ES2634249T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunológica con un polipéptido parcial de CAPRIN-1 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 5.

Description

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DESCRIPCION

Composicion farmaceutica para el tratamiento y/o la profilaxis del cancer Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un uso novedoso de un anticuerpo contra CAPRIN-1 o un fragmento del mismo en un farmaco tal como un agente terapeutico y/o preventivo para el cancer.

Tecnica anterior

El cancer es la principal causa de muerte. En la actualidad, esta enfermedad se trata principalmente mediante terapia quirurgica, en combinacion con radioterapia y/o quimioterapia. A pesar del reciente desarrollo de novedosas tecnicas quirurgicas o del descubrimiento de novedosos agentes anticancerosos, el tratamiento actual del cancer tiene un resultado insuficientemente mejorado, salvo para algunos tipos de cancer. Con los avances recientes de la biologla molecular o la inmunologla del cancer, se han identificado anticuerpos que reaccionan especlficamente con el cancer, antlgenos de cancer que son reconocidos por las celulas T citotoxicas, genes que codifican tales antlgenos de cancer y similares, lo que genera expectativas acerca de una terapia para el cancer especlfica dirigida a los antlgenos del cancer (bibliografla no de patente 1).

Con el fin de reducir los efectos secundarios de la terapia del cancer, es deseable que los peptidos, polipeptidos, o protelnas que se reconocen como antlgenos del cancer apenas existan en las celulas normales y que existan especlficamente en las celulas cancerosas. En 1991, Boon et al. (Ludwig Institute for Cancer Research, Belgica) aislaron el antlgeno MAGE 1 del melanoma humano que era reconocido por celulas T CD8 positivas mediante el metodo de clonacion de la expresion de ADNc utilizando una llnea celular de cancer autologa y celulas T reactivas contra el cancer (bibliografla no de patente 2). Posteriormente, se ha presentado un procedimiento SEREX (identification serologica de antlgenos mediante la clonacion de la expresion recombinante), que adopta un abordaje de clonacion de la expresion genica para identificar antlgenos tumorales reconocidos por anticuerpos producidos in vivo en respuesta al cancer autologo de un paciente con cancer (bibliografla no de patente 3 y bibliografla de patente 1). De acuerdo con este metodo, se aislaron algunos antlgenos cancerosos que apenas se expresan en celulas normales pero que se expresan especlficamente en celulas cancerosas (bibliografla no de patente 4 a 9). Ademas, actualmente se encuentran en ensayo cllnico dirigido a algunos de los antlgenos de cancer aislados una terapia celular que usa inmunocitos que reaccionan especlficamente con antlgenos de cancer o una inmunoterapia especlfica para el cancer que emplea vacunas o similares que comprenden antlgenos de cancer.

En los ultimos anos, han surgido por todo el mundo diversos farmacos de anticuerpos para el tratamiento del cancer que se dirigen a protelnas antigenicas en las celulas cancerosas. Estos farmacos han llamado la atencion debido a su eficacia como agentes terapeuticos especlficos para el cancer. la mayorla de las protelnas antigenicas utilizadas como diana por los farmacos, sin embargo, se expresan tambien en celulas normales. A causa de la administration de los anticuerpos, se danan las celulas cancerosas as! como las celulas normales que expresan los antlgenos, dando como resultado desventajosamente efectos adversos. Por lo tanto, si pudieran identificarse los antlgenos del cancer que se expresan especlficamente en la superficie de las celulas cancerosas y se pudieran usar como farmacos anticuerpos que se dirigen a estos antlgenos, podrla esperarse que estos farmacos de anticuerpos proporcionen un tratamiento con menos efectos adversos.

La protelna citoplasmatica y asociada a proliferation 1 (CAPRIN-1, acronimo de Cytoplasmic- and proliferation- associated protein 1) se conoce como una protelna intracelular que se expresa despues de la activation o division celular de las celulas normales que estan en fase de reposo y forma granulos de estres citoplasmaticos con los ARN en las celulas para participar en la regulation del transporte y en la traduction de los ARNm. Se ha descubierto que esta protelna se expresa especlficamente en la superficie de las celulas cancerosas y, por lo tanto, se esta estudiando como diana para farmacos de anticuerpos para el tratamiento del cancer (bibliografla de patente 2).

Lista de citas

Bibliografla de patente

Bibliografla de patente 1: Patente de EE.UU. n.° 5698396 Bibliografla de patente 2: WO2010/016526

Bibliografla no de patente

Bibliografla no de patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, "Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy", 1997, Volumen 24, pags. 55-519 (Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japon)

Bibliografla no de patente 2: Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647 (1991)

Bibliografla no de patente 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11810-11813 (1995)

Bibliografla no de patente 4: Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997)

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Bibliografla no de patente 5 Bibliografla no de patente 6 Bibliografla no de patente 7 Bibliografla no de patente 8 Bibliografla no de patente 9

Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998) Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998) Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999) Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996) Hum. Mol. Genet. 6:33-39 (1997)

Sumario de la invencion

Problema de la tecnica

Un objetivo de la presente invencion es producir un anticuerpo que se dirija a CAPRIN-1 expresado especlficamente en la superficie de las celulas cancerosas y que tenga mejor actividad antitumoral que los anticuerpos convencionales, y proporcionar el anticuerpo para su uso como agente para el tratamiento y/o la prevencion del cancer.

Solucion al problema

La presente invencion tiene los siguientes aspectos:

La presente invencion proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunologica con un polipeptido CAPRIN-1 parcial que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5. La presente invencion tambien proporciona una composition farmaceutica que comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo como principio activo y una combination farmaceutica como se define en las reivindicaciones. La invencion tambien proporciona dicha composicion farmaceutica y dicha combinacion farmaceutica, cada una para su uso en un metodo de tratamiento y/o prevencion del cancer.

En una realization de la presente invencion, el cancer es cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.

En otra realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

En una realizacion alternativa, el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo multiespeclfico (por ejemplo, anticuerpo biespeclfico).

Efectos ventajosos de la invencion

El anticuerpo contra la CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invencion dana las celulas cancerosas. Por lo tanto, el anticuerpo contra CAPRIN-1 es util en el tratamiento y/o prevencion del cancer.

Descripcion de las realizaciones

El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo que reconoce y se une a un polipeptido parcial predeterminado de CAPRIN-1 y tiene actividad antitumoral. El anticuerpo de acuerdo con la presente invencion es mas especlficamente un anticuerpo que reconoce (es decir, que tiene reactividad inmunologica) un polipeptido parcial de una protelna CAPRIN-1 (polipeptido parcial de CAPRIN-1) que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5. La presente invencion ha revelado que este anticuerpo presenta actividad antitumoral. La presente invencion se refiere a todos los anticuerpos que se unen a los fragmentos de protelnas CAPRIN-1 como se ha descrito anteriormente y que presentan actividad antitumoral.

El anticuerpo contra CAPRIN-1 segun la presente invencion puede ser cualquier tipo de anticuerpo que puede ejercer actividad antitumoral e incluye,, por ejemplo, anticuerpos recombinantes, por ejemplo, anticuerpos sinteticos, anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos), anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos y anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos humanos y sus fragmentos de anticuerpo, por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv. Estos anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden prepararse mediante metodos conocidos por los expertos en la materia. Deseablemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invencion tiene reactividad inmunologica con una protelna CAPRIN-1 o un polipeptido parcial de la misma, es decir, se une a la protelna CAPRIN-1 a traves de la reaction antlgeno-anticuerpo, preferentemente, se une especlficamente a la protelna CAPRIN-1. En este contexto, la frase "se une especlficamente a la protelna CAPRIN- 1" significa que el anticuerpo se une especlficamente a la protelna CAPRIN-1 sin unirse sustancialmente a otras protelnas. El anticuerpo segun la presente invencion es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo de acuerdo con la presente invencion puede ser un anticuerpo policlonal, siempre y cuando se puedan producir de forma estable anticuerpos homogeneos. En el caso de un sujeto humano, es deseable usar un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para evitar o suprimir el rechazo.

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El anticuerpo contra el polipeptido CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invencion puede examinarse con respecto a su actividad antitumoral, tal como se describe mas adelante, examinando in vivo la inhibicion del crecimiento tumoral en un animal con cancer o examinando ex vivo la presencia o ausencia de actividad citotoxica mediada por inmunocitos o por el complemento exhibida por el anticuerpo contra celulas tumorales que expresan el polipeptido.

El sujeto que va a recibir el tratamiento y/o la prevencion del cancer de acuerdo con la presente invencion es un mamlfero, tal como un ser humano, un animal de companla, ganado o un animal de deporte, preferentemente un ser humano.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira con mayor detalle.

<Preparacion del antlgeno para la preparacion de anticuerpos>

Las protelnas o fragmentos de las mismas usadas como antlgenos sensibilizantes para obtener el anticuerpo contra CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invencion no estan limitadas por la especie animal de la que proceden, incluyendo seres humanos, perros, ganado bovino, caballos, ratones, ratas, y pollos. Las protelnas o los fragmentos de las mismas, sin embargo, se seleccionan, preferentemente, a la vista de su compatibilidad con las celulas progenitoras para su uso en fusion celular. En general, se prefieren las protelnas procedentes de mamlferos. En particular, se prefieren las protelnas procedentes de seres humanos. Por ejemplo, cuando CAPRIN-1 es CAPRIN-1 humana, pueden usarse protelnas de CAPRIN-1, peptidos parciales de las mismas, o celulas que expresan CAPRIN-1 humana.

Las secuencias de nucleotidos y las secuencias de aminoacidos de CAPRIN-1 humana y los homologos de las mismas pueden obtenerse, por ejemplo, accediendo a GenBank (NCBI, EE.UU.) y usando los algoritmos BLAST o FASTA (Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993; y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

En la presente invencion, en referencia a la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 1 o 3) o la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2 o 4) de CAPRIN-1 humana, la CAPRIN-1 diana es acidos nucleicos o protelnas que consisten en secuencias que tienen de un 70 % a un 100 %, preferentemente de un 80 % a un 100 %, mas preferentemente de un 90% a un 100 %, aun mas preferentemente de un 95% a un 100 %, por ejemplo, de un 97 % a un 100 %, de un 98 % a un 100 %, de un 99% a un 100 % o de un 99,5 % a un 100% de identidad de secuencia respecto de la secuencia de nucleotidos o la secuencia de aminoacidos del ORF o la porcion madura de la secuencia de referencia. En este contexto, la expresion "% de identidad de secuencia" significa un porcentaje (%) del numero de aminoacidos (o bases) identicos respecto del numero total de aminoacidos (o bases nucleotldicas) cuando se alinean dos secuencias de tal forma que pueda lograrse el maximo grado de similitud o identidad con o sin huecos introducidos.

Como los fragmentos de cada protelna CAPRIN-1, los que comprenden un epltopo (o un determinante antigenico), que es la unidad mas pequena reconocida por un anticuerpo, tienen longitudes en el intervalo desde la longitud de aminoacidos del epltopo hasta menos de la longitud completa de la protelna. El epltopo se refiere a un fragmento polipeptldico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamlferos, preferentemente seres humanos. Su unidad mas pequena consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoacidos, por ejemplo, de 8 a 11 aminoacidos. El fragmento de la protelna CAPRIN-1 que se va a utilizar en la preparacion del anticuerpo de acuerdo con la presente invencion consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5 reconocida por el anticuerpo de la presente invencion.

Los fragmentos polipeptldicos que comprenden las protelnas CAPRIN-1 humanas y los peptidos parciales de las mismas anteriores, se pueden sintetizar segun metodos de slntesis qulmica, por ejemplo, los metodos de Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo) y tBoc (t-butiloxicarbonilo) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course en ingles) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd. (Japon), 1981). Ademas, estos polipeptidos pueden sintetizarse mediante metodos convencionales usando diversos sintetizadores de peptidos disponibles en el mercado.

Como alternativa, pueden prepararse polinucleotidos que codifican los polipeptidos usando estrategias de ingenierla genetica conocidas en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edicion, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edicion, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons; etc.) e incorporarse en vectores de expresion, que despues se introducen en celulas huesped para producir los polipeptidos en las celula huesped. De este modo, se pueden obtener las protelnas CAPRIN-1 o fragmentos de polipeptidos de las mismas de interes.

Los polinucleotidos que codifican los polipeptidos pueden prepararse facilmente mediante estrategias de ingenierla genetica conocidas en la tecnica o metodos rutinarios que usan sintetizadores de acidos nucleicos disponibles en el mercado. Por ejemplo, puede prepararse un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos del gen de CAPRIN-1 mediante la pCr usando un aDn cromosomico humano o una biblioteca de ADNc como molde y un par de

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cebadores disenados para que sean capaces de amplificar la secuencia de nucleotidos. Las condiciones de reaccion para esta PCR pueden determinarse de manera adecuada. Ejemplos de las condiciones pueden incluir, aunque no de forma limitativa, 30 ciclos que implican cada uno etapas de reaccion que consisten en 94 °C durante 30 segundos (desnaturalizacion), 55 °C durante de 30 segundos a 1 minuto (hibridacion) y 72 °C durante 2 minutos (elongacion) usando ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa, Pfu polimerasa o similares) y un tampon para PCR que contiene Mg2+, seguido de reaccion a 72 °C durante 7 minutos. La estrategia de la PCR, sus condiciones, etc. se describen en, por ejemplo, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3a edicion, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (particularmente, capltulo 15).

Ademas, pueden prepararse sondas o cebadores adecuados basandose en informacion acerca de las secuencias de nucleotidos del gen de CAPRIN-1 y las secuencias de aminoacidos de las protelnas CAPRIN-1 y usarse en la exploracion de, por ejemplo, una biblioteca de ADNc humano, para aislar el ADN deseado. Preferentemente, dicha biblioteca de ADNc se produce a partir de celulas, organos, o tejidos que expresan protelnas de CAPRIN-1. Los ejemplos de dichas celulas o tejidos incluyen celulas o tejidos procedentes de los testlculos o de canceres o tumores, tales como leucemia, cancer de mama, linfoma, tumor cerebral, cancer de pulmon, cancer pancreatico y cancer colorrectal. Estas operaciones, incluyendo la preparacion de sondas o cebadores, la construccion de una biblioteca de ADNc, la exploracion de la biblioteca de AdNc y la clonacion del gen de interes, son conocidas para los expertos en la materia y pueden efectuarse de acuerdo con metodos descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, 2a edicion, Current Protocols in Molecular Biology (1989), and Ausubel et al. (ibid.). Los ADN que codifican las protelnas CAPRIN-1 humanas y los peptidos parciales de las mismas pueden obtenerse a partir de los ADN obtenidos de este modo.

Las celulas huesped en las que se introducen los vectores de expresion pueden ser cualquier celula capaz de expresar los peptidos anteriores. Los ejemplos de celulas procariotas incluyen, aunque no de forma limitativa, E. coli. Los ejemplos de celulas eucariotas incluyen, aunque no de forma limitativa: celulas de mamlfero, tales como celulas de rinon de mono COS1 y celulas de ovario de hamster chino CHO; una llnea celular de rinon embrionario humano HEK293; la llnea celular de piel embrionaria de raton NIH3T3; celulas de levadura, tales como celulas de levadura en gemacion y de levadura en fision; celulas del gusano de la seda; y celulas de huevo de Xenopus.

En caso de usar celulas procariotas como celulas huesped, los vectores de expresion usados pueden tener un origen que permita la replicacion en las celulas procariotas, un promotor, un sitio de union a ribosomas, un sitio de clonacion multiple, un terminador, un gen de resistencia a farmacos, un gen complementario auxotrofo, etc. Los ejemplos de vectores de expresion para E. coli pueden incluir la serie pUC, pBluescript II, sistemas de expresion pET y sistemas de expresion pGEX. Los ADNc que codifican los polipeptidos anteriores pueden incorporarse en dichos vectores de expresion, con los que posteriormente se transforman las celulas hospedadoras procariotas, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que los polipeptidos codificados por los ADN se expresan en las celulas hospedadoras procariotas. A este respecto, los polipeptidos pueden expresarse como protelnas de fusion con otras protelnas.

En caso de usar celulas procariotas como celulas huesped, se pueden usar vectores de expresion para celulas eucarioticas que tengan un promotor, una region de cote y empalme, un sitio de adicion de poli (A), etc. como vectores de expresion. Ejemplos de tales vectores de expresion pueden incluir los vectores pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 y pYES2. De la misma manera que anteriormente, los ADNc que codifican los polipeptidos anteriores pueden incorporarse en dichos vectores de expresion, con los que posteriormente se transforman las celulas huesped eucariotas, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos de tal forma que los polipeptidos codificados por los ADN se expresan en las celulas huesped eucariotas. En el caso de utilizar vectores de expresion tales como pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 o pEGFP-C1, los polipeptidos pueden expresarse como varias protelnas de fusion marcadas con el marcador His (por ejemplo, de (His)6 a (His)10), el marcador FLAG, el marcador myc, el marcador HA, GFP o similares.

Los vectores de expresion pueden introducirse en las celulas hospedadoras usando metodos de sobra conocidos, tales como electroporacion, un metodo de fosfato de calcio, un metodo de liposoma, un metodo de DEAE dextrano, microinyeccion, infeccion vlrica, lipofeccion y union con peptidos que penetran en las celulas.

El polipeptido de interes puede aislarse y purificarse a partir de las celulas hospedadoras mediante una combinacion de operacion de separacion conocidos en la materia. Los ejemplos de los mismos incluyen, aunque no de forma limitativa, tratamiento con un desnaturalizante (por ejemplo, urea) o un tensioactivo, ultrasonicacion, digestion enzimatica, precipitacion salina, fraccionamiento y precipitacion de disolvente, dialisis, centrifugacion, ultrafiltracion, filtracion en gel, SDS-PAGE, electroforesis de electroenfoque, cromatografla de intercambio ionico, cromatografla hidrofoba, cromatografla de afinidad y cromatografla de fase inversa.

Con el fin de preparar el anticuerpo de acuerdo con la presente invencion, los antlgenos preparados de este modo pueden usarse como antlgenos sensibilizantes como se describe mas adelante.

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<Estructura del anticuerpo>

Los anticuerpos (inmunoglobulina) normalmente son glucoproteinas heteromultimericas que comprenden cada una al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las inmunoglobulinas, salvo las IgM, son glucoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150 kDa compuestas cada una de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Normalmente, cada cadena ligera se conecta a una cadena pesada a traves de un solo enlace disulfuro covalente, aunque el numero de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas cambia entre los diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada una de las cadenas pesada y ligera tambien tienen puentes disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene un dominio variable (region VH) en un extremo, seguido de una serie de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (region VL) en un extremo y tiene una region constante sencilla en el otro extremo. La region constante de la cadena ligera se alinea con la primera region constante de la cadena pesada, mientras que el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Regiones particulares denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en los dominios variables del anticuerpo exhiben una variabilidad especifica e imparten especificidad de union al anticuerpo. Las porciones relativamente conservadas en las regiones variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera completos comprenden cada uno cuatro FR conectadas mediante tres CDR. Estas tres CDR se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en este orden, desde el extremo N- terminal de la cadena pesada. De forma analoga, las CDR se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en la cadena ligera. La CDRH3 es la mas importante para la especificidad de union del anticuerpo por su antigeno. Ademas, las CDR en cada cadena se mantienen proximas entre si mediante las regiones FR y contribuyen a la formation de un sitio de union a antigeno en el anticuerpo, junto con las CDR en la otra cadena. Las regiones constantes no contribuyen directamente a la union anticuerpo-antigeno, pero muestran varias funciones efectoras, por ejemplo, implication en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis mediada por la union a un receptor Fcy, semivida/velocidad de elimination mediada por un receptor Fc neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por un componente C1q en la cascada de complemento.

<Preparacion de anticuerpos>

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invention significa un anticuerpo que tiene reactividad inmunologica con una proteina CAPRIN-1 de longitud completa o con un fragmento de la misma. En particular, el anticuerpo anti-CAPRlN-1 de la presente invencion es un anticuerpo que se une inmunologicamente a un polipeptido parcial de una proteina CAPRIN-1 (polipeptido parcial de CAPRIN-1) que es un peptido que contiene un epitopo y que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5. El anticuerpo de la presente invencion reconoce, preferentemente, un epitopo que consiste en aproximadamente DE 7 a 12 aminoacidos consecutivos, por ejemplo, de 8 a 11 aminoacidos consecutivos, en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5. Este anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invencion puede unirse especificamente a la proteina CAPRIN-1 de longitud completa. El anticuerpo de la presente invencion puede obtenerse seleccionando un anticuerpo que se une inmunologicamente a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5, de acuerdo con un metodo de rutina de entre los anticuerpos obtenidos con las proteinas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas como antigenos.

En este contexto, la "reactividad inmunologica" significa la propiedad del anticuerpo de unirse al antigeno de CAPRIN-1 (una proteina CAPRIN-1 de longitud completa o un polipeptido parcial de la misma) in vivo. Mediante dicha union, el anticuerpo de la presente invencion frente a CAPRIN-1, el anticuerpo ejerce la funcion del dano (por ejemplo, matar, suprimir, o causar la regresion de) las celulas tumorales. El anticuerpo de la presente invencion puede danar A tumores, tales como cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal (por ejemplo, cancer de colon), cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma como resultado de la union a la proteina CAPRIN-1.

El anticuerpo de la presente invencion puede ser cualquier tipo de anticuerpo. Ejemplos del tipo del anticuerpo segun la presente invencion incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos sinteticos, anticuerpos multiespecificos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, anticuerpos de cadena unica y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv ). Ademas, el anticuerpo es cualquier clase de molecula de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgA, IgD o IgY, o cualquier subclase, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 o IgA2.

Ademas, el anticuerpo puede modificarse mediante acetilacion, formilacion, amidacion, fosforilacion, PEGilacion o similares, asi como glicosilacion.

En lo sucesivo en el presente documento, se mostraran ejemplos de preparation de diversos anticuerpos.

Cuando el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, las lineas celulares de cancer de mama SK-BR-3 que expresan CAPRIN-1 se administran a cada raton para la inmunizacion. Se extrae el bazo de este raton. Despues de la separation de los esplenocitos, se fusionan las celulas con celulas de mieloma de raton. Los clones que producen anticuerpos que tienen un efecto inhibidor del crecimiento de celulas cancerosas se

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seleccionan de entre las celulas de fusion obtenidas (hibridomas). Como alternativa, se pueden seleccionar los clones que producen anticuerpos que se unen a un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5. Se alslan y se cultivan los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que tienen un efecto inhibidor del crecimiento de las celulas cancerosas o los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra los polipeptidos de SEQ ID NO: 5, etc. El anticuerpo de la presente invencion puede prepararse mediante purificacion a partir del sobrenadante de cultivo de acuerdo con un metodo general de purificacion por afinidad.

Los hibridomas productores del anticuerpo monoclonal pueden prepararse, por ejemplo, del modo siguiente. En primer lugar, se inmuniza a los animales con antlgenos sensibilizantes de acuerdo con un metodo conocido en la tecnica. Este metodo de inmunizacion implica generalmente, inyectar por via intraperitoneal o subcutanea los antlgenos sensibilizantes a mamlferos. Especlficamente, los antlgenos sensibilizantes se diluyen con o se suspenden en PBS (suero salino tamponado con fosfato), suero salino fisiologico o similares en una cantidad adecuada y despues se mezclan, si se desea, con una cantidad adecuada de un adyuvante convencional, por ejemplo, adyuvante completo de Freund. Despues de emulsionar, se administra a cada mamlfero varias veces cada 4 a 21 dlas. Como alternativa, puede usarse un vehlculo adecuado para la inmunizacion con antlgenos sensibilizantes.

Despues de la confirmacion de un aumento del nivel del anticuerpo deseado en el suero del animal (normalmente, mamlfero) as! inmunizado, los inmunocitos se recogen del animal y se someten a fusion celular. Ejemplos preferidos de los inmunocitos incluyen, particularmente, esplenocitos.

Se pueden usar celulas de mieloma de mamlfero, por ejemplo, como celulas progenitoras companeras para u fusion con los inmunocitos. En la materia se conocen varias llneas celulares, por ejemplo, P3U1 (P3-X63Ag8U1), P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (deSt. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), se usan, preferentemente, como las celulas de mieloma.

La fusion celular entre los inmunocitos y las celulas de mieloma puede efectuarse basicamente de acuerdo con un metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, el metodo de Kohler y Milstein (Kohler, G. and Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mas especlficamente, la fusion celular se lleva a cabo, por ejemplo, en presencia de un promotor de la fusion celular en un medio nutriente convencional. Por ejemplo, como promotor de fusion se usa polietilenglicol (PEG virus de hemaglutinante de Japon (VHJ)). Si se desea, puede anadirse ademas un adyuvante, tal como dimetilsulfoxido, para potenciar la eficacia de la fusion.

La proporcion entre los inmunocitos y las celulas de mieloma puede ajustarse de manera arbitraria. Por ejemplo, la cantidad de los inmunocitos se ajusta, preferentemente, a de 1 a 10 veces la cantidad de las celulas de mieloma. Los ejemplos del medio que puede usarse en la fusion celular incluyen los medios RPMI1640 y MEM, adecuados para el crecimiento de las lineas celulares de mieloma, as! como medios convencionales para su uso en este tipo de cultivo celular. Ademas, puede usarse un complemento de suero, tal como suero de ternero fetal (FCS) en combinacion con estas celulas.

Para la fusion celular, se mezclan exhaustivamente los inmunocitos y las celulas de mieloma en una cantidad predeterminada del medio. Normalmente se anade una solucion de PEG (meso molecular promedio: por ejemplo, de aproximadamente 1000 a 6000) precalentada a aproximadamente 37 °C a la mezcla a una concentracion del 30 al 60 % (p/v) y se mezcla con la misma para formar los hibridomas de interes. Posteriormente, se repiten los procedimientos de anadir secuencialmente un medio adecuado y retirar el sobrenadante por centrifugacion para eliminar los agentes de fusion celular o similares no favorables para el crecimiento de los hibridomas.

Los hibridomas obtenidos de este modo se cultivan en un medio selectivo convencional, por ejemplo, un medio HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina) para la seleccion. Se continua el cultivo en el medio HAT durante un periodo (normalmente, de varios dlas a varias semanas) suficiente para la muerte de las celulas (celulas no fusionadas) distintas de los hibridomas de interes. Posteriormente, se exploran los hibridomas que producen el anticuerpo de interes y se clonan como clones individuales mediante un metodo convencional de dilucion limitante.

Ademas de dicha obtencion de los hibridomas mediante la inmunizacion de animales no humanos con antlgenos, pueden obtenerse hibridomas que producen anticuerpos humanos que tienen la actividad deseada (por ejemplo, actividad inhibidora del crecimiento celular) sensibilizando a linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos infectados con el virus EB, con protelnas, celulas que expresan protelnas, o lisados de las mismas in vitro y fusionando los linfocitos sensibilizados con celulas de mieloma de origen humano capaces de dividirse permanentemente, por ejemplo, U266 (n.° de acceso TIB196).

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Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal preparados de este modo pueden subcultivarse en un medio convencional y tambien pueden almacenarse durante un largo periodo en nitrogeno llquido.

Especlficamente, los antlgenos deseados o las celulas que expresan los antlgenos deseados se usan como antlgenos sensibilizantes en la inmunizacion de acuerdo con un metodo de inmunizacion convencional. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con celulas progenitoras conocidas en la materia de acuerdo con un metodo de fusion celular convencional. Las celulas productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) pueden explorarse mediante un metodo de exploracion convencional para preparar el anticuerpo de interes.

Otro ejemplo de anticuerpo que puede usarse en la presente invencion es un anticuerpo policlonal. El anticuerpo policlonal puede obtenerse, por ejemplo, del modo siguiente:

Se obtiene suero de animales pequenos, tales como ratones, ratones productores de anticuerpos humanos o conejos inmunizados con protelnas CAPRIN-1 naturales o protelnas CAPRIN-1 recombinantes expresadas como protelnas de fusion con GST o similares en microorganismos, tales como E. coli, o peptidos parciales de las mismas. Como alternativa, se puede obtener suero de mamlferos inmunizados con polipeptidos de fragmentos de CAPRIN-1, comprendiendo cada uno la secuencia de aminoacidos. mostrada por la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoacidos que tiene un 80 % o mas, preferentemente un 85 % o mas, mas preferentemente un 90 % o mas, aun mas preferentemente un 95 % o mas de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoacidos (preferentemente, un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5) o polipeptidos, cada uno de los cuales comprende (preferentemente consiste en) un epltopo que consiste en aproximadamente de 7 a 12 aminoacidos consecutivos, por ejemplo, de 8 a 11 aminoacidos consecutivos, en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoacidos que tiene un 80 % o mas, preferentemente un 85% o mas, mas preferentemente un 90% o mas, aun mas preferentemente de un 95 % o mas de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos, como agentes sensibilizantes. Este suero se purifican usando, por ejemplo, precipitacion por sulfato de amonio, columnas de protelna A o de protelna G, cromatografla de intercambio ionico de DEAE o columnas de afinidad acopladas con protelnas CAPRIN-1 o peptidos sinteticos para preparar el anticuerpo policlonal anti-CAPRIN-1. El anticuerpo policlonal de la presente invencion incluye anticuerpos obtenidos de animales productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratones) inmunizados con protelnas CAPRIN-1.

En este contexto, por ejemplo, los ratones KM (Kirin Pharma Co., Ltd./Medarex) y los ratones Xeno (Amgen Inc.) se conocen como ratones productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, las Publicaciones internacionales n.° WO02/43478 y WO02/092812). Pueden obtenerse anticuerpos policlonales humanos completos a partir de la sangre de dichos ratones inmunizados con protelnas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas. Como alternativa, pueden aislarse esplenocitos de los ratones inmunizados de este modo y fusionarse con celulas de mieloma. De este modo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos.

Los antlgenos pueden prepararse de acuerdo con, por ejemplo, un metodo que usa celulas animales (publication de patente JP (Kohyo) n.° 2007-530068 A (2007)) o un metodo que usa baculovirus (por ejemplo, la publicacion internacional N.° WO 098/46777). Pueden unirse antlgenos que tienen baja inmunogenicidad a macromoleculas inmunogenicas, tales como albumina, para la inmunizacion. Los antlgenos se pueden administrar con adyuvantes para la inmunizacion.

Como alternativa, e anticuerpo de la presente invencion puede obtenerse como anticuerpos recombinantes, que se producen usando una tecnica de ingenierla genetica que implica: clonar los genes de anticuerpos de hibridomas; incorporar los genes de anticuerpo en vectores adecuados; e introducir los vectores en huespedes (vease, por ejemplo, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especlficamente, se sintetizan ADNc para la region variable (region V) del anticuerpo a partir de los ARNm de hibridomas usando una retrotranscriptasa. Despues de la obtencion de los ADNc que codifican las regiones V de anticuerpo de interes, se ligan los ADN con ADN que codifican las regiones constantes (regiones C) de anticuerpo deseadas. Los productos de ligamiento resultante se incorporan en vectores de expresion. Como alternativa, los ADN que codifican la region V de anticuerpo pueden incorporarse en vectores de expresion que contienen ADN de region C de anticuerpo. Estos ADN se incorporan en vectores de expresion para ser expresados bajo el control de regiones de control de la expresion, por ejemplo, un potenciador y un promotor. A continuation, las celulas hospedadoras pueden transformarse con los vectores de expresion resultante y se deja que expresen anticuerpos.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invencion es, preferentemente, un anticuerpo monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invencion puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo geneticamente modificado (anticuerpo quimerico, anticuerpo humanizado, etc.), o similares.

El anticuerpo monoclonal incluye anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales de animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de raton, de rata, de conejo y de pollo), anticuerpos monoclonales quimericos y similares. El anticuerpo monoclonal puede prepararse mediante el cultivo de hibridomas obtenidos mediante la fusion entre esplenocitos de mamlferos no humanos (por ejemplo, ratones o ratones productores de anticuerpos humanos, pollos y conejos) inmunizados con protelnas CAPRIN-1 o fragmentos de los mismos y celulas

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de mieloma. Como alternativa, se pueden incorporar genes de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera a partir de esplenocitos de animales no humanos (por ejemplo, ratones, ratones productores de anticuerpos humanos, pollos y conejos) inmunizados con protelnas CAPRIN-1 o fragmentos de las mismas mediante conectores en vectores fagemidos, que, a continuacion, se introducen en E. coli de manera que los anticuerpos de cadena unica se expresan a traves de fagos auxiliares para preparar los anticuerpos de interes. El anticuerpo quimerico es un anticuerpo preparado a partir de una combination de secuencias derivadas de distintos animales y es, por ejemplo, un anticuerpo compuesto por regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo de raton y regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano. El anticuerpo quimerico puede prepararse usando un metodo conocido en la materia que implica, por ejemplo: ligar los ADN que codifican regiones V de anticuerpo con ADN que codifican regiones C de anticuerpo humano; que incorpora los productos de union resultantes en vectores de expresion; e introducir los vectores en huespedes de modo que se producen anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales que tienen reactividad inmunologica con un polipeptido parcial de CAPRIN-1 que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5 y tienen un efecto antitumoral se preparan mediante metodos que se describen mas adelante en los ejemplos. Estos anticuerpos monoclonales comprenden cada uno, por ejemplo, una region variable de la cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9, 19, 58, 63, 69 o 77 y una region variable de la cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 13, 23, 53, 62, 65, 73 o 81. en estos anticuerpos monoclonales, la region VH puede comprender CDR1 mostrada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6, 16, 55, 66 o 74, CDR2 mostrada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, 17, 56, 67 o 75 y CDR3 mostrada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 8, 18, 57, 68 o 76 y la region VL puede comprender CDR1 mostrada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10, 20, 50, 59, 70 o 78, CDR2 mostrada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 11, 21, 51, 60, 64, 71 o 79 y CDR3 mostrada por la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 12, 22, 52, 61, 72 u 80.

El anticuerpo humanizado, tambien denominado anticuerpo humano reformado, es un anticuerpo disenado por ingenierla genetica. El anticuerpo humanizado se construye injertando CDR de anticuerpo procedentes de un animal inmunizado en las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo humano. Tambien se conoce una estrategia general de recombination genica para este proposito.

Especlficamente, por ejemplo, las secuencias de ADN disenadas para unir CDR de anticuerpos de raton, conejo y pollo, y regiones marco (FR, framework regions) de anticuerpo humano se sintetizan mediante PCR usando varios oligonucleotidos preparados que tienen porciones terminales que se solapan entre si. Los ADN obtenidos se ligan con ADN que codifican regiones constantes de anticuerpos humanos. Posteriormente, los productos de ligamiento resultantes se incorporan en vectores de expresion, que despues se introducen en huespedes para la production de anticuerpos para obtener el anticuerpo de interes (vease la publication de solicitud de patente europea n.° EP239400 y la publicacion internacional n.° WO96/02576). Las FR de anticuerpo humano conectadas a traves de las CDR se seleccionan de tal forma que las regiones determinantes de la complementariedad forman un sitio de union a antlgeno favorable. Si fuese necesario, pueden sustituirse aminoacidos en las regiones marco de las regiones variables de anticuerpo de tal forma que las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo humano reformado resultante forman un sitio de union a antlgeno adecuado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Ademas, pueden reemplazarse estas regiones marco con regiones marco procedentes de diversos anticuerpos humanos (vease la publicacion internacional n.° WO99/51743).

Las regiones marco de anticuerpo humano conectadas a traves de las CDR se seleccionan de tal forma que las regiones determinantes de la complementariedad forman un sitio de union a antlgeno favorable. Si fuese necesario, pueden sustituirse aminoacidos en las regiones marco de las regiones variables de anticuerpo de tal forma que las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo humano reformado resultante forman un sitio de union a antlgeno adecuado (Sato K. et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856).

Pueden sustituirse aminoacidos en las regiones variables (por ejemplo, las FR) o las regiones constantes del anticuerpo quimerico o el anticuerpo humanizado preparado de este modo, por ejemplo, por otros aminoacidos.

La sustitucion de aminoacidos es la sustitucion de, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos aminoacidos, preferentemente de 1 a 5 aminoacidos, mas preferentemente 1 o 2 aminoacidos. El anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitucion es, deseablemente, una sustitucion conservativa de aminoacidos, que es la sustitucion entre aminoacidos similares en sus propiedades, tales como la carga, las cadenas laterales, la polaridad y la aromaticidad. Los aminoacidos pueden clasificarse en cuanto a propiedades similares en, por ejemplo, aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina); aminoacidos acidos (acido aspartico y acido glutamico); aminoacidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cistelna y tirosina); aminoacidos no polares (leucina isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina); aminoacidos ramificados (leucina, valina e isoleucina); y aminoacidos aromaticos (fenilalanina tirosina, triptofano e histidina).

Los ejemplos de anticuerpos modificados pueden incluir anticuerpos unidos a varias moleculas, tales como polietilenglicol (PEG). En el anticuerpo modificado de la presente invention, no se limita la sustancia que se va a

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unir. Para obtener dicho anticuerpo modificado, el anticuerpo modificado puede modificarse qulmicamente. Ya se ha descrito exhaustivamente en la tecnica un metodo para esto.

En este contexto, la expresion "funcionalmente equivalente" significa que un anticuerpo especlfico tiene actividad biologica o bioqulmica similar a la del anticuerpo de la presente invencion, especlficamente, el anticuerpo especlfico tiene la funcion de danar el tumor y esencialmente no provoca rechazo cuando se aplica a seres humanos, por ejemplo. Los ejemplos de dicha actividad pueden incluir actividad inhibidora del crecimiento celular y actividad de union.

Un metodo para preparar un polipeptido funcionalmente equivalente a un determinado polipeptido, que comprende introducir una mutacion en un polipeptido, es de sobra conocido. Por ejemplo, los expertos en la materia pueden introducir de manera adecuada una mutacion en el anticuerpo de la presente invencion usando mutagenesis de sitio dirigido (Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ. y Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W. y Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos. 82, 488-492; y Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) o similares, preparando de este modo un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invencion.

Puede obtenerse un anticuerpo que reconoce un epltopo de una protelna CAPRIN-1 descrita anteriormente o un fragmento del polipeptido de CAPRIN-1 incluido en el mismo mediante un metodo conocido generalmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo puede obtenerse mediante un metodo que implica determinar el epltopo de la protelna CAPRlN-1 reconocida por el anticuerpo anti-CAPRIN-1 que tiene un efecto inhibidor del crecimiento de celulas cancerosas obtenido mediante el metodo convencional anterior (por ejemplo, mapeo de epltopos o un metodo para identificar un epltopo como se describe mas adelante) y preparar un anticuerpo usando un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos contenida en el epltopo en forma de inmunogeno o un metodo que implica determinar un epltopo para un anticuerpo preparado mediante un metodo convencional y seleccionar un anticuerpo que reconoce al mismo epltopo que aquel para el anticuerpo anti-CAPRIN-1. En este contexto, el "epltopo" se refiere a un fragmento polipeptldico que tiene antigenicidad o inmunogenicidad en mamlferos, preferentemente seres humanos. Su unidad mas pequena consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoacidos, preferentemente de 8 a 11 aminoacidos.

El anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo que tiene reactividad inmunologica con CAPRIN-1, o un anticuerpo que reconoce especlficamente a CAPRIN-1 o que un anticuerpo que se une especlficamente a CAPRIN- 1 y muestra actividad citotoxica o un efecto inhibidor del crecimiento tumoral sobre el cancer. El anticuerpo tiene, preferentemente, una estructura que provoque poco o ningun rechazo en animales receptores. Los ejemplos de dichos anticuerpos incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos (por ejemplo, anticuerpos quimericos humanos-de raton), anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespeclficos cuando los animales receptores son seres humanos. Estos anticuerpos tienen regiones variables de las cadenas pesada y ligera derivadas de un anticuerpo humano o tienen regiones variables de las cadenas pesada y ligera que consiste en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2, y CDR3) derivadas de un anticuerpo de animal no humano y regiones marco derivadas de un anticuerpo humano. Como alternativa, estos anticuerpos son anticuerpos recombinantes que tienen regiones variables de las cadenas pesada y ligera derivadas de un anticuerpo de animal no humano y regiones constantes de las cadenas pesada y ligera derivadas de un anticuerpo humano. El anticuerpo de la presente invencion es preferentemente los dos anticuerpos anteriores.

Dichos anticuerpos recombinantes pueden producirse del modo siguiente: los ADN que codifican anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ser humano, de raton, de rata, de conejo y de pollo) contra la CAPRIN-1 humana se clonan a partir de las celulas productoras de anticuerpos, tales como hibridomas, y se usan como moldes para preparar ADN que codifican las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos mediante RT-PCR o similares. Las respectivas secuencias de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada y las secuencias respectivas de CDR1, CDR2 y CDR3 en cada region se determinan basandose en el sistema de numeracion de la UE de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edicion. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Un ADN que codifica cada region variable o un ADN que codifica cada CDR se prepara usando una tecnica de ingenierla genetica (Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o un sintetizador de ADN. Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales humanos mencionados anteriormente se pueden preparar inmunizando a animales productores de anticuerpos humanos (por ejemplo, ratones) con CAPRIN-1 humana y, despues, fusionando esplenocitos extirpados de los animales inmunizados con celulas de mieloma. Aparte de esto, se preparan ADN que codifican regiones variables y constantes de las cadenas ligera o pesada derivadas de un anticuerpo humano, si es necesario, usando una tecnica de ingenierla genetica o un sintetizador de ADN.

Para el anticuerpo humanizado, puede prepararse un ADN que codifica el anticuerpo humanizado produciendo ADN en los que las secuencias que codifican las CDR en los ADN que codifican las regiones variables de las cadenas ligera o pesada derivadas de anticuerpos humano se sustituyen por las correspondientes secuencias que codifican

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CDR de un anticuerpo derivado de un animal no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo o pollo), ligando los ADN resultantes con los ADN que codifican regiones constantes de las cadenas ligera o pesada derivadas de anticuerpos humanos, respectivamente.

Para el anticuerpo quimerico, se puede preparar un ADN que codifica el anticuerpo quimerico ligando ADN que codifican regiones variables de las cadenas ligera o pesada de un anticuerpo derivado de un animal no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo o pollo) con los ADN que codifican regiones constantes de las cadenas ligera o pesada derivadas de anticuerpos humanos.

El anticuerpo monocatenario significa un anticuerpo en el que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se unen linealmente entre si mediante un enlazador. Puede prepararse un ADN que codifica el anticuerpo monocatenario ligando un ADN que codifica la region variable de cadena pesada, un ADN que codifica el enlazador y un ADN que codifica la region variable de la cadena ligera. En este contexto, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera proceden ambas de un anticuerpo humano o proceden de un anticuerpo humano en el que las CDR individuales se han sustituido por CDR de un anticuerpo procedente de un animal no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo o pollo). El enlazador consiste en 12 a 19 aminoacidos. Los ejemplos de los mismos incluyen (G4S)3 que consiste en 15 aminoacidos (G.B. Kim et al., Protein Engineering Design and Selection 2007, 20 (9): 425-432).

El anticuerpo biespeclfico (diacuerpo) significa un anticuerpo capaz de unirse especlficamente a dos epltopos diferentes. Puede prepararse un ADN que codifica el anticuerpo biespeclfico, por ejemplo, ligando un aDn que codifica una region variable A de la cadena pesada, un ADN que codifica una region variable B de la cadena ligera, un ADN que codifica una region variable B de la cadena pesada y un ADN que codifica una region variable A de la cadena ligera en este orden, en el que el ADN que codifica una region variable B de la cadena ligera y el ADN que codifica la region variable B de la cadena pesada estan ligados mediante un ADN que codifica un enlazador como se ha descrito anteriormente. En este contexto, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera proceden todas de un anticuerpo humano o proceden de un anticuerpo humano en el que las CDR individuales se han sustituido por CDR de un anticuerpo procedente de un animal no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo o pollo).

Los ADN recombinantes preparados de este modo pueden incorporarse en uno o mas vectores adecuados, que despues se introducen en celulas hospedadoras (por ejemplo, celulas de mamlfero, celulas de levadura y celulas de insecto) y los ADN se (co)expresan para producir anticuerpos recombinantes (vease,P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd y C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; y J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).

Los ejemplos del anticuerpo de la presente invencion preparados mediante cualquiera de los metodos descritos anteriormente incluyen los siguientes anticuerpos (a) a (g) obtenidos en los ejemplos que se describen a continuacion:

(a) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad CDR de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 13);

(b) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 20, 21 y 22 (por ejemplo, un anticuerpo construido usando una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 23);

(c) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 50, 51 y 52 (por ejemplo, un anticuerpo construido usando una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 53);

(d) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61 (por ejemplo, un anticuerpo construido usando una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 58 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 62);

(e) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 59, 64 y 61 (por ejemplo, un anticuerpo construido usando una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 63 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 65);

(f) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 66, 67 y 68, y una region variable de la cadena ligera

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que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72 (por ejemplo, un anticuerpo construido usando una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 69 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 73);

(g) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 74, 75 y 76, y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 78, 79 y 80 (por ejemplo, un anticuerpo construido usando una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 77 y una region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 81);

En este contexto, las secuencias de aminoacidos mostradas por las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, y las SEQ ID NO: 16, 17 y 18 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de una region variable de la cadena pesada de anticuerpo de raton. Las secuencias de aminoacidos mostradas por las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, las SEQ ID NO: 20, 21 y 22, y las SEQ ID NO: 50, 51 y 52 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de una region variable de la cadena ligera de anticuerpo de raton. Las secuencias de aminoacidos mostradas por las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, las SEQ ID NO: 66, 67 y 68, y las SEQ ID NO: 74, 75 y 76 corresponden a CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, de una region variable de la cadena pesada de anticuerpo de pollo. Las secuencias de aminoacidos mostradas por las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, las SEQ ID NO: 59, 64 y 61, las SEQ ID NO: 70, 71 y 72, y las SEQ ID NO: 78, 79 y 80 corresponden a CDR1, CDR2, y CDR3, respectivamente, de una region variable de la cadena ligera de anticuerpo de pollo.

Los ejemplos del anticuerpo humanizado, el anticuerpo quimerico, el anticuerpo monocatenario o el anticuerpo multiespeclfico de la presente invencion incluyen los siguientes anticuerpos descritos a continuacion. Los siguientes anticuerpos son realizaciones ilustrativas del anticuerpo (a), pero tambien pueden existir realizaciones similares de los otros anticuerpos (b) a (g).

(i) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de

aminoacidos de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, y las secuencias de aminoacidos de regiones marco conservadas

procedentes de anticuerpo humano y una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de

aminoacidos de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, y las secuencias de aminoacidos de regiones marco conservadas procedentes de un anticuerpo humano.

(ii) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de

aminoacidos de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, y las secuencias de aminoacidos de regiones marco conservadas

procedentes de un anticuerpo humano, una region constante de cadena pesada que comprende una secuencia de

aminoacidos procedente de un anticuerpo humano, una region variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, y las secuencias de aminoacidos de regiones marco procedentes de anticuerpo humano y una region constante de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos derivadas de anticuerpo humano.

(iii) un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9, una region constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos procedente de un anticuerpo humano, una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13, y una region constante de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos procedente de un anticuerpo humano.

Las secuencias de las regiones constantes y variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo humano estan disponibles a traves de, por ejemplo, NCBI (EE.UU.; GenBank, UniGene, etc.). Por ejemplo, puede hacerse referencia a las siguientes secuencias en: n.° de acceso J00228 para una region constante de la cadena pesada de IgG1; n.° de acceso J00230 para una region constante de la cadena pesada de IgG2; n.° de acceso X03604 para una region constante de la cadena pesada de IgG3; n.° de acceso K01316 para una region constante de la cadena pesada de IgG4; n.° de acceso V00557, X64135 y X64133 para una region constante k de cadena ligera humana; y n. de acceso X64132 y X64134 para una region constante A de la cadena ligera humana.

Preferentemente, estos anticuerpos tienen actividad citotoxica y, por lo tanto, pueden ejercer un efecto antitumoral.

Las secuencias particulares anteriores de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y las CDR en los anticuerpos mencionados anteriormente se proporcionan unicamente con fines ilustrativos y esta claro que el anticuerpo de la presente invencion no esta limitado por las secuencias particulares. Se preparan hibridomas capaces de producir anticuerpos humanos anti-CAPRIN-1 humana o anticuerpos animales no humanos (por ejemplo, anticuerpos de raton) diferentes de los descritos especlficamente anteriormente y se recuperan anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas y se determina si los anticuerpos recuperados son o no los anticuerpos de interes usando la actividad de union inmunologica contra CAPRIN-1 humana y la actividad citotoxica como indicadores. Los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal de interes se identifican de este modo. Despues, a partir de los hibridomas se preparan los ADN que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de interes y se secuencian, tal como se ha descrito anteriormente. Los ADN se usan para la preparacion de los diferentes anticuerpos.

El anticuerpo descrito anteriormente puede ser cualquiera de los anticuerpos (a) a (g), etc. que tiene la sustitucion,

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delecion o adicion de uno o varios aminoacidos, en particular, en una region distinta de las CDR, por ejemplo, en una secuencia de la region marco y/o una secuencia de la region constante, siempre que el anticuerpo tenga una especificidad tal que pueda reconocer especlficamente a CAPRIN-1. En el presente documento, el termino "varios" significa, preferentemente, De 2 a 5, mas preferentemente 2 o 3.

El anticuerpo de la presente invencion tiene una constante de afinidad Ka (kon/koff) de, preferentemente, al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 x 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1 al menos 5 x 1010 M-1 al menos 1011 M-1 al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1 o, al menos, 1013 M-1 para la protelna CAPRIN-1 o el fragmento de la misma.

El anticuerpo de la presente invencion se puede conjugar con un agente antitumoral. La conjugacion del anticuerpo con el agente antitumoral se puede realizar a traves de un espaciador que tiene un grupo reactivo con un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similar (por ejemplo, un grupo succinimidilo, un grupo formilo, un grupo 2-piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo o un grupo hidroxi).

Los ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos en las bibliograflas, por ejemplo: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxido de mecloretamina clorhidrato, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, androgenos (por ejemplo, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona), aminoglutetimida, mitotano, trilostano, acido frollnico, aceglatona, glucosido de aldofosfamida, acido aminolevullnico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucido, lentinano, lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, acido podofillnico, 2- etilhidracida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, acido tenuazonico, triazicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etoposido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecan, inhibidores de topoisomerasa, difluorometilornitina (DMFO), acido retinoico, capecitabina y sales y derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos.

Como alternativa, el anticuerpo de la presente invencion puede administrarse en combinacion con un agente antitumoral para producir un mayor efecto terapeutico. Esta estrategia puede adaptarse a un paciente con cancer que expresa CAPRIN-1 antes o despues de una intervencion quirurgica. Esta estrategia puede aplicarse, particularmente despues de la cirugla, a un cancer que expresa CAPRIN-1, que se ha tratado convencionalmente solo con un agente antitumoral solo, para producir una mayor prevencion de la recidiva del cancer o para la prolongacion del tiempo de supervivencia.

Los ejemplos del agente antitumoral usado en la administracion combinada con el anticuerpo de la presente invencion incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos en las bibliograflas, etc.: paclitaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, tiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida, trimetilolomelamina, bulatacina, butalacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficina 1, criptoficina 8, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, oxido de mecloretamina clorhidrato, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliceamicina, dinemicina, clodronato, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicina, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicina, dactinomicina, detorbicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, adriamicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina, denopterina, pteropterina, trimetrexato, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona, aminoglutetimida, mitotano, trilostano, acido frollnico, aceglatona, glucosido de aldofosfamida, acido aminolevullnico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, epotilona, etoglucido, lentinano,

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lonidamina, maitansina, ansamitocina, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarubicina, losoxantrona, acido podofillnico, 2-etilhidracida, procarbazina, razoxano, rizoxina, esquizofilano, espirogermanio, acido tenuazonico, triazicuona, roridina A, anguidina, uretano, vindesina, dacarbazina, manomustina, mitobronitol, mitolactol, pipobromano, gacitosina, docetaxel, clorambucilo, gemcitabina, 6-tioguanina, mercaptopurina, cisplatino, oxaliplatino, carboplatino, vinblastina, etoposido, ifosfamida, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, novantrona, teniposido, edatrexato, daunomicina, aminopterina, xeloda, ibandronato, irinotecan, inhibidores de topoisomerasa, difluorometilornitina (DMFO), acido retinoico, capecitabina, y sales farmaceuticamente aceptables (conocidas en la tecnica) y derivados (conocidos en la tecnica) de los mismos. Ente estos agentes antitumorales, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel o vinorelbina se usan particularmente preferentemente.

El anticuerpo de la presente invencion puede unirse a un radioisotopo conocido en la bibliografla, etc., tales como 211At, 131I, 125I, 90Y, 1 6Re, 188Re, 153Sm, 12Bi, 32P, 175Lu o 176Lu. Preferentemente, se usa un radioisotopo eficaz para el tratamiento o el diagnostico de tumores. Dicho radioisotopo tambien se incluye en el alcance del agente antitumoral de acuerdo con la presente invencion.

<Identificacion del epltopo>

El anticuerpo de la presente invencion reconoce la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5 como un epltopo, tal como se muestra mas adelante en los ejemplos. Un ejemplo de un metodo para confirmar el epltopo para el anticuerpo de la presente invencion comprende inmovilizar el polipeptido de la SEQ ID NO: 5 (epltopo) sobre una placa y evaluar el anticuerpo para su reactividad frente a este epltopo. Especlficamente, el polipeptido de SEQ ID NO: 5 se inmoviliza sobre una placa a traves de la reaccion con un grupo funcional electrofilico unido mediante un separador de, por ejemplo, oligoetilenglicol a la placa y, despues, se hace reaccionar con el anticuerpo de la presente invencion. Por ejemplo, se puede hacer reaccionar un anticuerpo secundario marcado con HRP (peroxidasa de rabano picante) capaz de unirse al anticuerpo de la presente invencion para evaluar la reactividad del anticuerpo (para confirmar el epltopo para el anticuerpo de la presente invencion). El polipeptido de SEQ ID NO: 5 a inmovilizar sobre una placa puede usarse como una forma que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 5 o una forma parcialmente modificada (por ejemplo, una forma modificada del polipeptido en el residuo en N-terminal o C- terminal con varios aminoacidos o una protelna tal como KLH o una forma modificada del polipeptido con una protelna MAP), siempre y cuando el anticuerpo de la presente invencion se una a estas formas polipeptldicas.

Algunos anticuerpos de la presente invencion pueden no reaccionar con el polipeptido de SEQ ID NO: 5 (es decir, el epltopo no esta confirmado) en el metodo anterior. En tal caso, el epltopo para el anticuerpo de la presente invencion puede confirmarse haciendo reaccionar el anticuerpo con el antlgeno en condiciones de solucion que facilitan la union antlgeno-anticuerpo como se describe en el Ejemplo 2, obteniendo el complejo antlgeno-anticuerpo resultante mediante un metodo de inmunoprecipitacion y, despues, separar un resto polipeptldico unido al anticuerpo y determinar su secuencia de aminoacidos. El antlgeno puede ser un polipeptido que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 5, la suya parcialmente modificada, o una protelna CAPRIN-1, siempre y cuando un epltopo reactivo con el anticuerpo de la presente invencion pueda ser confirmado mediante los metodos mencionados anteriormente.

<Efecto antitumoral>

Se considera que el efecto antitumoral del anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invencion sobre las celulas de cancer que expresan CAPRIN-1 se crean mediante el siguiente mecanismo: citotoxicidad dependiente de anticuerpo mediada por celulas efectoras (ADCC) contra las celulas que expresan CAPRIN-1 y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) contra las celulas que expresan CAPRIN-1. Sin embargo, el alcance de la presente invencion no pretende estar limitado por el mecanismo.

Se sabe que el efecto antitumoral basado en el mecanismo se correlaciona con el numero de moleculas diana de union a anticuerpos expresadas en la superficie de las celulas cancerosas (Niwa R., Clinical Cancer Research (2005) Mar 15; 11 (6): 2327-2336). El numero de moleculas diana expresadas en la superficie de las celulas cancerosas se puede examinar usando un kit de ensayo existente capaz de medir el numero de moleculas en la superficie celular. Especlficamente, el numero de moleculas dianas de union a anticuerpos se puede determinar mediante: reaccion de celulas cancerosas con, por ejemplo, anticuerpos contra las moleculas diana como anticuerpos primarios; la reaccion con ellos de anticuerpos marcados fluorescentemente contra los anticuerpos primarios, junto con perlas de la curva de calibration con el numero de moleculas previamente conocido; la medicion de la intensidad media de fluorescencia de las muestras; y la determination del numero de moleculas diana sobre la base de la curva de calibracion obtenida.

Por lo tanto, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 que se utilizara en la presente invencion puede analizarse en cuanto a su actividad determinando ex vivo la actividad de ADCC o la actividad de CDC frente a celulas cancerosas que expresan CAPRIN-1 o examinando el numero de moleculas de CAPRIN-1 expresadas en la superficie de las celulas cancerosas en el caso de usar el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de acuerdo con la presente invencion como un anticuerpo primario como se muestra especlficamente a continuation en los Ejemplos.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 que se utilizara en la presente invencion se une a las protelnas CAPRIN-1 en las

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celulas cancerosas y exhibe un efecto antitumoral a traves de la actividad. Por lo tanto, el anticuerpo anti-CAPRIN-1 de la presente invention se considera que es util en el tratamiento o prevention del cancer. Especlficamente, la presente invencion proporciona una composition farmaceutica para el tratamiento y/o prevencion del cancer, que como principio activo comprende el anticuerpo anti-CAPRIN-1. El anticuerpo anti-CApRlN-1 que se va a utilizar para el proposito de administration a cuerpos humanos (terapia de anticuerpos) es, preferentemente, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado para reducir la inmunogenicidad.

El anticuerpo anti-CAPRIN-1 con mayor afinidad de union a una protelna CAPRIN-1 en la superficie de las celulas cancerosas ejerce una actividad antitumoral mas fuerte. Por lo tanto, Por lo tanto, puede esperarse que el anticuerpos de acuerdo con la presente invencion tenga un efecto antitumoral mas fuerte debido a la alta afinidad de union por la protelna CAPRIN-1 y, por tanto, se puede usar como una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento y/o prevencion del cancer. Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la presente invencion tiene una constante de afinidad de union con la constante de asociacion (constante de afinidad) Ka (kon/koff) de,

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preferentemente, al menos 10 M- , al menos10 M- , al menos 5 x 10 M- , al menos10 M- , al menos 5 x 10 M- , al menos1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1 o al menos 1013 M- 1, tal como se ha descrito anteriormente.

Un mayor numero de moleculas de CAPRIN-1 que pueden unirse a anticuerpos anti-CAPRIN-1 en la superficie de las celulas cancerosas produce una actividad antitumoral mas fuerte. Deseablemente, con el fin de producir el efecto antitumoral esperado, el numero de moleculas de CAPRIN-1 a las que se unen los anticuerpos es 104 o mas, preferentemente 105 o mas moleculas de CAPRIN- 1 por celula cancerosa, medidos usando el anticuerpo anti- CAPRIN-1 de la presente invencion. El tumor (celulas cancerosas) que tiene un gran numero de moleculas de CAPRIN-1 en su superficie celular es particularmente preferido como cancer sujeto a la administracion del anticuerpo de la presente invencion.

<Union a celulas que expresan antlgenos>

Puede determinarse la capacidad del anticuerpo para unirse a CAPRIN-1 mediante el uso de un ensayo de union usando, por ejemplo, ELISA, transferencia de Western, inmunofluorescencia y analisis por citometrla de flujo, tal como se describe en los ejemplos.

<Tincion inmunohistoqulmica>

Puede analizarse la reactividad del anticuerpo que reconoce a CAPRIN-1 con CAPRIN-1 mediante un metodo inmunohistoqulmico de sobra conocido para los expertos en la materia usando una section congelada fijada en paraformaldehldo o acetona o una seccion incluida en parafina fijada con paraformaldehldo de un tejido obtenido de un paciente durante una intervention quirurgica o de un animal que porta un xenoinjerto de tejido inoculado con una llnea celular que expresa CAPRIN-1 ya sea de manera espontaneamente o despues de su transfection.

Para la tincion inmunohistoqulmica, el anticuerpo reactivo con CAPRIN-1 puede tenirse mediante diversos metodos. Por ejemplo, puede visualizarse el anticuerpo mediante la reaction con un anticuerpo de cabra anti-raton o un anticuerpo de cabra anti-conejo o un anticuerpo de cabra anti-pollo conjugado a peroxidasa de rabano picante.

<Composicion farmaceutica y medios para tratar y/o prevenir el cancer>

Una diana de la composicion farmaceutica para el tratamiento y/o la prevencion del cancer de la presente invencion no esta particularmente limitada en tanto que la diana sea cancer (celulas) que expresa un gen de CAPRIN-1.

Los terminos "tumor" y "cancer" usados en el presente documento significan neoplasia maligna y se usan de manera intercambiable entre si.

El cancer diana en la presente invencion es cancer que expresa un gen que codifica la protelna CAPRIN-1 y es, preferentemente, cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.

Los ejemplos especlficos de estos canceres incluyen, aunque no de forma limitativa, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de mama de tipo complejo, tumor mixto maligno de glandula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmon, cancer de celulas escamosas, cancer microcltico, cancer macrocltico, glioma que es tumor de tejido neuroepitelial, ependimoma ventricular, tumor neuronal, tumor neuroectodermico embrionario, neurilemoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocltica cronica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma alimentario, linfoma de celulas pequenas a medias, cancer cecal, cancer de colon ascendente, cancer de colon descendente, cancer de colon transverso, cancer de colon sigmoide, cancer rectal, cancer de ovarios epitelial, tumor de celulas germinales, tumor de celulas estromales, carcinoma pancreatico ductal, carcinoma pancreatico ductal invasivo, adenocarcinoma pancreatico, carcinoma de celulas acinares, carcinoma adenoescamoso, tumor de celulas gigantes, neoplasia papilar-mucinoso intraductal, neoplasia qulstica mucinosa, pancreoblastoma,

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cistadenocarcinoma seroso, tumor papilar solido, gastrinoma, glucagonoma, insulinoma, neoplasia endocrina multiple de tipo-1 (sindrome de Wermer), tumor de celulas de islote no funcionales, somatostatinoma y VIPoma.

El sujeto (paciente) como receptor es, preferentemente, mamiferos, por ejemplo, mamiferos incluyendo primates, mascotas, ganado y animales de deporte, y, de manera particularmente preferente, seres humanos, perros y gatos.

Cuando se usa el anticuerpo de la presente invencion es una composicion farmaceutica, la composicion farmaceutica puede formularse mediante un metodo conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede usarse en forma de una inyeccion parenteral de una solucion o suspension aseptica con agua o cualquier otro liquido farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede formularse con el anticuerpo mezclado en una forma de dosis unitaria requerida para la practica farmaceutica generalmente aceptada, en combination con vehiculos o medios farmacologicamente aceptables, especificamente, agua esterilizada, suero salino fisiologico, aceite vegetal, un emulsionante, un agente de suspension, un tensioactivo, un estabilizante, un agente aromatizante, un excipiente, un vehiculo, un conservante, un aglutinante, etc., segun sea adecuado. La cantidad del principio activo en dicha preparation se determina de tal forma que puede obtenerse una dosis adecuada dentro del intervalo indicado.

Puede formularse una composicion aseptica para inyeccion de acuerdo con la practica farmaceutica convencional usando un vehiculo, tal como agua destilada inyectable.

Los ejemplos de soluciones acuosas para inyeccion incluyen suero salino fisiologico, soluciones isotonicas que contienen glucosa y otros adyuvantes, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sodico. Estas soluciones pueden usarse en combinacion con un solubilizante adecuado, por ejemplo, un alcohol (particularmente etanol) o un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol), o un tensioactivo no ionico, por ejemplo, polisorbato 80 (TM) o HCO-60.

Los ejemplos de soluciones oleosas incluyen aquellos que usan aceite de sesamo y aceite de soja. Las soluciones pueden usarse en combinacion con un solubilizante, tal como benzoato de bencilo o alcohol bencilico. Se puede anadir a las soluciones un tampon (por ejemplo, una solucion de tampon fosfato o una solucion de tampon de acetato de sodio), un agente calmante (por ejemplo, clorhidrato de procaina), un estabilizante (por ejemplo, alcohol bencilico o fenol), o un antioxidante. Las soluciones para inyeccion preparadas de este modo se cargan normalmente en ampollas adecuadas.

La composicion farmaceutica de la presente invencion se administra por via oral o parenteral, preferentemente por via parenteral. Los ejemplos de estas formas de dosificacion incluyen inyecciones, agentes de administration intranasal, agentes de administracion transpulmonar y agentes de administracion percutanea. Los ejemplos de inyecciones incluyen inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion intraperitoneal e inyeccion subcutanea, mediante los cuales puede administrarse la composicion farmaceutica de manera sistemica o local.

Ademas, el metodo de administracion puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo de la edad, el peso, del sexo, los sintomas, etc. de un paciente. La dosis de una composicion farmaceutica que contiene el anticuerpo o un polinucleotido que codifica el anticuerpo puede seleccionarse dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,000l a 1000 mg/kg de peso corporal por dosis. Como alternativa, la dosis puede seleccionarse dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,001 a 100000 mg/cuerpo de un paciente, aunque la dosis no se limita necesariamente a estos valores numericos. Aunque la dosis y el metodo de administracion varian dependiendo del peso, la edad, del sexo, los sintomas, etc. de un paciente, los expertos en la materia pueden seleccionar de manera adecuada la dosis y el metodo.

La composicion farmaceutica que incluye el anticuerpo de la presente invencion o fragmentos de la misma puede administrarse a un sujeto para tratar y/o prevenir el cancer, preferentemente cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.

La presente invencion abarca ademas medios para tratar y/o prevenir el cancer, mediante la administracion de la composicion farmaceutica de la presente invencion en combinacion con el agente antitumoral tal como se ha ilustrado anteriormente o una composicion farmaceutica que comprende el agente antitumoral a un sujeto. El anticuerpo de la presente invencion o el fragmento del mismo pueden administrarse simultaneamente con o por separado del agente antitumoral al sujeto. En caso de administrar por separado estas composiciones farmaceuticas, cualquiera de ellas puede administrarse en primer lugar o despues. Sus intervalos de dosificacion, dosis, las vias de administracion y el numero de dosis pueden seleccionarse de manera adecuada por un especialista. Las otras formas de dosificacion farmaceuticas para su administracion simultanea incluyen tambien, por ejemplo, composiciones farmaceuticas formuladas cada una mezclando el anticuerpo de la presente invencion o un fragmento del mismo y el agente antitumoral en un vehiculo (o medio) farmacologicamente aceptable. Las descripciones anteriores acerca de la composicion, formulation, rutas de administracion, dosis, cancer, etc. referentes a las composiciones farmaceuticas y las formas de dosificacion que contienen el anticuerpo de la presente invencion

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tambien pueden aplicarse a cualquiera de las composiciones farmaceuticas y formas de dosificacion que contienen el agente antitumoral mencionadas anteriormente.

Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona una combinacion farmaceutica como se define en las reivindicaciones, que comprende la composition farmaceutica de la presente invencion y una composition farmaceutica que comprende el agente antitumoral tal como se ha ilustrado anteriormente y un metodo para tratar y/o prevenir el cancer, que comprende la administration de la misma. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o prevention del cancer, que comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo de la presente invencion y el agente antitumoral junto con un vehlculo farmacologicamente aceptable.

<Polipeptido y ADN>

La presente invencion proporciona ademas un ADN que codifica el anticuerpo de la presente invencion o el fragmento (fragmento de union a anticuerpos) del mismo. El ADN puede ser un ADN que codifica las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo o puede ser un ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo. El ADN puede ser tambien un ADN que codifica cada una o una combinacion de las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo. Un aDn de este tipo incluye, por ejemplo, un ADN que codifica una region variable de la cadena pesada a que comprende las secuencias de nucleotidos de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 y un ADN que codifica una region variable de la cadena ligera a que comprende las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, en el caso del anticuerpo mencionado anteriormente (a).

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) codificadas por el ADN que tiene estas secuencias sirven como regiones que determinan la especificidad del anticuerpo. Las secuencias que codifican las otras regiones (es decir, regiones constantes y regiones marco) del anticuerpo pueden, por tanto, ser secuencias derivadas de otros anticuerpos. En este contexto, "otros anticuerpos" tambien incluyen anticuerpos derivados de organismos no humanos, pero son, preferentemente, los derivados de seres humanos desde el punto de vista de reducir las reacciones adversas. Especlficamente, en el ADN de la presente invencion, las regiones que codifican cada region marco y cada region constante en las cadenas pesada y ligera comprenden, preferentemente, secuencias de nucleotidos que codifican secuencias de aminoacidos derivadas de anticuerpos humanos correspondientes.

Otros ejemplos del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invencion incluyen un ADN que codifica una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 9 y un ADN que codifica una region variable de la cadena ligera a que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13, en el caso del anticuerpo mencionado anteriormente (a). En este contexto, un ejemplo de las secuencias de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleotidos: de la SEQ ID NO: 14. Un ejemplo de las secuencias de nucleotidos que codifican la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleotidos: de la SEQ ID NO: 15. Cuando dicho ADN comprende regiones que codifican regiones constantes de las cadenas pesada y ligera, cada una de las regiones comprende, preferentemente, una secuencia de nucleotidos que codifica una correspondiente secuencia de aminoacidos derivada de anticuerpo humano (secuencia de aminoacidos de cada region constante de las cadenas pesada y ligera).

Estos ADN de anticuerpos se pueden obtener, por ejemplo, mediante los metodos descritos anteriormente, o por el metodo siguiente. En primer lugar, los ARN totales se preparan a partir de hibridomas que producen el anticuerpo de la presente invencion utilizando un kit de extraction de ARN comercialmente disponible y los ADNc se sintetizan a partir de ellos utilizando transcriptasa inversa y cebadores aleatorios o similares. Posteriormente, los ADNc que codifican anticuerpos se amplifican mediante PCR utilizando cebadores oligonucleotldicos para secuencias conservadas de regiones variables en genes conocidos de cadena pesada o ligera de anticuerpo de raton. Las secuencias que codifican las regiones constantes se pueden obtener mediante amplification por PCR de las secuencias conocidas. La secuencia de nucleotidos del ADN se puede incorporar en un plasmido o un fago para la secuenciacion, por ejemplo, y se determina de acuerdo con un metodo convencional.

La presente invencion proporciona ademas los siguientes polipeptidos y ADN relacionados con los anticuerpos (a) a (g) mencionados anteriormente:

(i) un polipeptido que comprende cualquier secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 9, 19, 58, 63, 69 y 77, y un ADN que codifica el polipeptido (por ejemplo, un ADN que comprende cualquier secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 14 y 24);

(ii) un polipeptido que comprende cualquier secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 13, 23, 53, 62, 65, 73 y 81, y un ADN que codifica el polipeptido (por ejemplo, un ADN que comprende cualquier secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 15, 25 y 54);

(iii) polipeptidos de la CDR de la cadena pesada seleccionados del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos mostradas por las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, las SEQ ID NO: 66, 67 y 68, y las SEQ ID NO: 74, 75 y 76, y un ADN que codifica los polipeptidos; y

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(iv) polipeptidos de la CDR de la cadena ligera seleccionados de las secuencias de aminoacidos mostradas por las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, las SEQ ID NO: 20, 21 y 22, las SEQ ID NO: 50, 51 y 52, las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, las SEQ ID NO: 59, 64 y 61, las SEQ ID NO: 70, 71 y 72, y las SEQ ID NO: 78, 79 y 80, y un ADN que codifica los polipeptidos.

Estos polipeptidos y ADN pueden prepararse usando tecnicas de ingenierla genetica como se ha descrito anteriormente.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira especlficamente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, el alcance de la presente invencion no pretende estar limitado por estos ejemplos especlficos.

Ejemplo 1 Analisis de la expresion de CAPRIN-1 en cada tejido

Se investigo la expresion del gen de la CAPRIN-1 en tejidos normales de perro y ser humano y diversas llneas celulares por el metodo de RT-PCR de acuerdo con el ejemplo 1 (4) del documento WO2010/016526. Como resultado, se observo una fuerte expresion en los testlculos entre los tejidos caninos sanos, mientras que la expresion se observo en cancer de mama canino y tejidos de adenocarcinoma. Adicionalmente, como resultado del examen de la expresion en tejidos humanos, la expresion se observo solo en el testlculo entre tejidos normales, como con el gen CAPRIN-1 canino. Por el contrario, la expresion se detecto en muchos tipos de llneas celulares de cancer, incluyendo 8 llneas celulares de cancer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB- 231V y MRK-nu-1) y 4 llneas celulares de cancer de pancreas (Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1 y BxPc-3), entre las celulas cancerosas. Estos resultados demostraron que la expresion de CAPRIN-1 no se encuentra en tejidos normales aparte del testlculo, mientras que CAPRIN-1 se expresa en las llneas celulares de cancer de mama y en las llneas celulares de cancer de pancreas.

Ejemplo 2 Preparacion de anticuerpo monoclonal de raton contra CAPRIN-1

(1) Preparacion del anticuerpo monoclonal de raton n.° 1

100 pg de protelnas de CAPRIN-1 humana (que tienen la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2) preparadas en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se mezclaron con una cantidad igual de adyuvante MPL + TDM (Sigma-Aldrich Corp.). Esta mezcla se uso como una solucion de antlgeno por raton. La solucion de antlgeno se administro por via intraperitoneal a cada raton Balb/c de 6 semanas de edad (preparado por Japan SLC, Inc.). Despues, se realizaron 7 administraciones cada 1 semana para completar la inmunizacion. Tres dlas despues de la inmunizacion final, el bazo de cada raton se escindio y se molio entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (fabricados por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y centrifugacion a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante se repitieron tres veces para obtener esplenocitos. Los esplenocitos obtenidos se mezclaron con celulas de mieloma de raton SP2/0 (adquiridas de la ATCC) en una proporcion de 10:1. Se anadio a la mezcla celular una solucion de PEG preparada mezclando 200 pl de un medio RPMI1640 que contenla FBS al 10 %, que se calento a 37 °C, con 800 pl de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH) y luego se dejo reposar durante 5 minutos para la fusion celular. Despues de la eliminacion del sobrenadante mediante centrifugacion a 1700 rpm durante 5 minutos, las celulas se suspendieron en 150 ml de un medio RPMI1640 que contenla 15 % de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solucion HAT (Gibco) (medio selectivo HAT). Esta suspension se sembro en quince placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 pl/pocillo. Los esplenocitos y las celulas de mieloma se fusionaron mediante cultivo durante 7 dlas a 37 °C, CO2 al 5 % para obtener hibridomas.

Los hibridomas preparados se sometieron a deteccion selectiva para determinar la afinidad de union de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a las protelnas CAPRIN-1 como indicador. Una solucion de 1 pg/ml de la protelna CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se anadio a una placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo y se dejo reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadio una solucion de seroalbumina bovina al 0,5 % (BSA) (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) a 400 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se elimino la solucion en cada pocillo y se lavo cada pocillo tres veces con 400 pl de PBS-T. A continuacion, se anadio el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadieron anticuerpos (H + L) IgG anti-raton marcados con HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadio una solucion de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejo reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reaccion de color. Despues de revelarse el color, se termino la reaccion mediante la adicion de acido sulfurico 1N a 100 pl/pocillo. Se midio la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrometro de absorcion. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que produclan anticuerpos que tenlan una alta absorbancia.

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Se anadieron los hibridomas seleccionados a una placa de 96 pocillos a 0,5 celulas/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana despues, se observaron los hibridomas que forman colonias unicas en los pocillos. Las celulas de estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se sometieron a deteccion selectiva para determinar la afinidad de union de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a la protelna CAPRIN-1 como indicador. Una solucion de 1 pg/ml de la protelna CAPRIN-1 preparada en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 se anadio a una placa de 96 pocillos a 100 pl/pocillo y se dejo reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadio una solucion de BSA al 0,5 % a 400 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se elimino la solucion en cada pocillo y se lavo cada pocillo tres veces con 400 pl de PBS-T. A continuacion, se anadio el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadieron anticuerpos (H + L) IgG anti-raton marcados con HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadio una solucion de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejo reposar durante 15 a 30 minutos para provocar la reaccion de color. Despues de revelarse el color, se termino la reaccion mediante la adicion de acido sulfurico 1N a 100 pl/pocillo. Se midio la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrometro de absorcion. Como resultado, se obtuvieron 88 llneas de hibridoma que produclan anticuerpos monoclonales reactivos con la protelna CAPRIN-1.

A continuacion, se exploraron estos anticuerpos monoclonales respecto a los anticuerpos reactivos con la superficie de las celulas de cancer de mama que expresan CAPRIN-1. Especlficamente, se centrifugaron 106 celulas de una llnea celular de cancer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugacion de 1,5 ml. Se anadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo del hibridoma obtenido anteriormente y se dejo reposar durante 1 hora sobre hielo. Despues de lavado con PBS, se anadieron a los mismos anticuerpos de cabra anti-IgG de raton marcados con FITc (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 500 veces con PBS que contenla FBS al 0,1 % y se dejo reposar durante 1 hora en hielo. Despues de lavar con PBS, se midio la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otra parte, se efectuo la misma operacion que antes usando el suero de cada raton Balb/c de 6 semanas de edad diluido 500 veces con un medio para cultivo de hibridoma, en lugar de los anticuerpos, para preparar un control. Como resultado, se selecciono un anticuerpo monoclonal (n.° 1) que tenlan una intensidad de fluorescencia mayor que la del control, es decir, reactivo con la superficie de las celulas de cancer de mama .

(2) Identificacion del epltopo de CAPRIN-1 reconocido por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 N.° 1

el anticuerpo monoclonal anticuerpo anti-CAPRIN-1 N.° 1 reactivo a la superficie de celulas cancerosas obtenido en la seccion (1) se uso para identificar una region de epltopo de CAPRIN-1 reconocida por el mismo. Se disolvieron 100 pg de protelnas CAPRIN-1 recombinantes en un tampon de disolucion libre de inhibidor de protelna y se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal de raton N.° 1. Se anadio una enzima digestiva tripsina o quimotripsina a la solucion para llevar a cabo la reaccion de digestion a una temperatura adecuada. Despues de la reaccion, se anadio un vehlculo de protelna G Sepharose a la mezcla de reaccion, se hizo reaccionar con la misma y se precipito por centrifugacion. Despues de la retirada del sobrenadante, el vehlculo se lavo con un tampon de disolucion y PBS y se disolvio en acido formico al 0,1 %, y se recupero el sobrenadante. La muestra del sobrenadante recuperada se aplico a una columna de fase inversa (HLB Extraction Cartridge (Oasis)) para la eliminacion del anticuerpo para obtener una solucion de muestra. La muestra obtenida se sometio a cromatografla de llquidos de fase inversa (Chromatography Nanosystem (KYA Tech Corp.)) para recuperar una solucion que solo contenla peptidos, que luego se introdujo en un espectrometro de masas en tandem de espectrometro de masas cuadrupolo-TOF (Waters- MicroMass) para analisis MS/MS para detectar los peptidos contenidos en la muestra. Como resultado, un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 se identifico como una secuencia parcial de CAPRIN-1 reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 N.° 1.

(3) Preparacion de anticuerpos monoclonales de raton n.° 2 y n.° 3

De manera similar a la descrita en la seccion (1), se mezclo una protelna de fusion de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 identificada en la seccion (2) y una protelna vehlculo KLH (hemocianina de lapa californiana) como un inmunogeno con una cantidad igual de un adyuvante TiterMax Gold(R) (CytRx Corp.) y esta mezcla se administro por via subcutanea a una dosis de 20 pg/inyeccion a cada raton a intervalos de 7 dlas. Despues de la administracion con cuatro inyecciones en total, se obtuvieron esplenocitos del raton 3 dlas despues de la inmunizacion final y se fusionaron con celulas de mieloma de raton de la misma manera que en la seccion (1) para producir hibridomas. Despues, se analizaron los anticuerpos, como indicador, la reactividad de los anticuerpos contenidos en los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas producidos con una solucion de 1 pg/ml de las protelnas CAPRIN-1 preparadas en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 o una protelna de fusion (utilizada como inmunogeno) de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 y una protelna vehlculo de KLH. La solucion de 1 pg/ml de protelnas CAPRIN-1 preparadas en el ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y la protelna de fusion (30 pg/ml) de la secuencia de aminoacidos de sEq ID NO: 5 y una protelna vehlculo KLH se anadieron cada una a 100 pl/pocillo a placas de 96 pocillos y se dejaron reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavo con PBS-T. Despues, a los mismos se anadio una solucion Blockace (DS Pharma Biomedical Co., a 400 pl/pocillo y se dejo

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reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se elimino la solucion en cada pocillo y se lavo cada pocillo con PBS-T. A continuacion, se anadio el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 100 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Cada pocillo se lavo con PBS-T. Despues, se anadieron anticuerpos (H + L) IgG anti-raton marcados con HRP (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 5000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavo con PBS-T. Despues, se anadio una solucion de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejo reposar durante de 5 a 30 minutos para provocar la reaccion de color. Despues de revelarse el color, se termino la reaccion mediante la adicion de acido sulfurico 1N a 100 pl/pocillo. Se midio la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrometro de absorcion. Como resultado, se seleccionaron los hibridomas que produclan anticuerpos que tenlan una alta absorbancia.

Se anadieron los hibridomas seleccionados a una placa de 96 pocillos a 0,3 celulas/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana despues, se observaron los hibridomas que forman colonias unicas en los pocillos. Las celulas de estos pocillos se cultivaron adicionalmente y los hibridomas clonados se sometieron a deteccion selectiva de mismo modo que anteriormente para determinar la afinidad de union de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 como una secuencia de CAPRIN-1 parcial como un indicador para obtener hibridomas que producen anticuerpos contra el aminoacido de SEQ ID NO: 5.

Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas obtenidos se exploraron para detectar los anticuerpos reactivos con la superficie de las celulas de cancer de mama que expresan CAPRIN-1. Especlficamente, se centrifugaron 106 celulas de una llnea celular de cancer de mama humana MDA-MB231 V en un tubo para microcentrifugacion de 1,5 ml. Se anadieron 100 pl del sobrenadante de cultivo del hibridoma obtenido anteriormente y se dejo reposar durante 1 hora sobre hielo. Despues de lavado con PBS, se anadieron a los mismos anticuerpos de cabra anti-IgG de raton marcados con FITC (fabricados por Invitrogen Corp.) diluidos 500 veces con PBS que contenla FBS al 0,1 % y se dejo reposar durante 1 hora sobre hielo. Despues de lavado con PBS, se midio la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otra parte, se efectuo la misma operacion que antes para preparar una muestra usando el suero de cada raton Balb/c de 6 semanas de edad diluido 500 veces con un medio para cultivo de hibridoma o preparar una muestra de control negativo mediante la reaccion unicamente con anticuerpos secundarios, en lugar de los anticuerpos. Como resultado, se obtuvieron 2 anticuerpos monoclonales (n.° 2 y n.° 3) que tenlan una intensidad de fluorescencia mayor que la del control negativo, es decir, reactivo con la superficie de las celulas de cancer de mama .

Los anticuerpos monoclonales de raton 2 y 3 obtenidos se examinaron en cuanto a su reaccion especlfica con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 como una secuencia parcial de CAPRIN-1 utilizada como inmunogeno. Una solucion de 30 pg/ml de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 preparada con una solucion acuosa de carbonato de sodio 0,1 M y una secuencia parcial de CAPRIN-1 libre de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 se anadieron a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino para ELISA (Nunc) a 100 pg/ml y se hizo reaccionar durante un dla entero y noche a 4 °C para unir los peptidos a los pocillos. Se anadio una solucion acuosa de carbonato de sodio 0,1 M que contenla etanolamina 10 mM a los pocillos unidos a peptido y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se elimino la solucion en cada pocillo y se lavo cada pocillo con PBS-T. A continuacion, se anadio una solucion Blockace a 400 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se elimino la solucion en cada pocillo y se lavo cada pocillo con PBS-T. A continuacion, se anadio el sobrenadante de cultivo que contenla el anticuerpo monoclonal n.° 2 de raton a los mismos a 50 pl/pocillo y se hizo reaccionar temperatura ambiente durante 1 hora. Despues, cada pocillo se lavo con PBS.T y anticuerpos IgG anti- raton marcados con HRP (H+L) (fabricados por Invitrogen ) diluidos 5000 veces con Soluciones a 50 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavo completamente con PBS-T. Despues, se anadio una solucion de sustrato de TMB (fabricada por Thermo Fisher Scientific Inc.) a 100 pl/pocillo y se dejo reposar durante de 5 a 30 minutos para provocar la reaccion de color. Despues de revelarse el color, se termino la reaccion mediante la adicion de acido sulfurico 1N a 100 pl/pocillo. Se midio la absorbancia a 450 nm y 595 nm usando un espectrometro de absorcion. Como resultado, los anticuerpos monoclonales n. 2 y n.° 3 no reaccionaron con la secuencia parcial de CAPRIN-1 libre de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5, sino que reacciono especlficamente solo con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5. Los resultados demostraron que el polipeptido de la SEQ ID NO: 5 contiene una region de epltopo para los anticuerpos anti-CAPRIN-1 n.° 2 y n.° 3.

Ejemplo 3 Preparacion de anticuerpo monoclonal de pollo contra CAPRIN-1

Se prepararon anticuerpos monoclonales derivados de pollo utilizando como inmunogeno una protelna de fusion de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 identificada en el Ejemplo 2 (2) y una protelna vehlculo KLH (hemocianina de lapa californiana). Se mezclaron 300 pg del inmunogeno con una cantidad igual de un adyuvante completo de Freund. Esta mezcla se uso como una solucion de antlgeno por pollo. La solucion de antlgeno se administro por via intraperitoneal a cada pollo de 7 semanas de edad. Despues, se realizaron 7 administraciones cada 4 semana para completar la inmunizacion. Cuatro dlas despues de la inmunizacion final, el bazo de cada pollo se escindio y se molio entre dos portaobjetos de vidrio esterilizados. Los procedimientos de lavado con PBS (-) (fabricados por Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y centrifugacion a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante se repitieron tres veces para obtener esplenocitos. Los esplenocitos obtenidas se mezclaron con celulas de mieloma de pollo deficientes en cadena ligera establecidas a partir de pollos mediante transformacion

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utilizando virus de la reticuloendoteliosis aviar, en una proporcion de 5:1. Se anadio a la mezcla celular una solucion de PEG preparada mezclando 200 pl de un medio IMDM que contenla FBS al 10 %, que se calento a 37 °C, con 800 pl de PEG1500 (fabricado por Boehringer Ingelheim GmbH) y luego se dejo reposar durante 5 minutos para la fusion celular. Despues de la eliminacion del sobrenadante mediante centrifugacion a 1700 rpm durante 5 minutos, las celulas se suspendieron en 300 ml de un medio IMDM que contenla 10% de FBS suplementado con 2 % de equivalente de una solucion HAT (Gibco) (medio selectivo HAT). Esta suspension se sembro en treinta placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 pl/pocillo. Los esplenocitos y las celulas de mieloma de pollo se fusionaron mediante cultivo durante 7 dlas a 37 °C, CO2 al 5 % para obtener hibridomas. Despues, se analizaron los anticuerpos, para determinar, como indicador, la reactividad del anticuerpo contenido en los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas producidos con una solucion de protelnas CApRIN-1 preparadas como se describe en el Ejemplo 3 del documento WO2010/016526 o una protelna de fusion (utilizada como inmunogeno) de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 y una protelna vehlculo de BSA. Especlficamente, La solucion de 1 pg/ml de protelnas CAPRIN- 1 preparada en el ejemplo 3 del documento WO2010/016526 y la protelna de fusion (1 pg/ml) de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 y la protelna vehlculo BSA se anadieron cada una a 50 pl/pocillo a placas de 96 pocillos y se dejaron reposar a 4 °C durante 18 horas. Cada pocillo se lavo con PBS-T. Despues, a los mismos se anadio una solucion Blockace (DS Pharma Biomedical Co., a 300 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. Se elimino la solucion en cada pocillo y se lavo cada pocillo con PBS-T. A continuacion, se anadio el sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente a los mismos a 50 pl/pocillo y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavo con PBS-T. Despues, se anadieron a los mismos anticuerpos IgY anti-pollo marcados con HRP (fabricados por KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, diluidos 1000 veces con PBS a 100 pl/pocillo y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Cada pocillo se lavo tres veces con PBS-T. Despues, se anadio a la misma una solucion de sustrato de OPD de 50 pl/pocillo y se dejo reposar durante de 5 a 15 minutos para provocar la reaccion de color. Despues de revelarse el color, se termino la reaccion mediante la adicion de acido sulfurico 2N a 50 pl/pocillo. Se midio la absorbancia a 490 nm y 630 nm usando un espectrometro de absorcion. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas que produclan anticuerpos que tenlan una alta absorbancia.

Se anadieron los hibridomas seleccionados a una placa de 96 pocillos a 0,5 celulas/pocillo y se cultivaron en la placa. Una semana despues, se observaron los hibridomas que forman colonias unicas en los pocillos. Las celulas en estos pocillos se cultivaron adicionalmente y se realizo deteccion selectiva de los hibridomas clonados para, como indicador, determinar la afinidad de union de los anticuerpos producidos por los hibridomas frente a las protelnas CAPRIN-1 o la reactividad de los anticuerpos contra la protelna de fusion (usada como inmunogeno) de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 5 y la protelna vehlculo de BSA, para obtener anticuerpos monoclonales de pollo.

A continuacion, se exploraron estos anticuerpos monoclonales respecto a los anticuerpos reactivos con la superficie de las celulas de cancer de mama que expresan CAPRIN-1. Especlficamente, se centrifugaron 2 x 105 celulas de una llnea celular de cancer de mama humana MDA-MB-231 V en un tubo para microcentrifugacion de 1,5 ml. Se anadieron 50 pl del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma obtenido anteriormente y se dejo reposar durante 1 hora sobre hielo. Despues de lavado con PBS, se anadieron a los mismos anticuerpos IgG (H+L) de cabra anti-pollo marcados con FITC (fabricados por Southern Biotech) diluidos 100 veces con PBS que contenla FBS al 0,5 % y se dejo reposar durante 1 hora sobre hielo. Despues de lavado con PBS, se midio la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otra parte, se realizo la misma operacion que la anterior utilizando un medio para cultivo de hibridomas para preparar una muestra de control negativo. Como resultado, se seleccionaron 4 anticuerpos monoclonales de pollo (anticuerpos monoclonales de pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4) que tenlan una intensidad de fluorescencia mas intensa que la del control, es decir, reactivos con la superficie de celulas de cancer de mama que expresan CAPRIN-1. Estos anticuerpos pueden unirse a CAPRIN-1 expresada en la superficie de las celulas de cancer de mama.

Ejemplo 4. Caracterizacion del anticuerpo monoclonal seleccionado

(1) Caracterizacion del anticuerpo monoclonal de raton

Los fragmentos de amplificacion de genes que codifican las regiones variables de los anticuerpos monoclonales de raton obtenidos en el Ejemplo 2 se obtuvieron segun un metodo descrito en el Ejemplo 5 del documento WO2010/016526 y se analizaron para sus secuencias de genes y secuencias de aminoacidos codificadas por el mismo. La secuencia genica resultante que codifica la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 1 derivado de raton se muestra en la SEQ ID NO: 24 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la EQ ID NO: 19; y la secuencia genica que codifica la region variable de la cadena ligera del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 23. La secuencia genica resultante que codifica la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 2 derivado de raton se muestra en la SEQ ID NO: 14 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 9; y la secuencia genica que codifica la region variable de la cadena ligera del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 13. La secuencia genica resultante que codifica la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 3 derivado de raton se muestra en la SEQ ID NO: 14 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 9; y la secuencia genica que codifica la region variable de la cadena ligera del mismo

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se muestra en la SEQ ID NO: 54 y la secuencia de aminoacidos se muestra en la SEQ ID NO: 53.

En otras palabras, se descubrio que el anticuerpo monoclonal de raton n.° 1 comprendla la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y la region variable de cadena ligera de SEQ iD NO: 23, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 20, 21 y 22, respectivamente. Se descubrio que el anticuerpo monoclonal de raton n.° 2 comprendia la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente. Se descubrio que el anticuerpo monoclonal de raton n.° 3 comprendia la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 50, 51 y 52, respectivamente.

(2) Caracterizacion del anticuerpo monoclonal de pollo

Se obtuvieron fragmentos de amplificacion de genes que codifican las regiones variables de los anticuerpos monoclonales de pollo (anticuerpos monoclonales de pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4) obtenidos en el Ejemplo 3 se obtuvieron segun un metodo descrito en el Ejemplo 4 del documento WO2011/096519 y se analizaron para sus secuencias de genes y secuencias de aminoacidos codificadas por el mismo. La secuencia de aminoacidos resultante de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 1 derivado de pollo se muestra en la SEQ ID NO: 58 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 62. La secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 2 derivado de pollo se muestra en la SEQ ID NO: 63 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 65. La secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 3 derivado de pollo se muestra en la SEQ ID NO: 69 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 73. La secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal n.° 4 derivado de pollo se muestra en la SEQ ID NO: 77 y la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 81.

En otras palabras, se descubrio que el anticuerpo monoclonal n.° 1 de pollo comprendia la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 62, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente. Se descubrio que el anticuerpo monoclonal n.° 2 de pollo comprendia la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 65, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 59, 64 y 61, respectivamente. Se descubrio que el anticuerpo monoclonal n.° 3 de pollo comprendia la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 69 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 73, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 66, 67 y 68, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72, respectivamente. Se descubrio que el anticuerpo monoclonal n.° 4 de pollo comprendia la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 77 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81, en la que la region variable de la cadena pesada tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 74, 75 y 76, respectivamente, la region variable de la cadena ligera tenia CDR1, CDR2 y CDR3 consistente en las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NO: 78, 79 y 80, respectivamente.

Ejemplo 5 Preparacion de anticuerpos policlonales contra el polipeptido parcial de CAPRIN-1 presente en la superficie de la celula cancerosa

Con el fin de obtener anticuerpos policlonales contra polipeptidos parciales de CAPRIN-1 presentes en la superficie de las celulas cancerosas, se sintetizaron un polipeptido (peptido derivado de CAPRIN-1 mostrado en SEQ ID NO: 5) que comprende las regiones de epitopo para los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 n.° 1, n.° 2 y n.° 3, un polipeptido que tiene una region de los restos de aminoacidos 50 a 98 en la secuencia de aminoacidos de CAPRIN-1 humana de SEQ ID NO: 2, y un polipeptido que tiene una region de restos de aminoacidos 233 a 305 de SEQ ID NO: 2. Cada 1 mg de estos peptidos se mezclaron como un antigeno con un volumen igual de una solucion de adyuvante de Freund incompleto (IFA). Esta mezcla se administro por via subcutanea al conejo cuatro veces cada dos semanas. Despues, se recogio sangre de la misma para obtener un antisuero que contiene los anticuerpos policlonales contra cada antigeno. El antisuero se purifico adicionalmente usando un vehiculo proteina G (fabricado

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Ejemplo 6 Analisis de la expresion de CAPRIN-1 en las celulas cancerosas

A continuation, Se examinaron 8 llneas celulares de cancer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V y MRK-nu-1) que se habla observado que tenlan un nivel de CAPRIN-1 alto para determinar su expresion de protelnas CAPRIN-1 en la superficie de las celulas. Se centrifugaron 5 x 105 celulas de las llneas celulares de cancer de mama humano que se habla observado anteriormente que tenlan la expresion genica en un tubo para microcentrifugacion de 1,5 ml. Despues de anadir 2 pg (5 pl) de los anticuerpos policlonales contra peptidos derivados de CAPRIN-1 preparados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5, as celulas se mezclaron adicionalmente con 95 pl de PBS que contenla suero bovino fetal al 0,1 % y se dejaron en reposo 1 hora en hielo. Despues de lavar con PBS, la solution resultante se mezclo con 2 pl de anticuerpos IgG de cabra anti- conejo marcados con Alexa 488 (fabricados por Invitrogen Corp.) y 98 pl de PBS que contenla suero bovino fetal (FBS) al 0,1 % y se dejo en reposo durante 30 horas en hielo. Despues de lavar con PBS, se midio la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Por otra parte, se realizo la misma operation que anteriormente utilizando los anticuerpos de control preparados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 5 en lugar de los anticuerpos policlonales contra los peptidos derivados de CAPRIN-1 para preparar un control. Como resultado, las celulas cancerosas tratadas con los anticuerpos anti-CAPRIN-1 mostraron todas una intensidad de fluorescencia al menos 35 % mas fuerte que la del control. Esto demostro que las protelnas CAPRIN-1 se expresan en la superficie de la membrana celular de las llneas celulares de cancer humano. Las velocidades de mejora en la intensidad de fluorescencia se expresan como las velocidades de aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) en las llneas celulares respectivas, que se calculan de acuerdo con la siguiente formula.

Velocidad de incremento de la intensidad de fluorescencia media (velocidad de mejora de la intensidad de fluorescencia) (%) = ((MFI de las celulas reaccionadas con los anticuerpos anti-CAPRIN-1) - (MFI Control))/(MFI Control) x 100

Ademas, tambien se midio la intensidad de fluorescencia en 3 llneas celulares de cancer de rinon (Caki-1, Caki-2 y A498), una llnea celular de cancer de vejiga urinaria (T24), una llnea celular de cancer de ovario (SKOV3), una llnea celular de cancer de pulmon (QG56), una llnea celular de cancer de prostata (PC3), una llnea celular de cancer de cuello uterino (HeLa), una llnea celular de fibrosarcoma (HT1080), 2 llneas celulares de tumores cerebrales (T98G y U87MG), una llnea celular de cancer gastrico (MNK28), una llnea celular de cancer de colorrectal (Lovo) y llneas celulares de cancer pancreatico (Capan- 2, MIAPaCa-2, Panc-1 y BxPC-3) usando el mismo procedimiento que el anterior. Como resultado, todas las celulas de cancer tenlan una intensidad de fluorescencia de, al menos, un 35 % mas fuerte que la del control.

Como con los resultados obtenidos anteriormente, tambien se confirmo la expresion de CAPRIN-1 utilizando el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal de raton N.° 1) que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 23, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal de raton N.° 2) que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 13 y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 (anticuerpo monoclonal de raton N.° 3) que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53, que se obtuvieron en el ejemplo 2 y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de pollo n.° 1 que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 58 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 62, el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de pollo N.° 2 que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 63 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 65, el anticuerpo monoclonal anti- CAPRIN-1 de pollo N.° 3 que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 69 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 73 y el anticuerpo monoclonal anti-CAPRIN-1 de pollo N.° 4 que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 77 y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81 (anticuerpos monoclonales de pollo n.°1 a n.°4), que se obtuvieron en el ejemplo 3.

Ejemplo 7 Tincion inmunohistoqulmica

(1) Expresion de CAPRIN-1 en tejidos normales de raton y caninos

Se exsanguinaron ratones (Balb/c, hembras) y perros (perros beagle, hembras) con anestesia con eter y con anestesia con ketamina/isofluorano y se sometieron a section abdominal. Despues, cada organo (Estomago, hlgado, globo ocular, timo, musculo, medula osea, utero, intestino delgado, esofago, corazon, rinon, glandula salivar, intestino grueso, glandula mamaria, cerebro, pulmones, piel, glandula suprarrenal, ovarios, pancreas, bazo y vejiga urinaria) se transfirio a una placa de 10 cm que contenla PBS. Cada organo se corto y abrio en PBS y luego se sometio a fijacion por perfusion durante una noche con una solucion 0,1 M de tampon fosfato (pH 7,4) que contenla un 4 % de paraformaldehldo (PFA). Se desecho el perfundido y la superficie tisular de cada organo se aclaro con PBS. Cada tejido se introdujo en una solucion de PBS que contenla 10 % de sacarosa en un tubo de centrifugation

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de 50 ml y se agito a 4 °C durante 2 horas utilizando un rotor. La solucion se sustituyo con una solucion de PBS que contenla un 20 % de sacarosa y la solucion resultante se dejo en reposo a 4 °C hasta que el tejido precipito. Despues, la solucion se sustituyo con una solucion de PBS que contenla un 30% de sacarosa y la solucion resultante se dejo en reposo a 4 °C hasta que el tejido precipito. Cada tejido se retiro y las porciones necesarias se escindieron con un escalpelo. A continuacion, se aplico un compuesto OCT (Tissue Teck) y se esparcio por toda la superficie. Despues, del tejido se monto en Cryomold. El Cryomold se coloco en hielo seco para la congelacion rapida congelacion del tejido y, despues, el tejido se corto en secciones de 10 a 20 pm de grosor utilizando un criostato (fabricado por Leica Biosystems) y, despues, se secaron al aire, junto con el portaobjetos de vidrio, durante 30 minutos con un secador de pelo, para preparar un portaobjetos de vidrio con una lamina de tejido colocada sobre el mismo. A continuacion, el portaobjetos de vidrio se coloco en una botella de tincion llena con PBS-T (solucion salina que contenla 0,05 % de Tween 20) y los procedimientos de sustitucion de PBS-T por uno recien preparado cada 5 minutos se llevaron a cabo tres veces. El agua en exceso alrededor de cada seccion se retiro con una toallita Kimwipe. La seccion sobre el portaobjetos de vidrio se rodeo con un bollgrafo Dako (fabricado por Dako Japan Inc.). Despues, se aplicaron al reactivo de bloqueo de Ig de raton MOM (Vectastain) para los tejidos de raton y una solucion de PBS-T que contenla FBS al 10 % para los tejidos caninos como soluciones de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una camara humeda.

A continuacion, se preparo un anticuerpo policlonal reactivo a la superficie de celulas de cancer contra el peptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) preparado en el Ejemplo 5 en una solucion de 10 pg/ml con una solucion de bloqueo y se aplico esta solucion. El portaobjetos de vidrio se dejo reposar durante una noche a 4 °C en una camara humeda. Despues de lavar tres veces con PBS-T durante 10 minutos, se aplicaron anticuerpos anti-IgG marcados con biotina MOM (Vectastain) diluidos 250 veces con una solucion de bloqueo y el portaobjetos de vidrio se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una camara de humedad. Despues de lavar tres veces con PBS- T durante 10 minutos, se aplico el reactivo avidina-biotina ABC (Vectastain) y el portaobjetos de vidrio se dejo reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos en una camara de humedad. Despues de lavar tres veces con pBs-T durante 10 minutos, se aplico una solucion de tincion de DAB (10 mg of DAB + 10 pl de 30% de H2O2/50 ml de tris-HCl 0,05 M (pH 7.6)) y el portaobjetos de vidrio se dejo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos en una camara de humedad. Despues de enjuagar con agua destilada, se le aplico un reactivo de hematoxilina (fabricado por Dako Japan Inc.), y el portaobjetos e vidrio se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y despues se aclaro con agua destilada. El portaobjetos e vidrio se coloco en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en este orden durante 1 minuto por solucion y, despues, se dejo reposar durante la noche en xileno. El portaobjetos de vidrio se extrajo y se monto en medio de montaje Glycergel (fabricado por Dako Japan Inc.), seguido de observacion. Como resultado, la expresion intracelular de CAPRIN-1 se observo ligeramente en los respectivos tejidos de la glandula salival, rinon, colon y estomago. Su expresion, sin embargo, no se observo en la superficie celular de estos tejidos. Ademas, no se observo expresion en los tejidos derivados de los otros organos.

(2) Expresion de CAPRIN-1 en tejido de cancer de mama canino

Se usaron tejidos de cancer de mama congelados de perros diagnosticados patologicamente como cancer de mama maligno en la preparation de portaobjetos de seccion congelada y tincion inmunohistoqulmica usando los anticuerpos policlonales contra el peptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) preparado de acuerdo con el ejemplo 5, De la misma manera que anteriormente. Como resultado, la expresion de CAPRIN-1 se observo en tejidos de cancer de mama canino.

(3) Expresion de CAPRIN-1 en varios tejidos de cancer humano

En la tincion inmunohistoqulmica se usaron muestras de diversos tejidos de cancer de cancer humano embebidas en parafina (fabricadas por US Biomax, Inc.) utilizando los anticuerpos policlonales (preparados en el Ejemplo 5) contra el peptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) de la misma manera que anteriormente. Como resultado, la expresion de CAPRIN-1 se observo en cancer de esofago, cancer de colon, cancer rectal, cancer de pulmon, cancer de pancreas, cancer de rinon, cancer de vejiga urinaria y cancer de cuello uterino.

Ejemplo 8 Preparacion de anticuerpo monoclonal quimerico humano-de raton

El fragmento de amplification genica preparado en el Ejemplo 4 que comprende la secuencia (SEQ ID NO: 14) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de raton n.° 2 se trato en ambos extremos con una enzima de restriction, despues se purifico y se inserto de acuerdo con un convencional en un vector pcDNA4/myc- His (fabricado por Invitrogen Corp.) que ya tenia insertos genicos de una secuencia lider derivada de anticuerpo de raton y una region constante de la cadena H de IgG1 humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 48. Ademas, el fragmento de amplificacion genica que comprende la secuencia (SEQ ID NO: 15) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de raton n.° 2 se trato en ambos extremos con una enzima de restriccion, despues se purifico y se inserto de acuerdo con un convencional en un vector pcDNA3.1/myc- His (fabricado por Invitrogen Corp.) que ya tenia insertos genicos de una secuencia lider derivada de anticuerpo de raton y una region constante de la cadena L de IgG1 humana que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 49.

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A continuacion, el vector recombinante que tiene el inserto de la secuencia de nucleotidos que codifica la region variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 14) del anticuerpo monoclonal de raton n. 2 y el vector recombinante que tiene el inserto de la secuencia de nucleotidos que codifica la region variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 15) del anticuerpo monoclonal de raton n.°2 se introdujeron en celulas CHO-K1 (obtenidas en Riken Cell Bank). Especlficamente, se cultivaron 2 x 105 celulas CHO-K1 en un medio F12 de Ham (fabricado por Invitrogen Corp.) que contenla 1 ml de FBS al10 %por pocillo en una placa de cultivo de 12 pocillos y se lavaron con PBS(-). Despues, se anadio un medio F12 de Ham fresco que contenla 1 ml de FBS al 10 % por pocillo. Se mezclaron 250 ng de cada uno de los vectores en 30 pl de OptiMEM (fabricado por Invitrogen Corp.) con 30 pl de reactivo de transfeccion Polyfect (fabricado por Qiagen N.V.) y esta mezcla se anadio a cada pocillo. Las celulas CHO-K1 cotransfectadas con los vectores recombinantes se cultivaron en un medio F12 de Ham que contenla FBS al 10 % suplementado con 200 pg/ml de Zeocin (fabricado por Invitrogen Corp.) y 200 pg/ml de geneticina (fabricado por Roche Diagnostics KK) y, despues, se sembraron en una placa de 96 pocillos a 0,5 celulas/pocillo para preparar una llnea celular que produce de forma estable un anticuerpo monoclonal n.° 1 (n.° 1) quimerico humano-de raton que tiene las regiones variables del anticuerpo monoclonal n.° 1 de raton. Tambien se prepararon llneas celulares que produclan de manera estable un anticuerpo monoclonal quimerico de raton-humano n.° 2 (n.° 2) o un anticuerpo monoclonal quimerico humano n°. 3 (n.° 3) de la misma manera que anteriormente para los anticuerpos monoclonales de raton n.° 2 y n.° 3.

Cada llnea celular preparada se cultivo durante 5 dlas en un matraz de 150-cm2 a una densidad de 5 x 105 celulas/ml en 30 ml de un medio OptiCHO sin suero (fabricado por Invitrogen Corp.) para obtener sobrenadantes de cultivo que contenlan n.° 1, n.° 2 o n.° 3.

Ademas, se prepararon llneas celulares que produclan de forma estable anticuerpos comparativos quimericos de humano - raton 1 a 11 de la misma manera que anteriormente, respectivamente, sobre la base de los siguientes anticuerpos monoclonales derivados de raton anti-CAPRIN-1 descritos en el documento WO2010/016526 como anticuerpos comparativos: un anticuerpo comparativo 1 que tiene la region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 27; un anticuerpo comparativo 2 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 29; un anticuerpo comparativo 3 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 30 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31; un anticuerpo comparativo 4 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 32 y la region variable de la cadena ligera de sEq ID NO: 33; un anticuerpo comparativo 5 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 35; un anticuerpo comparativo 6 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 36 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 37; un anticuerpo comparativo 7 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 39; un anticuerpo comparativo 8 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 40 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 41; un anticuerpo comparativo 9 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 42 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 43; un anticuerpo comparativo 10 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 44 y la region variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 45; y un anticuerpo comparativo 11 que tiene una region variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 46 y la region variable de2 la cadena ligera de SEQ ID NO: 47. Cada ^ea celular preparada se cultivo durante 5 dias en un matraz de 150 cm a una densidad de 5 x 10 celulas/ml en 30 ml de un medio OptiCHO sin suero (fabricado por Invitrogen Corp.) para obtener sobrenadantes de cultivo que contenlan los respectivos anticuerpos monoclonales, comparativos quimericos de humano-raton 1 a 11.

Ejemplo 9 Preparacion de anticuerpo monoclonal quimerico humano-de pollo

Sobre la base del anticuerpo monoclonal de pollo n.° 1 obtenido en el Ejemplo 3, se preparo una llnea celular que producla de forma estable un anticuerpo quimerico humano-de pollo n.° 1 que tenia las regiones variables del anticuerpo monoclonal de pollo n.° 1 de acuerdo con el metodo descrito en el Ejemplo 4 (2) del documento WO2011/096519 sobre la base de. La linea celular preparada se cultivo durante 5 dias en un matraz de 150-cm2 a una densidad de 5 x 105 celulas/ml en 30 ml de un medio OptiCHO sin suero (fabricado por Invitrogen Corp.) para obtener un sobrenadante de cultivo que contenia el anticuerpo quimerico de humano-pollo n.° 1.

Ademas, sobre la base de los anticuerpos monoclonales de pollo n.° 2, n.° 3 y n.° 4, tambien se prepararon lineas celulares que producian de forma estable un anticuerpo quimerico de humano-pollo n.° 2, n.° 3 o n.° 4 usando la misma estrategia que anteriormente. Cada linea celular preparada se uso para obtener sobrenadantes de cultivo que contenian el anticuerpo quimerico de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 o n.° 4.

Ejemplo 10 Analisis de la expresion de CAPRIN-1 en la superficie de varias celulas cancerosas usando anticuerpos monoclonales de raton N.° 1, n.° 2 y n.° 3 y anticuerpos monoclonales de pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4.

A continuacion, las lineas celulares de cancer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB- 231V y MRK-nu-1), las lineas celulares de cancer de rinon (Caki-1, Caki-2, A498 y ACHN), la linea celular de cancer de vejiga urinaria (T24), la linea celular de cancer de ovario (SKOV3), las lineas celulares de cancer de pulmon (QG56 y A549), las llneas celulares cancer de pancreas (Capan-2 y MIAPaCa-2), la llnea celular

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de cancer de prostata (PC3), la ilnea celular de cancer de cuello uterino (SW756), la llnea celular de fibrosarcoma (HT1080), las llneas celulares de tumores cerebrales )T98G, U87MG, U251, SNB19 y U373), las llneas celulares de cancer gastrico (MNK28 y MNK45), las llneas celulares de cancer colorrectal (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 y HCT116), la llnea celular de leucemia (AML5) y la llnea celular de linfoma (Ramos), que se habla observado que tenlan expresion del gen de CAPRIN-1, se examinaron con respecto a su expresion de protelnas CAPRIN-1 en la superficie de las celulas usando los sobrenadantes del cultivo que contenlan, respectivamente, los anticuerpos monoclonales n.° 1, n.° 2 y n.° 3 obtenidos en el ejemplo 2 y los anticuerpos monoclonales de pollo n.°1, n.° 2, n.°3 y n.° 4 obtenidos en el ejemplo 3. Se centrifugaron 106 celulas de cada llnea celular cada una en un tubo de microcentrifugacion de 1,5 ml. Cada sobrenadante de cultivo (100 pl) que contenla cualquiera de los anticuerpos n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales de pollo n.°1, n.° 2, n.°3 y n.°4 se anadio al tubo y se dejo reposar durante 1 hora sobre hielo. Despues de lavar con PBS, los anticuerpos de cabra anti-IgG de raton (H + L) marcados con FITC (fabricados por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) se diluyeron con PBS que contenla FBS al 0,1 % para los anticuerpos derivados de ratones o anticuerpos de cabra marcados con FITC,Inc.) diluidos 100 veces con FBS que contenla PBS al 0,1 % para los anticuerpos derivados de pollo y se dejaron reposar a 4 °C durante 30 minutos. Despues de lavado con PBS, se midio la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). El control negativo utilizado fue celulas que han reaccionado solo con anticuerpos secundarios. Como resultado, todas las celulas tratadas con cualquiera de los anticuerpos n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales de pollo n.°1 a n.° 4 tenlan una intensidad de fluorescencia de al menos un 35 % mas fuerte que la del control negativo. Esto demostro que las protelnas CAPRIN-1 se expresan en la superficie de la membrana celular de las llneas celulares de cancer humano. Las velocidades de mejora en la intensidad de fluorescencia se expresaron como las velocidades de aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) en las llneas celulares respectivas, que se calculan de acuerdo con la siguiente formula.

Velocidad de incremento de la intensidad de fluorescencia media (velocidad de mejora de la intensidad de fluorescencia) (%) = ((MFI de las celulas reaccionadas con los anticuerpos anti-CAPRIN-1) - (MFI Control))/(MFI Control) x 100

Ejemplo 11 Actividad antitumoral contra las celulas cancerosas del anticuerpo frente al peptido derivado de CAPRIN- 1 (SEQ ID NO: 5)

Con el fin de evaluarlos anticuerpos contra el peptido derivado de CAPRIN-1 (SEQ ID NO: 5) para determinar la resistencia de su citotoxicidad frente a las celulas cancerosas que expresan CAPRIN-1, se determino la actividad de ADCC. En esta evaluacion se utilizaron los anticuerpos policlonales (preparados en el Ejemplo 5) contra el peptido mostrado en la SEQ ID NO: 5. Se realizo una evaluacion similar usando anticuerpos policlonales contra otros peptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticuerpos policlonales contra los restos de aminoacidos 50 a 98 en la secuencia de aminoacidos de CAPRIN-1 humana y anticuerpos policlonales contra los restos de aminoacidos 233 a 305 en la secuencia de aminoacidos de la CAPRIN-1 humana, que se prepararon en el Ejemplo 5) como anticuerpos para comparacion o los anticuerpos de control derivados de suero de conejo preparados en el Ejemplo 5 como control negativo.

Se recogieron 106 celulas de la llnea celular cancer de mama humano MCF7, la llnea celular de cancer colorrectal humano HCT-116, la llnea celular de cancer pancreatico humano MIAPaCa-2, la llnea celular de cancer de rinon humano Caki-2 y de la llnea celular de cancer de pulmon QG56 que se observo que tenlan expresion de CAPRIN-1 cada una en un tubo de centrlfuga de 50 ml y, a continuacion, se anadieron al mismo 100 pCi de cromo 51, seguido de incubacion a 37 °C durante 2 horas. Despues, las celulas se lavaron tres veces con un medio RPMI1640 que contenla 10 % de suero de ternera fetal y se anadieron a 2 x 103 celulas/pocillo a una placa de fondo en V de 96 pocillos. Los anticuerpos policlonales contra el peptido derivado de CAPRIN-1 humana (SEQ ID NO: 5) y dos tipos de anticuerpos policlonales contra otros peptidos derivados de CAPRIN-1 humana (anticuerpos policlonales contra los restos de aminoacidos 50 a 98 de CAPRIN-1 humana y anticuerpos policlonales contra los restos de aminoacidos 233 a 305 de CAPRIN-1 humana se anadieron cada uno a 1 pg/pocillo. Los linfocitos separados de la sangre periferica humana de acuerdo con un metodo convencional se anadieron adicionalmente a los mismos a 4 x 105 celulas/pocillo y se cultivaron durante 4 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Despues del cultivo, se midio la cantidad de cromo (Cr) 51 liberado de las celulas cancerosas danadas en el sobrenadante de cultivo para calcular la actividad ADCC contra las celulas cancerosas debido a los anticuerpos policlonales contra los peptidos derivados de CAPRIN- 1 humana. Como resultado, todos los anticuerpos policlonales obtenidos mediante inmunizacion con los peptidos parciales de CAPRIN-1 humana que tienen la secuencia de aminoacidos de los restos de aminoacidos 50 a 98 o los restos de aminoacidos 233-305 de CAPRIN-1 humana tuvieron una actividad inferior al 10 % frente a la llnea celular de cancer de mama humano MCF7, la llnea celular de cancer colorrectal humano HCT-116, la llnea celular de cancer pancreatico humano MIAPaCa-2, la llnea celular de cancer de rinon humano Caki-2, y la a llnea celular de cancer de pulmon humano QG56. Por el contrario, los grupos de las celulas tratadas con los anticuerpos policlonales contra el peptido derivado de CAPRIN-1 humana (SEQ ID NO: 5) exhibieron una actividad citotoxica de 25 % o mas contra todas las llneas celulares de cancer. Los anticuerpos de control negativo tuvieron una actividad inferior al 4 % frente a todas las celulas cancerosas. Estos resultados revelaron que los anticuerpos contra CAPRIN-1 mostrados en la SEQ ID NO: 5 ejercen una fuerte actividad citotoxica contra las celulas cancerosas que expresan CAPRIN-1.

Estos resultados se obtuvieron mediante la determinacion de la actividad citotoxica mediante, como se ha descrito

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antes, la mezcla del anticuerpo de CAPRIN-1 usado en la presente invencion, los linfocitos y 2 x 103 Celulas de cada llnea celular de cancer con cromo 51 incorporado, cultivo de las celulas durante 4 horas; despues del cultivo, medir la cantidad de cromo 51 liberada en el medio; y calcular la actividad citotoxica contra cada llnea celular de cancer de acuerdo con la siguiente formula*.

*Expresion: Actividad citotoxica (%) = [Cantidad de cromo 51 liberado por las celulas diana tratadas con el anticuerpo contra la CAPRIN-1 y linfocitosj/Cantidad de cromo 51 liberado por las celulas diana tratadas con acido clorhldrico 1 Nj x 100

Se evaluaron los anticuerpos monoclonales quimericos humanos n.° 1, n.° 2 y n.° 3 obtenidos en el ejemplo 8 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.°1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 obtenidos en el Ejemplo 9 para determinar su actividad citotoxica contra las celulas cancerosas humanas. Se purifico el sobrenadante del cultivo de cada llnea celular que producla cualquiera de los n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.°1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 usando itrap Protein A Sepharose FF (fabricado por GE Healthcare BioSciences Ltd.). Despues del reemplazo con PBS(-), se filtro la solucion a traves de un filtro de 0,22 pm (fabricado por Millipore Corp.). El anticuerpo resultante se uso para un ensayo de actividad. Se recogieron 106 celulas de la llnea celular cancer de mama humano MCF7, la llnea celular de cancer colorrectal humano HCT-116, la llnea celular de cancer pancreatico humano MIAPaCa-2, la llnea celular de cancer de rinon humano Caki-2 y de la llnea celular de cancer de pulmon QG56 que se en un tubo de centrlfuga de 50 ml y, a continuacion, se anadieron al mismo 100 pCi de cromo 51, seguido de incubacion a 37 °C durante 2 horas. Despues, las celulas se lavaron tres veces con un medio RPMI1640 que contenla 10 % de FBS y se anadieron a 2 x 103 celulas/pocillo a una placa de fondo en V de 96 pocillos para preparar las celulas diana. Se evaluaron los anticuerpos purificados (anticuerpos monoclonales, quimericos de humano-raton n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.°1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 ) y los anticuerpos monoclonales quimericos de pollo humano comparativos 1 a 11 # obtenidos en el ejemplo 8 se anadieron cada uno a los mismos a 1,3 pg/pocillo. Se separo una poblacion de celulas que contenla celulas NK humanas utilizando un metodo convencional de linfocitos de sangre periferica humana preparados de acuerdo con un metodo convencional. La poblacion celular que contiene celulas NK humanas que se uso en esta evaluation se preparo como sigue: las celulas mononucleares de sangre periferica humana separadas usando una solucion de separation por densidad Histopaque para la separation de celulas mononucleares de sangre periferica (Sigma-Aldrich Corp.) se hicieron reaccionar con anticuerpos marcados con el colorante fluorescente FITC (anticuerpo anti-CD3 humano, anticuerpo anti-CD20 humano, anticuerpo anti-CD19 humano, anticuerpo anti-CD11c humano o anticuerpo anti-HLA-DR (Becton, and Dickinson and Company)); y se separo una poblacion celular que contenla celulas NK sin tenir con los anticuerpos utilizando un clasificador de celulas (FACS Vantage SE (Becton, and Dickinson and Company)) o se separo una poblacion de celulas con un kit de separacion de celulas NK humanas (fabricado por Miltenyi Biotec KK). La poblacion celular separada que contenla celulas NK se anadio a la placa a 2 x 105 celulas/pocillo y se cultivaron durante 4 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Despues del cultivo, se midio la cantidad de cromo 51 liberada de las celulas tumorales danadas en el sobrenadante del cultivo para calcular la actividad citotoxica de cada anticuerpo anti-CAPRIN-1 contra las celulas cancerosas. El control negativo utilizado fue celulas tratadas con anticuerpos de control de isotipo. Como resultado, Los anticuerpos de control de isotipo utilizados y los anticuerpos monoclonales comparativos quimericos de humano - raton 1 a 11 tuvieron actividad citotoxica de menos de 5 % frente a MCF7, menos de 3 % frente a HCT-116, 7 % frente a MIAPaCa-2, menos de 8 % contra Caki-2 y menos de 5 % contra QG56. Por el contrario, el anticuerpo monoclonal quimerico de humano- raton n.° 1 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1 a n.° 4 tenlan actividad citotoxica de 30 % o mas frente a MCF7, 19 % o mas frente a HCT-116, 28 % o mas contra MIAPaCa-2, 34 % o mas frente a Caki-2, y 10 % o mas frente a QG56. Ademas, los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-raton n.° 2 y n.° 3 tenlan actividad citotoxica de 32 % o mas frente a MCF7, 18 % o mas frente a HCT-116, 32% o mas contra MIAPaCa-2, 18 % o mas frente a Caki-2 y 10 % o mas frente a QG56. De forma analoga, los anticuerpos de control de isotipo utilizados y los anticuerpos comparativos 1 a 11 utilizados tenlan actividad citotoxica inferior al 4 % frente a todas las otras celulas cancerosas: llneas celulares de cancer de mama ZR75-1, T47D, Hs578T, BT- 20, SK-BR-3, MDA-MB-231V y MRK-nu-1, llneas celulares de glioma T98G y U373, una llnea celular de cancer de pulmon A549, llneas celulares de cancer de rinon Caki-1 y ACHN, una llnea celular de cancer de cuello uterino SW756, una llnea celular de cancer de Vejiga urinaria T24, llneas celulares de cancer gastrico MKN28 y MKN45, una llnea celular de cancer colorrectal SW480, una llnea celular de leucemia AML5 y una llnea celular de linfoma Ramos. Por el contrario, Se observo que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-raton n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.°1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 tenlan una actividad citotoxica del 10 % o mayor contra estas llneas celulares. Estos resultados mostraron que los anticuerpos monoclonales n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.°1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 contra las celulas cancerosas que expresan CAPRIN-1 a traves de su actividad ADCC y se demostro que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-raton n.° 1, n.° 2 y n.° 3 y los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.°1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 exhiben una actividad citotoxica mas fuerte frente a las celulas cancerosas humanas contra la de los anticuerpos comparativos 1 a 11

Ademas, los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 se evaluaron de la misma manera que anteriormente para determinar su actividad citotoxica contra la llnea celular de cancer de mama humano MDA-MB-436, la llnea celular de cancer el rinon humano Caki-1, la llnea celular de cancer de pulmon humano A549, la llnea celular de cancer de pancreas humano Panc-1 y las celulas de cancer colorrectal humano

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DLD-1 que se observo que tenlan expresion del gen de CAPRIN-1. Adicionalmente, los anticuerpos quimericos de humano - pollo n.° 1 y n.° 2 contra cApRIN-1 descritos en el Ejemplo 4 del documento WO2011/096517 se usaron como anticuerpos comparativos 12 y 13, respectivamente; los anticuerpos quimericos de humano - pollo n.° 1 contra CAPRIN-1 descritos en el Ejemplo 4 del documento WO2011/096519 se usaron como anticuerpos comparativos 13; anticuerpos quimericos de humano-pollo n.° 1 y anticuerpos monoclonales de raton n.° 2, n.° 3, n.° 4, n.° 5,y n.° 6 contra CapR|N-1 descritos en el Ejemplo 4 del documento WO2011/096528 se usaron como anticuerpos comparativos 14, 15, 16, 17, 18 y 19, respectivamente; los anticuerpo monoclonales de raton n.° 1, n.° 2,y n.° 3 contra CAPRIN-1 descritos en el Ejemplo 3 del documento WO2011/096533 se usaron como anticuerpos comparativos 20, 21 y 22, respectivamente; y los anticuerpos monoclonales de raton n.° 1, n.° 2,y n.° 3 contra CAPRIN-1 descritos en el Ejemplo 3 del documento WO2011/096534 se usaron como anticuerpos comparativos 23, 24 y 25, respectivamente, para la evaluacion de la actividad citotoxica. Especlficamente, se recogieron 106 celulas de la llnea celular de cancer colorrectal humano DLD-1 en un tubo de centrlfuga de 50 ml y, a continuacion, se anadieron al mismo 100 pCi de cromo 51, seguido de incubacion a 37 °C durante 1 hora. A continuaicon, las celulas se lavaron tres veces con un medio RPMI1640 que contenla 10 % de FBS y se anadieron a 2 x 103 celulas/pocillo a una placa de fondo en V de 96 pocillos para preparar las celulas diana. A continuacion, los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1 a n.° 4 y los anticuerpos comparativos 12 a 25 se anadieron cada uno a 1 pg/pocillo. Una poblacion celular que contenla las celulas NK humanas preparada de acuerdo con un metodo convencional se anadio adicionalmente a los mismos a 105 celulas/pocillo y se cultivaron durante 4 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Despues del cultivo, se midio la cantidad de cromo 51 liberada de las celulas tumorales danadas en el sobrenadante del cultivo para calcular la actividad citotoxica de cada anticuerpo anti-CAPRIN-1 contra las celulas cancerosas. Tambien se evaluo la citotoxicidad contra MDA-MB-436, Caki-1, A549 y Panc-1 de la misma forma que se ha indicado anteriormente. Como resultado, todos los anticuerpos comparativos 12 a 25 tenlan actividad citotoxica del 5% o menor frente a MDA-MB-436, mientras que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 tenlan una actividad citotoxica del 18 % o mayor contra esta llnea celular. Todos los anticuerpos comparativos 12 a 25 tenlan actividad citotoxica del 5% o menor frente a Caki-1, mientras que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 tenlan una actividad citotoxica del 14% o mayor contra esta llnea celular. Todos los anticuerpos comparativos 12 a 25 tenlan actividad citotoxica del 5 % o menor frente a A549, mientras que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 tenlan una actividad citotoxica del 12% o mayor contra esta llnea celular. Todos los anticuerpos comparativos 12 a 25 tenlan actividad citotoxica del 5 % o menor frente a Panc-1, mientras que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 tenlan una actividad citotoxica del 18 % o mayor contra esta llnea celular. Todos los anticuerpos comparativos 12 a 25 tenlan actividad citotoxica del 7 % o menor frente a DLD-1, mientras que los anticuerpos monoclonales quimericos de humano-pollo n.° 1, n.° 2, n.° 3 y n.° 4 tenlan una actividad citotoxica del 15% o mayor contra esta llnea celular.

Estos resultados se obtuvieron mediante la determinacion de la actividad citotoxica mediante, como se ha descrito antes, mezclando el anticuerpo anti-CAPRIN-1 usado en la presente invencion, los linfocitos (poblacion celular que contiene celulas NK) y 2 x 103 celulas de cada llnea celular de cancer con cromo 51 incorporado; cultivando las celulas durante 4 horas; despues del cultivo, midiendo la cantidad de cromo 51 liberada en el medio; y calculando la actividad citotoxica contra cada llnea celular de cancer de acuerdo con la siguiente formula*.

*Expresion: Actividad citotoxica (%) = [Cantidad de cromo 51 liberado por las celulas diana tratadas con el anticuerpo contra la CAPRIN-1 y linfocitos (poblacion celular que contiene celulas NK)]/[Cantidad de cromo 51 liberado por las celulas diana tratadas con acido clorhldrico 1N] x 100

Ejemplo 12 Numero de moleculas de CAPRIN-1 en la superficie de varias celulas cancerosas reconocidas por los anticuerpos monoclonales anti-CAPRIN-1 N.° 1, n.° 2 y n.° 3.

Se examinaron las llneas celulares de cancer de mama humano (ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB- -231V y MRK-nu-1), las llneas celulares de cancer de rinon (Caki-1, Caki-2, A498 y ACHN), una llnea celular de cancer de vejiga urinaria (T24), una llnea celular de cancer de ovario (SKOV3), las llneas celulares de cancer de pulmon (QG56 y A549), las llneas celulares cancer de pancreas (MIAPaCa-2 y Capan- 2), una llnea celular de cancer de prostata (PC3), una llnea celular de cancer de cuello uterino (SW756), una llnea celular de fibrosarcoma (HT1080), las llneas celulares de tumores cerebrales (T98G, U87MG, U251, SnB19 y U373), las llneas celulares de cancer gastrico (MNK28 y MNK45), las llneas celulares de cancer colorrectal (HT29, Lovo, CaCo2, SW480 y HCT116), una llnea celular de leucemia (AML5) y una llnea celular de linfoma (Ramos) usando un kit de ensayo para el numero de moleculas "QIFIKIT" (fabricado por Dako Japan Inc.) para determinar el numero de moleculas de CAPRIN-1 en su superficie celular reconocidas por los anticuerpos monoclonales de raton n.° 1, n.° 2 y n.° 3 obtenidos en el ejemplo 2. De manera similar, el numero de moleculas de CAPRIN-1 en la superficie de estas diversas celulas cancerosas tambien se examino usando los anticuerpos monoclonales comparativos 1 a 11.

Especlficamente, de acuerdo con el protocolo adjunto al kit, cada anticuerpo (anticuerpos monoclonales de raton n.° 1, n.° 2 y n.° 3, y los anticuerpos comparativos 1 a 11) se diluyo en 5 pg/ml a una concentracion final con PBS y esta dilucion se anadio a cada linea celular y se hizo reaccionar durante 30 minutos. Despues de lavar con PBS, los anticuerpos IgG anti-raton marcados fluorescentemente unidos al kit se anadieron como anticuerpos secundarios, junto con perlas de calibracion unidas al kit, a cada llnea celular y se dejaron reposar durante 45 minutos en hielo.

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Cada ilnea celular y las perlas de calibracion se lavaron con PBS. Despues, se midio la intensidad de fluorescencia usando FACSCalibur (Becton, Dickinson y Company) para obtener un valor medio de la intensidad de fluorescencia (media) para todos los anticuerpos descritos anteriormente. El control negativo utilizado fue celulas que reaccionaron con los anticuerpos de control de isotipo y tambien se obtuvo una media. Cada valor de intensidad de fluorescencia media (media) se utilizo para calcular el numero de moleculas de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Como resultado, el numero de moleculas de CAPRIN-1 en la superficie de varias celulas cancerosas reconocidas por los anticuerpos monoclonales de raton n.° 1, n.° 2 y n.° 3 fue 105 o mas por celula para todas las llneas celulares de cancer humano examinadas. Por otra parte, el numero de moleculas reconocidas por los anticuerpos comparativos 1 a 11 fue inferior a 105 por celula.

Aplicabilidad industrial

El anticuerpo de la presente invencion es util en el tratamiento y/o prevencion del cancer.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Toray Industries, Inc.

<120> Composicion farmaceutica para el tratamiento y prevencion del cancer

<130> PH-5299-PCT

<150> JP 2011-171300 <151 >

<160>81

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <211 > 5562 <212>ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (190)..(2319)

<223>

<400> 1

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que tiene reactividad inmunologica con un polipeptido parcial de CAPRIN-1 que consiste en la secuencia de aminoacidos mostrada por la SEQ ID NO: 5.
2. 2. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo tienen actividad citotoxica contra una celula cancerosa que expresa una protelna CAPRIN-1.
3. 3. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
5. 5. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo monocatenario o un anticuerpo multiespeclfico.
6. 6. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que

   comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la

   complementariedad de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
7. 7. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que

   comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la

   complementariedad de las SEQ ID NO: 16, 17 y 18 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 20, 21 y 22 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
8. 8. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que

   comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la

   complementariedad de las SEQ ID NO: 6, 7 y 8 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 50, 51 y 52 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
9. 9. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que

   comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la

   complementariedad de las SEQ ID NO: 55, 56 y 57 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
10. 10. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 55, 56 y 57 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 59, 64 y 61 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
11. 11. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 66, 67 y 68 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 70, 71 y 72 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
12. 12. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, que comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 74, 75 y 76 y una region variable de la cadena ligera que comprende las regiones determinantes de la complementariedad de las SEQ ID NO: 78, 79 y 80 y que tienen reactividad inmunologica con la protelna CAPRIN-1.
13. 13. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo estan conjugados con un agente antitumoral.
14. 14. El anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un metodo de tratamiento y/o de prevencion del cancer.

    5

    10

    15

    20

    25
15. 15. El anticuerpo o el fragmento del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde el cancer es cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
16. 16. Una composition farmaceutica que, como principio activo, comprende el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
17. 17. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 16 para su uso en un metodo de tratamiento y/o de prevencion del cancer.
18. 18. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 17, en donde el cancer es cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
19. 19. Una combination farmaceutica que comprende una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 16 y una composicion farmaceutica que comprende un agente antitumoral.
20. 20. La combinacion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 19 para su uso en un metodo de tratamiento y/o de prevencion del cancer.
21. 21. La combinacion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 20, en donde el cancer es cancer de mama, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de pulmon, tumor cerebral, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de vejiga urinaria, cancer de esofago, leucemia, linfoma, fibrosarcoma, mastocitoma o melanoma.
22. 22. Un ADN que codifica el anticuerpo o el fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.