KR20120059556A - Ｆｆｐｅ 물질 내의 인테그린 복합체의 검출용 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인테그린의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 기록 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직에서 인테그린을 검출하기 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역원이 곤충 발현 배양물-유래 재조합 세포외 인테그린 도메인인 단일클론 토끼 항체의 제조 방법, 및 가장 가까운 인테그린 상동 사이를 구별해내고 FFPE 물질 내 면역조직화학에 특히 적합한 항-인테그린 항체의 또다른 스크리닝 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인테그린의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 기록 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직에서 인테그린을 검출하기 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역원이 곤충 발현 배양물-유래 재조합 세포외 인테그린 도메인인 단일클론 토끼 항체의 제조 방법, 및 가장 가까운 인테그린 상동 사이를 구별해내고 FFPE 물질 내 면역조직화학에 특히 적합한 항-인테그린 항체의 또다른 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인테그린은 2 개의 비공유 연관 사슬로 구성된 세포 부착 분자의 계열이다. 인테그린의 복합 멀티-도메인 구조는 미묘한 조절에 민감하다. 인테그린은 번역 및 전사, 번역-후 글리코실화, 세포 표면 전달, 세포내 촉진에 의한 세포 표면 활성화 및 세포외 촉진에 의한 세포 표면 활성화를 비롯한, 많은 수준으로 조절된다. 알파 및 베타 사슬 모두는 막을 통과하고 세포외 매트릭스를 세포내 구획과 통합시켜, 궁극적으로 부착, 증식, 생존, 이동 및 침윤의 조절을 야기하는 신호 경로를 제공하는 계열 I 막통과 단백질이다.
인테그린은 많은 인간 병리학에서 치료 표적이다. 예를 들어 암에서, 알파-v 계열 인테그린 (αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 및 αvβ8) 은 혈관신생, 종양 세포의 화학요법 및 방사능요법으로부터의 보호, 종양 생존 및 국부적 면역 억제에 다양하게 연루된다. α5β1 및 α4β1 은 또한 혈관신생에 연루되는 반면, α2β1 및 α6β4 는 종양 증식에 연루되었다. αvβ3 과발현은 인간 흑색종의 침윤상과 연관되며, αvβ3 및 αvβ5 모두는 내피 표면 상의 혈관신생 성장 인자의 기능을 조절하는 것으로 보이는, 종양-침윤성 내피에서 특이적으로 상향조절된다. 인테그린의 정확한 발현 패턴은 둘 사이 및 제시된 종양 계열 내에서 매우 가변적이고, 기능 생물학을 반영한다. 그러므로, 이들은 또한 종양 상태의 바이오마커이고, 발현 패턴은 결과에 대한 예후이고, 치료 기회를 정의할 수 있다.
인테그린 αvβ3 및 αvβ5 를 억제하는, αv-인테그린 사슬에 대항하는 단일클론 항체 DI-17E6, 및 실렌기티드, 환형화 RGD-함유 펜타펩티드가 임상적으로 개발되었다. 그러나, 부분적으로는 병리학적 조건에서 인테그린 발현 패턴의 현저하게 불완전한 그림이 있기 때문에 인테그린에 표적하는 요법의 완전한 치료 잠재력은 아직 수득되지 않았다. 인테그린 분포의 병리학적 특성분석은 신선한 동결 조직에 대한 연구에 의존한다. 살아있는 세포-대-동결염색 (cryostaining) 연결이 잘 성립되어 있으며, 동결 조직은 인테그린 염색에 대한 우수한 기질이나, 이들의 보존 수준 및 초-구조적 충성도는 FFPE 물질에서 정규적인 것에 훨씬 못 미친다. 이것은 복합체 조직 내 염색 해석에 결정적으로 영향을 줄 수 있다. 게다가, 정규적 임상 실시, 및 일반적으로 그리고 상업적으로 이용가능한 조직 은행이 FFPE 물질을 제공한다: 동결된 임상적 물질을 수득하는 것은 복잡하고 (logistic) 종종 임상적-배양 도전이거나, 또는 단순히 특정 종양을 다루고 흔치않고 귀한 임상적 샘플을 다루는 경우 불가능한 것이다.
이것은 FFPE 물질 내 명백한 인테그린 검출이 종래 기술에서 방해되는, 고전적인 조직학 및 인테그린의 구조의 모순되는 필요성으로 인한 것이다. 조직학은 임의로 가열 영향과 함께 포름알데히드 용액, 등급 알코올 및 파라핀 왁스와 같은 소수성 불용성 시약에 의한 연한 친수성 조직의 광범위한 가교 연결, 침투 및 안정화를 비롯한, 조직 구조의 뛰어나고 강인한 형태학적 보존을 필요로 한다. 특히 임상 조직학 실험실에서 실시되는 바와 같은 고정 및 포매는 에피토프를 감추거나 심지어 파괴할 수 있는 것으로 알려져 있다. 비-고유의 상태는 추출되거나 또는 분해되는 것이 아니고, 주로 폐색되는 인테그린을 야기한다. 구조적으로 활성인 의무적인 인테그린 헤테로이량체는 이러한 구조적 변화에 민감하고, 이것이 FFPE 절차 동안 일어나므로 이들은 폐색으로부터 쉽게 회복될 수 없다.
조직 고정 및 포매에 관여하는 화학약품이 인테그린 구조에 심각하게 영향을 미치므로, 당업자에 의해 사용되는 규정하는 이용가능한 단일클론 항체는 FFPE 가공 후 인테그린을 쉽게 인지하지 못한다. 인테그린 세포질 도메인을 인지하는 항체는 필연적으로 단일 인테그린 사슬에 제한되어, 이들이 미손상 인테그린 헤테로이량체의 분포를 보고하지 않으므로, FFPE 물질 내 모호한 염색 패턴을 야기한다. 게다가, 짧은 펩티드 에피토프에 대항하는 이러한 항체는 형태 독립적인 경향이 있어, 단일 사슬 또는 분해 산물의 검출, 및 미손상 인테그린 복합체를 검출할 항체보다 낮은 특이성 친화성을 야기한다.
마우스 단일클론 항-인테그린 avβ3 항체 LM609 와 같은 여러 마우스 단일클론 항체는 FACS 또는 동결 조직을 사용하여 αvβ3 및 αvβ5 인테그린을 검출하나, 이들은 FFPE 물질 내 이들의 에피토프의 뚜렷한 또는 재현성 있는 표지를 보이지 않는다. 이들의 제한된 에피토프 인지에서의 쥣과 단일클론의 의존성 및 저 친화성은 널리 인식되었다. 이러한 항체가 FFPE 물질에 대해 사용되는 경우 제시되는 분포 패턴은 신선한-동결 절단 물질에서 관찰된 패턴으로부터 벗어나는 반면, 상기 신선한-동결 절단 물질의 발현 프로파일은 이러한 조직으로부터 단리된 생존 세포의 프로파일과 가깝게 부합한다. 이러한 항체로의 FFPE 염색은 미심쩍은 유래의 것으로서 검토되어야만 하고, 항원 회수에 대한 기술은 FFPE 물질로부터 이러한 결정소를 회수하기 위해 성장되어야만 한다.
지금까지, FFPE 환자 종양 조직 내 인테그린의 특징분석을 가능케 하는 FFPE 조직 내 αvβ3 또는 αvβ5 세포외 에피토프를 강하게 인지하는 이용가능한 단일클론 항체는 없었다. 상기 상태의 최종 결과는 십수년의 병리학적 시편이 인테그린에 표적하는 요법으로부터 이득을 얻을 수 있는 환자 집단을 밝혀낼 것인 인테그린 발현 프로파일에 대해 분석될 수 없다는 것이다. 신흥 요법 관점에서, 이러한 결함은 애석하게도 효과적인 의약이 요구에 도달하지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 기본을 형성하는 기술적 과제는 FFPE 물질 내, 특히 정규적 FFPE 종양 생검 내 인테그린 복합체의 신뢰성 있고 명백한 검출을 허용하게 하는 항체를 제공하는 것이다. FFPE 물질 내 면역조직화학 동안 인테그린 상동 사이의 효과적인 차등 거동을 나타내는 항-인테그린 항체를 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는 것이 또다른 과제이다.
본 발명은 각각의 사슬이 경쇄 (VL) 및/또는 중쇄 (VH) 의 가변 영역 내 토끼 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 임의로 골격 영역 (FR) 을 포함하는 하나 이상의 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하는 항체로서, 인테그린의 세포외 또는 세포내 도메인에 결합하는 역량을 갖는 항체를 제공함으로써 첫번째 과제를 해결한다. 다른 말로는, 항체는 각각의 영역이 토끼 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 임의로 하나 이상의 골격 영역 (FR) 을 포함하는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 (VL) 및/또는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함하며, 인테그린의 세포외 또는 세포내 도메인에 결합하는 역량을 갖는다.
더욱 상세히는, 본 발명은 항체 또는 이의 절편이 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 을 적어도 포함하고, 항체가 세포외 인테그린 도메인, 세포외 인테그린 사슬 도메인 또는 세포내 인테그린 사슬 도메인의 비-폐색된 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 갖고, 항체가 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 물질에서 단리된 형태로 ELISA 에서 및/또는 실질적으로 동일한 특이성을 갖는 생존 세포 상의 본래의 상태로 인테그린의 미손상 헤테로이량체에 결합할 수 있는, 곤충-유래 글리코실화 패턴을 갖는 인테그린 및 임의의 다른 진핵 글리코실화 패턴을 갖는 인테그린 모두에 대한 단일클론 토끼 항체, 또는 이의 절편을 제공함으로써 첫번째 과제를 해결한다.
FFPE-유능 항체가 토끼 내 면역원으로서 인테그린 또는 인테그린 사슬의 세포외 또는 세포내 도메인을 사용함으로써 쉽게 생성될 수 있다는 것이, 본 출원인에 의해 놀랍게도 입증되었다. 최고의 결과는 바람직하게는 재조합적으로 발현될 수 있는 미손상 도메인으로 수득된다. 특히, 세포외 헤테로이량체성 인테그린 도메인은 곤충 세포에서 제조되는 경우, 효과적인 면역원인 것으로 입증되었다. 본 발명에 따른 절단된 인테그린 면역원의 제공은 에피토프의 접근성을 유의하게 향상시키고, 항원에 대해 정교한 민감성 및 특이성의 항체를 산출한다. 단일클론 토끼 항체는 항원에 선택적으로, 그러나 글리코실화 패턴과 독립적으로 결합한다. 심지어 본 발명의 활성 항체가 곤충-유래 재조합 단백질에 대항하여 생육될지라도, 항원 글리코실화 패턴의 관점에서 다기능성이므로, 이들은 곤충-유래 재조합 항원의 인지에 적합한 것으로 고려되나, 상기 패턴에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는 임의의 진핵 글리코실화 패턴의 특이적 인테그린의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 인지하는데 매우 적합하다. 글리코실화 패턴은 서로 혼합되는 것이 아니라, 구별되는 진핵 세포 또는 유기체 각각으로부터 유래되는 것으로 이해될 것이다. 이렇게 함으로써, 발생된 항체는 특히 복합 FFPE 매트릭스 내의 표적 구조를 인지할 수 있다. 본 출원인은 FFPE 조직 내 인테그린 검출을 위한 상기 항체의 예상치못한 적합성을 제시하였다. 적합성은 수득되는 항체가 FFPE 물질에 대해 집중적으로 특이적이고 활성인 한, 입증된다. FFPE 물질 내 인테그린 복합체가 본 발명의 항체에 의해 쉽게 검출될 수 있다는 것이 압도적인 효과이다. 고전적인 단일클론 항체가 FFPE 물질에서 작용하지 않는 반면, 본 발명의 항체는 FFPE 물질에서 그리고 생존 세포 상에서 동일한 특이성으로 이들의 항원에 실질적으로 결합하며; 생존 세포 상에 대한 결합은 생 세포 유세포 측정 (예를 들어, 형광-활성화 세포 분류, 간략하게 FACS) 에서 제한 없이 증명된다. 본 발명의 항체는 또한 FFPE 물질에서 그리고 ELISA 에서 단리된 형태에서 동일한 특이성으로 이들의 항원에 실질적으로 결합하며; 단리된 형태에 대한 결합은 본 명세서의 과정에서 기재되고 실시예 3.3 에 기재되는 바와 같은 표준 ELISA 에서 제한 없이 증명된다. 이로 인해 달성된 FFPE 조직에서의 염색 패턴은 종래 기술의 항체로부터 필연적으로 수득된 모호한 결과에 비해 명백한 장점이다.
지금까지, 24 개 이상의 인테그린 복합체의 조성이 기재되었다. 인테그린은 2 개의 비공유 연관 사슬로 구성된 세포 부착 분자의 계열이다. 두 개의 서브유닛인 알파 (α) 및 베타 (β) 는 막을 통과하여 세포외 매트릭스와 세포내 구획을 통합시켜, 세포 부착, 증식, 이동 및 침윤을 조절하는 상기 세포외 신호를 전달한다. 각각의 조성에 근거하여, 세포외 및 세포내 인테그린 도메인이 할당되고 공지되며, 이들은 통상의 공정에 의해 제조될 수 있다. 천연 기원의 도메인이 생물학적 샘플로부터 단리되거나, 또는 도메인이 재조합적으로 발현되고 이후 정제된다. 특히, 샘플은 인테그린 분포 패턴에 대해 분석되어지는 포유동물로부터 생체 내에서 채취된다. 샘플의 회수는 양호한 의료적 실시에 따라야만 한다. 생물학적 샘플은 관심의 인테그린을 갖는 임의의 종류의 생물학적 종으로부터 채취될 수 있으나, 샘플은 특히 실험실 동물 또는 인간, 더욱 바람직하게는 래트, 마우스, 토끼 또는 인간으로부터 채취된다. 인테그린의 다운스트림 가공은 당업계에 공지된 임의의 공정에 의해 수행되고, 세포외 또는 세포내 도메인의 도메인 분열 및 분리가 뒤따른다. 세포 용해는 삼투압 쇼크를 일으켜 세포막을 천공시킬 수 있는, 적합한, 잘 알려진 용해 완충액으로 수행될 수 있다. 세포 구조의 안정성은 또한 볼 밀, 프렌치 (French) 프레스, 초음파 등과 같은 기계적 힘에 의해, 세포벽 및 세포막의 효소적 분해에 의해, 각각 및/또는 텐시드 (tenside: 계면활성제) 의 작용에 의해 파괴될 수 있다. 인테그린은 성가신 성분을 제거하기 위해 추가로 정제될 수 있거나, 인테그린은 샘플에 농축될 수 있다. 다운스트림-가공 및/또는 농축은 바람직하게는 침전, 투석, 겔 여과, 겔 용리 또는 크로마토그래피, 예컨대 HPLC 또는 이온 교환 크로마토그래피의 방법에 의해 수행된다. 더 나은 수율을 위해 여러 방법을 조합하는 것이 권고된다.
바람직하게는, 세포외 인테그린 도메인은 재조합적으로 발현되고 정제된다. 단백질 서열을 코딩하는 DNA 는 당업자에게 공지된 기술로 수득되고, 증폭되고, 임의로 변경되거나 합성될 수 있다. DNA 는 벡터 내에 도입되어, 세포에서 전사 및 번역될 수 있다. 도메인은 친화성 크로마토그래피에 대한 태그, 예컨대 Strep-태그, His-태그, GST-태그, Arg-태그 또는 칼모듈린 결합 단백질과 융합될 수 있거나, 성립된 항체-친화성 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 컬럼에 단백질 현탁액을 로딩하면, 태그가 결핍된 모든 성분은 즉시 용리된다. 세정 단계에 의한 비특이적 결합제의 제거 후, 태그-융합 구축물을 컬럼으로부터 제거한다. 태그가 항체의 유도에 영향을 주는 경우, 이것을 면역화 전에 절단시킨다.
여러 발현 시스템이 당업계에 있다. 흥미롭게도, 면역원의 단백질 요소에 대항하는 적정농도는 곤충-유래 재조합 인테그린 도메인이 적용된 경우 유리하게 증가할 수 있다. 곤충-유래의, 재조합 포유동물 당단백질은 완전히 글리코실화되며, 말단 당 가공 및 확장이 결핍되고, 이것은 단백질 에피토프가 비-재조합 단백질 또는 통상의 진핵세포 발현의 재조합 단백질과 비교하여 고도로 노출된 것을 의미한다. 그러므로, 면역원 인테그린 도메인이 곤충-유래 글리코실화 패턴을 갖는 것이 (바람직하게는 세포외 도메인) 바람직하다. 게다가, 면역 반응을 도출하거나 좀더 증가시키는 항원 특성은 항원이 큰 운반체, 예컨대 단백질 또는 다당류에 부착되는 경우 영향을 줄 수 있다; 운반체는 그 자체에 의해 면역 반응을 도출하지 않는 것일 수 있다.
인테그린 도메인이 인간 1 차 구조를 갖는, 즉, 아미노산 서열이 데이터베이스, 예컨대 서열 데이터베이스 Swiss-Prot 의 접근 번호에 부합하는 인간 입력물과 정렬되는 것이 바람직한 구현예이다. 당업자는 본원에 적용되는 서열을 발췌하기 위해 분자 생물학의 이러한 데이터베이스를 알고 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 세포외 인테그린 도메인은 인간 1 차 구조 및 곤충 글리코실화 패턴을 갖는다.
본 발명의 항체는 면역글로불린 유전자, 또는 이의 분절에 의해 코딩된 폴리펩티드를 나타낸다. 항체는 하나 이상의 경쇄 및/또는 하나 이상의 중쇄, 바람직하게는 하나 이상의 경쇄 및 하나 이상의 중쇄, 더욱 바람직하게는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄를 포함하며, 이들 각각은 본원에 이하 정의되는 바와 같다. 이것은 경쇄가 상기 경쇄 (VL) 의 가변 영역 내에, 특히 토끼 기원의 적어도 단일 CDR 및 임의로 상기 경쇄 (VL) 의 가변 영역 내에 적어도 단일 FR, 바람직하게는 적어도 상기 CDR 및 적어도 상기 FR 을 포함하는 것을 의미한다. 중쇄가 상기 중쇄 (VH) 의 가변 영역 내에, 특히 토끼 기원의 적어도 단일 CDR 및/또는 상기 중쇄 (VH) 의 가변 영역 내에 적어도 단일 FR, 바람직하게는 적어도 상기 CDR 및 적어도 상기 FR 을 포함한다. 항체의 항원-결합 부분 내에, CDR 은 항원의 에피토프와 직접 상호작용하는 반면, FR 은 파라토프의 3 차 구조를 유지한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 모두에서, 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR-1 내지 CDR-3) 에 의해 각각 분리된 3 개 내지 4 개의 골격 영역 (FR-1 내지 FR-4) 이 있다. CDR 또는 과가변 영역, 특히 CDR-3 영역, 더욱 특히 중쇄 CDR-3 은 항체 친화성 및 특이성을 크게 담당한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 경쇄 가변 영역 (VL) 은 2 개의 CDR, 더욱 바람직하게는 3 개의 CDR, 가장 바람직하게는 동일한 수의 FR 과 함께 또는 심지어 1 개의 FR 을 더 포함한다. 본 발명의 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, 중쇄 가변 영역 (VH) 은 2 개의 CDR, 더욱 바람직하게는 3 개의 CDR, 가장 바람직하게는 동일한 수의 FR 과 함께 또는 심지어 1 개의 FR 을 더 포함한다. 또다른 더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함하며, 각각의 영역은 2 개의 CDR, 가장 바람직하게는 3 개의 CDR, 더욱 바람직하게는 동일한 수의 FR 과 함께 또는 심지어 1 개의 FR 을 더 포함한다.
다른 말로는, 본 발명의 항체는 특히 임의의 인테그린 도메인 또는 세포외 도메인 각각에 대한 결합 역량을 부여하는 단일 사슬의 가변 영역으로부터의 최소 스캐폴드를 적어도 포함할 것이다. 본 발명에 따르면, 항체는 또한 상기 언급된 최소 스캐폴드가 제시된다면, 면역글로불린의 다수의 기타 잘-특징화된 절편으로서 또는 심지어 미손상 면역글로불린으로서 존재할 수 있다. 절편은 바람직하게는 중쇄 (H), 경쇄 (L), 가변 영역 (V), 단일 사슬 가변 절편 (scFv), 공유 결합된 항체 경쇄 및 항체 중쇄 (Fd) 의 일부로 이루어지는 Fab 절편, 등을 포함하는 군으로부터 선택된다.
항체의 경쇄는 부가적으로 경쇄의 불변 영역 (CL) 을 포함할 수 있다. 유사하게는, 항체의 중쇄는 부가적으로 중쇄의 불변 영역 (CH), 또는 이의 일부를 포함할 수 있으며, 상기 부분은 특히 Fd 영역 내의 불변 영역을 말한다. Fd 절편은 항체 특이성의 주요한 결정소이고 별개로 에피토프-결합 능력을 보유한다. 본 발명의 항체는 또한 항원 결합에 관여하지 않는, 보체 캐스케이드 (cascade) 의 효과기로서 Fc 절편에 의해 완전해질 수 있다. 절편, 예컨대 Fab 및 Fc 절편은 다양한 펩티다아제를 사용하는 분할에 의해 생성될 수 있다. 게다가, 절편은 조작되고 재조합적으로 발현될 수 있다 (바람직하게는 scFv).
본 발명의 범주에서, 항체는 폴리클론 또는 단일클론 기원일 수 있다. 폴리클론 항체는 통상, 면역 반응이 포유동물 유기체에 대해 낯설고 3.000 g/mol 을 초과하는 분자량을 갖는 항원에 의해 야기되는 경우 포유동물 유기체에서 생성된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 단일클론이다. 단일클론 항체의 큰 장점에는 시약의 불멸의 공급원, 안정한 항체 특성 및 정확한 특이성이 포함된다. 단일클론 항체 제조를 위한 대중화된 기술, 예컨대 하이브리도마 기술이 또한 당업자에게 잘 알려져 있다.
폴리클론 및/또는 단일클론 항체 제조를 위한 호의적인 숙주 종은 래트, 염소, 토끼 및 마우스, 더욱 바람직하게는 토끼를 포함한다. 토끼 항체, 더욱 바람직하게는 토끼 단일클론 항체 (RabMab) 는 마우스 단일클론보다 넓은 범위의 에피토프 인지와 함께 높은 친화성을 나타내는 반면, 면역계에서의 다양성, 및 확장된 CDR 로 인해, 에피토프, 바람직하게는 인간 에피토프에 대해 보다 강한 반응이 쥣과 반응에 비해 생성될 수 있다. 하나 이상의 CDR 이 토끼 기원을 갖는다면, CDR, FR 및/또는 불변 영역이 상이한 포유동물 기원으로부터 유래되는, 키메라 항체가 유전적으로 조작될 수 있다는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 키메라 항체는 비-토끼 기원의 CDR 뿐 아니라, 경쇄 및 중쇄의 전체 가변 영역을 대체함으로써 수득될 수 있다. 항원-결합 부위의 친화성은 가변 영역 내 일부 아미노산의 선택적 교환에 의해 대안적으로 영향을 받을 수 있다.
단일클론 토끼 항체의 제조를 위한 기본 원리는 마우스 단일클론에 대한 것과 같았다. 토끼의 면역화 후, 비장을 폴리클론 혈청을 생성하는 상기 토끼로부터 채취한다. 면역화된 토끼의 단리된 토끼 B 세포를 토끼 형질세포종 세포주와 융합시켜, 안정한 하이브리도마를 생성한다. 하이브리도마 세포를 면역원에 대해 특이적인 항체의 분비에 대해 시험하고, 이들을 이어서 클로닝할 수 있다. 토끼 하이브리도마 융합 파트너 세포주의 본래의 수립은 문헌 [Spieker-Polet et al., PNAS USA 1995, 92(20): 9348-9352] 에 기재되어 있다. 융합 파트너 세포주의 추가의 개발은 US 7,429,487 B2 에 기재되어 있다. 더욱 추가의 방법은 US Appl. Nos. 10/705,109; 10/266,387; 10/313,881; 10/350,841 및 11/476,277 에 공개되어 있다. 항체를 코딩하는 삽입체의 cDNA 를 바람직하게는 클로닝하고, 서열분석하고, 발현 벡터 내에 삽입하여 전체적으로 정의된 항체를 생성하게 한다. 당업자는 문헌 [Pham et al., Biotech Bioeng 2003, 84(3): 332-342] 에 따른 EBNA 세포 발현 시스템과 같은 항체의 재조합 생성을 위한 적합한 기술을 알고 있다. 상기 공개문헌은 본 명세서에 전체가 참조로서 인용된다.
항체 또는 이의 절편은 특히 인테그린 αvβ3, αvβ5, αvβ6 또는 αvβ8 의 세포외 도메인에 대항하는 것이다.
본 발명의 바람직한 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 절편은 인테그린 αvβ3 의 세포외 도메인에 대항하는 것이다. VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 항-αvβ3 항체의 문맥을 언급하면, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ3 항체 문맥에서 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 81 (CDR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 82 (CDR-2-VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 83 (CDR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 87 (FR-1-VL-αvβ3), SEQ ID NO: 88 (FR-2-VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 89 (FR-3-VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ3 항체 문맥에서 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 84 (CDR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 85 (CDR-2-VH-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 86 (CDR-3-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 91 (FR-1-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 92 (FR-2-VH-αvβ3), SEQ ID NO: 93 (FR-3-VH-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 94 (FR-4-VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
항-αvβ3 항체 문맥에서의 또다른 바람직한 구현예에서, VL 은 SEQ ID NO: 95 (VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 96 (VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 VL 은 SEQ ID NO: 95 (VL-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 96 (VH-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 가장 바람직하게는 항체는 항-αvβ3 scFv 로서 형상화된다.
항-αvβ3 항체는 경쇄 (CL) 및/또는 중쇄 (CH) 의 불변 영역에 의해 완결될 수 있다. 바람직하게는, CL 은 SEQ ID NO: 97 (CL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 CH 는 SEQ ID NO: 98 (CH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항-αvβ3 항체는 더욱 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하며, 경쇄는 SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 경쇄는 SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄는 SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 또다른 바람직한 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 절편은 인테그린 αvβ5 의 세포외 도메인에 대한 것이다. VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 항-αvβ5 항체의 문맥을 언급하면, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ5 항체 문맥에서의 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 1 (CDR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 2 (CDR-2-VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 3 (CDR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 7 (FR-1-VL-αvβ5), SEQ ID NO: 8 (FR-2-VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 9 (FR-3-VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ5 항체 문맥에서의 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 4 (CDR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 5 (CDR-2-VH-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 6 (CDR-3-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 11 (FR-1-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 12 (FR-2-VH-αvβ5), SEQ ID NO: 13 (FR-3-VH-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 14 (FR-4-VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다.
항-αvβ5 항체 문맥에서의 또다른 바람직한 구현예에서, VL 은 SEQ ID NO: 15 (VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 16 (VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 VL 은 SEQ ID NO: 15 (VL-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 16 (VH-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 가장 바람직하게는 항체는 항-αvβ5 scFv 로서 형상화된다.
항-αvβ5 항체는 경쇄 (CL) 및/또는 중쇄 (CH) 의 불변 영역에 의해 완결될 수 있다. 바람직하게는, CL 은 SEQ ID NO: 17 (CL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 CH 는 SEQ ID NO: 18 (CH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항-αvβ5 항체는 더욱 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하며, 경쇄는 SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 경쇄는 SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄는 SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 여전히 또다른 바람직한 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 절편은 인테그린 αvβ6 의 세포외 도메인에 대항하는 것이다. VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-avβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-avβ6) 및 SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 항-αvβ6 항체의 문맥을 언급하면, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ6 항체 문맥에서의 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 121 (CDR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 122 (CDR-2-VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 123 (CDR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 127 (FR-1-VL-αvβ6), SEQ ID NO: 128 (FR-2-VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 129 (FR-3-VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ6 항체 문맥에서의 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 124 (CDR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 125 (CDR-2-VH-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 126 (CDR-3-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 131 (FR-1-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 132 (FR-2-VH-αvβ6), SEQ ID NO: 133 (FR-3-VH-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 134 (FR-4-VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다.
항-αvβ6 항체 문맥에서의 또다른 바람직한 구현예에서, VL 은 SEQ ID NO: 135 (VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 136 (VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 VL 은 SEQ ID NO: 135 (VL-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 136 (VH-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 가장 바람직하게는 항체는 항-αvβ6 scFv 로서 형상화된다.
항-αvβ6 항체는 경쇄 (CL) 및/또는 중쇄 (CH) 의 불변 영역에 의해 완결될 수 있다. 바람직하게는, CL 은 SEQ ID NO: 137 (CL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 CH 는 SEQ ID NO: 138 (CH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항-αvβ6 항체는 더욱 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하며, 경쇄는 SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 경쇄는 SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄는 SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 여전히 또다른 바람직한 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 절편은 인테그린 αvβ8 의 세포외 도메인에 대항하는 것이다. VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 항-αvβ8 항체의 문맥을 언급하면, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ8 항체 문맥에서의 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 161 (CDR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 162 (CDR-2-VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 163 (CDR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 167 (FR-1-VL-αvβ8), SEQ ID NO: 168 (FR-2-VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 169 (FR-3-VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αvβ8 항체 문맥에서의 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 164 (CDR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 165 (CDR-2-VH-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 166 (CDR-3-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 171 (FR-1-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 172 (FR-2-VH-αvβ8), SEQ ID NO: 173 (FR-3-VH-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 174 (FR-4-VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다.
항-αvβ8 항체 문맥에서의 또다른 바람직한 구현예에서, VL 은 SEQ ID NO: 175 (VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 176 (VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 VL 은 SEQ ID NO: 175 (VL-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 176 (VH-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 가장 바람직하게는 항체는 항-αvβ8 scFv 로서 형상화된다.
항-αvβ8 항체는 경쇄 (CL) 및/또는 중쇄 (CH) 의 불변 영역에 의해 완결될 수 있다. 바람직하게는, CL 은 SEQ ID NO: 177 (CL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 CH 는 SEQ ID NO: 178 (CH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항-αvβ8 항체는 더욱 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하며, 경쇄는 SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 경쇄는 SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄는 SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 여전히 또다른 바람직한 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 절편은 인테그린 αv 의 세포외 도메인에 대항하는 것이다. VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) 및 SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) 및 SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) 및 SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) 및 SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 항-αv 항체의 문맥을 언급하면, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) 및 SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) 및 SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) 및 SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) 및 SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αv 항체 문맥에서의 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 201 (CDR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 202 (CDR-2-VL-αv) 및 SEQ ID NO: 203 (CDR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 207 (FR-1-VL-αv), SEQ ID NO: 208 (FR-2-VL-αv) 및 SEQ ID NO: 209 (FR-3-VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-αv 항체 문맥에서의 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 204 (CDR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 205 (CDR-2-VH-αv) 및 SEQ ID NO: 206 (CDR-3-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 211 (FR-1-VH-αv), SEQ ID NO: 212 (FR-2-VH-αv), SEQ ID NO: 213 (FR-3-VH-αv) 및 SEQ ID NO: 214 (FR-4-VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다.
항-αv 항체 문맥에서의 또다른 바람직한 구현예에서, VL 은 SEQ ID NO: 215 (VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 216 (VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 VL 은 SEQ ID NO: 215 (VL-αv) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 216 (VH-αv) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 가장 바람직하게는 항체는 항-αv scFv 로서 형상화된다.
항-αv 항체는 경쇄 (CL) 및/또는 중쇄 (CH) 의 불변 영역에 의해 완결될 수 있다. 바람직하게는, CL 은 SEQ ID NO: 217 (CL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 CH 는 SEQ ID NO: 218 (CH-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항-αv 항체는 더욱 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 219 (L-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 220 (H-αv) 의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 경쇄는 SEQ ID NO: 219 (L-αv) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 220 (H-αv) 의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 219 (L-αv) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄는 SEQ ID NO: 220 (H-αv) 의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 인테그린 세포질 도메인은 1 차 면역원으로서 사용된다. 상기 세포질 도메인은 또한 세포내 도메인으로서 언급된다. 이들은 특히 N-말단 융합 단백질로서 발현된다. 융합 파트너는 하기 기재되는 차등 스크리닝을 허용하도록 다양할 수 있거나 (예를 들어, GST, MBP, KLH, 등), 1 차 및 2 차 스크리닝을 배제하고, 세포주 어레이 상의 3 차 스크리닝으로 바로 진행될 수 있다. 세포질 도메인의 형태는 세포외 도메인의 형태보다 덜 규정되고, 쌍을 이룬 사슬에 비교적 독립적이다, 즉, β3 에 대항하는 항체는 예를 들어 αvβ3 및 αiibβ3 모두와 연합된 β3 을 인지할 것이다. 이것은 DTM-αvβ3 복합체에 대항하는 항체에 대한 특이성이 효과적으로 감소하며, 이것을 스크리닝하여 αv 와 연합되어 있을 때에 오직 β3 만을 인지하는 항체를 수득할 수 있다. αvβ5 에 대항하여 생성되는 항체에 유사한 고려사항을 적용한다. 그러나 장점은 인테그린 세포질 도메인이 포유동물 전체에 걸쳐 전체적으로 보존되므로, 광범위한 종 교차 반응성이 생성될 수 있다는 것이다.
특히, 항체 또는 이의 절편은 인테그린 β3 사슬의 세포질 도메인에 대항하는 것이다. VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 이러한 항-β3 항체의 특별한 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) 및 SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) 및 SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) 및 SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) 및 SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
그러나 항-β3 항체의 문맥을 언급하면, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) 및 SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) 및 SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) 및 SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) 및 SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VL 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-β3 항체 문맥에서의 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VL 내 CDR 은 SEQ ID NO: 41 (CDR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 42 (CDR-2-VL-β3) 및 SEQ ID NO: 43 (CDR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VL 내 FR 은 SEQ ID NO: 47 (FR-1-VL-β3), SEQ ID NO: 48 (FR-2-VL-β3) 및 SEQ ID NO: 49 (FR-3-VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
VH 내 적합한 CDR 은 SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 적합한 FR 은 SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함하는 것이, 항-β3 항체 문맥에서의 여전히 또다른 조합적 구현예이다. 바람직하게는, VH 내 CDR 은 SEQ ID NO: 44 (CDR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 45 (CDR-2-VH-β3) 및 SEQ ID NO: 46 (CDR-3-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 내 FR 은 SEQ ID NO: 51 (FR-1-VH-β3), SEQ ID NO: 52 (FR-2-VH-β3), SEQ ID NO: 53 (FR-3-VH-β3) 및 SEQ ID NO: 54 (FR-4-VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
항-β3 항체 문맥에서의 또다른 바람직한 구현예에서, VL 은 SEQ ID NO: 55 (VL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 56 (VH-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 VL 은 SEQ ID NO: 55 (VL-β3) 의 아미노산 서열로 이루어지고 및/또는 VH 는 SEQ ID NO: 56 (VH-β3) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 가장 바람직하게는 항체는 항-β3 scFv 로서 형상화된다.
항-β3 항체는 경쇄 (CL) 및/또는 중쇄 (CH) 의 불변 영역에 의해 완결될 수 있다. 바람직하게는, CL 은 SEQ ID NO: 57 (CL-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 CH 는 SEQ ID NO: 58 (CH-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 항-β3 항체는 더욱 바람직하게는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함하고, 경쇄는 SEQ ID NO: 59 (L-β3) 의 아미노산 서열을 포함하고, 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 60 (H-β3) 의 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, 경쇄는 SEQ ID NO: 59 (L-β3) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 및/또는 중쇄는 SEQ ID NO: 60 (H-β3) 의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 경쇄는 SEQ ID NO: 59 (L-β3) 의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄는 SEQ ID NO: 60 (H-β3) 의 아미노산 서열로 이루어진다.
CDR, FR, VL, VH, C, L 및/또는 H 의 조합은 하기 본원에 상세히 기재되는 바와 같이 검토되지 않지만, 이러한 성분은 임의의 다른 방식으로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야만 한다. 각각의 조합은 수득되는 항체 또는 이의 절편이 인테그린의 세포외 도메인을 인지하는 한, 본 발명의 범주에 대해 판독되는 것으로 간주되어야만 한다.
또한, 동일한 기능을 갖는 상기 아미노산 서열 또는 상동 서열의 변이체, 돌연변이체, 일부가 정의 및 또는 보호 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야만 한다. 본래의 서열과 그의 유도체 사이의 변형 정도는 구조적 맥락 내, 특히 FFPE 물질 내 항원 인지의 요건에 의해 부득이 제한된다. 본 발명의 이점을 광범위하게 실현함으로써 본 발명의 교시의 것과 기능이 유사한 동등한 펩티드 및 단백질, 즉 아미노산 서열을 생성하는 몇몇 방법이 당업자에게 알려져 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 본원에 열거된 바와 같은 변형을 포함한다. 본 발명의 항체를 이루는 아미노산 서열의 변이체가 개질 (예를 들어, 적어도 단일 아미노산의 알킬화, 아릴화 또는 아세틸화), 거울상체의 혼입, 적어도 단일 아미노산의 부가 및/또는 또다른 펩티드 또는 단백질과의 융합으로부터 발생될 수 있다. 가능한 돌연변이는 결실, 삽입, 치환, 전좌 및/또는 역위를 포함한다. 아미노산 서열 및 항체의 일부는 각각, 특이적 기능의 발현에 충분한 상기 영역에 대한 제한에 관한 것이다. 항체의 일부는 예를 들어, 또한 세포외 인테그린 도메인에 대한 것처럼 항원에 결합하는 파라토프의 특징화로 인해 매우 작을 수 있다. 본 발명의 의미에서, 임의의 크기의 일부와 상동 서열 사이에서 명확하게 구별되는 것이고; 상동 서열의 상동은 전체 서열과 관련이 있다. 바람직하게는, 본래 서열과 동일한 특징을 갖는 그의 유도체 사이의 상동은 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상에 달한다. 유사하게는, 상동은 임의의 크기의 상기 언급된 일부가 변이체 또는 돌연변이체로 변경되는 경우 고려되는 것이다. 본 발명의 교시는 본 발명의 과제를 해결하는 한, 이러한 절차에 의해 본 발명의 성분을 기반으로 개발된 모든 펩티드 유도체를 포괄한다.
게다가 동일한 기능을 갖는 비-상동 펩티드를 발생시키기 위한 여러 기술이 종래 기술에 기재되어 있다. 본원에는, 비-상동 펩티드는 상기 바람직한 양의 상동에 비해 상동을 덜 갖는 아미노산 서열을 표시한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 달성하는데 있어 활성에 부정적인 영향을 주지 않고 단일 아미노산 또는 다중 아미노산을 대체하는 것이 가능하다. 이러한 아미노산의 대체를 위해, 생화학 및 유전학의 적합한 표준 교과서를 참조한다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 일부 아미노산은 유사한 물리화학적 특성을 가지므로, 상기 아미노산은 유리하게는 서로 대체될 수 있다. 여기에는 아미노산 그룹 (a) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (b) 세린 및 트레오닌, (c) 아스파라긴 및 글루타민, (d) 아스파르트산 및 글루탐산, (e) 리신 및 아르기닌, 및 (f) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 포함된다. 하나 및 동일한 그룹 (a) 내지 (f) 내의 아미노산은 서로 대체될 수 있다. 추가의 변형은 기능적으로 유사한 아미노산 서열을 발생시키는 하나의 방식을 기재하고 있는 문헌 [Schneider et al., PNAS 1998, 95: 12179-12184; WO 1999/62933 및/또는 WO 2002/38592] 의 교시에 따라 가능하다. 참조는 이에 의해 본 발명의 설명에 인용된다. 언급된 방법을 사용하고 본 발명의 임의의 아미노산 서열로부터 출발하여 디자인된 모든 아미노산 서열, 서열 부분 또는 서열을 포함하는 구조는 본 발명의 의미 내의 서열로서 간주되고, 이들이 본 발명의 목적을 달성하기만 한다면, 본 발명에 따른 교시에 포함될 것이다.
본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 절편이다. "폴리뉴클레오티드" 라는 용어는 DNA 또는 RNA 중합체에 도입될 수 있는 합성, 비-천연 또는 개질 뉴클레오티드를 대안적으로 포함하는 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 의 천연 또는 합성 중합체를 말한다. 각각의 뉴클레오티드는 당 부분, 포스페이트 부분, 및 퓨린 또는 피리미딘 잔기로 이루어진다. 핵산은 포스포로티오에이트 DNA, 잠금 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA) 또는 스피에겔머 (spiegelmer) 로서 임의로 개질될 수 있다. "~ 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드" 라는 용어는 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 유전자의 일부를 말한다. 전사의 개시 또는 종결을 통제하는 조절 서열 및/또는 요소는 배제된다. 코딩 서열 및/또는 조절 요소는 정상적으로 세포에서 발견될 수 있으며, 이 경우 이것은 자가의 것 또는 내인성의 것이라고 불리며, 또는 이것은 세포 내에 위치할 수 없을 수 있고, 이 경우 이것은 이종의 것이라고 불린다. "유전자" 라는 용어는 특이적 단백질을 코딩하는 DNA 서열 및 상기 DNA 서열의 발현을 통제하는 조절 요소를 표시한다.
이종 유전자는 또한 유전자가 이동된, 세포에서 정상적으로는 발견되지 않는 순서 및/또는 배향으로 배열된 자가 요소로 구성될 수 있다. 이종 유전자는 박테리아 또는 바이러스 게놈 또는 에피좀, 진핵 또는 플라스미드 DNA, cDNA, 또는 화학적으로 합성된 DNA 를 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 기원으로부터 완전히 또는 부분적으로 유래될 수 있다. 구조적 유전자는 연속 코딩 영역을 형성할 수 있고, 또는 이것은, 적합한 스플라이스 접합에 의해 경계를 둔 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 구조적 유전자는 다양한 자연 발생적 또는 합성 기원으로부터 유래된 분절로 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 21 내지 29 및 31 내지 40, SEQ ID NO: 61 내지 69 및 71 내지 80, SEQ ID NO: 101 내지 109 및 111 내지 120, SEQ ID NO: 141 내지 149 및 151 내지 160, SEQ ID NO: 181 내지 189 및 191 내지 200, 및 SEQ ID NO: 221 내지 229 및 231 내지 240 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 항체 및 이의 특이적 아미노산 서열에 관한 본 명세서의 종래의 교시는 편리하다면, 폴리뉴클레오티드 및 특이적 핵산 서열에 제한되지 않고 유효하고 이용가능한 것으로 간주된다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. "벡터" 라는 용어는 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 로 이루어지는 선형 또는 환형인, 플라스미드, 바이러스, 자가 복제 서열, 파지, 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있는 재조합 DNA 구조물을 표시하고, 다수의 뉴클레오티드 서열은 연결되거나 재조합되어 독특한 구조를 형성하며, 벡터는 적합한 비-번역된 3' 서열과 함께, 세포 내로 센스 또는 안티센스 방향으로 선택된 유전자 생성물의 프로모터 절편 및 DNA 서열을 도입할 수 있다.
특히 본 발명의 항체 또는 이의 절편의 재조합 유전자를 클로닝하고 발현하기 위해, 플라스미드가 본 발명의 항체-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 의미에서, 플라스미드는 이들의 숙주 세포의 염색체의 일부가 아니면서, 안정하게 상속되는 유전적 요소이다. 이들은 DNA 또는 RNA 를 포함할 수 있고, 이들은 선형 및 환형 모두일 수 있다. 플라스미드는 세포 복제 동안 이들의 복제 및 안정한 상속을 확보하는 분자를 코딩한다. 본 명세서에 기재된 출발 플라스미드는 시판되는, 공개적으로 접근가능한 것이거나, 또는 잘 알려진 공개된 방법의 정규적인 사용에 의해 이용가능한 플라스미드로부터 구축될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라스미드 및 기타 클로닝 및 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려지고 용이하게 이용가능하다. 게다가, 당업자는 본 발명에서 사용하기에 적합한 임의의 수의 기타 플라스미드를 쉽게 구축할 수 있다.
벡터는 숙주 세포 내로의 도입에 적합할 것이다. 따라서, 항체-코딩 폴리뉴클레오티드가 있는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 본 발명의 여전히 또다른 목적이다. 본 발명은 바람직하게는 단리된 원핵 또는 진핵 세포에 관한 것이나, 또한 상기 기재된 벡터를 포함하는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물, 조직, 기관 등 및 심지어 유기체를 포괄할 것이다. "숙주 세포" 라는 용어는, 여전히 상기 서열을 포함하는 키메라, 이종 또는 자가 핵산 서열 또는 이의 유도체의 이동에 의해 유전적으로 개질된 세포를 표시한다. 상기 세포는 또한 유전자도입 세포로서 언급되기도 한다. 자가 핵산 서열이 이동되는 경우, 숙주 세포 내 상기 서열의 카피본의 수는 자연 발생적 서열의 카피본의 수보다 많다.
본 발명은 또한 곤충-유래 글리코실화 패턴을 갖는 세포외 인테그린 도메인으로 이루어지는 재조합 면역원에 관한 것이다. 세포외 도메인은 바람직하게는 델타-막통과 (DTM) 형태로서 커플링된다. 본 발명의 상기 면역원은 토끼를 비롯한 선택된 포유동물 종에서 스스로에게 주사하는 경우 후천적 면역 반응을 유발할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 면역원은 SEQ ID NO: 10, 90, 130, 170 또는 210 의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열 또는 동일한 기능을 갖는 적어도 95% 상동 서열의 변이체, 돌연변이체, 일부를 갖는다. 본 발명의 목적은 또한 본 발명의 상기 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 바람직한 구현예에서, 면역원-코딩 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 30, 110, 150, 190 또는 230 의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 또는 동일한 기능을 갖는 적어도 95% 상동 서열의 변이체, 돌연변이체, 일부를 갖는다. 본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 면역원-코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 여전히 또다른 목적은 본 발명에 따른 면역원-코딩 폴리뉴클레오티드가 있는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 숙주 종이 본 발명에 따른 보호 범주에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 항체, 또는 서열 또는 이의 상동 서열의 변이체, 돌연변이체, 일부, 항체-코딩 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터, 숙주 세포 등과 관련된 본 명세서의 종래 교시는 적합한 경우 상기 또는 기타 항체를 발생시키기 위한 면역원에 제한 없이 유효하고 이용가능하다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 토끼 항체의 제조 방법에 관한 것이다: (a) 곤충 세포에서 세포외 인테그린 도메인 또는 이의 절편을 재조합적으로 발현하는 단계; (b) 발현된 세포외 도메인을 정제하는 단계; (c) 토끼를 정제된 세포외 도메인으로 면역화하는 단계; (d) 토끼로부터 폴리클론 항체를 포함하는 폴리클론 항혈청을 채취하는 단계; 및 임의로 (e) 단일클론 항체를 제조하는 단계.
바람직하게는, 단일클론 항체의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 곤충 세포에서 세포외 인테그린 도메인을 재조합적으로 발현하는 단계; (b) 발현된 세포외 인테그린 도메인을 정제하는 단계; (c) 토끼를 정제된 세포외 인테그린 도메인으로 면역화하는 단계; (d) 토끼로부터 폴리클론 항체를 포함하는 폴리클론 항혈청을 채취하는 단계; 및 (e) 단일클론 항체를 제조하는 단계. 더욱 바람직하게는, 본 방법은 상기 상세히 기재된 바와 같은 본 발명의 상기 단일클론 항체의 제조에 관한 것이다.
단계 (a) 의 단백질 발현은 여러 적합한 곤충 세포, 곤충 세포주 및 이들을 트랜스펙션시키기 위한 방식에 대한 접근법을 가지고 있는 당업자에게 있어서는 일상적인 일이다. 예를 들어, 재조합 배큘로바이러스로 감염된 BTI-Tn5B1-4 (High Five) 곤충 세포주가 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템 내에서 널리 사용되는데, 이는 많은 분비된 재조합 단백질이 스포돕테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda) 유래 세포주, 예컨대 Sf9 에서보다 상당히 높은 속도로 제조되기 때문이다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템으로부터 세포외 인테그린 도메인의 수율을 최적화하기 위해, 숙주 세포의 상태, 감염 다중도, 감염시 세포 밀도 및 영양분 및 산소가 있는 배지의 보충의 영향을 조사하기 위해 High Five 세포의 현탁액 채택 배양물로 용이하게 실험을 수행할 수 있다. 이러한 절차는 최첨단의 것이고 예를 들어, 문헌 [Vallazza & Petri, Cytotechnology 1999, 29: 85-92], 또는 [Mehta et al., Biochem J 1998, 330: 861-869] 에 공개되어 있다.
항체 또는 면역원 변형에 관한 종래 교시는 편리하다면 단계 (a) 의 변형된 면역원에 제한 없이 유효하고 이용가능한 것으로 고려된다. 당업자에게 명백하듯이, 본 발명은 인테그린의 전장 세포외 도메인에 제한되는 것으로 해석되어서는 안될 것이다. 세포외 도메인의 생리학적 또는 인공적 절편, 세포외 도메인의 이차 개질, 세포외 도메인의 종-의존적 변형 뿐 아니라 대립 변이체도 또한 본 발명에 포함된다. 이와 관련하여, "대립 변이체" 는 유전적인 단일 좌에 존재할 수 있는 유전자 또는 DNA 서열의 형태의 2 개 이상의 상이한 형태 중 하나의 유전자 생성물을 나타내는 것으로 이해된다. 인공적 절편은 바람직하게는 합성적으로 또는 재조합 기술에 의해 생성된 펩티드를 포함하고, 이것은 적어도 진단 관심의 에피토프를 포함한다.
단계 (e) 에 따라 곤충 세포에서 발현되는 경우, 세포외 인테그린 도메인은 성숙 포유동물 세포 상의 글리코실화 패턴과 상이한 결함이 있는 착생 (abherent) 글리코실화 패턴을 갖는다. 인테그린이 광범위하게, 즉, 10 질량% 넘게 글리코실화되므로, 이것은 곤충 단백질이 포유동물 시스템에서 생성되는 토끼 고유의 인테그린과 더욱 상이하다는 것을 의미한다. 곤충-유래 면역원은 상기 면역원의 단백질 요소에 대해 크게 향상된 면역원성 및 보다 강한 항체 반응을 야기한다.
단계 (b) 내지 (d) 의 단백질 정제, 포유동물 면역화 및 혈청 추출은 명세서 및 실시예 과정에 기재된 바와 같은, 잘 알려진 기술 및 양호한 실험실 실시를 따른다. 이어서 단계 (d) 의 혈청을 폴리클론의 존재에 대해 시험하고, 검출된 항체를 항원 인지에 대해 스크리닝한다. 적합한 시험 및 스크리닝은 당업자에게 이용가능하다.
임의로, 항체 제조는 1-특이적인, 동일한 항체의 종, 즉, 단계 (e) 의 단일클론으로 계속된다. 단일클론 항체는 전형적으로는 골수종 세포를, 단계 (c) 에 따라 면역화된 포유동물로부터의 비장 세포와 융합시켜 제조된다. 오직 융합된 세포만이 성장할 수 있는 하이포크잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 선택적 HAT 배지가 특히 사용된다. 그 다음 소위 하이브리도마를 희석하고, 마이크로리터 웰에서 클론을 단일 모 세포로부터 성장시킨다. 상이한 클론에 의해 분비된 항체를 세포외 인테그린 도메인의 항원에 결합하는 능력에 대해 시험한다. 따라서, 본 발명의 항체는 특히 하기 방법에 의해 제조된다.
세포내 인테그린 도메인을 사용함으로써 본 발명의 상기 방법에 의해 항체가 유사하게 제조될 수 있다는 것은 당연하다. 방법을 필요한 부분만 약간 수정하여 적용할 것이다.
본 발명의 목적은 또한 곤충 세포에서 재조합적으로 발현된 인테그린의 세포외 또는 세포질 도메인으로의 토끼의 면역화에 의해 수득된 항체이다. 본 발명의 면역원이 항체 생성에 사용될 수 있으므로, 본 발명은 특히 각각 본 발명에 따라 토끼를 면역원 및/또는 폴리뉴클레오티드로 면역화하고, 폴리클론 항체가 있는 폴리클론 항혈청을 채취하고, 단일클론 항체를 제조함으로써 수득되는 단일클론 항체에 관한 것이다. 면역원 및 토끼 항체의 제조 방법에 관한 본 명세서의 종래 교시는 적합하게는 상기 방법에 의해 제조된 항체 생성물에 제한 없이 유효하고 적용가능한 것으로 간주될 것이다.
가장 생산적이고 안정한 클론이 배양 배지에서 대량 부피로 성장될 수 있지만, 선택의 단일클론은 바람직하게는 재조합 방식으로 발현된다. 이것은 전체적으로 정의된 항체의 제조를 가능하게 하기 위해 항체 코딩 삽입체의 cDNA 클로닝, 서열분석 및 발현 벡터 내 삽입을 필요로 한다. 이어서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 재조합 단일클론 항체 또는 이의 절편의 제조 방법에 관한 것이다: (a) SEQ ID NO: 21 내지 29 및 31 내지 40, SEQ ID NO: 61 내지 69 및 71 내지 80, SEQ ID NO: 101 내지 109 및 111 내지 120, SEQ ID NO: 141 내지 149 및 151 내지 160, SEQ ID NO: 181 내지 189 및 191 내지 200, 및/또는 SEQ ID NO: 221 내지 229 및 231 내지 240 의 핵산 서열(들) 을 포함하는 벡터(들) 을 숙주 세포 내로 도입하는 단계, (b) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양함으로써, 코딩된 항체 또는 이의 절편을 발현시키는 단계, 및 (c) 발현된 항체 또는 이의 절편을 정제하는 단계.
벡터는 형질전환, 트랜스펙션 또는 형질도입과 같은 당업계의 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 박테리아 및 고세균류를 비롯한 원핵 세포는 특히 형질전환되는 반면 (예컨대 에스케리챠 (Escherichia) 종 또는 바실러스 (Bacillus) 종), 진핵 세포는 특히 트랜스펙션되는 것 (예컨대, CHO, HeLa, 등) 으로 이해될 것이다. 3 개의 도메인 시스템은 또한 바이러스 비히클에 의해 형질도입될 수 있다. 벡터는 단일클론 항체를 코딩하는 1 개 이상의 핵산 서열 또는 이의 절편을 포함할 수 있다.
단계 (a) 의 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 115 (VL-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 116 (VH-αvβ3) 의 핵산 서열을 포함한다. 단계 (a) 의 더욱 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 119 (L-αvβ3) 및/또는 SEQ ID NO: 120 (H-αvβ3) 의 핵산 서열을 포함한다.
단계 (a) 의 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 35 (VL-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 36 (VH-αvβ5) 의 핵산 서열을 포함한다. 단계 (a) 의 더욱 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 39 (L-αvβ5) 및/또는 SEQ ID NO: 40 (H-αvβ5) 의 핵산 서열을 포함한다.
단계 (a) 의 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 155 (VL-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 156 (VH-αvβ6) 의 핵산 서열을 포함한다. 단계 (a) 의 더욱 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 159 (L-αvβ6) 및/또는 SEQ ID NO: 160 (H-αvβ6) 의 핵산 서열을 포함한다.
단계 (a) 의 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 195 (VL-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 196 (VH-αvβ8) 의 핵산 서열을 포함한다. 단계 (a) 의 더욱 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 199 (L-αvβ8) 및/또는 SEQ ID NO: 200 (H-αvβ8) 의 핵산 서열을 포함한다.
단계 (a) 의 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 235 (VL-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 236 (VH-αv) 의 핵산 서열을 포함한다. 단계 (a) 의 더욱 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 239 (L-αv) 및/또는 SEQ ID NO: 240 (H-αv) 의 핵산 서열을 포함한다.
단계 (a) 의 또다른 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 75 (VL-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 76 (VH-β3) 의 핵산 서열을 포함한다. 단계 (a) 의 더욱 바람직한 구현예에서, 도입되는 벡터(들) 은 SEQ ID NO: 79 (L-β3) 및/또는 SEQ ID NO: 80 (H-β3) 의 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 양상에서 본 발명은 하기 단계로의, 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함하는 재조합 단일클론 항체의 제조 방법에 관한 것이다: (a) (i) SEQ ID NO: 115 (VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 116 (VH-αvβ3), (ii) SEQ ID NO: 35 (VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 36 (VH-αvβ5), (iii) SEQ ID NO: 155 (VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 156 (VH-αvβ6), (iv) SEQ ID NO: 195 (VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 196 (VH-αvβ8), 또는 (v) SEQ ID NO: 235 (VL-αv) 및 SEQ ID NO: 236 (VH-αv) 의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, (b) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양함으로써, 코딩된 항체를 발현시키는 단계, 및 (c) 발현된 항체를 정제하는 단계. 여러 개의 벡터는 상기 SEQ ID NO 의 오직 단일 서열만을 가짐으로써 바람직하게는 상이한 것으로 이해될 것이다. 단계 (a) 에서 각각, 상기 SEQ ID NOs 의 하나의 서열을 갖는 2 개의 벡터를 도입하는 것이 바람직하다.
게다가, 항체, 아미노산 서열 및 이의 변형, 상기를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뿐 아니라 토끼 항체의 제조에 관한 본 명세서의 종래 교시가, 편리한 경우 재조합 단일클론의 제조에 제한 없이 유효하고 이용가능한 것으로 고려된다.
포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 물질 내 인테그린의 검출을 위해 본 발명의 항체, 또는 이의 절편을 사용하는 것이 더욱 또다른 목적이다. 지금까지, 인테그린에 대한 것이며, FFPE 물질 내 복합체와 특이적으로 그리고 확실히 반응하는 고전적인 단일클론 항체가 없었다. 오로지 본 발명의 항체, 특히 토끼 단일클론만이, 인테그린의 비-폐색된 에피토프의 검출을 가능하게 할 고 친화성 및 특이성을 갖는다. 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "비-폐색된" 및 "노출된" 이라는 용어는, 에피토프가 항체에 의해 인지될 수 있는 항원의 분자 형태를 의미하는 것으로 여겨진다. 그러므로, FFPE 물질 상의 본 발명의 항체를 동결 물질 상의 쥣과 단일클론과 비교하는 경우 동일한 염색 패턴이 관찰된다. 게다가, FFPE 물질 상의 본 발명의 항체와 ELISA 내 단리된 인테그린 형태 및/또는 생존 세포 상의 고유의 인테그린 상태를 비교하는 경우, 바람직하게는 FFPE 물질 상의 및 생존 세포 상의 본 발명의 항체를 비교하는 경우, 실질적으로 동일한 염색 패턴이 관찰된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, FFPE 물질은 조직이다. FFPE 조직은 먼저, 절개 또는 생검에 의해 동물 시편으로부터 분리된 조직의 조각이다. 그 다음, 상기 조직을 부패 또는 분해로부터 방지하고 조직학적, 병리학적 또는 세포학적 연구를 위해 현미경하에서 이것을 명확하게 검사하기 위해 고정한다. 고정은 조직을 현미경하에서 염색 및 조망하기 위한 목적으로 부동화시키고, 치사시키고, 보존시키는 공정이다. 고정-후 가공은 조직이 염색 시약을 투과하도록 만들고 거대분자를 가교시켜, 이들이 위치에 안정화되고 갇히게 한다. 예를 들어, 보우인 (Bouine) 용액, 포르말린 또는 액체 질소와 같은, 많은 고정액이 본 목적을 위해 사용된다. 그 다음 상기 고정된 조직을 왁스에 포매시켜, 얇은 섹션으로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 염색될 수 있게 한다. 이 후, 마이크로톰 (microtoming) 은 현미경하에서 항체로의 염색을 연구하기 위해 미세한 섹션을 절단함으로써 실시된다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, FFPE 조직은 종양 조직, 가장 바람직하게는 인간 종양 조직이다. 종양은 특히 평편 상피, 방광, 위, 신장, 머리, 목, 식도, 자궁경부, 갑상선, 장, 간, 뇌, 전립선, 비뇨생식관, 림프계, 위, 후두 및/또는 폐의 종양 군으로부터 선택된다. 게다가 종양은 특히 폐 선종암종, 소세포 폐 암종, 췌장암, 교모세포종, 결장 암종 및 유방 암종 군으로부터 선택된다. 또한, 바람직한 것은 혈액 및 면역계의 종양, 더욱 특히 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병 및/또는 만성 림프성 백혈병 군으로부터 선택되는 종양에 대해 제시된다. 이러한 종양은 또한 본 발명의 의미에서 암으로서 지정될 수 있다.
본 발명의 항체는 인테그린 검출을 위해 FFPE 물질과 함께 인큐베이션된다. "인큐베이션" 이라는 용어는 FFPE 물질을 본 발명의 항체와, 물질의 종류에 따라 (항체 및/또는 항원) 다른 시간 동안 접촉시키는 것을 나타낸다. 인큐베이션 공정은 또한 다양한 다른 파라미터, 예를 들어, 검출 민감도에 따라 다르고, 이의 최적화는 당업자에게 공지된 정규 절차를 따른다. 화학 용액을 첨가하는 것 및/또는 물리적 절차, 예를 들어 가열 영향을 적용하는 것은 샘플 내 표적 구조의 접근가능성을 향상시킬 수 있다. 특이적 인큐베이션 생성물이 인큐베이션의 결과로서 형성된다.
형성된 항체/항원 복합체의 검출을 위한 적합한 시험이 당업자에게 알려져 있고, 또는 일상적인 일로서 용이하게 디자인될 수 있다. 많은 상이한 유형의 어세이가 알려져 있고, 이의 예는 하기에 언급된다. 본 발명에 따른 어세이가 인테그린 발현을 검출 및/또는 정량화하는데 적합한 임의의 어세이일 수 있더라도, 인테그린 발현은 바람직하게는 본 발명의 1 차 항체와 특이적으로 상호작용하는 성분에 의해 측정된다.
본원에서 사용되는 "특이적 성분" 이라는 용어는 신뢰성 있는 결합을 확보하기 위해 본 발명의 항-인테그린 항체에 대해 고 친화성을 갖는 분자를 포함한다. 성분은 바람직하게는 항체의 일부, 예를 들어, 불변 영역, 특히 토끼 불변 영역, 더욱 특히 Fc 절편 (있는 경우) 에 특이적이다. 존재하는 토끼 항체에 대항하는 구별되는 수의 특이적 항체가 있다. 일부는 특이적 기능, 즉, 인지를 위한 구조적 결정소의 제공의 발현에 적합한 영역에 대한 제약을 나타낸다. 본 발명의 문맥에서, "인지" 라는 용어는 특이적 성분과 표적 항체 사이의 임의의 유형의 상호작용, 특히 공유 또는 비공유 결합 또는 회합, 예컨대 공유 결합, 소수성/친수성 상호작용, 반데르 발스 힘, 이온 쌍, 수소 결합, 리간드-수용체 상호작용, 에피토프와 항체 결합 부위 사이의 상호작용, 뉴클레오티드 염기 쌍 등과 관련되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 회합은 또한 펩티드, 단백질 또는 기타 뉴클레오티드 서열과 같은 다른 분자의 존재를 포함할 수 있다.
특이적 성분은 인지, 결합 및 상호작용을 가능하게 만드는 방식으로 표적 분자와 상호작용할 수 있는 생물학적 및/또는 화학적 구조로 구성된다. 특히, 성분은 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 중합체 및 50 내지 1.000 Da 의 분자량을 갖는 소 분자, 바람직하게는 단백질 및 핵산 군으로부터 선택된다. 특이적 성분은 신뢰성 있는 검출을 확보하기 위해 충분한 민감성 및 특이성을 발현한다. 특이적 성분은 항-인테그린 항체에 대해 적어도 10-7 M 의 친화성을 갖는다. 특이적 성분은 그의 표적 분자에 대해 바람직하게는 10-8 M 또는 심지어 더욱 바람직하게는 10-9 M 의 친화성을 갖는다. 당업자가 인식하고 있듯이, 특이적이라는 용어는 샘플에 존재하는 다른 생분자가 항-인테그린 항체에 대한 특이적 성분에 유의하게 결합하지 않는 것을 나타내는데 사용된다. 바람직하게는, 표적 분자 이외의 생분자에 대한 결합 수준은 표적 분자의 친화성의 오직 10 %, 더욱 바람직하게는 오직 5 % 이하의 결합 친화성을 산출한다. 가장 바람직하게는, 성분은 본 발명의 선택된 1 차 항-인테그린 항체와 배타적이고 직접적인 상호작용을 보증하기 위해 1-특이적이다. 매우 바람직한 특이적 성분은 친화성에 대해서 뿐 아니라 특이성에 대해 초과 최소 기준을 모두 충족할 것이다.
단백질 또는 펩티드는 바람직하게는 항체, 사이토카인, 리포칼린, 수용체, 렉틴, 아비딘, 지단백질, 당단백질, 올리고펩티드, 펩티드 리간드 및 펩티드 호르몬으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 항체는 특이적 성분으로서 사용된다. 핵산은 바람직하게는 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 프라이머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA 효소, 앱타머 및/또는 siRNA, 또는 이의 일부이다. 더욱 바람직한 핵산 탐침은 앱타머, 가장 바람직하게는 RNA 앱타머인데, RNA 내에 이용가능한 2'-히드록실기가 한 쌍의 내부- 및 상호분자 접촉을 촉진시키기 때문이다. 앱타머는 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 대략 30 개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 RNA 앱타머는 시험관 내 전사에 의해 다량으로 유리하게 합성될 수 있다. 앱타머의 선별, 합성 및 정제는 당업자에게 잘 알려져 있다.
특이적 성분은, 모니터링 되는 특이적 성분 및 특이적 인큐베이션 생성물의 내재적 특징 뿐 아니라 적용되는 검출 방법, 즉, 필요한 민감성, 접합 용이성, 안정성 요구사항, 및 이용가능한 기기장치 및 폐기 조항에 따라 표지화를 달리하면서 표지될 수 있다. 표지화 방법은 표지가 쉽게 검출되는 한 특별히 제한되지 않는다. "표지된 특이적 성분" 은 표지의 존재를 검출함으로써 본 발명의 항-인테그린 항체의 존재가 검출될 수 있도록, 연결자 또는 화학 결합을 통해 공유적으로, 또는 이온, 반데르 발스, 정전기, 소수성 상호작용 또는 수소 결합을 통해 비-공유적으로 표지에 결합된 것이다.
단백질에 대한 항체의 특이적 면역학적 결합은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 이하, 항체-대-단백질 쌍은 인테그린에 대한 본 발명의 1 차 항체 또는 1 차 항-인테그린 항체에 대한 2 차 항체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 적합한 검출 방법의 바람직한 예는 발광, 특히 형광, 게다가 VIS 색상 및/또는 방사능 방출이다.
발광은 화학적발광, 생물학적발광, 또는 광발광의 결과로서 빛을 방출하는 것이다. 화학적발광은 화학 반응의 결과로서 가시광의 방출에 관여하는 반면, 생물학적발광은 루시페라아제의 활성을 필요로 한다. 형광 자극으로서도 알려진, 현재 바람직한 광발광은 광자의 흡수에 의해 야기되고, 바람직하게는 대략 10-8 초의 기간 내에 30 내지 50 nm 의 파장의 이동으로 광자로서 다시 방출되는 방사에 의해 제공된다. 형광 검출용 기구에는 전형적인 벤치탑 형광계, 형광 복합-웰 플레이트 판독기, 광섬유 형광계, 형광 현미경 및 형광 검출과 커플링된 마이크로칩/마이크로유체공학 시스템이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
VIS 색상은 맨눈에도 보이도록 하기 위한 임의의 무채색 성분의 가시화를 표시한다. 바람직하게는, 색상의 강도는 광도계에 의해 측정된다.
동위원소의 방사선은 섬광에 의해 측정된다. 액체 섬광의 방법은 섬광 칵테일로서 언급되는 유기 용매 및 용질의 시스템 내 베타 방출의 포획을 통해 샘플 내 베타 붕괴의 검출을 수반한다. 샘플 내 3H, 14C, 32P, 33P 및 35S 와 같은 방사능 동위원소에 의해 방출되는 베타 붕괴 전자는 용매 분자를 여기시키고, 이 후 에너지를 용질로 전달한다. 용질 (광 광자) 의 에너지 방출은 섬광 계수기 내 광전자 증배관에 의해 전기 신호로 전환된다. 칵테일은 또한 샘플의 균일한 현탁을 유지시키는 가용화제로서 작용해야만 한다. 감마선 광자는 종종 과도한 에너지의 새롭게 형성된 핵을 제거하기 위한 다른 붕괴 과정 (시리즈 붕괴) 의 결과로서 생성된다. 이들은 질량이 없고, 이들의 경로를 따라 충돌에 의해 임의의 직접적인 이온화가 있는 경우 거의 생성되지 않는다. 감마 광자는 하기 하나 이상의 3 가지 메카니즘에 의해 검출 및 양자화를 위해 흡수된다: 컴프톤 효과, 광전 효과 및 쌍 생성. 본 발명의 바람직한 감마 붕괴 동위원소는 125I 이다.
직접 표지에는 항체에 부착된, 형광 또는 발광 태그, 금속, 염료, 방사성 핵종 등이 포함된다. 요오드-125 (125I) 로 표지된 항체가 사용될 수 있다. 단백질에 특이적인 화학적발광 항체를 사용하는 화학적발광 어세이는 단백질 수준의 민감한, 비-방사성 검출에 적합하다. 형광색소로 표지된 항체가 또한 적합하다. 형광색소의 예에는 제한 없이, DAPI, 플루오레세인, Hoechst 33258, R-파이코시아닌, B-파이코에리트린, R-파이코에리트린, 로다민, 텍사스 (Texas) 레드, 및 리사민이 포함된다.
간접 표지에는 호스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제 (AP), β-갈락토시다아제, 우레아제 등과 같은 당업계에 잘 알려진 다양한 효소가 포함된다. 효소에 대한 항-인테그린 항체의 공유 연결은 글루타알데하이드와의 커플링과 같은 상이한 방법에 의해 수행될 수 있다. 효소 및 항체 모두는 유리 아미노기를 통해 글루타알데하이드와 연결되고, 네트워크를 형성한 효소와 항체의 부산물은 제거된다. 또다른 방법에서, 효소는 페록시다아제와 같이, 당단백질인 경우 당 잔기를 통해 항체에 커플링된다. 효소는 나트륨 페리오데이트에 의해 산화되고, 항체의 아미노기와 직접 연결된다. 탄수화물을 함유하는 기타 효소는 또한 상기 방식으로 항체에 커플링될 수 있다. 효소 커플링은 또한, 숙신이미딜 6-(N-말레이미도) 헥사노에이트와 같은 헤테로이작용성 연결자를 사용하여 β-갈락토시다아제와 같은 효소의 유리 티올기와 항체의 아미노기를 연결함으로써 수행될 수 있다. 호스래디쉬-페록시다아제 검출 시스템은, 450 nm 에서 검출가능한 과산화수소의 존재하에서 가용성 생성물을 산출하는 예를 들어, 색원성 기질 테트라메틸벤지딘 (TMB) 과 함께 사용될 수 있다. 알칼리 포스파타아제 검출 시스템은 예를 들어, 405 nm 에서 쉽게 검출가능한 가용성 생성물을 산출하는 색원성 기질 p-니트로페닐 포스페이트와 함께 사용될 수 있다. 유사하게는, β-갈락토시다아제 검출 시스템은 410 nm 에서 검출가능한 가용성 생성물을 산출하는 색원성 기질 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라녹시드 (ONPG) 와 함께 사용될 수 있다. 우레아제 검출 시스템은 우레아-브로모크레졸 퍼플과 같은 기질과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 방사성 핵종, 형광 염료, 예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™, 로다민, 텍사스 레드, 테트라로디민 이소티오시아네이트 (TRITC), Cy3, Cy5, 등, 형광 마커, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP), 파이코에리트린, 등, 종양-연관 프로테아제, 효소, 예를 들어, 루시페라아제, HRP, AP, 등, 나노입자, 비오틴, 디곡시게닌 등에 의해 활성화되는 자가-켄치 형광 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 검출가능 부분으로 표지된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 핵산은 디곡시게닌, 비오틴, 화학적발광 물질, 형광 염료, 자석 비이드, 금속성 비이드, 콜로이드성 입자, 전자-밀집 시약, 효소 (이들 모두는 당업계에 잘 알려져 있음), 또는 방사능 동위원소로 표지된다. 본 발명의 범주 내에서 핵산의 표지화를 위한 바람직한 동위원소는 3H, 14C, 32P, 33P, 35S 또는 125I, 더욱 바람직한 것은 32P, 33P 또는 125I 이다.
경쟁적 및 비-경쟁적 면역어세이를 비롯한 다양한 면역어세이 기술이 사용될 수 있다. "면역어세이" 라는 용어는, 유세포 측정, FACS, 효소 면역어세이 (EIA), 예컨대 효소 다중 면역어세이 기술 (EMIT), 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELlSA), IgM 항체 포획 ELISA (MAC ELISA) 및 마이크로입자 효소 면역어세이 (MEIA), 게다가 모세관 전기영동 면역어세이 (CEIA), 방사능-면역어세이 (RIA), 면역방사계측 어세이 (IRMA), 형광 편광 면역어세이 (FPIA) 및 화학적발광 어세이 (CL) 를 비롯한 기술을 제한 없이 포함한다. 원하는 경우, 이러한 면역어세이는 자동화될 수 있다. 면역어세이는 또한 레이저 유도 형광과 함께 사용될 수 있다. 리포좀 면역어세이, 예컨대 흐름-주입 리포좀 면역어세이 및 리포좀 면역센서가 또한 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 또한, 단백질/항체 복합체의 형성이 마커 농도의 함수로서 피크 속도 신호로 전환되는 증가된 광 산란을 야기하는 비탁분석 어세이가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인큐베이션 생성물은 ELISA, RIA, 플루오로 면역어세이 (FIA) 또는 가용성 입자 면역 어세이 (SPIA) 에 의해 검출된다.
ELISA 의 성분은 면역학적 반응의 하나의 파트너에 결합되는 효소이다. 인테그린의 추적자 항원 (분석 유도체) 은 바람직하게는 단일 포획 항체 (본원에서 이하 1 차로서 언급됨) 를 사용하는 경쟁적 ELISA 에서 표지되는 반면, 항체는, 바람직하게는 두번째 항체 (본원에서 이하 2 차로서 언급됨) 에 의해 항원-항체 복합체의 침전을 포함하는 비-경쟁적 ELISA 에서 바람직하게는 표지된다. 항원 및 2 개의 항체로 이루어지는 복합체는 또한 샌드위치 복합체로 불린다. 검출은 기질의, 생성물, 바람직하게는 가시적 색상, 생물학적발광, 형광 또는 전기적 신호의 측정 (효소 전극) 에 의해 인지되는 색조 생성물로의 후속되는 효소적 전환을 포함한다. 본 발명에서의 표지화를 위한 바람직한 효소는 페록시다아제 (예를 들어, HRP), 클로르암페니콜 아세틸 트랜스페라아제 (CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-트랜스페라아제 (GST), 루시페라아제, β-갈락토시다아제 및 AP 와 같이 당업자에게 알려져 있다.
부가적으로 바람직한 것은 합성 동안 면역 시약 내로 혼입되거나, 어세이의 면역 시약에, 바람직하게는 항체에 이후에 커플링되는 방사능 동위원소를 이용하는 방사능 면역어세이이다.
형광단으로 유리하게 표지된 항체가 FIA 에서 사용된다.
SPIA 는 응집의 결과로서 은 입자의 색상 변화를 이용한다. 2 차 항체 또는 표시자 반응 중 어느 것도 본 발명의 범주 내에서 특히 유용한 것이 되기 위해 필요하지 않다. 유사하게 바람직한 것은 색상이 있는 라텍스 입자에 결합된 항체를 사용하는 라텍스 응집 시험이다. 그러나, 이것은 이전 세정 단계에서 미결합된 및/또는 비-특이적으로 결합된 항원을 제거하기 위해 인테그린의 강한 부동화를 필요로 한다.
일반적으로, 모든 검출 방법에는 인테그린/항체 복합체로부터 미결합된 항체를 분리하기 위해 집중적인 세정 단계가 포함된다. 게다가, 임의의 검출 방법의 실험적 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다.
직접 또는 간접 표지로부터의 신호는 예를 들어, 색원성 기질로부터 색상을 검출하는 분광광도계를 사용하여, 125I 의 검출을 위한 감마 계수기와 같은 방사능을 검출하는 방사능 검출기를 사용하여, 또는 특정 파장의 빛의 존재하에 형광을 검출하는 형광계를 사용하여 분석될 수 있다. 효소-연결 항체의 검출을 위해, 정량 분석은 제조자의 지침에 따라 EMAX Microplate Reader (Molecular Devices; Menlo Park, CA) 와 같은 분광광도계를 사용하여 수행될 수 있다. 원한다면, 본 발명의 어세이를 자동화하거나 로봇으로 수행할 수 있어, 다중 샘플로부터의 신호를 동시에 검출할 수 있다.
카메라 또는 다른 기록 장치 (예를 들어, 광다이오드 및 데이터 저장 장치) 에 의해 관측되고 임의로 기록된 광학적 이미지는 예를 들어, 이미지를 디지털화하고 이미지를 컴퓨터에 저장 및 분석함으로써, 본원의 구현예 중 임의의 것에서 임의로 추가로 가공된다. 다양한 시판되는 주변 장치 및 소프트웨어가 디지털화된 비디오 또는 디지털화된 광학적 이미지의 디지털화, 저장 및 분석에 이용가능하다. 하나의 통상적인 시스템은 시편 시야로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 냉각된 전하 결합 소자 (CCD) 카메라로 빛을 운반한다. CCD 카메라에는 화소 어레이 (픽셀) 가 포함된다. 시편으로부터의 광은 CCD 상에 이미지화된다. 시편의 영역에 상응하는 특정 픽셀은 각각의 위치에 대한 광 강도 판독을 수득하기 위해 샘플링된다. 다중 픽셀을 동시에 처리하여 속력을 증가시킨다. 본 발명의 장치 및 방법은 예를 들어, 형광 또는 암 시야 현미경 기술에 의해 임의의 샘플을 관측하기 위해 용이하게 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 90 의 DTM-αvβ3 에 대항하여 생성된, SEQ ID NO: 99 (L-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 100 (H-αvβ3) 의 아미노산 서열로 이루어지는 토끼 하이브리도마 클론은 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성한다. 이들은 αvβ3 에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 10 의 DTM-αvβ5 에 대항하여 생성된, SEQ ID NO: 19 (L-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 20 (H-αvβ5) 의 아미노산 서열로 이루어지는 토끼 하이브리도마 클론은 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성한다. 이들은 αvβ5 에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 130 의 DTM-αvβ6 에 대항하여 생성된, SEQ ID NO: 139 (L-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 140 (H-αvβ6) 의 아미노산 서열로 이루어지는 토끼 하이브리도마 클론은 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성한다. 이들은 αvβ6 에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 170 의 DTM-αvβ8 에 대항하여 생성된, SEQ ID NO: 179 (L-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 180 (H-αvβ8) 의 아미노산 서열로 이루어지는 토끼 하이브리도마 클론은 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성한다. 이들은 αvβ8 에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 210 의 DTM-αv 에 대항하여 생성된, SEQ ID NO: 219 (L-αv) 및 SEQ ID NO: 220 (H-αv) 의 아미노산 서열로 이루어지는 토끼 하이브리도마 클론은 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성한다. 이들은 αv 에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 더욱 또다른 바람직한 구현예에서, SEQ ID NO: 50 의 β3 면역원에 대항하여 생성된, SEQ ID NO: 59 (L-β3) 및 SEQ ID NO: 60 (H-β3) 의 아미노산 서열로 이루어지는 토끼 하이브리도마 클론은 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성한다. 이들은 β3 에 선택적으로 결합한다. 그러나, 본 발명에서 기재되는 바와 같은 임의의 대안적인 서열 또는 이의 조합이 본 발명의 용도를 위해 적용될 수 있다는 것으로 이해되어야만 한다. 항체 및 이의 아미노산에 관련된 본 명세서의 종래 교시는 편리한 경우 용도에 제한 없이 유효하고 적용가능한 것으로 고려된다.
추가로, 본 발명은 FFPE 물질 내 인테그린의 검출이라는 본 발명의 용도를 수행하기 위해, 각각 본 발명에 따른, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 키트로서 실시될 수 있다. 특히, 항체는 종양 또는 기타 인간 병리학의, 특히 기록 FFPE 물질 내 인테그린 프로파일, 예를 들어, αv 인테그린 또는 기타 인테그린 발현 프로파일의 특징분석을 위한 진단 검출 키트 내에 도입될 수 있다. 본 발명의 키트에는 서면 지침을 포함하거나 사용자에게 본 발명의 방법을 실시하는 방법에 대한 서면 지침을 지시하는 문헌이 포함된다. 구현예에서, 키트는 리포터 부분 또는 리포터 장치를 추가로 포함한다. 키트 구성요소 및 이의 용도에 관련된 본 명세서의 종래 교시는 편리한 경우 키트에 제한 없이 유효하고 적용가능한 것으로 고려된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 인테그린 α-서브유닛 및/또는 β-서브유닛의 각각의 가장 가까운 상동 사이를 구별할 수 있고, FFPE 물질 내 면역조직화학에 적합한 항-인테그린 항체의 스크리닝 방법을 교시함으로써 두번째 과제를 해결한다: (a) 선택된 인테그린에 결합할 수 있는 항체의 샘플을 제공하는 단계; (b) 인테그린 서열을 정렬하여 선택된 인테그린의 α-서브유닛 및/또는 β-서브유닛의 가장 가까운 상동을 확인하는 단계; (c) 항체 샘플로, 선택된 인테그린의 고유의 형태 및 이의 가장 가까운 상동(들) 에 대해 차등 ELISA 를 수행하여, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 축적하는 단계 (1 차 스크리닝); (d) 단계 c) 의 축적된 항체로, 선택된 인테그린의 고유의 형태 및 또다른 인테그린에 대해 또다른 차등 ELISA 를 수행하여, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (2 차 스크리닝); (e) 단계 d) 의 축적된 항체로 FFPE 세포주의 면역조직화학을 수행하는 단계로, 하나 이상의 세포주는 선택된 인테그린을 발현할 수 있고, 임의로 또다른 세포주는 선택된 인테그린을 발현할 수 없어, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (3 차 스크리닝); (f) 단계 e) 의 FFPE 세포주의 면역조직화학을 단계 e) 의 축적된 항체로 수행하는 단계로, 세포주를 포유동물에서 이종이식 종양으로서 성장시켜, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (4 차 스크리닝); 및 (g) 기록 FFPE 종양의 면역조직화학을 단계 f) 의 축적된 항체로 수행하여, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (5 차 스크리닝).
1 차 스크리닝은 면역원의 본래의, 생물학적으로 활성인, 비-변성된 형태에 대해 차등 ELISA 에 의해 수행된다 (Mehta et al., 1998, Biochem J 330: 861-869). 표적 면역원이 αvβ3 인 경우, 예를 들어, 1 차 스크리닝은 αvβ3 대 αvβ5 이다. 이것은 1 차 스크리닝이 1 차 표적에 대해 가장 가까운 서열 상동성을 갖는 인테그린에 대해 반대-스크리닝을 사용하는 것을 의미한다. β3 사슬과 가장 가까운 상동은 β5 인 반면, αv 는 두 복합체에서 일치한다. 상기 방식으로 가장 차별되는 항체가 수득될 수 있다. 유사하게는, αvβ5 는 αvβ8 에 대해 스크리닝될 수 있다. 알파-사슬 특이적 항체에 대한 스크리닝은 동일한 절차를 따를 수 있다, 즉, αvβ1 은 α5β1 특이적 항체에 대한 반대 스크리닝으로서 사용될 수 있을 것이다. 2 차 스크리닝은 특이성을 추가로 확인하기 위해 ELISA 내 광범위한 세트의 재조합 인테그린을 살펴본다, 예를 들어, αiibβ3 은 αvβ3 항체의 β3-사슬 단독보다 αv 복합체에 대한 특이성을 확인하기 위해 사용될 수 있다 (바람직하게는 αvβ3 단일클론). 단계 (d) 에서 차등 스크리닝이 선택된 인테그린 및 또다른 가깝게 연관된 인테그린의 본래의 형태 상에서 단계 (c) 의 축적된 항체로 수행되는 것이 바람직하다. 3 차 스크리닝은 인테그린 발현 프로파일에 대해 생화학적으로 특징분석된 FFPE 세포주의 IHC 내 항체 염색을 살펴본다. 4 차 스크리닝은 누드 마우스에서 이종이식 종양으로서 성장된 동일한 세포주 상의 FFPE-IHC 를 사용한다. 5 차 스크리닝은 기록 FFPE 인간 종양을 살펴본다. 예를 들어, 3 차 및 4 차 스크리닝은 양성 스크리닝 표적으로서 M21, U87MG 및 M24 흑색종 상에 수행된다. 모든 상기 세포주는 αvβ3 을 발현하는 프로파일링이 내부 및 문헌으로부터 알려져 있는 반면, A549 NSCLC, Raji 및 HT29 는 음성 스크리닝 표적이다. 모든 상기 세포주는 αvβ3 을 발현하지 않는 프로파일링이 내부 및 문헌으로부터 알려져 있다. 5 차 스크리닝은 바람직하게는 αvβ3 양성으로서 악성 흑색종 및 교모세포종, 및 αvβ3 음성 인간 종양으로서 NSCLC 및 CRC 상에 수행된다.
스크리닝 방법의 구현예에서, 단계 (c) 내지 (g) 중 임의의 것은 축적된 항체의 차등 수용력 및/또는 특이성을 검출하는 추가 단계를 포함한다.
본 발명의 범주에서, 항체는 처음으로 제공되었고, 이것은 FFPE 기록 환자 물질, 예컨대 종양 생검에서, 및 또한 생 세포 유세포 측정 (FACS) 에 의해 인테그린의 입증된 검출을 허용한다. 관련 있는 단일클론 항체로 수득된 패턴에 상응하는 FACS 내 염색 패턴은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, αvβ3 의 경우 LM609; αvβ5 의 경우 P1F6). 본 발명의 항체가 FFPE 물질에서 뿐 아니라, 생존 세포 상의 이들의 본래의 상태에서도 각각의 인테그린을 검출한다는 것이 제시된다. 인테그린, 특히 αvβ3, αvβ5, αvβ6 또는 αvβ8 은 본 출원이 출원되기 전에 정규적 FFPE 생검 물질에서 쉽게 가시화될 수 없었던 1 차 치료 표적이다. 본 발명의 강력한 항체는 동결-보존된 물질 상에 공지된 αvβ3-, αvβ5- 또는 αvβ6-특이적 단일클론 항체에 의해 제시되는 분포와 일치하는 염색 패턴으로, 그러나 FFPE 대 동결-조직학 물질의 전형적인 형태학적 보존의, 잘 알려진 더욱 높은 공간적인 해상도 및 품질로, 기록 FFPE 물질에서 이들의 인테그린 표적을 인지하는 잠재력을 갖는다. 매우 적합한 항체는 단순히 또다른 종으로부터 기원하지 않는 토끼 단일클론이나, 상기 RabMab 는 유리하게는 특이성, 재현성 및 영원성 (즉, 영구히 동일한 시약 및 동일한 특이성) 을 갖는 것으로 입증되었다. αvβ3 또는 αvβ5 클론을 사용하여 생성된 RabMab 는 고전적인 항-αvβ3 항체 LM609 또는 항-avβ5 항체 PIF6 으로 염색된 동결-고정 물질과 일치하는 염색 패턴으로 인간 종양에서 기록 αvβ3 또는 αvβ5 를 인지한다. β3-세포질 도메인을 사용하여 생성된 RabMab 는 표적 세포의 공지된 αvβ3 발현 프로파일에 상응하는 패턴으로 이종이식 어레이를 염색한다. 이하에 밝혀지는 방식으로 제조되고, 임의로 스크리닝에 의해 선택되는 항체가 주로 FFPE 인테그린 상에 작용할지라도, 이들은 또한 생 세포 집단 상의 유세포 측정을 위해, 단리된 인테그린 상의 ELISA 에서 사용될 수 있고, 또는 심지어 기타 표준 생화학적 적용을 갖는다. 항체는 관찰된 인간 병리학 및 수용체의 생화학 사이에 흔치 않고 귀중한 입증 다리를 제공한다.
본 발명은 정제된 인테그린 도메인, 특히 정제된 인테그린 세포외 도메인, 더욱 특히 인간 기원의 상기 도메인을 사용함에 의한 항-인테그린 항체의 생성을 교시한다. 본 발명의 면역원은 짧은 기간의 면역화 내 높은 적정농도의 항체를 유발한다. 높은 항체 적정농도는 면역화 후 수득되고 어세이에서 사용되는 혈청의 고 희석에 의해 반영된다. 동시에, 다른 혈청 성분에 의해 야기될 수 있는 역효과는 이들의 희석된 존재로 인해 크게 감소된다. 적정농도는 유리하게는, 내생적이고 고도로 상동인 토끼 인테그린으로부터 글리코실화의 차이를 생성하는 곤충 재조합 면역원 제조에 의해 추가로 증가될 것이다. 항체 및 이의 유도체는 산업적 제조 규모, 적은 제조 비용 및 편리한 취급으로 포유동물 발현 시스템에서 높은 특이성 안정성 및 발현에 의해 특징화된다. 상기 특징은 교차 반응성 및 역효과의 결핍이 포함되는 재현성있는 작용을 위한, 그리고 이들의 부합되는 인테그린 구조와의 실현가능하고 안전한 상호작용을 위한 토대를 형성한다. 항체가 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있으므로, 이들은 기본적인 연구 및 진단을 위한 물질의 절대적으로 안정하고 재현가능한 소스를 제공한다. 게다가, 적합한 키트는 비용-효율적이게 생성된다.
본원에 언급된 모든 참조는 본 발명의 명세서에 참조로서 인용된다.
본 발명이 본원에 기재된 특이적 항체, 특정 방법, 용도 및 키트에 제한되는 것이 아닌 것으로 (이러한 물질이 물론 다양할 수 있으므로) 이해된다. 또한 본원에 사용된 전문용어는 오직 특정 구현예를 기재하기 위한 목적으로 사용되며, 오직 특허청구범위에 정의된, 본 발명의 범주를 제한하고자 의도되는 것이 아닌 것으로 이해된다. 특허청구범위를 포함하여 본원에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어에는 문맥상 다르게 명확하게 표시되지 않는 한 상응하는 복수의 참조가 포함된다. 그러므로, 예를 들어, "항체" 에 대한 참조에는 단일한 또는 여러 개의 상이한 항체들이 포함되는 반면, "항체들" 에 대한 참조는 필요한 부분만 약간 수정하여 적용할 것이며, "방법" 에 대한 참조에는 당업자에게 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 참조 등이 포함된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 따라 필수적인 기술은 명세서에 상세히 기재되어 있다. 상세히 기재되지 않은 다른 기술은 당업자에게 잘 알려진 공지된 표준 방법에 상응하며, 또는 기술은 언급된 참조문헌, 특허 출원 또는 표준 문헌에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 출원에 언급되지 않은 기타 미생물, 세포주, 플라스미드, 프로모터, 내성 마커, 복제 기원 등은 시판된다. 다른 힌트가 본 출원에 제공되지 않는 한, 이들은 오직 예로서만 사용되며, 이들은 본 발명에 따라 필수적인 것으로 간주되지 않지만, 다른 적합한 도구 및 생물학적 물질로 대체될 수 있다. 본원에 기재된 바와 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 예가 하기에 기재된다. 하기 예는 제한이 아닌 설명으로 제공된다. 실시예에서, 오염 활성이 없는 (언제든 실시시) 표준 시약 및 완충액이 사용된다. 실시예는 특히 특징의 명백하게 입증된 조합에 제한되지 않도록 해석되지만, 예시된 특징은 본 발명의 기술적 과제가 해결된다면 제한 없이 다시 조합될 수 있다.
도 1 은 αvβ3 의 외부 도메인에 대항하여 생성되는 서브클론 E3528-2-12 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 (좌) 및 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 2 는 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 클론 E3528-2-7 로의 이종이식 내 M21 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 3 은 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 E3528-2-7, E3528-2-11 및 E3528-2-12 로의 암 세포주 M21 (좌) 및 M21 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 4 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 및 Spotfire 로의 그래프 제시의 도움으로 항-αvβ3 항체 E3528-2-7, E3528-2-11 및 E3528-2-12 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 5 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항체 αvβ3_E3528-2-7 및 마우스 단일클론 항체 20H9 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다. 클론 20H9 는 β3-인테그린 사슬에 대항하는 것이다. "발현 (%최대)" 는 M21 의 발현에 표준화된다.
도 6 은 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 E3531-227-3 및 E3531-229-3 으로의 이종이식 내 M21 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 7 은 멀티클론 227 의 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 (E3531-227-3, E3531-227-3 및 E3531-227-6) 로의 암 세포주 M21 (좌) 및 M21 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 8 은 M21 세포 내 발현 % 로서 계산되는, 클론 E3531-227 (상) 의 그리고 마우스 단일클론 항-β3 항체 20H9 (하) 에 대해 비교한, 항-αvβ3 항체로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다. 발현은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 분석되었다.
도 9 는 αvβ5 의 외부 도메인에 대항하여 생성되는 서브클론 E3536-99-3 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 (좌) 및 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 10 은 인테그린 αvβ3 및 αvβ5 및 전장 정제된 혈소판 gpiibiiia 의 재조합 인간 세포외 도메인에 대항하는 정제된 단일클론 하이브리도마 항체 E3531-227-3, E3531-229-3 및 E3536-99-2 의 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 11 은 정제된 항-αvβ5 인테그린 항체 클론 E3536-99-3 으로의 이종이식 내 A431 및 HCT116 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 12 는 정제된 항-αvβ5 인테그린 항체 E3536-99-1, E3536-99-2 및 E3536-99-3 으로의 암 세포주 U87MG (좌) 및 U87MG 및 A431 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 13 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 및 Spotfire 로의 그래프 제시의 도움으로 항-αvβ5 항체 E3536-99-1, E3536-99-2 및 E3536-99-3 으로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 14 는 서브클론 E3866-52-1 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 (좌) 및 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 15 는 서브클론 E3866-52-1 의 정제된 항체로의 FFPE 암 세포주의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 16 은 재조합 항-αvβ6 인테그린 항체로의 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 17 은 재조합 항-αvβ6 인테그린 항체로의 이종이식 내 전립선 암종 세포 (상) 및 HT29 결장 암종 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 18 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항-αvβ6 항체로의 면역조직화학 염색 (실행 3421) 의 분석을 나타낸다.
도 19 는 항-avβ6 재조합 항체로의 슬라이드-대-슬라이드 및 실행-대-실행 재현성을 나타낸다.
도 20 은 항-αvβ8 서브클론 133-9 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 21 은 항-αvβ8 서브클론 E3875-133-9 의 정제된 항체로의 FFPE 암 세포주의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 22 는 재조합 항-αvβ8 인테그린 항체 EM13309 로의 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 23 은 재조합 항-αvβ8 인테그린 항체 EM13309 로의 인간 조직의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 24 는 재조합 항-αvβ8 인테그린 항체로의 이종이식 내 전립선 암종 세포 (상) 및 H1975 폐 암종 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 25 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항-αvβ8 항체 EM 13309 로의 면역조직화학 염색 (실행 3422) 의 분석을 나타낸다.
도 26 은 항-avβ8 재조합 항체 EM 13309 로의 슬라이드-대-슬라이드 및 실행-대-실행 재현성을 나타낸다.
도 27 은 항-αv 서브클론 E3875-13-9 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 28 은 서브클론 E3875-13-9 의 정제된 항-αv 항체로의 FFPE 암 세포주의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 29 는 재조합 항-αv 항체 EM01309 로의 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 30 은 재조합 항-αv 항체 EM01309 로의 이종이식 내 DU-145 (상) 및 HT29 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 31 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 재조합 항-αv 항체 EM01309 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 32 는 항-αv 재조합 항체 EM01309 로의 슬라이드-대-슬라이드 및 실행-대-실행 재현성을 나타낸다.
도 33 은 정제된 항-β3 인테그린 항체 클론 E3592-2-12 로의 이종이식 내 M21 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 34 는 정제된 항-β3 인테그린 항체 E3592-2-4, E3592-2-10 및 E3592-2-12 로의 암 세포주 M21 (좌) 및 M21 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 35 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 및 Spotfire 로의 그래프 제시의 도움으로 항-β3 항체 E3592-2-4, E3592-2-10 및 E3592-2-12 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 36 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항체 β3_E3592-2-12 및 마우스 단일클론 항체 20H9 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다. 클론 20H9 는 β3-인테그린 사슬에 대항하는 것이다. "발현 (%최대)" 는 M21 의 발현에 표준화된다.
도 37 은 재조합 인간 αv-인테그린 세포외 도메인 및 전장 정제된 혈소판 gpiibiiia 의 재조합 인간 세포외 도메인에 대항하는 토끼 항-인테그린 유래의 정제된 단일클론 하이브리도마 항체 E3875-133-9, E3866-052-1 및 E3875-013-9 의 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 38 은 재조합 인간 αv-인테그린 세포외 도메인 및 전장 정제된 혈소판 gpiibiiia 에 대항하는 EBNA-재조합 토끼 항-인테그린 단일클론 항체 EM22703, EM09902, EM00212, EM05201, EM13309 및 EM01309 의 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 39 는 리간드로서 비오틴 비트로넥틴을 사용하는 RabMab 항체 EM22703, EM09902, EM00212 에 대한 수용체 억제 어세이를 나타낸다.
도 40 은 M21 상의 EM022703 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 41 은 A549 상의 EM009902 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 42 는 HT29 상의 EM05202 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 43 은 M24-met 세포 상의 EM13309 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 2 는 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 클론 E3528-2-7 로의 이종이식 내 M21 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 3 은 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 E3528-2-7, E3528-2-11 및 E3528-2-12 로의 암 세포주 M21 (좌) 및 M21 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 4 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 및 Spotfire 로의 그래프 제시의 도움으로 항-αvβ3 항체 E3528-2-7, E3528-2-11 및 E3528-2-12 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 5 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항체 αvβ3_E3528-2-7 및 마우스 단일클론 항체 20H9 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다. 클론 20H9 는 β3-인테그린 사슬에 대항하는 것이다. "발현 (%최대)" 는 M21 의 발현에 표준화된다.
도 6 은 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 E3531-227-3 및 E3531-229-3 으로의 이종이식 내 M21 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 7 은 멀티클론 227 의 정제된 항-αvβ3 인테그린 항체 (E3531-227-3, E3531-227-3 및 E3531-227-6) 로의 암 세포주 M21 (좌) 및 M21 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 8 은 M21 세포 내 발현 % 로서 계산되는, 클론 E3531-227 (상) 의 그리고 마우스 단일클론 항-β3 항체 20H9 (하) 에 대해 비교한, 항-αvβ3 항체로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다. 발현은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 분석되었다.
도 9 는 αvβ5 의 외부 도메인에 대항하여 생성되는 서브클론 E3536-99-3 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 (좌) 및 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 10 은 인테그린 αvβ3 및 αvβ5 및 전장 정제된 혈소판 gpiibiiia 의 재조합 인간 세포외 도메인에 대항하는 정제된 단일클론 하이브리도마 항체 E3531-227-3, E3531-229-3 및 E3536-99-2 의 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 11 은 정제된 항-αvβ5 인테그린 항체 클론 E3536-99-3 으로의 이종이식 내 A431 및 HCT116 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 12 는 정제된 항-αvβ5 인테그린 항체 E3536-99-1, E3536-99-2 및 E3536-99-3 으로의 암 세포주 U87MG (좌) 및 U87MG 및 A431 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 13 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 및 Spotfire 로의 그래프 제시의 도움으로 항-αvβ5 항체 E3536-99-1, E3536-99-2 및 E3536-99-3 으로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 14 는 서브클론 E3866-52-1 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 (좌) 및 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 15 는 서브클론 E3866-52-1 의 정제된 항체로의 FFPE 암 세포주의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 16 은 재조합 항-αvβ6 인테그린 항체로의 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 17 은 재조합 항-αvβ6 인테그린 항체로의 이종이식 내 전립선 암종 세포 (상) 및 HT29 결장 암종 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 18 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항-αvβ6 항체로의 면역조직화학 염색 (실행 3421) 의 분석을 나타낸다.
도 19 는 항-avβ6 재조합 항체로의 슬라이드-대-슬라이드 및 실행-대-실행 재현성을 나타낸다.
도 20 은 항-αvβ8 서브클론 133-9 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 21 은 항-αvβ8 서브클론 E3875-133-9 의 정제된 항체로의 FFPE 암 세포주의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 22 는 재조합 항-αvβ8 인테그린 항체 EM13309 로의 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 23 은 재조합 항-αvβ8 인테그린 항체 EM13309 로의 인간 조직의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 24 는 재조합 항-αvβ8 인테그린 항체로의 이종이식 내 전립선 암종 세포 (상) 및 H1975 폐 암종 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 25 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항-αvβ8 항체 EM 13309 로의 면역조직화학 염색 (실행 3422) 의 분석을 나타낸다.
도 26 은 항-avβ8 재조합 항체 EM 13309 로의 슬라이드-대-슬라이드 및 실행-대-실행 재현성을 나타낸다.
도 27 은 항-αv 서브클론 E3875-13-9 의 상청액으로의 FFPE 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 28 은 서브클론 E3875-13-9 의 정제된 항-αv 항체로의 FFPE 암 세포주의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 29 는 재조합 항-αv 항체 EM01309 로의 암 세포주 및 이종이식의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 30 은 재조합 항-αv 항체 EM01309 로의 이종이식 내 DU-145 (상) 및 HT29 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 31 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 재조합 항-αv 항체 EM01309 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 32 는 항-αv 재조합 항체 EM01309 로의 슬라이드-대-슬라이드 및 실행-대-실행 재현성을 나타낸다.
도 33 은 정제된 항-β3 인테그린 항체 클론 E3592-2-12 로의 이종이식 내 M21 세포의 원형질 막 염색을 나타낸다.
도 34 는 정제된 항-β3 인테그린 항체 E3592-2-4, E3592-2-10 및 E3592-2-12 로의 암 세포주 M21 (좌) 및 M21 이종이식 (우) 의 면역조직화학 염색을 나타낸다.
도 35 는 이미지 분석 (Ariol SL-50) 및 Spotfire 로의 그래프 제시의 도움으로 항-β3 항체 E3592-2-4, E3592-2-10 및 E3592-2-12 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다.
도 36 은 이미지 분석 (Ariol SL-50) 의 도움으로 항체 β3_E3592-2-12 및 마우스 단일클론 항체 20H9 로의 면역조직화학 염색의 분석을 나타낸다. 클론 20H9 는 β3-인테그린 사슬에 대항하는 것이다. "발현 (%최대)" 는 M21 의 발현에 표준화된다.
도 37 은 재조합 인간 αv-인테그린 세포외 도메인 및 전장 정제된 혈소판 gpiibiiia 의 재조합 인간 세포외 도메인에 대항하는 토끼 항-인테그린 유래의 정제된 단일클론 하이브리도마 항체 E3875-133-9, E3866-052-1 및 E3875-013-9 의 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 38 은 재조합 인간 αv-인테그린 세포외 도메인 및 전장 정제된 혈소판 gpiibiiia 에 대항하는 EBNA-재조합 토끼 항-인테그린 단일클론 항체 EM22703, EM09902, EM00212, EM05201, EM13309 및 EM01309 의 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도 39 는 리간드로서 비오틴 비트로넥틴을 사용하는 RabMab 항체 EM22703, EM09902, EM00212 에 대한 수용체 억제 어세이를 나타낸다.
도 40 은 M21 상의 EM022703 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 41 은 A549 상의 EM009902 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 42 는 HT29 상의 EM05202 의 FACS 적정을 나타낸다.
도 43 은 M24-met 세포 상의 EM13309 의 FACS 적정을 나타낸다.
실시예 1: 면역원의 생성
실시예 1.1: 세포외 도메인 αvβ3, αvβ5, αvβ6 및 αvβ8v 의 생성
재조합 인간 인테그린 세포외 도메인, αvβ3, αvβ5, αvβ6 및 αvβ8 을, 배큘로바이러스 감염을 사용하는 곤충 세포주 (Hive Five) 에서 발생시켰다. 음성 대조군으로서 곤충 세포주의 사용이 적절하였다. 발효 후, 다운스트림 공정은 하기 요소를 포함한다: <Mab 14D9> Toyopearl 친화성 컬럼 상의 크로마토그래피, Spectra/POR 투석 튜브 (DTM-αvβ3 및 DTM-αvβ5 의 경우 6-8 kDa; DTM-αvβ8 의 경우 25 kDa) 로의 투석, 컷 오프 30 kDa (오직 DTM-αvβ5 및 DTM-αvβ8 만) 을 갖는 Millipore TFF Labscale 로의 농축, 컷 오프 30 kDa 를 갖는 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 단위로의 농축 및 Millex GV (오직 DTM-αvβ3, DTM-αvβ6, DTM-αvβ8 만) 로의 0.2 ㎛ 여과.
22 mg DTM-αvβ3 을 50 mM Na(CH3COO), 0.2 mM MnCl2, pH 7.4 의 완충액에 용해시켜, 2.0 mg/ml 의 단백질 농도를 산출하였다. 이어서 저장액을 500 ㎕ 의 바이알 22 개로 분취하였다. 10.6 mg DTM-αvβ5 를 50 mM Na(CH3COO), 0.2 mM MnCl2, pH 7.4 의 완충액에 용해시켜, 2.36 mg/ml 의 단백질 농도를 산출하였다. 이어서 저장액을 500 ㎕ 의 바이알 9 개로 분취하였다. 15 mg DTM-αvβ6 을 50 mM Na(CH3COO), 0.2 mM MnCl2, pH 7.4 의 완충액에 용해시켜, 2.36 mg/ml 의 단백질 농도를 산출하였다. 16.6 mg DTM-αvβ8 을 50 mM Na(CH3COO), 0.2 mM MnCl2, pH 7.4 의 완충액에 용해시켜, 2.78 mg/ml 의 단백질 농도를 산출하였다.
분취액을 액체 질소로 동결시키고, -80℃ 에서 저장하였다. 정규적 실험 활용에 의해 쿠마시 (Coomassie) 염색 또는 웨스턴 블롯팅으로 BCA 어세이 및 SDS 페이지에 의해 분석을 수행하였다. 하기 항체를 웨스턴 블롯팅에 의한 DTM-αvβ3 검출에 대해 사용하였다: 일차 Mab AP3 EMD 330515/CH000, 5 ㎍/ml, 2 h RT, 및 이차 염소 항 IgG (H+L) x AP, Dianova, 115-055-062, 1:1000, 1 h RT, 이후 Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0382, 1:5000. 하기 항체를 웨스턴 블롯팅에 의한 DTM-αvβ5 검출에 대해 사용하였다: 일차 Mab <11D1>-CH004, 2.5 ㎍/ml, 1 h RT, 및 이차 염소 항 마우스 IgG (H+L) x AP, Dianova, 115-055-062, 1:1000, 1 h RT, 이후 Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0382, 1:5000. 하기 항체를 웨스턴 블롯팅에 의한 DTM-αvβ6 검출에 대해 사용하였다: 일차 Mab 442-5C4 x 비오틴 (Biotin) <hu-lntegrin β6> 330510/CH001, 2 ㎍/ml, 2 h RT, 및 이차 항 비오틴 x AP, Sigma A-7064, 1:2500, 2 h RT, 이후 Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0380, 1:5000. 하기 항체를 웨스턴 블롯팅에 의한 DTM-αvβ8 검출에 대해 사용하였다: 일차 Mab LM 142 x 비오틴 Pool A 269A07H1.G01, 5 ㎍/ml, 2 h RT, 및 이차 염소 항 마우스 IgG (H+L) x AP, Dianova, 115-055-062, 1:1000, 1 h RT, 이후 Precision Step Tractin x AP, BioRad, 161-0382, 1:5000, 1 h RT.
면역원을 이들의 동일계통 기질, 예를 들어, 비트로넥틴 (αvβ3 및 αvβ5) 및 피브로넥틴 (αvβ3) 에 결합하는 능력에 의해 생물학적으로 활성이고 특이적인 것으로 특징화하였다. 상기 제제는 인테그린 구조적 충실성에 대한 골드-표준으로서 인정되었다 (Mehta et al., Biochem J 1998, 330: 861-869; Xiong et al., Science 2001, 294: 339-345). 재조합 인간 인테그린 세포외 도메인 DTM-αvβ3, DTM-αvβ5, DTM-αvβ6 및 DTM-αvβ8 을 면역원으로서 사용하였다.
실시예 1.2: 세포질 도메인 β3 의 생성
GST 에 융합된 인간 β3 인테그린 세포질 도메인을 E. 콜라이 BL21 에서 제조하고, 재조합 융합 단백질로서 면역원으로서 정제하였다. 발효 후, 다운스트림 공정은 하기 요소를 포함한다: 세포 용리, 프렌치 프레스 (French press), 봉입체의 제조, 투석 및 농축에 의한 재폴딩. 55 mg 단백질을 0.1 M 탄산나트륨, 5 mM DTT, pH 9.5 의 완충액에 용해시켜, 1.27 mg/ml 의 단백질 농도를 산출하였다. 이어서 저장액을 10 ml 의 바이알 2 개, 5 ml 의 바이알 4 개 및 1 ml 의 바이알 4 개로 분취하였다. 분취액을 여과하고 (0.2 ㎛), 액체 질소 로 동결시키고, -80℃ 에서 저장하였다. 정규적 실험 활용에 의해 쿠마시 (Coomassie) 염색 또는 웨스턴 블롯팅으로 Bradford 어세이 및 SDS 페이지에 의해 분석을 수행하였다. 하기 항체를 웨스턴 블롯팅에 의한 β3 검출에 대해 사용하였다: 1 차 염소-항-GST, Amersham, No. 27-4577-01, 1:5000, 1 h RT, 및 2 차 F(ab')2 절편 토끼-항-염소 IgG (H+L) x AP, Dianova, 305-056-045, 1:1000, 1h RT, 이후 Precision Strep Tactin-AP Conjugate, BioRad, Nr. 161-0382, 1:5000.
실시예 1.3: gpiibiiia 의 생성
전장 인간 gpiibiiia 를 이전에 상세히 기재된 바와 같이 옥틸글루코시드를 사용하여 구식의 인간 혈소판으로부터 추출하였다 (Mitjans et al., J Cell Sci 1995, 108(Pt 8): 2825-38).
실시예 2: 항체의 생성
토끼 단일클론 항체의 생성은 하기 4 단계 절차를 따랐다: (A) 토끼의 면역화 및 폴리클론 혈청의 스크리닝, (B) 하이브리도마 세포를 생성하기 위한 융합 및 멀티클론의 상청액의 스크리닝, (C) 서브클로닝 및 서브클론의 상청액의 스크리닝, 및 (D) 항체 코딩 삽입체의 cDNA 클로닝, 서열분석 및 EBNA 발현 벡터 내로의 삽입에 의한 전체적으로 정의된 항체의 생성 허용. 토끼를 출혈시켜, 하이브리도마 상청액 및 정제된 항체를 표준 프로토콜에 따라, 부동화된 정제된 면역원에 대항하여 ELISA 에서 분석하였다. 양성 클론을 특이성 및 활성을 확인하기 위해 전달에 대해 αvβ3, αvβ5 αvβ6 및 αvβ8 의 재조합 세포외 도메인에 대항하여 차등 스크리닝에 의해 재시험하였다.
단계 (A) 에서, 면역원 당 여러 마리의 토끼를 면역화시키고, 항혈청 적정농도를 모니터링하였다. 모든 토끼의 전-출혈은 FFPE 물질에 대해 심지어 낮은 희석 (1:50) 에서도 신호를 제시하지 않았으나, 융합 전 1 차 출혈 (폴리클론 혈청) 은 세포 표면 단백질에 대한 특이성의 강한 지표를 갖고, 이미 명백하고 분명한 신호를 제시하였다. 각각의 토끼의 3 개 출혈을 전달하고, 8 내지 12 주 후 융합에 대해 면역원 당 단일한 양성 토끼를 선택하였다.
단계 (B) 에서, 혈청 양성 토끼로부터의 B 세포를 단리하고, 토끼 융합 파트너 세포주 240E-W 를 단리된 토끼 B-세포와 융합하여 토끼 하이브리도마 세포를 제작하였다. 96-웰 플레이트로 ELISA 에 의해 융합에 대해 스크리닝하였다. 10 내지 100 개의 양성 클론에 대한 상청액을 전달하였고, 면역원 당 3 개의 멀티클론을 5 내지 6 주 후에 선택하였다.
단계 (C) 에서, 하이브리도마를 클로닝 및 스크리닝하여 적합한 특이적 항원을 인지하는 항체를 분비하는 클론을 선택하였고, 다양한 방법 (웨스턴 블롯팅, IHC, ICC, 유세포 측정 등) 을 사용하여 항체를 특징화하였다. 서브클론의 상청액을 특히 특이적 항원 인지를 위해 ELISA 로 스크리닝하였다. 양성 시험된 서브클론의 상청액을 동결시키고 사용시까지 -80℃ 에서 저장하였다. 이어서, 서브클론 상청액을 실시예 3 의 2 단계 방법으로, 첫번째 암 세포주 어레이 상에서, 두번째 단계에서는 첫번째 스크리닝을 입증하기 위해 동시에 암 세포주 어레이가 있는 이종이식 조직 상에서, 스크리닝하였다.
단계 (D) 에서, 선택된 항체 클론의 DNA 서열을 잘라내고, EBNA 발현 벡터 내로 클로닝하고, 자동화 cDNA Sanger 염료 서열분석에 의해 서열분석하였다. 재조합 항체를 문헌 [Pham et al., Biotech Bioeng 2003, 84(3): 332-342] 에 따른 EBNA 세포 발현 시스템에서, 그러나 일시적 트랜스펙션 시스템을 위한 pTT5 벡터가 있는 HEK293-6E 세포를 사용하는 약간의 변형을 하여 제조하였다. 항체 생성은 ELISA 및 IHC 에 의해 입증되었다. 하이브리도마 세포로부터의 mRNA 를 제조자의 제안에 따라 TuboCapture Kit (Qiagen) 를 사용하여 단리한 다음, 올리고-dT 프라이머를 사용하여 cDNA 내로 역전사시켰다. 중쇄의 가변 영역 (VH) 을 전매 프라이머 OYZ64-2 및 OYZvh3 을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 전체 경쇄 (L) 를 전매 프라이머 OYZ62 및 OYZ71 을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 절편의 VH 영역을 제한 효소 HindIII 및 KpnI 을 사용하여 소화시켰다. L PCR 절편을 HindIII 및 NotI 을 사용하여 소화시켰다. 모든 소화된 생성물을 Qiagen PCR 클리닝 업 키트를 사용하여 정제하였다. 정제 후, VH 또는 L 절편을 상응하는 중쇄 또는 경쇄 전매 발현 벡터 내로 라이게이션하고, 수용능 세포 DH5α (MC Lab) 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 고르고, 상응하는 제한 효소 (예상되는 크기에 의해: VH 의 경우 대략 440 bp 및 L 의 경우 740 bp) 를 사용하여 삽입체를 확인하였다. 정확한 크기의 삽입체가 있는 플라스미드를 프라이머에 대해 TT5 를 사용하여 서열분석하였다. 전체 경쇄 또는 중쇄 절편을 HindIII 및 NotI 로 상응하는 벡터로부터 잘라내고 이어서 Qiagen PCR 클리닝 업 키트를 사용하여 정제하였다. 대략 50 내지 100 ng 의 cDNA 삽입체가 모였다.
실시예 3: 항체의 스크리닝 및 특징분석 방법
실시예 3.1 어레이 조성물
27 개의 암 세포주 및 1 개의 곤충 세포주를 포스페이트 완충된 4% 파라포름알데히드, pH 7 에서, 16 내지 24 시간에 걸쳐 실온에서 고정시키고, 파라핀에 포매시키고, 28 개의 세포주 파라핀 블록 (CAX05) 으로 정렬하였다. 어레이에 사용된 여러 세포주의 인테그린 세포 표면 발현 프로파일을, 각각 αvβ3 및 αvβ5 인테그린 복합체에 대항하는 규정된 마우스 단일클론 항체, 예컨대 LM609 (Cheresh & Spiro, JBC 1987, 262: 17703-17712) 및 P1F6 (Varner & Cheresh, Important Adv Oncol 1996, 87: 69) 을 사용하여 유세포 측정에 의해 미리 특징분석하였다 (Mitjans et al., J Cell Sci 1995, 108(Pt 8): 2825-38).
CAX05:
A 431 평편세포암 oes
A 549 폐암
A2780 ADR 난소암
C 8161 흑색종
Calu 6 폐 선종
Colo 205 결장암
DU145 전립선암
HCT 116 결장암
HT 29 결장암
Igrov 1 난소암
Kyse 30 평편세포암
Lox 흑색종
M21 흑색종
M24-met 흑색종
MCF 7 유방암
MDA-MB 23 유방암
MDA-MB468 유방암
MiaPaCa2 췌장암
NCI-H460LC 폐암
Ovcar-3 난소암
PC 3 전립선암
Raji 버킷림프종
Sf9 곤충 세포
SKOV 3 난소암
Suit 7 췌장암
SW707 결장암
U87MG 교모세포종
WM 164 흑색종
상이한 실험 연구로부터의 어레이 (Xeno-08-A; Xeno-08-Mu1) 가 비히클 처리된 마우스로부터의 이종이식을 사용하여 구성되었다.
Xeno-08-A:
M21 마우스
U87MG 마우스
HCT116 CD1 nu/nu 마우스
A549 (인간 폐 암종) CD1 nu/nu 마우스
Calu 6 CD1 nu/nu 마우스
Xeno-08-Mu1:
A549, HCT116, U87MG, M21, Calu 6, A431, BT474, Colo205, H1975, MDA MB-231, Mes-Sa/Dx5, PC3, SW707, A2780, A2780ADR
암 세포주 어레이 및 이종이식 어레이의 3 ㎛ 섹션을 양성 전하의 SuperFrost®Plus 슬라이드 (Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany) 상에 고정시키고, 건조제와 함께 -80℃ 에서 보관하였다.
실시예 3.2: IHC 절차
섹션의 탈파라핀화로 시작하는 면역조직화학 염색 절차를 염색 기구 Discovery™ 또는 Discovery® XT (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, USA) 를 사용하여 수행하였다. 탈파라핀화 후 섹션을 Tris-EDTA 완충액 pH 8 에서 에피토프 회수를 위해 가열하거나, 37℃ 에서 8 분 (프로테아제 1) 또는 12 분 (프로테아제 2) 동안 프로테아제와 인큐베이션시켰다. 내생 페록시다아제를 3% 과산화수소 (OmniMap™ 또는 UltraMap™ Kits 의 일부, Ventana Medical Systems) 내 인큐베이션에 의해 차단하였다. 첫번째 면역조직화학 실행 날에 실온에서 상청액을 가온시킨 후, 나트륨 아자이드를 0.01 % (w/v) 의 최종 농도로 첨가하고, 상청액을 4℃ 에서 저장하였다. 한 시리즈의 상청액은 항상 동일한 기구로 염색하였다. 섹션을 멀티클론 및 서브클론의 상청액, 또는 재조합적으로 발현된 항체 (2-10 ㎍/ml; 슬라이드 당 100 ㎕) 와, 그 다음 OmniMap 또는 UltraMap Kit 의 HRP 공액 중합체와 같은 적합한 2 차 항체와 16 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 호스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 는 3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (DAB)/H2O2 반응을 촉매화하여 가시화될 수 있는 불용성 암갈색 침전물을 생성하였다. 섹션을 헤마토자일린으로 반대염색하였다. 수돗물로 슬라이드를 세정하고, 탈수시키고, 영구적 고정 매질 Entellan® Neu (VWR, Germany) 내 유리 커버슬립으로 고정시켰다. 슬라이드를 실온에서 저장하고, 파라핀 블록을 6℃ 에서 저장하였다.
면역조직화학 염색 절차의 도해:
A. 전처리
- 탈파라핀화 (온도: 8 분 동안 75℃, 그 다음 EZ Prep Buffer 8 분 동안 75℃ 에서)
- 세포 조건화 (Tris EDTA 완충액 pH 8, 시간: 48 분; 온도: 95℃)
또는
- 프로테아제 조건화 (프로테아제 1: 0.5 U/ml, 또는 프로테아제 2: 0.1 U/ml; 시간: 8 또는 12 분; 온도: 37℃)
B. 검출
- 1 차 항체 (부피: 100 ㎕; 시간: 32 분; 온도: 37℃)
- 2 차 항체 (HRP 와 공액된 OmniMap 또는 UltraMap; 부피: 100 ㎕; 시간: 16 분; 온도: 37℃)
- 검출 (ChromoMap DAB)
- 반대염색 (헤마토자일린 II; 시간: 8 분)
- 후-반대염색 (블루잉 (Bluing) 시약)
- 슬라이드 세정
세포주 어레이를 자동화 현미경 Ariol SL-50 으로 X20 (눈금 x/y: 1 픽셀 = 0.38 x 0.38 ㎛2) 로 스캐닝하였다. 0.1 mm2 의 원 영역 (입력 영역 면적) 을 각각의 조직 스폿에서 설정하였다. 양성 면역조직화학 표지의 갈색 색상은 "색상", "색조", 및 "채도" 에 대한 설정 역치값에 의해 Ariol SL-50 의 이미지 분석 소프트웨어의 도움으로 정량화되었다. 입력 영역 면적 내 양성 면적이 갈색 표지된 조직의 분획이었다. 양성 면적의 강도는 적색, 청색 및 녹색 필터로 사진을 찍은 3 개의 흑색 및 백색 이미지에서 측정된 갈색 색상의 평균 흑백값이었다. 흑백값은 0 (흑색) 에서 백색 (255) 까지의 범위이다. 발현은 양성 면적 분획*(255-강도) 에 따라 계산하였다. 데이터를 Spotfire®DecisionSite™ (버전 9.0, Spotfire Inc.) 로 나타냈다.
실시예 3.3: ELISA 프로토콜
재조합 인테그린 (1 ㎍/ml) 을 코팅 완충액 (150 mM NaCl; 1 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 ㎛ MnCl2; 50 mM Tris-Cl; pH 7.5) 으로부터의 흡수 (4℃; 16 h) 에 의해 마이크로적정 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 세정하고 (세정 완충액: PBS 중 0.5% BSA; 0.05% Tween 20), 차단하고 (1 h; 4℃; PBS 중 5% BSA), 세정 완충액으로 연속 희석된 1 차 항체와 인큐베이션시켰다 (1 h; 37℃). 세정 후, 2 차 검출 항체 (염소-항-토끼 HRP; 1:5000) 를 첨가한 후 (1 h; 37℃), 세정하고 시트레이트-포스페이트 완충액 (pH 5.0) 중 테트라메틸-벤지딘 (100 ㎍/ml) 을 사용하여 검출하고, 황산으로 현상하고, 450 nm 에서 시약 블랭크에 대해 판독하였다. 전형적으로 양성 대조군 값의 < 5 % 였던 블랭크 값을 빼서 결과를 표현하였다.
실시예 3.4: FACS 분석
로그 성장 중의 세포를 트립신 (0.5 ㎍/ml)/EDTA (0.2 ㎍/ml) 을 사용하여 수확하고, FACS 완충액 (PBS 및 0.9 mM CaCl2; 0.5 mM MgCl2; 0.5% w/v BSA) 으로 세정하고, 항-인테그린 항체 (60 분; 4℃; FACS 완충액 중 10 ㎍/ml) 와 인큐베이션하였다. 세정 후, 세포를 Alexa-488 표지된 항-토끼 IgG (Invitrogen), 또는 염소 항-마우스 IgG FITC (Becton-Dikinson) 로 염색하고 (30 분; 4℃), 세정하고 FACS 완충액 (500 ㎕/튜브) 에 재현탁하였다. 세포를 FACScan (Becton-Dickinson) 상에서 분석하고, 평균 강도 형광 (MIF) 을 음성 대조군 (PI 및 2 차 표지 항체로 염색된 세포, 1 차 항체 없이) 의 MIF 에 대해 표준화하였다.
실시예 3.5: 평가 및 통계분석
ELISA 에서의 항체 결합에 대한 IC50 을 그래픽 소프트웨어 패키지 Graphpad Prism (Ver 5.0: GraphPad Software, Inc. LaJolla Ca) 에서 비선형 곡선 피팅에 의해 삼중 데이터 지점으로부터 측정하였다. 유세포 측정을 BD Facs-스캔 프로그램 (CellQuest MacOS 8.6) 을 사용하여 분석하였다.
실시예 4: 항-αvβ3 클론 및 항-αvβ3-항체의 특징분석
실시예 4.1: E3528-2-7, E3528-2-11 및 E3528-2-12 의 특징분석
토끼 E3528 의 멀티클론 2 및 63 으로부터 수득된 24 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAX05 의 FFPE 세포주 어레이 상에 비희석된 채로 스크리닝하였다. 명확한 막 프로파일이 없는 세포질 신호를 비-인테그린 특이적인 것으로서 배제하였다. 멀티클론 2 의 서브클론은 원형질 막 염색을 나타낸다 (도 1). 특정 세포 유형에 관한 서브클론의 선택성을 마우스 단일클론 IgG, 클론 20H9 와 비교하였다. 클론 20H9 는 FFPE 에서 교차 반응하는, 그러나 저 결합 친화성을 갖는 항-β3 사슬 항체이다 (Mitjans et al., J Cell Sci 1995, 108(Pt 8) 2825-38). 양성 서브클론을 이종이식 어레이 Xeno-08-A 상에서 2 회 실행으로 시험하여 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다 (표 1).
표 1: 세포외 αvβ3 도메인에 대한 클론. 염색 강도를 - (음성) 에서 +++ (강함) 까지 등급화하였다.
3 개의 서브클론, 2-7, 2-11 및 2-12 를, 염색 강도, 공지된 αvβ3 인테그린 양성 세포와 관련된 선택성 및 원형질 막 염색의 품질에 근거하여 최종 클론으로서 선택하였다. 3 개의 항-αvβ3 클론은 구별되는 원형질 막 염색을 나타내며, 유사한 염색 특성을 나타냈다 (도 2). 이종이식 어레이 Xeno-08-Mu1 에서, M21 이종이식 만이 오로지 양성의 것이었다 (도 3). 서브클론은 αvβ3 을 발현하지 않는 것으로 알려진, A549 및 HCT116 을 비롯한 암종의 범위에서 (표 2), 그리고 부착 의존성 Raji-T-세포 림프종에서 음성이었다. 상기 데이터는 항체의 αvβ3-인테그린 에피토프와 일치하였다. 암 세포주 어레이 상 3 개의 항체로의 염색의 선택성 및 강도는 거의 일치하였다 (도 4). 3 개의 항체의 염색 선택성을 단일클론 항-β3 인테그린 항체 클론 20H9 와 비교하였다 (도 5, 클론 E3528-2-7 에 대해 제시됨). 세포 선택성을 고려하면, 3 개의 클론은 클론 20H9 와 유사한 특징을 보였으며, 3 개의 항체의 에피토프가 αvβ3 에피토프였다는 것을 나타낸다. M21 세포주 내 αvβ3 의 높은 발현은 클론 LM609 로의 FACS 분석에 의해 이전에 제시되었다 (표 2; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87(5) 716-723).
표 2: 여러 암 세포주의 FACS 분석 및 항-αvβ3 면역조직화학
실시예 4.2: E3531-227 및 E3531-229 의 특징분석
실시예 4.1 과 유사하게, 토끼 E3531 의 B-림프구의 제 2 융합 실행에 따라 서브클론 227-3 을 수득하였다. 멀티클론 227 및 229 로부터 수득된 18 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAX05 의 FFPE 세포주 어레이 상에 비희석된 채로 스크리닝하였다. 명확한 막 프로파일이 없는 세포질 신호를 비-인테그린 특이적인 것으로서 배제하였다. 두 멀티클론의 서브클론은 양호한 원형질 막 염색을 나타냈다. 특정 세포 유형에 관한 서브클론의 선택성을 마우스 단일클론 IgG, 클론 20H9 와 비교하였다. 양성 서브클론을 이종이식 어레이 Xeno-08-A 상에서 2 회 실행으로 시험하여 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다. 6 개의 서브클론, E3531-227-2, -227-3, 227-6, -229-3, 229-9 및 -229-11 을, 염색 강도, 공지된 αvβ3 인테그린 양성 세포와 관련된 선택성 및 원형질 막 염색의 품질에 근거하여 최종 클론으로서 선택하였다.
선택된 최종 클론을 배양하고 항체를 정제하였다. 6 개의 항-αvβ3 클론은 구별되는 원형질 막 염색을 보여, 유사한 염색 특성을 나타냈다 (도 6). 이종이식 어레이 Xeno-08-Mu1 에서, M21 이종이식 만이 오로지 양성인 것이었다 (도 7). U87MG 는 음성이었다. 암 세포주 어레이 CAX08 상의 3 개의 항체 E3531-227-2, E3531-227-3 및 E3531-227-6 로의 염색의 선택성은 거의 일치하였다 (도 8). 항-αvb3 항체의 염색의 선택성을 클론 E3531-227-3 에 대해 제시된, 단일클론 항-β3 인테그린 항체 클론 20H9 와 비교하였다 (도 8). 세포 선택성과 관련하여, 클론은 클론 20H9 와 유사한 특성을 보였고, 6 개의 항체의 에피토프가 αvβ3 에피토프였다는 것을 나타냈다. M21 세포주 내 αvβ3 의 고 발현은 클론 LM609 로의 FACS 분석에 의해 이전에 제시되었다 (표 3; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87(5): 716-723). 최고의 IgG 양을 생성하는 클론 E3531-227-3 및 E3531-229-3 을 서열분석하였고, 일치하는 서열을 보였다 (하기 참조).
표 3: 여러 암 세포주의 FACS 분석 및 항-β3 면역조직화학
6 개의 클론 E3531-227-2, -227-3, 227-6, -229-3, 229-9 및 -229-11 의 염색 특징은 M21 세포 내 "원형질 막 염색" 및 높은 신호와 같이, 항체의 αvβ3-인테그린 에피토프와 일치하였다. 항체는 포름알데히드-고정 파라핀-포매 조직에서 αvb3-인테그린을 검출하였다. EM22703 을 추가 현상하였다. 이것은 미손상 αiibβ3 (IC50 은 ELISA 에서와 동일하였음) 상에 대해 동일하게 반응하였고, 두 파트너와의 복합체 중 β3 사슬을 검출하였음을 나타냈다. 이것은 스크리닝된 것을 정확히 검출하는 단일클론 항체의 힘을 반영하였다. 실시에서, 교차 반응성은 그 자리에서 αvβ3 을 검출하는 심각한 단점을 입증하지 않아야만 하고: αiibβ3 은 대식세포/거핵세포 혈액 유래 계통상에서 단독으로 발현되며, αvβ3 의 조직 내 위치 특성에서 제시되는 것으로 거의 예상되지 않는다.
실시예 5: 항-αvβ5 클론 및 항-αvβ5-항체의 특징분석
토끼 E3536 의 멀티클론 13, 40 및 99 로부터 수득된 27 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAX05 의 FFPE 세포주 어레이 상에서 비희석된 채로 스크리닝하였다. 3 개의 서브클론, 99-1, 99-2 및 99-3 이 원형질 막 염색을 나타냈다 (도 9). 이들 하이브리도마 상청액은 50 pM 의 면역원 상 EC50 로, αvβ3 에 대해 αvβ5 (겉보기 Kd 로 > 100 의 인자) 에 고도로 특이적이었다 (도 10). 양성 서브클론을 이종이식 어레이 상에서 시험하여 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다 (도 9, 우측 열). 이종이식 조직과 비교하여 배양물에서 성장된 경우, 세포주는 상이한 정도의 αvβ5 발현을 보였다.
표 4: 세포외 αvβ5 도메인에 대한 클론. 염색 강도를 - (음성) 에서 +++ (강함) 까지 등급화하였다.
3 개의 서브클론, 99-1, 99-2, 및 99-3 을, 염색 강도, 공지된 αvβ5 인테그린 양성 세포와 관련된 선택성 및 원형질 막 염색의 품질에 근거하여 최종 클론으로서 선택하였다 (표 4). 3 개의 항-αvβ5 클론은 원형질 막을 표지하였다 (도 11). 이종이식 어레이 Xeno-08-Mu1 에서, 여러 개의 이종이식은 양성이었다 (특히 A431) (도 12). 3 개의 항-αvβ5 클론, E3536-99-1, -99-2, 및 -99-3 은 이미지 분석으로 측정되는 세포 선택성 및 염색 강도와 관련하여 매우 유사한 염색 특성을 나타내었다 (도 13). 높은 αvβ5_E3536-99-1 (또는 -99-2, 또는 -99-3) 신호를 보였던 세포주 (즉, HT-29, HCT116, Kyse 30, A549 및 NCI-H460) 는 클론 P1F6 으로의 FACS 에 의해 분석된 높은 αvβ5 발현을 나타냈다 (Kemperman et al., Exp Cell Res 1997, 234(1): 156-164; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87(5): 716-723). M21 세포주는 면역조직화학으로의 낮은 신호 및 FACS 분석에 의한 상응하는 낮은 신호를 나타냈다 (표 5). αv 음성이었던 Raji 골수종 세포는 면역조직화학으로의 암 세포주 어레이 상에서 신호를 보이지 않았다.
표 5: 여러 암 세포주의 FACS 분석 및 항-αvβ5 면역조직화학.
서브클론 특징분석은 αvβ5 인테그린의 분포에 대해 FACS 및 생화학적 데이터와 부합하였고, αvβ5-인테그린 에피토프와 반응하는 것으로서 서브클론 99 을 지지하였다. 클론 99 는 cDNA 서열분석에 의해 밝혀지는 바와 같이 독특한 하이브리도마 세포로부터 유래되었다 (하기 참조).
실시예 6: 항-αvβ6 클론 및 항-αvβ6-항체의 특징분석
상기 멀티클론으로부터 수득되는 33 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAX08 의 FFPE 세포주 어레이 상에서 비희석된 채로 스크리닝하였다. 명확한 막 프로파일이 없는 세포질 신호를 비-인테그린 특이적인 것으로서 배제하였다. 암 세포주 상에서 시험된 많은 서브클론 상청액은 가열 후 뿐 아니라 프로테아제 전처리 후에도 양성이었다. 멀티클론 52 (도 14), 106 및 118 의 서브클론은 양호한 원형질 막 염색을 보였다. 양성 서브클론을 이종이식 어레이 Xeno-08-Mu1 상에서 2 회 실행으로 시험하여 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다. 프로테아제 전처리는 52 및 106 의 서브클론에 대해 높은 신호를 야기하였다. 그러므로, 상기 서브클론 상청액을 오직 프로테아제 전처리된 이종이식 상에서만 시험하였다. 멀티클론 52 의 상이한 서브클론은 이들의 염색 선택성 및 특이성이 상이하였다. 클론 106-1 은 멀티클론 52 및 118 의 서브클론과는 반대로 SW707 에서 음성이었다 (표 6).
표 6: 세포외 αvβ6 도메인에 대한 서브클론 상청액. 염색 강도를 - (음성) 에서 +++ (강함) 까지 뿐 아니라 0 (음성) 에서 3 (강함) 으로 등급화하였다.
이종이식 조직에서, 비 소세포 폐암 세포주 (NSCLC) H1975 는 최고의 염색 강도를 보였다 (도 14H). 암 세포주 에러이 상에서, 2 개의 평편 세포 암종 Kyse30 (도 14I) 및 A431 (도 14A), 그리고 이종이식 어레이 상에서 A431 이종이식 (도 14B) 는 높은 신호를 보였다. 암 세포주 어레이 상에서 높은 염색 강도를 갖는 세포주는 HT29 (도 14G), MDA-MB468, Colo205 및 A431 이었다. 이것은 상기 세포주의 높은 β6 인테그린 mRNA 에 상응하였다. 멀티클론 52, 106 및 118 의 서브클론 상청액의 선택성 및 특이성은 항체에 의해 인지되는 αvβ6 에피토프와 일치하였다. 9 개의 서브클론, 52-1, 52-2, 52-3, 52-4, 52-6, 52-8, 52-9, 106-1 및 118-1 은 염색 강도, 공지된 αvβ6 인테그린 양성 세포와 관련된 선택성 및 원형질 막 염색의 품질에 근거하여 최종 클론으로서 선택하였다 (표 6). 일치하는 염색이 있는 서브클론 중에서, 최고 IgG 농도를 갖는 것을 최종 클론으로서 선택하였다.
최고 IgG 농도를 갖는 클론인 클론 E3866-52-1 을 배양하고, 항체를 표준 프로토콜에 따라 정제하였다. 항체의 활성은 암 세포주 어레이 상의 IHC 에 의해 제시되었다 (도 15). 재조합 항체로, 암 세포주 어레이 및 이종이식의 여러 개의 슬라이드를 염색하였다 (도 16). HT29 결장암의 이종이식, H1975 폐 암종 및 환자 전립선 종양 외식편 PRXF MRIH (Oncotest GmbH, Freiburg) 에서, 항-αvβ6 재조합 항체는 두드러진 신호를 보인 반면, β6 mRNA 발현이 없는 M21 흑색종 이종이식은 음성이었다 (도 16). 항-αvβ6 재조합 항체는 원형질 막의 명확한 염색을 보였다 (도 17). 암 세포주 어레이 상의 신호를 이미지 분석의 도움으로 정량화하였다 (도 18). HT29, Colo205 또는 MDA-MB468 과 같은 높은 항체 염색 신호를 갖는 세포주는, 높은 mRNA 수준의 β6 인테그린 mRNA 를 갖는 세포주와 상응하였다. 재조합 항-αvβ6 항체는 자동화 염색 절차를 사용하여 높은 슬라이드-대-슬라이드 (r=0.996) 및 실행-대-실행 재현성을 보였다 (r=0.991, 도 19).
αvβ6-인테그린 펩티드에 대해 생성된 토끼 IgG 재조합 항체 αvβ6 (EM05201) 는 FFPE 조직에 대해 적합하였다. "원형질 막 염색" 및 높은 β6 인테그린 mRNA 를 발현하는 세포주에서의 높은 신호와 같은, 재조합 항체 αvβ6 (EM05201) 의 ELISA 특이성 및 염색 특징분석은 항체의 αvβ6-인테그린 에피토프와 일치하였다.
실시예 7: 항-αvβ8 클론 및 항-αvβ8-항체의 특징분석
상기 멀티클론으로부터 수득된 36 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAX08 의 FFPE 세포주 어레이 상에서 비희석된 채로 스크리닝하였다. 모든 36 개의 서브클론은 막 신호를 나타냈고, 이들 중 아무것도 비-인테그린 특이적 세포막 염색으로 인해 배제되지 않았다. 암 세포주 상에 시험된 많은 서브클론 상청액은 가열 후 뿐 아니라 프로테아제 전처리 후에도 양성이었다. 각각의 멀티클론에 대해, 최고 IgG 농도를 갖는 4 개의 서브클론을 이종이식 어레이 Xeno-08-Mu1 상에서 추가 시험을 위해 선택하여, 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다 (도 20). 프로테아제 전처리는 서브클론에 대해 높은 신호를 야기하였다. 멀티클론 6 의 서브클론은 이종이식 상에서 음성이었다. Ovcar-3, M24met, MDA-MB 468 및 A431 과 같은 암 세포주 어레이 상에서 높은 염색 강도를 갖는 세포주는, β8 인테그린의 최고 mRNA 발현을 보였다 (표 7). 서브클론 40-4, 40-10, 40-11, 133-5, 133-8 및 133-9 가 공지된 β8 mRNA 발현과 관련된 선택성 및 원형질 막 염색의 품질에 근거하여 최종 클론으로서 선택되었다. 일치하는 염색이 있는 서브클론 중에서, 최고 IgG 농도를 갖는 것을 최종 클론으로서 선택하였다.
표 7: 세포외 αvβ8 도메인에 대한 서브클론 상청액. 염색 강도를 - (음성) 에서 +++ (강함) 까지 뿐 아니라 0 (음성) 에서 4 (강함) 로 등급화하였다.
최고 IgG 농도를 갖는 클론인 클론 E3875-133-9 를 배양하고, 항체를 표준 프로토콜에 따라 정제하였다. 항체의 활성은 암 세포주 어레이 상의 IHC 에 의해 제시되었다 (도 21).
재조합 항체로, 암 세포주 어레이, 이종이식 및 정상 인간 조직 중 어레이의 여러 개의 슬라이드를 염색하였다. 모두 β8 mRNA 를 발현하는 암 세포주 Ovcar-3 (난소 암종), M24-met (흑색종) 및 MDA-MB468 (유방 암종) 은 양성이었던 반면, β8 mRNA 가 없는 MCF-7 세포 (유방 암종) 는 음성이었다 (도 22). 상기 세포주로부터, 이종이식은 이용가능하지 않았다. H1975 폐 암종 이종이식에서, 및 더욱 강하게는 전립선 종양 외식편 PRXF MRIH (Oncotest GmbH, Freiburg) 이종이식에서 항-αvβ8 재조합 항체는 일부 신호를 보였다 (도 22). 가장 강한 신호는 인간 말초 신경에서 관찰되었다 (도 23). 항-αvβ8 재조합 항체는 원형질 막의 명확한 염색을 보였다 (도 24). 암 세포주 어레이 상의 신호를 이미지 분석의 도움으로 정량화하였다 (도 25). Ovcar-3, M24-met, 및 MDA-MB468 과 같은 높은 항체 염색 신호를 갖는 세포주는, 높은 mRNA 수준의 β8 인테그린 mRNA 를 갖는 세포주와 상응하였다. 재조합 항-αvβ8 항체는 높은 슬라이드-대-슬라이드 (r=0.982) 및 실행-대-실행 재현성을 보였다 (r=0.966, 도 26).
αvβ8-인테그린 펩티드에 대항하여 발생된 토끼 IgG 재조합 항체 αvβ8 (EM13309) 는 FFPE 조직에 적합하였다. "원형질 막 염색", 높은 β8 인테그린 mRNA 를 발현하는 세포주에서 높은 신호, 및 미엘린화된 말초 신경의 강한 표지화와 같은 재조합 항체 αvβ8 (EM13309) 의 ELISA 특이성 및 염색 특성은 항체의 αvβ8-인테그린 에피토프와 일치하였다.
실시예 8: 항-αv 클론 및 항-αv-항체의 특징분석
αvβ6 뿐 아니라 αvβ8 에 결합하는 미리 선택된 멀티클론은 멀티클론 E3866-68 및 E3675-13 이었다. 상기 멀티클론으로부터 수득된 24 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAXO8 의 FFPE 세포주 어레이 상에서 비희석된 채로 스크리닝하였다. 모든 24 개의 서브클론은 높은 원형질 막 신호를 보였으나, 또한 일부 세포질 신호를 보였다 (도 27). 멀티클론 E3675-13 중 5 개 및 멀티클론 E3866-68 중 4 개의 9 개의 서브클론을, 이종이식 조직 상의 시험을 위해 선택하여 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다. 매우 높은 신호 때문에, 클론 13-3, 13-9 및 68-7 의 상청액을 1:5 및 1:10 으로 희석하였다. 희석된 상청액 13-3- 및 13-9 는 암 세포주 어레이 상의, Raji 림프종 세포 및 Sf9 곤충 세포를 제외한 모든 세포를 염색하였다. 이종이식은 높은 원형질 막 신호를 보이고, 또한 일부 세포질 염색을 보였다 (도 27). 1:5 희석 후, 서브클론 68-7 은 서브클론 13-3 으로 양성이었던 세포주인 MiaPaca2 를 염색하지 않았다. 멀티클론 E3688-68 의 서브클론의 에피토프는 E3875-13 과 상이할 것이다. 서브클론 E3875-13-3 및 -13-9 를 이들의 최고 IgG 농도에 근거하여 최종 클론으로서 선택하였다 (표 8).
표 8: 세포외 αv 도메인에 대한 서브클론 상청액. 염색 강도를 - (음성) 에서 +++ (강함) 까지 뿐 아니라 0 (음성) 에서 3 (강함) 으로 등급화하였다.
최고 IgG 농도를 갖는 클론인 클론 E3875-13-9 을 배양하고, 항체를 표준 프로토콜에 따라 정제하였다 (Protein G Sepharose, HiLoad Superdex 200 pg). 항체의 활성은 암 세포주 어레이 상의 IHC 에 의해 제시되었다 (도 28).
재조합 항체로, 암 세포주 어레이 및 이종이식 어레이의 여러 개의 슬라이드를 염색하였다 (도 29). 암 세포주에서 뿐 아니라 이종이식에서 항-αv 재조합 항체는 유의한 신호를 보였다. 음성은 αv-인테그린 mRNA 를 발현하지 않는 림프종 세포주, 예컨대 Raji 및 Pfeiffer 림프종이었다. 항-αv 재조합 항체는 원형질 막의 명확한 염색을 보였다 (도 30). 암 세포주 어레이 상의 신호를 이미지 분석의 도움으로 정량화하였다 (도 31). 재조합 항-αv 항체는 슬라이드-대-슬라이드 (r=0.947) 및 실행-대-실행 재현성을 보였다 (r=0.924, 도 32).
αvβ8-인테그린 펩티드에 대항하여 생성된 토끼 IgG 재조합 항체 αv (EM01309) 는 FFPE 조직에 대해 적합하였다. "원형질 막 염색", αv-인테그린 mRNA 를 발현하는 세포주에서의 높은 신호, 및 αv-인테그린을 발현하지 않는 림프종 세포주에서의 신호 없음과 같은 재조합 항체 αv (EM01309) 의 ELISA 특이성 및 염색 특징화는 항체의 αv-사슬 에피토프와 일치하였다.
실시예 9: 항-β3 세포질 도메인 인테그린 클론 및 항-β3-세포질 도메인 인테그린 항체의 특징분석
상기 멀티클론 2 및 67 로부터 수득된 24 개의 서브클론으로부터의 상청액을 암 세포주 CAX05 의 FFPE 세포주 어레이 상에서 비희석된 채로 스크리닝하였다. 명확한 막 프로파일이 없는 세포질 신호는 비-인테그린 특이적인 것으로 배제하였다. 멀티클론 2 의 서브클론은 양호한 원형질 막 염색을 나타내었다. 특정 세포 유형과 관련된 서브클론의 선택성을 마우스 단일클론 IgG, 클론 20H9 와 비교하였다. 양성 서브클론을 이종이식 어레이 Xeno-08-A 상의 제 2 실행에서 시험하여 종양 조직 상의 교차-반응성을 확인하였다. 3 개의 서브클론, 2-4, 2-10 및 2-12 를 염색 강도, 공지된 αvβ3 인테그린 양성 세포와 관련된 선택성, 및 원형질 막 염색의 품질에 근거하여 최종 클론으로서 선택하였다 (표 9).
표 9: 세포내 β3 도메인에 대한 서브클론. 염색 강도를 - (음성) 에서 +++ (강함) 까지 뿐 아니라 1 (저), 2 (중), 3 (고) 으로 등급화하였다.
선택된 최종 클론을 배양하고 항체를 정제하였다. 3 개의 항-β3 클론, E3592-2-4, -2-10, 및 -2-12 는 구별되는 원형질 막 염색을 보여, 유사한 염색 특징화를 나타내었다 (도 33). 이종이식 어레이 Xeno-08-Mu1 에서, M21 이종이식은 양성이었다 (도 34). U87MG 는 음성이었다. 암 세포주 어레이 CAX08 상의 3 개의 항체로의 염색의 선택성은 거의 일치하였다 (도 35). 염색 강도는 다양했고, 클론 E3592-2-12 에 대해 가장 강했다. 3 개의 항체의 염색 선택성을 클론 E3592-2-12 에 대해 제시된, 단일클론 항-β3 엑소-도메인 인테그린 항체 클론 20H9 와 비교하였다 (도 36). 세포 선택성과 관련하여, 3 개의 클론은 클론 20H9 와 유사한 특성을 나타냈으며, 3 개의 항체의 에피토프가 β3 에피토프였음을 나타내었다. M21 세포주 내 αvβ3 의 높은 발현은 클론 LM609 로의 FACS 분석에 의해 이전에 제시되었다 (표 10; Mitjans et al., Int J Cancer 2000, 87(5): 716-723).
표 10: 여러 암 세포주의 FACS 분석 및 항-β3 면역조직화학.
"원형질 막 염색" 및 M21 내 높은 신호와 같은, 3 개의 클론 E3592-2-4, -2-10, 및 -2-12 의 염색 특징화는 항체의 β3-인테그린 에피토프와 일치하였다. β3-인테그린 펩티드에 대항하여 생성된 토끼 하이브리도마 클론 E3592-2-4 2-10, 및 -2-12 는 FFPE 조직에 적합한 항체를 생성하였다. 이들의 에피토프 인지는 이들의 결합 β3 세포질 도메인 에피토프와 일치하였다. 가장 강하게 염색되는 항체를 생성하는 클론으로부터의 항체 사슬, E3592-2-12 를 cDNA 클로닝하고, 항체 코딩 영역을 다중 서열분석하였다 (하기 참조).
실시예 10: 서열 및 서열 목록
여러 개의 클론을 cDNA 서열분석에 의해 평가하였다 (표 11). 컴퓨터 판독가능 형태로 기록된 정보는 서면 서열 목록과 일치한다.
표 11: 서열분석된 클론.
클론으로부터 각각의 중쇄 및 경쇄 상의 3 회의 일차 서열분석 실행은 Lasergene 소프트웨어 (DNAstar Inc.) 를 사용하여 콘티그 (contig) 로 모으고, ClustalW 다중 배열 도구를 사용하여 분석하였다. 클론 E3531-227-3 및 -229-3 은 일치하는 중쇄 및 경쇄 서열을 가졌고, 항체 집단의 단일클론성을 확인하였다. 클론 E3536-99-1, -99-2 및 -99-3 은 일치하는 중쇄 및 경쇄 서열을 가졌고, 항체 집단의 단일클론성을 확인하였다.
실시예 11: 재조합 RabMabs 는 ELISA 에 의해 이들의 리간드에 특이적이다.
플레이트 상 1 ㎍/ml 코팅된 인테그린으로의 표준 ELISA 조건에서, 항체는 4 logs 의 농도보다 양호한 것으로 정의된 바와 같이 이들의 면역원에 대해 본질적으로 1-특이적이었고, gpiibiiia 및 αvβ3 모두와의 교차-반응성 (IC50 ~ 100 배 저하) 을 보였던 EM09902 를 제외하고는 가장 가깝게 관련된 인테그린 사슬과 유의하게 교차 반응하지 않았으므로 (도 10, 37, 38), 분명하게 복합체의 β5 및 β3 사슬 모두 상의 관련된 에피토프를 인지한다. αvβ5 의 발현이 αvβ3 보다 더욱 보편적이고, EM09902 로부터의 신호가 IHC 에서 극히 강하므로, 이것이 FFPE 사용에 심각하게 영향을 주지 않아야만 한다. 다른 재조합 항체의 특이성은 하이브리도마 상청액 및 이들로부터 유래된 항체로부터 ELISA 및 IHC 염색에서 구별가능하지 않았다 (도 10, 37, 38). 게다가, cDNA 서열분석에서, 항-αvβ3 항체 중 2 개, EM22703 및 EM22903 은 단일 클론으로부터 유래된 것으로 밝혀졌다. ELISA 내 특이성 및 ELISA 중 IC50 으로 표현되는 명백한 결합 친화성이 표 12 에 제시되었다.
표 12: 단리된 인테그린에 대한 ELISA 중 재조합 RabMab IC50.
실시예 12: 재조합 RabMab 는 리간드의 이들의 수용체에 대한 결합에 영향을 주지 않는다.
항체 및 소 분자 모두는 인테그린 활성을 억제 또는 향상시킬 수 있으나, 본원에서 선택된 RabMab 는 리간드 결합에 대해 영향을 주지 않았다 (도 39). αvb3 및 αvb5 의 저해제는 예상되는 바와 같이, 양성 (실렌기티드) 및 음성 (c(RβA-DfV)) 으로 반응하였다.
실시예 13: 생 세포 유세포 측정 시 재조합 RabMab ("FACS")
FACS 에서 고유의 인테그린은 제 자리에서 고유의 글리코실화 패턴으로 존재하고, 그러므로 이것은 특이성 "골드 표준" 을 나타낸다. RabMab 를 표준 잘 특징화된 쥣과 단일클론 항체와 비교하여 FACS 에서 평가하였다. αvβ8 의 경우 시판되는 항체가 없다. 항체는 FACS 에서 세포 유형 의존적 방식으로 반응하였고, FACS 프로파일은 항체의 ELISA 프로파일과 가깝게 부합하였다. 결과는 제 2 층 대조군 항체에 표준화된 평균 형광 강도로서 요약되었다 (표 13). RabMab 와 마우스 Mab 사이의 발현의 절대적 수준 차이는 제 2 층 항체의 친화성의 다양화로 인한 것 같았다.
표 13: Alexa-488 표지된 제 2 층 항체 대 토끼 Ig 또는 FITC 표지된 항-마우스를 사용하는 생 세포 유세포 측정에서의 RabMab 및 비교자 항체 활성. rMIF 는 제 2 층 단독과 비교한, 피크 평균 형광 강도이다.
쥣과 항체는 HUVEC 세포가 높은 수준의 αv, αvβ3 및 αvβ5 를 발현하도록 하고 αvβ6 또는 αvβ8 을 발현하지 않는 것을 나타냈다. 상기 세포에서, RabMab EM01309 는 강하게, 그리고 쥣과 항-αv 경쟁자인 17E6 에 필적할만한 수준으로 반응하였다. 쥣과 항체는 HT-29 CRC 세포 상에서 높은 수준의 αv, αvβ3 은 없음, 높은 수준의 αvβ5 및 일부 αvβ6 을 나타냈다. RabMab 는 이를 확인시켜주었고, 또한 높은 발현의 αvβ8 인테그린을 나타냈다. RabMab EM01309 는 약하게 반응했다. 쥣과 항체는 A549 NSCLC 세포 상에서 높은 수준의 αv, αvβ3 은 없음, 높은 수준의 αvβ5 및 αvβ6 은 없음을 나타냈다. RabMab 결합은 이를 확인시켜주었고, 또한 αvβ8 인테그린의 발현은 보이지 않았다. RabMab EM01309 는 반응하지 않았다. 쥣과 항체는 M24 Met 흑색종 세포 상에서 높은 수준의 αv, αvβ3 및 αvβ5 및 αvβ6 은 없음, 및 강한 발현의 β1 을 나타냈다. RabMab 는 이를 확인시켜주었고, 또한 EM13309 의 강한 결합을 나타냈고, αvβ8 인테그린의 발현을 밝혔다. RabMab EM01309 는 반응하지 않았다. 쥣과 항체는 M21 흑색종 세포 상에서 높은 수준의 αv, αvβ3 및 αvβ5, αvβ6 은 없음, 및 강한 발현의 β1 을 나타냈다. RabMab 는 이를 확인시켜주었고, 또한 αvβ8 발현을 나타내는 높은 수준의 EM13309 결합을 나타냈다. RabMab EM01309 는 반응하지 않았다. 쥣과 항체는 M21-L 흑색종 세포 상에서 αv, αvβ3, αvβ5 또는 αvβ6 이 없음, 및 강한 발현의 β1 을 나타냈다. RabMab 중 어느 것도 상기 백그라운드에 특이적으로 결합하지 않았다. 쥣과 항체는 M21-gpiib 흑색종 세포 상에서 αv, αvβ3, αvβ5 또는 αvβ6 이 없음, 그러나 강한 발현의 β1 및 β3 을 나타냈다. RabMab EM05201, EM13309 및 EM01309 는 반응하지 않았다. 그러나, EM22703 및 EM09902 모두는 반응하였고, EM22703 이 강하게 반응하였다. 이것은 EM22703 이 αiibβ3 과 교차 반응할 것이고, EM09902 가 αvβ3 및 αiibβ3 모두와 약하게 교차 반응할 것이라는 ELISA 데이터 (참조, 실시예 11) 를 지지한다.
생 세포 유세포 측정은 명백하였다. 항체는 αv-결핍 M21-L 세포주가 있는 상기 백그라운드와 반응하지 않았다. 표준화된 MIF 가 EM22703 및 EM09902 접근법 100 으로, 및 EM05201 및 EM 13309 로 획득되므로, 이것은 항체의 기본적인 정규적으로 획득가능한 신호-대-노이즈를 나타내며, 이는 표준 LM609 및 P1F6 시약으로 획득된 것을 상당히 초과하였다. 이것이 1 차 RabMab 그 자체의 특성보다는 보다 높은 친화성 제 2 층 플루오레세인화 시약의 결과라는 것이 아직 명백하지는 않지만, 이유가 무엇이든지 RabMab 는 FACS 에 대해 우수한 시약이었다.
EM22703 은 LM609 에 대해 FACS 에서 동시에 염색되어, 이것이 αvβ3 복합체를 인지하고 있다는 것을 확인시켜 줄 뿐 아니라, 또한 M21-gpiib 와 강하게 반응하여, 이것이 EM22703 에 의해 인지되었던 인테그린 복합체 내 β3 사슬이었음을 나타낸다.
EM09902 염색은 일반적으로 P1F6 염색과 동시적이지만, β3 뿐 아니라 β5 사슬과도 약하게 반응하였다. EM09902 의 지지된 표적인 αvβ5 를 발현하지 않는 M21-gpiib 세포의 FACS 에서 가시적이었다. 항체를 적정함으로써, 시약의 최적 농도는, ELISA 데이터로부터 예상되는 바와 같은 잠재적인 αvβ5 신호를 유지하면서 (FACS 의 경우 이것은 0.3-1 ㎍/ml 이었음), αvβ3 교차 반응성을 최소화하기 위해 선택될 수 있을 것이다.
b3 세포질 도메인에 대항하는 EM00212 는 FACS 및 ELISA 에서 음성이었다.
이것이 종, 이소형 및 표적 대조군이므로, 이것은 특이성의 우수한 지시자이고, 100:1 의 우수한 신호 대 노이즈 비가 FACS 에서 달성된다는 것을 암시한다.
EM05201 은 αvβ6 에 대해 크게 특이적이었고, 상기 단백질이 발현되는 것으로 알려진 오직 HT29 세포에서만 상기 단백질을 밝혀냈다.
EM13309 는 αvβ8 인테그린의 생 세포 FACS 의 이용가능한 첫번째 시약이고, αvβ8 이 HT29 암종, 및 M21 및 M24 met 흑색종 상에서 αvβ6 보다 더욱 널리 발현된다는 놀라운 정보를 제공하였다. αvβ8 이 성상세포 신경 계통에서 보고되어 있으므로 신경외배엽 계통의 염색은 아마도 놀랍지 않을 것이지만, 암종의 염색은 예상외였고, 생물학에 반영될 수 있을 것이다: αvβ8 의 최근의 분석은 상기 부위에서 장 APC 통제된 염증 반응에서 이의 발현을 나타냈다. 상상컨대, CRC 주 HT29 는 또한 이러한 매커니즘을 반영하였다.
αv 세포외 도메인에 대항하는 EM01309 는 HUVEC 를 제외하고는 균일하게 음성이었다.
요약하면, RabMab 항체는 생 세포 유세포 측정에서 기능하는 것으로 제시되었다. 이것은 종양 입증 및 특징분석을 위한 생화학과 조직 IHC 사이의 가치있는 다리를 제공한다. 특히 αvβ6 및 αvβ8 시약은 인테그린 연구의 중요한 연구 소스이고, 이러한 항체를 RabMab 에서 상기 반응성 프로파일로 제조하는 능력이 그 길을 열어, 마침내 기록 조직 내 인테그린 발현 패턴의 엄격한 분석을 가능하게 한다.
실시예 14: 적정 실험
적합한 염색 농도를 조사하기 위해 FACS 내 적정 실험을 수행하였다 (도 40-43). 곡선 형태는 포화를 나타내지 않았으나, 1 mg/ml 초과시 평평해지기 시작하였다. 토끼 단일클론 항체는 FACS 에서 강한 결합자이다. 특히 EM09902 가 고 친화성을 가졌고, 0.1 ㎍/ml 항체 농도에서 강한 결합이 관찰되었으므로, 이것은 < 1 ug/ml 염색 농도로 성공적으로 사용될 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING
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material
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130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val
145 150 155 160
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser
180 185 190
Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val
195 200 205
Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr
210 215 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
275 280 285
Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu
290 295 300
Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro
305 310 315 320
Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
325 330 335
His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg
355 360 365
Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala
385 390 395 400
Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg
420 425 430
Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 21
agatgtgcgc ttgtgatg 18
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 22
acattggtag cgac 14
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 23
gcaggctata aaagttatag tgatgatggt catgg 35
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 24
cccctccgta atgtctggat atcc 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 25
tgcatttata ctggtaggga ttgg 24
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 26
gcgagaattg tttatggtgg tgctggttat agattg 36
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 27
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
<210> 28
<211> 70
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 28
acccagactc caccctccgt ggaggcagct gtgggaggca cagtcaccat caattgccag 60
gccagtcagg 70
<210> 29
<211> 168
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 29
ttagcctggt atcagcagaa accagggcag cctcccaagc tcctgatcta ttctgcatcc 60
agtctggcat ctggggtccc atcgcgattc aaagccagtg gatctgggac acagttcact 120
ctcaccatca gcgacgtgca gtgtgacgat gctgccactt actcctgt 168
<210> 30
<211> 2157
<212> DNA
<213> human
<400> 30
atgccgcggg ccccggcgcc gctgtacgcc tgcctcctgg ggctctgcgc gctcctgccc 60
cggctcgcag gtctcaacat atgcactagt ggaagtgcca cctcatgtga agaatgtctg 120
ctaatccacc caaaatgtgc ctggtgctcc aaagaggact tcggaagccc acggtccatc 180
acctctcggt gtgatctgag ggcaaacctt gtcaaaaatg gctgtggagg tgagatagag 240
agcccagcca gcagcttcca tgtcctgagg agcctgcccc tcagcagcaa gggttcgggc 300
tctgcaggct gggacgtcat tcagatgaca ccacaggaga ttgccgtgaa cctccggccc 360
ggtgacaaga ccaccttcca gctacaggtt cgccaggtgg aggactatcc tgtggacctg 420
tactacctga tggacctctc cctgtccatg aaggatgact tggacaatat ccggagcctg 480
ggcaccaaac tcgcggagga gatgaggaag ctcaccagca acttccggtt gggatttggg 540
tcttttgttg ataaggacat ctctcctttc tcctacacgg caccgaggta ccagaccaat 600
ccgtgcattg gttacaagtt gtttccaaat tgcgtcccct cctttgggtt ccgccatctg 660
ctgcctctca cagacagagt ggacagcttc aatgaggaag ttcggaaaca gagggtgtcc 720
cggaaccgag atgcccctga ggggggcttt gatgcagtac tccaggcagc cgtctgcaag 780
gagaagattg gctggcgaaa ggatgcactg catttgctgg tgttcacaac agatgatgtg 840
ccccacatcg cattggatgg aaaattggga ggcctggtgc agccacacga tggccagtgc 900
cacctgaacg aggccaacga gtacacagca tccaaccaga tggactatcc atcccttgcc 960
ttgcttggag agaaattggc agagaacaac atcaacctca tctttgcagt gacaaaaaac 1020
cattatatgc tgtacaagaa ttttacagcc ctgatacctg gaacaacggt ggagatttta 1080
gatggagact ccaaaaatat tattcaactg attattaatg catacaatag tatccggtct 1140
aaagtggagt tgtcagtctg ggatcagcct gaggatctta atctcttctt tactgctacc 1200
tgccaagatg gggtatccta tcctggtcag aggaagtgtg agggtctgaa gattggggac 1260
acggcatctt ttgaagtatc attggaggcc cgaagctgtc ccagcagaca cacggagcat 1320
gtgtttgccc tgcggccggt gggattccgg gacagcctgg aggtgggggt cacctacaac 1380
tgcacgtgcg gctgcagcgt ggggctggaa cccaacagcg ccaggtgcaa cgggagcggg 1440
acctatgtct gcggcctgtg tgagtgcagc cccggctacc tgggcaccag gtgcgagtgc 1500
caggatgggg agaaccagag cgtgtaccag aacctgtgcc gggaggcaga gggcaagcca 1560
ctgtgcagcg ggcgtgggga ctgcagctgc aaccagtgct cctgcttcga gagcgagttt 1620
ggcaagatct atgggccttt ctgtgagtgc gacaacttct cctgtgccag gaacaaggga 1680
gtcctctgct caggccatgg cgagtgtcac tgcggggaat gcaagtgcca tgcaggttac 1740
atcggggaca actgtaactg ctcgacagac atcagcacat gccggggcag agatggccag 1800
atctgcagcg agcgtgggca ctgtctctgt gggcagtgcc aatgcacgga gccgggggcc 1860
tttggggaga tgtgtgagaa gtgccccacc tgcccggatg catgcagcac caagagagat 1920
tgcgtcgagt gcctgctgct ccactctggg aaacctgaca accagacctg ccacagccta 1980
tgcagggatg aggtgatcac atgggtggac accatcgtga aagatgacca ggaggctgtg 2040
ctatgtttct acaaaaccgc caaggactgc gtcatgatgt tcacctatgt ggagctcccc 2100
agtgggaagt ccaacctgac cgtcctcagg gagccagagt gtggaaacac ccccaac 2157
<210> 31
<211> 138
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 31
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
gagcagctgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120
tgcacagtct ctggattc 138
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 32
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtggatcg ga 42
<210> 33
<211> 114
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 33
ccctactacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccattt ccaagtcctc gtcgaccacg 60
gtgactctcc aaatgaccag tctgacagcc acggacacgg ccacatattt ctgt 114
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 34
tggggcccag gcaccctggt caccgtttcc tca 33
<210> 35
<211> 365
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 35
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgcgc ttgtgatgac ccagactcca ccctccgtgg aggcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtcaggac attggtagcg acttagcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattctgcat ccagtctggc atctggggtc 240
ccatcgcgat tcaaagccag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg 300
cagtgtgacg atgctgccac ttactcctgt gcaggctata aaagttatag tgatgatggt 360
catgg 365
<210> 36
<211> 411
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 36
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
gagcagctgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120
tgcacagtct ctggattccc cctccgtaat gtctggatat cctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtggat cggatgcatt tatactggta gggattggcc ctactacgcg 240
agctgggcga aaggccgatt caccatttcc aagtcctcgt cgaccacggt gactctccaa 300
atgaccagtc tgacagccac ggacacggcc acatatttct gtgcgagaat tgtttatggt 360
ggtgctggtt atagattgtg gggcccaggc accctggtca ccgtttcctc a 411
<210> 37
<211> 346
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 37
tttcggcgga gggaccgagg tggtggtcaa gggtgatcca gttgcaccta ctgtcctcat 60
cttcccacca gctgctgatc aggtggcaac tggaacagtc accatcgtgt gtgtggcgaa 120
taaatacttt cccgatgtca ccgtcacctg ggaggtggat ggcaccaccc aaacaactgg 180
catcgagaac agtaaaacac cgcagaattc tgcagattgt acctacaacc tcagcagcac 240
tctgacactg accagcacac agtacaacag ccacaaagag tacacctgca aggtgaccca 300
gggcacgacc tcagtcgtcc agagcttcaa taggggtgac tgttag 346
<210> 38
<211> 972
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 38
gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60
tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa gggtacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180
ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240
aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300
agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360
ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420
gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480
cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540
accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600
aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660
gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720
ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780
gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840
ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900
tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960
ccgggtaaat ga 972
<210> 39
<211> 711
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 39
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgcgc ttgtgatgac ccagactcca ccctccgtgg aggcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtcaggac attggtagcg acttagcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattctgcat ccagtctggc atctggggtc 240
ccatcgcgat tcaaagccag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacgtg 300
cagtgtgacg atgctgccac ttactcctgt gcaggctata aaagttatag tgatgatggt 360
catggtttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaagggtg atccagttgc acctactgtc 420
ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480
gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540
actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 600
agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660
acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaataggg gtgactgtta g 711
<210> 40
<211> 1383
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 40
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
gagcagctgg aggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120
tgcacagtct ctggattccc cctccgtaat gtctggatat cctgggtccg ccaggctcca 180
gggaaggggc tggagtggat cggatgcatt tatactggta gggattggcc ctactacgcg 240
agctgggcga aaggccgatt caccatttcc aagtcctcgt cgaccacggt gactctccaa 300
atgaccagtc tgacagccac ggacacggcc acatatttct gtgcgagaat tgtttatggt 360
ggtgctggtt atagattgtg gggcccaggc accctggtca ccgtttcctc agggcaacct 420
aaggctccat cagtcttccc actggccccc tgctgcgggg acacacccag ctccacggtg 480
accctgggct gcctggtcaa agggtacctc ccggagccag tgaccgtgac ctggaactcg 540
ggcaccctca ccaatggggt acgcaccttc ccgtccgtcc ggcagtcctc aggcctctac 600
tcgctgagca gcgtggtgag cgtgacctca agcagccagc ccgtcacctg caacgtggcc 660
cacccagcca ccaacaccaa agtggacaag accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc 720
acgtgcccac cccctgaact cctgggggga ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc 780
aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840
caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc 900
cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc 960
atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca 1020
ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag 1080
gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc 1140
atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca 1200
gaggacaact acaagaccac gccggccgtg ctggacagcg acggctccta cttcctctac 1260
agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg 1320
atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg cagaagtcca tctcccgctc tccgggtaaa 1380
tga 1383
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 41
Arg Phe Ala Gln Ile Val Met
1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 42
Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr
1 5
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 43
Gln Ala Tyr Ser Asp Ser Tyr Ser Tyr Asp Asn Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 44
Asp Phe Ser Ser Asp Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 45
Tyr Ile Asn Val Gly Asp Gly Lys
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 46
Gly Lys Asp Leu Gly Leu
1 5
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 47
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala
20
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 48
Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr
1 5 10 15
Ile Lys Cys Gln Ala Ser
20
<210> 49
<211> 58
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 49
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
35 40 45
Ala Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Gln Ser
50 55
<210> 50
<211> 292
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Fusion protein of GST and ß3
<400> 50
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Arg
210 215 220
Ser Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Gly Gly Gly Gly Ser Glu
225 230 235 240
Asn Leu Tyr Phe Gln Lys Leu Leu Ile Thr Ile His Asp Arg Lys Glu
245 250 255
Phe Ala Lys Phe Glu Glu Glu Arg Ala Arg Ala Lys Trp Asp Thr Ala
260 265 270
Asn Asn Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Thr Ser Thr Phe Thr Asn Ile Thr
275 280 285
Tyr Arg Gly Thr
290
<210> 51
<211> 45
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 51
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Gly Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe
35 40 45
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 52
Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Gln Trp Ile Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 38
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 53
Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr
1 5 10 15
Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Ala Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 54
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 125
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 55
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Ala Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Gln
100 105 110
Ser Gln Ala Tyr Ser Asp Ser Tyr Ser Tyr Asp Asn Ser
115 120 125
<210> 56
<211> 131
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 56
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Gly Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Ile Ala Tyr Ile Asn Val Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Ala Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Phe Cys Gly Lys Asp Leu Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 57
<211> 114
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 57
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Val Val Glu Gly Asp Pro Val Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
20 25 30
Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val
35 40 45
Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser
50 55 60
Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr
65 70 75 80
Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys
85 90 95
Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly
100 105 110
Asp Cys
<210> 58
<211> 323
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 58
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
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<211> 239
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 59
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Phe Ala Gln Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Gln
100 105 110
Ser Gln Ala Tyr Ser Asp Ser Tyr Ser Tyr Asp Asn Ser Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Leu Val Val Glu Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 60
<211> 454
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 60
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Gly Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser
35 40 45
Ser Asp Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Ile Ala Tyr Ile Asn Val Gly Asp Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr
85 90 95
Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Ala Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Phe Cys Gly Lys Asp Leu Gly Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
165 170 175
Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro
195 200 205
Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn
275 280 285
Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro
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Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu
340 345 350
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
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Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
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Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 61
agatttgccc aaattgtgat g 21
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 62
agcatttaca gcta 14
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<211> 41
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 63
caaagccagg cttatagtga tagttatagt tatgataata g 41
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 64
gacttcagta gcgactactg gatgtcc 27
<210> 65
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 65
tacattaatg ttggtgatgg taaa 24
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 66
ggcaaagatt taggcttg 18
<210> 67
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 67
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60
<210> 68
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 68
acccagactc cagcctccgt ggaggcagct gtgggaggca cagtcaccat caagtgccag 60
gccagtcag 69
<210> 69
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 69
cttatcctgg tttcagcaga aaccagggca gcctcccaac ctcctgatct acgatgcatc 60
caaactggcc tctggggtcc catcgcggtt caaaggcagt ggatctggga cagagttcac 120
tctcaccatc agcgacctgg agtgtgccga tgctgccact ttctactgt 169
<210> 70
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<212> DNA
<213> human
<400> 70
cacgaccgaa aagaattcgc taaatttgag gaagaacgcg ccagagcaaa atgggacaca 60
gccaacaacc cactgtataa agaggccacg tctaccttca ccaatatcac gtaccggggc 120
acttaa 126
<210> 71
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 71
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgttggagg agtccggggg aggcctggtc aagcctggag gaaccctgac actcacctgc 120
aaagcctctg gattc 135
<210> 72
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 72
tgggtccgcc agggtccagg gaaggggctg cagtggatcg ca 42
<210> 73
<211> 114
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 73
acttactacg cgagctgggc gaaaggccga ttcaccatct ccaaaacctc gtcgaccacg 60
gtgactctgc aaatgaccag tctggcagcc gcggacacgg ccacctattt ctgt 114
<210> 74
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 74
tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc tca 33
<210> 75
<211> 374
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 75
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60
agatttgccc aaattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120
acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcatttaca gctacttatc ctggtttcag 180
cagaaaccag ggcagcctcc caacctcctg atctacgatg catccaaact ggcctctggg 240
gtcccatcgc ggttcaaagg cagtggatct gggacagagt tcactctcac catcagcgac 300
ctggagtgtg ccgatgctgc cactttctac tgtcaaagcc aggcttatag tgatagttat 360
agttatgata atag 374
<210> 76
<211> 393
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 76
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgttggagg agtccggggg aggcctggtc aagcctggag gaaccctgac actcacctgc 120
aaagcctctg gattcgactt cagtagcgac tactggatgt cctgggtccg ccagggtcca 180
gggaaggggc tgcagtggat cgcatacatt aatgttggtg atggtaaaac ttactacgcg 240
agctgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctgcaa 300
atgaccagtc tggcagccgc ggacacggcc acctatttct gtggcaaaga tttaggcttg 360
tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc tca 393
<210> 77
<211> 346
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 77
tttcggcggg gggaccgaac tggtggtcga aggtgatcca gttgcaccta ctgtcctcat 60
cttcccacca gctgctgatc aggtggcaac tggaacagtc accatcgtgt gtgtggcgaa 120
taaatacttt cccgatgtca ccgtcacctg ggaggtggat ggcaccaccc aaacaactgg 180
catcgagaac agtaaaacac cgcagaattc tgcagattgt acctacaacc tcagcagcac 240
tctgacactg accagcacac agtacaacag ccacaaagag tacacctgca aggtgaccca 300
gggcacgacc tcagtcgtcc agagcttcaa taggggtgac tgttag 346
<210> 78
<211> 967
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 78
gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60
tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa gggtacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120
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ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240
aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300
agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360
ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420
gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480
cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540
accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600
aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660
gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720
ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780
gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840
ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900
tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960
ccgggta 967
<210> 79
<211> 720
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 79
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60
agatttgccc aaattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120
acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcatttaca gctacttatc ctggtttcag 180
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gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
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tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
<210> 80
<211> 1365
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 80
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgttggagg agtccggggg aggcctggtc aagcctggag gaaccctgac actcacctgc 120
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aaccactaca cgcagaagtc catctcccgc tctccgggta aatga 1365
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 81
Thr Phe Ala Gln Val Leu
1 5
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 82
Glu Ser Val Tyr Ala Asp Ile Ala
1 5
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 83
Ala Gly Asp Tyr Gly Ala Gly Thr Glu Pro Asn Leu
1 5 10
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 84
Ser Leu Ser Ser Tyr Gly Val Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 85
Ser Ile Ser Thr Thr Gly Ile
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 86
Ala Arg Gly Phe Pro Gly His Leu Arg Lys Pro Ser Asp Ile
1 5 10
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<211> 20
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 87
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 88
Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Cys Gln Ser Ser
20
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<211> 56
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 89
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys
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50 55
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<211> 692
<212> PRT
<213> human
<400> 90
Gly Pro Asn Ile Cys Thr Thr Arg Gly Val Ser Ser Cys Gln Gln Cys
1 5 10 15
Leu Ala Val Ser Pro Met Cys Ala Trp Cys Ser Asp Glu Ala Leu Pro
20 25 30
Leu Gly Ser Pro Arg Cys Asp Leu Lys Glu Asn Leu Leu Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Ala Pro Glu Ser Ile Glu Phe Pro Val Ser Glu Ala Arg Val Leu
50 55 60
Glu Asp Arg Pro Leu Ser Asp Lys Gly Ser Gly Asp Ser Ser Gln Val
65 70 75 80
Thr Gln Val Ser Pro Gln Arg Ile Ala Leu Arg Leu Arg Pro Asp Asp
85 90 95
Ser Lys Asn Phe Ser Ile Gln Val Arg Gln Val Glu Asp Tyr Pro Val
100 105 110
Asp Ile Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu
115 120 125
Trp Ser Ile Gln Asn Leu Gly Thr Lys Leu Ala Thr Gln Met Arg Lys
130 135 140
Leu Thr Ser Asn Leu Arg Ile Gly Phe Gly Ala Phe Val Asp Lys Pro
145 150 155 160
Val Ser Pro Tyr Met Tyr Ile Ser Pro Pro Glu Ala Leu Glu Asn Pro
165 170 175
Cys Tyr Asp Met Lys Thr Thr Cys Leu Pro Met Phe Gly Tyr Lys His
180 185 190
Val Leu Thr Leu Thr Asp Gln Val Thr Arg Phe Asn Glu Glu Val Lys
195 200 205
Lys Gln Ser Val Ser Arg Asn Arg Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp
210 215 220
Ala Ile Met Gln Ala Thr Val Cys Asp Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn
225 230 235 240
Asp Ala Ser His Leu Leu Val Phe Thr Thr Asp Ala Lys Thr His Ile
245 250 255
Ala Leu Asp Gly Arg Leu Ala Gly Ile Val Gln Pro Asn Asp Gly Gln
260 265 270
Cys His Val Gly Ser Asp Asn His Tyr Ser Ala Ser Thr Thr Met Asp
275 280 285
Tyr Pro Ser Leu Gly Leu Met Thr Glu Lys Leu Ser Gln Lys Asn Ile
290 295 300
Asn Leu Ile Phe Ala Val Thr Glu Asn Val Val Asn Leu Tyr Gln Asn
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Leu Ile Pro Gly Thr Thr Val Gly Val Leu Ser Met Asp
325 330 335
Ser Ser Asn Val Leu Gln Leu Ile Val Asp Ala Tyr Gly Lys Ile Arg
340 345 350
Ser Lys Val Glu Leu Glu Val Arg Asp Leu Pro Glu Glu Leu Ser Leu
355 360 365
Ser Phe Asn Ala Thr Cys Leu Asn Asn Glu Val Ile Pro Gly Leu Lys
370 375 380
Ser Cys Met Gly Leu Lys Ile Gly Asp Thr Val Ser Phe Ser Ile Glu
385 390 395 400
Ala Lys Val Arg Gly Cys Pro Gln Glu Lys Glu Lys Ser Phe Thr Ile
405 410 415
Lys Pro Val Gly Phe Lys Asp Ser Leu Ile Val Gln Val Thr Phe Asp
420 425 430
Cys Asp Cys Ala Cys Gln Ala Gln Ala Glu Pro Asn Ser His Arg Cys
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Gly Trp Leu Gly Ser Gln Cys Glu Cys Ser Glu Glu Asp Tyr Arg Pro
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485 490 495
Gln Arg Gly Glu Cys Leu Cys Gly Gln Cys Val Cys His Ser Ser Asp
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Phe Gly Lys Ile Thr Gly Lys Tyr Cys Glu Cys Asp Asp Phe Ser Cys
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Val Arg Tyr Lys Gly Glu Met Cys Ser Gly His Gly Gln Cys Ser Cys
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Gly Asp Cys Leu Cys Asp Ser Asp Trp Thr Gly Tyr Tyr Cys Asn Cys
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Gly Arg Gly Lys Cys Glu Cys Gly Ser Cys Val Cys Ile Gln Pro Gly
580 585 590
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660 665 670
Ser Ser Gly Lys Ser Ile Leu Tyr Val Val Glu Glu Pro Glu Cys Pro
675 680 685
Lys Gly Pro Asp
690
<210> 91
<211> 45
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 91
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro
20 25 30
Thr Asp Thr Leu Ile Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
35 40 45
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 92
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1 5 10
<210> 93
<211> 39
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 93
Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn
1 5 10 15
Thr Asn Leu Tyr Thr Val Thr Leu Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Ala
20 25 30
Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 94
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 95
<211> 124
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 95
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Glu Ser Val Tyr Ala Asp Ile Ala Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Asp Tyr Gly Ala Gly Thr Glu Pro Asn Leu
115 120
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<211> 138
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<213> rabbit
<400> 96
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro
20 25 30
Thr Asp Thr Leu Ile Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Ser Ile Ser Thr Thr Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Ser Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Tyr Thr Val
85 90 95
Thr Leu Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
100 105 110
Cys Ala Arg Gly Phe Pro Gly His Leu Arg Lys Pro Ser Asp Ile Trp
115 120 125
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
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<211> 114
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<213> rabbit
<400> 97
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Ser Gly Asp Pro Val Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
20 25 30
Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val
35 40 45
Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser
50 55 60
Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr
65 70 75 80
Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys
85 90 95
Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly
100 105 110
Asp Cys
<210> 98
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 98
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
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Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 99
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Ser Ile Ser Cys Gln Ser Ser
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Glu Ser Val Tyr Ala Asp Ile Ala Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Asp Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Asp Tyr Gly Ala Gly Thr Glu Pro Asn Leu Phe Gly Gly Gly
115 120 125
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130 135 140
Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
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Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 100
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
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Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro
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Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gln Pro Lys Ala Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr
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Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr
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Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro
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Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser
195 200 205
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Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln
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Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu
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Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys
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Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln
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Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
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<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 101
acatttgccc aagtgctg 18
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 102
agtgtttatg ctgacatcgc 20
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 103
gcaggcgatt atggggctgg tactgagcct aatctt 36
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 104
tccctcagta gctatggagt gagc 24
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 105
tccattagta ctactggtat c 21
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 106
gaggttttcc tggtcatctt cgtaagccgt cggaca 36
<210> 107
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 107
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
<210> 108
<211> 69
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 108
acccagactc catcctccgt gtctgcagct gtgggaggca cagtcagcat cagttgccag 60
tccagtgag 69
<210> 109
<211> 169
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 109
cttatcctgg tttcagcaga aaccagggca gcctcccaag ctcctgatct atggtgcatc 60
cactctggca tctggggtcc catcgcggtt cagcggcagt ggatctggga cagaattcac 120
tctcaccatc agcgacgtgc agtgtgacgc tgctgccact tactattgt 169
<210> 110
<211> 2154
<212> DNA
<213> human
<400> 110
atgcgagcgc ggccgcggcc ccggccgctc tgggtgactg tgctggcgct gggggcgctg 60
gcgggcgttg gcgtaggagg gcccaacatc tgtaccacgc gaggtgtgag ctcctgccag 120
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tcacctcgct gtgacctgaa ggagaatctg ctgaaggata actgtgcccc agaatccatc 240
gagttcccag tgagtgaggc ccgagtacta gaggacaggc ccctcagcga caagggctct 300
ggagacagct cccaggtcac tcaagtcagt ccccagagga ttgcactccg gctccggcca 360
gatgattcga agaatttctc catccaagtg cggcaggtgg aggattaccc tgtggacatc 420
tactacttga tggacctgtc ttactccatg aaggatgatc tgtggagcat ccagaacctg 480
ggtaccaagc tggccaccca gatgcgaaag ctcaccagta acctgcggat tggcttcggg 540
gcatttgtgg acaagcctgt gtcaccatac atgtatatct ccccaccaga ggccctcgaa 600
aacccctgct atgatatgaa gaccacctgc ttgcccatgt ttggctacaa acacgtgctg 660
acgctaactg accaggtgac ccgcttcaat gaggaagtga agaagcagag tgtgtcacgg 720
aaccgagatg ccccagaggg tggctttgat gccatcatgc aggctacagt ctgtgatgaa 780
aagattggct ggaggaatga tgcatcccac ttgctggtgt ttaccactga tgccaagact 840
catatagcat tggacggaag gctggcaggc attgtccagc ctaatgacgg gcagtgtcat 900
gttggtagtg acaatcatta ctctgcctcc actaccatgg attatccctc tttggggctg 960
atgactgaga agctatccca gaaaaacatc aatttgatct ttgcagtgac tgaaaatgta 1020
gtcaatctct atcagaacta tagtgagctc atcccaggga ccacagttgg ggttctgtcc 1080
atggattcca gcaatgtcct ccagctcatt gttgatgctt atgggaaaat ccgttctaaa 1140
gtcgagctgg aagtgcgtga cctccctgaa gagttgtctc tatccttcaa tgccacctgc 1200
ctcaacaatg aggtcatccc tggcctcaag tcttgtatgg gactcaagat tggagacacg 1260
gtgagcttca gcattgaggc caaggtgcga ggctgtcccc aggagaagga gaagtccttt 1320
accataaagc ccgtgggctt caaggacagc ctgatcgtcc aggtcacctt tgattgtgac 1380
tgtgcctgcc aggcccaagc tgaacctaat agccatcgct gcaacaatgg caatgggacc 1440
tttgagtgtg gggtatgccg ttgtgggcct ggctggctgg gatcccagtg tgagtgctca 1500
gaggaggact atcgcccttc ccagcaggac gagtgcagcc cccgagaggg tcagcccgtc 1560
tgcagccagc ggggcgagtg cctctgtggt caatgtgtct gccacagcag tgactttggc 1620
aagatcacgg gcaagtactg cgagtgtgac gacttctcct gtgtccgcta caagggggag 1680
atgtgctcag gccatggcca gtgcagctgt ggggactgcc tgtgtgactc cgactggacc 1740
ggctactact gcaactgtac cacgcgtact gacacctgca tgtccagcaa tgggctgctg 1800
tgcagcggcc gcggcaagtg tgaatgtggc agctgtgtct gtatccagcc gggctcctat 1860
ggggacacct gtgagaagtg ccccacctgc ccagatgcct gcacctttaa gaaagaatgt 1920
gtggagtgta agaagtttga ccgggagccc tacatgaccg aaaatacctg caaccgttac 1980
tgccgtgacg agattgagtc agtgaaagag cttaaggaca ctggcaagga tgcagtgaat 2040
tgtacctata agaatgagga tgactgtgtc gtcagattcc agtactatga agattctagt 2100
ggaaagtcca tcctgtatgt ggtagaagag ccagagtgtc ccaagggccc tgac 2154
<210> 111
<211> 135
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 111
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgat actcacctgc 120
acagtctctg gattc 135
<210> 112
<211> 42
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 112
tgggtccgcc aggctccagg gaacgggctg gaatacatcg ga 42
<210> 113
<211> 121
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 113
acatactacg cgagctgggc gaaaagccga tccaccatca ccagaaacac caacctgtac 60
acggtgactc tgaaaatgac cggtctgaca gccgcggaca cggccaccta tttctgtgcg 120
a 121
<210> 114
<211> 35
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 114
tttggggccc cggcaccctg gtcaccgtct ccgca 35
<210> 115
<211> 372
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 115
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcagcatca gttgccagtc cagtgagagt gtttatgctg acatcgcctt atcctggttt 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatg gtgcatccac tctggcatct 240
ggggtcccat cgcggttcag cggcagtgga tctgggacag aattcactct caccatcagc 300
gacgtgcagt gtgacgctgc tgccacttac tattgtgcag gcgattatgg ggctggtact 360
gagcctaatc tt 372
<210> 116
<211> 414
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 116
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgat actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtagctat ggagtgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aacgggctgg aatacatcgg atccattagt actactggta tcacatacta cgcgagctgg 240
gcgaaaagcc gatccaccat caccagaaac accaacctgt acacggtgac tctgaaaatg 300
accggtctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagaggttt tcctggtcat 360
cttcgtaagc cgtcggacat ttggggcccc ggcaccctgg tcaccgtctc cgca 414
<210> 117
<211> 345
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 117
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcagc ggtgatccag ttgcacctac tgtcctcatc 60
ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat 120
aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc 180
atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct gcagattgta cctacaacct cagcagcact 240
ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag 300
ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat aggggtgact gttag 345
<210> 118
<211> 972
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 118
gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60
tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa gggtacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180
ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240
aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300
agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360
ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420
gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480
cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540
accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600
aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660
gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720
ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780
gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840
ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900
tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960
ccgggtaaat ga 972
<210> 119
<211> 717
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 119
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcagcatca gttgccagtc cagtgagagt gtttatgctg acatcgcctt atcctggttt 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatg gtgcatccac tctggcatct 240
ggggtcccat cgcggttcag cggcagtgga tctgggacag aattcactct caccatcagc 300
gacgtgcagt gtgacgctgc tgccacttac tattgtgcag gcgattatgg ggctggtact 360
gagcctaatc ttttcggcgg agggaccgag gtggtggtca gcggtgatcc agttgcacct 420
actgtcctca tcttcccacc agctgctgat caggtggcaa ctggaacagt caccatcgtg 480
tgtgtggcga ataaatactt tcccgatgtc accgtcacct gggaggtgga tggcaccacc 540
caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600
ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660
aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717
<210> 120
<211> 1386
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 120
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgat actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtagctat ggagtgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aacgggctgg aatacatcgg atccattagt actactggta tcacatacta cgcgagctgg 240
gcgaaaagcc gatccaccat caccagaaac accaacctgt acacggtgac tctgaaaatg 300
accggtctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagaggttt tcctggtcat 360
cttcgtaagc cgtcggacat ttggggcccc ggcaccctgg tcaccgtctc cgcagggcaa 420
cctaaggctc catcagtctt cccactggcc ccctgctgcg gggacacacc cagctccacg 480
gtgaccctgg gctgcctggt caaagggtac ctcccggagc cagtgaccgt gacctggaac 540
tcgggcaccc tcaccaatgg ggtacgcacc ttcccgtccg tccggcagtc ctcaggcctc 600
tactcgctga gcagcgtggt gagcgtgacc tcaagcagcc agcccgtcac ctgcaacgtg 660
gcccacccag ccaccaacac caaagtggac aagaccgttg cgccctcgac atgcagcaag 720
cccacgtgcc caccccctga actcctgggg ggaccgtctg tcttcatctt ccccccaaaa 780
cccaaggaca ccctcatgat ctcacgcacc cccgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccaggatg accccgaggt gcagttcaca tggtacataa acaacgagca ggtgcgcacc 900
gcccggccgc cgctacggga gcagcagttc aacagcacga tccgcgtggt cagcaccctc 960
cccatcgcgc accaggactg gctgaggggc aaggagttca agtgcaaagt ccacaacaag 1020
gcactcccgg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca gagggcagcc cctggagccg 1080
aaggtctaca ccatgggccc tccccgggag gagctgagca gcaggtcggt cagcctgacc 1140
tgcatgatca acggcttcta cccttccgac atctcggtgg agtgggagaa gaacgggaag 1200
gcagaggaca actacaagac cacgccggcc gtgctggaca gcgacggctc ctacttcctc 1260
tacagcaagc tctcagtgcc cacgagtgag tggcagcggg gcgacgtctt cacctgctcc 1320
gtgatgcacg aggccttgca caaccactac acgcagaagt ccatctcccg ctctccgggt 1380
aaatga 1386
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 121
Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Val
1 5 10 15
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 122
Gln Ser Val Gly Ile Asn
1 5
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 123
Gln Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Val Asp Asn Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 124
Ile Asp Leu Ser Ser Ala Ala Ile Asn
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 125
Val Ile Gly Gly Ser Thr Gly Pro Tyr
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 126
Gly Leu Phe Gly Ile Asn Asn Asp Ile Ser Arg Ile
1 5 10
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<211> 20
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 127
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala
20
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<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 128
Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
1 5 10
<210> 129
<211> 57
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 129
Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Ser Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
35 40 45
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
50 55
<210> 130
<211> 694
<212> PRT
<213> human
<400> 130
Gly Arg Asn Asp His Val Gln Gly Gly Cys Ala Val Gly Gly Ala Glu
1 5 10 15
Thr Cys Glu Asp Cys Leu Leu Ile Gly Pro Gln Cys Ala Trp Cys Ser
20 25 30
Gln Glu Asn Phe Thr His Leu Ser Gly Val Gly Glu Arg Cys Asp Thr
35 40 45
Pro Ala Asn Leu Leu Ala Lys Gly Cys Gln Leu Thr Phe Ile Glu Asn
50 55 60
Pro Val Ser Gln Val Glu Ile Leu Thr Asn Lys Pro Leu Ser Ile Gly
65 70 75 80
Arg Gln Lys Asn Ser Ser Asp Ile Val Gln Ile Ser Pro Gln Ser Leu
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Ala Leu Lys Leu Arg Pro Gly Leu Glu Gln Thr Leu Gln Val Gln Val
100 105 110
Arg Gln Thr Glu Asp Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu
115 120 125
Ser Ala Ser Met Asp Asp Asp Leu Asn Thr Ile Lys Glu Leu Gly Ser
130 135 140
Leu Leu Ser Lys Glu Met Ser Lys Leu Thr Ser Asn Phe Arg Leu Gly
145 150 155 160
Phe Gly Ser Phe Val Glu Lys Pro Ile Ser Pro Phe Met Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Glu Glu Ile Ala Asn Pro Cys Ser Ser Ile Pro Tyr Phe Cys Leu
180 185 190
Pro Thr Phe Gly Phe Lys His Ile Leu Pro Leu Thr Asn Asp Ala Glu
195 200 205
Arg Phe Asn Glu Ile Val Lys Asn Gln Lys Ile Ser Ala Asn Ile Asp
210 215 220
Thr Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met Gln Ala Ala Val Cys Lys
225 230 235 240
Glu Lys Ile Gly Trp Arg Asn Asp Ser Leu His Leu Leu Val Phe Val
245 250 255
Ser Asp Ala Asp Ser His Phe Gly Met Asp Ser Lys Leu Ala Gly Ile
260 265 270
Val Ile Pro Asn Asp Gly Leu Cys His Leu Asp Ser Lys Asn Glu Tyr
275 280 285
Ser Met Ser Thr Ile Leu Glu Tyr Pro Thr Ile Gly Gln Leu Ile Asp
290 295 300
Lys Leu Val Gln Asn Asn Val Leu Leu Ile Phe Ala Val Thr Gln Glu
305 310 315 320
Gln Val His Leu Tyr Glu Asn Tyr Ala Lys Leu Ile Pro Gly Ala Thr
325 330 335
Val Gly Val Leu Gln Lys Asp Ser Gly Asn Ile Leu Gln Leu Ile Ile
340 345 350
Ser Ala Tyr Glu Glu Leu Arg Ser Glu Val Glu Leu Glu Val Leu Gly
355 360 365
Asp Thr Glu Gly Leu Asn Leu Ser Phe Thr Ala Ile Cys Asn Thr Gly
370 375 380
Ile Pro Val Pro His Gln Lys Lys Cys Ser His Met Lys Val Gly Asp
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Ser Arg His Ile Ile Leu Lys Pro Val Gly Leu Gly Asp Ala Leu Glu
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Ile Leu Val Ser Pro Glu Cys Ser Cys Asp Cys Gln Lys Glu Val Glu
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Val Asn Ser Ser Lys Cys Asn Asn Gly Asn Gly Ser Phe Gln Cys Gly
450 455 460
Val Cys Ala Cys His Pro Gly His Met Gly His His Cys Glu Cys Gly
465 470 475 480
Glu Asp Thr Leu Ser Thr Glu Ser Cys Lys Glu Ala Pro Gly Arg Pro
485 490 495
Ser Cys Ser Gly Arg Gly Asp Cys Tyr Cys Gly Gln Cys Val Cys His
500 505 510
Leu Ser Pro Tyr Gly Asn Ile Tyr Gly Pro Tyr Cys Gln Cys Asp Asn
515 520 525
Phe Ser Cys Val Arg His Lys Gly Leu Leu Cys Gly Asp Asn Gly Asp
530 535 540
Cys Asp Cys Gly Glu Cys Val Cys Arg Ser Gly Trp Thr Gly Glu Tyr
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Leu Cys Ser Gly Arg Gly Asp Cys Val Cys Gly Lys Cys Ile Cys Thr
580 585 590
Asn Pro Gly Ala Ser Gly Pro Thr Cys Glu Arg Cys Pro Thr Cys Gly
595 600 605
Asp Pro Cys Asn Ser Lys Arg Ser Cys Ile Glu Cys Tyr Leu Ser Ala
610 615 620
Asp Gly Gln Ala Gln Glu Glu Cys Val Asp Lys Cys Lys Leu Ala Gly
625 630 635 640
Ala Thr Ile Asn Glu Glu Glu Asp Phe Ser Lys Asp Ser Phe Val Ser
645 650 655
Cys Ser Leu Gln Gly Glu Asn Glu Cys Leu Ile Thr Phe Leu Leu Thr
660 665 670
Thr Asp Asn Glu Gly Lys Thr Val Ile His Ser Ile Asn Glu Lys Asp
675 680 685
Cys Pro Lys Pro Pro Asn
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<212> PRT
<213> rabbit
<400> 131
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
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Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro
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Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
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<213> rabbit
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Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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<213> rabbit
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Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr
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Thr Val Ala Leu Lys Ile Ala Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr
20 25 30
Tyr Phe Cys Ala Arg
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<213> rabbit
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Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu
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<212> PRT
<213> rabbit
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Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
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Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Val Asp Asn Val
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<213> rabbit
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Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
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Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Pro
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Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
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Ser Ala Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Val Ile Gly Gly Ser Thr Gly Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp
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Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ala Leu
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Lys Ile Ala Gly Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Gly Leu Phe Gly Ile Asn Asn Asp Ile Ser Arg Ile Trp Gly Pro
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<212> PRT
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 137
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro
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Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
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Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val
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Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser
50 55 60
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Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys
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100 105 110
Asp Cys
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<211> 323
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 138
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
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Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
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Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
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210 215 220
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Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
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<211> 236
<212> PRT
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (222)..(222)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 139
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
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Val Glu Val Val Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
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Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Val Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu
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Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
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Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val
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<212> PRT
<213> rabbit
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Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
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Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
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100 105 110
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115 120 125
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
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195 200 205
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340 345 350
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370 375 380
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<210> 141
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<212> DNA
<213> rabbit
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<212> DNA
<213> rabbit
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 143
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<212> DNA
<213> rabbit
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<212> DNA
<213> rabbit
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gtcattggtg gtagtaccgg tccatac 27
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<212> DNA
<213> rabbit
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<212> DNA
<213> rabbit
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 148
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 149
ttagcctggt atcaaaaaaa atcagggcag cgtcccaaac tcctgatcta tgctgcatcc 60
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ctcaccatca gcgacctgga gtgtgccgat gctgccactt actattgtca g 171
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<212> DNA
<213> human
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gattgtccga agcctccaaa c 2121
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<212> DNA
<213> rabbit
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<212> DNA
<213> rabbit
<400> 152
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatggatcg gg 42
<210> 153
<211> 111
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 153
tacgcgagct gggtgaatgg ccgattcacc atctccaaaa cctcgaccac ggtggctctg 60
aaaatcgccg ggccgacaac cgaggacacg gccacctatt tctgtgccag a 111
<210> 154
<211> 33
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 154
tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc tta 33
<210> 155
<211> 366
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 155
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgcct atgatatgac ccagactcca gcctctgtgg aggtagttgt gggaggcaca 120
gtcaccatca agtgccaggc cagtcagagc gttggtatta atttagcctg gtatcaaaaa 180
aaatcagggc agcgtcccaa actcctgatc tatgctgcat ccactctggc atctggggtc 240
tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 300
gagtgtgccg atgctgccac ttactattgt cagcagactt atagtagtgg taatgttgat 360
aatgtg 366
<210> 156
<211> 408
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 156
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc aagcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gaatcgacct cagtagcgct gcaataaact gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg ggtcattggt ggtagtaccg gtccatacta cgcgagctgg 240
gtgaatggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggctctgaa aatcgccggg 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag gcttgtttgg tataaataat 360
gatattagta ggatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctta 408
<210> 157
<211> 360
<212> DNA
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (297)..(298)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 157
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa ggtgatccag ttgcacctac tgtcctcatc 60
ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat 120
aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc 180
atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct gcagattgta cctacaacct cagcagcact 240
ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc cacaaagagt acacctgcaa ggtgacnnag 300
ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat aggggtgact gttagagtga gagcggccgc 360
<210> 158
<211> 998
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 158
gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60
tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa gggtacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180
ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240
aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300
agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360
ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420
gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480
cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540
accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600
aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660
gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720
ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780
gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840
ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900
tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960
ccgggtaaat gagcgctgtg ccggcgagct gcggccgc 998
<210> 159
<211> 726
<212> DNA
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (663)..(664)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 159
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgcct atgatatgac ccagactcca gcctctgtgg aggtagttgt gggaggcaca 120
gtcaccatca agtgccaggc cagtcagagc gttggtatta atttagcctg gtatcaaaaa 180
aaatcagggc agcgtcccaa actcctgatc tatgctgcat ccactctggc atctggggtc 240
tcatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagttca ctctcaccat cagcgacctg 300
gagtgtgccg atgctgccac ttactattgt cagcagactt atagtagtgg taatgttgat 360
aatgtgttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaaggtg atccagttgc acctactgtc 420
ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480
gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540
actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 600
agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660
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ggccgc 726
<210> 160
<211> 1406
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 160
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc aagcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gaatcgacct cagtagcgct gcaataaact gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg ggtcattggt ggtagtaccg gtccatacta cgcgagctgg 240
gtgaatggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggctctgaa aatcgccggg 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag gcttgtttgg tataaataat 360
gatattagta ggatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctccttagg gcaacctaag 420
gctccatcag tcttcccact ggccccctgc tgcggggaca cacccagctc cacggtgacc 480
ctgggctgcc tggtcaaagg gtacctcccg gagccagtga ccgtgacctg gaactcgggc 540
accctcacca atggggtacg caccttcccg tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg 600
ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 660
ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc gttgcgccct cgacatgcag caagcccacg 720
tgcccacccc ctgaactcct ggggggaccg tctgtcttca tcttcccccc aaaacccaag 780
gacaccctca tgatctcacg cacccccgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccag 840
gatgaccccg aggtgcagtt cacatggtac ataaacaacg agcaggtgcg caccgcccgg 900
ccgccgctac gggagcagca gttcaacagc acgatccgcg tggtcagcac cctccccatc 960
gcgcaccagg actggctgag gggcaaggag ttcaagtgca aagtccacaa caaggcactc 1020
ccggccccca tcgagaaaac catctccaaa gccagagggc agcccctgga gccgaaggtc 1080
tacaccatgg gccctccccg ggaggagctg agcagcaggt cggtcagcct gacctgcatg 1140
atcaacggct tctacccttc cgacatctcg gtggagtggg agaagaacgg gaaggcagag 1200
gacaactaca agaccacgcc ggccgtgctg gacagcgacg gctcctactt cctctacagc 1260
aagctctcag tgcccacgag tgagtggcag cggggcgacg tcttcacctg ctccgtgatg 1320
cacgaggcct tgcacaacca ctacacgcag aagtccatct cccgctctcc gggtaaatga 1380
gcgctgtgcc ggcgagctgc ggccgc 1406
<210> 161
<211> 16
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 161
Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Glu Pro
1 5 10 15
<210> 162
<211> 6
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 162
Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
1 5
<210> 163
<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 163
Gln Cys Thr Gly Gly Ile Ile Ile Asp Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 164
Phe Ser Leu Asn Ser Gly Asn Met Gln
1 5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 165
Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe
1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 166
Gly Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Val
1 5
<210> 167
<211> 20
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 167
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala
20
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 168
Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
1 5 10
<210> 169
<211> 56
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 169
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Ala Cys
35 40 45
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
50 55
<210> 170
<211> 642
<212> PRT
<213> human
<400> 170
Glu Asp Asn Arg Cys Ala Ser Ser Asn Ala Ala Ser Cys Ala Arg Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Gly Pro Glu Cys Gly Trp Cys Val Gln Glu Asp Phe Ile
20 25 30
Ser Gly Gly Ser Arg Ser Glu Arg Cys Asp Ile Val Ser Asn Leu Ile
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Ser Val Asp Ser Ile Glu Tyr Pro Ser Val His Val
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Glu Asn Glu Ile Asn Thr Gln Val Thr Pro Gly Glu
65 70 75 80
Val Ser Ile Gln Leu Arg Pro Gly Ala Glu Ala Asn Phe Met Leu Lys
85 90 95
Val His Pro Leu Lys Lys Tyr Pro Val Asp Leu Tyr Tyr Leu Val Asp
100 105 110
Val Ser Ala Ser Met His Asn Asn Ile Glu Lys Leu Asn Ser Val Gly
115 120 125
Asn Asp Leu Ser Arg Lys Met Ala Phe Phe Ser Arg Asp Phe Arg Leu
130 135 140
Gly Phe Gly Ser Tyr Val Asp Lys Thr Val Ser Pro Tyr Ile Ser Ile
145 150 155 160
His Pro Glu Arg Ile His Asn Gln Cys Ser Asp Tyr Asn Leu Asp Cys
165 170 175
Met Pro Pro His Gly Tyr Ile His Val Leu Ser Leu Thr Glu Asn Ile
180 185 190
Thr Glu Phe Glu Lys Ala Val His Arg Gln Lys Ile Ser Gly Asn Ile
195 200 205
Asp Thr Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Met Leu Gln Ala Ala Val Cys
210 215 220
Glu Ser His Ile Gly Trp Arg Lys Glu Ala Lys Arg Leu Leu Leu Val
225 230 235 240
Met Thr Asp Gln Thr Ser His Leu Ala Leu Asp Ser Lys Leu Ala Gly
245 250 255
Ile Val Val Pro Asn Asp Gly Asn Cys His Leu Lys Asn Asn Val Tyr
260 265 270
Val Lys Ser Thr Thr Met Glu His Pro Ser Leu Gly Gln Leu Ser Glu
275 280 285
Lys Leu Ile Asp Asn Asn Ile Asn Val Ile Phe Ala Val Gln Gly Lys
290 295 300
Gln Phe His Trp Tyr Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ile
305 310 315 320
Ala Gly Glu Ile Glu Ser Lys Ala Ala Asn Leu Asn Asn Leu Val Val
325 330 335
Glu Ala Tyr Gln Lys Leu Ile Ser Glu Val Lys Val Gln Val Glu Asn
340 345 350
Gln Val Gln Gly Ile Tyr Phe Asn Ile Thr Ala Ile Cys Pro Asp Gly
355 360 365
Ser Arg Lys Pro Gly Met Glu Gly Cys Arg Asn Val Thr Ser Asn Asp
370 375 380
Glu Val Leu Phe Asn Val Thr Val Thr Met Lys Lys Cys Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Gly Lys Asn Tyr Ala Ile Ile Lys Pro Ile Gly Phe Asn Glu Thr
405 410 415
Ala Lys Ile His Ile His Arg Asn Cys Ser Cys Gln Cys Glu Asp Asn
420 425 430
Arg Gly Pro Lys Gly Lys Cys Val Asp Glu Thr Phe Leu Asp Ser Lys
435 440 445
Cys Phe Gln Cys Asp Glu Asn Lys Cys His Phe Asp Glu Asp Gln Phe
450 455 460
Ser Ser Glu Ser Cys Lys Ser His Lys Asp Gln Pro Val Cys Ser Gly
465 470 475 480
Arg Gly Val Cys Val Cys Gly Lys Cys Ser Cys His Lys Ile Lys Leu
485 490 495
Gly Lys Val Tyr Gly Lys Tyr Cys Glu Lys Asp Asp Phe Ser Cys Pro
500 505 510
Tyr His His Gly Asn Leu Cys Ala Gly His Gly Glu Cys Glu Ala Gly
515 520 525
Arg Cys Gln Cys Phe Ser Gly Trp Glu Gly Asp Arg Cys Gln Cys Pro
530 535 540
Ser Ala Ala Ala Gln His Cys Val Asn Ser Lys Gly Gln Val Cys Ser
545 550 555 560
Gly Arg Gly Thr Cys Val Cys Gly Arg Cys Glu Cys Thr Asp Pro Arg
565 570 575
Ser Ile Gly Arg Phe Cys Glu His Cys Pro Thr Cys Tyr Thr Ala Cys
580 585 590
Lys Glu Asn Trp Asn Cys Met Gln Cys Leu His Pro His Asn Leu Ser
595 600 605
Gln Ala Ile Leu Asp Gln Cys Lys Thr Ser Cys Ala Leu Met Glu Gln
610 615 620
Gln His Tyr Val Asp Gln Thr Ser Glu Cys Phe Ser Ser Pro Ser Tyr
625 630 635 640
Leu Arg
<210> 171
<211> 44
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 171
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly
35 40
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 172
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
1 5 10
<210> 173
<211> 35
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 173
Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr
20 25 30
Tyr Phe Cys
35
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 174
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Leu
1 5 10
<210> 175
<211> 122
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 175
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Glu Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Asn Ile Tyr Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Ala Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
100 105 110
Thr Gly Gly Ile Ile Ile Asp Gly Gly Ala
115 120
<210> 176
<211> 131
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 176
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn
35 40 45
Ser Gly Asn Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly
100 105 110
Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Leu
130
<210> 177
<211> 116
<212> PRT
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (108)..(108)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 177
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
20 25 30
Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val
35 40 45
Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser
50 55 60
Lys Thr Pro His Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ile Ser Thr
65 70 75 80
Leu Thr Leu Thr Xaa Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys
85 90 95
Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Xaa Phe Asn Arg Gly
100 105 110
Asp Cys Leu Glu
115
<210> 178
<211> 323
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 178
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 179
<211> 238
<212> PRT
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (207)..(207)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (230)..(230)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 179
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Glu Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Asn Ile Tyr Ser Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Ala Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
100 105 110
Thr Gly Gly Ile Ile Ile Asp Gly Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu
115 120 125
Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val
145 150 155 160
Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly
165 170 175
Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro His Asn Ser
180 185 190
Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ile Ser Thr Leu Thr Leu Thr Xaa Thr
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr
210 215 220
Thr Ser Val Val Gln Xaa Phe Asn Arg Gly Asp Cys Leu Glu
225 230 235
<210> 180
<211> 454
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 180
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn
35 40 45
Ser Gly Asn Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Tyr Ile Gly Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly
100 105 110
Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Val Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
130 135 140
Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr
165 170 175
Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro
195 200 205
Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys
210 215 220
Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn
275 280 285
Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu
340 345 350
Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg
355 360 365
Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
435 440 445
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210> 181
<211> 48
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 181
agatgtgatg ttgtgatgac ccagactcca tcctccgtgt ctgaacct 48
<210> 182
<211> 18
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 182
gagaacattt acagttct 18
<210> 183
<211> 33
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 183
tgtactggtg gtattattat tgatgggggt gct 33
<210> 184
<211> 27
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 184
ttctccctca atagtggcaa tatgcaa 27
<210> 185
<211> 27
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 185
tacattggta gtggtggtag cacattc 27
<210> 186
<211> 27
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 186
ggcagatatg gtggtagtag gggtgta 27
<210> 187
<211> 60
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 187
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
<210> 188
<211> 36
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 188
gtgggaggca cagtcaccat caattgccag gccagt 36
<210> 189
<211> 171
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 189
ttagcctggt atcagcagaa accagggcag cctcccaagc tcctgatcta tgctgcatcc 60
aatctggcat ctggggtccc atcgcggttc aaaggcagtg gatctgggac agagttcact 120
ctcaccatca gcgacctggc gtgtgccgat gctgccactt actattgtca a 171
<210> 190
<211> 2052
<212> DNA
<213> human
<400> 190
atgtgcggct cggccctggc tttttttacc gctgcatttg tctgcctgca aaacgaccgg 60
cgaggtcccg cctcgttcct ctgggcagcc tgggtgtttt cacttgttct tggactgggc 120
caaggtgaag acaatagatg tgcatcttca aatgcagcat cctgtgccag gtgccttgcg 180
ctgggtccag aatgtggatg gtgtgttcaa gaggatttca tttcaggtgg atcaagaagt 240
gaacgttgtg atattgtttc caatttaata agcaaaggct gctcagttga ttcaatagaa 300
tacccatctg tgcatgttat aatacccact gaaaatgaaa ttaataccca ggtgacacca 360
ggagaagtgt ctatccagct gcgtccagga gccgaagcta attttatgct gaaagttcat 420
cctctgaaga aatatcctgt ggatctttat tatcttgttg atgtctcagc atcaatgcac 480
aataatatag aaaaattaaa ttccgttgga aacgatttat ctagaaaaat ggcatttttc 540
tcccgtgact ttcgtcttgg atttggctca tacgttgata aaacagtttc accatacatt 600
agcatccacc ccgaaaggat tcataatcaa tgcagtgact acaatttaga ctgcatgcct 660
ccccatggat acatccatgt gctgtctttg acagagaaca tcactgagtt tgagaaagca 720
gttcatagac agaagatctc tggaaacata gatacaccag aaggaggttt tgacgccatg 780
cttcaggcag ctgtctgtga aagtcatatc ggatggcgaa aagaggctaa aagattgctg 840
ctggtgatga cagatcagac gtctcatctc gctcttgata gcaaattggc aggcatagtg 900
gtgcccaatg acggaaactg tcatctgaaa aacaacgtct atgtcaaatc gacaaccatg 960
gaacacccct cactaggcca actttcagag aaattaatag acaacaacat taatgtcatc 1020
tttgcagttc aaggaaaaca atttcattgg tataaggatc ttctacccct cttgccaggc 1080
accattgctg gtgaaataga atcaaaggct gcaaacctca ataatttggt agtggaagcc 1140
tatcagaagc tcatttcaga agtgaaagtt caggtggaaa accaggtaca aggcatctat 1200
tttaacatta ccgccatctg tccagatggg tccagaaagc caggcatgga aggatgcaga 1260
aacgtgacga gcaatgatga agttcttttc aatgtaacag ttacaatgaa aaaatgtgat 1320
gtcacaggag gaaaaaacta tgcaataatc aaacctattg gttttaatga aaccgctaaa 1380
attcatatac acagaaactg cagctgtcag tgtgaggaca acagaggacc taaaggaaag 1440
tgtgtagatg aaacttttct agattccaag tgtttccagt gtgatgagaa taaatgtcat 1500
tttgatgaag atcagttttc ttctgagagt tgcaagtcac acaaggatca gcctgtttgc 1560
agtggtcgag gagtttgtgt ttgtgggaaa tgttcatgtc acaaaattaa gcttggaaaa 1620
gtgtatggaa aatactgtga aaaggatgac ttttcttgtc catatcacca tggaaatctg 1680
tgtgctgggc atggagagtg tgaagcaggc agatgccaat gcttcagtgg ctgggaaggt 1740
gatcgatgcc agtgcccttc agcagcagcc cagcactgtg tcaattcaaa gggccaagtg 1800
tgcagtggaa gaggcacgtg tgtgtgtgga aggtgtgagt gcaccgatcc caggagcatc 1860
ggccgcttct gtgaacactg ccccacctgt tatacagcct gcaaggaaaa ctggaattgt 1920
atgcaatgcc ttcaccctca caatttgtct caggctatac ttgatcagtg caaaacctca 1980
tgtgctctca tggaacaaca gcattatgtc gaccaaactt cagaatgttt ctccagccca 2040
agctacttga ga 2052
<210> 191
<211> 132
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 191
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
gcagtctctg ga 132
<210> 192
<211> 42
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 192
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatacatcg ga 42
<210> 193
<211> 105
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 193
tacgcgagct gggtgaatgg ccgattcacc atctccaaaa cctcgaccac ggtggatctg 60
aagatcacca gtccgacaac cgaggacacg gccacctatt tttgt 105
<210> 194
<211> 18
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 194
tggggcccag gcaccctg 18
<210> 195
<211> 366
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 195
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgatg ttgtgatgac ccagactcca tcctccgtgt ctgaacctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtgagaac atttacagtt ctttagcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgctgcat ccaatctggc atctggggtc 240
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcgacctg 300
gcgtgtgccg atgctgccac ttactattgt caatgtactg gtggtattat tattgatggg 360
ggtgct 366
<210> 196
<211> 378
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 196
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
gcagtctctg gattctccct caatagtggc aatatgcaat gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgg atacattggt agtggtggta gcacattcta cgcgagctgg 240
gtgaatggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa gatcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttt tgtggcagat atggtggtag taggggtgta 360
tggggcccag gcaccctg 378
<210> 197
<211> 361
<212> DNA
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (254)..(254)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (323)..(323)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 197
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa ggtgatccag ttgcacctac tgtcctcatc 60
ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat 120
aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc 180
atcgagaaca gtaaaacacc gcataattct gcagattgta cctacaacct catcagcact 240
ctgacactga ccancacaca gtacaacagc cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag 300
ggcacgacct cagtcgtcca gancttcaat aggggtgact gtttagagtg agagcggccg 360
c 361
<210> 198
<211> 1013
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 198
gtcaccgtct ccttagggca acctaaggct ccatcagtct tcccactggc cccctgctgc 60
ggggacacac ccagctccac ggtgaccctg ggctgcctgg tcaaagggta cctcccggag 120
ccagtgaccg tgacctggaa ctcgggcacc ctcaccaatg gggtacgcac cttcccgtcc 180
gtccggcagt cctcaggcct ctactcgctg agcagcgtgg tgagcgtgac ctcaagcagc 240
cagcccgtca cctgcaacgt ggcccaccca gccaccaaca ccaaagtgga caagaccgtt 300
gcgccctcga catgcagcaa gcccacgtgc ccaccccctg aactcctggg gggaccgtct 360
gtcttcatct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcacgcac ccccgaggtc 420
acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggat gaccccgagg tgcagttcac atggtacata 480
aacaacgagc aggtgcgcac cgcccggccg ccgctacggg agcagcagtt caacagcacg 540
atccgcgtgg tcagcaccct ccccatcgcg caccaggact ggctgagggg caaggagttc 600
aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 660
agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac accatgggcc ctccccggga ggagctgagc 720
agcaggtcgg tcagcctgac ctgcatgatc aacggcttct acccttccga catctcggtg 780
gagtgggaga agaacgggaa ggcagaggac aactacaaga ccacgccggc cgtgctggac 840
agcgacggct cctacttcct ctacagcaag ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg 900
ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag 960
tccatctccc gctctccggg taaatgagcg ctgtgccggc gagctgcggc cgc 1013
<210> 199
<211> 727
<212> DNA
<213> rabbit
<220>
<221> misc_feature
<222> (620)..(620)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (689)..(689)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 199
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgatg ttgtgatgac ccagactcca tcctccgtgt ctgaacctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtgagaac atttacagtt ctttagcctg gtatcagcag 180
aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tatgctgcat ccaatctggc atctggggtc 240
ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat cagcgacctg 300
gcgtgtgccg atgctgccac ttactattgt caatgtactg gtggtattat tattgatggg 360
ggtgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcaaaggtg atccagttgc acctactgtc 420
ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480
gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540
actggcatcg agaacagtaa aacaccgcat aattctgcag attgtaccta caacctcatc 600
agcactctga cactgaccan cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660
acccagggca cgacctcagt cgtccaganc ttcaataggg gtgactgttt agagtgagag 720
cggccgc 727
<210> 200
<211> 1391
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 200
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
gcagtctctg gattctccct caatagtggc aatatgcaat gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatacatcgg atacattggt agtggtggta gcacattcta cgcgagctgg 240
gtgaatggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa gatcaccagt 300
ccgacaaccg aggacacggc cacctatttt tgtggcagat atggtggtag taggggtgta 360
tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc ttagggcaac ctaaggctcc atcagtcttc 420
ccactggccc cctgctgcgg ggacacaccc agctccacgg tgaccctggg ctgcctggtc 480
aaagggtacc tcccggagcc agtgaccgtg acctggaact cgggcaccct caccaatggg 540
gtacgcacct tcccgtccgt ccggcagtcc tcaggcctct actcgctgag cagcgtggtg 600
agcgtgacct caagcagcca gcccgtcacc tgcaacgtgg cccacccagc caccaacacc 660
aaagtggaca agaccgttgc gccctcgaca tgcagcaagc ccacgtgccc accccctgaa 720
ctcctggggg gaccgtctgt cttcatcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780
tcacgcaccc ccgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccaggatga ccccgaggtg 840
cagttcacat ggtacataaa caacgagcag gtgcgcaccg cccggccgcc gctacgggag 900
cagcagttca acagcacgat ccgcgtggtc agcaccctcc ccatcgcgca ccaggactgg 960
ctgaggggca aggagttcaa gtgcaaagtc cacaacaagg cactcccggc ccccatcgag 1020
aaaaccatct ccaaagccag agggcagccc ctggagccga aggtctacac catgggccct 1080
ccccgggagg agctgagcag caggtcggtc agcctgacct gcatgatcaa cggcttctac 1140
ccttccgaca tctcggtgga gtgggagaag aacgggaagg cagaggacaa ctacaagacc 1200
acgccggccg tgctggacag cgacggctcc tacttcctct acagcaagct ctcagtgccc 1260
acgagtgagt ggcagcgggg cgacgtcttc acctgctccg tgatgcacga ggccttgcac 1320
aaccactaca cgcagaagtc catctcccgc tctccgggta aatgagcgct gtgccggcga 1380
gctgcggccg c 1391
<210> 201
<211> 16
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 201
Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala
1 5 10 15
<210> 202
<211> 8
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 202
Gln Ser Val Ala Ser Asn Asn Ala
1 5
<210> 203
<211> 13
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 203
Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Gly Thr Asp Cys Asn Val
1 5 10
<210> 204
<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 204
Ile Asp Leu Thr Ser Asn Ser Leu Ser
1 5
<210> 205
<211> 9
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 205
Ala Ile Ser Ser Arg Ala Thr Thr Tyr
1 5
<210> 206
<211> 5
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 206
Gly Lys Phe Asn Leu
1 5
<210> 207
<211> 20
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 207
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala
20
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 208
Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
1 5 10
<210> 209
<211> 56
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 209
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
35 40 45
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
50 55
<210> 210
<211> 957
<212> PRT
<213> human
<400> 210
Phe Asn Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Tyr Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser
20 25 30
Arg Met Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro
35 40 45
Gly Ile Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr
50 55 60
Arg Arg Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Lys Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala
85 90 95
Ser Val Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr
100 105 110
His Trp Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys
115 120 125
Phe Leu Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser
130 135 140
Gln Asp Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser
145 150 155 160
Ile Asp Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser
165 170 175
Phe Tyr Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val
180 185 190
Ser Lys Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu
195 200 205
Ala Thr Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr
210 215 220
Ser Val Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val
225 230 235 240
Ser Gly Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr
245 250 255
Asp Gly Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met
260 265 270
Ala Ala Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp
275 280 285
Asp Tyr Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly
290 295 300
Ser Asp Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln
305 310 315 320
Arg Ala Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val
325 330 335
Phe Ala Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln
340 345 350
Asp Gly Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp
355 360 365
Lys Lys Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn
370 375 380
Ala Val Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met
385 390 395 400
Pro Pro Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys
405 410 415
Asn Gly Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala
420 425 430
Ile Leu Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu
435 440 445
Val Tyr Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro
450 455 460
Gly Thr Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys
465 470 475 480
Ala Asp Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu
485 490 495
Leu Leu Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu
500 505 510
Phe Leu Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser
515 520 525
Arg Gly Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp
530 535 540
Glu Ser Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu
545 550 555 560
Tyr Arg Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro
565 570 575
Ile Leu Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile
580 585 590
Leu Leu Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val
595 600 605
Ser Val Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro
610 615 620
Leu Thr Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu
625 630 635 640
Ala Glu Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val
645 650 655
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660 665 670
Glu Asn Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys
675 680 685
Ala Gly Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln
690 695 700
Ser Glu Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser
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Asn Leu Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu
725 730 735
Ala Val Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His
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Ile Phe Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr
755 760 765
Glu Glu Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn
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Asn Gly Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro
785 790 795 800
Tyr Lys Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile
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Asp Gly Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg
820 825 830
Ile Lys Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala
835 840 845
Gly Gln Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu
850 855 860
Ser Glu Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu
865 870 875 880
Lys Ile Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile
885 890 895
Leu Tyr Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu
900 905 910
Asn Gln Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val
915 920 925
Ile Glu Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser
930 935 940
Thr Leu Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro
945 950 955
<210> 211
<211> 44
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 211
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Ala Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
35 40
<210> 212
<211> 14
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 212
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 213
<211> 35
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 213
Phe Ala Ala Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr
1 5 10 15
Thr Val Asp Leu Arg Ile Thr Ser Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ala Thr
20 25 30
Tyr Phe Cys
35
<210> 214
<211> 11
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 214
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 215
<211> 125
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 215
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Ala Ser Asn Asn Ala Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Gly Thr Asp Cys Asn Val
115 120 125
<210> 216
<211> 127
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 216
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Ala Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Thr
35 40 45
Ser Asn Ser Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ala Ile Ser Ser Arg Ala Thr Thr Tyr Phe Ala Ala Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Arg Ile Thr Ser Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Gly
100 105 110
Lys Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 217
<211> 114
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 217
Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro
1 5 10 15
Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr
20 25 30
Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val
35 40 45
Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser
50 55 60
Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr
65 70 75 80
Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys
85 90 95
Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly
100 105 110
Asp Cys
<210> 218
<211> 323
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 218
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
35 40 45
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
65 70 75 80
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
85 90 95
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
100 105 110
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
115 120 125
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
130 135 140
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
145 150 155 160
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
195 200 205
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
210 215 220
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
225 230 235 240
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
245 250 255
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
275 280 285
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
290 295 300
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Gly Lys
<210> 219
<211> 239
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 219
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Val Ala Ser Asn Asn Ala Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Leu Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Gly Thr Asp Cys Asn Val Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
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195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 220
<211> 450
<212> PRT
<213> rabbit
<400> 220
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Ala Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
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Gly Thr Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Thr
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Ser Asn Ser Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
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100 105 110
Lys Phe Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp
130 135 140
Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu
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165 170 175
Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
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Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn
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Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro
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Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp
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Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg
275 280 285
Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg
290 295 300
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys
305 310 315 320
Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr
340 345 350
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Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp
370 375 380
Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro
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Gly Lys
450
<210> 221
<211> 46
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 221
catttgccca agtgctgacc cagactccat cctccgtgtc tgcagc 46
<210> 222
<211> 24
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 222
cagagtgttg ctagtaacaa tgcc 24
<210> 223
<211> 36
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 223
ggcggttatg attgtagggg tactgattgt aatgtt 36
<210> 224
<211> 27
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 224
atcgacctca ctagcaattc gctgagc 27
<210> 225
<211> 27
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 225
gccattagta gtcgtgctac cacatat 27
<210> 226
<211> 15
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 226
gggaaattta atttg 15
<210> 227
<211> 61
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 227
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
a 61
<210> 228
<211> 37
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 228
tgtggggggc acagtcacca tcaattgcca ggccagt 37
<210> 229
<211> 171
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 229
ttagcctggt ttcagcagaa accagggcag cctcccaaac tcctgatcta ttatgcgtcc 60
actctggcat ctggggtccc atcgcgattc aaaggcagtg gatctgggac acagttcact 120
ctcaccatca gcgacctgga gtgtgccgat gctgccactt actactgtct a 171
<210> 230
<211> 2961
<212> DNA
<213> human
<400> 230
atggcttttc cgccgcggcg acggctgcgc ctcggtcccc gcggcctccc gcttcttctc 60
tcgggactcc tgctacctct gtgccgcgcc ttcaacctag acgtggacag tcctgccgag 120
tactctggcc ccgagggaag ttacttcggc ttcgccgtgg atttcttcgt gcccagcgcg 180
tcttcccgga tgtttcttct cgtgggagct cccaaagcaa acaccaccca gcctgggatt 240
gtggaaggag ggcaggtcct caaatgtgac tggtcttcta cccgccggtg ccagccaatt 300
gaatttgatg caacaggcaa tagagattat gccaaggatg atccattgga atttaagtcc 360
catcagtggt ttggagcatc tgtgaggtcg aaacaggata aaattttggc ctgtgcccca 420
ttgtaccatt ggagaactga gatgaaacag gagcgagagc ctgttggaac atgctttctt 480
caagatggaa caaagactgt tgagtatgct ccatgtagat cacaagatat tgatgctgat 540
ggacagggat tttgtcaagg aggattcagc attgatttta ctaaagctga cagagtactt 600
cttggtggtc ctggtagctt ttattggcaa ggtcagctta tttcggatca agtggcagaa 660
atcgtatcta aatacgaccc caatgtttac agcatcaagt ataataacca attagcaact 720
cggactgcac aagctatttt tgatgacagc tatttgggtt attctgtggc tgtcggagat 780
ttcaatggtg atggcataga tgactttgtt tcaggagttc caagagcagc aaggactttg 840
ggaatggttt atatttatga tgggaagaac atgtcctcct tatacaattt tactggcgag 900
cagatggctg catatttcgg attttctgta gctgccactg acattaatgg agatgattat 960
gcagatgtgt ttattggagc acctctcttc atggatcgtg gctctgatgg caaactccaa 1020
gaggtggggc aggtctcagt gtctctacag agagcttcag gagacttcca gacgacaaag 1080
ctgaatggat ttgaggtctt tgcacggttt ggcagtgcca tagctccttt gggagatctg 1140
gaccaggatg gtttcaatga tattgcaatt gctgctccat atgggggtga agataaaaaa 1200
ggaattgttt atatcttcaa tggaagatca acaggcttga acgcagtccc atctcaaatc 1260
cttgaagggc agtgggctgc tcgaagcatg ccaccaagct ttggctattc aatgaaagga 1320
gccacagata tagacaaaaa tggatatcca gacttaattg taggagcttt tggtgtagat 1380
cgagctatct tatacagggc cagaccagtt atcactgtaa atgctggtct tgaagtgtac 1440
cctagcattt taaatcaaga caataaaacc tgctcactgc ctggaacagc tctcaaagtt 1500
tcctgtttta atgttaggtt ctgcttaaag gcagatggca aaggagtact tcccaggaaa 1560
cttaatttcc aggtggaact tcttttggat aaactcaagc aaaagggagc aattcgacga 1620
gcactgtttc tctacagcag gtccccaagt cactccaaga acatgactat ttcaaggggg 1680
ggactgatgc agtgtgagga attgatagcg tatctgcggg atgaatctga atttagagac 1740
aaactcactc caattactat ttttatggaa tatcggttgg attatagaac agctgctgat 1800
acaacaggct tgcaacccat tcttaaccag ttcacgcctg ctaacattag tcgacaggct 1860
cacattctac ttgactgtgg tgaagacaat gtctgtaaac ccaagctgga agtttctgta 1920
gatagtgatc aaaagaagat ctatattggg gatgacaacc ctctgacatt gattgttaag 1980
gctcagaatc aaggagaagg tgcctacgaa gctgagctca tcgtttccat tccactgcag 2040
gctgatttca tcggggttgt ccgaaacaat gaagccttag caagactttc ctgtgcattt 2100
aagacagaaa accaaactcg ccaggtggta tgtgaccttg gaaacccaat gaaggctgga 2160
actcaactct tagctggtct tcgtttcagt gtgcaccagc agtcagagat ggatacttct 2220
gtgaaatttg acttacaaat ccaaagctca aatctatttg acaaagtaag cccagttgta 2280
tctcacaaag ttgatcttgc tgttttagct gcagttgaga taagaggagt ctcgagtcct 2340
gatcatatct ttcttccgat tccaaactgg gagcacaagg agaaccctga gactgaagaa 2400
gatgttgggc cagttgttca gcacatctat gagctgagaa acaatggtcc aagttcattc 2460
agcaaggcaa tgctccatct tcagtggcct tacaaatata ataataacac tctgttgtat 2520
atccttcatt atgatattga tggaccaatg aactgcactt cagatatgga gatcaaccct 2580
ttgagaatta agatctcatc tttgcaaaca actgaaaaga atgacacggt tgccgggcaa 2640
ggtgagcggg accatctcat cactaagcgg gatcttgccc tcagtgaagg agatattcac 2700
actttgggtt gtggagttgc tcagtgcttg aagattgtct gccaagttgg gagattagac 2760
agaggaaaga gtgcaatctt gtacgtaaag tcattactgt ggactgagac ttttatgaat 2820
aaagaaaatc agaatcattc ctattctctg aagtcgtctg cttcatttaa tgtcatagag 2880
tttccttata agaatcttcc aattgaggat atcaccaact ccacattggt taccactaat 2940
gtcacctggg gcattcagcc a 2961
<210> 231
<211> 132
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 231
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgc ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga catccctgac actcacctgc 120
acggtctctg ga 132
<210> 232
<211> 42
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 232
tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gaatggatcg gg 42
<210> 233
<211> 105
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 233
ttcgcggctt gggcgaaggg ccgattcacc atctccagaa cctcgaccac ggtggatctc 60
agaatcacca gtctgacagc ttcagacacg gccacctatt tctgt 105
<210> 234
<211> 33
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 234
tggggccaag gcaccctggt caccgtctcc tca 33
<210> 235
<211> 375
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 235
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt ggggggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtcagagt gttgctagta acaatgcctt agcctggttt 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaaactc ctgatctatt atgcgtccac tctggcatct 240
ggggtcccat cgcgattcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gacctggagt gtgccgatgc tgccacttac tactgtctag gcggttatga ttgtaggggt 360
actgattgta atgtt 375
<210> 236
<211> 381
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 236
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgc ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga catccctgac actcacctgc 120
acggtctctg gaatcgacct cactagcaat tcgctgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg ggccattagt agtcgtgcta ccacatattt cgcggcttgg 240
gcgaagggcc gattcaccat ctccagaacc tcgaccacgg tggatctcag aatcaccagt 300
ctgacagctt cagacacggc cacctatttc tgtgggaaat ttaatttgtg gggccaaggc 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 237
<211> 360
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 237
ttcggcggag ggaccgaggt ggtggtcaaa ggtgatccag ttgcacctac tgtcctcatc 60
ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat 120
aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc 180
atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct gcagattgta cctacaacct cagcagcact 240
ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag 300
ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat aggggtgact gttagagtga gagcggccgc 360
<210> 238
<211> 998
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 238
gggcaaccta aggctccatc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60
tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa gggtacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120
tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180
ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240
aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300
agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360
ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420
gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480
cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540
accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600
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gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720
ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780
gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840
ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900
tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960
ccgggtaaat gagcgctgtg ccggcgagct gcggccgc 998
<210> 239
<211> 735
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 239
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt ggggggcaca 120
gtcaccatca attgccaggc cagtcagagt gttgctagta acaatgcctt agcctggttt 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaaactc ctgatctatt atgcgtccac tctggcatct 240
ggggtcccat cgcgattcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gacctggagt gtgccgatgc tgccacttac tactgtctag gcggttatga ttgtaggggt 360
actgattgta atgttttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 420
cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480
gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600
aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660
tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
agtgagagcg gccgc 735
<210> 240
<211> 1379
<212> DNA
<213> rabbit
<400> 240
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgc ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga catccctgac actcacctgc 120
acggtctctg gaatcgacct cactagcaat tcgctgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg ggccattagt agtcgtgcta ccacatattt cgcggcttgg 240
gcgaagggcc gattcaccat ctccagaacc tcgaccacgg tggatctcag aatcaccagt 300
ctgacagctt cagacacggc cacctatttc tgtgggaaat ttaatttgtg gggccaaggc 360
accctggtca ccgtctcctc agggcaacct aaggctccat cagtcttccc actggccccc 420
tgctgcgggg acacacccag ctccacggtg accctgggct gcctggtcaa agggtacctc 480
ccggagccag tgaccgtgac ctggaactcg ggcaccctca ccaatggggt acgcaccttc 540
ccgtccgtcc ggcagtcctc aggcctctac tcgctgagca gcgtggtgag cgtgacctca 600
agcagccagc ccgtcacctg caacgtggcc cacccagcca ccaacaccaa agtggacaag 660
accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc acgtgcccac cccctgaact cctgggggga 720
ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg 840
tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac 900
agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag 960
gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag 1080
ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc 1140
tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca gaggacaact acaagaccac gccggccgtg 1200
ctggacagcg acggctccta cttcctctac agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg 1260
cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg 1320
cagaagtcca tctcccgctc tccgggtaaa tgagcgctgt gccggcgagc tgcggccgc 1379
Claims (15)
- 각각 적어도 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함하는 곤충-유래 글리코실화 패턴을 갖는 인테그린 및 또다른 진핵 글리코실화 패턴을 갖는 인테그린에 대한 단일클론 토끼 항체, 또는 이의 절편으로서, 상기 항체가 세포외 인테그린 도메인 또는 세포외 인테그린 사슬 도메인의 비-폐색 에피토프에 대한 항원 결합 특이성을 갖고, 항체가 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 물질 내 및 실질적으로 동일한 특이성으로 생존 세포 상의 인테그린의 미손상 헤테로이량체에 결합할 수 있는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 항체가 인테그린 αvβ3 의 세포외 도메인에 결합하고, 바람직하게는, VL 은 SEQ ID NO: 95 (VL-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 는 SEQ ID NO: 96 (VH-αvβ3) 의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 항체가 인테그린 αvβ5 의 세포외 도메인에 결합하고, 바람직하게는, VL 은 SEQ ID NO: 15 (VL-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 는 SEQ ID NO: 16 (VH-αvβ5) 의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 항체가 인테그린 αvβ6 의 세포외 도메인에 결합하고, 바람직하게는, VL 은 SEQ ID NO: 135 (VL-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 는 SEQ ID NO: 136 (VH-αvβ6) 의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 항체가 인테그린 αvβ8 의 세포외 도메인에 결합하고, 바람직하게는, VL 은 SEQ ID NO: 175 (VL-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 는 SEQ ID NO: 176 (VH-αvβ8) 의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
- 제 1 항에 있어서, 항체가 인테그린 사슬 αv 의 세포외 도메인에 결합하고, 바람직하게는, VL 은 SEQ ID NO: 215 (VL-αv) 의 아미노산 서열을 포함하고, VH 는 SEQ ID NO: 216 (VH-αv) 의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 절편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 델타-막통과 형태로서 임의로 커플링된, 곤충-유래 글리코실화 패턴을 갖는 세포외 인테그린 도메인으로 이루어진 재조합 면역원.
- 제 8 항에 있어서, SEQ ID NO: 10, 90, 130, 170 또는 210 의 아미노산 서열, 또는 동일한 기능을 갖는 아미노산 서열의 변형, 변이체, 일부 또는 95% 이상 상동 서열을 갖는 면역원.
- 제 9 항의 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 토끼를 제 8 항 또는 제 9 항에 따른 면역원 및/또는 제 10 항에 따른 폴리뉴클레오티드로 면역화시키고, 폴리클론 항체가 있는 폴리클론 항혈청을 채취하고, 단일클론 항체를 제조하여 수득되는 단일클론 항체.
- 하기 단계를 포함하는, 단일클론 토끼 항체의 제조 방법:
(a) 세포외 인테그린 도메인을 곤충 세포에서 재조합적으로 발현시키는 단계,
(b) 발현된 세포외 인테그린 도메인을 정제하는 단계,
(c) 토끼를 정제된 세포외 인테그린 도메인으로 면역화하는 단계,
(d) 토끼로부터 폴리클론 항체를 포함하는 폴리클론 항혈청을 채취하는 단계, 및
(e) 단일클론 항체를 제조하는 단계. - 하기 단계로, 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH) 을 포함하는 재조합 단일클론 항체의 제조 방법:
(a) 하기의 항체-코딩 핵산 서열
(i) SEQ ID NO: 115 (VL-αvβ3) 및 SEQ ID NO: 116 (VH-αvβ3),
(ii) SEQ ID NO: 35 (VL-αvβ5) 및 SEQ ID NO: 36 (VH-αvβ5),
(iii) SEQ ID NO: 155 (VL-αvβ6) 및 SEQ ID NO: 156 (VH-αvβ6),
(iv) SEQ ID NO: 195 (VL-αvβ8) 및 SEQ ID NO: 196 (VH-αvβ8), 또는
(V) SEQ ID NO: 235 (VL-αv) 및 SEQ ID NO: 236 (VH-αv)
을 포함하는 하나 이상의 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계,
(b) 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하여, 코딩된 항체를 발현하는 단계, 및
(c) 발현된 항체를 정제하는 단계. - 제 1 항 내지 제 6 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항의 항체, 또는 이의 절편의, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 물질 내 인테그린의 검출을 위한 용도.
- 하기 단계를 포함하는, 인테그린 α-서브유닛 및/또는 β-서브유닛의 각각의 가장 가까운 상동 사이를 구별할 수 있고, 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 물질 내 면역조직화학에 적합한 항-인테그린 항체의 스크리닝 방법:
(a) 선택된 인테그린에 결합할 수 있는 항체의 샘플을 제공하는 단계,
(b) 인테그린 서열을 정렬하여 선택된 인테그린의 α-서브유닛 및/또는 β-서브유닛의 가장 가까운 상동을 확인하는 단계,
(c) 항체 샘플로, 선택된 인테그린의 고유의 형태 및 이의 가장 가까운 상동(들) 에 대해 차등 ELISA 를 수행하여, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 축적하는 단계 (1 차 스크리닝),
(d) 단계 (c) 의 축적된 항체로, 선택된 인테그린의 고유의 형태 및 또다른 인테그린에 대해 또다른 차등 ELISA 를 수행하여, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (2 차 스크리닝),
(e) 단계 (d) 의 축적된 항체로 FFPE 세포주의 면역조직화학을 수행하는 단계로, 하나 이상의 세포주는 선택된 인테그린을 발현할 수 있고, 임의로 또다른 세포주는 선택된 인테그린을 발현할 수 없어, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (3 차 스크리닝),
(f) 단계 (e) 의 FFPE 세포주의 면역조직화학을 단계 (e) 의 축적된 항체로 수행하는 단계로, 세포주를 포유동물에서 이종이식 종양으로서 성장시켜, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (4 차 스크리닝), 및
(g) 기록 FFPE 종양의 면역조직화학을 단계 (f) 의 축적된 항체로 수행하여, 선택된 인테그린에 대항하는 항체를 추가로 축적하는 단계 (5 차 스크리닝).
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