BR112012003686B1

BR112012003686B1 - Anticorpos monoclonais, seu uso para detecção de complexos de integrina em material ffpe, e polinucleotídeo

Info

Publication number: BR112012003686B1
Application number: BR112012003686-6A
Authority: BR
Inventors: Simon Goodman; Claudia Wilm; Francesc Mitjans
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2021-09-21
Also published as: KR101606236B1; ES2622487T3; CA2771441A1; JP2013502205A; US20130203079A1; CN102597001A; EP2467401A2; AU2010285265A2; ZA201201990B; IL218119A; HK1173455A1; BR112012003686A2; SG178348A1; WO2011020529A8; JP5734978B2; AU2010285265B2; AU2010285265A1; EA201200281A1; CA2771441C; US20120171699A1

Abstract

anticorpos para detecção de complexos de integrina em material ffpe. a presente invenção refere-se a anticorpos que são capazes de ligação ao domínio extracelular de integrina. outro objeto da invenção relaciona-se ao uso dos ditos anticorpos para detectar integrinas no tecido embebido em parafina e fixado em formalina (ffpe) arquivado. a invenção também se relaciona a métodos para preparação de anticorpos monoclonais de coelho, em que o imunógeno é um domínio extracelular de integrina recombinante derivado da cultura de expressão de inseto, e outro método para rastreamento de anticorpos anti-integrina que discriminam entre homólogos de integrina muito próximos e que são especialmente adequados para imunohistoquímica no material ffpe.

Description

[0001] A presente invenção se refere a anticorpos que são capazes de se ligar ao domínio extracelular de integrina. Outro objeto da invenção relaciona-se ao uso dos ditos anticorpos para detectar integrinas em tecido embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE) arquivado. A invenção também se relaciona a métodos para preparação de anticorpos monoclonais de coelho, em que o imunógeno é um domínio extracelular de integrina recombinante derivado da cultura de expressão de inseto, e outro método para rastreamento de anticorpos anti-integrina que discriminam entre homólogos de integrina muito próximos e que são especialmente adequados para imunohistoquímica em material FFPE.

[0002] As integrinas são uma família de moléculas de adesão celular compostas de duas cadeias não covalentemente associadas. A estrutura de multidomínio complexa de integrinas é sensível à modulação sutil. As integrinas são reguladas em muitos níveis, incluindo tradução e transcrição, glicosilação pós-tradução, entrega na superfície celular, ativação de superfície celular por estímulo intracelular e ativação de superfície celular por estímulo extracelular. Tanto cadeias alfa como beta são proteínas de transmembrana de classe I, que cruzam a membrana e integram a matriz extracelular ao compartimento intracelular, dessa forma fornecendo uma via para os sinais que enfim conduzem ao controle de adesão, proliferação, sobrevivência, migração e invasão.

[0003] As integrinas são alvos terapêuticos em muitas patologias humanas. Por exemplo, em câncer, as integrinas de série alfa-v (αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 e αvβ8) estão envolvidas diferentemente em angiogênese, protegendo células tumorais de quimio- e radioterapia, sobrevivência tumoral e supressão imune local. α5β1 e α4β1 estão também envolvidas em angiogênese, enquanto α2β1 e α6β4 têm sido envolvidas em proliferação tumoral. Superexpressão de αvβ3 correlaciona-se com a fase invasiva do melanoma humano, e tanto αvβ3 como αvβ5 são especificamente reguladas para cima no endotélio tumor-invasivo, onde parecem regular as funções de fatores de crescimento angiogênicos na superfície endotelial. O modelo de expressão exato das integrinas é altamente variável tanto entre e dentro de uma dada classe de tumores como reflete a biologia funcional. Por isso, são também biomarcadores do status tumoral, e o modelo de expressão é prognóstico para o resultado e pode definir oportunidades terapêuticas.

[0004] O anticorpo monoclonal DI-17E6 direcionado contra a cadeia de αv-integrina, e cilengitida, um pentapeptídeo ciclizado contendo RGD, que inibe integrinas αvβ3 e αvβ5 está em desenvolvimento clínico. Entretanto, o potencial terapêutico completo de terapias que visam integrinas ainda tem que ser alcançado, em parte porque há um quadro notavelmente incompleto dos modelos de expressão de integrina em condições patológicas. Caracterização patológica da distribuição de integrina dependia de estudos de tecidos congelados frescos. A ligação de célula viva para marcação a frio é bem estabelecida, e os tecidos congelados são substratos excelentes para marcação de integrina, mas seu nível da preservação e fidelidade ultraestrutural é muito mais baixo do que aquela rotina no material FFPE. Isto pode afetar criticamente as interpretações da marcação no tecido complexo. Além disso, a prática clínica regular, e bancos de tecido geralmente e comercialmente disponíveis, fornecem o material FFPE: obter material clínico congelado é um desafio logístico e, muitas vezes, clínico e cultural, ou simplesmente uma impossibilidade quando se trata de certos tumores e com amostras clínicas raras e preciosas.

[0005] É devido às necessidades conflitantes da histologia clássica e da estrutura das integrinas que a detecção inequívoca de integrina no material FFPE é evitada na técnica anterior. A histologia necessita de preservação morfológica excelente e robusta de estruturas de tecido, envolvendo uma interligação, infiltração e estabilização extensa de tecidos hidrofílicos moles por reagentes insolubilizantes hidrofóbicos, tais como solução de formaldeído, álcoois graduados e cera de parafina, opcionalmente junto com o impacto térmico. É conhecido que a fixação e a embebição, especialmente como praticada em laboratórios de histologia clínica pode esconder ou até destruir epítopos. As condições não nativas resultam em integrinas que não são nem extraídas nem degradadas, mas principalmente oclusas. Os heterodímeros de integrina conformacionalmente ativos forçados são sensíveis a tal modificação conformacional, e não podem ser prontamente recuperados da oclusão como a que ocorre durante os procedimentos FFPE.

[0006] Uma vez que as químicas envolvidas em fixação de tecido e embebição afetam seriamente a estrutura de integrina, os anticorpos monoclonais disponíveis definitivos usados por versados no campo não reconhecem com confiança em integrinas após processamento FFPE. Os anticorpos que reconhecem domínios citoplasmáticos de integrina são necessariamente restringidos a cadeias de integrina única, levando a modelos de marcação ambíguos no material FFPE uma vez que não relatam a distribuição de heterodímeros de integrina intactos. Além disso, tais anticorpos, que são direcionados contra epítopos de peptídeo curto, tendem a ter conformação independente, que leva à detecção de cadeias únicas ou produtos de degradação, e uma especificidade e afinidade mais baixa do que anticorpos que detectariam complexos de integrina intactos.

[0007] Vários anticorpos monoclonais de camundongo, tais como anticorpo monoclonal de camundongo anti-integrina avβ3 LM609, detectam integrinas αvβ3 e αvβ5 usando FACS ou tecido congelado, entretanto, não mostram marcação significante ou reprodutível de seus epítopos no material FFPE. As deficiências de monoclonais murinos em seu reconhecimento de epítopo restringido e baixa afinidade são largamente reconhecidas. Os modelos de distribuição vistos quando tais anticorpos são usados no material FFPE divergem dos modelos observados no material crioseccionado congelado fresco; enquanto estes últimos perfis de expressão estritamente combinam com aqueles de células viáveis isoladas de tais tecidos. Marcação FFPE com tais anticorpos deve ser examinada uma vez que a proveniência duvidosa, e uma tecnologia na recuperação de antígeno tem que crescer para recuperar tais determinantes do material FFPE.

[0008] No momento, nenhum anticorpo monoclonal está disponível que reconhece robustamente epítopos extracelulares de αvβ3 ou αvβ5 no tecido FFPE, permitindo a caracterização de integrinas no tecido FFPE tumoral de paciente. O resultado final desta situação consiste em que décadas de espécimes patológicos não podem ser analisados para os perfis de expressão de integrina que poderiam revelar populações de pacientes que podem se beneficiar de terapias que visam integrinas. Na paisagem terapêutica emergente, tal déficit pode significar que a terapêutica eficaz tragicamente nunca alcançou os necessitados.

[0009] Por isso, o problema técnico que forma a base da presente invenção é fornecer anticorpos, que permitam detecção confiável e inequívoca de complexos de integrina no material FFPE, especialmente em biópsias FFPE tumorais de rotina. É outro problema fornecer um método para rastreamento de anticorpos anti-integrina, que exibem um comportamento discriminatório eficaz entre homólogos de integrina durante a imuno-histoquímica no material FFPE.

[00010] A presente invenção resolve o primeiro problema fornecendo um anticorpo compreendendo uma ou mais cadeias leves e/ou cadeias pesadas, cada uma das cadeias compreendendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de origem de coelho e opcionalmente regiões conservadas (FRs) em regiões variáveis das cadeias leves (VL) e/ou pesadas (VH), em que o anticorpo tem a capacidade de se ligar a um domínio extracelular ou intracelular de integrina. Em outras palavras, o anticorpo compreende pelo menos uma região variável da cadeia leve (VL) e/ou pelo menos uma região variável da cadeia pesada (VH), cada uma das regiões compreendendo pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de origem de coelho e opcionalmente uma ou mais regiões conservadas (FRs), em que o anticorpo tem a capacidade de ligação a um domínio extracelular ou intracelular da integrina.

[00011] Em mais detalhes, a presente invenção resolve o primeiro problema fornecendo um anticorpo monoclonal de coelho, ou um fragmento do mesmo, tanto contra integrina com o modelo de glicosilação derivado de inseto como contra integrina com qualquer outro modelo de glicosilação eucariótico, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região variável da cadeia pesada (VH), em que o anticorpo tem especificidade de ligação a antígeno de um epítopo não ocluso de um domínio extracelular de integrina, domínio da cadeia extracelular de integrina ou domínio intracelular da cadeia de integrina, e em que o anticorpo é capaz de ligar a heterodímeros intactos da integrina em material embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE) e em uma forma isolada em ELISA e/ou em um estado nativo em células viáveis com substancialmente a mesma especificidade.

[00012] Foi surpreendentemente demonstrado pelos inventores que os anticorpos FFPE-capazes podem ser prontamente gerados usando o domínio extracelular ou intracelular de integrinas ou cadeias de integrina como imunógeno em coelhos. Os melhores resultados são obtidos com o domínio intacto, que pode ser favoravelmente expresso recombinantemente. Especialmente, os domínios de integrina heterodiméricos extracelulares foram provados serem imunógenos eficazes se preparados em células de inseto. O fornecimento de imunógenos de integrina truncados de acordo com a invenção significativamente aumenta a aceitabilidade de epítopos e resulta em anticorpos de sensibilidade seletiva e especificidade ao antígeno. Os anticorpos monoclonais de coelho ligam-se ao antígeno seletivamente, mas independentemente do modelo de glicosilação. Mesmo embora os anticorpos ativos da invenção sejam originados contra proteínas recombinantes derivadas de inseto, são multifuncionais em termos do modelo de glicosilação antigênico e por isso, são considerados como adequados para o reconhecimento de um antígeno recombinante derivado de inseto, mas sem ser limitados a este modelo. Os anticorpos da invenção são bem ajustados para reconhecer o domínio extracelular de uma integrina específica ou partes da mesma de qualquer modelo de glicosilação eucariótico. Deve ser entendido que os modelos de glicosilação não são misturados, mas derivados de uma célula ou organismo eucariótico distintos, respectivamente. Ao fazê-lo, os anticorpos gerados são especialmente capazes de reconhecer a estrutura alvo dentro de uma matriz FFPE complexa. Os inventores mostraram adequabilidade inesperada destes anticorpos para detecção de integrina no tecido FFPE. A conveniência é demonstrada já que os anticorpos resultantes são intensivamente específicos e ativos no material FFPE. É um efeito esmagador que os complexos de integrina no material FFPE possam ser facilmente detectados pelo anticorpo da invenção. Enquanto os anticorpos monoclonais clássicos não agem no material FFPE, os anticorpos da invenção substancialmente se ligam a seus antígenos no material FFPE e em células viáveis com a mesma especificidade; o último é provado sem limitações na citometria de fluxo de células vivas (por exemplo, sorteamento celular ativado por fluorescência, resumidamente FACS). Os anticorpos da invenção também podem se ligar substancialmente a seus antígenos no material FFPE e em uma forma isolada em ELISA com a mesma especificidade; o último é provado sem limitações em ELISAs padrão como descrito no decorrer do presente relatório descritivo e detalhado no exemplo 3.3. O modelo de marcação no tecido FFPE alcançado por meio deste é de vantagem clara sobre os resultados ambíguos necessariamente obtidos de anticorpos da técnica anterior.

[00013] Até agora, as composições de pelo menos 24 complexos de integrina foram descritas. As integrinas são uma família de moléculas de adesão celular compostas de duas cadeias não covalentemente associadas. Ambas as subunidades, alfa (α) e beta (β), atravessam a membrana e integram a matriz extracelular ao compartimento intracelular, para entregar aqueles sinais extracelulares que controlam adesão, proliferação, migração e invasão celular. Baseado na respectiva composição, os domínios extracelulares e intracelulares de integrina são destinados e conhecidos e podem ser preparados por processos convencionais. Um domínio de origem natural é isolado de uma amostra biológica ou o domínio é recombinantemente expresso e purificado após isso. Particularmente, a amostra é tomada in-vivo de um mamífero para ser analisada para o modelo de distribuição de integrina. A retirada da amostra deve seguir a boa prática médica. Amostras biológicas podem ser tomadas de qualquer tipo de espécies biológicas que têm uma integrina de interesse, mas a amostra é especialmente tomada de um animal de laboratório ou um humano, mais preferencialmente um rato, camundongo, coelho ou humano. O processamento a jusante da integrina é conduzido por qualquer processo conhecido na técnica e seguido por divisão de domínio e separação do domínio extracelular ou intracelular. A lise celular pode ser realizada em tampões de lise adequados, bem conhecidos, que podem causar um choque osmótico e perfurar a membrana celular. A estabilidade da estrutura celular também pode ser destruída por forças mecânicas, tais como moinho de bola, prensa francesa, ultrassônica, etc., por degradação enzimática de parede celular e membrana celular, respectivamente, e/ou pela ação de tensídeos. As integrinas podem ser ainda purificadas para remover substâncias perturbadoras, ou as integrinas podem ser concentradas na amostra. Processamento e/ou concentração a jusante são preferencialmente realizados por método de precipitação, diálise, filtração em gel, eluição em gel ou cromatografia, tal como HPLC ou cromatografia de troca iônica. Recomenda-se combinar vários métodos para melhores rendimentos.

[00014] Preferencialmente, o domínio extracelular de integrina é recombinantemente expresso e purificado. DNA que codifica a sequência proteica pode ser obtido, amplificado, opcionalmente alterado ou sintetizado com técnicas conhecidas pelo versado. DNA pode ser introduzido em um vetor e transcrito e traduzido em células. O domínio pode ser fusionado com uma marcação para cromatografia por afinidade, tal como marcação com Strep, marcação com His, marcação com GST, marcação com Arg ou proteína de ligação a calmodulina, ou purificada usando técnicas estabelecidas de purificação por afinidade de anticorpo. Uma coluna é carregada com a suspensão proteica e todos os componentes sem marcação são imediatamente eluídos. Após a remoção de ligantes não específicos por etapas de lavagem, o construto fusionado por marcação é removido da coluna. Se a marcação afetar a indução de anticorpos, é clivada de antes da imunização.

[00015] Vários sistemas de expressão são estado de arte. De maneira interessante, o título contra os elementos proteicos do imunógeno pode ser vantajosamente aumentado se os domínios recombinantes de integrina derivado de inseto forem aplicados. Glicoproteínas recombinantes mamíferas derivadas de inseto são glicosiladas incompletamente, e necessitam de processamento e extensão de açúcar terminal, que significa que os epítopos proteicos são altamente expostos em comparação com proteínas não recombinantes ou proteínas recombinantes para expressão eucariótica convencional. É preferencial, por isso, que o domínio imunogênico de integrina tenha um modelo de glicosilação derivado de inseto, preferencialmente o domínio extracelular. Além disso, as propriedades antigênicas de provocar ou aumentar uma resposta imune podem ser afetadas ligando o antígeno a um veículo grande, tal como uma proteína ou polissacarídeo; o veículo pode ser aquele que não provoca uma resposta imune por si mesmo.

[00016] É uma modalidade preferencial que o domínio de integrina tenha uma estrutura primária humana, isto é, a sequência de aminoácidos alinha-se a uma entrada humana em correspondência com bancos de dados, tais como o número de acesso do banco de dados de sequências Swiis-Prot. O versado sabe que tais bancos de dados de biologia molecular a fim de extrair sequências a serem aplicadas neste pedido. Em uma modalidade mais preferencial da presente invenção, o domínio extracelular de integrina tem uma estrutura primária humana e um modelo de glicosilação de inseto.

[00017] O anticorpo inventivo denota um polipeptídeo codificado por um gene de imunoglobulina, ou fragmentos do mesmo. O anticorpo compreende pelo menos uma cadeia leve e/ou pelo menos uma cadeia pesada, preferencialmente pelo menos uma cadeia leve e pelo menos uma cadeia pesada, mais preferencialmente duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, cada uma delas como definidas abaixo. Isto significa, a cadeia leve compreende pelo menos uma CDR única, particularmente de origem de coelho, na dita região variável da cadeia leve (VL) e opcionalmente pelo menos uma FR única da dita região variável da cadeia leve (VL), preferencialmente pelo menos dita CDR e pelo menos a dita FR. A cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR única, particularmente de origem de coelho, na dita região variável da cadeia pesada (VH) e/ou pelo menos uma FR única na dita região variável da cadeia pesada (VH), preferencialmente pelo menos a dita CDR e pelo menos a dita FR. Dentro da porção de ligação a antígeno de um anticorpo, as CDRs diretamente interagem com o epítopo do antígeno enquanto as FRs mantêm a estrutura terciária do parátopo. Tanto na cadeia leve como na cadeia pesada de imunoglobulinas, há três a quatro regiões conservadas (FR-1 até FR- 4) separadas respectivamente por três regiões de determinação de complementaridade (CDR-1 até CDR-3). As CDRs ou regiões hipervariáveis, em particular regiões CDR-3, mais particularmente CDR-3 da cadeia pesada, são basicamente responsáveis por afinidade e especificidade de anticorpo.

[00018] Em outra modalidade preferencial da invenção, a região variável da cadeia leve (VL) compreende duas CDRs, mais preferencialmente três CDRs, ainda mais preferencialmente em conjunto com o mesmo número de FRs ou até uma FR a mais. Ainda em outra modalidade preferencial da invenção, a região variável da cadeia pesada (VH) compreende duas CDRs, mais preferencialmente três CDRs, ainda mais preferencialmente em conjunto com o mesmo número de FRs ou até uma FR a mais. Em outra modalidade mais preferencial, o anticorpo da invenção compreende a região variável da cadeia leve (VL) e a região variável da cadeia pesada (VH), cada uma das regiões compreende duas CDRs, ainda mais preferencialmente três CDRs, altamente preferencialmente junto com o mesmo número de FRs ou até uma FR a mais.

[00019] Em outras palavras, o anticorpo da invenção deve compreender pelo menos que estrutura mínima de uma região variável de uma cadeia única, que confere a capacidade de ligação a qualquer domínio de integrina ou especialmente, o domínio extracelular, respectivamente. De acordo com a invenção, o anticorpo também pode estar presente como diversos outros fragmentos bem caracterizados de uma imunoglobulina ou mesmo que uma imunoglobulina intacta contanto que a estrutura mínima acima seja dada. Os fragmentos são preferencialmente selecionados a partir do grupo compreendendo a cadeia pesada (H), cadeia leve (L), regiões variáveis (V), fragmento variável de cadeia única (scFv), fragmentos Fab consistindo de uma cadeia leve de anticorpo covalentemente ligada e uma porção da cadeia pesada (Fd) do anticorpo e similares.

[00020] A cadeia leve do anticorpo pode compreender adicionalmente uma região constante da cadeia leve (CL). Similarmente, a cadeia pesada do anticorpo pode compreender adicionalmente uma região constante da cadeia pesada (CH), ou porção da mesma, em que a porção especialmente se refere à região constante dentro da região Fd. O fragmento Fd é o determinante principal da especificidade de anticorpo e conserva a capacidade de ligação a epítopo em isolamento. O anticorpo da invenção também pode ser completado pelo fragmento Fc como o efetor da cascata de complemento, que não está envolvido na ligação a antígeno. Fragmentos, tais como fragmentos Fab e Fc, podem ser produzidos por clivagem usando várias peptidases. Além disso, fragmentos podem ser engendrados e recombinantemente expressos, preferencialmente scFv.

[00021] No escopo da invenção, o anticorpo pode ser de origem policlonal ou monoclonal. Anticorpos policlonais são produzidos normalmente em organismos mamíferos quando uma resposta imune é causada por antígenos que são estranhos ao organismo e têm um peso molecular que excede 3.000 g/mol. Preferencialmente, os anticorpos da invenção são monoclonais. As grandes vantagens de anticorpos monoclonais incluem uma fonte imortal de reagentes, propriedades estáveis de anticorpo e especificidade exata. Técnicas populares para produção de anticorpos monoclonais, tais como a tecnologia de hibridoma, são também bem conhecidas pelo versado.

[00022] Espécies de hospedeiro favoráveis para produção de anticorpo policlonal e/ou monoclonal compreendem rato, cabra, coelho e camundongo, mais preferencialmente coelho. Os anticorpos de coelho, mais preferencialmente anticorpos monoclonais de coelho (RabMabs), exibem afinidade mais alta junto com uma mais ampla faixa de reconhecimento de epítopo do que monoclonais de camundongo, enquanto devido à divergência nos sistemas imunes, e CDRs extensas, as respostas mais fortes a epítopos, preferencialmente epítopos humanos, podem ser produzidas em comparação com respostas murinas. Deve ser entendido que os anticorpos quiméricos podem ser geneticamente engendrados, que CDRs, FRs e/ou regiões constantes sejam derivadas de fontes mamíferas diferentes contanto que uma ou mais CDRs tenham uma fonte de coelho. Consequentemente, os anticorpos quiméricos podem ser obtidos pela substituição de não somente CDR mas regiões variáveis inteiras das cadeias leves e pesadas de origem não coelho. A afinidade dos sítios de ligação a antígeno pode estar alternativamente sob o efeito da troca seletiva de alguns aminoácidos dentro das regiões variáveis.

[00023] O principal básico para produção de anticorpos monoclonais de coelho foi quanto a monoclonais de camundongo. Após imunização de coelhos, o baço é tomado daqueles coelhos que produzem soro policlonal. As células B de coelho isoladas dos coelhos imunizados são fusionadas com uma linhagem celular de plasmocitoma de coelho para produzir hibridomas estáveis. As células de hibridoma são testadas para a secreção de anticorpos, que são específicos para o imunógeno, e podem ser posteriormente clonados. O estabelecimento original da linhagem celular de parceiro de fusão de hibridomas de coelho é descrito por Spieker-Polet et al., PNAS USA 1995, 92 (20): 9348-9352. Desenvolvimentos adicionais da linhagem celular de parceiro de fusão são revelados em US 7.429.487 B2. Métodos ainda adicionais são publicados nos Pedidos de Patente Americana Nos. 10/705.109; 10/266.387; 10/313.881; 10/350.841 e 11/476.277. O cDNA de insertos que codificam o anticorpo é preferencialmente clonado, sequenciado e inserido em um vetor de expressão para permitir a produção de anticorpos inteiramente definidos. O versado conhece técnicas adequadas para a produção recombinante de anticorpos, tal como no sistema de expressão celular EBNA de acordo com o Pham et al., Biotech Bioeng 2003, 84 (3): 332342. As ditas publicações são incorporadas por referência no conjunto na revelação da invenção.

[00024] O anticorpo ou um fragmento do mesmo são particularmente direcionados contra o domínio extracelular de integrina αvβ3, αvβ5, αvβ6 ou αvβ8.

[00025] Em uma modalidade especial preferencial da presente invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é direcionado contra o domínio extracelular de integrina αvβ3. CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3), e/ou as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH- αvβ3). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3), e/ou as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) e SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3). Mais preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3), e as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) e SEQ ID NO: 86 (CDR -3-VH-αvβ3).

[00026] Ainda se referindo ao contexto de anticorpo anti-αvβ3, FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3), e/ou FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 (FR-1- VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH- αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3). Preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3), e/ou as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR- 2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) e SEQ ID NO: 94 (FR-4- VH-αvβ3). Mais preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR- 3-VH-αvβ3) e SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3).

[00027] É outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ3, no qual as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3), e FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3), e as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR- 2-VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3).

[00028] É ainda outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ3, no qual as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3), e FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3). Preferencialmente, as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) e SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR- 2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) e SEQ ID NO: 94 (FR-4- VH-αvβ3).

[00029] Em outra modalidade preferencial no contexto de anticorpo anti-αvβ3, VL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 95 (VL-αvβ3) e/ou VH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 96 (VH-αvβ3), mais preferencialmente VL consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 95 (VL-αvβ3) e/ou VH consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 96 (VH- αvβ3), ainda mais preferencialmente o anticorpo é formado como scFv anti-αvβ3.

[00030] O anticorpo anti-αvβ3 pode ser completado por regiões constantes da cadeia leve (CL) e/ou pesada (CH). Preferencialmente, CL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 97 (CL-αvβ3) e/ou CH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 98 (CH-αvβ3).

[00031] Consequentemente, anticorpo anti-αvβ3 compreende mais preferencialmente cadeias leves e/ou pesadas, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 (L- αvβ3) e/ou a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3). Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) e/ou a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 (H- αvβ3). Em uma modalidade altamente preferencial da presente invenção, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) e a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3).

[00032] Em outra modalidade especial preferencial da presente invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é direcionado contra o domínio extracelular de integrina αvβ5. CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5), e/ou as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR- 2-VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5), e/ou as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (CDR- 1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) e SEQ ID NO: 6 (CDR-3- VH-αvβ5). Mais preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5), e as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) e SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5).

[00033] Ainda se referindo ao contexto do anticorpo anti-αvβ5, FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5), e/ou FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (FR-1- VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH- αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5). Preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 9 (FR-3- VL-αvβ5), e/ou as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR- 2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) e SEQ ID NO: 14 (FR-4- VH-αvβ5). Mais preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (FR- 1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH- αvβ5) e SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5).

[00034] É outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ5, no qual as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5), e FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (CDR- 1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 3 (CDR-3- VL-αvβ5), e as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2- VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5).

[00035] É ainda outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ5, no qual as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (CDR- 1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5), e FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5). Preferencialmente, as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) e SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) e SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5).

[00036] Em outra modalidade preferencial no contexto de anticorpo anti-αvβ5, VL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (VL-αvβ5) e/ou VH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (VH-αvβ5), mais preferencialmente VL consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 (VL-αvβ5) e/ou VH consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 (VH- αvβ5), ainda mais preferencialmente o anticorpo é formado como scFv anti-αvβ5.

[00037] O anticorpo anti-αvβ5 pode ser completado por regiões constantes da cadeia leve (CL) e/ou pesada (CH). Preferencialmente, CL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 (CL-αvβ5) e/ou CH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 (CH-αvβ5).

[00038] Consequentemente, o anticorpo anti-αvβ5 compreende mais preferencialmente cadeias leves e/ou pesadas, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) e/ou a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5). Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) e/ou a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 (H- αvβ5). Em uma modalidade altamente preferencial da presente invenção, a cadeia leve consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) e a cadeia pesada consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5).

[00039] Ainda em outra modalidade especial preferencial da presente invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é direcionado contra o domínio extracelular de integrina αvβ6. CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6), e/ou as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6), e/ou as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) e SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH- αvβ6). Mais preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL- αvβ6), e as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) e SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6).

[00040] Ainda se referindo ao contexto do anticorpo anti-αvβ6, FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6), e/ou FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (FR-1- VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3- VH-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6). Preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6), e/ou as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) e SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6). Mais preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) e SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6).

[00041] É outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ6, no qual as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL- αvβ6), e FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6), e as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6).

[00042] É ainda outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ6, no qual as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6), e FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6). Preferencialmente, as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) e SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) e SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6).

[00043] Em outra modalidade preferencial no contexto de anticorpo anti-αvβ6, VL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 (VL-αvβ6) e/ou VH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 136 (VH-αvβ6), mais preferencialmente VL consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 135 (VL- αvβ6) e/ou VH consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 136 (VH-αvβ6), ainda mais preferencialmente o anticorpo é formado como anti- scFv αvβ6.

[00044] O anticorpo anti-αvβ6 pode ser completado por regiões constantes da cadeia leve (CL) e/ou pesada (CH). Preferencialmente, CL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 137 (CL-αvβ6) e/ou CH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 138 (CH-αvβ6).

[00045] Consequentemente, o anticorpo anti-αvβ6 compreende mais preferencialmente cadeias leves e/ou pesadas, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) e/ou a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6). Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) e/ou a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 140 (H- αvβ6). Em uma modalidade altamente preferencial da presente invenção, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) e a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6).

[00046] Ainda em outra modalidade especial preferencial da presente invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é direcionado contra o domínio extracelular de integrina αvβ8. CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8), e/ou as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8), e/ou as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) e SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH- αvβ8). Mais preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL- αvβ8), e as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) e SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8).

[00047] Ainda se referindo ao contexto do anticorpo anti-αvβ8, FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8), e/ou FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 171 (FR-1- VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3- VH-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8). Preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8), e/ou as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) e SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8). Mais preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) e SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8).

[00048] É outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ8, no qual as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL- αvβ8), e FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8), e as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8).

[00049] É ainda outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αvβ8, no qual as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8), e FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8). Preferencialmente, as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) e SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) e SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8).

[00050] Em outra modalidade preferencial no contexto de anticorpo anti-αvβ8, VL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175 (VL-αvβ8) e/ou VH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 176 (VH-αvβ8), mais preferencialmente VL consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 175 (VL- αvβ8) e/ou VH consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 176 (VH-αvβ8), ainda mais preferencialmente o anticorpo é formado como scFv anti-αvβ8.

[00051] O anticorpo anti-αvβ8 pode ser completado por regiões constantes da cadeia leve (CL) e/ou pesada (CH). Preferencialmente, CL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 177 (CL-αvβ8) e/ou CH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 178 (CH-αvβ8).

[00052] Consequentemente, o anticorpo anti-αvβ8 compreende mais preferencialmente cadeias leves e/ou pesadas, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) e/ou a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8). Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) e/ou a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 180 (H- αvβ8). Em uma modalidade altamente preferencial da presente invenção, a cadeia leve consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) e a cadeia pesada consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8).

[00053] Ainda em outra modalidade especial preferencial da presente invenção, o anticorpo ou um fragmento do mesmo é direcionado contra o domínio extracelular de integrina αv. CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) e/ou SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv), e/ou as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) e/ou SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) e SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv), e/ou as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) e SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv). Mais preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) e SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv), e as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) e SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv).

[00054] Ainda se referindo ao contexto do anticorpo anti-αv, FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) e/ou SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv), e/ou FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 (FR-1- VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) e/ou SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv). Preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) e SEQ ID NO: 209 (FR-3- VL-αv), e/ou as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) e SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv). Mais preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR- 2-VL-αv) e SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 (FR-1- VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) e SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv).

[00055] Em outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αv, no qual as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) e/ou SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv), e FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) e/ou SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) e SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv), e as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR- 2-VL-αv) e SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv).

[00056] Em ainda outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-αv, no qual as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) e/ou SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv), e FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) e/ou SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv). Preferencialmente, as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) e SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 211 (FR-1- VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) e SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv).

[00057] Em outra modalidade preferencial no contexto de anticorpo anti-αv, VL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 215 (VL-αv) e/ou VH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 216 (VH-αv), mais preferencialmente VL consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 215 (VL-αv) e/ou VH consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 216 (VH- αv), ainda mais preferencialmente o anticorpo é formado como scFv anti-αv.

[00058] O anticorpo anti-αv pode ser completado por regiões constantes da cadeia leve (CL) e/ou pesada (CH). Preferencialmente, CL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 217 (CL-αv) e/ou CH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 218 (CH-αv).

[00059] Consequentemente, o anticorpo anti-αv compreende mais preferencialmente cadeias leves e/ou pesadas, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 219 (L- αv) e/ou a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 220 (H-αv). Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 219 (L-αv) e/ou a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 220 (H-αv). Em uma modalidade altamente preferencial da presente invenção, a cadeia leve consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 219 (L-αv) e a cadeia pesada consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 220 (H-αv).

[00060] Em outra modalidade da presente invenção, domínios citoplasmáticos de integrina são usados como imunógeno primário. Os ditos domínios citoplasmáticos também são referidos como domínios intracelulares. São especialmente expressos como proteínas de fusão N-terminal. O parceiro de fusão pode ser variado (por exemplo, GST, MBP, KLH, etc.) para permitir o rastreamento diferencial descrito abaixo, ou rastreamentos primários e secundários podem ser excluídos, indo diretamente para o rastreamento terciário em arranjos de linhagem celular. A conformação dos domínios citoplasmáticos é menos definida do que aquela dos domínios extracelulares, e é relativamente independente da cadeia pareada, isto é um anticorpo direcionado contra β3, por exemplo, reconhecerá β3 associado tanto αvβ3 como αiibβ3. Isto é efetivamente uma redução da especificidade em anticorpos direcionados contra o complexo DTM-αvβ3, que pode ser rastreado para obter anticorpos que reconhecem β3 somente quando está em parceria com αv. Considerações similares solicitam anticorpos gerados contra αvβ5. A vantagem é, entretanto, que domínios citoplasmáticos de integrina são inteiramente conservados através mamíferos e por isso, ampla reatividade de cruzamento de espécies pode ser feita.

[00061] Em particular, o anticorpo ou um fragmento do mesmo são direcionados contra o domínio citoplasmático da cadeia β3 de integrina. É uma modalidade especial de tal anticorpo anti-β3, que as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) e/ou SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3), e/ou as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) e/ou SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) e SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3), e/ou as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) e SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3). Mais preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) e SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3), e as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR- 2-VH-β3) e SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3).

[00062] Ainda se referindo ao contexto do anticorpo anti-β3, FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) e/ou SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3), e/ou FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) e/ou SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3). Preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) e SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3), e/ou as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (FR- 1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) e SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3). Mais preferencialmente, as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 (FR- 1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) e SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) e SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3).

[00063] Em outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-β3, no qual as CDRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) e/ou SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3), e FRs adequadas em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) e/ou SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3). Preferencialmente, as CDRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) e SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3), e as FRs em VL compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2- VL-β3) e SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3).

[00064] É ainda outra modalidade combinatória no contexto de anticorpo anti-β3, no qual as CDRs adequadas em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) e/ou SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3), e FRs adequadas em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) e/ou SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3). Preferencialmente, as CDRs em VH compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR- 2-VH-β3) e SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3), e as FRs em VH compreendem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51 (FR-1- VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) e SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3).

[00065] Em outra modalidade preferencial no contexto de anticorpo anti-β3, VL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 (VL-β3) e/ou VH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 (VH-β3), mais preferencialmente VL consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55 (VL-β3) e/ou VH consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 (VH-β3), ainda mais preferencialmente o anticorpo é formado como β anti 3 scFv.

[00066] O anticorpo anti-β3 pode ser completado por regiões constantes da cadeia leve (CL) e/ou pesada (CH). Preferencialmente, CL compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 (CL-β3) e/ou CH compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58 (CH-β3).

[00067] Consequentemente, o anticorpo anti-β3 compreende mais preferencialmente cadeias leves e/ou pesadas, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (L-β3) e/ou a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 (H-β3). Ainda mais preferencialmente, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (L-β3) e/ou a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 (H-β3). Em uma modalidade altamente preferencial da presente invenção, a cadeia leve consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (L-β3) e a cadeia pesada consiste de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60 (H-β3).

[00068] Deve ser entendido que as combinações de CDRs, FRs, VL, VH, C, L e/ou H não estão esgotadas como detalhado abaixo, mas os ditos componentes podem ser combinados de qualquer outra maneira. Cada combinação deve ser considerada pronta para ser lida sobre o escopo da presente invenção contanto que o anticorpo resultante ou o fragmento do mesmo reconheça um domínio extracelular de integrina.

[00069] Também deve ser entendido que variantes, mutantes, partes das ditas sequências de aminoácidos ou sequências homólogas tendo a mesma função estão incluídos no alcance de definição bem como proteção. O grau da alteração entre a sequência original e seus derivados é inevitavelmente limitado pela exigência do reconhecimento de antígeno dentro do contexto estrutural, particularmente no material FFPE. Um par de métodos é conhecido pelo versado para gerar peptídeos e proteínas equivalentes, isto é, sequências de aminoácidos que são análogas na função daquelas do ensinamento inventivo realizando os benefícios da invenção em larga escala. Por isso, a invenção também contém as alterações como listadas neste pedido. As variantes das sequências de aminoácidos que são base do anticorpo da invenção podem resultar de modificações (por exemplo, alquilação, arilação ou acetilação de pelo menos um aminoácido único), incorporação de enantiômetros, adição de pelo menos um aminoácido único e/ou fusão com outro peptídeo ou uma proteína. Mutações possíveis compreendem deleção, inserção, substituição, deslocamento e/ou inversão. Partes das sequências de aminoácidos e anticorpos, respectivamente, relacionam-se a uma restrição àquelas regiões que são suficientes para a expressão de uma função específica. As partes do anticorpo podem ser muito pequenas devido à caracterização do parátopo, por exemplo, que também se liga a um antígeno quanto ao domínio extracelular de integrina. No significado da invenção, deve ser claramente distinguido entre partes de qualquer tamanho e sequências homólogas; homologia da última está relacionada à sequência inteira. Preferencialmente, a homologia entre uma sequência original e seus derivados que têm as mesmas características aumenta para pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente pelo menos 98%. Similarmente, a homologia deve ser considerada se a parte acima mencionada de qualquer tamanho for alterada a uma variante ou mutante. O presente ensinamento resolvendo o problema da invenção cobre todos os derivados de peptídeo, que são desenvolvidos com base nos presentes ingredientes por tais procedimentos.

[00070] Além disso, várias técnicas são descritas na técnica anterior para gerar peptídeos não homólogos com a mesma função. Neste pedido, peptídeos não homólogos denotam sequências de aminoácidos que têm menos homologia em comparação com as quantidades preferenciais da homologia acima. Por exemplo, é possível substituir um aminoácido único ou aminoácidos múltiplos sem afetar adversamente a atividade com respeito ao cumprimento do objeto da presente invenção. Para a substituição de tais aminoácidos, referência é feita a manuais padrão apropriados de bioquímica e genética. Como bem conhecido pelos versados na técnica, alguns aminoácidos têm propriedades físico-químicas análogas e por isso, estes aminoácidos podem ser vantajosamente substituídos entre si. Estes incluem os grupos de aminoácido (a) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (b) serina e treonina, (c) asparagina e glutamina, (d) ácido aspártico e ácido glutâmico, (e) lisina e arginina, e fenilalanina (f), tirosina e triptofano. Aminoácidos dentro de um e do mesmo grupo (a) a (f) podem ser substituídos entre si. Alterações adicionais são possíveis conforme o ensinamento de Schneider et al., PNAS 1998, 95: 12179-12184; WO 1999/62933 e/ou WO 2002/38592, descrevendo um modo de gerar sequências de aminoácidos funcionalmente análogas. As referências são por meio deste incorporadas na revelação da invenção. Todas as sequências de aminoácidos, partes de sequência ou estruturas que compreendem sequências, que são projetadas usando os métodos citados e iniciando de qualquer sequência de aminoácidos da invenção, são consideradas como sequências no significado da invenção, e devem estar incluídos no ensinamento de acordo com a invenção, contanto que cumpram o objeto da invenção.

[00071] O objeto da invenção é também um polinucleotídeo que codifica o anticorpo de acordo com a invenção, ou fragmento do mesmo. O termo "polinucleotídeo"se refere a um polímero natural ou sintético de DNA ou RNA de fita única ou dupla alternativamente incluindo nucleotídeos sintéticos, não naturais ou modificados, que podem ser incorporados em polímeros de RNA ou DNA. Cada nucleotídeo consiste de uma porção de açúcar, uma porção de fosfato, e uma purina ou resíduo de pirimidina. Os ácidos nucleicos podem ser opcionalmente modificados como fosforotioato DNA, ácido nucleico trancado (LNA), ácido nucleico peptídico (PNA) ou spiegelmero. O termo "polinucleotídeo codificante" se refere àquela parte de um gene que cifra uma proteína, um polipeptídeo ou uma parte dos mesmos. As sequências reguladoras e/ou elementos controlando a iniciação ou terminação da transcrição são excluídos. A sequência de codificação e/ou o elemento regulador podem ser normalmente encontrados em células, em que caso ele se menciona como autólogo ou endogênico, ou não pode ser localizado em células, caso em que é referido como heterólogo. O termo "gene" denota uma sequência de DNA que codifica proteína específica e elementos reguladores controlando a expressão da dita sequência de DNA. Um gene heterólogo também pode ser composto de elementos autólogos arranjados em uma ordem e/ou orientação, que não é normalmente encontrada naquela célula, o gene é transferido para o interior. Um gene heterólogo pode ser derivado completamente ou parcialmente de qualquer fonte conhecida na técnica, incluindo um genoma bacteriano ou viral ou epissoma, eucariótico nuclear ou DNA plasmidial, cDNA, ou DNA quimicamente sintetizado. O gene estrutural pode formar uma região de codificação contínua, ou pode compreender um ou mais íntrons limitados por ligações de junção adequadas. O gene estrutural pode consistir de segmentos derivados de várias fontes de ocorrência natural ou sintéticas.

[00072] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o polinucleotídeo que codifica os anticorpos da invenção compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas a partir do grupo das SEQ ID NOs: 21 a 29 e 31 a 40, SEQ ID NOs: 61 a 69 e 71 a 80, SEQ ID NOs: 101 a 109 e 111 a 120, SEQ ID NOs: 141 a 149 e 151 a 160, SEQ ID NOs: 181 a 189 e 191 a 200, e SEQ ID NOs: 221 a 229 e 231 a 240. O ensinamento anterior do presente relatório descritivo acerca do anticorpo e sequências de aminoácidos específicas do mesmo é considerado como válido e aplicável sem restrições ao polinucleotídeo e sequências de ácidos nucleicos específicas se adequadas.

[00073] Outro objeto da invenção relaciona-se a um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica o anticorpo de acordo com a invenção como descrito acima. O termo "vetor" denota um construto de DNA recombinante que pode ser um plasmídeo, um vírus, uma sequência de replicação autônoma, um fago, ou uma sequência nucleotídica, que é linear ou circular, consistindo de DNA ou RNA de fita única ou dupla, em que diversas sequências nucleotídicas são ligadas ou recombinadas para formar uma construção única, e que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e uma sequência de DNA de um produto gênico selecionado na orientação senso ou antissenso em uma célula, em conjunto com sequências 3'não traduzidas adequadas.

[00074] É preferencial que um plasmídeo compreende o polinucleotídeo que codifica o anticorpo da invenção, particularmente para clonar e expressar genes recombinantes do anticorpo inventivo ou um fragmento do mesmo. No significado da invenção, os plasmídeos são elementos genéticos que são estáveis herdados sem ser parte do cromossomo da sua célula hospedeira. Podem compreender DNA ou RNA, e podem ser tanto lineares como circulares. Os plasmídeos codificam moléculas que asseguram sua replicação e herança estável durante a replicação celular. Os plasmídeos iniciais revelados no presente relatório descritivo estão comercialmente disponíveis, acessíveis ao público, ou podem ser construídos de plasmídeos disponíveis pelo uso regular de métodos bem conhecidos, publicados. Muitos plasmídeos e outros vetores de clonagem e de expressão, que podem ser usados de acordo com a invenção, são bem conhecidos e facilmente disponíveis para o versado. Além disso, um versado na técnica pode construir facilmente qualquer número de outros plasmídeos adequados para o uso nesta invenção.

[00075] O vetor deve ser adequado para a introdução em células hospedeiras. Consequentemente, uma célula hospedeira compreendendo o vetor com o polinucleotídeo que codifica o anticorpo é ainda outro objeto da invenção. A presente invenção preferencialmente relaciona-se a células procarióticas ou eucarióticas isoladas, mas também deve cobrir culturas celulares, tecidos, órgãos, e similares, e até organismos, que compreendem a célula hospedeira da invenção, incluindo um vetor descrito acima. O termo "célula hospedeira" denota uma célula que foi geneticamente modificada pela transferência de uma sequência de ácidos nucleicos quimérica, heteróloga ou autóloga ou derivados da mesma ainda incluindo a dita sequência. Estas células também são referidas como células transgênicas. Onde uma sequência de ácidos nucleicos autóloga é transferida, o número de cópias desta sequência na célula hospedeira é mais alto do que aquele das sequências que ocorrem naturalmente.

[00076] A invenção também se relaciona a um imunógeno recombinante consistindo de um domínio extracelular de integrina com o modelo de glicosilação derivado de inseto. O domínio extracelular é preferencialmente acoplado como forma de membrana de delta-trans (DTM). O dito imunógeno da invenção é capaz de provocar uma resposta imune adaptável se injetado sozinho em uma espécie mamífera da escolha, incluindo coelho. Mais preferencialmente, o imunógeno da invenção tem uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 10, 90, 130, 170 ou 210, ou variantes, mutantes, partes da sequência de aminoácidos ou sequências homólogas de pelo menos 95% tendo a mesma função. O objeto da invenção é também um polinucleotídeo que codifica os ditos imunógenos da invenção. Em uma modalidade preferencial, o polinucleotídeo que codifica o imunógeno tem uma sequência nucleotídica das SEQ ID NOs: 30, 110, 150, 190 ou 230, ou variantes, mutantes, partes da sequência de aminoácidos ou sequências homólogas de pelo menos 95% tendo a mesma função. Outro objeto da invenção relaciona-se a um vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica o imunógeno de acordo com a invenção. Ainda outro objeto é uma célula hospedeira compreendendo o vetor com o polinucleotídeo que codifica o imunógeno de acordo com a invenção. Deve ser entendido que a espécie hospedeira está incluída no presente escopo da proteção de acordo com a presente invenção. O ensinamento anterior do presente relatório descritivo acerca de anticorpos, ou variantes, mutantes, partes de sequências ou sequências homólogas dos mesmos, polinucleotídeos codificam anticorpos, ou vetores, células hospedeiras e similares, é válido e aplicável sem restrições ao imunógeno para originar o dito anticorpo ou outros, se apropriado.

[00077] A invenção também se relaciona a um método para preparação de anticorpos de coelho compreendendo as etapas de: (a) expressão recombinante de um domínio extracelular de integrina ou um fragmento do mesmo em células de inseto; (b) purificação do domínio extracelular expresso; (c) imunização de um coelho com o domínio extracelular purificado; (d) introdução de antissoro policlonal compreendendo anticorpos policlonais de coelho; e opcionalmente (e) preparação de anticorpos monoclonais.

[00078] Preferencialmente, o método para preparação de anticorpos monoclonais compreende as seguintes etapas: (a) expressão recombinante de um domínio extracelular de integrina em células de inseto; (b) purificação do domínio extracelular de integrina expresso; (c) imunização de um coelho com o domínio extracelular de integrina purificado; (d) introdução de antissoro policlonal compreendendo anticorpos policlonais de coelho; e (e) preparação de anticorpos monoclonais. Mais preferencialmente, o método se refere à preparação dos ditos anticorpos monoclonais da invenção como descrito detalhadamente acima.

[00079] A expressão proteica da etapa (a) é uma matéria de rotina para o versado que tem acesso a várias células de inseto apropriadas, linhagens celulares de inseto e meios para transfectá-las. Por exemplo, a linhagem celular de inseto BTI-Tn5B1-4 (High Five) infectada com um baculovírus recombinante ganhou uso comum dentro do sistema de expressão de célula de baculovírus/inseto porque muitas proteínas recombinantes secretadas são produzidas em taxas consideravelmente mais altas do que em linhagens celulares derivadas de Spodoptera frugiperda, tais como Sf9. Para otimizar o rendimento do domínio extracelular de integrina do sistema de expressão de célula de baculovírus/inseto, os experimentos podem ser facilmente realizados com culturas adaptadas de suspensão de células High Five para investigar os efeitos do estado da célula hospedeira, multiplicidade de infecção, densidade celular no momento de infecção e suplemento do meio com nutrientes e oxigênio. Tais procedimentos são o estado da arte e publicados, por exemplo, por Vallazza & Petri, Cytotechnology 1999, 29: 85-92, ou Mehta et al., Biochem J 1998, 330: 861-869.

[00080] Considera-se que o ensinamento anterior acerca do anticorpo ou as alterações de imunógeno é válido e aplicável sem restrições a imunógenos alterados da etapa (a) se adequado. Como óbvio para o versado, a presente invenção não deve ser interpretada a ser limitada aos domínios extracelulares completos de integrina. Fragmentos fisiológicos ou artificiais dos domínios extracelulares, modificações secundárias dos domínios extracelulares, alterações dependentes das espécies bem como as variantes alélicas dos domínios extracelulares também são englobados pela presente invenção. Neste sentido, entende-se que uma "variante alélica"representa o produto gênico de uma de duas ou mais formas diferentes de um gene ou sequência de DNA que podem existir em loci únicos genéticos. Os fragmentos artificiais preferencialmente englobam um peptídeo produzido sinteticamente ou por técnicas recombinantes, que compreende pelo menos os epítopos de interesse diagnóstico.

[00081] Se expresso em células de inseto de acordo com a etapa (e), o domínio extracelular de integrina tem um modelo de glicosilação aderente incorreto que se diferencia do modelo de glicosilação em células mamíferas maduras. Como as integrinas são extensivamente glicosiladas, isto é, mais de 10% em massa, isto significa que a proteína de inseto é mais divergente das integrinas nativas de coelho produzidas em sistemas mamíferos. O imunógeno derivado de inseto leva a uma imunogenicidade muito aumentada e resposta mais forte de anticorpo aos elementos proteicos do dito imunógeno.

[00082] A purificação proteica, imunização de mamífero e extração de soro das etapas (b) a (d) seguem técnicas bem conhecidas e boa prática de laboratório, tais como descritas no decorrer do relatório descritivo e exemplos. Os soros da etapa (d) são posteriormente testados para a presença de policlonais, e os anticorpos detectados são rastreados para o reconhecimento de antígeno. Testes adequados e rastreamentos estão disponíveis para os versados na técnica.

[00083] Opcionalmente, a preparação de anticorpo é continuada nas espécies de anticorpos monoespecíficos, idênticos, isto é, monoclonais da etapa (e). Anticorpos monoclonais são tipicamente produzidos por fusão de células de mieloma com células de baço do mamífero que foi imunizado de acordo com a etapa (c). Um meio HAT seletivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina é particularmente usado no qual as células somente fusionadas podem crescer. Os chamados hibridomas então são diluídos e os clones são cultivados de células parentais únicas em poços de microtítulo. Os anticorpos secretados pelos clones diferentes são testados para sua capacidade de ligação ao antígeno do domínio extracelular de integrina. Consequentemente, os anticorpos da invenção são especialmente preparados pelo método abaixo.

[00084] É óbvio que os anticorpos podem ser similarmente preparados pelo dito método da invenção usando um domínio de integrina intracelular. O método será aplicado mutatis mutandis.

[00085] O objeto da invenção é também os anticorpos obtidos pela imunização de um coelho com um domínio extracelular ou citoplasmático da integrina recombinantemente expressa em células de inseto. Como o imunógeno da invenção pode ser usado para originar anticorpos, a invenção particularmente relaciona-se a anticorpos monoclonais obtidos pela imunização de um coelho com o imunógeno e/ou polinucleotídeo, cada um de acordo com a invenção, introduzindo antissoro policlonal com anticorpos policlonais e preparando os anticorpos monoclonais. O ensinamento anterior do presente relatório descritivo acerca do imunógeno e o método para preparação de anticorpos de coelho devem ser considerados tão válido e aplicável sem restrições ao produto de anticorpo como produzido por este processo, se adequado.

[00086] Embora o clone mais produtivo e estável possa ser cultivado em meio de cultura a um alto volume, o monoclonal de escolha é preferencialmente expresso de uma maneira recombinante. Requer que à clonagem de cDNA dos insertos de codificação de anticorpo, sequenciamento e inserção em vetores de expressão permita a produção de anticorpos inteiramente definidos. Posteriormente, a invenção também se relaciona a um método para produzir um anticorpo monoclonal recombinante ou um fragmento do mesmo que compreende as etapas de vetor(es) de introdução, que compreende a sequência(s) de ácidos nucleicos das SEQ ID NOs: 21 a 29 e 31 a 40, SEQ ID NOs: 61 a 69 e 71 a 80, SEQ ID NOs: 101 a 109 e 111 a 120, SEQ ID NOs: 141 a 149 e 151 a 160, SEQ ID NOs: 181 a 189 e 191 a 200, e/ou SEQ ID NOs: 221 a 229 e 231 a 240 em uma célula hospedeira, (b) cultura da célula hospedeira em meio de cultura, por meio disso expressando o anticorpo codificado ou fragmento do mesmo, e (c) purificação do anticorpo expresso ou fragmento do mesmo.

[00087] O vetor pode ser introduzido por qualquer método da técnica, tal como transformação, transfecção ou transdução. Deve ser entendido que células procarióticas, incluindo bactérias e archaea, são particularmente transformadas, tais como espécies Escherichia ou espécies Bacillus, ao passo que células eucarióticas são particularmente transfectadas, tais como CHO, HeLa e similares. Os três sistemas de domínio também podem ser transduzidos por transportes virais. O vetor pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo.

[00088] Ainda em outra modalidade preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 115 (VL-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 116 (VH- αvβ3). Em uma modalidade mais preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 119 (L-αvβ3) e/ou SEQ ID NO: 120 (H-αvβ3).

[00089] Em uma modalidade preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 35 (VL-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 36 (VH-αvβ5). Em uma modalidade mais preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 39 (L-αvβ5) e/ou SEQ ID NO: 40 (H-αvβ5).

[00090] Em uma modalidade preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 155 (VL-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 156 (VH-αvβ6). Em uma modalidade mais preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 159 (L-αvβ6) e/ou SEQ ID NO: 160 (H-αvβ6).

[00091] Em uma modalidade preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 195 (VL-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 196 (VH-αvβ8). Em uma modalidade mais preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 199 (L-αvβ8) e/ou SEQ ID NO: 200 (H-αvβ8).

[00092] Em uma modalidade preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 235 (VL-αv) e/ou SEQ ID NO: 236 (VH-αv). Em uma modalidade mais preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 239 (L-αv) e/ou SEQ ID NO: 240 (H-αv).

[00093] Em outra modalidade preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 75 (VL-β3) e/ou SEQ ID NO: 76 (VH-β3). Em uma modalidade mais preferencial da etapa (a), o vetor(es) a ser introduzido compreende as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 79 (L-β3) e/ou SEQ ID NO: 80 (H-β3).

[00094] Em um aspecto preferencial de que a invenção relaciona-se a um método para produção de um anticorpo monoclonal recombinante compreendendo uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região variável da cadeia pesada (VH) com as etapas: (a) introdução de um ou mais vetores compreendendo as sequências de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: (i) 115 (VL-αvβ3) e SEQ ID NO: 116 (VH-αvβ3), (ii) SEQ ID NO: 35 (VL-αvβ5) e SEQ ID NO: 36 (VH-αvβ5), (iii) SEQ ID NO: 155 (VL-αvβ6) e SEQ ID NO: 156 (VH-αvβ6), (iv) SEQ ID NO: 195 (VL-αvβ8) e SEQ ID NO: 196 (VH-αvβ8), ou (v) SEQ ID NO: 235 (VL-αv) e SEQ ID NO: 236 (VH-αv) em uma célula hospedeira, (b) cultura da célula hospedeira em meio de cultura, por meio disso expressando o anticorpo codificado, e (c) purificação do anticorpo expresso. Deve ser entendido que vários vetores são favoravelmente diferentes carregando somente uma sequência única das ditas SEQ ID NOs acima. É preferencial na etapa (a) introduzir dois vetores, cada um deles carregando uma sequência das ditas SEQ ID NOs acima.

[00095] Além disso, o ensinamento anterior do presente relatório descritivo acerca do anticorpo, sequências de aminoácidos e alterações dos mesmos, polinucleotídeos que codificam o mesmo bem como a preparação de anticorpos de coelho considera-se como válido e aplicável sem restrições à produção de monoclonais recombinante, se adequado.

[00096] É ainda outro objeto para uso do anticorpo da invenção, ou um fragmento do mesmo, para a detecção de integrinas em material embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE). Até agora, não há nenhum anticorpo monoclonal clássico direcionado a integrinas e reagindo especificamente e confiantemente com os complexos no material FFPE. Somente os anticorpos da invenção, particularmente monoclonais de coelho, têm uma afinidade e especificidade tão altas, que permite a detecção de epítopos não fechados de integrinas. Os termos "não fechado" e "exposto", que são usados intercambiavelmente neste pedido, são tomados para significar a confirmação molecular de um antígeno no qual os epítopos podem ser reconhecidos por um anticorpo. Por isso, o mesmo modelo de marcação é observado comparando os anticorpos da invenção no material FFPE com monoclonais murinos no material congelado. Além disso, substancialmente o mesmo modelo de marcação é observado se comparar os anticorpos da invenção em material FFPE e formas de integrina isoladas em ELISA e/ou o estado de integrina nativo em células viáveis, preferencialmente se comparar os anticorpos da invenção no material FFPE e em células viáveis.

[00097] Em uma modalidade preferencial da invenção, o material FFPE é um tecido. O tecido FFPE é uma parte do tecido que é primeiro separado de um espécime animal por dissecação ou biópsia. Então, este tecido é fixado a fim de impedir o decaimento ou degeneração dele e examiná-lo claramente sob um microscópio de estudos histológicos, patológicos ou citológicos. A fixação é o processo pelo qual o tecido é imobilizado, morto e conservado com o objetivo de marcá-lo e examiná-lo sob um microscópio. O processamento de pós-fixação torna o tecido permeável a reagentes de marcação e interliga suas macromoléculas para que sejam estabilizadas e trancadas na posição. Muitos fixadores são usados com esta finalidade, por exemplo, solução de Bouine, formalina ou nitrogênio líquido. Este tecido fixado é então introduzido em cera para permitir que seja cortado em seções finas e ser marcado com marcadores eosina e hematoxilina. Depois disto, microtomia é feita por corte de seções finas para estudar a marcação com anticorpos sob microscópio.

[00098] Em uma modalidade mais preferencial da invenção, o tecido FFPE é um tecido tumoral, ainda mais preferencialmente tecido tumoral humano. O tumor é particularmente selecionado a partir do grupo de tumores do epitélio escamoso, bexiga, estômago, rins, cabeça, pescoço, esôfago, cérvix, tireoide, intestino, fígado, cérebro, próstata, trato urogenital, sistema linfático, estômago, laringe e/ou pulmão. O tumor é, além disso, particularmente selecionado a partir do grupo de adenocarcinoma de pulmão, carcinomas de pulmão de pequenas células, câncer pancreático, glioblastomas, carcinoma de cólon e carcinoma de mama. Além disso, a preferência é dada a um tumor do sangue e sistema imune, mais particularmente para um tumor selecionado a partir do grupo de leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfática aguda e/ou leucemia linfática crônica. Tais tumores também podem ser designados como cânceres no significado da invenção.

[00099] O anticorpo da invenção é incubado com o material FFPE para detecção de integrina. O termo "incubação"denota contato do material FFPE com o anticorpo da invenção durante um período distinto, que depende do tipo de material, anticorpo e/ou antígeno. O processo de incubação também depende de vários outros parâmetros, por exemplo, a sensibilidade da detecção, otimização a qual segue procedimentos regulares conhecidos pelos versados na técnica. Adição de soluções químicas e/ou aplicação de procedimentos físicos, por exemplo, impacto de calor, podem melhorar a aceitabilidade das estruturas alvo na amostra. Produtos de incubação específicos são formados como resultado da incubação.

[000100] Testes adequados para a detecção de complexos de anticorpo/antígeno formados são conhecidos pelos versados na técnica ou podem ser facilmente projetados com matéria de rotina. Muitos tipos diferentes de ensaios são conhecidos, exemplos dos quais são apresentados abaixo. Embora o ensaio de acordo com a invenção possa ser qualquer ensaio adequado para detectar e/ou quantificar a expressão de integrina, o último é preferencialmente determinado por meio de substâncias que especificamente interagem com o anticorpo primário da invenção.

[000101] O termo "substâncias específicas"como usado neste pedido compreende moléculas com a alta afinidade ao anticorpo anti- integrina da invenção a fim de assegurar uma ligação confiável. As substâncias são preferencialmente específicas para partes do anticorpo, por exemplo, regiões constantes, particularmente regiões constantes de coelho, mais particularmente um fragmento Fc, se houver algum. Há um número distinto de anticorpos específicos contra anticorpos de coelho existentes. As partes representam uma restrição àquelas regiões que são suficientes para a expressão de uma função específica, isto é, fornecimento de um determinante estrutural para o reconhecimento. No contexto da presente invenção, o termo "reconhecimento" - sem ser limitado a este - relaciona-se a qualquer tipo de interação entre as substâncias específicas e o anticorpo alvo, particularmente ligação ou associação covalente ou não covalente, tais como uma ligação covalente, interações hidrofílicas / hidrofóbicas, forças de van der Waals, pares iônicos, ligações de hidrogênio, interações ligante-receptor, interações entre epítopo e sítio de ligação de anticorpo, pareamento de base de nucleotídeo e similares. Tal associação também pode englobar a presença de outras moléculas, tais como peptídeos, proteínas ou outras sequências nucleotídicas.

[000102] As substâncias específicas são compostas de estruturas biológicas e/ou químicas capazes de interagir com a molécula alvo em tal maneira que faça um reconhecimento, ligação e interação possíveis. Especialmente, as substâncias são selecionadas a partir do grupo de proteínas, peptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, polímeros e pequenas moléculas que têm um peso molecular entre 50 e 1.000 Da, preferencialmente proteínas e ácidos nucleicos. As substâncias específicas expressam uma sensibilidade suficiente e especificidade a fim de assegurar uma detecção confiável. Uma substância específica tem pelo menos uma afinidade de 10-7 M para o anticorpo anti-integrina. A substância específica tem preferencialmente uma afinidade de 10-8 M ou até mais preferencial de 10-9 M para sua molécula alvo. Como o versado apreciará, o termo específico é usado para indicar que outras biomoléculas presentes na amostra não se ligam significativamente à substância específica para o anticorpo anti- integrina. Preferencialmente, o nível da ligação a uma biomolécula exceto a molécula alvo resulta em uma afinidade de ligação de somente 10% da afinidade da molécula alvo, mais preferencialmente somente 5% ou menos. Ainda mais preferencialmente, as substâncias são monoespecíficas a fim de garantir uma interação exclusiva direcionada ao anticorpo anti-integrina primário escolhido da invenção. Uma substância específica altamente preferencial cumprirá ambos os critérios de afinidade mínimos acima bem como de especificidade.

[000103] As proteínas ou os peptídeos são preferencialmente selecionados a partir do grupo consistindo de anticorpos, citocinas, lipocalinas, receptores, lectinas, avidinas, lipoproteínas, glicoproteínas, oligopeptídeos, ligantes peptídicos e hormônios peptídicos. Mais preferencialmente, os anticorpos são usados como substância específica. Os ácidos nucleicos são preferencialmente DNA ou RNA de fita única ou dupla, iniciadores, oligonucleotídeos antissenso, ribozimas, enzimas de DNA, aptâmeros e/ou siRNA, ou partes dos mesmos. Sondas de ácidos nucleicos mais preferenciais são aptâmeros, ainda mais preferencialmente aptâmeros de RNA uma vez que o grupo 2’-hidroxila disponível em RNA promove um par de contatos intra- e intermoleculares. Aptâmeros podem ser sintetizados usando química de fosforamidita padrão. Além disso, os aptâmeros de RNA que têm mais de aproximadamente 30 nucleotídeos podem ser favoravelmente sintetizados em grandes quantidades por transcrição in-vitro. A seleção, síntese e purificação de aptâmeros são bem conhecidas para os versados na técnica.

[000104] Substâncias específicas podem ser marcadas; na realização, portanto a marcação depende das características inerentes de substâncias específicas e produtos de incubação específicos a serem monitorados, bem como o método de detecção a ser aplicado, isto é, a sensibilidade necessária, a facilidade de conjugação, exigências de estabilidade, e instrumentação disponível e provisões de disposição. Um método de marcação não é particularmente limitado enquanto uma marcação é facilmente detectada. Uma "substância específica marcada"é aquela que está ligada, covalentemente por um ligador ou uma ligação química, ou não covalentemente por interações iônicas, de van der Waals, eletrostáticas, hidrofóbicas ou ligações de hidrogênio, a uma marcação tal que a presença do anticorpo anti- integrina da invenção possa ser detectada pela detecção da presença da marcação.

[000105] Ligação imunológica específica de um anticorpo a uma proteína pode ser detectada diretamente ou indiretamente. De acordo com este documento, deve ser entendido que o par de anticorpo-para- proteína inclui o anticorpo primário da invenção direcionado à integrina ou um anticorpo secundário direcionado ao anticorpo anti-integrina primário. Exemplos preferenciais de métodos de detecção adequados de acordo com a presente invenção são luminescência, particularmente fluorescência, além disso, coloração VIS e/ou emissão radioativa.

[000106] Luminescência relaciona-se à emissão de luz em consequência de quimioluminescência, bioluminescência ou fotoluminescência. Quimioluminescência envolve a emissão da luz visível em consequência de uma reação química, ao passo que a bioluminescência requer a atividade de luciferase. A fotoluminescência presentemente preferencial, que também é conhecida como estimulação de fluorescência, é causada pela absorção de fótons, preferencialmente fornecidos pela radiação, que é lançada novamente como fóton com um deslocamento no comprimento de onda de 30 a 50 nm e dentro de um período de aproximadamente 10-8 segundos. Os instrumentos para detecção de fluorescência incluem, mas não são limitados a fluorômetros benchtoptípicos, leitores fluorescência de placa multipoços, fluorômetros de fibra ótica, microscópios de fluorescência e sistemas microchips/microfluídicos acoplados com detecção de fluorescência.

[000107] A coloração VIS denota a visualização de qualquer substância acromática a fim de ser visível ao olho nu. Preferencialmente, a intensidade da coloração é medida por um fotômetro.

[000108] Radiação radioativa de isótopos é medida por cintilação. O processo da cintilação líquida envolve a detecção do decaimento beta dentro de uma amostra através da captura de emissões beta em um sistema de solventes orgânicos e os solutos referidos como o coquetel de cintilação. O elétron de decaimento beta emitido por isótopos radioativos tais como 3H, 14C, 32P, 33P e 35S na amostra excita a molécula de solvente, que por sua vez transfere a energia para o soluto. A emissão de energia do soluto (o fóton de luz) é convertida em um sinal elétrico por um tubo de fotomultiplicador dentro de um contador de cintilação. O coquetel também deve atuar como um agente solubilizante e mantém uma suspensão uniforme da amostra. Fótons de raio gama muitas vezes surgem em consequência de outros processos de decaimento (decaimento de série) para libertar o núcleo recentemente formado da energia excessiva. Não têm massa e produzem pouca se qualquer ionização direta pelo choque ao longo do seu caminho. Fótons gama são absorvidos para detecção e quantização por um ou mais de três mecanismos: o efeito de Compton, o efeito fotelétrico e produção de par. Um isótopo de decaimento gama favorável da presente invenção é 125I.

[000109] Marcações diretas incluem marcações fluorescentes ou luminescentes, metais, corantes, radionuclídeos, e similares, ligadas ao anticorpo. Um anticorpo marcado com iodo 125 (125I) pode ser usado. Um ensaio de quimioluminescência usando um anticorpo quimioluminescente específico para a proteína é adequado para a detecção sensível, não radioativa de níveis proteicos. Um anticorpo marcado com o fluorocromo é também adequado. Exemplos de fluorocromos incluem, sem limitação, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, vermelho Texas e lissamina.

[000110] Marcações indiretas incluem várias enzimas bem conhecidas na técnica, tais como peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase, urease e similares. A ligação covalente de um anticorpo anti-integrina a uma enzima pode ser realizada por métodos diferentes, tais como o acoplamento com o glutaraldeído. Ambos, a enzima e o anticorpo são ligados ao glutaraldeído através de grupos amino livres, e os subprodutos de enzimas em rede e anticorpos são removidos. Em outro método, a enzima é acoplada ao anticorpo através de resíduos de açúcar se for uma glicoproteína, tal como peroxidase. A enzima é oxidada por periodato de sódio e diretamente ligada com grupos amino do anticorpo. Outra enzima que contém carboidratos também pode ser acoplada ao anticorpo nesta maneira. O acoplamento de enzima também pode ser realizado ligando os grupos amino do anticorpo com grupos tiol livres de uma enzima, tais como β-galactosidase, usando um ligador heterobifuncional, tais como succinimidil 6-(N-maleimido) hexanoato. O sistema de detecção de peroxidase de rábano-silvestre pode ser usado, por exemplo, com o substrato cromogênico tetrametilbenzidina (TMB), que produz um produto solúvel na presença de peróxido de hidrogênio que é detectável em 450 nm. O sistema de detecção de fosfatase alcalina pode ser usado com o fosfato de p- nitrofenila como substrato cromogênico, por exemplo, que produz um produto solúvel prontamente detectável em 405 nm. Similarmente, o sistema de detecção de β-galactosidase pode ser usado com o substrato cromogênico o-nitrofenil-β-D-galactopiran0xido (ONPG), que produz um produto solúvel detectável em 410 nm. Um sistema de detecção de urease pode ser usado com um substrato, tal como púrpura de ureia-bromocresol.

[000111] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os anticorpos são marcados com porções detectáveis, que incluem, mas não são limitadas a, radionuclídeos, corantes fluorescentes, por exemplo, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Green Oregon™, rodamina, vermelho Texas, isotiocianato de tetra-rodamina (TRITC), Cy3, Cy5, etc., marcadores fluorescentes, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), ficoeritrina, etc., compostos fluorescentes auto-extintos que são ativados por proteases associadas ao tumor, enzimas, por exemplo, luciferase, HRP, AP, etc., nanopartículas, biotina, digoxigenina, e similares.

[000112] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, os ácidos nucleicos são marcados com digoxigenina, biotina, substâncias de quimioluminescência, corantes de fluorescência, contas magnéticas, contas metálicas, partículas coloidais, reagentes elétron- densos, enzimas; todos são bem conhecidos na técnica, ou isótopos radioativos. Isótopos preferenciais para marcar ácidos nucleicos no escopo da invenção são 3H, 14C, 32P, 33P, 35 ou 125I, mais preferencial 32P, 33P ou 125I.

[000113] Uma variedade de técnicas de imunoensaio, incluindo imunoensaios competitivos e não competitivos, pode ser usada. O termo "imunoensaio" engloba técnicas incluindo, sem limitação, citometria de fluxo, FACS, imunoensaios de enzima (EIA), tais como técnica de imunoensaio multiplicada por enzima (EMIT), ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ELISA de captura de anticorpo IgM (MAC ELISA) e imunoensaio de enzima de micropartícula (MEIA), além disso imunoensaios de eletroforese capilares (CEIA), radioimunoensaios (RIA), ensaios imunorradiométricos (IRMA), imunoensaios de polarização de fluorescência (FPIA) e ensaios de quimioluminescência (CL). Se desejado, tais imunoensaios podem ser automatizados. Os imunoensaios também podem ser usados em conjunto com fluorescência induzida por laser. Imunoensaios de lipossoma, tais como imunoensaios de lipossoma de injeção do fluxo e imunossensores de lipossoma, são também adequados para o uso na presente invenção. Além disso, ensaios de nefelometria, nos quais a formação de complexos de proteína/anticorpo resulta na dispersão de luz aumentada que é convertida em um sinal de taxa de pico como uma função da concentração do marcador, são adequados para o uso nos métodos da presente invenção. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, os produtos de incubação são detectados por ELISA, RIA, fluoroimunoensaio (FIA) ou ensaio imune em solúvel em partícula (SPIA).

[000114] Componente de ELISAs são enzimas que estão ligadas a um parceiro de reação imunológica. O antígeno de investigador (derivado de analito) da integrina é preferencialmente marcado no ELISA competitivo utilização de um anticorpo de captura único (em seguida referido como primário), ao passo que o anticorpo é preferencialmente marcado no ELISA não concorrente, preferencialmente compreendendo a precipitação do complexo de anticorpo do antígeno por um segundo anticorpo (em seguida referido como secundário). Os complexos consistir do antígeno e dois anticorpos também são chamados complexos de sanduíche. A detecção compreende a conversão enzimática subsequente de um substrato a um produto, preferencialmente um produto colorido, que é reconhecido por coloração visual, bioluminescência, fluorescência ou a medida de sinais elétricos (eletrodo de enzima). As enzimas favoráveis para marcar na presente invenção são conhecidas pelo versado, tal como peroxidase (por exemplo, HRP), cloranfenicol acetil transferase (CAT), proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S-transferase (GST), luciferase, β-galactosidase e AP.

[000115] Adicionalmente preferencial são imunoensaios radioativos que utilizam isótopos radioativos que são incorporados em um reagente imune durante a síntese ou posteriormente acoplados a um reagente imune do ensaio, preferencialmente a um anticorpo.

[000116] Os anticorpos, que são favoravelmente marcados com fluoróforos, são usados em FIAs.

[000117] SPIA utiliza a modificação de cor da partícula de prata como resultado de aglutinação. Nem um anticorpo secundário nem uma reação de indicador são necessários para torná-la particularmente útil no escopo da presente invenção. Similarmente favoravelmente é o teste de aglutinação de látex usando anticorpos que estão ligados a partículas coloridas de látex. Entretanto, requer que uma imobilização forte da integrina para remover antígenos não ligados e/ou não especificamente ligados em etapas prévias de lavagem.

[000118] Em geral, todos os métodos da detecção incluem etapas de lavagem intensivas para separar anticorpos não ligados do complexo integrina/anticorpo. Além disso, o procedimento experimental de qualquer método de detecção é bem conhecido para os versados na técnica.

[000119] Um sinal de marcação direta ou indireta pode ser analisado, por exemplo, usando um espectrofotômetro para detectar a cor de um substrato cromogênico, usando um contador de radiação para detectar a radiação, tal como um contador gama da detecção de 125I, ou usando um fluorômetro para detectar a fluorescência na presença da luz de certo comprimento de onda. Para a detecção de anticorpos ligados à enzima, uma análise quantitativa pode ser feita usando um espectrofotômetro, tal como um Leitor de Microplaca EMAX (Molecular Devices; Menlo Park, CA) conforme as instruções do fabricante. Se desejado, os ensaios da presente invenção podem ser automatizados ou realizados roboticamente, e o sinal de múltiplas amostras pode ser detectado simultaneamente.

[000120] Imagens óticas examinadas e opcionalmente registradas por uma câmera ou outro dispositivo de registro (por exemplo, um fotodiodo e dispositivo de armazenamento de dados) são opcionalmente ainda processadas em qualquer uma das modalidades neste pedido, por exemplo, digitalizando a imagem e armazenando e analisando a imagem em um computador. Uma variedade de equipamentos periféricos comercialmente disponíveis e programas estão disponíveis para digitalização, armazenamento e análise de um vídeo digitalizado ou imagem ótica digitalizada. Um sistema convencional transporta a luz do campo de espécime a uma câmera de dispositivo acoplado à carga (CCD) resfriado, em uso comum na técnica. Uma câmera de CCD inclui uma tabela de elementos de quadros (pixels). A luz do espécime é visualizada no CCD. Pixels particulares correspondentes a regiões do espécime são escolhidos para obter leituras de intensidade de luz de cada posição. Múltiplos pixels são processados em paralelo para aumentar a velocidade. O aparelho e os métodos da invenção são facilmente usados para examinar qualquer amostra, por exemplo, por técnicas microscópicas de fluorescentes ou de campo escuro.

[000121] Em uma modalidade preferencial da invenção, os clones de hibridoma de coelho consistem das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) e SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3), que são gerados contra DTM-αvβ3 da SEQ ID NO: 90, produzem anticorpos adequados para o tecido FFPE. Ligam-se a αvβ3 seletivamente. Em outra modalidade preferencial da presente invenção, os clones de hibridoma de coelho consistem das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) e SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5), que são gerados contra DTM- αvβ5 da SEQ ID NO: 10, produzem anticorpos adequados para o tecido FFPE. Ligam-se a αvβ5 seletivamente. Ainda em outra modalidade preferencial da presente invenção, os clones de hibridoma de coelho consistem das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) e SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6), que são gerados contra DTM-αvβ6 da SEQ ID NO: 130, produzem anticorpos adequados para o tecido FFPE. Ligam-se a αvβ6 seletivamente. Ainda em outra modalidade preferencial da presente invenção, os clones de hibridoma de coelho consistem das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) e SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8), que são gerados contra DTM-αvβ8 da SEQ ID NO: 170, produzem anticorpos adequados para o tecido FFPE. Ligam-se a αvβ8 seletivamente. Ainda em outra modalidade preferencial da presente invenção, os clones de hibridoma de coelho consistem das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 219 (L-αv) e SEQ ID NO: 220 (H-αv), que são gerados contra DTM-αv da SEQ ID NO: 210, produzem anticorpos adequados para o tecido FFPE. Ligam-se a αv seletivamente. Ainda em outra modalidade preferencial da invenção, os clones de hibridoma de coelho consistem das sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 59 (L-β3) e SEQ ID NO: 60 (H-β3), que são gerados contra o imunógeno β3 da SEQ ID NO: 50, produzem anticorpos adequados para o tecido FFPE. Ligam- se a β3 seletivamente. Deve ser entendido, entretanto, que qualquer sequência alternativa ou combinações das mesmas como descrito no presente relatório descritivo podem ser aplicadas para o uso inventivo. O ensinamento anterior do presente relatório descritivo acerca dos anticorpos e sequências amino disso é considerado como válido e aplicável sem restrições ao uso, se adequado.

[000122] Além disso, a invenção pode ser praticada como um conjunto compreendendo o anticorpo, polinucleotídeo, vetor ou célula hospedeira, cada um deles de acordo com a presente invenção, a fim de realizar o uso inventivo de detecção de integrinas no material FFPE. Particularmente, os anticorpos podem ser incorporados em um conjunto de detecção diagnóstico para caracterizar o perfil de integrina, por exemplo, a integrina αv ou outros perfis de expressão de integrina de tumores ou outras patologias humanas, e especialmente no material FFPE arquivado. O conjunto da invenção pode incluir um artigo que compreende instruções escritas ou dirige o usuário a instruções escritas de como praticar o método da invenção. Em uma modalidade, o conjunto compreende ainda uma porção repórter ou um aparelho repórter. O ensinamento anterior do presente relatório descritivo acerca dos ingredientes de conjunto e uso dos mesmos é considerado como válido e aplicável sem restrições ao conjunto, se adequado.

[000123] A presente invenção resolve o segundo problema pelo ensinamento de um método para rastreamento de anticorpos anti- integrina, que são capazes da discriminação entre os respectivos homólogos muito próximos da subunidade α e/ou subunidade β de integrina e adequados para a imunohistoquímica no material FFPE, compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de uma amostra de anticorpos que são capazes de se ligar a uma integrina selecionada; (b) sequências de integrina se alinham para identificar o homólogo muito próximo da subunidade α e/ou subunidade β da integrina selecionada; (c) execução de um ELISA diferencial em formas nativas da integrina selecionada e o homólogo(s) muito próximo da mesma com a amostra de anticorpo, por meio disso acumulando anticorpos contra a integrina selecionada (rastreamento primário); (d) execução de outro ELISA diferencial em formas nativas da integrina selecionada e outra integrina com os anticorpos acumulados de etapa c), por meio disso acumulando anticorpos adicionais contra a integrina selecionada (rastreamento secundário); (e) realização de imunohistoquímica de linhagens celulares FFPE com os anticorpos acumulados da etapa d), em que pelo menos uma linhagem celular é capaz de expressar a integrina selecionada e opcionalmente outra linhagem celular não é capaz de expressar a integrina selecionada, por meio disso acumulando anticorpos adicionais contra a integrina selecionada (rastreamento terciário); (f) realização de imunohistoquímica de linhagens celulares FFPE da etapa e) com os anticorpos acumulados da etapa e), em que a linhagem celular é cultivada como tumor de xenoenxerto em um mamífero, por meio disso acumulando anticorpos adicionais contra a integrina selecionada (rastreamento quaternário); e (g) realização de imunohistoquímica de tumores FFPE arquivados com os anticorpos acumulados de etapa f), por meio disso acumulando anticorpos adicionais contra a integrina selecionada (rastreamento quintenário).

[000124] O rastreamento primário é realizado por ELISA diferencial em formas biologicamente nativa, ativas, não desnaturadas dos imunógenos (Mehta et al., 1998, Biochem J 330: 861-869). Se o imunógeno alvo for αvβ3, por exemplo, o rastreamento primário é αvβ3 contra αvβ5. Isto significa que a o rastreamento primário usa um contrarrastreamento na integrina com homologia de sequência muito próxima ao alvo primário. O homólogo muito próximo à β3 cadeia é β5, enquanto αv é idêntico em ambos os complexos. Deste modo os anticorpos mais discriminatórios podem ser obtidos. Similarmente, αvβ5 pode ser rastreado contra αvβ8. Rastreamentos da cadeia alfa dos anticorpos específicos podem seguir o mesmo procedimento, isto é, αvβ1 podem ser usados como rastreamento contrário de anticorpo específico para α5β1. O rastreamento secundário enxerga um conjunto mais amplo de integrinas recombinantes em ELISA para confirmar ainda que a especificidade, por exemplo, αiibβ3 pode ser usado para confirmar a especificidade de complexos αv em vez de cadeia β3 sozinha de anticorpos αvβ3, preferencialmente monoclonais de αvβ3. É preferencial na etapa (d) que o rastreamento diferencial seja realizado em formas nativas da integrina selecionada e outra integrina estritamente relacionada aos anticorpos acumulados da etapa (c). O rastreamento terciário enxerga a marcação de anticorpo em IHC de linhagens celulares FFPE que são bioquimicamente caracterizadas para seus perfis de expressão de integrina. O rastreamento quaternário usa FFPE-IHC nas mesmas linhagens celulares cultivadas que tumores de xenoenxerto em camundongos nus. O rastreamento quintenário enxerga tumores humanos FFPE arquivados. Por exemplo, os rastreamentos terciários e quaternários estão em melanomas M21, U87MG e M24 como alvos positivos de rastreamento. Todas estas linhagens são conhecidas de perfis internos e da literatura por expressar αvβ3, enquanto A549 NSCLC, Raji e HT29 são alvos negativos de rastreamento. Todas estas linhagens são conhecidas de perfis internos e da literatura por não expressar αvβ3. Os rastreamentos quintenários estão preferencialmente no melanoma maligno e glioblastoma como tumores humanos αvβ3 positivos, e NSCLC e CRC como αvβ3 negativos.

[000125] Em uma modalidade do método de rastreamento, qualquer uma das etapas (c) a (g) compreende a etapa adicional de detecção da capacidade discriminatória e/ou a especificidade dos anticorpos acumulados.

[000126] No escopo da presente invenção, os anticorpos foram fornecidos pela primeira vez, que permitem detecção validada de integrinas no material FFPE de pacientes arquivados, tais como biópsias tumorais, e também pela citometria de fluxo de célula viva (FACS). Os modelos de marcação em FACS correspondem aos modelos obtidos com os anticorpos monoclonais relevantes conhecidos pelos versados na técnica (por exemplo, LM609 para αvβ3; P1F6 para αvβ5). Mostra que os anticorpos da invenção detectam as respectivas integrinas não somente no material FFPE, mas também no seu estado nativo em células viáveis. Integrinas, particularmente αvβ3, αvβ5, αvβ6 ou αvβ8 são alvos terapêuticos primários que não podem ser confiantemente visualizados no material de biópsia FFPE regular antes de depositar este pedido de patente. Os anticorpos robustos da invenção têm o potencial para reconhecer seus alvos de integrina no material FFPE arquivados no modelo de marcação idêntico à distribuição vista por anticorpos monoclonais conhecidos αvβ3, αvβ5-ou αvβ6 específicos no material criopreservado, mas com resolução espacial bem conhecida, muito mais alta e qualidade de preservação morfológica típica para FFPE contra o material de crio-histologia. Anticorpos muito adequados são monoclonais de coelho que não são simplesmente originados de outras espécies, mas estes RabMabs são provados favoravelmente possuir especificidade, reprodutibilidade e eternalidade (isto é, o mesmo reagente e a mesma especificidade para sempre). RabMabs, que são gerados usando clones αvβ3 ou αvβ5, reconhecem αvβ3 ou αvβ5 em tumores humanos arquivados em modelos de marcação idênticos ao material criofixado marcado anticorpo LM609 anti-αvβ3 clássico ou anticorpo PIF6 anti-αvβ5. RabMabs, que são gerados usando domínios citoplasmáticos β3, arranjos de xenoenxerto de marcação no modelo correspondente ao perfil de expressão αvβ3 conhecido de células alvo. Embora os anticorpos produzidos, e opcionalmente selecionados por rastreamento na via revelada de acordo com este documento, funcionam principalmente em integrinas FFPE, também podem ser usados em ELISA em integrinas isoladas, para citometria de fluxo em populações celulares vivas, ou até ter outras aplicações bioquímicas padrão. Os anticorpos fornecem uma ponte de validação excepcional e valiosa entre as patologias humanas observadas e a bioquímica dos receptores.

[000127] A invenção ensina a geração de anticorpos anti-integrina usando domínios de integrina purificados, particularmente domínios extracelulares de integrina purificados, mais particularmente de origem humana. O imunógeno da invenção causa altos títulos de anticorpos dentro de períodos curtos de imunização. Os altos títulos de anticorpo são refletidos por uma alta diluição do soro que é obtido após imunização e usado em ensaios. Simultaneamente, os efeitos adversos que podem ser causados por outros componentes do soro são basicamente reduzidos devido à sua presença diluída. O título pode ser vantajosamente aumentado ainda pela produção de imunógeno de inseto recombinante que gera uma divergência na glicosilação das integrinas de coelho endógenas e altamente homólogas. Os anticorpos e os derivados dos mesmos são caracterizados por uma alta estabilidade de especificidade e expressão em sistemas de expressão mamífera em uma escala de produção industrial, baixos custos de produção e manejo adequado. Estas características formam a base de uma ação reprodutível, em que a falta de reatividade cruzada e efeitos adversos está incluída, e para uma interação confiável e segura com sua correspondência com estruturas de integrina. Como os anticorpos podem ser clonados em vetores de expressão, fornecem uma fonte absolutamente estável e reprodutível de material de pesquisa básica e diagnóstico. Além disso, o conjunto apropriado é produzido tem bom custo/benefício.

[000128] Todas as referências citadas neste pedido são incorporadas por referência na revelação da invenção por meio deste.

[000129] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada aos anticorpos específicos, métodos particulares, usos e conjuntos descritos neste pedido, como tal matéria pode variar, naturalmente. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste pedido é com o objetivo de descrever modalidades particulares somente e não é destinada a limitar o escopo da presente invenção, que somente é definida pelas reivindicações acrescentadas. Como usado neste pedido, incluindo as reivindicações acrescentadas, as formas singulares das palavras, tais como "um", "uma", "a" e "o" incluem seus referentes plurais correspondentes a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa forma, por exemplo, a referência a "um anticorpo" inclui um anticorpo simples ou vários anticorpos diferentes, ao passo que a referência a "anticorpos" deve ser aplicável mutatis mutandis, e a referência a "um método"inclui referência a etapas equivalentes e métodos conhecidos por um versado ordinário na técnica, e similares. A menos que de outra maneira não definido, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado ordinário na técnica à qual esta invenção pertence.

[000130] As técnicas que são essenciais de acordo com a invenção são descritas detalhadamente no relatório descritivo. Outras técnicas que não são descritas detalhadamente correspondem a métodos padrão conhecidos que são bem conhecidos por um versado na técnica, ou as técnicas são descritas em mais detalhes em referências citadas, pedidos de patente ou literatura padrão. Outros microrganismos, linhagens celulares, plasmídeos, promotores, marcadores de resistência, origens de replicação, e similares, que não são mencionados no pedido de patente, estão comercialmente disponíveis. Contanto que nenhuma outra alusão no pedido de patente seja dada, são usadas como exemplos somente, não são consideradas que sejam essenciais de acordo com a invenção, mas podem ser substituídos por outros instrumentos e materiais biológicos adequados. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste pedido possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, exemplos adequados são descritos abaixo. Os seguintes exemplos são fornecidos por meio de ilustração e não por meio de limitação. Dentro dos exemplos, reagentes padrão e tampões que são livres de atividades contaminantes (sempre que possível) são usados. Exemplos devem ser particularmente interpretados tal que não sejam limitados às combinações explicitamente demonstradas de características, mas das características exemplificadas podem ser irrestritamente combinadas novamente se o problema técnico da invenção for resolvido.

[000131] A figura 1 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE (esquerda) e xenoenxertos (direita) com sobrenadantes do subclone E3528-2-12 gerado contra o domínio externo de αvβ3.

[000132] A figura 2 mostra a marcação de membrana plasmática de células M21 em xenoenxertos com o clone de anticorpo anti-αvβ3 de integrina purificado E3528-2-7.

[000133] A figura 3 mostra a marcação imunohistoquímica da linhagem celular de câncer M21 (esquerda) e o xenoenxerto M21 (direita) com os anticorpos anti-αvβ3 purificados de integrina E3528-2- 7, E3528-2-11 e E3528-2-12.

[000134] A figura 4 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com os anticorpos anti-αvβ3 E3528-2-7, E3528-2-11 e E3528-2-12 com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50) e representação gráfica com Spotfire.

[000135] A figura 5 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com o anticorpo αvβ3 _E3528-2-7 e o anticorpo monoclonal 20H9 de camundongo com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50). O clone 20H9 é direcionado contra a cadeia de integrina β3. A "Expressão (%max)"é normalizada para a expressão de M21.

[000136] A figura 6 mostra a marcação de membrana plasmática de células M21 em xenoenxertos com os anticorpos anti-αvβ3 purificados de integrina E3531-227-3 e E3531-229-3.

[000137] A figura 7 mostra a marcação imunohistoquímica da linhagem celular de câncer M21 (esquerda) e o xenoenxerto M21 (direita) com os anticorpos de integrina anti-αvβ3 purificados do multiclone 227 (E3531-227-3, E3531-227-3 e E3531-227-6).

[000138] A figura 8 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com os anticorpos anti-αvβ3 dos clones E3531-227 (acima) e em comparação com o monoclonal anticorpo 20H9 anti-β3 de camundongo (abaixo), calculado como % da expressão em células M21. A expressão foi analisada com ajuda da análise de imagem (Ariol SL-50).

[000139] A figura 9 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE (esquerda) e xenoenxertos (direita) com sobrenadantes do subclone E3536-99-3 gerado contra o domínio externo de αvβ5.

[000140] A figura 10 mostra o perfil de ELISA de anticorpos de hibridoma monoclonais purificados E3531-227-3, E3531-229-3 e E3536-99-2 contra domínios extracelulares humanos recombinantes da integrina αvβ3 e αvβ5 e gpiibiiia de plaqueta completa purificada.

[000141] A figura 11 mostra a marcação de membrana plasmática de células A431 e HCT116 em xenoenxertos com o clone de anticorpo anti-αvβ5 purificado de integrina E3536-99-3.

[000142] A figura 12 mostra a marcação imunohistoquímica da linhagem celular de câncer U87MG (esquerda) e o U87MG e xenoenxertos A431 com os anticorpos de integrina anti-αvβ5 purificados E3536-99-1, E3536-99-2 e E3536-99-3.

[000143] A figura 13 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com os anticorpos anti-αvβ5 E3536-99-1, E3536- 99-2 e E3536-99-3 com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50) e representação gráfica com Spotfire.

[000144] A figura 14 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE (esquerda) e xenoenxertos (direita) com sobrenadantes do subclone E3866-52-1.

[000145] A figura 15 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE com o anticorpo purificado do subclone E3866-52-1.

[000146] A figura 16 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer e xenoenxertos com o anticorpo anti- αvβ6 recombinante de integrina.

[000147] A figura 17 mostra a marcação de membrana plasmática de células de carcinoma de próstata (acima) e células de carcinoma de cólon HT29 em xenoenxertos com o anticorpo anti-αvβ6 recombinante de integrina.

[000148] A figura 18 mostra a análise da marcação imunohistoquímica (corrida 3421) com o anticorpo anti-αvβ6 com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50).

[000149] A figura 19 mostra a reprodutibilidade lâmina a lâmina e corrida a corrida com o anticorpo recombinante anti-αvβ6.

[000150] A figura 20 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE e xenoenxertos com sobrenadantes com o subclone 133-9 anti-αvβ8.

[000151] A figura 21 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE com o anticorpo purificado com o subclone E3875-133-9 anti-αvβ8.

[000152] A figura 22 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer e xenoenxertos com o anticorpo anti- αvβ8 recombinante de integrina EM13309.

[000153] A figura 23 mostra a marcação imunohistoquímica do tecido humano com o anticorpo anti-αvβ8 recombinante de integrina EM13309.

[000154] A figura 24 mostra a marcação de membrana plasmática de células de carcinoma de próstata (acima) e células de carcinoma de pulmão H1975 em xenoenxertos com o anticorpo anti-αvβ8 recombinante de integrina.

[000155] A figura 25 mostra a análise da marcação imunohistoquímica (corrida 3422) com o anticorpo anti-αvβ8 EM13309 com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50).

[000156] A figura 26 mostra a reprodutibilidade lâmina a lâmina e corrida a corrida com o anticorpo recombinante anti-avβ8 EM13309.

[000157] A figura 27 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE e xenoenxertos com sobrenadantes do subclone anti-αv E3875-13-9.

[000158] A figura 28 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer FFPE com o anticorpo anti-αv purificado do subclone E3875-13-9.

[000159] A figura 29 mostra a marcação imunohistoquímica de linhagens celulares de câncer e xenoenxertos com o anticorpo recombinante anti-αv EM01309.

[000160] A figura 30 mostra a marcação de membrana plasmática de células DU-145 (acima) e HT29 em xenoenxertos com o anticorpo anti- αv recombinante EM01309.

[000161] A figura 31 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com o anticorpo anti-αv recombinante EM01309 com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50).

[000162] A figura 32 mostra a reprodutibilidade lâmina a lâmina e corrida a corrida com o anticorpo anti-αv recombinante EM01309.

[000163] A figura 33 mostra a marcação de membrana plasmática de células M21 em xenoenxertos com o clone E3592-2-12 do anticorpo de integrina purificado anti-β3.

[000164] A figura 34 mostra a marcação imunohistoquímica da linhagem celular de câncer M21 (esquerda) e o xenoenxerto M21 (direita) com os anticorpos de integrina purificado anti-β3 E3592-2-4, E3592-2-10 e E3592-2-12.

[000165] A figura 35 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com os anticorpos anti-β3 E3592-2-4, E3592-2-10 e E3592-2-12 com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50) e representação gráfica com Spotfire.

[000166] A figura 36 mostra a análise da marcação imunohistoquímica com o anticorpo β3_E3592-2-12 e o anticorpo monoclonal 20H9 de camundongo com o auxílio da análise de imagem (Ariol SL-50). O clone 20H9 é direcionado contra a cadeia de integrina β3. A "Expressão (%max)"é normalizada à expressão de M21.

[000167] A figura 37 mostra o perfil de ELISA de anticorpos de hibridoma monoclonais purificados E3875-133-9, E3866-052-1 e E3875-013-9 da anti-integrina de coelho contra domínios extracelulares de αv-integrina humana recombinante e gpiibiiia de plaqueta completa purificada.

[000168] A figura 38 mostra o perfil de ELISA de anticorpos monoclonais anti-integrina de coelho EBNA-recombinante EM22703, EM09902, EM00212, EM05201, EM13309 e EM01309 contra domínios extracelulares de αv-integrina humana recombinante e gpiibiiia de plaqueta completa purificada.

[000169] A figura 39 mostra o ensaio de inibição de receptor para anticorpos RabMab EM22703, EM09902, EM00212 usando biotina vitronectina como ligante.

[000170] A figura 40 mostra a titulação FACS de EM022703 em M21.

[000171] A figura 41 mostra a titulação FACS de EM009902 em A549.

[000172] A figura 42 mostra a titulação FACS de EM05202 em HT29.

[000173] A figura 43 mostra a titulação FACS de EM13309 em células M24-encontradas.

EXEMPLO 1: Geração de imunógenos Exemplo 1.1: Geração de domínios extracelulares αvβ3, αvβ5, αvβ6 e αvβ8v

[000174] Domínios extracelulares de integrina humana recombinante, αvβ3, αvβ5, αvβ6 e αvβ8, foi originada em linhagens celulares de inseto (Hive Five) usando infecção de baculovírus. O uso da linhagem de inseto como controle negativo foi apropriado. Após fermentação, processamento a jusante compreendeu os seguintes elementos: cromatografia em coluna de afinidade Toyopearl <Mab 14D9>, diálise com tubulação de diálise Spectra/POR (6-8 kDa para DTM-αvβ3 e DTM-αvβ5; 25 kDa para DTM-α vβ8), concentração com Millipore TFF Labscale tendo ponto de corte de 30 kDa (DTM-αvβ5 e DTM-α vβ8 somente), concentração com unidades de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 tendo ponto de corte de 30 kDa e filtração em 0,2 μm com Millex GV (DTM-αvβ3, DTM-α vβ6, DTM-α vβ8 somente).

[000175] 22 mg de DTM-αvβ3 foram dissolvidos em tampão Na(CH3COO) 50 mM, MnCl2 0,2 mM, pH 7,4, para fornecer uma concentração de proteína de 2,0 mg/mL. A solução de estoque foi posteriormente aliquotada em 22 frascos de 500 μL. 10,6 mg de DTM- αvβ5 foram dissolvidos em tampão Na(CH3COO) 50 mM, MnCl2 0,2 mM, pH 7,4, para fornecer uma concentração de proteína de 2,36 mg/mL. A solução de estoque foi posteriormente aliquotada em 9 frascos de 500 μL. 15 mg de DTM-α vβ6 foram dissolvidos em tampão Na(CH3COO) 50 mM, MnCl2 0,2 mM, pH 7,4, para fornecer uma concentração de proteína de 2,36 mg/mL. 16,6 mg de DTM-α vβ8 foram dissolvidos em tampão Na(CH3COO) 50 mM, MnCl2 0,2 mM, pH 7,4, para fornecer uma concentração de proteína de 2,78 mg/mL.

[000176] As alíquotas foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. Métodos analíticos foram realizados por ensaio de BCA e SDS page com marcação de Coomassie ou western blotting de acordo com o práxis experimental regular. Os seguintes anticorpos foram usados para a detecção DTM-αvβ3 por western blotting: Mab AP3 EMD 330515/CH000 primário, 5 μg/mL, 2 h TA, e IgG anti- camundongo de cabra secundária (H+L) x AP, Dianova, 115-055-062, 1:1000, 1 h TA, seguido por Precision Step Tractin x AP, BioRad, 1610382, 1:5000. Os seguintes anticorpos foram usados para a detecção de DTM-αvβ5 por western blotting: Mab <11D1>-CH004 primário, 2,5 μg/mL, 1 h TA, e IgG anti-camundongo de cabra secundária (H+L) x AP, Dianova, 115-055-062, 1:1000, 1 h TA, seguido por Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0382, 1:5000. Os seguintes anticorpos foram usados para detecção de DTM-α vβ6 por western blotting: Mab primário Biotina x 442-5C4 <Hu-integrina β6> 330510/CH001, 2 μg/mL, 2 h TA, e anti-Biotina secundária x AP, Sigma A-7064, 1:2500, 2 h TA, seguido por Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0380, 1:5000. Os seguintes anticorpos foram usados para detecção de DTM-α vβ8 por western blotting: Mab LM 142 primário x Pool A 269A07H1.G01 de Biotina, 5 μg/mL, 2 h TA, e IgG anti-camundongo de cabra secundária (H+L) x AP, Dianova, 115-055-062, 1:1000, 1 h TA, seguido por Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0382, 1:5000, 1 h TA.

[000177] Os imunógenos foram caracterizados como ativos biologicamente e específicos pela sua capacidade de ligação a seus substratos cognatos, por exemplo, vitronectina (αvβ3 e αvβ5) e fibronectina (αvβ3). Estas preparações foram reconhecidas como um padrão ouro da fidelidade estrutural de integrina (Mehta et al., Biochem J 1998, 330: 861-869; Xiong et al., Science 2001, 294: 339-345). Os domínios extracelulares de integrina humana recombinante DTM-αvβ3, DTM-αvβ5, DTM-α vβ6 e DTM-α vβ8 foram usados como imunógenos.

Exemplo 1.2: Geração de domínio citoplasmático β3

[000178] O domínio citoplasmático integrina humana β3, fusionado a GST foi produzido em E.coli BL21 e purificado como uma proteína de fusão recombinante como imunógeno. Após fermentação, processamento a jusante compreendeu os seguintes elementos: lise celular, prensa francesa, preparação de corpos de inclusão, que se re- enovelam por diálise e concentração. 55 mg de proteína foram dissolvidos no tampão de carbonato de sódio 0,1 M, DTT 5 mM, pH 9,5, para fornecer uma concentração de proteína de 1,27 mg/mL. A solução estoque foi posteriormente aliquotada em 2 frascos de 10 ml, 4 frascos de 5 ml e 4 frascos de 1 ml. As alíquotas foram filtradas (0,2 μm), congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. Métodos analíticos foram realizados por ensaio de Bradford e SDS page com marcação de Coomassie ou western blotting de acordo com o práxis experimental regular. Os seguintes anticorpos foram usados para detecção de β3 por western blotting: Cabra-Anti -GST primário, Amersham, No. 27-4577-01, 1:5000, 1h TA, e Fragmento secundário F(ab’)2 Coelho-Anti-Cabra IgG (H+L) x AP, Dianova, 305-056-045, 1:1000, 1h TA, seguido por Precision Strep Tactin-AP Conjugado, BioRad, Nr. 161-0382, 1:5000.

Exemplo 1.3: Geração de gpiibiiia

[000179] O gpiibiiia humano completo foi extraído de plaquetas humanas antigas usando octilglicosídeo como anteriormente detalhado (Mitjans et al., J Cell Sci 1995, 108 (Pt 8): 2825-38).

EXEMPLO 2: Geração de anticorpos

[000180] A geração de anticorpos monoclonais de coelho seguiu um procedimento de quatro etapas: (A) imunização de coelhos e rastreamento de soros policlonais, (B) fusão para gerar células de hibridoma e rastreamento de sobrenadantes de multiclones, (C) subclonagem e rastreamento de sobrenadantes de subclones, e (D) clonagem de cDNA do anticorpo que codifica insertos, sequenciamento e inserção em vetores de expressão de EBNA para permitir a produção de anticorpos inteiramente definidos. Sangramentos de coelho, sobrenadantes de hibridoma e anticorpos purificados foram analisados em ELISA contra imunógenos purificados imobilizados, após protocolos padrão. Os clones positivos foram retestados pelo rastreamento diferencial contra domínios extracelulares recombinantes de αvβ3, αvβ5 αvβ6 e αvβ8 para entrega, para confirmar especificidade e atividade.

[000181] Na etapa (A), vários coelhos por imunógeno foram imunizados e os títulos de antisoros foram monitorados. Pré- sangramentos de todos os coelhos não deu sinal até em baixa diluição (1:50) nos materiais FFPE, enquanto sangramentos primários (soros policlonais) antes da fusão já deu sinais claros e inequívocos, com indicações fortes da especificidade de proteínas de superfície celular. Três sangramentos de cada coelho foram entregues, e um coelho positivo único por imunógeno foi selecionado para a fusão após 8 a 12 semanas.

[000182] Na etapa (B), as células B de coelhos soropositivos foram isolados, e a linhagem celular de fusão de coelho de associação 240E- W foram fusionados às células B de coelho isoladas para criar células de hibridoma de coelho. Placas de 96 poços foram rastreadas para a fusão por ELISA. O sobrenadante de 10 a 100 clones positivos foi entregue, e 3 multiclones por imunógeno foram selecionados a partir após 5 a 6 semanas.

[000183] Na etapa (C), os hibridomas foram clonados e rastreados para selecionar clones que secretam anticorpos com o reconhecimento de antígeno específico apropriado, e os anticorpos são caracterizados usando uma variedade de métodos (western blotting, IHC, ICC, citometria de fluxo, etc.). Os sobrenadantes de subclones foram particularmente rastreados com ELISA para reconhecimento específico de antígeno. Os sobrenadantes de subclones testados positivos foram congelados e armazenados a - 80°C até o uso. Posteriormente, os sobrenadantes de subclone foram rastreados no processo de etapa dupla do Exemplo 3, primeiro no arranjo de linhagem celular de câncer e na segunda etapa no tecido de xenoenxerto com uma tabela de linhagem celular de câncer em paralelo para verificar o primeiro rastreamento.

[000184] Na etapa (D), as sequências de DNA dos clones de anticorpo selecionados foram extirpadas, clonadas em vetores de expressão de EBNA, e sequenciadas por sequenciamento automatizado de cDNA com corante Sanger. Os anticorpos recombinantes foram produzidos no sistema de expressão celular EBNA de acordo com Pham et al., Biotech Bioeng 2003, 84 (3): 332342, mas com a modificação menor de uso de células HEK293-6E com o vetor pTT5 do sistema de transfecção transiente. A produção de anticorpo foi verificada por ELISA e IHC. mRNA de células de hibridoma foi isolado usando Conjunto TuboCapture (Qiagen) após sugestão do fabricante e em seguida transcrito reversamente em cDNA usando iniciador oligo-dT. A região variável da cadeia pesada (VH) foi amplificada por PCR usando iniciadores proprietários OYZ64-2 e OYZvh3. A cadeia leve inteira (L) foi amplificado por PCR usando iniciadores proprietários OYZ62 e OYZ71. A região VH de fragmentos de PCR foi digerida usando enzima de restrição HindIII e Kpnl. Os fragmentos L de PCR foram digeridos usando HindIII e NotI. Todo o produto digerido foi purificado usando conjunto de purificação Qiagen PCR. Após purificação, o fragmento VH ou L foi ligado no vetor de expressão proprietário da cadeia pesada ou leve correspondente e transformado em células competentes DH5α (MC Lab). As colônias transformadas foram escolhidas e os insertos foram confirmados usando as enzimas de restrição correspondentes (por tamanho esperado: aproximadamente 440 bp de VH e 740 bp de L). Os plasmídeos com insertos de tamanho esperado foram sequenciados usando TT5 para o iniciador. A cadeia leve inteira ou o fragmento da cadeia pesada foram extirpados do vetor correspondente com HindIII e NotI e posteriormente purificados usando conjunto de purificação Qiagen PCR. Aproximadamente 50 a 100 ng de insertos de cDNA foram depositados.

EXEMPLO 3: Métodos para rastreamento e caracterização de anticorpos EXEMPLO 3.1 Composições da Tabela

[000185] Vinte e sete linhagens celulares de câncer e uma linhagem celular de inseto foram fixadas em fosfato tamponado, paraformaldeído 4%, pH 7, em 16 a 24 horas à temperatura ambiente, introduzida na parafina e arranjada em um bloco de parafina de linhagem celular 28 (CAX05). O perfil de expressão de superfície de célula de integrina de várias das linhagens celulares usadas no arranjo foi anteriormente caracterizado por citometria de fluxo, usando anticorpos monoclonais de camundongo definidos, tais como LM609 (Cheresh & Spiro, JBC 1987, 262: 17703-17712) e P1F6 (Varner & Cheresh, Important Adv Oncol 1996, 87: 69) direcionado contra complexos de integrina αvβ3 e αvβ5, respectivamente (Mitjans et al., J Cell Sci 1995, 108 (Pt 8): 2825-38).

[000186] Arranjos com resultado de estudos experimentais diferentes (Xeno-08-A; Xeno-08-Mu1) foram compostos usando xenoenxertos de camundongos tratados com veículo.

A549, HCT116, U87MG, M21, Calu 6, A431, BT474, Colo205, H1975, MDA MB-231, Mes-Sa/Dx5, PC3, SW707, A2780, A2780ADR

[000187] Seções de 3 μm do arranjo de linhagem celular de câncer e os arranjos de xenoenxerto foram montados em lâminas SuperFrost®Plus positivamente carregadas (Menzel-Glaeser, Braunschweig, Alemanha) e armazenadas a -80°C com o dessecativo.

Exemplo 3.2: Procedimento de IHC

[000188] O procedimento de marcação imunohistoquímico que começa com a desparafinização das seções foi feito com os instrumentos de marcação Discovery™ ou a Discovery® XT (Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, EUA). Após as seções de desparafinização serem aquecidas para a recuperação de epítopo no tampão de Tris-EDTA pH 8 ou incubadas com protease a 37°C durante 8 (protease 1) ou 12 min (protease 2). Peroxidase endógena foi bloqueada pela incubação em peróxido de hidrogênio 3% (parte de Conjuntos OmniMap™ ou UltraMap™, Ventana Medical Systems). Após aquecer os sobrenadantes à temperatura ambiente no dia da primeira corrida imunohistoquímica, azida de sódio foi adicionada a uma concentração final de 0,01% (p/v), e os sobrenadantes foram armazenados a 4°C. Uma série de sobrenadantes foi sempre marcada com o mesmo instrumento. Seções foram incubadas com os sobrenadantes de multiclones e subclones, ou anticorpos recombinantemente expressos (2-10 μg/mL; 100 μL por lâmina), e em seguida com o anticorpo secundário apropriado, como são polímeros conjugados a HRP do Conjunto UltraMap ou OmniMap, por 16 min a 37°C. Peroxidase de rábano silvestre (HRP) catalisa a reação de 3,3’- tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB)/H2O2 para produzir um precipitado marrom-escuro insolúvel que pode ser visualizado. As seções foram contramarcadas com hematoxilina. A lâmina foi lavada na água de torneira, desidratada e montadas com lamínulas de vidro em meios de montagem permanente Entellan® Neu (VWR, Alemanha). A lâmina foi armazenada à temperatura ambiente, e os blocos de parafina foram armazenados a 6°C.

[000189] Diagrama de procedimento de marcação imuno- histoquímica: A. Pré-tratamento - Desparafinização (temperatura: 75°C por 8 min, então Tampão EZ Prep a 75°C por 8 min) - Condicionamento de célula (tampão Tris EDTA pH 8, tempo: 48 min; temperatura: 95°C) ou - Condicionamento de protease (protease 1: 0,5 U/mL, ou protease 2: 0,1 U/mL; tempo: 8 ou 12 min; temperatura: 37°C) B. Detecção - Anticorpo primário (volume: 100 μL; tempo: 32 min; temperatura: 37°C) - Anticorpo secundário (OmniMap ou UltraMap conjugados com HRP; volume: 100 μL; - tempo: 16 min; temperatura: 37°C) - Detecção (ChromoMap DAB) - Contramarcador (Hematoxilina II; tempo: 8 min) - Pós-contramarcador (Reagente de Bluing) - Limpeza de lâmina

[000190] Os arranjos de linhagem celular foram esquadrinhados com o microscópio automatizado Ariol SL-50 em X20 (escala x/y: 1 pixel = 0,38 x 0,38 μm2). Uma região circular (área de região de entrada) de 0,1 mm2 foi estabelecida em cada lugar do tecido. A cor marrom da marcação imunohistoquímica positiva foi quantificada com a ajuda do programa de análise de imagem do Ariol SL-50 definindo limiares de "cor", "tom", e "saturação". A área positiva na área de região de entrada foi a fração do tecido marcado de marrom. A intensidade da área positiva foi o valor cinza médio do marrom medida em 3 imagens pretas e brancas fotografadas com um filtro vermelho, um azul e um verde. Os valores cinza variam de 0 (preto) a branco (255). A expressão foi calculada de acordo com a fração de área positiva * (de intensidade 255). Os dados foram expostos com Spotfire®DecisionSite™ (versão 9.0, Spotfire Inc).

Exemplo 3.3: protocolo de ELISA

[000191] Integrinas recombinantes (1 μg/mL) foram recobertas em placas de microtítulo por adsorção (4°C; 16 h) de tampão de revestimento (NaCl 150 mM; CaCh 1 mM; MgCh 1 mM; MnCh 10 μM; Tris-Cl 50 mM; pH 7,5). As placas foram lavadas (tampão de lavagem: BSA 0,5%; Tween 20 0,05% em PBS), bloqueadas (1 h; 4°C; BSA 5% em PBS), e incubadas com anticorpos primários em série diluídos em tampão de lavagem (1 h; 37°C). Após lavagem, anticorpo de detecção secundário (HRP de cabra-anti-coelho; 1:5000) foi adicionado (1 h; 37°C), seguido por lavagem e detecção usando tetrametilbenzidina (100 μg/mL) em tampão citrato-fosfato (pH 5,0), desenvolvimento com ácido sulfúrico, e leitura contra um branco de reagente em 450 nm. Os resultados foram expressos após subtração dos valores em branco que foram tipicamente <5% de valores controle positivos.

Exemplo 3.4: análise de FACS

[000192] As células em crescimento log foram coletadas usando tripsina (0,5 μg/mL)/EDTA (0,2 μg/mL), lavadas em tampão FACS (PBS mais CaCl2 0,9 mM; MgCl2 0,5 mM; BSA 0,5% p/v), e incubadas com anticorpos anti-integrina (60 min; 4°C; 10 μg/mL em tampão FACS). Após lavagem, as células foram marcadas com IgG anticoelho marcado com Alexa-488 (Invitrogen), ou IgG anti-camundongo de cabra FITC (Becton-Dikinson) (30 min; 4°C), lavadas e ressuspensas em tampão FACS (500 μL/tubo). As células foram analisadas em um FACScan (Becton-Dickinson) e a fluorescência de intensidade média (MIF) foi normalizada para o MIF do controle negativo (células marcadas com PI e anticorpo marcado secundário, sem anticorpo primário).

Exemplo 3.5: Avaliação e estatística

[000193] A IC50 da ligação de anticorpo em ELISA foi determinada de pontos de dados triplos pelo ajuste de curva não linear no pacote do programa gráfico Graphpad Prisma (Ver 5.0: GraphPad Software, Inc LaJolla Ca). A citometria de fluxo foi analisada usando o programa BD Facs-scan (CellQuest MacOS 8.6).

EXEMPLO 4: Caracterização de clones anti-αvβ3 e anticorpos anti- αvβ3 Exemplo 4.1: Caracterização de E3528-2-7, E3528-2-11 e E3528-2-12

[000194] Os sobrenadantes de 24 subclones obtidos de multiclones 2 e 63 do coelho E3528 foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX05. Os sinais citoplasmáticos sem perfil de membrana claro foram excluídos como não específicos para integrina. Subclones do multiclone 2 exibem uma marcação de membrana plasmática (Figura 1). A seletividade dos subclones quanto a certos tipos celulares foi comparada com IgG monoclonal de camundongo, clone 20H9. O clone 20H9 é um anticorpo de cadeia anti-β3 (Mitjans et al., J Cell Sci 1995, 108 (Pt 8): 2825-38), que reage cruzadamente em FFPE, entretanto com uma baixa afinidade de ligação. Os subclones positivos foram testados dentro de uma segunda corrida em arranjo de xenoenxerto Xeno-08-A para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral (Tabela 1). Tabela 1: Clones para domínio extracelular αvβ3. A intensidade de marcação foi classificada como - (negativo) a +++ (forte).

[000195] Três subclones, 2-7, 2-11 e 2-12, foram selecionados como clones finais, baseados em intensidade de marcação, seletividade quanto a células positivas conhecidas para integrina αvβ3 e qualidade da marcação de membrana plasmática. Os três clones anti-αvβ3 exibiram características de marcação similares, mostrando marcação de membrana plasmática distinta (Figura 2). No arranjo de xenoenxerto Xeno-08-Mu1, os xenoenxertos de M21 foram os únicos positivos (Figura 3). Os subclones foram negativos em uma faixa de carcinomas incluindo A549 e HCT116, conhecidos por não expressarem αvβ3 (Tabela 2), e no linfoma de célula T Raji independente de ancoragem. Estes dados estão de acordo com um epítopo αvβ3 de integrina dos anticorpos. A seletividade e intensidade da marcação com os três anticorpos no arranjo de linhagem celular de câncer foram quase idênticas (Figura 4). A seletividade da marcação dos três anticorpos foi comparada com o clone monoclonal de anticorpo anti-β3 de integrina 20H9 (Figura 5, mostrada para o clone E3528-2-7). Quanto à seletividade celular, os três clones mostraram características similares ao clone 20H9, indicando que o epítopo dos três anticorpos foi um epítopo αvβ3. A alta expressão de αvβ3 em linhagens celulares M21 foi mostrada anteriormente pela análise FACS com o clone LM609 (Tabela 2; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87 (5): 716-723). Tabela 2: análise de FACS e imunohistoquímica anti-αvβ3 de várias linhagens celulares de câncer.

Exemplo 4.2: Caracterização de E3531-227 e E3531-229

[000196] Similarmente ao Exemplo 4.1, o subclone 227-3 foi obtido após uma segunda corrida de fusão de linfócitos B de coelho E3531. Os sobrenadantes de 18 subclones obtidos de multiclones 227 e 229 foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX05. Os sinais citoplasmáticos sem perfil de membrana claro foram excluídos como não específico para integrina. Os subclones de ambos os multiclones exibiram uma boa marcação de membrana plasmática. A seletividade dos subclones quanto a certos tipos celulares foi comparada com IgG monoclonal de camundongo, clone 20H9. Os subclones positivos foram testados dentro de uma segunda corrida no Xeno-08-A de arranjo de xenoenxerto para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral. Seis subclones, E3531-227-2,-227-3, 227-6,-229-3, 229-9 e-229-11 foram selecionados como clones finais, baseados em intensidade de marcação, seletividade quanto à células positivas conhecidas para integrina αvβ3, e qualidade da marcação de membrana plasmática.

[000197] Os clones finais selecionados foram cultivados e os anticorpos purificados. Os seis clones de anti-αvβ3 exibiram características de marcação similares, mostrando marcação de membrana plasmática distinta (Figura 6). No Xeno-08-Mu1 do arranjo de xenoenxerto, os xenoenxertos M21 foram os únicos positivos (Figura 7). U87MG foram negativos. A seletividade da marcação com os três anticorpos E3531-227-2, E3531-227-3 e E3531-227-6 no arranjo de linhagem celular de câncer CAX08 foi quase idêntica (Figura 8). A seletividade da marcação dos anticorpos anti-αvb3 foi comparada ao clone de anticorpo monoclonal anti-β3 de integrina 20H9, mostrada para o clone E3531-227-3 (Figura 8). Quanto à seletividade celular, os clones mostraram características similares ao clone 20H9, indicando que o epítopo dos seis anticorpos foi um epítopo de αvβ3. A alta expressão de αvβ3 em linhagens celulares M21 foi mostrada anteriormente pela análise FACS com o clone LM609 (Tabela 3; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87 (5): 716-723). Os clones E3531-227-3 e E3531-229-3 produzindo a quantidade de IgG mais alta foram sequenciados e mostraram sequências idênticas (cf. abaixo). Tabela 3: Análise FACS e imunohistoquímica anti-β3 de várias linhagens celulares de câncer.

[000198] As características de marcação dos seis clones E3531-227- 2,-227-3, 227-6,-229-3, 229-9 e-229-11, como são "marcação de membrana plasmática" e o alto sinal em células M21, foram de acordo com um epítopo αvβ3 de integrina dos anticorpos. Os anticorpos detectaram αvβ3 no tecido embebido em parafina e fixado em formaldeído. EM22703 foi ainda desenvolvido. Reage igualmente bem em αiibβ3 intacto (IC50 foi a mesma em ELISA), indicando que detectava a cadeia β3 no complexo com ambos os parceiros. Isto refletiu o poder do anticorpo monoclonal de detectar exatamente contra o que foi rastreado. Na prática, a reatividade cruzada não deve comprovar uma desvantagem séria à detecção de αvβ3 in situ: αiibβ3 é expresso sozinho em macrófago/linhagens originadas de sangue megacariocíticas, e raramente esperado ser visto na característica de posições intratecido de αvβ3.

EXEMPLO 5: Caracterização de clones de anti-αvβ5 e anti-αvβ5- antibodies

[000199] Os sobrenadantes de 27 subclones obtidos de multiclones 13, 40 e 99 do coelho E3536 foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX05. Três subclones, 99-1, 99-2 e 99-3, exibiram uma marcação de membrana plasmática (Figura 9). Os sobrenadantes de hibridoma foram altamente específicos para αvβ5 sobre αvβ3 (um fator de> 100 em Kd aparente), com EC50 no imunógeno de 50 pM (Figura 10). Os subclones positivos foram testados no arranjo de xenoenxerto para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral (Figura 9, coluna direita). As linhagens celulares mostraram graus diferentes da expressão de αvβ5 se cultivadas na cultura em comparação com o tecido de xenoenxerto. Tabela 4: Clones a domínio de αvβ5 extracelular. A intensidade de marcação foi classificada de - (negativo) a +++ (forte).

[000200] Três subclones, 99-1, 99-2, e 99-3, foram selecionados como clones finais baseados em intensidade de marcação, seletividade quanto à células positivas conhecidas para integrina αvβ5 e qualidade da marcação de membrana plasmática (Tabela 4). Os três clones de anti-αvβ5 marcaram a membrana plasmática (Figura 11). No arranjo de xenoenxerto Xeno-08-Mu1, vários xenoenxertos foram positivos, especialmente A431 (Figura 12). Os três clones anti-αvβ5, E3536-99-1, -99-2 e -99-3, exibiram características de marcação muito similares quanto à seletividade celular e marcação de intensidade medida com a análise de imagem (Figura 13). As linhagens celulares que mostraram um sinal alto de αvβ5 _E3536-99-1 (ou -99-2, ou -99-3) (isto é, HT-29, HCT116, Kyse 30, A549 e NCI-H460) exibiram alta expressão de αvβ5 analisada por FACS com o clone P1F6 (Kemperman et al., Exp Cell Res 1997, 234 (1): 156-164; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87 (5): 716-723). A linhagem celular M21 exibiu um sinal baixo com a imunohistoquímica e um sinal baixo correspondente pela análise FACS (Tabela 5). As células de linfoma de Raji, que foram αv negativas, não mostraram nenhum sinal no arranjo de linhagem celular de câncer com a imunohistoquímica. Tabela 5: Análise FACS e imunohistoquímica anti-αvβ5 de várias linhagens celulares de câncer.

[000201] As características de subclone combinaram com FACS e dados bioquímicos para a distribuição da integrina de αvβ5 e suportaram subclones 99 ao reagir com um epítopo αvβ5 de integrina. Os clones 99 foram derivados de uma célula de hibridoma única, como revelado pelo sequenciamento cDNA (cf. abaixo).

EXEMPLO 6: Caracterização de clones anti-αvβ6 e anticorpos anti- αvβ6

[000202] Os sobrenadantes de 33 subclones obtidos destes multiclones foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX08. Os sinais citoplasmáticos sem perfil de membrana claro foram excluídos como não específicos para integrina. Muitos sobrenadantes de subclone testados nas linhagens celulares de câncer foram positivos após calor bem como após pré-tratamento de protease. Os subclones dos multiclones 52 (Figura 14), 106 e 118 mostraram uma boa marcação de membrana plasmática. Os subclones positivos foram testados dentro de uma segunda corrida no Xeno-08-Mu1 do arranjo de xenoenxerto para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral. O pré-tratamento de protease resultou em um sinal mais alto dos subclones de 52 e 106. Por isso, estes sobrenadantes de subclone foram testados em xenoenxertos pré-tratados somente com protease. Os subclones diferentes do multiclone 52 foram idênticos em sua seletividade de marcação e especificidade. O clone 106-1 foi negativo em SW707 em contraste com os subclones dos multiclones 52 e 118 (Tabela 6). Tabela 6: Sobrenadantes de subclone para domínio extracelular de αvβ6. A intensidade de marcação foi classificada de - (negativo) a +++ (forte) bem como de 0 (negativo) a 3 (forte).

[000203] No tecido de xenoenxerto, a linhagem celular de câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC) H1975 mostrou a intensidade de marcação mais alta (Figura 14a). No arranjo de linhagem celular de câncer, dois carcinomas de células escamosas Kyse30 (Figura 14I) e A431 (Figuras 14A), e no arranjo de xenoenxerto, os xenoenxertos A431 (Figuras 14B) mostraram um alto sinal. As linhagens celulares com alta intensidade de marcação no arranjo de linhagem celular de câncer foram HT29 (Figura 14G), MDA- MB468, Colo205 e A431. Isto correspondeu ao alto mRNA β6 de integrina destas linhagens celulares. A seletividade e a especificidade dos sobrenadantes de subclone dos multiclones 52, 106 e 118 foram de acordo com um epítopo αvβ6 reconhecido pelos anticorpos. Nove subclones, 52-1, 52-2, 52-3, 52-4. 52-6, 52-8, 52-9, 106-1 e 118-1 foram selecionados como clones finais, baseados em intensidade de marcação, seletividade quanto a células positivas conhecidas para integrina αvβ6 e qualidade da marcação de membrana plasmática (Tabela 6). De subclones com marcações idênticas, aqueles com a concentração de IgG mais alta foram selecionados como clones finais.

[000204] O clone com a concentração IgG mais alta, clone E3866-52- 1, foi cultivado e o anticorpo purificado de acordo com os protocolos padrão. A atividade do anticorpo foi mostrada por IHC no arranjo de linhagem celular de câncer (Figura 15). Com o anticorpo recombinante, várias lâminas do arranjo de linhagem celular de câncer e xenoenxertos foram marcadas (Figura 16). Em xenoenxertos de câncer de cólon HT29, carcinoma de pulmão H1975 e um explante tumoral de próstata do paciente PRXF MRIH (Oncotest GmbH, Freiburg) o anticorpo anti-αvβ6 recombinante mostrou um sinal pronunciado, ao passo que um xenoenxerto de melanoma M21 sem expressão mRNA de β6, foi negativo (Figura 16). O anticorpo recombinante anti-αvβ6 mostrou uma marcação clara da membrana plasmática (Figura 17). O sinal no arranjo de linhagem celular de câncer foi quantificado com o auxílio da análise de imagem (Figura 18). As linhagens celulares com o alto sinal de marcação de anticorpo, como foram HT29, Colo205 ou MDA-MB468, corresponderam às linhagens celulares com altos níveis de mRNA do mRNA de integrina β6. O anticorpo recombinante anti-αvβ6 mostrou alta reprodutibilidade lâmina a lâmina (r=0,996) e corrida a corrida (r=0,991, Figura 19) usando procedimentos automatizados de marcação.

[000205] O anticorpo IgG recombinante de coelho αvβ6 (EM05201) gerado contra um peptídeo integrina-αvβ6 era adequado para o tecido FFPE. As especificidades de ELISA e as características de marcação do anticorpo recombinante αvβ6 (EM05201), como eram "marcação de membrana plasmática"e alto sinal em linhagens celulares que expressam alta integrina β6 mRNA, foram de acordo com um epítopo de integrina-αvβ6 do anticorpo.

EXEMPLO 7: Caracterização de clones anti-αvβ8 e anticorpos anti- αvβ8

[000206] Os sobrenadantes de 36 subclones obtidos destes multiclones foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX08. Os 36 subclones mostraram um sinal de membrana, nenhum foi excluído devido a não marcação citoplasmática específica para integrina. Muitos sobrenadantes de subclone testados nas linhagens celulares de câncer foram positivos após calor bem como após pré-tratamento com protease. Para cada multiclone, quatro subclones com as concentrações de IgG mais altas foram selecionados para o teste adicional no Xeno-08-Mu1 de arranjo de xenoenxerto para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral (Figura 20). O pré-tratamento de protease resultou em um sinal mais alto dos subclones. Os subclones do multiclone 6 foram negativos nos xenoenxertos. As linhagens celulares com a alta intensidade de marcação no arranjo de linhagem celular de câncer, como foram Ovcar-3, M24met, MDA-MB 468 e A431 mostraram a expressão de mRNA mais alta da integrina β8 (Tabela 7). Os subclones 40-4, 40-10, 40-11, 133-5, 133-8 e 133-9 foram selecionados como clones finais, baseados na seletividade quanto à expressão conhecida de mRNA β8 e qualidade da marcação de membrana plasmática. De subclones com marcações idênticas, aqueles com a concentração de IgG mais alta foram selecionados como clones finais. Tabela 7: sobrenadantes de subclone a domínio Dvβ8 extracelular. A intensidade de marcação foi classificada de - (negativo) ao +++ (forte) bem como de 0 (negação) a 4 (muito forte).

[000207] O clone com a concentração de IgG mais alta, clone E3875-133-9, foi cultivado e o anticorpo purificado de acordo com os protocolos padrão. A atividade do anticorpo foi mostrada por IHC no arranjo de linhagem celular de câncer (Figura 21).

[000208] Com o anticorpo recombinante, várias lâminas dos arranjos de linhagem celular de câncer, xenoenxertos, e um arranjo fora do tecido humano normal foi marcado. As linhagens celulares de câncer Ovcar-3 (carcinoma ovariano), M24-met (melanoma) e MDA-MB468 (carcinoma de mama), todos expressando mRNA de β8, foram positivos, ao passo que células MCF-7 (carcinoma de mama) sem mRNA de β8, foram negativos (Figura 22). Destas linhagens celulares, nenhum xenoenxerto estava disponível. Em xenoenxertos de carcinoma de pulmão H1975 e mais forte no explante tumoral de próstata PRXF MRIH (Oncotest GmbH, Freiburg) xenoenxertos do anticorpo anti-αvβ8 recombinante mostrou algum sinal (Figura 22). O sinal mais forte foi observado em nervos periféricos humanos (Figura 23). O anticorpo recombinante anti-αvβ8 mostrou uma marcação clara da membrana plasmática (Figura 24). O sinal no arranjo de linhagem celular de câncer foi quantificado com o auxílio da análise de imagem (Figura 25). As linhagens celulares com o alto sinal de marcação de anticorpo, como foram Ovcar-3, M24-met, e MDA-MB468, corresponderam às linhagens celulares com altos níveis mRNA de integrina β8 mRNA. O anticorpo recombinante anti-αvβ8 mostrou alta reprodutibilidade lâmina a lâmina (r=0,982) e corrida a corrida (r=0,986, Figura 26).

[000209] O anticorpo IgG de coelho recombinante αvβ8 (EM13309) gerado contra um peptídeo integrina anti-αvβ8 adequado para o tecido FFPE. As especificidades de ELISA e as características de marcação do anticorpo recombinante αvβ8 (EM13309) como são "marcação de membrana plasmática", alto sinal em linhagens celulares que expressam alto mRNA de integrina β8, e marcação forte de nervos periféricos mielinados foi de acordo com um epítopo αvβ8 do anticorpo.

EXEMPLO 8: Caracterização de clones anti-αv e anticorpos anti-αv

[000210] Os multiclones anteriormente selecionados que se ligam a αvβ6 bem como a αvβ8 foram os multiclones E3866-68 e E3875-13. Os sobrenadantes de 24 subclones obtidos destes multiclones foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX08. Os 24 subclones mostraram um alto sinal de membrana plasmática, entretanto também algum sinal citoplasmático (Figura 27). Nove subclones, 5 do multiclone E3875-13 e 4 do multiclone E3866-68, foram selecionados para testar no tecido de xenoenxerto para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral. Por causa de um sinal muito alto, os sobrenadantes de clones 13-3, 13-9 e 68-7 foram diluídos 1:5 e 1:10. Os sobrenadantes diluídos 13-3-e 13-9 marcaram todas as células no arranjo de linhagem celular de câncer exceto células de linfoma Raji e célula de inseto Sf9. Os xenoenxertos mostram alto sinal de membrana plasmática, e também um pouco de marcação citoplasmática (Figura 27). Após diluição 1:5, o subclone 68-7 não marcou MiaPaca2, uma linhagem celular que foi positiva para o subclone 13-3. O epítopo dos subclones do multiclone E3688-68 poderia ser diferente de E3875-13. Os subclones E3875-13- 3 e -13-9 foram selecionados como clones finais, baseados em sua concentração de IgG mais alta (Tabela 8). Tabela 8: sobrenadantes de subclone a domínio αv extracelular. A intensidade de marcação foi classificada de - (negativa) ao +++ (forte) bem como de 0 (negativa) a 3 (forte).

[000211] O clone com a concentração de IgG mais alta, o clone E3875-13-9, foi cultivado e o anticorpo purificado de acordo com os protocolos padrão (Sepharose Proteína G, HiLoad Superdex 200 pg). A atividade do anticorpo foi mostrada por IHC no arranjo de linhagem celular de câncer (Figura 28).

[000212] Com o anticorpo recombinante, várias lâminas de arranjos de linhagem celular de câncer e arranjos de xenoenxerto foram marcados (Figura 29). Em linhagens celulares de câncer bem como em xenoenxertos do anticorpo recombinante anti-αv mostraram um sinal pronunciado. Negativas são linhagens celulares de linfoma, como linfoma de Raji e de Pfeiffer que não expressam mRNA de integrina anti-αv. O anticorpo recombinante mostrou uma marcação clara da membrana plasmática (Figura 30). O sinal no arranjo de linhagem celular de câncer foi quantificado com o auxílio da análise de imagem (Figura 31). O anticorpo recombinante anti-αv mostrou reprodutibilidade lâmina a lâmina (r=0,947) e corrida a corrida (r=0,924, Figura 32).

[000213] O anticorpo recombinante IgG de coelho αv (EM01309) gerado contra o peptídeo de integrina αvβ8 adequado para o tecido FFPE. As especificidades ELISA e características de marcação do anticorpo recombinante αv (EM01309), como foram "marcação de membrana plasmática", o alto sinal em linhagens celulares que expressam mRNA de αv-integrina, e nenhum sinal em linhagens celulares de linfoma que não expressam αv-integrina foi de acordo com o epítopo da cadeia αv do anticorpo.

EXEMPLO 9: Caracterização de clones de integrina de domínio citoplasmático anti-β3 e anticorpos de integrina de domínio citoplasmático anti-β3

[000214] Os sobrenadantes de 24 subclones obtidos de multiclones 2 e 67 foram rastreados não diluídos no arranjo de linhagem celular FFPE de linhagens celulares de câncer CAX05. Os sinais citoplasmáticos sem perfil de membrana claro foram excluídos como não específicos para integrina. Os subclones do multiclone 2 exibiram uma boa marcação de membrana plasmática. A seletividade dos subclones quanto a certos tipos celulares foi comparada com IgG monoclonal de camundongo, o clone 20H9. Os subclones positivos foram testados dentro de uma segunda corrida no arranjo de xenoenxerto Xeno-08-A para confirmar a reatividade cruzada no tecido tumoral. Três subclones, 2-4, 2-10 e 2-12, foram selecionados como clones finais, baseados em intensidade de marcação, seletividade quanto a células positivas conhecidas para integrina αvβ3, e qualidade da marcação de membrana plasmática (Tabela 9). Tabela 9: Subclones para domínio β3 intracelular. A intensidade de marcação foi classificada como - (negativa) a +++ (forte) bem como 1 (baixa), 2 (média), 3 (alta).

[000215] Os clones finais selecionados foram cultivados e os anticorpos purificados. Três clones anti-β3, E3592-2-4, -2-10, e -2-12, exibiram características de marcação similares, mostrando marcação de membrana plasmática distinta (Figura 33). No arranjo de xenoenxerto Xeno-08-Mu1, os xenoenxertos M21 foram positivos (Figura 34). U87MG foi negativo. A seletividade da marcação com os três anticorpos no CAX08 do arranjo de linhagem celular de câncer foi quase idêntica (Figura 35). A intensidade de marcação variou e foi mais forte para o clone E3592-2-12. A seletividade da marcação dos três anticorpos foi comparada com o clone de anticorpo monoclonal anti-β3 de integrina de exo-domínio 20H9, mostrada para o clone E3592-2-12 (Figura 36). Quanto à seletividade celular, os três clones mostraram características similares ao clone 20H9, indicando que o epítopo dos três anticorpos foi um epítopo β3. A alta expressão de αvβ3 em linhagens celulares M21 foi mostrada anteriormente pela análise FACS com o clone LM609 (Tabela 10; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87 (5): 716-723). Tabela 10: Análise de FACS e imunohistoquímica anti-β3 de várias linhagens celulares de câncer.

[000216] As características de marcação dos três clones E3592-2-4, -2-10, e -2-12, como foram "marcação de membrana plasmática" e alto sinal em M21, foram de acordo com um epítopo β3 de integrina dos anticorpos. Os clones de hibridoma de coelho E3592-2-4, -2-10, e -212 gerados contra o peptídeo β3-integrina produziram anticorpos adequados para o tecido FFPE. Seu reconhecimento de epítopo foi de acordo com seu epítopo de domínio citoplasmático β3 de ligação. As cadeias de anticorpo do clone que produz o anticorpo de marcação mais fortemente, e3592-2-12, teve o cDNA clonado e as regiões de codificação de anticorpo foram multiplamente sequenciadas (cf. abaixo).

EXEMPLO 10: Sequenciamento e listagem de sequência

[000217] Vários clones foram avaliados pelo sequenciamento de cDNA (Tabela 11). A informação registrada em forma legível em computador é idêntica à listagem de sequência escrita. Tabela 11: Clones sequenciados.

[000218] Três corridas de sequenciamento primárias em cada uma das cadeias pesadas e leves dos clones foram montadas em contíguos usando o programa Lasergene (DNAstar Inc) e analisados usando múltiplas ferramentas de alinhamento ClustalW. Os clones E3531-227-3 e -229-3 tinham sequências idênticas de cadeia pesada e leve, confirmando a monoclonalidade da população de anticorpo. Os clones E3536-99-1, -99-2 e -99-3 tinham sequências idênticas de cadeia pesada e leve, confirmando a monoclonalidade da população de anticorpo.

EXEMPLO 11: RabMabs recombinantes são específicos para seus ligantes por ELISA.

[000219] Em condições padrão de ELISA com integrina recoberta 1 μg/mL na placa, os anticorpos foram essencialmente monoespecíficos para seus imunógenos, como definido sendo melhor do que 4 logs de concentrações, e não interreagiram significativamente com as cadeias de integrina ainda mais estritamente relacionadas (Figuras 10, 37, 38), com a exceção de EM09902 que mostrou uma reatividade cruzada (IC50 ~ 100 vezes mais baixa) tanto com gpiibiiia como com αvβ3, já que aparentemente reconheceu um epítopo relacionado tanto nas cadeias β5 como β3 dos complexos. Não deve afetar seriamente o uso de FFPE, como a expressão de αvβ5 é mais prevalente do que αvβ3 e o sinal de EM09902 é extremamente forte em IHC. As especificidades de outros anticorpos recombinantes foram indistinguíveis em ELISA e em IHC de marcação dos sobrenadantes de hibridoma e anticorpos derivados dos mesmos (Figuras 10, 37, 38). De fato, no sequenciamento de cDNA, encontrou-se que dois dos anticorpos anti- αvβ3, EM22703 e EM22903, eram derivados de um clone único. As especificidades em ELISA e as afinidades de ligação aparentes expressas como IC50 em ELISA foram mostradas na Tabela 12. Tabela 12: IC50 de RabMab Recombinante em ELISA em integrinas isoladas.

EXEMPLO 12: RabMabs recombinantes não afetam a ligação de ligante aos seus receptores.

[000220] Ambos os anticorpos e pequenas moléculas podem inibir ou aumentar a atividade de integrina, entretanto RabMabs selecionados aqui não tinham nenhum efeito sobre a ligação de ligante (Figura 39). Os inibidores de αvb3 e αvb5, reagiram como predito, positivo (cilengitida) e negativo (c(RβA-DfV)).

EXEMPLO 13: RabMabs Recombinantes em citometria de fluxo de célula viva ("FACS")

[000221] Em FACS, integrinas nativas apresentaram seu modelo in situ de glicosilação nativa, portanto que representa uma especificidade "padrão ouro". Os RabMabs foram avaliados em FACS em comparação com o padrão bem caracterizado de anticorpos monoclonais murinos. Para αvβ8, nenhum anticorpo está comercialmente disponível. Os anticorpos reagiram em FACS em um tipo celular dependente do modo e perfis de FACS estritamente combinados aos perfis de ELISA dos anticorpos. Os resultados foram resumidos como a intensidade média da fluorescência normalizada para os anticorpos controle de segunda camada (Tabela 13). As diferenças nos níveis absolutos da expressão entre RabMabs e Mabs de camundongo foram prováveis devido à afinidade variada dos anticorpos de segunda camada. Tabela 13: RabMab e a atividade de anticorpo comparador em citometria de fluxo de célula viva usando anticorpo de 2a camada marcado com Alexa-488 vs. Ig de coelho ou anti-camundongo marcado com FITC. rMIF é a intensidade média de pico da fluorescência, em relação à segunda camada sozinha.

[000222] Anticorpos murinos apresentaram as células HUVEC para expressar altos níveis de αv, αvβ3 e αvβ5 e sem αvβ6 ou αvβ8. Nestas células, o RabMab EM01309 reagiu fortemente, e em níveis comparáveis com comparador 17E6 anti-αv murino. Anticorpos murinos mostraram altos níveis de αv, sem αvβ3, altos níveis de αvβ5 e algum de αvβ6 em células CRC HT-29. Os RabMabs confirmaram isto e também mostraram alta expressão de integrina αvβ8. RabMab EM01309 reagiu fracamente. Os anticorpos murinos mostraram altos níveis de αv, sem αvβ3, altos níveis do αvβ5 e sem αvβ6 em células NSCLC A549. A ligação de RabMabs confirmou isto, e também não mostrou nenhuma expressão de integrina αvβ8. RabMab EM01309 não reagiu. Os anticorpos murinos mostraram altos níveis de αv, αvβ3 e αvβ5 e sem αvβ6, e forte expressão de β1 em células de melanoma M24 Met. Os RabMabs confirmaram isto e também mostraram forte ligação de EM13309, mostrando expressão de integrina αvβ8. O RabMab EM01309 não reagiu. Os anticorpos murinos mostraram altos níveis de αv, αvβ3 e αvβ5, sem αvβ6, e forte expressão de β1 em células de melanoma M21. Os RabMabs confirmaram isto e também mostraram altos níveis de ligação de EM13309, mostrando expressão de αvβ8. RabMab EM01309 não reagiu. Os anticorpos murinos não mostraram nenhum αv, αvβ3, αvβ5 ou αvβ6 nas células de melanoma M21-L, e forte expressão de β1. Nenhum dos RabMabs ligou-se significativamente acima da referência. Os anticorpos murinos não mostraram nenhum αv, αvβ3, αvβ5 ou αvβ6 nas células de melanoma M21-gpiib, mas expressão forte de β1 e β3. Os RabMabs EM05201, EM13309 e EM01309 não se ligaram. Entretanto, tanto EM22703 como EM09902 reagiram, EM22703 fortemente. Isto suportou os dados de ELISA (cf. Exemplo 11) que EM22703 pode interreagir com αiibβ3, e que EM09902 pode interreagir fracamente tanto com αvβ3 como com αii bβ3.

[000223] A citometria de fluxo de célula viva foi inequívoca. Os anticorpos não reagiram acima da referência de linhagem celular M21- L deficiente em αv. Como o MIF normalizado alcançado com EM22703 e EM09902 aproxima-se de 100, e com EM05201 e EM13309, isto indicou a relação sinal/ruído básica rotineiramente atingível dos anticorpos, que foi consideravelmente acima daquela alcançada com reagentes padrão LM609 e P1F6. Ainda não está claro se isto foi um resultado da afinidade mais alta da segunda camada de reagentes de fluorescência, em vez das propriedades dos próprios RabMabs primários, independentemente de que razão, os RabMabs foram reagentes excelentes para FACS.

[000224] EM22703 forneceu uma marcação paralela em FACS para LM609, confirmando que reconhecia o complexo de αvβ3, mas também reagiu fortemente com M21-gpiib, mostrando que foi a cadeia β3 no complexo de integrina que era reconhecida por EM22703.

[000225] Marcação de EM09902, em geral, assemelhou-se à marcação de P1F6, mas reagiu fracamente com cadeias β3 bem como β5. Isto foi visível no FACS de células M21-gpiib, que não expressaram αvβ5, o suposto alvo de EM09902. Por titulação do anticorpo, a concentração ótima do reagente pode ser selecionada para minimizar a reatividade cruzada de αvβ3, conservando um sinal de αvβ5 potente, como predito dos dados de ELISA, e para FACS que foi 0,3-1 μg/mL.

[000226] EM00212, direcionado contra o domínio citoplasmático β3 foi negativo em FACS e ELISA. Como isto é um controle de espécie, isotipo e alvo, é um indicador excelente de especificidade, e sugere que uma relação sinal/ruído sinal excelente 100:1 esteja sendo alcançada em FACS.

[000227] EM05201 foi intensamente específico para αvβ6 e revelou esta proteína somente em células HT29, onde é conhecido que ela é expressa.

[000228] EM13309 é o primeiro reagente capaz de FACS de célula viva de integrina αvβ8, e forneceu informação surpreendente que αvβ8 é mais amplamente expresso do que αvβ6, em carcinoma HT29, e melanomas met M21 e M24. A marcação da linhagem neuroectodérmica não foi possivelmente surpreendente como o αvβ8 foi relatado na linhagem neuronal de astrócito, entretanto, a marcação do carcinoma foi inesperada, e pode refletir a biologia: análise recente de αvβ8 mostrou que sua expressão em APCs intestinais controlam a resposta inflamatória neste sítio. De modo concebível, a linhagem CRC HT29 também refletiu tal mecanismo.

[000229] EM01309, contra o domínio extracelular αv, foi uniformemente negativo com exceção de HUVEC.

[000230] Em resumo, mostrou-se que os anticorpos RabMab funcionavam em citometria de fluxo de célula viva. Isto fornece uma ponte valiosa entre a bioquímica e tecido de IHC para validação e caracterização tumoral. Especialmente reagentes de αvβ6 e αvβ8 são um recurso importante para estudos de integrina, e a capacidade de produzir tais anticorpos com estes perfis de reatividade em RabMabs abrem uma porta, finalmente em uma análise rigorosa de modelos de expressão de integrina em tecidos arquivados.

EXEMPLO 14: Experimentos de titulação

[000231] Os experimentos de titulação em FACS foram realizados para investigar concentrações de marcação apropriadas (Figuras 4043). As formas da curva não indicaram a saturação, mas começaram a nivelar-se acima de 1 mg/mL. Os anticorpos monoclonais de coelho são ligadores fortes em FACS.

[000232] Especialmente EM09902 tem alta afinidade, e a ligação forte foi vista na concentração de anticorpo 0,1 μg/mL e por isso, pode ser com sucesso usado em concentração de marcação <1 ug/mL.

Claims

1. Anticorpo monoclonal de coelho anti-integrina, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo: (a) um anticorpo contra o domínio extracelular da integrina αvβ5 que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) consistindo na SEQ ID NO: 15 (VL-αvβ5) e uma região variável da cadeia pesada (VH) consistindo na SEQ ID NO: 16 (VH-αvβ5); (b) um anticorpo contra o domínio extracelular da integrina αvβ3 que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) consistindo na SEQ ID NO: 95 (VL-αvβ3) e uma região variável da cadeia pesada (VH) consistindo na SEQ ID NO: 96 (VH-αvβ3); (c) um anticorpo contra o domínio extracelular da integrina αvβ6 que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) consistindo na SEQ ID NO: 135 (VL-αvβ6) e uma região variável da cadeia pesada (VH) consistindo na SEQ ID NO: 136 (VH-αvβ6); (d) um anticorpo contra o domínio extracelular da integrina αvβ8 que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) consistindo na SEQ ID NO: 175 (VL-αvβ8) e uma região variável da cadeia pesada VH consistindo na SEQ ID NO: 176 (VH-αvβ8); e/ou (e) um anticorpo contra o domínio extracelular da integrina αv que compreende uma região variável da cadeia leve (VL) consistindo na SEQ ID NO: 215 (VL-αv) e uma região variável da cadeia pesada VH consistindo na SEQ ID NO: 216 (VH-αv).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar a um domínio de integrina extracelular com padrão de glicosilação derivado de inseto apresentando SEQ ID NOs: 10, 90, 130, 170 ou 210.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar a heterodímeros intactos de, respectivamente, integrina βvβ5, integrina αvβ3, integrina αvβ6, integrina αvβ8 e integrina apresentando cadeia αv em material embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE), em uma forma isolada em ELISA e em células viáveis com substancialmente a mesma especificidade.

4. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Uso do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para detecção de integrinas no material embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE).