ES2583627T3

ES2583627T3 - Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención del cáncer

Info

Publication number: ES2583627T3
Application number: ES11739876.8T
Authority: ES
Inventors: Fumiyoshi Okano; Takanori Saito; Shinichi Kobayashi; Takayoshi Ido; Yoshinori Narita
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2010-02-04
Filing date: 2011-02-04
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2031-02-04
Also published as: EP2532365B1; BR112012018947A8; JP5742714B2; KR101842893B1; JPWO2011096528A1; CN102821788B; PT2532365T; RU2607366C2; EP2532365A4; DK2532365T3; BR112012018947B8; CN102821788A; PL2532365T3; WO2011096528A1; MX340014B; HUE030103T2; RU2012137498A; KR20120123500A; EP2532365A1; BR112012018947B1

Abstract

Un anticuerpo dirigido contra CAPRIN-1, o un fragmento del mismo, que presenta actividad antitumoral, en donde el anticuerpo o el fragmento se unen a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por las SEQ ID NO: 69 o 70 contenidas en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 37 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 69 o 70.

Description

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Tras la preparación de un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, los aminoácidos en una región variable (por ejemplo, FR) o una región constante, pueden estar sustituidos con otros aminoácidos.

5 La sustitución de aminoácidos es una sustitución de, por ejemplo, menos de 15, menos de 10, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos aminoácidos y es preferentemente una sustitución de 1 a 5 aminoácidos, y más preferentemente 1 o 2 aminoácidos. Un anticuerpo sustituido debe ser funcionalmente equivalente a un anticuerpo no sustituido. La sustitución es deseablemente una sustitución de un(os) aminoácido(s) conservativo(s) entre los aminoácidos que tienen propiedades análogas tales como carga eléctrica, cadena secundaria, polaridad, y aromaticidad. Los aminoácidos que tienen propiedades análogas se pueden clasificar por ejemplo en aminoácidos básicos (arginina, lisina, e histidina), aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico), aminoácidos polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, cisteína, y tirosina), aminoácidos no polares (leucina, isoleucina, alanina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina), aminoácidos de cadena ramificada (treonina, valina e isoleucina), y aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina,

15 triptófano, e histidina).

Los ejemplos de un producto de anticuerpo modificado incluyen anticuerpos unidos a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG). Las sustancias que se van a unir en el producto de anticuerpos modificado de la presente invención no están limitadas. Dicho producto de anticuerpo modificado puede obtenerse sometiendo el anticuerpo obtenido de esta manera a modificación química. Se han establecido ya, por tanto, métodos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término "funcionalmente equivalente" se refiere al de un anticuerpo sujeto que tiene una actividad biológica o bioquímica similar a la del anticuerpo de la presente invención, y se refiere específicamente a la de un anticuerpo sujeto que tiene la función de afectar negativamente al tumor sin producir, por

25 ejemplo, esencialmente rechazo tras su aplicación a un ser humano. Un ejemplo de dicha actividad incluye una actividad de suprimir la proliferación celular o una actividad de unión.

Como método bien conocido por las personas expertas para la preparación de un polipéptido funcionalmente equivalente a un polipéptido, se conoce un método para introducir una mutación en un polipéptido. Por ejemplo, las personas expertas en la materia pueden preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo de la presente invención introduciendo adecuadamente una mutación en el anticuerpo usando mutagénesis dirigida al sitio (HashimotoGotoh, T. et al., (1995) Gene 152, 271275; Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468500; Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12, 94419456; Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol. 154, 350367; Kunkel, TA., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 488492; Kunkel (1988) Methods

35 Enzymol. 85, 27632766), por ejemplo.

Se puede obtener un anticuerpo que reconoce un epítopo de una proteína CAPRIN1 reconocida por el anterior anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 mediante un método conocido por personas expertas en la materia. Por ejemplo, se puede obtener dicho anticuerpo mediante un método que implica determinar un epítopo de una proteína CAPRIN1 reconocido por un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1, mediante un método general (por ejemplo, un cartografiado de epítopos) y a continuación preparar un anticuerpo utilizando un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos contenida en el epítopo como un inmunógeno, o un método que implica determinar un epítopo de dicho anticuerpo preparado mediante un método general, y a continuación seleccionar un anticuerpo que tiene el epítope idéntico con el de un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1. Como se usa en el presente documento, el

45 término "epítopo" se refiere a, en un mamífero y preferentemente un ser humano, un fragmento de polipéptido que tiene antigenicidad o inmunogenicidad. Su unidad de tamaño mínimo consiste en aproximadamente 7 a 12 aminoácidos, y preferentemente 8 a 11 aminoácidos.

La constante de afinidad Ka (kon/koff) del anticuerpo de la presente invención es preferentemente al menos 107 M1, al menos 108 M1, al menos 5 x 108 M1, al menos 109 M1, al menos 5 x 109 M1 al menos 1010 M1, al menos 5 x 1010 M1, al menos 1011 M1 al menos 5 x 1011 M1 al menos 1012 M1, o al menos 1013 M1 .

El anticuerpo de la presente invención puede conjugarse con un agente antitumoral. La conjugación del anticuerpo con un agente antitumoral puede llevarse a cabo mediante un separador que tiene un grupo reactivo para un grupo

55 amino, un grupo carboxilo, un grupo hidroxi, un grupo tiol o similares (por ejemplo, un grupo succinato de succinimidilo, un grupo formilo, grupo 2piridiltio, un grupo maleimidilo, un grupo alcoxicarbonilo, y un grupo hidroxi).

Los ejemplos del agente antitumoral incluyen los siguientes agentes antitumorales conocidos como en las bibliografías de la técnica anterior y similares, tales como paclitaxel, doxorubicina, daunorubicina, ciclofosfamida, metotrexato, 5fluorouracilo, tiiotepa, busulfan, improsulfan, piposulfan, benzodopa, carbocuona, meturedopa, uredopa, altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiiofosforamida, trimetilolomelamina, bullatacina, bullatacinona, camptotecina, briostatina, calistatina, criptoficinilo, criptoficina, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, sarcodictina, espongistatina, clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de clorhidrato de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, 65 prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina, caliqueamicina, dinemicina, clodronata, esperamicina, aclacinomicina, actinomicina, autramicina

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IgG3 humana, la secuencia del N.º de Registro K01316 puede referirse a la región constante de la cadena pesada IgG4 humana, las secuencias de los N.os de Registro V00557, X64135, X64133, y similares pueden referirse a las regiones constantes de la cadena ligera K humana, y las secuencias de los N.os de Registro X64132, X64134, y similares pueden referirse a las regiones constantes de la cadena ligera À humana.

5 Los anteriores anticuerpos tienen preferentemente actividad citotóxica y de esta manera pueden presentar efectos antitumorales.

También, las secuencias específicas de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de las CDR en los anteriores anticuerpos se proporcionan simplemente a fines ilustrativos, y de esta manera, están claramente no limitadas a dichas secuencias específicas. Se preparó un hibridoma capaz de producir otro anticuerpo humano o un anticuerpo animal no humano (por ejemplo, un anticuerpo de ratón) contra CAPIN1 humano, un anticuerpo monoclonal que está producido por el hibridoma y se recoge, y a continuación se determina si es o no un anticuerpo diana mediante una propiedad de unión inmunológica con CAPRIN1 y actividad citotóxica como marcadores. Tras la identificación de un hibridoma que produce al anticuerpo monoclonal de esta manera, se preparó el ADN que

15 codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo diana a partir del hibridoma que se ha descrito anteriormente, se llevó a cabo la secuenciación, y a continuación se usó el ADN para la preparación de otro anticuerpo.

Además, el anticuerpo anterior de la presente invención, la secuencia de los anteriores anticuerpos (a) a (f), particularmente la secuencia de la región marco y/o la secuencia de la región constante de cada uno de los anticuerpos puede tener una sustitución, una deleción, o una adición de uno o varios (preferentemente, 1 o 2) aminoácidos, siempre que tenga especificidad para el reconocimiento específico de CAPRIN1. Aquí, el término "varios" se refiere a 2 a 5 y preferentemente 2 o 3.

25 La presente invención proporciona además ADN que codifica en anterior anticuerpo de la presente invención, o, ADN que codifica la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo anterior, o, ADN que codifica la región variable de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo anterior. Los ejemplos de dicho ADN incluyen, en el caso del anticuerpo (a), el ADN que codifica una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 40, 41, y 42 y el ADN que codifica una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 44, 45, y 46.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) codificadas por las secuencias de ADN son regiones para determinar la especificidad de un anticuerpo. De esta manera, las secuencias que codifican las regiones en un

35 anticuerpo diferente que las CDR (específicamente, una región constante y una región marco) pueden ser de otros anticuerpos. Aquí, los ejemplos de dichos "otros anticuerpos" incluyen anticuerpos de organismos no humanos, y son preferentemente de un ser humano a la vista de la reducción de los efectos secundarios. De esta manera, en el caso de las anteriores regiones de ADN que codifican cada región marco y cada región de contacto de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras comprenden preferentemente secuencias de nucleótidos que codifican las correspondientes secuencias de aminoácidos de un anticuerpo humano.

Además, los ejemplos alternativos del ADN que codifica el anticuerpo de la presente invención incluyen, en el caso del anticuerpo (a), el ADN que codifica una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y el ADN que codifica la región variable

45 de la cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47. Aquí, un ejemplo de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 43 es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 71. También un ejemplo de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 47 es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 72. En estos ADN, las regiones que codifican cada región constante de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras comprenden preferentemente las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes de un anticuerpo humano.

Se puede obtener el ADN de la presente invención mediante, por ejemplo, los métodos anteriores o el siguiente método. En primer lugar, se preparó el ARN total a partir de un hibridoma relacionado con el anticuerpo de la

55 presente invención utilizando un kit de extracción del ARN comercialmente disponible, y a continuación se sintetizó el ADNc con la transcriptasa inversa utilizando cebadores aleatorios, y similares. Posteriormente, se amplificó el ADNc que codificaba un anticuerpo mediante un método de la PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos de las secuencias conservadas en cada región variable de los genes de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo de ratón conocido. Se puede obtener la secuencia que codifica una región constante amplificando una secuencia conocida mediante un método de la PCR. Se puede determinar la secuencia de nucleótidos del ADN mediante un método convencional tal como la inserción de este en un plásmido o un fago para secuenciación.

Un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 que se va a usar en la presente invención se considera que presenta los efectos antitumorales contra células cancerosas que expresan CAPRIN1 debido a la citotoxicidad celular

65 dependiente de anticuerpo (ADCC) de células efectoras contra células cancerosas que expresan CAPRIN1, o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) contra células que expresan CAPRIN1.

Por tanto, la actividad de un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 que se va a usar en la presente invención puede evaluarse mediante, como se ha descrito específicamente en los Ejemplos siguientes, la medida ex vivo de la actividad de ADCC o la actividad de CDC anteriores contra las células cancerosas que expresan CAPRIN1.

5 Un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 que se va a usar en la presente invención se une a una proteína CAPRIN1 sobre una célula cancerosa y presenta efectos antitumorales debido a la actividad anterior, y de esta manera es útil para tratar o prevenir el cáncer. Específicamente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir un cáncer, que comprende un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 como un principio activo. Cuando el anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 se usa para su administración a un cuerpo humano (Tratamiento de anticuerpos), es preferentemente un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado a fin de disminuir la inmunogenicidad.

Además, cuanto mayor sea la afinidad de unión entre un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 y una proteína CAPRIN1 o las superficies de células cancerosas, se puede obtener la actividad antitumoral más fuerte del

15 anticuerpo dirigido contra CAPRIN1. Por tanto, cuando se puede adquirir un anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 que tiene una alta afinidad de unión con una proteína CAPRIN1, se pueden esperar efectos antitumorales más fuertes y dicha aplicación de anticuerpo como una composición farmacéutica para el objetivo del tratamiento y/o la prevención del cáncer se vuelve posible. Dicha alta afinidad de unión es deseable como sigue. Como se ha descrito anteriormente, la constante de unión (constante de afinidad) Ka (kon/koff) es preferentemente al menos 107 M1, al menos 108 M1, al menos 5 x 108 M1, al menos 109 M1, al menos 5 x 109 M1 al menos 1010 M1, al menos 5 x 1010 M1 , al menos 1011 M1 al menos 5 x 1011 M1 al menos 1012 M1, o al menos 1013 M1 .

<Unión a la célula que expresa el antígeno>

25 Se puede especificar la capacidad de un anticuerpo de unirse a CAPRIN1 mediante el ensayo de unión utilizando ELISA, un método de transferencia Western, inmunofluorescencia y análisis mediante citometría de flujo, o similar como se describe en los Ejemplos.

<Tinción inmunohistoquímica>

Se puede ensayar un anticuerpo que reconoce CAPRIN1 para la reactividad a CAPRIN 1, mediante un método de inmunohistoquímica conocido por personas expertas en la materia usando secciones congeladas fijadas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con paraformaldehído, que se prepara a partir de muestras de tejido obtenidas de un paciente durante la cirugía, o muestras de tejido obtenidas de

35 un animal que tiene un heterotrasplante de tejido inoculado con una línea celular que expresa CAPRIN1 naturalmente o después de la transfección.

Se puede teñir un anticuerpo reactivo a CAPRIN1 mediante diversos métodos para tinción inmunohistoquímica. Por ejemplo, un anticuerpo de cabra dirigido contra un anticuerpo de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante

o un anticuerpo de cabra dirigido contra un anticuerpo de pollo se le obliga a reaccionar, se puede visualizar un anticuerpo diana.

<Composición farmacéutica>

45 La presente invención proporciona además una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir un cáncer, que se caracteriza por contener el anterior anticuerpo o fragmento del mismo como un principio activo que tiene reactividad inmunológica con polipéptidos parciales de CAPRIN1 representados por las secuencias de número par de las SEQ ID NOS: 2 a 30 en las que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 37 o una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37.

Una diana de la composición farmacéutica para tratar y/o prevenir un cáncer de la presente invención no está particularmente limitada, siempre que este cáncer (célula) exprese un gen CAPRIN1.

55 El término "tumor" y "cáncer" como se usa en el presente documento se refiere a un neoplasma maligno y se usa indistintamente.

El cáncer que se va a someter en la presente invención es un cáncer que expresa los genes que codifican las proteínas CAPRIN1 que tienen secuencias de aminoácidos de las secuencias de número par de las SEQ ID NOS: 2 a 30. Los ejemplos de dichos cánceres incluyen preferentemente cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, mastocitoma, cáncer de riñón, cáncer de cuello de útero, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer gástrico, y cáncer colorrectal.

Los ejemplos de dicho cáncer incluyen, pero no de forma limitativa, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de

65 mama de tipo compuesto, tumor mixto maligno de glándula mamaria, adenocarcinoma papilar intraductal, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma espinocelular, carcinoma microcítico, carcinoma macrocítico, glioma que es

tumor de tejido epitelial neural, ependimoma, neurocitoma, tumor neuroectodermal fetal, schwannoma, neurofibroma, meningioma, leucemia linfocítica crónica, linfoma, linfoma gastrointestinal, linfoma digestivo, linfoma de células medias a células pequeñas, cáncer de intestino ciego, cáncer de colon ascendente, cáncer de colon descendente, cáncer de colon transversal, cáncer de colon sigmoideo, y cáncer de recto.

5 Además, los sujetos preferibles son mamíferos, incluyendo primates, mascotas, animales domésticos, animales de raza, y similares y son particularmente preferibles los seres humanos, perros, y gatos.

Cuando se va a usar un anticuerpo en la presente invención que se usa como composición farmacéutica, se puede formular mediante un método conocido por las personas expertas en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo se puede usar parenteralmente en la forma de una preparación de inyección tal como una solución o suspensión aséptica preparada con agua o una solución farmacológicamente aceptable diferente de agua. Por ejemplo, se puede formular mezclando en una forma farmacéutica unitaria requerida por la práctica farmacéutica generalmente aceptada en combinación adecuada con un transportador o medio farmacológicamente aceptable, específicamente, agua estéril o solución salina, aceite vegetal, un emulsionante, una suspensión, un tensioactivo, un estabilizante, un

15 compuesto aromatizante, un excipiente, un vehículo, un antiséptico, un aglutinante, y similares. Las cantidades de principios activos en estas preparaciones se determinan de tal manera que se pueda obtener una dosis adecuada en el intervalo indicado.

Se puede prescribir una composición aséptica para inyección de acuerdo con la práctica farmacéutica general utilizando un vehículo tal como agua destilada para inyección.

Los ejemplos de una solución acuosa para inyección incluyen solución salina, una solución isotónica que contiene dextrosa u otros adyuvantes tales como Dsorbitol, Dmanosa, Dmanitol, y cloruro sódico. Estos ejemplos se pueden usar en combinación con un agente solubilizante adecuado tal como alcohol, específicamente etanol y

25 polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol), y un tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80 (TM) y HCO60).

Los ejemplos del aceite incluyen aceite de sésamo y aceite de soja, que se pueden usar en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. También, se pueden combinar con el anterior un agente tamponante tal como tampón fosfato o tampón acetato de sodio, un agente calmante tal como clorhidrato de procaína, un estabilizante tal como alcohol bencílico o fenol, y un antioxidante. El más grande adecuado se carga generalmente con la solución de inyección preparada de esta manera.

La administración es administración peroral o parenteral y es preferentemente administración parenteral. Los

35 ejemplos específicos de la ruta de administración incluyen inyección, administración transnasal, administración pulmonar, y administración transdérmica. Los ejemplos de inyección incluyen la inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección subcutánea de tal manera que es posible la administración sistémica o local.

También, se pueden seleccionar adecuadamente los métodos de administración dependiendo de la edad del paciente, el peso corporal, el género, los síntomas, y similares. La dosificación por administración de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del intervalo entre 0,0001 mg y 1000 mg por kg de peso corporal. De forma alternativa, por ejemplo, la dosificación puede seleccionarse a partir del intervalo entre 0,001 mg/peso corporal y

45 100000 mg/de peso corporal por paciente. Sin embargo, el intervalo de dosificación no está siempre limitado a estos valores numéricos. La dosificación y el método de administración se hacen variar dependiendo del peso corporal del paciente, la edad, el género, los síntomas, y similares, pero se puede seleccionar adecuadamente por las personas expertas en la materia.

La composición farmacéutica anterior que contiene el anticuerpo o su fragmente de la presente invención se administra a un sujeto, de tal manera que el cáncer, preferentemente cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, linfoma, mastocitoma, cáncer de riñón, cáncer de cuello de útero, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer gástrico, y cáncer colorrectal se puede tratar y/o prevenirse.

55 La presente invención abarca además un método para tratar y/o prevenir un cáncer, que comprende administrar a un sujeto la composición farmacéutica de la presente invención en combinación con el agente antitumoral o la composición farmacéutica anteriormente ilustrados que contienen dicho agente antitumoral. El anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención y un agente antitumoral se pueden administrar simultáneamente o por separado a un sujeto. Se pueden administrar por separado siguiendo el orden de administración. Un especialista puede seleccionar adecuadamente los intervalos de administración, dosificación, la ruta de administración, y la frecuencia de administración. Los ejemplos de las otras formulaciones farmacéuticas que se van a administrar simultáneamente incluyen las composiciones farmacéuticas obtenidas mezclando el anticuerpo o fragmento del mismo de la presente invención con un agente antitumoral en un transportador farmacológicamente aceptable (o un medio) seguido por formulación. Además, son aplicables aproximadamente cualquiera de las composiciones

65 farmacéuticas anteriores que contienen un agente antitumoral y la formulación, las explicaciones que se refieren a la prescripción, formulación, la ruta de administración, la dosis, el cáncer, y similares para administrar una composición

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en proteínas. La secuencia de nucleótidos del homólogo de pollo está representada por la SEQ ID NO: 29 y la secuencia de aminoácidos de la misma está representada por la SEQ ID NO: 30. Además, las identidades de secuencias de los genes que codifican los homólogos humanos y del gen que codifica el homólogo de pollo eran del 81 % al 82 % al nivel de la secuencia de nucleótidos y del 86 % al nivel de la secuencia de aminoácidos en las

5 regiones que se van a traducir en proteínas.

(4) Análisis de la expresión génica en cada tejido

Se examinó la expresión de los genes obtenido mediante el método anterior en tejidos normales de perro y ser humano y varias líneas de células mediante un método de RTPCR. Se llevó a cabo la reacción de transcriptasa inversa como sigue. De forma específica, se extrajo el ARN total de 50 mg a 100 mg del tejido o de 5 a 10 x 106 células de la línea de células utilizando un reactivo TRIZOL (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos acompañantes. Se sintetizó el ADNc con el ARN total utilizando un Sistema de Síntesis Superscript FirstStrand para la RTPCR (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos acompañantes. Se llevó a cabo la PCR como sigue usando 15 los cebadores de las SEQ ID NOS: 33 y 34 específicas de los genes obtenidos. De forma específica, se añadieron los reactivos y un tampón acompañante a 0,25 µl de la muestra preparados mediante la reacción de transcripción inversa hasta un volumen total de 25 µl, de tal manera que lo resultante contenía los cebadores anteriores de 2 µM cada uno, los dNTP de 0,2 mM cada uno, y 0,65 U de la polimerasa ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.). Se llevó a cabo la PCR repitiendo un ciclo de 94 ºC durante 30 segundos, 60 ºC durante 30 segundos, y 72 ºC durante 30 segundos 30 veces usando un Ciclador Térmico (BIO RAD). Los cebadores específicos de los genes anteriores son capaces de amplificar la región que varía de los nucleótidos 206 a 632 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5 (gen CAPRIN1 de perro) y la región que varía entre los nucleótidos 698 a 1124 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (gen CAPRIN1 humano). Como control a fines comparativos, se usaron también simultáneamente cebadores específicos de GAPDH de las SEQ ID NOS: 35 y 36. Como resultado, como se representa en la Fig. 1, se

25 observó una fuerte expresión en testículos entre tejidos de perros normales, aunque se observó la expresión en cáncer de mama y en tejidos de adenocarcinoma de perros. Además, se llevó a cabo también la observación de la expresión de los homólogos humanos a partir de los genes obtenidos. Como resultado, se podría observar la similitud de la expresión en el caso del gen CAPRIN1 de perro solo en testículos entre tejidos normales. Sin embargo, en el caso de células cancerosas, se detectó la expresión en muchos tipos de líneas de células cancerosas, incluyendo líneas de células de cáncer de mama, tumor cerebral, leucemia, cáncer de pulmón, y cáncer de esófago. Se observó la expresión concretamente en muchas líneas de células de cáncer de mama. Se confirmó por los resultados que la expresión de CAPRIN1 no se observó en tejidos normales diferentes de testículos, mientras que CAPRIN1 se expresó en muchas células cancerosas y particularmente en líneas celulares de cáncer de mama.

35 En la Fig. 1 Referencia n.º 1 sobre cada eje vertical indica los modelos de expresión de los genes identificados anteriormente y la Referencia n.º 2 indica los modelos de expresión del gen GAPDH como control.

(5): Tinción inmunohistoquímica

(5): 1 Expresión de CAPRIN1 en tejidos normales de ratón y perro

Se desangraron ratones (Balb/c, hembras) y perros (beagles, perras) con anestesia de éter y anestesia de ketamina/isoflurano. Tras la laparotomía, se transfirió cada órgano (estómago, hígado, globo ocular, glándula del 45 timo, músculo, médula ósea, útero, intestino delgado, esófago, corazón, riñón, glándula salivar, intestino grueso, glándula mamaria, cerebro, pulmón, piel, glándula adrenal, ovario, páncreas, bazo, y vejiga) a una placa de 10 cm que contenía PBS. Se cortó cada órgano en abierto en PBS y a continuación se sometió a fijación por perfusión durante la noche en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) que contenía paraformaldehído al 4 % (PFA). Se descartó la solución de perfusión, se enjuagó la superficie de tejido de cada órgano con PBS, se añadió una solución de PBS que contenía sacarosa al 10 % a un tubo de centrífuga de 50 ml, se añadió cada tejido al tubo, y a continuación el tubo se agitó usando un rotor a 4 ºC durante 2 horas. Se sustituyó la solución por una solución de PBS que contenía sacarosa al 20 % y a continuación se dejó reposar a 4 ºC hasta que el tejido se hundió. Se sustituyó la solución por una solución de PBS que contenía sacarosa al 30 % y a continuación se dejó reposar a 4 ºC hasta que el tejido se hundió. Se retiró el tejido y se recortaron las porciones necesarias con un escalpelo quirúrgico. A continuación, se 55 añadió un compuesto OCT (Tissue Tek) al tejido de tal manera que este se aplicó vigorosamente a la superficie del tejido, y a continuación el tejido se colocó en un criomolde. El criomolde se colocó en hielo seco para congelar rápidamente. Posteriormente, el tejido se cortó en rodajas de 10 µm a 20 µm usando un criostato (LEICA). Las secciones se secaron al aire sobre vidrios de porta usando un secador de pelo durante 30 minutos para preparar el tejido cortado en rodajas sobre un vidrio de porta. A continuación, cada muestra se colocó en un frasco de tinción relleno con PBST (solución salina que contenía Tween 20 al 0,05 %) y a continuación se sometió a sustitución con PBST repitiéndose tres veces cada 5 minutos. Se retiró el agua en exceso alrededor de las secciones con Kimwipes y a continuación las secciones se rodearon usando un DAKOPEN (DAKO). Como soluciones bloqueantes, un reactivo MOM de bloqueo de la Ig de ratón (VECTASTAIN) y una solución de PBST que contenía FBS al 10 % se superpusieron sobre tejido de ratón y tejido de perro, respectivamente, y a continuación se dejaron reposar en una 65 cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución del anticuerpo monoclonal contra CAPRIN1 (anticuerpo monoclonal n.º 1) de 10 µg/ml se ajustó con una solución de bloqueo, que reacciona

con las superficies de células cancerosas y tiene la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47 que se ha preparado en el Ejemplo 4, se colocó encima y a continuación se dejó reposar durante la noche en una cámara húmeda a 4 ºC. Se llevaron a cabo 10 minutos de lavado con PBST 3 veces, y a continuación un anticuerpo dirigido contra IgG marcado con biotina MOM 5 (VECTASTAIN) diluido 250 veces con la solución de bloqueo se colocó y a continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora en una cámara húmeda. Después de diez (10) minutos, se llevó a cabo el lavado con PBST 3 veces, se colocó encima un reactivo ABC de avidinabiotina (VECTASTAIN), y a continuación la muestra se dejó reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de (10) minutos, se llevó a cabo el lavado con PBST 3 veces, se colocó encima una solución de colorante DAB (DAB 10 mg

+H2O2 al 30% 10 µl/TrisHCl 0,05 M (pH 7,6) 50 ml), y a continuación la muestra se dejó reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras enjuagar con agua destilada, se colocó encima un reactivo de hematoxilina (DAKO), la muestra se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto, y a continuación se enjuagó con agua destilada. El vidrio del portaobjetos se sumergió en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, y a continuación 100 %, en dicho orden durante 1 minuto cada vez y a continuación se mantuvo 15 en reposo durante la noche en xileno. Se retiró el vidrio del portaobjetos, se precintó en Medio Glycergel Mounting (DAKO), y a continuación se observó. Como resultado, se observó ligeramente la expresión de CAPRIN1 en las células de cada tejido de glándula salivar, riñón, colon, y estómago, pero no se observó la expresión de la misma en las superficies celulares. Además, no se observó expresión en tejidos procedente de otros órganos. Además, se obtuvieron resultados similares en el caso de utilizar en anticuerpo monoclonal dirigido contra CAPRIN1 (anticuerpo monoclonal n.º 2) que comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 47 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 55, un anticuerpo monoclonal dirigido contra CAPRIN1 (anticuerpo monoclonal n.º 3) que comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 59 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 63, un anticuerpo monoclonal dirigido contra CAPRIN1 (anticuerpo monoclonal n.º 4) que comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 76 y la región variable de la cadena

25 ligera de la SEQ ID NO: 80, un anticuerpo monoclonal dirigido contra CAPRIN1 (anticuerpo monoclonal n.º 5) que comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 84 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 88, un anticuerpo monoclonal dirigido contra CAPRIN1 (anticuerpo monoclonal n.º 6) que comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 92 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO:

96.

(5)2 Expresión de CAPRIN1 en tejido de cáncer de mama de perro

Se prepararon portas con las secciones congeladas mediante un método similar al anterior utilizando 108 especímenes de tejido de cáncer de mama congelado de perros a los que se les había diagnosticado

35 patológicamente teniendo cáncer maligno de mama, y se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal n.º 1 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó la expresión de CAPRIN1 en 100 de 108 especímenes (92,5 %) y CAPRIN1 se expresó fuertemente sobre las superficies de células cancerosas con un grado particularmente elevado de atipismo. Además, en el caso de utilizar los anticuerpos monoclonales n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5 y n.º 6, se obtuvieron resultados similares.

(5) 3 Expresión de CAPRIN1 en tejidos de cáncer de mama humano

Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica usando 188 especímenes de tejido de cáncer de mama sobre una matriz de tejido de cáncer de mama humano incluido en parafina (BIOMAX). Después de tres horas de tratamiento 45 de la matriz de tejido de cáncer de mama humano a 60 ºC, la matriz se colocó en frasco de tinción relleno con xileno, seguido por la sustitución del xileno repitiéndose la sustitución tres veces cada 5 minutos. A continuación, se llevó a cabo un procedimiento similar con etanol y PBST en vez de xileno. La matriz de tejido de cáncer de mama humano se colocó en un frasco de tinción relleno con tampón citrato 10 mM) (pH 6,0) que contenía Tween 20 al 0,05 %. Después de 5 minutos de tratamiento a 125 ºC, la matriz se dejó reposar a temperatura ambiente durante 40 minutos o más. Se retiró el agua en exceso alrededor de las secciones con Kimwipes, las secciones se rodearon con un DAKOPEN y se añadió gota a gota peroxidasa de bloqueo (DAKO) en las cantidades adecuadas. Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos, la matriz se colocó en un frasco de tinción relleno con PBST, seguido por PBST, repitiéndose la sustitución tres veces cada 5 minutos. Como solución de bloqueo, se colocó una solución de PBST que contenía FBS al 10 % sobre la matriz, y a continuación se dejó reposar la matriz 55 en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, una solución del anticuerpo monoclonal n.º 1 de 10 µg/ml ajustada con una solución de PBST que contenía FBS al 5 %, que reacciona con las superficies de células cancerosas y se había preparado en el Ejemplo 4 se colocó encima, y la matriz de dejó reposar durante la noche en una cámara húmeda a 4 ºC. después de diez (10) minutos de lavado llevado a cabo con PBST 3 veces, se añadió gota a gota Conjugado Polimérico Marcado con Peroxidasa (DAKO) en cantidades adecuadas y a continuación la matriz se dejó reposar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de diez (10) minutos, se llevó a cabo el lavado con PBST 3 veces, se colocó encima una solución DAB colorante (DAKO) y a continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Se descartó la solución colorante, se llevaron a cabo 10 minutos de lavado con PBST 3 veces, y a continuación este se enjuagó con agua destilada. La matriz se sumergió en soluciones de etanol al 70 %, 80 %, 65 90 %, 95 %, y a continuación 100 %, en dicho orden durante 1 minuto cada vez y a continuación se mantuvo en reposo durante la noche en xileno. Se retiró el vidrio del portaobjetos, se precintó en Medio Glycergel Mounting

(DAKO), y a continuación se observó. Como resultado, se observó la expresión fuerte de CAPRIN1 en 138 de un total de 188 especímenes de tejido de cáncer de mama (73 %). Además, en el caso de utilizar los anticuerpos monoclonales n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5 y n.º 6, se obtuvieron resultados similares.

5 (5)4 Expresión de CAPRIN1 en tumor cerebral maligno humano

Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con un método similar al usado en (5)3 anterior con 247 especímenes de tejido de tumor cerebral maligno en una matriz de tejido de tumor cerebral humano incluida en parafina (BIOMAX), utilizando el anticuerpo monoclonal n.º 1 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó la expresión fuerte de CAPRIN1 en 227 de un total de 247 especímenes de tejido de tumor cerebral maligno (92 %). Además, en el caso de utilizar los anticuerpos monoclonales n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5 y n.º 6, se obtuvieron resultados similares.

(5)5 Expresión de CAPRIN1 en ganglio linfático metastatizado de cáncer de mama humano

15 Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con un método similar al del (5)3 anterior con 150 especímenes de tejido de ganglio linfático metastatizado de cáncer de mama en una matriz de tejido de ganglio linfático metastatizado de cáncer de mama humano incluido en parafina (BIOMAX), utilizando el anticuerpo monoclonal n.º 1 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó la expresión fuerte de CAPRIN1 en 136 de un total de 150 especímenes de tejido de ganglio linfático metastatizado de cáncer de mama (90 %). De forma específica, se reveló que CAPRIN1 se expresó fuertemente también en tejidos de cáncer que habían metastatizado procedentes del cáncer de mama. Además, en el caso de utilizar los anticuerpos monoclonales n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5 y n.º 6, se obtuvieron resultados similares.

25 (5) 6 Expresión de CAPRIN1 en varios tejidos de cáncer humano

Se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con un método similar al anterior con especímenes en varias matrices de tejido de cáncer humano incluidas en parafina (BIOMAX), utilizando el anticuerpo monoclonal n.º 1 preparado en el Ejemplo 4. Como resultado, se observó la expresión fuerte de CAPRIN1 en cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, y cáncer de cuello de útero. Además, en el caso de utilizar los anticuerpos monoclonales n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5 y n.º 6, se obtuvieron resultados similares.

Ejemplo 2 Preparación de una novedosa proteína antigénica de cáncer humano

35 (1) Preparación de la proteína recombinante

Basándose en el gen de la SEQ ID NO: 1 obtenido en el Ejemplo 1, se preparó una proteína recombinante del gen homólogo humano de acuerdo con el siguiente método. Se llevó a cabo la PCR en un volumen total de 50 µl con 1 µl de ADNc, dos cebadores (SEQ ID NOS: 38 y 39 que comprenden las secuencias de escisión de las enzimas de restricción Sac Iy Xho I) de 0,4 µM cada, 0,2 mM de dNTP, y 1,25 U PrimeSTAR HS polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.), preparado añadiendo los reactivos y un tampón adjunto. La expresión se confirmó por un método de RTPCR para el ADNc usado en el presente documento procedente de diferentes tejidos o ADNc derivados de células preparado en el Ejemplo 1. La PCR se llevó a cabo repitiendo un ciclo de 98 ºC durante 10 segundos y a 68 ºC durante 2,5 minutos 30 veces usando un Thermal Cycler (BIO RAD). Los dos cebadores anteriores son capaces de

45 amplificar una región que codifica la totalidad del aminoácido de la SEQ ID NO: 2. Tras la PCR, el ADN así amplificado se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 %, y a continuación se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,1 kbp usando el kit de extracción QIAquick Gel (QIAGEN).

El fragmento de ADN así purificado se ligó en un vector de clonación PCRBlunt (Invitrogen). Tras la transformación de Escherichia coli con el mismo, se recogió un plásmido. Se verificó mediante secuenciación que el fragmento génico así amplificado tiene la secuencia de interés. El plásmido que tiene una secuencia coincidente con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción Sac Iy Xho I y a continuación se purificó con un kit de extracción QIAquick Gel. La secuencia génica de interés se insertó en un vector de expresión pET30a (Novagen) de Escherichia coli tratado con las enzimas de restricción Sac Iy Xho I. Con el vector se puede producir una proteína

55 recombinante fusionada con etiqueta His. El plásmido se transformó en Escherichia coli para la expresión recombinante, BL21(DE3), y a continuación la expresión se indujo con IPTG 1 mM, de forma que la proteína de interés se expresó en Escherichia coli.

(2) Purificación de la proteína recombinante

La Escherichia coli recombinante anteriormente obtenida que expresa el gen de la SEQ ID NO: 1 se cultivó en medio LB que contenía 30 µg/ml de kanamicina a 37 ºC hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó aproximadamente 0,7, se añadió isopropilβD1tiogalactopiranósido a una concentración final de 1 mM y, a continuación, las células se cultivaron a 37 ºC durante 4 horas. Posteriormente, se realizó la centrifugación a 4800 rpm durante 10 minutos y a

65 continuación las células se recogieron. El aglomerado celular resultante se suspendió en suero salino tamponado con fosfato y se centrifugó a 4800 rpm durante 10 minutos, y a continuación las células se lavaron.

imagen16

Los hibridomas así seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a 0,5 células por pocillo y a continuación se cultivaron. Después de 1 semana, se observó que los hibridomas habían formado colonias individuales en los pocillos. Estas células en los pocillos se cultivaron adicionalmente, y los hibridomas se seleccionaron usando como 5 marcador la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados frente a la proteína CAPRIN1. La solución de la proteína CAPRIN1 (1 µg/ml) preparada en el Ejemplo 2 se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo y a continuación se dejó reposar a 4 ºC durante 18 horas. Cada pocillo se lavó tres veces con PBST, se añadieron a cada pocillo 400 µl de una solución de BSA al 0,5 %, y a continuación el resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se eliminó, y a continuación los pocillos se lavaron tres veces con 400 µl de PBST por pocillo. 100 µl de cada sobrenadante del cultivo de los hibridomas anteriormente obtenidos se añadió a cada pocillo, y a continuación la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras lavar cada pocillo tres veces con PBST, se añadieron 100 µl de un anticuerpo dirigido contra IgY de conejo marcado con HRP (SIGMA) diluido 5000 veces con PBS por pocillo y después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar los pocillos tres veces con PBST, se añadieron 100 µl de una

15 solución de sustrato TMB (Thermo) a cada pocillo y a continuación se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de coloración. Tras el desarrollo del color, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción y a continuación se midieron las absorbancias a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron varias líneas celulares de hibridomas productoras de anticuerpos monoclonales reactivos contra la proteína CAPRIN1.

A continuación, de estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron los anticuerpos reactivos a la superficie celular de las células de cáncer de mama que expresan CAPRIN1. Específicamente, 5 x 105 células de cáncer de mama humano de la línea celular MDAMB231V se sometieron a centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se añadieron 100 µl del sobrenadante del cultivo de cada uno de los anteriores hibridomas al tubo, y a continuación

25 el tubo se dejó reposar sobre hielo durante 1 hora. Tras lavar con PBS, se añadió un anticuerpo de cabra dirigido contra IgG (H+L) de pollo marcado con FITC (SouthernBiotech) diluido 30 veces con PBS que contiene FBS al 0,1 %, y a continuación el resultante se dejó reposar sobre hielo durante 1 hora. Tras lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando un calibre FACS (Becton, Dickinson and Company). Entre tanto, se llevaron a cabo procedimientos análogos a los anteriores usando medio para cultivar hibridomas, de forma que se obtuvo una muestra de control. Como resultado, se seleccionó un anticuerpo monoclonal (anticuerpo monoclonal n.º 1) que mostró una intensidad de fluorescencia mayor que la del control, y esto es, que había reaccionado con las superficies de células de cáncer de mama que expresaban CAPRIN1.

Además, 100 µg de la proteína antigénica (CAPRIN1 humana) representada por la SEQ ID NO: 2 preparada en el

35 Ejemplo 2 se mezcló con una cantidad equivalente de un adyuvante MPL+TDM (Sigma) para preparar un anticuerpo monoclonal de ratón, de tal forma que la mezcla se preparó en forma de una solución antigénica para un ratón. Tras administración intraperitoneal de la solución antigénica a cada ratón Balb/cc de 6 semanas de edad (Japan SLC Inc.), la administración se realizó 7 veces cada semana, de forma que se completó la inmunización. Cada bazo se extirpó el día 3 después de la inmunización final. Cada bazo se intercaló entre dos portas de vidrio esterilizados, y a continuación se trituró. El resultado se lavó con PBS() (Misuri) y después se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante. Este procedimiento se repitió 3 veces, de forma que se obtuvieron esplenocitos. Los esplenocitos así obtenidos y las células de mieloma de ratón SP2/0 (adquiridas de la ATCC) se mezclaron en una proporción de 10 : 1. Se añadió a la mezcla una solución de PEG preparada mezclando 200 µl de medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 % calentado a 37 ºC y 800 µl of PEG1500 (Boehringer), se dejó reposar

45 durante 5 minutos par fusión celular, y a continuación se sometió a 5 min. de centrifugación a 1700 rpm. Tras eliminar el sobrenadante, las células se suspendieron en 150 ml de medio RPMI1640 (medio selectivo HAT) que contenía FBS al 15 % al que se había añadido una solución de HAT (Gibco) (2 % equivalente), y a continuación la suspensión celular se sembró en cincuenta placas de 96 pocillos (Nunc) a 100 µl por pocillo. Las células se cultivaron durante 7 días a 37 ºC en condiciones de 5 % de CO2, de forma que se obtuvieron las células de fusión del hibridoma preparado de los esplenocitos y las células de mieloma de pollo.

Los hibridomas se seleccionaron usando como marcador la afinidad de unión del anticuerpo producido por los hibridomas preparados frente a la proteína CAPRIN1. La solución de la proteína CAPRIN1 (1 µg/ml) preparada en el Ejemplo 2 se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo y a continuación se dejó reposar a 4 ºC 55 durante 18 horas. Tras lavar cada pocillo 3 veces con PBST, se añadió una solución de PBST, una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 %(Sigma) a 400 µl por pocillo, y después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se retiró, cada pocillo se lavó tres veces con 400 µl of PBST, cada sobrenadante del cultivo del hibridoma anteriormente obtenido se añadió a 100 µl por pocillo, y a continuación el resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras lavar cada pocillo tres veces con PBST, se añadieron a cada pocillo 100 µl de un anticuerpo dirigido contra IgG (H+L) de ratón marcado con HRP (SIGMA) diluido 5000 veces con PBS por pocillo y después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar los pocillos tres veces con PBST, se añadieron 100 µl de una solución de sustrato TMB (Thermo) a cada pocillo y a continuación el resultante se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de coloración. Tras el desarrollo del color, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción y a

65 continuación se midieron las absorbancias a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se seleccionaron varios hibridomas productores de anticuerpos con elevados valores de absorbancia.

Los hibridomas así seleccionados se añadieron a una placa de 96 pocillos a 0,5 células por pocillo y a continuación se cultivaron. Después de 1 semana, se observó que los hibridomas habían formado colonias individuales en los pocillos. Estas células en los pocillos se cultivaron adicionalmente, y los hibridomas se seleccionaron usando como 5 marcador la afinidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas clonados por la proteína CAPRIN1. La solución de la proteína CAPRIN1 (1 µg/ml) preparada en el Ejemplo 3 se añadió a una placa de 96 pocillos a 100 µl por pocillo y a continuación se dejó reposar a 4 ºC durante 18 horas. Después de lavar cada pocillo tres veces con PBST, se añadieron a cada pocillo 400 µl de una solución de BSA al 0,5 %, y a continuación el resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. La solución se eliminó. Después de lavar las células tres veces con 400 µl de PBST por pocillo, se añadieron a cada pocillo 100 µl de una solución de cada sobrenadante del cultivo del hibridoma anteriormente obtenido, y a continuación el resultado se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras lavar cada pocillo tres veces con PBST, se añadieron a cada pocillo 100 µl de un anticuerpo dirigido contra IgG (H+L) de ratón marcado con HRP (SIGMA) diluido 5000 veces con PBS por pocillo y después se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar los pocillos tres veces con PBST, se añadieron 100

15 µl de una solución de sustrato TMB (Thermo) a cada pocillo y a continuación se dejó reposar durante 15 a 30 minutos para la reacción de coloración. Tras el desarrollo del color, se añadieron 100 µl de ácido sulfúrico 1 N a cada pocillo para detener la reacción y a continuación se midieron las absorbancias a 450 nm y 595 nm usando un espectrómetro de absorción. Como resultado, se obtuvieron 50 líneas celulares de hibridomas productoras de anticuerpos monoclonales reactivos con la proteína CAPRIN1.

A continuación, de estos anticuerpos monoclonales, se seleccionaron los anticuerpos reactivos a la superficie celular de las células de cáncer de mama que expresan CAPRIN1. Específicamente, 106 células de la línea celular MDAMB231V de cáncer de mama humano se sometieron a centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se añadieron 100 µl del sobrenadante del cultivo de cada uno de los anteriores hibridomas al tubo, y a continuación se

25 dejó reposar sobre hielo durante 1 hora. Tras lavar con PBS, se añadió un anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón (invitrogen) diluido 500 veces con PBS que contiene FBS al 0,1 %, y a continuación el resultante se dejó reposar sobre hielo durante 1 hora. Tras lavar con PBS, se midió la intensidad de fluorescencia usando un calibre FACS (Becton, Dickinson). Entre tanto, se realizaron procedimientos similares a los anteriores usando una muestra de suero no tratada (de un ratón Balb/c de 6 semanas de edad) diluido 500 veces con medio para cultivar hibridomas, en lugar de los anticuerpos, de forma que se obtuvo una muestra de control. Como resultado, se seleccionaron cinco anticuerpos monoclonales (n.º 2, n.º 3, n.º 4. n.º 5 y n.º 6) que mostraron una intensidad de fluorescencia mayor que la del control, y específicamente, los que reaccionaban con las superficies celulares de las células de cáncer de mama.

35 Ejemplo 4 Caracterización de los anticuerpos seleccionados

(1) Clonación de los genes de las regiones variables del anticuerpo monoclonal dirigido contra CAPRIN1

Se extrajo el ARNm de una línea celular de hibridoma derivada de pollo productora de anticuerpos monoclonales (seleccionados en el Ejemplo 3) reactivos con las superficies de células de cáncer de mama que expresan CAPRIN

1. Sobre los anteriores se llevó a cabo un método RTPCR usando cebadores específicos de la secuencia derivada de FR1 de pollo y de la secuencia derivada de FR4 de pollo, y se obtuvieron el gen de la región variable de la cadena pesada (VH) y el gen de la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo. También se extrajo el ARNm de dos líneas celulares de hibridoma derivadas de ratón productoras de anticuerpos monoclonales reactivos

45 con las superficies de células de cáncer de mama que expresan CAPRIN1. Sobre los anteriores se llevó a cabo un método RTPCR usando cebadores específicos de la secuencia derivada de FR1 de ratón y de la secuencia derivada de FR4 de ratón, y se obtuvieron el gen de la región variable de la cadena pesada (VH) y el gen de la región variable de la cadena ligera (VL) de cada anticuerpo. Para determinación de la secuencia, estos genes se clonaron en un vector pCR2.1 (Invitrogen).

(1)1 RTPCR

Tras la extracción del ARN total de 106 células de cada línea celular de hibridoma usando un kit de aislamiento High Pure RNA (Roche), se sintetizó el ADNc usando un kit de síntesis PrimeScriptII 1st strand cDNA (Takara). Estos

55 procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos anexos a cada kit.

El gen de la región variable de cadena pesada del anticuerpo de pollo y el gen de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de pollo, y el gen de la región variable de la cadena pesada y el gen de la región variable de la cadena ligera de ratón se amplificaron mediante un método de la PCR de acuerdo con un método convencional usando el ADNc así sintetizado como molde y una KODPlusDNA Polymerase (TOYOBO).

Para obtener el gen de la región VH del anticuerpo de pollo, se utilizaron un cebador específico de la secuencia FR1 de la cadena pesada de pollo y un cebador específico de la secuencia FR4 de la cadena pesada de pollo. Además, para obtener el gen de la región VL, se utilizaron un cebador específico de la secuencia FR1 de la cadena ligera de 65 pollo y un cebador específico de la secuencia FR4 de la cadena ligera de pollo. Los genes de las regiones VH y VL del anticuerpo de ratón se obtuvieron de una forma similar al anterior. Específicamente, se utilizaron un cebador

específico de la secuencia FR1 de la cadena pesada del ratón, cebador específico de la secuencia FR4 de la cadena pesada de ratón, un cebador específico de la secuencia FR1 de la cadena ligera de ratón, y un cebador específico de la secuencia FR4 de la cadena ligera de ratón.

5 Los productos de la PCR así obtenidos se sometieron, cada uno de ellos, a electroforesis en gel de agarosa, y se recortaron las bandas de ADN de la región VH y la región VL. Los fragmentos de ADN se purificaron usando un kit de purificación QIAquick Gel (QIAGEN) de acuerdo con los protocolos anexos. El ADN purificado se clonó en un vector pCR2.1 usando e kit de clonación TA (Invitrogen). El vector ligado se transformó en células DH5 competentes (TOYOBO) de acuerdo con un método convencional. 10 clones de cada transformante se cultivaron durante la noche en medio (100 µg/ml de ampicilina) a 37 ºC, y a continuación el ADN plásmido se purificó con un kit Qiaspin Miniprep (QIAGEN).

(1)2 Determinación de la secuencia

15 Las secuencias génicas de la región VH y la región VL de cada plásmido obtenido anteriormente se analizaron con un cebador directo M13 (SEQ ID NO: 64) y un cebador inverso M13 (SEQ ID NO: 65) en un secuenciador de fluorescencia (secuenciador de ADN 3130XL; ABI), usando un kit de secuenciación Big Dye Terminator Ver3.1 Cycle (ABI) de acuerdo con los protocolos anexos. Como resultado, de determinó la secuencia de cada gen. Las secuencias fueron idénticas entre los 10 clones.

La secuencia génica así obtenida y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal derivado de pollo se representan mediante las SEQ ID NOS: 71 y 43, respectivamente, y la secuencia génica y la secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal derivado de pollo se representan mediante las SEQ ID NOS: 72 y 47, respectivamente.

25 También, las secuencias génicas así obtenidas que codifican las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo derivadas de ratón se representan mediante las SEQ ID NOS: 71, 103, 105, 97, 99, y 101, sus secuencias de aminoácidos se representan mediante las SEQ ID NOS: 51, 59, 76, 84, and 92, respectivamente, las secuencias que codifican las regiones variables de la cadena ligera se representan mediante las SEQ ID NOS: 104, 106, 98, 100, sus secuencias de aminoácidos se representan mediante las SEQ ID NOS: 55, 63, 80, 88, y 96, respectivamente.

Específicamente, se ha revelado que el anticuerpo monoclonal n.º 1 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 47, en la que las CDR1, 35 CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 40, 41, y 42, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 44, 45, y 46, respectivamente. También se ha revelado que el anticuerpo monoclonal n.º 2 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 55, en la que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 48, 49, y 50, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 52, 53, y 54, respectivamente. También se ha revelado que el anticuerpo monoclonal n.º 3 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 59 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 63, en la que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consiste en las secuencias 45 de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 56, 57, y 58, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 60, 61, y 62, respectivamente. También se ha revelado que el anticuerpo monoclonal n.º 4 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 76 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 80, en la que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 73, 74, y 75, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 77, 78, y 79, respectivamente. También se ha revelado que el anticuerpo monoclonal n.º 5 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 84 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 88, en la que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 82, 83, y 84,

55 respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 85, 86, y 87, respectivamente. También se ha revelado que el anticuerpo monoclonal n.º 6 comprende la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 92 y la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 96, en la que las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 90, 91, y 92, respectivamente, y las CDR1, CDR2, y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 94, 95, y 96, respectivamente.

(2) Preparación del anticuerpo recombinante quimérico humanopollo y el anticuerpo quimérico ratónpollo

65 Un fragmento de amplificación del gen de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 43) del anticuerpo monoclonal de pollo n.º 1 obtenido en el apartado (1) anterior se trató en ambos extremos con las enzimas de

imagen17

3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6 mostraron una intensidad de fluorescencia mayor en un 20 % o más que la del control. Específicamente, cuando se utilizó el anticuerpo n.º 1, la intensidad de fluorescencia se potenció hasta un 4700 % en el caso de SKBR3 y 5500 % en el caso de MDAMB231 V. También, cuando se usaron los anticuerpos n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6, se potenció la intensidad de fluorescencia. Mediante estos resultados, se reveló que la

5 proteína CAPRIN1 se expresaba sobre las superficies de las membranas celulares de las líneas celulares de cáncer humano. Este porcentaje de mejora en la intensidad de fluorescencia anterior, expresada como porcentaje de la intensidad promedio de la fluorescencia (nivel) en cada tipo de célula, se calculó mediante la siguiente fórmula.

Porcentaje de aumento en la intensidad de fluorescencia promedio (porcentaje de mejora en la intensidad de la fluorescencia) (%) = ((nivel MFI en las células que han reaccionado con el anticuerpo dirigido contra CAPRIN1) (nivel MFI de control) / (nivel MFI de control) x 100.

(4) Efectos antitumorales (actividad ADCC) de los anticuerpos dirigidos contra CAPRIN1 n.º 1, n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6 sobre células cancerosas

15 A continuación, se evaluó la actividad citotóxica de los anticuerpos dirigidos contra dirigidos contra CAPRIN1 n.º 1, n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6 frente a diferentes células cancerosas humanas. Cada sobrenadante de cultivo celular productor de n.º 1, n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5, o n.º 6 obtenido en el Ejemplo 3 y el apartado (2) anterior se purificó usando Hitrap ProteinA Sepharose FF (GE HealthCare), sometida a sustitución de tampón con PBS(), y a continuación se filtró a través de un filtro de 0,22 µm (Millipore). Los resultantes se utilizaron como anticuerpos para la medición de la actividad. 106 células de la línea celular de cáncer de mama humano MDAMB157 se recogieron en un tubo de centrífuga de 50 ml, se añadieron 100 µCi de cromo 51, y a continuación la incubación se llevó a cabo a 37 ºC durante 2 horas. Posteriormente, el resultante se lavó tres veces con medio RPMI1640 que contenía FBS al 10 %. Las células se añadieron a una placa de 96 pocillos de fondo en V a 103 células por pocillo para su uso como

25 células diana. Los anticuerpos purificados anteriores (1 µg cada) se añadieron a las células. 5 x 104 células de linfocitos separadas de sangre periférica humana de acuerdo con un método convencional se añadieron posteriormente, y a continuación se cultivaron durante 4 horas a 37 ºC en condiciones de 5 % de CO2. Tras el cultivo, se midió la cantidad de cromo51 liberado de las células tumorales dañadas en un sobrenadante del cultivo, y se calculó la actividad citotóxica de cada anticuerpo dirigido contra CAPRIN1 frente a las células cancerosas. Como muestras de control negativo, se utilizaron una muestra preparada por adición de PBS en lugar de los anticuerpos y una muestra preparada añadiendo un anticuerpo control de isotipo en lugar de los anticuerpos. Como resultado, los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 muestran 40 %, 26,4 %, y 32,4 % de actividad citotóxica, respectivamente, frente a MDAMB157 (véase la Fig. 2). También, los anticuerpos n.º 4, n.º 5, y n.º 6 muestran 31,0 %, 30,9 %, y 19,0 % de actividad citotóxica, respectivamente. Por el contrario, la actividad de la muestra

35 preparada por adición de PBS como control negativo y la actividad de la muestra preparada por adición del anticuerpo control de isotipo como control negativo fueron 1,1 % y 2,0 %, respectivamente. Análogamente, se examinó la actividad citotóxica de los anticuerpos n.º 1, n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6 contra otras células de cáncer humano incluyendo líneas celulares de glioma T98G y U373, líneas celulares de cáncer de pulmón A549 y QG56, líneas celulares de cáncer renal Caki1 y ACHN, una líneas celulares de cáncer de cuello de útero SW756, una línea celular de cáncer de vejiga T24, una línea celular de cáncer esofágico KYSE180, líneas celulares de cáncer gástrico MNK28 y MNK45, una línea celular de cáncer colorrectal SW480, una línea celular de leucemia AML5, y una línea celular de linfoma de Ramos. Como resultado, el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 18,0 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 12 % o superior contra T98G (1,3 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 23,3 % y los anticuerpos del n.º 2 al n.º 6 mostraron una actividad del 16 %

45 o superior contra U373 (3 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 36,3 % y los anticuerpos del n.º 2 al n.º 6 mostraron una actividad del 24 % o superior contra A549 (2,6 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 33,0 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 20 % o superior contra QG56 (0,2 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 27,0 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 23 % o superior contra Caki1 (3,0 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 26,0 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 14 % o superior contra ACHN (1,5 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 29,7 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 16 % o superior contra SW756 (2,5 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 25,6 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 18 % o superior contra T24 (2,1 % en el caso del control de isotipo), el

55 anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 27,6 % y los anticuerpos n.º 2 a 6 mostraron una actividad del 22 % o superior contra KYSE180 (3,0 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 21,7 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 15 % o superior contra MNK28 (1,7 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 25,3 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 10 % o superior contra MNK45 (2,3 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 26.9 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 17 % o superior contra SW480 (1,3 % en el caso del control de isotipo), el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 13.1 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 10 % o superior contra AML5 (3,0 % en el caso del control de isotipo), y el anticuerpo n.º 1 mostró una actividad del 11.7 % y los anticuerpos n.º 2 a n.º 6 mostraron una actividad del 10 % o superior contra Ramos (4.1 % en el caso del control de isotipo). Los anteriores resultados demuestran que los

65 anticuerpos dirigidos contra CAPRIN1 así obtenidos (n.º 1, n.º 2, n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6) dañan diferentes células cancerosas humanas que expresan CAPRIN1.

(5) Efectos antitumorales (actividad CDC) de los anticuerpos dirigidos contra CAPRIN1 n.º 1, n.º 2, y n.º 3 sobre células cancerosas

5 A continuación, se evaluó la actividad citotóxica (actividad CDC) de los anticuerpos dirigidos contra CAPRIN1 n.º 1, n.º 2, y n.º 3 frente a diferentes células cancerosas humanas. La sangre extraída de un conejo se añadió a un tubo Eppendorf, se dejó reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos, y a continuación se sometió a 5 minutos de centrifugación a 3000 rpm. A continuación, se preparó el suero para medición de la actividad CDC. 105 células MDAMB231V de la línea de cáncer de mama humano se recogieron en un tubo de centrífuga de 50 ml, se añadieron 100 µCi de cromo 51, y a continuación la incubación se llevó a cabo a 37 ºC durante 2 horas. El resultante se lavó tres veces con medio RPMI que contenía FBS al 10 %. Posteriormente, las células se suspendieron en medio RPMI que contenía el suero de conejo anteriormente preparado (50 %), y a continuación se añadió a una placa de 96 pocillos con un fondo plano en V a 103 células por pocillo. 1 mg de cada uno de los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 obtenido en el Ejemplo 3 y (2) anterior se añadieran a las células cuando se cultivaron durante 4 horas a 37 ºC en condiciones

15 de5%deCO2. Tras el cultivo, se midió la cantidad de cromo51 liberado de las células tumorales dañadas en un sobrenadante del cultivo, y se calculó la actividad CDC de cada anticuerpo dirigido contra MDAMB231V. Como resultado, los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 mostraron aproximadamente un 30 % de actividad CDC. Por tanto, se reveló con n.º 1, n.º 2, and n.º 3 pueden dañar las células tumorales que expresan CAPRIN1 también mediante la actividad CDC.

(6) Afinidad de unión

Para calcular la constante de afinidad Ka a una molécula de CAPRIN1 del anticuerpo n.º 1 anterior, la proteína recombinante CAPRIN1 preparada en el Ejemplo 2 se ajustó para tener una concentración de 20 µg/ml con una 25 solución de Acetate 4.5 (GE), y a continuación se inmovilizó en una placa sensora CM5 (GE) de acuerdo con un método convencional; esto es, un método de inmovilización de acoplamiento de aminas usando un Amine Coupling Kit (GE). Como control de referencia (célula de referencia) se usó placa sensora con 20 µg/ml de albúmina derivada de suero de bovino inmovilizada a l mismo por el mismo método. Una placa sensora a la que se había inmovilizado la molécula CAPRIN1 se configuró en BIACORE 2000, 40 µl de cada una de las soluciones de anticuerpo (analito) preparada para tener una concentración (100, 80, 40, 20, 10, 5, o 2.5 µg/ml) se aplicaron a un caudal de 20 µl/minuto, se midió el ángulo de la resonancia de plasmón superficial en el momento de la unión del anticuerpo a la molécula CAPRIN1 inmovilizada sobre la placa sensora, por lo que se pudieron obtener todos los valores de UR (Unidad de resonancia). A continuación, se aplicó una solución de tampón de análisis HBSEP (GE), y a continuación se determinó el ángulo de resonancia tras la disociación del anticuerpo de la molécula CAPRIN1, y a

35 continuación se obtuvo el valor de UR en ese momento. Se aplicó análogamente una solución de anticuerpo a una placa sensora control de referencia (célula de referencia), se midieron el ángulo de resonancia en el momento de la reacción de inmovilización y el ángulo de resonancia en el momento de la reacción de disociación, y de esta forma se obtuvieron los valores de la UR del fondo. Antes de la aplicación del anticuerpo con cada concentración, se aplicó Glycine 2.0 (GE) para regenerar la placa sensora que tienen inmovilizado sobre la misma CAPRIN1 y albúmina derivada de suero de bovino. A continuación, la siguiente muestra se sometió a la medición. La constante de velocidad de asociación (kon) y la constante de velocidad de disociación (koff) se calcularon a partir de los valores de UR obtenidos para cada concentración de anticuerpos usando el programa informático de análisis de afinidad BIA evaluation, de forma que se calculó la constante de afinidad Ka(=kon/koff). Como resultado, la constante de afinidad Ka del anticuerpo n.º 1 fue de 4,6 x 107 M1 .

45 Ejemplo 5 Efectos antitumorales in vivo de los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 dirigidos contra CAPRIN1 en ratones

(1) Efectos antitumorales en ratones en los que se trasplantaron células tumorales de ratón

A continuación, se evaluaron los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 dirigidos contra CAPRIN1 obtenidos de esta manera para sus efectos antitumorales in vivo en ratones que soportan tumores. Los anticuerpos usados en el presente documento se prepararon mediante purificación en columna del sobrenadante del cultivo de dada célula productora del n.º 1, n.º 2, o n.º 3 de una manera similar a la anterior.

Se examinaron los efectos antitumorales de los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 utilizando ratones que soportan

55 tumores en los cuales se ha trasplantado una línea de células cancerosas derivada de ratón que expresa CAPRIN1. Se trasplantaron células 4T1 (adquiridas de la ATCC) por vía subcutánea a la región dorsal de 40 ratones Balb/c (Japan SLC Inc.) a 5x105 células (para un ratón). Se dejó que los tumores crecieran hasta alcanzar un tamaño de aproximadamente 5 mm de diámetro. Los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3 se administraron cada uno por vía intraperitoneal a 10 ratones de entre los 30 ratones que soportaban el tumor en una cantidad de 200 µg (en 200 µl) para un ratón. Posteriormente, la misma cantidad de cada anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a cada ratón que soporta el tumor 3 veces en un total de 2 días. Se midieron los tamaños tumorales cada día y se examinaron los efectos tumorales mediante observación. Mientras tanto, como grupo control, se administró PBS () en vez de los anticuerpos a los 10 ratones restantes que soportaban el tumor. Como resultado de la observación de los efectos antitumorales, en el grupo de ensayo al cual se ha administrado los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3

65 dirigidos contra CAPRIN1, cuando el volumen del tumor al inicio de la administración del anticuerpo se designó como que se encontró que 100 % de tumores habían retrocedido al 51 %, 84 %, y 93 %, en el día 4,

aproximadamente un 31 %, 56 % y 70 % en el día 6, y 9 %, 34 %, y 54 % en el día 8 y se encontró que los tumores habían retrocedido casi completamente antes de los días 10 a 14 (véase la Fig. 3). En el grupo del control al cual se había administrado PBS(), al tamaño del tumor aumentó hasta aproximadamente 230 %, 290 %, 470 % y 800 % en los días 4, 6, 8, y 11, respectivamente (véase la Fig. 3). Se demostró por los resultados que los anticuerpos n.º 1, n.

5 º 2, y n.º 3 obtenidos presentan fuertes efectos antitumorales in vivo contra las células cancerosas derivadas de ratón que expresan CAPRIN1. Se calculó el tamaño del tumor como un volumen utilizando la fórmula: longitud del eje mayor x longitud del eje menor x longitud del eje menor x 0,5.

(2) Efectos antitumorales sobre ratones a los cuales se trasplantaron células tumorales humanas

A continuación, se evaluaron los efectos antitumorales in vivo del anticuerpo n.º 1 dirigido contra CAPRIN1 en ratones que soportan el tumor. Se preparó el anticuerpo n.º 1 utilizado en el presente documento de una manera similar al anterior mediante purificación en columna de un sobrenadante del cultivo de células productoras del anticuerpo. Una línea ZR751 de células cancerosas derivada de ser humano (adquirida de la ATCC) que expresa

15 CAPRIN1 se trasplantó mediante las regiones en diez ratones Balb/cnu/nu de 5 semanas de edad (Japan SLC Inc.) a 107 células/ratón. Se inició la administración de anticuerpos en el día 4 después del trasplante de células. El anticuerpo n.º 1 se administró por vía intraperitoneal a cinco ratones que soportaban el tumor a 200 µg/ratón. Como un control de referencia, un anticuerpo control de la IgG humana (en una cantidad igual que la del anticuerpo n.º 1) se administró a los cinco ratones restantes que soportaban el tumor. En el día 3 después de la administración, cada anticuerpo se administró una vez, y a continuación se midieron los tamaños tumorales y de esta manera se observaron los efectos antitumorales. Como resultado, el volumen promedio del tumor en el caso del grupo al cual se había administrado el anticuerpo n.º 1, se encontró que había retrocedido al 66 % en el día 21 tras el trasplante de cáncer, cuando el volumen promedio del tumor del control de referencia se designó como 100 %.

25 A continuación, se evaluaron los efectos antitumorales in vivo del anticuerpo n.º 3 dirigido contra CAPRIN1 en ratones que soportan el tumor. Se preparó el anticuerpo n.º 3 utilizado en el presente documento de una manera similar al anterior mediante purificación en columna de un sobrenadante del cultivo de células productoras del anticuerpo. Una línea MCF7 de células cancerosas derivada de ser humano (adquirida de la ATCC) que expresa CAPRIN1 se trasplantó por vía subcutánea mediante las regiones en diez ratones Balb/cnu/nu de 5 semanas de edad (Japan SLC Inc.) a 106 células/ratón. Después que el diámetro de cada tumor alcanzara aproximadamente 7 mm, se inició la administración del anticuerpo. Se administró PBS() (en la misma cantidad que la del anticuerpo n.º 3) como un control de referencia para los cinco ratones restantes que soportan el tumor. Se midieron los tamaños de los tumores y a continuación se observaron los efectos antitumorales. Como resultado, el volumen promedio del tumor en el caso del grupo al cual se había administrado el anticuerpo n.º 3, se encontró que había retrocedido al

35 45 % en el día 26 tras el trasplante de cáncer, cuando el volumen promedio del tumor del control de referencia se designó como 100 %. Se demostró por los resultados que los anticuerpos n.º 1, y n.º 3 obtenidos de esta manera presentan fuertes efectos antitumorales in vivo sobre las células cancerosas derivadas de ser humano que expresan CAPRIN1.

Ejemplo 6 Identificación del epítopo de la proteína CAPRIN1, a la cual se unen los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6 contra CAPRIN1

Con el uso de los anticuerpos n.º 1, n.º 2, y n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6 dirigidos contra CAPRIN1 obtenidos en el Ejemplo 4 (2) que reaccionan con las superficies celulares de las células cancerosas, se identificó un epítopo

45 peptídico en una proteína CAPRIN1 que va ser reconocida por los anticuerpos. Se sintetizaron 93 péptidos candidatos, consistiendo cada uno en 12 a 16 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína CAPRIN

1. Se disolvió cada péptido en DMSO a una concentración de 1 mg/ml.

Se disolvió cada péptido en tampón carbonato de sodio 0,1 M (pH 9,6) a una concentración de 30 µg/ml, añadido a una placa de 96 pocillos (Nunc, Producto N.º 436006) a 100 µl por pocillo, y a continuación se dejó reposar a 4 ºC durante la noche. Se descartó la solución, se añadió etanolamina 10 mM/tampón carbonato de sodio 0,1 M (pH 9,6) a 200 µl por pocillo, y a continuación se dejó reposar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. Se descartó la solución, se lavó la placa dos veces con PBS (PBST) que contenía Tween 20 al 0,5 % de tal manera que se preparó la placa con cada péptido inmovilizado del anterior.

55 Se añadió un sobrenadante del cultivo celular que contenía el anticuerpo monoclonal quimérico de ser humanopollo (n.º 1) y los anticuerpos monoclonales (n.º 2, y n.º 3, n.º 4, n.º 5, y n.º 6) de ratón obtenidos en el Ejemplo 4 (2) se añadieron a la placa a 50 µl por pocillo. Después de 1 hora de agitar a temperatura ambiente, se retiró la solución, y a continuación, se lavó la placa tres veces con PBST. A continuación, un anticuerpo dirigido contra IgG humana marcado con HRP (Invitrogen) diluido 3000 a 4000 veces con PBST (una solución de anticuerpo secundario) se añadió a cada pocillo del anticuerpo monoclonal quimérico de ser humanopollo y un anticuerpo dirigido contra IgG de ratón marcado con HRP (Invitrogen) diluido 3000 a 4000 veces con PBST (una solución de anticuerpo secundario) se añadió a cada pocillo del anticuerpo monoclonal de ratón, a 50 µl por pocillo, y a continuación se retiró la solución, seguido por seis veces de lavado con PBST.

65 Se añadió una solución sustrato de TMB (Thermo) a 100 µl por pocillo, y la placa se dejó reposar durante 15 a 30

Claims

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