단편을 취득하고, 유전자 서열 및 그 아미노산 서열을 해석했다. 그 결과, 얻어진 마우스 유래 모노클론 항체 #1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 24로, 아미노산 서열을 서열 번호 19로, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 25로, 아미노산 서열을 서열 번호 23으로 나타낸다. 또한, 얻어진 마우스 유래 모노클론 항체 #2의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 14로, 아미노산 서열을 서열 번호 9로, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 15로, 아미노산 서열을 서열 번호 13으로 나타낸다. 또한, 얻어진 마우스 유래 모노클론 항체 #3의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 14로, 아미노산 서열을 서열 번호 9로, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 54로, 아미노산 서열을 서열 번호 53으로 나타낸다.

즉, 마우스 모노클론 항체 #1은 서열 번호 19의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 23의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다. 또한, 마우스 모노클론 항체 #2은 서열 번호 9의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 13의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다. 또한, 마우스 모노클론 항체 #3은 서열 번호 9의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다.

(2) 닭 모노클론 항체의 특성 평가

실시예 3에서 얻어진 닭 모노클론 항체(닭 모노클론 항체 #1, #2, #3, #4)에 대해서, WO2011/096519의 실시예 4에 기재된 방법을 따라서 가변 영역을 코딩하는 유전자의 증폭 단편을 취득하고, 유전자 및 그 아미노산 서열을 해석했다. 그 결과 얻어진 닭 모노클론 항체 #1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 58로, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 62로 나타낸다. 닭 모노클론 항체 #2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 63으로, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 65로 나타낸다. 닭 모노클론 항체 #3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 69로, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 73으로 나타낸다. 닭 모노클론 항체 #4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 77로, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 81로 나타낸다.

즉, 닭 모노클론 항체 #1은 서열 번호 58의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 62의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다. 닭 모노클론 항체 #2는 서열 번호 63의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 65의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 59, 서열 번호 64, 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다. 닭 모노클론 항체 #3은 서열 번호 69의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 73의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다. 닭 모노클론 항체 #4는 서열 번호 77의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 81의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR 1∼3이 각각 서열 번호 78, 서열 번호 79, 서열 번호 80의 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다.

실시예 5 암 세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1의 부분 폴리펩티드에 대한 폴리클론 항체의 제작

암 세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1의 부분 폴리펩티드에 대한 폴리클론 항체를 얻기 위해서, 항 CAPRIN-1 모노클론 항체 #1, #2 및 #3의 에피토프 영역을 포함하는 폴리펩티드(서열 번호 5로 나타내어지는 CAPRIN-1 유래 펩티드), 서열 번호 2의 인간 CAPRIN-1의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기 번호 50-98 영역의 폴리펩티드 및 서열 번호 2 중의 아미노산 잔기 번호 233-305 영역의 폴리펩티드를 합성했다. 이들의 펩티드 1mg씩을 항원으로서, 등용량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA) 용액과 혼합하고, 이것을 2주일 마다 4회, 토끼의 피하에 투여를 행했다. 그 후 혈액을 채취하고, 각 폴리클론 항체를 포함하는 항혈청을 얻었다. 또한, 이들 항혈청을 단백질 G 담체(GE health care bioscience사 제품)을 이용하여 정제하서 PBS로 치환함으로써, 암 세포 표면상에 존재하는 CAPRIN-1의 부분 폴리펩티드 에 대한 폴리클론 항체를 얻었다. 또한, 항원을 투여하지 않는 토끼의 혈청을 상기와 동일하게 하여 단백질 G 담체를 이용하여 정제한 것을 대조군 항체로 했다.

실시예 6 암 세포상에서의 CAPRIN-1 단백질의 발현 해석

다음에, CAPRIN-1 유전자의 발현이 많이 확인된 인간 유방암 세포주 8종 (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1)에 대해서, 그 세포 표면 상에 CAPRIN-1 단백질이 발현되고 있는지의 여부를 조사했다. 상기에서 유전자 발현이 확인된 각 인간 유방암 세포주 각각 5×10⁵ 세포를 1.5ml의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리했다. 이것에 본 실시예 5에서 상기한 바와 같이 제조한 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체 2μg (5μl)을 첨가하고, 또한 95μl의 0.1% 소태아 혈청을 포함하는 PBS를 첨가해서 혼합하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 2μl의 Alexa 488 표식 Goat anti-rabbit IgG 항체(Invitrogen사 제품) 및 98μl의 0.1% 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 PBS를 첨가해서 혼합하고, 빙상에서 30시간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 주식회사의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 같은 조작을, CAPRIN-1유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체 대신에 본 실시예 5에서 상기한 바와 같이 제조한 대조군 항체를 이용하여 행하여 대조군으로 했다. 그 결과, 항 CAPRIN-1 항체를 첨가한 세포는 대조군에 비하여, 모든 암 세포의 형광 강도가 35% 이상 강했다. 이것으로부터, 상기 인간 암 세포주의 세포막 표면 상에 CAPRIN-1 단백질이 발현되고 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 형광 강도의 증강율은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI값)의 증가율로 나타내고, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

평균 형광 강도의 증가율(형광 강도의 증강율)(%) = ((항 CAPRIN-1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값) - (대조군 MFI값) ÷ (대조군 MFI값) × 100.

또한, 동일한 상기 방법을 이용하여, 신장암 세포주 3종(Caki-1, Caki-2, A498), 방광암 세포주(T24), 난소암 세포주(SKOV3), 폐암 세포주(QG56), 전립선암 세포주(PC3), 자궁경부암 세포주(Hela), 섬유 육종 세포주(HT1080), 뇌종양 세포주 2종(T98G, U87MG), 위암 세포주(MNK28), 대장암 세포주(Lovo), 췌장암 세포주(Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, BxPC-3)에 대해서 형광 강도를 측정한 바, 대조군에 비해서 모든 암 세포의 형광 강도가 35% 이상 강했다.

또한, 본 결과는 실시예 2에서 취득된 서열 번호 19의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 23의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 모노클론 항체(마우스 모노클론 항체 #1) 또는 서열 번호 9의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 13의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 모노클론 항체(마우스 모노클론 항체 #2) 또는 서열 번호 9의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 53의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 모노클론 항체(마우스 모노클론 항체 #3), 실시예 3에서 취득된 서열 번호 58의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 62의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 닭 모노클론 항체 #1, 서열 번호 63의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 65의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 닭 모노클론 항체 #2, 서열 번호 69의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 73의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 닭 모노클론 항체 #3, 서열 번호 77의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 81의 경쇄 가변 영역을 갖는 CAPRIN-1에 대한 닭 모노클론 항체 #4(닭 모노클론 항체 #1∼#4)를 사용한 경우도 CAPRIN-1의 발현이 확인되었다.

실시예 7 면역 조직 화학 염색

(1) 마우스 및 개 정상 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

마우스(Balb/c, 암컷) 및 개(비글견, 암컷)을 에테르 마취 하 및 케타민/이소풀루란 마취 하에서 방혈시키고, 개복 후, 각 장기(위, 간장, 안구, 흉선, 근육, 골수, 자궁, 소장, 식도, 심장, 신장, 티액선, 대장, 유선, 뇌, 폐, 피부, 부신, 난소, 취장, 비장, 방광)을 각각 PBS가 들어간 10cm 디쉬에 옮겼다. PBS 중에서 각 장기를 절개하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 포함하는 0.1M 인산 완충액(pH7.4)으로 하룻밤 환류 고정했다. 환류액을 버리고, PBS로 각 장기의 조직 표면을 세척하고, 10% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액을 50ml 부피의 원심 튜브에 넣고, 그 속에 각 조직을 넣어서 4℃에서 2시간 로터를 이용하여 진동시켰다. 20% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액으로 교체하고, 4℃에서 조직이 침전할 때까지 정치 후, 30% 수크로오스를 포함하는 PBS 용액으로 교체하고, 4℃에서 조직이 침전할 때까지 정치했다. 조직을 인출하고, 필요한 부분을 수술용 메스로 절단했다. 다음에 OCT 컴파운딩(Tissue Tek사 제품)을 작동시켜 조직 표면에 잘 융화시킨 후, 크라이오몰드에 조직을 배치했다. 드라이 아이스 상에 크라이오몰드를 두고 급속 동결시킨 후, 크라이오스탯(LEICA사 제품)을 이용하여 10∼20μm으로 박절(薄切)하고, 슬라이드 글래스마다 헤어 드라이로 30분간 풍건하고, 박절 조직이 놓인 슬라이드 글래스를 제작했다. 다음에 PBS-T(0.05% Tween 20을 포함하는 생리 식염수)를 채운 염색병에 넣어서 5분마다 PBS-T를 교체하는 조작을 3회 행했다. 절편 주위의 여분의 수분을 김 와이프(Kim Wipe)로 닦아내고, DAKOPEN(DAKO사 제품)로 둘러싼 후, 블로킹액으로서, 마우스 조직은 MOM 마우스 Ig 블로킹 시약(VECTASTAIN사 제품)을, 개 조직은 10% FBS를 포함하는 PBS-T 용액을 각각 두고, 모이스트 챔버상에서 실온에서 1시간 정치했다.

다음에, 실시예 5에서 제작한 암 세포 표면에 반응하는, CAPRIN-1 유래 펩티드(서열 번호 5)에 대한 폴리클론 항체를 블로킹액으로 10μg/ml로 제조한 용액을 두고, 모이스트 챔버내에서 4℃ 하에서 밤새 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, 블로킹액으로 250배로 희석한 MOM 비오틴 표식 항 IgG 항체(VECTASTAIN사 제품)를 두고, 모이스트 챔버내에서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, 아비딘 비오틴 ABC 시약(VECTASTAIN사 제품)을 두고, 모이스트 챔버내에서 실온에서 5분간 정치했다. PBS-T로 10분간 3회 세정을 행한 후, DAB 발색액(DAB 10mg + 30% H₂O₂ 10μl/0.05M Tris-HCl(pH7.6) 50ml)을 놓고, 모이스트 챔버내에서 실온에서 30분간 정치했다. 증류수로 린싱하고, 헤매톡실린(hematoxylin) 시약(DAKO사 제품)을 놓고 실온에서 1분간 정치 후, 증류수로 린싱했다. 70%, 80%, 90%, 95%, 100%의 각 에탄올 용액에 순서대로 1분간씩 넣은 후, 크실렌 중에서 하룻밤 정치했다. 슬라이드 글래스를 인출하고, Glycergel Mounting Medium(DAKO사 제품)으로 봉입 후, 관찰을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 침샘, 신장, 결장, 위의 각 조직에 있어서 세포내에서 약간 발현이 확인되었지만, 세포 표면에서의 발현은 확인되지 않았고, 또한 그 밖의 장기 유래의 조직에서는 전혀 발현이 확인되지 않았다.

(2) 개 유방암 조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

병리 진단에서 악성 유방암이라 진단된 개의 동결된 유방암 조직을 이용하여, 상기와 같은 방법으로 동결 절편 슬라이드 제작 및 실시예 5에서 제작한 CAPRIN-1 유래 펩티드(서열 번호 5)에 대한 폴리클론 항체를 사용한 면역 조직 화학 염색을 행한 결과, 개 유방암 조직에 있어서 CAPRIN-1의 발현이 확인되었다.

(3) 인간 각종 암조직에 있어서의 CAPRIN-1의 발현

파라핀 포매된 인간 각종 암조직 어레이(BIOMAX사 제품)의 검체를 이용하여, 상기와 같은 방법으로, 실시예 5에서 제작한 CAPRIN-1 유래 펩티드(서열 번호 5)에 대한 폴리클론 항체를 사용한 면역 조직 화학 염색을 행했다. 그 결과, CAPRIN-1은 식도암, 결장암, 직장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 방광암 및 자궁경부암으로 발현이 확인되었다.

실시예 8 인간-마우스 키메라 모노클론 항체의 제작

실시예 4에서 얻어진 서열 번호 14로 나타내어지는 마우스 모노클론 항체 #2의 중쇄 가변 영역을 포함한 유전자 증폭 단편의 양 단을 제한 효소 처리한 후 정제하고, 마우스 항체 유래의 리더 서열과 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG₁의 H쇄 정상 영역을 이미 삽입 완료된 pcDNA4/myc-His(Invitrogen사 제품) 벡터에 상법을 따라서 삽입했다. 또한, 서열 번호 15로 나타내어지는 마우스 모노클론 항체 #2의 경쇄 가변 영역을 포함한 유전자 증폭 단편의 양 단을 제한 효소 처리한 후 정제하고, 마우스 항체 유래의 리더 서열과 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG₁의 L쇄 정상 영역을 이미 삽입 완료된 pcDNA 3.1/myc-His(Invitrogen사 제품) 벡터에 상법을 따라서 삽입했다.

다음에 서열 번호 14로 나타내어지는 마우스 모노클론 항체 #2의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 삽입된 상기 재조합 벡터와, 서열 번호 15로 나타내어지는 마우스 모노클론 항체 #2의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드서열이 삽입된 상기 재조합 벡터를 CHO-K1 세포(리켄 셀 뱅크로부터 입수)에 도입했다. 구체적으로는, 12웰 배양 플레이트의 1웰당 1ml의 10% FBS를 포함하는 Ham's F12 배지(Invitrogen사 제품)에서 배양된 2×10⁵개의 CHO-K1 세포를 PBS(-)로 세정한 후에, 1웰당 1ml의 10% FBS를 포함하는 Ham's F12 배지를 새로이 첨가한 웰에 30μl의 OptiMEM(Invitrogen사 제품)에 용해한 상기 각 벡터 250ng과 Polyfect transfection reagent(QIAGEN사 제품) 30μl를 혼합한 것을 첨가했다. 상기 재조합 벡터를 도입한 CHO-K1 세포를 200μg/ml 제오신(Zeocin)(Invitrogen사 제품) 및 200μg/ml 제네티신(Geneticin)(로슈사 제품)을 첨가한 10% FBS를 포함하는 Ham's F12 배지로 배양한 후, 96웰 플레이트의 1웰당 0.5개가 되도록 상기 재조합 벡터를 도입한 CHO-K1 세포를 파종하고, 마우스 모노클론 항체 #1의 가변 영역을 갖는 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #1(#1)를 안정적으로 산생하는 세포주를 제작했다. 상기 방법과 동일하게 하여 마우스 모노클론 항체 #2 및 #3에 대해서도 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #2(#2) 및 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #3(#3)을 안정적으로 산생하는 세포주를 제작했다.

제작한 세포주를 150cm² 플라스크를 이용하여 5×10⁵개/ml로 혈청을 포함하지 않는 OptiCHO 배지(Invitrogen사 제품) 30ml를 이용하여 5일간 배양하고, #1, #2, #3을 포함하는 배양 상청을 얻었다.

또한, 비교 항체로서, WO2010/016526에 기재되는 마우스 유래의 항 CAPRIN-1 모노클론 항체로 서열 번호 26의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 27의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 1, 서열 번호 28의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 29의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 2, 서열 번호 30의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 31의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 3, 서열 번호 32의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 33의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 4, 서열 번호 34의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 35의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 5, 서열 번호 36의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 37의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 6, 서열 번호 38의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 39의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 7, 서열 번호 40의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 41의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 8, 서열 번호 42의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 43의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 9, 서열 번호 44의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 45의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 10, 서열 번호 46의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 47의 경쇄 가변 영역을 갖는 비교 항체 11에 대해서도 상기와 동일하게 하여, 인간-마우스 키메라 비교 항체 1∼11을 각각 안정적으로 산생하는 세포주를 제작하고, 제작한 세포주를 150cm² 플라스크를 이용하여 5×10⁵개/ml로 혈청을 포함하지 않는 OptiCHO 배지(Invitrogen사 제품) 30ml를 이용하여 5일간 배양하고, 인간-마우스 키메라 비교 모노클론 항체 1∼11을 포함하는 배양 상청을 얻었다.

실시예 9 인간-닭 키메라 모노클론 항체의 제작

실시예 3에서 얻은 닭 모노클론 항체 #1에 대해서 WO2011/096519의 실시예 4(2)에 기재된 방법을 따라서 닭 모노클론 항체 #1의 가변 영역을 갖는 인간-닭 키메라 항체 #1을 안정적으로 산생하는 세포주를 제작했다. 제작한 세포주를 150cm² 플라스크를 이용하여 5×10⁵개/ml로 혈청을 포함하지 않는 OptiCHO 배지(Invitrogen사 제품) 30ml를 이용하여 5일간 배양하고, 인간-닭 키메라 항체 #1을 포함하는 배양 상청을 얻었다.

닭 모노클론 항체 #2, #3 및 #4에 대해서도 같은 방법을 이용하여, 각각 인간-닭 키메라 항체 #2∼#4을 안정적으로 산생하는 세포주를 제작하고, 제작한 세포주를 이용하여, 인간-닭 키메라 항체 #1, #2, #3 및 #4을 포함하는 배양 상청을 각각 얻었다.

실시예 10 마우스 모노클론 항체 #1, #2 및 #3과 닭 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4를 사용한 각종 암 세포 표면에서의 CAPRIN-1의 발현

다음에 CAPRIN-1 유전자의 발현이 확인된 인간 유방암 세포주(ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1), 신장암 세포주(Caki-1, Caki-2, A498, ACHN), 방광암 세포주(T24), 난소암 세포주(SKOV3), 폐암 세포주(QG56, A549), 췌장암 세포주(Capan-2, MIAPaCa-2), 전립선암 세포주(PC3), 자궁경부암 세포주(SW756), 섬유육종 세포주(HT1080), 뇌종양 세포주(T98G, U87MG, U251, SNB19, U373), 위암 세포주(MNK28, MNK45), 대장암 세포주(HT29, Lovo, CaCo2, SW480, HCT116), 백혈병 세포주(AML5), 임파종 세포주(Ramos)에 대해서, 실시예 2에서 얻어진 #1, #2 및 #3, 및 실시예 3에서 얻어진 닭 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4를 각각 포함하는 배양 상청을 이용하여, 각 세포의 세포 표면상에서의 CAPRIN-1 단백질의 발현을 조사했다. 각 세포주 각각 10⁶ 세포를 1.5ml 부피의 마이크로 원심 튜브로 원심 분리했다. 항체 #1, #2 및 #3, 및 닭 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4를 각각 포함하는 각 세포 배양 상청(100μl)을 첨가하고, 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 마우스 유래의 항체에는 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 희석한 FITC 표식 염소 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Jackson Immuno Research사 제품)를 첨가하고, 닭 유래의 항체에는 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 100배 희석한 FITC 표식 염소 항 닭 IgG(H+L) 항체(Southern Biotech사 제품)을 첨가해서 4℃에서 30분간 정치했다. PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 주식 회사의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정했다. 음성 대조군에는 2차 항체만을 반응한 것을 사용했다. 그 결과, 항체 #1, #2 및 #3, 및 닭 모노클론 항체 #1∼#4을 각각 첨가한 세포는 음성 대조군에 비하여, 모두 형광 강도가 35% 이상 강했다. 이로부터, 상기 인간 암 세포주의 세포막 표면 상에 CAPRIN-1 단백질이 발현되고 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 형광 강도의 증강율은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI값)의 증가율로 나타내어지고, 이하의 계산식에 의해 산출했다.

평균 형광 강도의 증가율(형광 강도의 증강율)(%) = ((항 CAPRIN-1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값) - (대조군 MFI값)) ÷ (대조군 MFI값) × 100.

실시예 11 CAPRIN-1 유래 펩티드(서열 번호 5)에 대한 항체의 암 세포에 대한 항종양 활성

서열 번호 5에 나타내는 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 항체의 CAPRIN-1을 발현하는 암 세포에 대한 세포 장해성의 강도를 평가하기 위해서, ADCC 활성을 측정했다. 실시예 5에서 제조한 서열 번호 5에 나타내는 펩티드에 대한 폴리클론 항체를 이용하여 평가를 행했다. 비교하는 항체로서, 그 밖의 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체(실시예 5에서 제조한 인간 CAPRIN-1의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기 번호 50-98에 대한 폴리클론 항체와 아미노산 잔기 번호 233-305에 대한 폴리클론 항체)를 사용하고, 음성 대조군으로서, 실시예 5에서 제조한 토끼 혈청 유래의 대조군 항체를 이용하여 동일하게 평가했다.

CAPRIN-1의 발현이 확인되고 있는 인간 유방암 세포주 MCF7, 인간 대장암 세포주 HCT-116, 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2, 인간 신장암 세포주 Caki-2, 인간 폐암 세포주 QG56를 10⁶개 50ml 부피의 원심 튜브에 모으고, 100μ Ci의 크롬 51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이팅했다. 그 후, 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640배지로 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1웰 당 2×10³개씩 첨가했다. 이것에 상기 서열 번호 5에 나타내는 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체 및 상기에 있는 그 밖의 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체 2종류(인간 CAPRIN-1의 아미노산 잔기 번호 50-98에 대한 폴리클론 항체와 아미노산 잔기 번호 233-305에 대한 폴리클론 항체)를 각각 1μg씩 첨가하고, 또한 인간의 말초혈로부터 정법을 따라서 분리한 임파구를 4×10⁵개씩 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 암 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬(Cr) 51의 양을 측정하고, 각 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체에 의한 암 세포에 대한 ADCC 활성을 산출했다. 그 결과, 인간 CAPRIN-1의 아미노산 잔기 번호 50-98 및 아미노산 잔기 번호 233-305의 아미노산 서열을 갖는 인간 CAPRIN-1 부분 펩티드를 면역해서 얻은 폴리클론 항체의 경우에는 인간 유방암 세포주 MCF7, 인간 대장암 세포주 HCT-116, 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2, 인간 신장암 세포주 Caki-2, 인간 폐암 세포주 QG56에 있어서의 활성은 모든 항체 각각 10% 미만이었던 것에 대해서, 서열 번호 5에 나타내는 인간 CAPRIN-1 유래 펩티드에 대한 폴리클론 항체를 첨가한 군은 모든 암 세포주에 대해서 25% 이상의 세포 장해 활성이 확인되었다. 음성 대조군의 항체는 모든 암 세포에 대해서 4% 미만의 활성이었다. 따라서, 서열 번호 5에 나타내는 CAPRIN-1에 대한 항체는 CAPRIN-1을 발현하는 암 세포에 대하여, 강한 세포 장해 활성을 발휘하는 것이 확인되었다.

또한, 세포 장해 활성은 상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체, 임파구 및 크롬 51을 포함한 2×10³개의 각 암 세포주를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크롬 51의 양을 측정하고, 이하 계산식^＊에 의해 산출된 암 세포주에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 결과이다.

^＊식 : 세포 장해 활성(%) = CAPRIN-1에 대한 항체 및 임파구를 첨가했을 때의 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량 ÷ 1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량×100.

실시예 8에서 얻은 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #1, #2 및 #3과, 실시예 9에서 얻은 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4의 인간 암 세포에 대한 세포 장해 활성을 평가했다. #1, #2 및 #3, 및 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4를 산생하는 각 세포 배양 상청을 Hitrap Protein A Sepharose FF(GEhealth kea사 제품)를 이용하여 정제하고, PBS(-)로 치환해서 0.22μm의 필터(Millipore사 제품)로 여과한 것을 활성 측정용의 항체로서 사용했다. 10⁶개의 인간 유방암 세포주 MCF7, 인간 대장암 세포주 HCT-116, 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2, 인간 신장암 세포주 Caki-2, 인간 폐암 세포주 QG56을 50ml 부피의 원심 튜브에 모으고, 100μCi의 크롬 51을 가해 37℃에서 2시간 인큐베이팅했다. 그 후 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지로 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1웰당 2×10³개씩 첨가해서 표적 세포로 했다. 이것에 상기 정제 항체 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #1, #2 및 #3, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4, 및 실시예 8에서 얻은 인간-마우스 키메라 비교 모노클론 항체 1∼11을 각각 1.3μg 첨가하고, 또한 정법을 따라서 제조한 인간 말초혈 임파구 세포로부터 정법을 이용하여 인간 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 분리했다. 인간 NK 세포를 포함하는 세포 집단은 말초혈 단핵구 세포 분리용의 비중 분리액 Histopaque(Sigma Aldrich사)를 이용하여 분리한 인간 말초혈 단핵구 세포를 FITC 형광 색소로 표식된 항체(항 인간 CD3 항체, 항 인간 CD20 항체, 항 인간 CD19 항체, 항 인간 CD11c 항체, 항 HLA-DR 항체(벡톤 딕킨슨사))로 반응시켜, 셀 소터(sorter)(FACS Vantage SE(벡톤 딕킨슨사))를 이용하여, 상기 항체로 염색되지 않은 NK 세포를 포함한 세포 집단을 분리한 것, 또는 인간 NK 세포 분리 키트(Miltenyi사 제품)를 이용하여 분리한 것을 사용했다. 분리한 NK 세포를 포함한 세포를 1웰당 2×10⁵개 첨가하고, 37℃, 5% CO²의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정하고, 항 CAPRIN-1 항체에 의한 암 세포에 대한 세포 장해 활성을 산출했다. 음성 대조군에는 아이소 타입 대조군 항체를 첨가한 것을 사용했다. 그 결과, 아이소 타입 대조군 항체를 사용했을 경우 및 인간-마우스 키메라 비교 모노클론 항체 1∼11의 세포 장해 활성은 MCF7에 대하여 5% 미만, HCT-116에 대하여 3% 미만, MIAPaCa-2에 대하여 7%, Caki-2에 대하여 8% 미만, QG56에 대하여 5% 미만이었던 것에 대해서, 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #1, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1∼#4는 MCF7에 대하여 30% 이상, HCT-116에 대하여 19% 이상, MIAPaCa-2에 대하여 28% 이상, Caki-2에 대하여 34% 이상, QG56에 대하여 10% 이상이었다. 또한, 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #2 및 #3은 MCF7에 대하여 32% 이상, HCT-116에 대하여 18% 이상, MIAPaCa-2에 대하여 32% 이상, Caki-2에 대하여 18% 이상, QG56에 대하여 10%이상이었다. 동일하게, 다른 암 세포, 유방암 세포주 ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V, MRK-nu-1, 글리오마 세포주 T98G, U373, 폐암 세포주 A549, 신장암 세포주 Caki-1, ACHN, 자궁경부암 세포주 SW756, 방광암 세포주 T24, 위암 세포주 MKN28, MKN45, 대장암 세포주 SW480, 백혈병 세포주 AML5 및 임파종 세포주 Ramos에 대해서, 아이소 타입 대조군 항체를 사용한 경우 및 비교 항체 1∼비교 항체 11를 사용한 경우에는 모두 4% 미만이었던 것에 대해, 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #1, #2 및 #3, 및 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 세포 장해 활성이 10% 이상 확인되었다. 이상의 결과로부터, 취득한 CAPRIN-1에 대한 모노클론 항체 #1, #2, #3, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 ADCC 활성에 의해 CAPRIN-1을 발현하는 암 세포를 장해하는 것이 나타내어지고, 비교 항체 1∼11에 비해서 인간-마우스 키메라 모노클론 항체 #1, #2 및 #3, 및 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 인간 암 세포에 대하여 강한 세포 장해 활성을 나타내는 것이 확인되었다.

또한, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4에 대해서, 상기와 동일하게 CAPRIN-1 유전자의 발현이 확인된 인간 유방암 세포주 MDA-MB-436, 인간 신장암 세포주 Caki-1, 인간 폐암 세포주 A549, 인간 췌장암 세포주 Panc-1, 인간 대장암 세포 DLD-1에 대한 세포 장해 활성을 평가했다. 또한, WO2011/096517의 실시예 4에 기재된 CAPRIN-1에 대한 인간-닭 키메라 항체 #1 및 #2을 각각 비교 항체 12 및 비교 항체 13, WO2011/096519의 실시예 4에 기재된 CAPRIN-1에 대한 인간-닭 키메라 항체 #1을 비교 항체 13, WO2011/096528의 실시예 4에 기재된 CAPRIN-1에 대한 인간-닭 키메라 항체 #1, 마우스 모노클론 항체 #2, #3, #4, #5 및 #6을 각각 비교 항체 14, 비교 항체 15, 비교 항체 16, 비교 항체 17, 비교 항체 18 및 비교 항체 19, WO2011/096533의 실시예 3에 기재된 CAPRIN-1에 대한 마우스 모노클론 항체 #1, #2 및 #3을 각각 비교 항체 20, 비교 항체 21 및 비교 항체 22, WO2011/096534의 실시예 3에 기재된 CAPRIN-1에 대한 마우스 모노클론 항체 #1, #2 및 #3을 각각 비교 항체 23, 비교 항체 24 및 비교 항체 25로서 사용해서 평가했다. 구체적으로는, 인간 대장암 세포주 DLD-1를 50ml 부피의 원심 튜브에 10⁶개 모으고, 100μCi의 크롬 51을 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이팅했다. 그 후, 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지로 3회 세정하고, 96구멍 V바닥 플레이트 1웰당 2×10³개씩 첨가해서 표적 세포로 했다. 다음에 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1∼#4 및 비교 항체 12∼25를 각각 1웰당 1μg 첨가하고, 또한 정법을 따라서 제조한 인간 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 1웰당 10⁵개 첨가하고, 37℃, 5% CO²의 조건하에서 4시간 배양했다. 배양 후, 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청 중의 크롬 51의 양을 측정하고, 항 CAPRIN-1 항체에 의한 암 세포에 대한 세포 장해 활성을 산출했다. MDA-MB-436, Caki-1, A549, Panc-1에 대해서도 상기와 같은 방법으로 평가를 행했다. 그 결과, MDA-MB-436에 대한 비교 항체 12∼25의 세포 장해 활성은 모두 5% 이하이었던 것에 대해서, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4은 18% 이상의 세포 장해 활성을 나타냈다. Caki-1에 대한 비교 항체 12∼25의 세포 장해 활성은 모두 5% 이하이었던 것에 대해서, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 14% 이상의 세포 장해 활성을 나타냈다. A549에 대한 비교 항체 12∼25의 세포 장해 활성은 모두 5% 이하이었던 것에 대해서, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 12% 이상의 세포 장해 활성을 나타냈다. Panc-1에 대한 비교 항체 12∼25의 세포 장해 활성은 모두 5% 이하이었던 것에 대해서, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 18% 이상의 세포 장해 활성을 나타냈다. 또한, DLD-1에 대한 비교 항체 12∼25의 세포 장해 활성은 모두 7% 이하이었던 것에 대해서, 인간-닭 키메라 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 #4는 15% 이상의 세포 장해 활성을 나타냈다.

또한, 세포 장해 활성은 상기한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체, 임파구(NK 세포를 포함하는 집단) 세포 및 크롬 51을 포함한 2×10³개의 각 암 세포주를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크롬 51의 양을 측정하고, 이하 계산식^＊에 의해 산출한 암 세포주에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 결과이다.

^＊식 : 세포 장해 활성(%) = CAPRIN-1에 대한 항체 및 임파구(NK 세포를 포함하는 집단) 세포를 가했을 때의 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량 ÷ 1N 염산을 가한 표적 세포로부터의 크롬 51 유리량 × 100.

실시예 12 항 CAPRIN-1 모노클론 항체 #1, #2 및 #3이 인식하는 각종 암 세포 표면에서의 CAPRIN-1의 분자수

인간 유방암 세포주(ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1), 신장암 세포주(Caki-1, Caki-2, A498, ACHN), 방광암 세포주(T24), 난소암 세포주(SKOV3), 폐암 세포주(QG56, A549), 췌장암 세포주(MIAPaCa-2, Capan-2), 전립선암 세포주(PC3), 자궁경부암 세포주(SW756), 섬유육종 세포주(HT1080), 뇌종양 세포주(T98G, U87MG, U251, SNB19, U373), 위암 세포주(MNK28, MNK45), 대장암 세포주(HT29, Lovo, CaCo2, SW480, HCT116), 백혈병 세포주(AML5), 임파종 세포주(Ramos)에 대해서, 실시예 2에서 얻은 마우스 모노클론 항체 #1, #2 및 #3이 인식하는 각종 암 세포 표면에서의 CAPRIN-1 분자의 수를 분자수 측정 키트“QIFIKIT”(DAKO사 제품)을 이용하여 조사했다. 동일하게 하여, 모노클론인 비교 항체 1∼11에 대해서도 각종 암 세포 표면에서의 CAPRIN-1 분자의 수를 조사했다.

구체적으로는 첨부 프로토콜을 따르고, 각 세포주에 항체 마우스 모노클론 항체 #1, #2, #3 및 비교 항체 1∼비교 항체 11을 최종 농도가 5μg/ml가 되도록 PBS로 희석하고, 각 세포주에 첨가해서 30분 반응시켰다. PBS로 세정한 후, 키트에 첨부의 검량 비드와 함께 각 세포주에 키트에 첨부의 형광 표식된 2차 항체 항 마우스 IgG 항체를 첨가해서 빙상에서 45분간 정치했다. 각 세포주 및 검량 비드를 PBS로 세정 후, 벡톤 딕킨슨 주식회사의 FACS 캘리버로 형광 강도를 측정해서 모든 상기 항체에 대해서 각 평균 형광 강도값(mean)을 얻었다. 음성 대조군에는 아이소 타입 대조군 항체를 반응시킨 것을 사용하여 mean을 얻었다. 각 평균 형광 강도값(mean)을 이용하여 키트에 첨부된 방법을 따라 분자수를 산출했다. 그 결과, 마우스 모노클론 항체 #1, 항체 #2, 항체 #3이 인식하는 각종 암 세포 표면에서의 CAPRIN-1의 분자수는 조사한 모든 인간 암 세포에 있어서, 세포 1개당 10⁵개 이상이었다. 한편, 비교 항체 1∼11에 대해서는 세포 1개당 10⁵개 보다 적었다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명의 항체는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Pharmaceutical Composition for Treatment and Prevention of Cancer <130> PH-5299-PCT <150> JP 2011-171300 <151> 2011-08-04 <160> 81 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5562 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (190)..(2319) <223> <400> 1 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc tcg gcc acc agc cac agc ggg agc ggc agc aag tcg 231 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 1 5 10 tcc gga ccg cca ccg ccg tcg ggt tcc tcc ggg agt gag gcg gcc gcg 279 Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gcc ggg gcc gcc gcg ccg gct tct cag cac ccc gca acc ggc acc 327 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg atc gac 375 Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423 Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471 Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519 Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca cta agt caa gat att cag aaa aca 567 Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa 615 Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663 Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg cgg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat gga 711 Leu Gly Asp Asp Glu Val Arg Thr Asp Leu Lys Gln Gly Leu Asn Gly 160 165 170 gtg cca ata ttg tcc gaa gag gag ttg tca ttg ttg gat gaa ttc tat 759 Val Pro Ile Leu Ser Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Asp Glu Phe Tyr 175 180 185 190 aag cta gta gac cct gaa cgg gac atg agc ttg agg ttg aat gaa cag 807 Lys Leu Val Asp Pro Glu Arg Asp Met Ser Leu Arg Leu Asn Glu Gln 195 200 205 tat gaa cat gcc tcc att cac ctg tgg gac ctg ctg gaa ggg aag gaa 855 Tyr Glu His Ala Ser Ile His Leu Trp Asp Leu Leu Glu Gly Lys Glu 210 215 220 aaa cct gta tgt gga acc acc tat aaa gtt cta aag gaa att gtt gag 903 Lys Pro Val Cys Gly Thr Thr Tyr Lys Val Leu Lys Glu Ile Val Glu 225 230 235 cgt gtt ttt cag tca aac tac ttt gac agc acc cac aac cac cag aat 951 Arg Val Phe Gln Ser Asn Tyr Phe Asp Ser Thr His Asn His Gln Asn 240 245 250 ggg ctg tgt gag gaa gaa gag gca gcc tca gca cct gca gtt gaa gac 999 Gly Leu Cys Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ser Ala Pro Ala Val Glu Asp 255 260 265 270 cag gta cct gaa gct gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047 Gln Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln 275 280 285 agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095 Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143 Thr Gln Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag gct gca 1191 Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala 320 325 330 tcc cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag gca 1239 Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gca caa atg 1287 Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ctg gat ttt gaa aat 1335 Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp Phe Glu Asn 370 375 380 cag aca ctt gat cct gcc att gta tct gca cag cct atg aat cca aca 1383 Gln Thr Leu Asp Pro Ala Ile Val Ser Ala Gln Pro Met Asn Pro Thr 385 390 395 caa aac atg gac atg ccc cag ctg gtt tgc cct cca gtt cat tct gaa 1431 Gln Asn Met Asp Met Pro Gln Leu Val Cys Pro Pro Val His Ser Glu 400 405 410 tct aga ctt gct cag cct aat caa gtt cct gta caa cca gaa gcg aca 1479 Ser Arg Leu Ala Gln Pro Asn Gln Val Pro Val Gln Pro Glu Ala Thr 415 420 425 430 cag gtt cct ttg gta tca tcc aca agt gag ggg tac aca gca tct caa 1527 Gln Val Pro Leu Val Ser Ser Thr Ser Glu Gly Tyr Thr Ala Ser Gln 435 440 445 ccc ttg tac cag cct tct cat gct aca gag caa cga cca cag aag gaa 1575 Pro Leu Tyr Gln Pro Ser His Ala Thr Glu Gln Arg Pro Gln Lys Glu 450 455 460 cca att gat cag att cag gca aca atc tct tta aat aca gac cag act 1623 Pro Ile Asp Gln Ile Gln Ala Thr Ile Ser Leu Asn Thr Asp Gln Thr 465 470 475 aca gca tca tca tcc ctt cct gct gcg tct cag cct caa gta ttt cag 1671 Thr Ala Ser Ser Ser Leu Pro Ala Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln 480 485 490 gct 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Tyr Asn 595 600 605 agt cgt ggt gtg tct cgt gga ggc tcc cgt ggt gct aga ggc ttg atg 2055 Ser Arg Gly Val Ser Arg Gly Gly Ser Arg Gly Ala Arg Gly Leu Met 610 615 620 aat gga tac cgg ggc cct gcc aat gga ttc aga gga gga tat gat ggt 2103 Asn Gly Tyr Arg Gly Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gly Gly Tyr Asp Gly 625 630 635 tac cgc cct tca ttc tct aac act cca aac agt ggt tat aca cag tct 2151 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Asn Thr Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Gln Ser 640 645 650 cag ttc agt gct ccc cgg gat tac tct ggc tat caa cgg gat gga tat 2199 Gln Phe Ser Ala Pro Arg Asp Tyr Ser Gly Tyr Gln Arg Asp Gly Tyr 655 660 665 670 cag cag aat ttc aag cga ggc tct ggg cag agt gga cca cgg gga gcc 2247 Gln Gln Asn Phe Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ser Gly Pro Arg Gly Ala 675 680 685 cca cga ggt cgt gga ggg ccc cca aga ccc aac aga ggg atg ccg caa 2295 Pro Arg Gly Arg Gly Gly Pro Pro Arg Pro Asn Arg Gly Met Pro Gln 690 695 700 atg aac act cag caa gtg aat taa tctgattcac aggattatgt ttaatcgcca 2349 Met Asn Thr Gln Gln Val Asn 705 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taaatcatct catgtggata tgaaacttct tttttaaaac ttaaaaaggt agaatgttat 4929 tgattacctt gattagggca gttttatttc cagatcctaa taattcctaa aaaatatgga 4989 aaagtttttt ttcaatcatt gtaccttgat attaaaacaa atatccttta agtatttcta 5049 atcagttagc ttctacagtt cttttgtctc cttttatatg cagctcttac gtgggagact 5109 tttccactta aaggagacat agaatgtgtg cttattctca gaaggttcat taactgaggt 5169 gatgagttaa caactagttg agcagtcagc ttcctaagtg ttttaggaca tttgttcatt 5229 atattttccg tcatataact agaggaagtg gaatgcagat aagtgccgaa ttcaaaccct 5289 tcattttatg tttaagctcc tgaatctgca ttccacttgg gttgttttta agcattctaa 5349 attttagttg attataagtt agatttcaca gaatcagtat tgcccttgat cttgtccttt 5409 ttatggagtt aacggggagg aagacccctc aggaaaacga aagtaaattg ttaaggctca 5469 tcttcatacc tttttccatt ttgaatccta caaaaatact gcaaaagact agtgaatgtt 5529 taaaattaca ctagattaaa taatatgaaa gtc 5562 <210> 2 <211> 709 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala 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acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg atc gac 375 Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423 Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471 Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519 Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca cta agt caa gat att cag aaa aca 567 Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa 615 Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663 Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat 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270 cag gta cct gaa gct gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047 Gln Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln 275 280 285 agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095 Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143 Thr Gln Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag gct gca 1191 Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala 320 325 330 tcc cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag gca 1239 Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gca caa atg 1287 Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ctg gat ttt gaa aat 1335 Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp 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Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln 480 485 490 gct ggg aca agc aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta aat gca 1719 Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767 Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815 Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln 530 535 540 gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863 Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911 Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tcc cca gac cag tcc cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959 Gly Ser Pro Asp Gln Ser His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat tac aat 2007 Pro Gln 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tgctctgttt ctaaaactta atcttggacc 2414 caaattttaa tttttgaatg atttaatttt ccctgttact atataaactg tcttgaaaac 2474 tagaacatat tctcttctca gaaaaagtgt ttttccaact gaaaattatt tttcaggtcc 2534 taaaacctgc taaatgtttt taggaagtac ttactgaaac atttttgtaa gacatttttg 2594 gaatgagatt gaacatttat ataaatttat tattcctctt tcattttttt gaaacatgcc 2654 tattatattt tagggccaga caccctttaa tggccggata agccatagtt aacatttaga 2714 gaaccattta gaagtgatag aactaatgga atttgcaatg ccttttggac ctctattagt 2774 gatataaata tcaagttatt tctgactttt aaacaaaact cccaaattcc taacttattg 2834 agctatactt aaaaaaaatt acaggtttag agagtttttt gtttttcttt tactgttgga 2894 aaactacttc ccattttggc aggaagttaa cctatttaac aattagagct agcatttcat 2954 gtagtctgaa attctaaatg gttctctgat ttgagggagg ttaaacatca aacaggtttc 3014 ctctattggc cataacatgt ataaaatgtg tgttaaggag gaattacaac gtactttgat 3074 ttgaatacta gtagaaactg gccaggaaaa aggtacattt ttctaaaaat taatggatca 3134 cttgggaatt actgacttga ctagaagtat caaaggatgt ttgcatgtga atgtgggtta 3194 tgttctttcc caccttgtag catattcgat gaaagttgag ttaactgata gctaaaaatc 3254 tgttttaaca gcatgtaaaa agttatttta tctgttaaaa gtcattatac agttttgaat 3314 gttatgtagt ttctttttaa cagtttaggt aataaggtct gttttcattc tggtgctttt 3374 attaattttg atagtatgat gttacttact actgaaatgt aagctagagt gtacactaga 3434 atgtaagctc catgagagca ggtaccttgt ctgtcttctc tgctgtatct attcccaacg 3494 cttgatgatg gtgcctggca catagtaggc actcaataaa tatttgttga atgaatgaa 3553 <210> 4 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45 Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys 50 55 60 Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu 65 70 75 80 Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val 85 90 95 Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110 Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln 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120 acctatttag aatggtacct gcagaaacca ggccagtctc caaagctcct gatctacaaa 180 gtttccaacc gattttctgg ggtcccagac aggttcagtg gcagtggatc agggacagat 240 ttcacactca agatcagcag agtggaggct gaggatctgg gagtttatta ctgctttcaa 300 ggttcacatg ttccgctcac gttcggtgct gggaccaagc tggagctgaa acgt 354 <210> 26 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu His Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 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10 15 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro 20 25 30 Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 35 40 45 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Glu Val Pro Ser Trp Arg 85 90 95 Ser Asn Lys <210> 48 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 49 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 53 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Gly Val Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 50 55 60 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 75 80 Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 85 90 95 Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Arg 115 <210> 54 <211> 345 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 54 ggggtcattg tgatgtcaca gtctccatcc tccctagctg tgtcacttgg agagaaggtt 60 actatgagct gcaagtccag tcagagcctt ttatatagta gcaatcaaaa gaactacttg 120 gcctggtacc agcagaaacc agggcagtct cctaaactgc tgatttactg ggcatccact 180 agggaatctg gggtccctga tcgcttcaca ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 240 accatcagca gtgtgaaggc tgaagacctg gcagtttatt actgtcagca atattatagc 300 tatccattca cgttcggctc ggggacaaag ttggaaataa aacgt 345 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 55 His Ser Met Phe 1 <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 56 Gly Ile Tyr Gly Val Gly Arg Ser Ile Arg Tyr Gly Ser Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 57 <211> 20 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 57 Ser Gly Tyr Phe Ser Asn Ser Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Ala Tyr Phe 1 5 10 15 Ile Asp Ala Trp 20 <210> 58 <211> 127 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 58 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Ser Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Gly Val Gly Arg Ser Ile Arg Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Tyr Phe Ser Asn Ser Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Ala 100 105 110 Tyr Phe Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser 115 120 125 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 59 Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 60 Tyr Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 61 Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Ala Gly Ile Phe 1 5 10 <210> 62 <211> 103 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 62 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln 20 25 30 Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys 35 40 45 Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Ala Gly Ile Phe Gly 85 90 95 Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 <210> 63 <211> 127 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 63 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser His 20 25 30 Ser Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Gly Ile Tyr Gly Val Gly Arg Ser Ile Arg Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Tyr Phe Ser Asn Arg Arg Tyr Trp Asp Ser Gly Ala 100 105 110 Tyr Phe Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser 115 120 125 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 64 Glu Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 65 <211> 103 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 65 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Glu Ile Thr Cys Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln 20 25 30 Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Tyr Asn Asp Lys 35 40 45 Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Gly Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Arg Ala Glu Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Thr Asp Ala Gly Ile Phe Gly 85 90 95 Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 <210> 66 <211> 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 66 Phe Gly Met Phe 1 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 67 Ser Ile Ser Asp Asn Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 68 Asn Ala Tyr Val Gly Arg Gly Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Ile Asp Ala 1 5 10 15 Trp <210> 69 <211> 124 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 69 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Asp Asn Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Ala Tyr Val Gly Arg Gly Cys Cys Phe Ser Tyr Ser Ile 100 105 110 Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser 115 120 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 70 Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Ala Tyr Gly 1 5 10 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 71 Asn Gly Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 72 Gly Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Val Gly Ile Phe 1 5 10 <210> 73 <211> 106 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 73 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Val Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Ala Tyr Gly Trp 20 25 30 Tyr Gln Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu Ile Tyr Asn 35 40 45 Gly Ser Asn Arg Pro Ser His Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Thr 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Gly Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Val Gly 85 90 95 Ile Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 <210> 74 <211> 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 74 Tyr Gly Met Gly 1 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 75 Ala Ile Arg Lys Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Pro Ala Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 76 Arg Ser His Thr Gly Val Asn Ala Ala Lys Ile Asp Ala Trp 1 5 10 <210> 77 <211> 120 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 77 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Val Ser Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Lys Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Gly Pro Ala Val Lys 50 55 60 Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu 65 70 75 80 Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Ser His Thr Gly Val Asn Ala Ala Lys Ile Asp Ala Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Glu Val Ile Val Ser 115 120 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 78 Ser Gly Ala Ser His Asn Tyr Gly 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 79 Ser Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 80 Gly Gly Tyr Asn Ile Tyr Gly Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 81 <211> 101 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 81 Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Ala Ser His Asn Tyr Gly Trp Phe Gln Gln 20 25 30 Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser Asn Asp Lys 35 40 45 Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Gly Gly Tyr Asn Ile Tyr Gly Pro Thr Phe Gly Ala Gly 85 90 95 Thr Thr Leu Thr Val 100

Claims (17)

1. 서열 번호 5로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 CAPRIN-1 부분 폴리펩티드와 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
2. 제 1 항에 있어서,
   CAPRIN-1 단백질을 발현하는 암 세포에 대하여 세포 장해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 항체는 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   서열 번호 6, 7 및 8의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 10, 11 및 12의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   서열 번호 16, 17 및 18의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 20, 21 및 22의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   서열 번호 6, 7 및 8의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 50, 51 및 52의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   서열 번호 55, 56 및 57의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 59, 60 및 61의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   서열 번호 55, 56 및 57의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 59, 64 및 61의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    서열 번호 66, 67 및 68의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 70, 71 및 72의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    서열 번호 74, 75 및 76의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 78, 79 및 80의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항종양제가 콘쥬게이팅된 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
13. 제 1 항에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 임파종, 섬유육종, 비만세포종 또는 멜라노마인 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
15. 제 13 항에 기재된 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물과 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품.
16. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA.
17. 삭제